Патент ru2708199

Авторы патента:


Группа изобретений относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены способ приготовления среды для культивирования лимфоцитов (варианты), включающий измерение концентрации показателя качества, выбранного из группы, включающей эстрадиол, кортизол, IGF-1, инсулин и SHBG, в препаратах крови доноров и сравнение с диапазоном концентраций, предопределенным для показателя качества; среда для культивирования лимфоцитов, приготовленная указанным способом, применение среды для культивирования лимфоцитов. Изобретения обеспечивают улучшенный результат культивирования лимфоцитов. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к средам для культивирования клеток с высокими стандартами качества, в частности, для роста и наращивания иммунных клеток, и способу приготовления.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Одним из наиболее перспективных достижений для лечения злокачественной опухоли является новый класс терапевтических средств под названием активная клеточная иммунотерапия. Активная иммунотерапия стимулирует иммунную систему пациента для того чтобы способствовать антигенспецифическому противоопухолевому воздействию при помощи собственных иммунных клеток организма. Для этого иммунные клетки культивируют in vitro для увеличения числа клеток и влияния на дифференцировку.

Для культивирования клеток in vitro должны быть выполнены несколько средовых требований, таких как контролируемая температура, субстрат для прикрепления клеток и подходящая среда для выращивания, и инкубатор, который поддерживает правильные pH и осмоляльность.

Составы сред для культивирования клеток широко описаны в литературе, и ряд сред является коммерчески доступным. Среды для культивирования клеток, в основном, состоят из постоянного источника энергии и соединений, которые регулируют клеточный цикл. Типичная среда для культивирования состоит из комплекта аминокислот, витаминов, неорганических солей, глюкозы, и сыворотки в качестве источника факторов роста, гормонов и факторов прикрепления. В дополнение к питательным веществам, среда также помогает поддерживать pH и осмоляльность.

Составы сред для культивирования клеток широко описаны в литературе, и ряд сред является коммерчески доступным. Для культивирования и наращивания иммунных клеток, в частности, лимфоцитов, среду для культивирования клеток, как правило, получают из сыворотки или плазмы, поскольку они обеспечивают окружение для иммунных клеток, которое аналогично природному окружению в организме.

Однако, скорость пролиферации и активность лимфоцитов, которые наращивают в среде для культивирования на существующем уровне техники, все еще являются недостаточными. Кроме того, предсказуемые результаты относительно количества, качества и жизнеспособности результатов наращивания лимфоцитов все еще являются довольно редкими, и обычной практикой является необходимость тестировать несколько партий сыворотки для определения требуемого качества.

Таким образом, целью настоящего изобретения является преодоление, по меньшей мере, одного из недостатков известного уровня техники.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, в числе прочего, основано на открытии, что качество применяемой среды для культивирования клеток оказывает существенное влияние на исход процесса наращивания лимфоцитов для клеточной иммунотерапии. В частности, авторы настоящего изобретения определили ряд показателей качества, которые определяют качество среды для культивирования клеток в отношении наращивания лимфоцитов. Авторы изобретения смогли определить показатели качества, такие как эстрадиол, кортизол, IGF-1, инсулин и SHBG, которые должны присутствовать в конкретных предопределенных концентрациях. Среда для культивирования клеток, удовлетворяющая критериям, которые были определены для отдельных показателей качества, обеспечивает улучшенный результат культивирования клеток млекопитающих, в частности, клеток иммунной системы.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу для приготовления среды для культивирования клеток, содержащей смесь из препаратов крови от двух или более доноров, включающему этапы:

a) обеспечение, по меньшей мере, первого препарата крови от первого донора;

b) измерение концентрации, по меньшей мере, одного показателя качества в первом препарате крови;

c) сравнение измеренной концентрации показателя качества с диапазоном концентраций, предопределенным для показателя качества;

d) выбор первого препарата крови для среды для культивирования клеток, если концентрация, измеренная для показателя качества, находится в предопределенном диапазоне, и необязательно преобразование первого выбранного препарата крови в первый обработанный препарат крови, или иначе отмена выбора первого препарата крови.

