Штамм бактерий salmonella enterica subsp. enterica serovar typhi в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике брюшного тифа

Изобретение относится к микробиологии, в частности к бактериологии. Штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, характеризующийся устойчивостью к фторхинолонам, депонирован Государственной коллекцией патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером B-8452. Штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 используется в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике брюшного тифа. Изобретение обеспечивает выполнение диагностики штаммов с устойчивостью высокого уровня к фторхинолонам. 3 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии (бактериологии), а именно к разделу определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам и молекулярной детекции механизмов резистентности и может быть использовано в качестве контрольного штамма для контроля качества при диагностике брюшного тифа: на этапах фенотипических исследований (определение чувствительности к антибиотикам: выявление устойчивости высокого уровня к фторхинолонам) и молекулярных исследований (определение механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в гене gyrA).

По литературным данным в различных странах мира выделяют штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, устойчивые к фторхинолонам за счет мутаций в хромосомном гене gyrA. Большинство зарубежных штаммов имеют устойчивость низкого уровня к фторхинолонам, обусловленную одной мутацией вида Ser83Phe. Штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, выделенные в других странах, не могут быть ввезены и использованы в качестве контрольных штаммов при диагностике брюшного тифа в РФ. На территории РФ штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, характеризующиеся устойчивостью высокого уровня к фторхинолонам, обусловленной двумя мутациями в хромосомном гена gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn ранее не обнаружены, не изучены и не депонированы.

При диагностике брюшного тифа необходимо проводить постоянный контроль качества различных этапов исследования, в том числе при определении чувствительности штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к существующим антимикробным препаратам, использующимся для лечения брюшного тифа в качестве препаратов первого выбора (фторхинолонов). Для разработки новых фторхинолонов для лечения брюшного тифа необходимо точно установить механизмы устойчивости к антибиотикам молекулярными методами. Для контроля качества этих этапов исследования требуются контрольные штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi с известным уровнем устойчивости к фторхинолонам и известным механизмом устойчивости (мутациями в хромосомных генах).

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, выделенный в Камбоджи, который имеет такие же две мутации в хромосомном гене gyrA (Ser83Phe и Asp87Asn), как и штамм, предлагаемый в качестве изобретения (Kuijpers LMF, Phe Т, Veng СН, Lim K, Ieng S, Kham С, et al. (2017) The clinical and microbiological characteristics of enteric fever in Cambodia, 2008-2015//PLoS. Negl. Trop. Dis. - 2017. - Vol. 11, №9: e0005964. https://doi.org/10.1371/journal. pntd.0005964). Однако данный штамм характеризуется устойчивостью к хинолонам низкого уровня (минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина составляет 0,38 мг/л) и может быть использован в качестве контрольного штамма при изучении штаммов с устойчивостью только низкого уровня (с минимальной подавляющей концентрацией ципрофлоксацина от 0,12 до 0,5 мг/л) и не позволяет проводить контроль диагностики штаммов с устойчивостью высокого уровня (с минимальной подавляющей концентрацией ципрофлоксацина от 2,0 до 32,0 мг/л).

Предлагаемый в качестве изобретения штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 помогает преодолеть это ограничение, поскольку характеризуется двумя свойствами, позволяющими использовать его как контрольный штамм (устойчивостью высокого уровня (минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина составляет 6,0 мг/л) и двумя мутациями в хромосомном гена gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn) и может быть использован в качестве контрольного штамма при изучении штаммов с устойчивостью высокого уровня в рамках диагностики брюшного тифа.

Изобретение направлено на разработку контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. serovar Typhi, необходимого для обеспечения достоверной диагностики и лечения брюшного тифа.

Авторами получен контрольный штамм для контроля качества различных этапов лабораторной диагностики брюшного тифа, с устойчивостью высокого уровня к фторхинолонам и двумя мутациями в гене gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn.

Заявляемый штамм выделен от больного брюшным тифом, идентифицирован до вида Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi бактериологическими и серологическими методами. Устойчивость высокого уровня к фторхинолонам установлена стандартизованными методами диско-диффузионным и градиентных концентраций; наличие и вид мутаций в хромосомном гене gyrA определено при анализе данных полногеномного секвенирования штамма на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США).

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8452.

Характеристика штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспорообразующие.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, 3 группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.

Культуральные свойства: хемоорганотроф, каталазоположительный, оксидозоотрицательный, растет на питательных средах (агар Эндо, висмут-сульфит-агар, гектоен-агар, XLD-arap, агар Плоскирева) при оптимальной температуре 37°С при рН 7,2, образуя характерные для бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi колонии.

Антигенная характеристика: по результатам серологического исследования штамм относится к группе O9 (D), серовару S.Typhi и имеет антигенную формулу 9,12, Vi:d:-

Основные свойства штамма:

1. Устойчивость высокого уровня к фторхинолонам:

- минимальная подавляющая концентрация налидиксовой кислоты более 256,0 мг/л, диаметр зоны задержки роста - 6 мм;

- минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина - 6,0 мг/л;

- диаметр зоны задержки роста вокруг диска с пефлоксацином - 6 мм.