Изобретение дополнительно относится к среде для культивирования клеток, которая содержит, основываясь на объеме среды для культивирования клеток:

- CCL5 в концентрации ниже 3 нг/мл;

- эотаксин в концентрации ниже 500 пг/мл,

- PDGF-88 и/или CXCL-10 в концентрации ниже 100 пг/мл;

- IL-10 в концентрации ниже 200 пг/мл;

- IL-13 в концентрации ниже 50 пг/мл;

- IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL12p70, IL-15, IL-17a, IL-21, основной FGF, EGF, IFNγ, GCSF, GM-CSF, MCP1, MIP1a, MIP1b, PDGF, IL-1RA, и/или TNFα в концентрации ниже 20 пг/мл;

- эстрадиол в концентрации, по меньшей мере, 65 пмоль/л, предпочтительно, по меньшей мере, 75 пмоль/л, более предпочтительно, по меньшей мере, 85 пмоль/л;

- кортизол в концентрации, по меньшей мере, 190 нмоль/л, предпочтительно, по меньшей мере, 210 нмоль/л, более предпочтительно, по меньшей мере, 220 нмоль/л;

- IGF-1 в концентрации, по меньшей мере, 80 мкг/л, предпочтительно, по меньшей мере, 120 мкг/л, более предпочтительно, по меньшей мере, 140 мкг/л; и/или

- SHBG в концентрации ниже 31 нмоль/л, предпочтительно ниже 29 нмоль/л.

Наконец, изобретение относится к применению среды для культивирования клеток для культивирования клеток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения обнаружили, что для иммунотерапии культурой клеток по отношению к среде для культивирования клеток должны выполняться стандарты более высокого качества. Как показано в примерах, различия в соответствующих показателях качества приводят к значительным изменениям в результатах суспензии лимфоцитов. В частности, в среде, в которой показатели качества находятся в предопределенных диапазонах, рост, пролиферация или наращивание иммунных клеток приводят к повышенным скорости пролиферации, жизнеспособности и активности клеток. Выявление этих показателей качества позволяет определить улучшенный способ для приготовления среды для культивирования клеток, в частности, для клеточных популяций для иммунотерапии.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу для приготовления среды для культивирования клеток, содержащей смесь из препаратов крови от двух или более доноров, включающему этапы:

a) обеспечения, по меньшей мере, первого препарата крови от первого донора;

b) измерения концентрации, по меньшей мере, одного показателя качества в первом препарате крови;

c) сравнения измеренной концентрации показателя качества с диапазоном концентраций, предопределенным для показателя качества;

d) выбоя первого препарата крови для среды для культивирования клеток, если концентрация, измеренная для показателя качества, находится в предопределенном диапазоне, и необязательно преобразование первого выбранного препарата крови в первый обработанный препарат крови, или иначе отмена выбора первого препарата крови.

Способ по изобретению относится к среде для культивирования клеток с высоким качеством, которая в комбинации с факторами для наращивания лимфоцитов делает возможной активную пролиферацию клеток и высокую активность наращенных лимфоцитов. Кроме того, способ обеспечивает предоставление среды для культивирования однородного качества для облегчения наращивания лимфоцитов, таких как T-клетки, in vitro.

Как используют в настоящем документе, «среда для культивирования клеток» или «среда для выращивания» представляет собой жидкость или гель, разработанные для поддержания роста животных или растительных клеток. Среды для выращивания могут различаться по pH, концентрации глюкозы, факторам роста и наличию других питательных веществ. Существует два класса сред для культивирования клеток: среды на основе препаратов крови и синтетические среды.

По изобретению «среды на основе препаратов крови» содержат, по меньшей мере, один препарат крови.

Как используют в настоящем документе, «синтетическая среда» представляет собой химически определенную среду. Такая среда не содержит никаких питательных сред природного происхождения, таких как препараты крови. Вместо этого, все компоненты добавляют в среду в определенных концентрациях.

Как используют в настоящем документе, «препарат крови» относится к цельной крови млекопитающего или к подклассам цельной крови, в частности, к плазме, сыворотке или к дополнительным подклассам плазмы и сыворотки.

Как используют в настоящем документе, «обработанный препарат крови» включает плазму, сыворотку и их подклассы.

«Плазма», как используют в настоящем документе, относится к плазме крови млекопитающих. Это бледно-белый, иногда желтый жидкий компонент крови, который в норме удерживает клетки крови в цельной крови в виде суспензии. Плазма, в основном, состоит из воды и содержит растворенные белки, глюкозу, факторы свертывания, электролиты, гормоны и диоксид углерода. Плазму крови можно получать из крови, например, посредством центрифугирования свежей крови, содержащей антикоагулянт, при котором клетки крови оседают на дно пробирки для центрифугирования. Супернатант представляет собой плазму крови.

«Сыворотка», как используют в настоящем документе, представляет собой плазму крови без факторов свертывания.

«Фактор свертывания», как используют в настоящем документе, также обозначаемый как «свертывающий фактор» включает ряд белков, таких как фибриноген, протромбин или фактор VII.

«Подкласс цельной крови», как используют в настоящем документе, относится к раствору или суспензии, получаемым из цельной крови и содержащим часть компонентов цельной крови. Плазма и сыворотка являются подклассами цельной крови.

«Донор», как используют в настоящем документе, относится к млекопитающему, в частности, к человеку, от которого получают препарат крови. Донорство может быть в виде цельной крови (ЦК) или конкретных компонентов цельной крови, извлеченных путем афереза.

«Аферез», как используют в настоящем документе, представляет собой медицинскую технологию, при которой кровь донора проходит через аппарат, который отделяет один конкретный компонент и возвращает остальное в циркуляцию. Например, плазмаферез приводит к сбору только плазмы крови; все остальные компоненты возвращаются донору.

Как используют в настоящем документе, «получение препарата крови» от донора относится к действию извлечения крови из донора, в частности, путем забора крови непосредственно из вены донора.

«Цитокины», как используют в настоящем документе, представляют собой обширную и свободную категорию малых белков (~5-20 кДа), которые важны для клеточной сигнализации. Они высвобождаются клетками и влияют на поведение других клеток. Цитокины могут также участвовать в аутокринной передаче сигнала. Цитокины включают хемокины, интерфероны, интерлейкины, лимфокины, фактор некроза опухоли и факторы роста.

«Клинически значимые лимфоциты», также обозначаются как лимфоциты, отредактированные по антигену. Термин «клинически значимые» также используют для субпопуляций лимфоцитов. Особенно предпочтительными клинически значимыми лимфоцитами являются клинически значимые T-клетки или T-клетки, отредактированные по антигену.

«Клинически значимые антигены» по изобретению представляют собой антигены, вовлеченные в заболевание. Таким образом, клинически значимые антигены могут быть опухоль-ассоциированными антигенами (TAA), патоген-ассоциированными антигенами (PAA) или аутоантигенами. Опухоль-реактивные лимфоциты являются специфическими для TAA и взаимодействуют с TAA. Реактивные лимфоциты для инфекционного заболевания являются специфическими для PAA и взаимодействуют с PAA, и реактивные лимфоциты для аутоиммунного заболевания являются специфическими для аутоантигенов и взаимодействуют с аутоантигенами.

По изобретению «антиген» (АГ) представляет собой любое структурное вещество, которое служит мишенью для рецепторов приобретенного иммунного ответа, TCR или антитела, соответственно. Антигены, в частности, являются белками, полисахаридами, липидами и их подструктурами, такими как пептиды. Липиды и нуклеиновые кислоты, в частности, являются антигенными в сочетании с белками или полисахаридами.