Стабильность свойств штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 (диаметров зон задержки роста и значений минимальных подавляющих концентраций) подтверждена путем повторения в течение 7 дней процедуры определения чувствительности к фторхинолонам диско-диффузионным методом и методом градиентных концентраций с агаром Мюллера-Хинтон, дисков и полосок с антибиотиками различных производителей: Oxoid (Великобритания), BioRad (США), HiMedia (Индия) и НИЦФ (Россия). Штамм давал стабильные результаты на агарах, дисках и полосках всех производителей при тестировании в течение 7 дней.

2. Молекулярный механизм устойчивости к фторхинолонам: две мутации в хромосомном гене gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn. Стабильность наличия мутаций в геноме контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидной последовательности после хранения штамма в течение 6 мес.при -70°С на криосреде.

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Контроль качества определения чувствительности возбудителя брюшного тифа S.Typhi к антимикробным препаратам диско-диффузионным методом.

Чувствительность штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к фторхинолонам диско-диффузионным методом проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Использовали чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон высотой 4 мм. Исследуемые штаммы и контрольный штамм выращивали на кровяном агаре в течении 24 часов при +37°С. Для каждого исследуемого штамма и контрольного штамма отбирали несколько изолированных однотипных колоний и готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия. Инокулюмы засевали ватным стерильным тампоном на отдельные чашки Петри с агаром; накладывали диски, пропитанные антибиотиками - налидиксовая кислота, 30 мкг и пефлоксацин 5 мкг. Инкубировали посевы в течении 24 часов при +35°С. Учитывали результат путем измерения зоны задержки роста культуры вокруг дисков с антибиотиками, интерпретировали результат согласно Клиническим рекомендациям и относили исследуемые штаммы к категориям «Чувствительный», «Устойчивый», «Промежуточный». Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: диаметр зоны задержки роста вокруг диска с налидиксовой кислотой - 6 мм, вокруг диска с пефлоксацином - 6 мм и относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам.

Пример 2. Контроль качества определения чувствительности возбудителя брюшного тифа S.Typhi к антимикробным препаратам методом градиентной диффузии.

Чувствительность штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к фторхинолонам методом градиентной диффузии проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Использовали чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон высотой 4 мм. Исследуемые штаммы и контрольный штамм выращивали на кровяном агаре в течении 24 часов при +37°С. Для каждого исследуемого штамма и контрольного штамма отбирали несколько изолированных однотипных колоний и готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия. Инокулюмы засевали ватным стерильным тампоном на отдельные чашки Петри с агаром; накладывали градуированные полоски, пропитанные антибиотиками в градиенте концентраций: налидиксовая кислота - от 0,016 мг/л до 256,0 мг/л и ципрофлоксацин - от 0,002 мг/л до 32,0 мг/л. Инкубировали посевы в течении 24 часов при +35°С. Учитывали значение концентрации в месте пересечения эллипсовидной зоны задержки роста штамма с полоской, интерпретировали результат согласно Клиническим рекомендациям и относили исследуемые штаммы к категориям «Чувствительный», «Устойчивый», «Промежуточный». Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: значение минимальной подавляющей концентрации налидиксовой кислотой составляло более 256,0 мг/л (полное отсутствие зоны задержки роста вокруг полоски), ципрофлоксацина - 6 мг/л. Контрольный штамм относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам, уровень устойчивости расценивался как высокий.

Пример 3. Контроль качества определения механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в гене gyrA по данным полногеномного секвенирования.

Детекцию мутаций в хромосомном гене gyrA проводили путем анализа данных полногеномного секвенирования. Выделение ДНК из исследуемых штаммов и контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 проводили с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit для выделения ДНК из тканей, мазков, крови и биологическихжидкостей (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Качество и количество полученной ДНК оценили путем электрофореза в 0,5×ТВЕ-буфере в 1,5% агарозном геле, а также используя спектрофотометр QIAxpert при длине волны 260 нм. Подготовку библиотек проводили с использованием набора для подготовки библиотек Nextera DNA Sample Preparation Kit, набора индексов Nextera Index Kit и сменных крышек, магнитных частиц AMPure ХР Beads согласно стандартному протоколу производителя. Секвенирование геномов исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США). Поиск мутаций в хромосомных генах, отвечающих за устойчивость к фторхинолонам, у исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили с помощью веб-сервера ResFinder Датского Технического Университета, куда вводили данные секвенирования в формате fasta. Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 проявлял заявленные свойства: стабильно обнаруживались две мутации в хромосомном гене gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn.

Для обеспечения достоверной диагностики брюшного тифа необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования материала. Предлагаемый штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать два этапа диагностики: этап определение чувствительности и устойчивости высокого уровня возбудителя к фторхинолонам двумя фенотипическими методами, а также этапа определения механизма устойчивости (двух мутаций в гене gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn) молекулярными методами.