Обеспечение препарата крови от донора или нескольких доноров не включает процесс получения препарата крови.

По изобретению показатель качества может быть любым компонентом, который можно найти в крови и концентрация котторого оказывает воздействие на рост и свойства высокочувствительной линии клеток, таких как клетки иммунной системы и стволовые клетки.

Клетки иммунной системы в качестве неограничивающих примеров включают B-клетки, T-клетки, NK-клетки, моноциты, дендритные клетки, гранулоциты и тромбоциты.

Среды, полученные из крови, имеют тот недостаток, что существует различие по ингредиентам из-за колебаний от одного донора к другому.

Как используют в настоящем документе «факторы, связанные с патогенами» представляют собой факторы, которые выявляют присутствие патогенов в крови. Часто тестируемыми патогенами являются, например, антитело к Trypanosoma cruzi, вирус гепатита B (HBV), вирус гепатита C (HCV), парвовирус, вирус ветряной оспы, вирус гепатита E (HEV) и вирусы иммунодефицита человека типов 1 и 2 (ВИЧ-1, ВИЧ-2). Тестирование на факторы, связанные с патогенами, сводит к минимуму риск использования зараженного препарата крови. Предпочтительно, показатель качества не является фактором, связанным с патогенами.

Доноры человеческой крови включают добровольных доноров и профессиональных доноров под наблюдением. И те, и другие должны быть здоровыми индивидуумами. Кроме того, доноры человеческой крови должны удовлетворять определенным критериям, таким как возраст, масса тела и диета. Профессиональные доноры крови под наблюдением внесены в регистр. В регистре записывается ряд данных о доноре и прилагаемых образцах крови.

Обеспечение первого препарата крови включает, в частности, перенос препарата крови в набор с пакетом для крови, пакет, контейнер, сосуд или многолуночный планшет. По одному из вариантов осуществления первый препарат крови от первого донора переносят в набор с пакетом для крови.

По одному из вариантов осуществления первый препарат крови от первого донора переносят в многолуночный планшет. Многолуночный планшет, в частности, представляет собой 24-луночный планшет, 48-луночный планшет, 96-луночный планшет или 192-луночный планшет. Многолуночный планшет представляет собой планшет с множеством лунок. Количество лунок не ограничено.

В данной области известен ряд способов для измерения концентрации показателя качества. По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения показатель качества измеряют способом, выбранным из нефелометрии, турбидиметрии и ELISA. Нефелометр представляет собой инструмент для измерения концентрации частиц суспендированных в жидкости или в коллоидном газе.

Нефелометрия (и турбидиметрия) определены в Европейском стандарте EN 27027 (идентичен немецкому DIN-Norm ISO Norm 7027). Нефелометр измеряет суспендированные частицы с использованием луча света и детектора света, установленного с одной стороны от источника луча. При нефелометрии к образцу препарата крови добавляют антитела, специфические для показателей качества. Взаимодействие антител с показателями качества затем приводит к распределению, вызывая боковое рассеяние света. Таким образом, можно количественно оценить повышение или снижение. При нефелометрии измеряют увеличение бокового светорассеяния. При турбидиметрии измеряют снижение прямого светорассеяния. Результаты нефелометрического измерения приведены в виде нефелометрических единиц мутности (NTU) и через калибровку с кривой NTU с определенными значениями концентрации показателя качества связаны со значением концентрации показателя качества.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) представляет собой анализ на твердой фазе для определения присутствия и качественных характеристик антигенов, в частности, можно использовать сэндвич-ELISA. Присутствие факторов, связанных с патогенами, в частности, определяют при помощи способов на основе ПЦР.

Сравнение измеренной концентрации показателя качества с диапазоном концентраций, предопределенным для показателя качества, означает, что показания прибора, полученные для измерения конкретного показателя качества, приняты и идет проверка, находится ли величина показателя качества в предопределенном диапазоне. Тестирование может производиться автоматически при помощи аппарата для тестирования или аппарата, соединенного с аппаратом для тестирования. Альтернативно, сравнение может проводить вручную человек, выполнявший измерение.

Предпочтительным показателем качества по изобретению является цитокин или ряд цитокинов. Показатель качества может быть группой цитокинов. Кроме того, показатель качества может быть всеми цитокинами. Как показано в примерах, для ряда цитокинов было установлено, что присутствие этих цитокинов вне предопределенного диапазона, что означает выше конкретного порогового значения, сильно снижает качество среды относительно ее способности поддерживать рост и/или наращивать клетки иммунной системы или стволовые клетки. В частности, невозможно получить наращенные лимфоциты иммунотерапевтической степени качества.

Таким образом, по одному из вариантов осуществления показатель качества является цитокином. Однако было обнаружено, что другие компоненты сильно влияют на качество среды для наращивания относительно ее способности поддерживать рост, в частности, наращивать, клетки иммунной системы.

Интересно то, что среда с показателем качества за пределами предопределенного диапазона, т.е. невыбранная среда, все еще может быть полезной для выращивания клеток для экспрессии рекомбинантных белков. Дополнительные показатели качества, которые были идентифицированы, представляют собой эстрадиол, кортизол, глобулин, связывающий половые гормоны (SHBG), инсулин и инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1).

Несмотря на то, что дополнительные показатели качества могут быть конкретно не упомянуты, но они также влияют на качество среды относительно роста и наращивания лимфоцитов, хотя не обязательно влияют на рост стандартных линий клеток. По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один показатель качества выбран из группы, состоящей из эстрадиола, кортизола, SHBG, инсулина и IGF-1.

Существует ряд цитокинов, концентрация которых вне предопределенного диапазона приводит к отказу от выбора препарата крови. Одним из показателей качества является CCL5, также известный как RANTES. Предопределенный диапазон для CCL5 находится ниже 5 нг/мл, в частности, ниже 3 нг/мл.

Все значения концентраций определены нефелометрией согласно ISO 7027. Таким образом, верхнее пороговое значение составляет 5 нг/мл, в частности, 3 нг/мл; все концентрации определены для показателей качества на основании объема препарата крови.

Дополнительный показатель качества представляет собой цитокин эотаксин. Предопределенный диапазон для эотаксина находится ниже 800 пг/мл, в частности, 500 пг/мл. Еще один показатель качества представляет собой PDGF-88. Предопределенный диапазон для PDGF-88 находится ниже 150 пг/мл, в частности, ниже 100 пг/мл. Дополнительный показатель качества представляет собой CXCL-10. Предопределенный диапазон для CXCL-10 находится ниже 150 пг/мл, в частности, ниже 100 пг/мл. Дополнительный показатель качества представляет собой цитокин IL-10. Предопределенный диапазон для IL-10 находится ниже 200 пг/мл. Еще один показатель качества представляет собой цитокин IL-13. Предопределенный диапазон для IL-13 находится ниже 80 пг/мл, в частности, ниже 50 пг/мл. Дополнительный показатель качества представляет собой IL-1b. Предопределенный диапазон для IL-1b находится ниже 30 пг/мл, в частности, ниже 20 пг/мл. Дополнительный показатель качества представляет собой IL-2. Еще один показатель качества представляет собой IL-4. IL-5 представляет собой еще один показатель качества. IL-7 представляет собой еще один показатель качества. Также IL-8 представляет собой еще один показатель качества. Дополнительный показатель качества представляет собой IL-9. По изобретению также IL-12p70 представляет собой показатель качества. Еще один показатель качества представляет собой IL-15. Один из показателей качества по изобретению представляет собой IL-17a. IL-21 представляет собой еще один показатель качества. Дополнительный показатель качества представляет собой основной FGF. Эпидермальный фактор роста (EGF) представляет собой дополнительный показатель качества. Еще один показатель качества представляет собой интерферон гамма (IFNγ). Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GCSF) представляет собой еще один показатель качества по изобретению. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) представляет собой дополнительный показатель качества по изобретению. Кроме того, MCP1 определяли как показатель качества. Еще один определяемый показатель качества представляет собой MIP1a. А также MIP1b. Дополнительный показатель качества представляет собой PDGF. Кроме того, IL-1RA представляет собой еще один показатель качества, и фактор некроза опухоли α (TNFα) представляет собой еще один показатель качества. Все эти факторы являются известными цитокинами, которые могут присутствовать в крови человека.