Штамм бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8452, используемый в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике брюшного тифа.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Предлагается штамм микроводорослей Chlorella vulgaris, депонированный в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений им.
Изобретение относится к микробиологии, в частности к бактериологии. Штамм Escherichia coli O144:Н45, характеризующийся отсутствием генов, кодирующих факторы патогенности, специфичных для Shigella spp.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения уровня заселенности почв грибами родов Pythium, Fusarium и Helminthosporium возбудителей питиозной, фузариозной и обыкновенной корневых и прикорневых гнилей сельскохозяйственных культур.

Генотерапевтический днк-вектор на основе генотерапевтического днк-вектора vtvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов col1a1, col1a2, bmp2, bmp7, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм escherichia coli scs110-af/vtvaf17- col1a1 или escherichia coli scs110-af/vtvaf17- col1a2 или escherichia coli scs110-af/vtvaf17- bmp2 или escherichia coli scs110-af/vtvaf17- bmp7, несущий генотерапевтический днк-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического днк-вектора // 2707537
Изобретение относится к генной инженерии. Описан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17- COL1A2, или VTvaf17- ВМР2, или VTvaf17-ВМР7 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 соответственно.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 346, обладающий способностью полностью деструктировать диклофенак натрия, депонирован в Национальном биоресурсном центре - Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ) ФГБУ ГосНИИгенетика НИЦ «Курчатовский институт» под регистрационным номером ВКПМ Ас-2106.

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, медицинской микробиологии. Предложена рекомбинантная плазмида pHFQ2.21, экспрессирующая клонированный ген hfq (шаперона) Vibrio cholerae 01 биовара El Tor, встроенный по сайтам Bam HI-PstI в полилинкер векторной плазмиды pQE30, под контролем Т5-промотора.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Предложен способ получения штамма Е.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ повышения продуктивности бактерий Escherichia coli.

Изобретение относится к биотехнологии. Микробный препарат содержит смесь предварительно высушенных до влажности не более 10% штаммов Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D, Acinetobacter guillouiae B-3216D, Acinetobacter guillouiae B-3217D в равных объемах с содержанием каждого компонента не менее 1×107 KOE/г.

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложены выделенный штамм вида Mycosphaerella sp.
Изобретение относится к микробиологии, в частности к бактериологии. Штамм Escherichia coli O144:Н45, характеризующийся отсутствием генов, кодирующих факторы патогенности, специфичных для Shigella spp.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к штамму бактерий Leptospira interrogans серогруппы Canicola серовара canicola для детекции антител к L. canocola.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 346, обладающий способностью полностью деструктировать диклофенак натрия, депонирован в Национальном биоресурсном центре - Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ) ФГБУ ГосНИИгенетика НИЦ «Курчатовский институт» под регистрационным номером ВКПМ Ас-2106.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения белковой биомассы. Предлагается штамм бактерий Methylococcus capsulatus, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им.

Изобретение относится к иммунобиотическому комплексу для нормализации кишечной микрофлоры организма. Указанный комплекс включает сухую микробную массу живых бактерий и биологически активные вещества (БАВ).

Изобретение относится к микробиологии. Способ производства сухих солей желчных кислот из нативной желчи крупного рогатого скота предусматривает осветление нативной желчи путем добавления активированного угля, прогреванием смеси до заданной температуры и охлаждением с последующей фильтрацией с получением осветленной желчи.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм лактобактерий Enterococcus hirae Т-8 13-2018, обладающий способностью продуцировать молочную кислоту и высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре депонированный под регистрационным номером ВКПМ В-13055.

Изобретение относится к микробиологии. Изобретение касается нового штамма (вида) микроорганизма – продуцента актифенола.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus plantarum Лб (н)37 2-2018, обладающий антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-13052.

Изобретение относится к микробиологии и предназначено для моделирования дормантного статуса М. tuberculosis в условиях in vitro. Способ моделирования заключается в генерации дормантного фенотипа микобактерий туберкулеза в жидкой питательной среде в условиях депривации компонентов, необходимых для полноценного роста и размножения М. tuberculosis in vitro. Дормантное состояние М. tuberculosis достигается в интервале между 4 и 11 сутками культивирования микобактерий туберкулеза в модифицированной среде Middlebrook 7Н9, содержащей гидрофосфат натрия (Na2HPO4), дигидрофосфат калия (KH2PO4), сульфат аммония ((NH4)2SO4), L-глютаминовую кислоту (C5H9NO4), цитрат натрия (Na3C6H5O7), сульфат магния (MgSO4), цитрат железа(III)-аммония (Fe(NH4)3(C6H5O7)2), сульфат цинка (ZnSO4), сульфат меди(II) (CuSO4), пиридоксин (C8H11NO3), биотин (C10H16N2O3S), хлорид кальция (CaCl2), глицерин (C3H8O3), Твин-80 (C64H124O26) и дистиллированную воду. Изобретение позволяет упростить способ и может использоваться в экспериментальных и клинических микобактериологических исследованиях. 3 табл., 3 ил.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к бактериологии. Штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, характеризующийся устойчивостью к фторхинолонам, депонирован Государственной коллекцией патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером B-8452. Штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 используется в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике брюшного тифа. Изобретение обеспечивает выполнение диагностики штаммов с устойчивостью высокого уровня к фторхинолонам. 3 пр.

Наверх