Факторы IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL12p70, IL-15, IL-17a, IL-21, основной FGF, EGF, IFNγ, GCSF, GM-CSF, MCP1, MIP1a, MIP1b, PDGF, IL-1RA, и TNFα находятся ниже 30 пг/мл, в частности, ниже 20 пг/мл.

Было обнаружено, что все вышеперечисленные цитокины влияют на культивирование, в частности, наращивание лимфоцитов, иммунных клеток или также стволовых клеток. Таким образом, эти цитокины могут присутствовать только до определенного верхнего порога. Другие показатели качества необходимо включить в препарат крови, по меньшей мере, в определенной степени. По одному из вариантов осуществления показатель качества представляет собой эстрадиол. Эстрадиол должен присутствовать в препарате крови с концентрацией, по меньшей мере, 65 пмоль/л. Предпочтительная концентрация для эстрадиола составляет, по меньшей мере, 75 пмоль/л. Более предпочтительно, концентрация эстрадиола составляет, по меньшей мере, 85 пмоль/л.

По одному из вариантов осуществления изобретения показатель качества представляет собой кортизол. Предопределенный диапазон для кортизола составляет, по меньшей мере, 190 нмоль/л, предпочтительно, по меньшей мере, 210 нмоль/л, более предпочтительно, по меньшей мере, 220 нмоль/л.

По одному из вариантов осуществления изобретения показатель качества представляет собой инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1). По одному из вариантов осуществления предопределенный диапазон для IGF-1 составляет, по меньшей мере, 100 мкг/л, предпочтительно, по меньшей мере, 130 мкг/л, более предпочтительно, по меньшей мере, 140 мкг/л.

Есть ряд дополнительных параметров, которым должна соответствовать среда для культивирования клеток по изобретению. В частности, стандартные факторы для культивирования должны находиться в предопределенных диапазонах. Таким образом, способ дополнительно содержит измерение стандартных факторов для культивирования и сравнение их с предопределенными диапазонами.

Примеры стандартных факторов для культивирования представляют собой белки, глюкозу, небелковый азот, азот мочевины, азот аминокислот, креатинин, креатин, мочевину, общие липиды, триглицерид, холестерин, липиды, этерифицированные компоненты, фосфолипиды, жирные кислоты, органические кислоты, пируват, цитрат, кетоны.

Предопределенный диапазон на основании общего объема среды для культивирования клеток составляет для белков от 60,0 до 80,0 г/л; для глюкозы от 4,5 до 5,5 ммоль/л, для небелкового азота от 15 до 30 ммоль/л, для азота мочевины от 3,5 до 7,0 ммоль/л, для азота аминокислот от 3,0 до 5,0 ммоль/л; для креатинина от 70,0 до 140,0 мкмоль/л; для креатина от 25,0 до 70,0 мкмоль/л; для мочевины от 3,0 до 5,0 мкмоль/л; для общих липидов от 4,5 до 8,5 г/л, для триглицеридов от 0,6 до 2,4 ммоль/л, для холестерина от 4,0 до 6,5 ммоль/л, липиды в концентрации от 0,3 до 0,4 ммоль/л, для этерифицированных компонентов от 0,7 до 0,8 ммоль/л, для фосфолипидов от 2,0 до 3,0 ммоль/л, для жирных кислот от 0,3 до 0,9 ммоль/л; для органических кислот от 4,0 до 6,0 ммоль/л, для пирувата от 0,1 до 0,2 ммоль/л, для цитрата от 0,1 до 0,2 ммоль/л, и для кетонов в концентрации от 0,3 до 0,5 ммоль/л.

По одному из вариантов осуществления изобретения этапы, которые должны быть выполнены более чем с одним препаратом крови и выбранным препаратом крови или обработанными препаратами крови, комбинируют для формирования среды для культивирования. От одного донора за один раз можно получать только приблизительно от 200 до 500 мл препарата крови. Таким образом, для культивирования клеток необходимо сочетать несколько препаратов крови от нескольких доноров. Для приготовления среды для культивирования клеток используют только выбранные препараты крови.

Если в невыбранном образце один или несколько показателей качества в препарате крови выходят за верхний предел, если это применимо, менее чем на 30%, более предпочтительно, менее чем на 20%, наиболее предпочтительно, менее чем на 10% от величины верхнего предела для показателя качества, препарат крови является временно невыбранным препаратом крови. Кроме того, если в невыбранном образце один или несколько показателей качества в препарате крови выходят за нижний предел, если это применимо, менее чем на 30%, более предпочтительно, менее чем на 20%, наиболее предпочтительно, менее чем на 10% от величины верхнего предела показателя качества, препарат крови является временно невыбранным препаратом крови. Временно невыбранный препарат крови может стать выбранным препаратом крови, если возможно смешать временно невыбранный препарат крови, по меньшей мере, с одним выбранным препаратом крови для получения смешанного препарата крови с показателями качества в определенных диапазонах. Иначе временно невыбранный препарат крови становится невыбранным препаратом крови.

Также возможно определять концентрацию, по меньшей мере, одного показателя качества в смеси продуктов. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к способу для приготовления среды для культивирования клеток, которая содержит смесь препаратов крови от двух или более доноров, включающему этапы

a) обеспечения, по меньшей мере, первой смеси препаратов крови от двух или более доноров;

b) измерения концентрации, по меньшей мере, одного показателя качества в первой смеси;

c) сравнения измеренной концентрации показателя качества с диапазоном концентраций, предопределенным для показателя качества;

d) выбора первой смеси для среды для культивирования клеток, если концентрация, измеренная для показателя качества находится в предопределенном диапазоне, в ином случае отмена выбора первой смеси.

Также, предпочтительно измерять концентрацию показателей качества непосредственно в препаратах крови перед добавлением препарата крови в смесь для формирования среды для культивирования. Также возможно проводить скрининг различных смесей препаратов крови и подтверждать, удовлетворяют ли они требованиям, которые определены показателями качества.

Препарат крови можно преобразовывать в обработанный препарат крови после отбора и перед добавлением к конечному продукту, т.е. к среде для культивирования клеток. Обработка препарата крови означает перевод одного типа препарата крови в другой тип препарата крови. Например, измеренный и выбранный препарат крови представляет собой цельную кровь, которую затем дополнительно преобразуют в плазму. Альтернативно, измеренный и выбранный препарат крови представляет собой цельную кровь, а обработанный препарат крови представляет собой сыворотку. Другой вариант заключается в том, что выбранный препарат крови представляет собой плазму, и обработанный препарат крови представляет собой сыворотку. Другой вариант заключается в том, что выбранный препарат крови представляет собой плазму, и обработанный препарат крови представляет собой подгруппу сыворотки. Также выбранный препарат крови может быть сывороткой, а обработанный препарат крови представляет собой подгруппу сыворотки.

Предпочтительно предоставляемый препарат крови представляет собой плазму. Плазму часто используют для культивирования, например, клеток иммунной системы. Кроме того, плазму можно легко извлекать у донора путем плазмафереза. Таким образом, обработанный препарат крови также представляет собой плазму. Использование плазмы имеет то преимущество, что не нужен дополнительный этап обработки. Таким образом, экономится этап обработки.

Предпочтительно тестируют два или более показателей качества, например, тестируют 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 показателей качества. Тестирование большего количества показателей качества увеличивает шанс получения конечной среды для культивирования клеток, которая фактически удовлетворяет стандартам высокого качества для культивирования и наращивает высоко активные лимфоциты. Однако тестирование большого количества факторов в одном образце также приводит к повышению сложности процесса. Таким образом, предпочтительно тестируют, менее чем 15, менее чем 12, менее чем 10, менее чем 8, менее чем 6 показателей качества.

По одному из вариантов осуществления изобретения число тестируемых показателей качества находится в диапазоне от двух до шести, предпочтительно, от трех до пяти, предпочтительно, равно четырем. Выявлено, что конкретной подгруппы известных показателей качества достаточно, чтобы выявить с высокой вероятностью, что среда для культивирования клеток представляет собой клеточную среду, подходящую для наращивания лимфоцитов или культивирования стволовых клеток. Показателями качества, которые приведены для того чтобы обеспечить свидетельство о том, что образец целиком представляет собой образец высокого качества, являются SHBG, IGF-1, CCL5 и IL-6. Таким образом, предпочтительно, показатель качества является SHBG. Также предпочтительным в виде показателя качества является IGF-1. Аналогично, CCL5 является предпочтительным показателем качества. IL-6 также является предпочтительным показателем качества. По одному из вариантов осуществления изобретения все тестируемые показатели качества представляют собой SHBG, IGF-1, CCL5 и IL-6.

Тест для показателя качества также можно использовать для отбора подходящих доноров, в частности, профессиональных доноров под наблюдением. Профессиональные доноры под наблюдением регулярно сдают препараты крови и записаны в регистре.

При помощи способа по изобретению можно идентифицировать при необходимости донора крови для донорства препаратов крови высокого качества. Таким образом, способ по изобретению относится к дополнительному этапу отбора на уровне донора.

По одному из вариантов осуществления способ включает отбор донора:

a) обеспечение препарата крови от донора;

b) измерение концентрации, по меньшей мере, одного показателя качества в препарате крови первого донора;

c) сравнение измеренной концентрации показателя качества с диапазоном концентраций, предопределенным для показателя качества;

d) отбор донора для донорства плазмы или сыворотки, если величина концентрации для пула плазмы или концентрация, концентрация, измеренная для показателя качества находится в предопределенном диапазоне, в ином случае отмена выбора первого донора.

Доноры, которых не отобрали, удаляются из регистра для препаратов крови высокого качества.

Настоящее изобретение также относится к среде для культивирования клеток, которая содержит, на основании объема среды для культивирования клеток:

- CCL5 в концентрации ниже 3 нг/мл;

- эотаксин в концентрации ниже 500 пг/мл,

- PDGF-88 и/или CXCL-10 в концентрации ниже 100 пг/мл;

- IL-10 в концентрации ниже 200 пг/мл;

- IL-13 в концентрации ниже 50 пг /мл;

- IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL12p70, IL-15, IL-17a, IL-21, основной FGF, EGF, IFNγ, GCSF, GM-CSF, MCP1, MIP1a, MIP1b, PDGF, IL1-RA, и/или TNFα в концентрации ниже 20 пг/мл;

- эстрадиол в концентрации, по меньшей мере, 65 пмоль/л, предпочтительно, по меньшей мере, 75 пмоль/л, более предпочтительно, по меньшей мере, 85 пмоль/л;

- кортизол в концентрации, по меньшей мере, 190 нмоль/л, предпочтительно, по меньшей мере, 210 нмоль/л, более предпочтительно, по меньшей мере, 220 нмоль/л;

- IGF-1 в концентрации, по меньшей мере, 100 мкг/л, предпочтительно, по меньшей мере, 130 мкг/л, более предпочтительно, по меньшей мере, 140 мкг/л; и/или

- SHBG в концентрации ниже 31 нмоль/л, предпочтительно ниже 29 нмоль/л.

Среда обеспечивает питательные вещества, необходимые для культивирования и наращивания T-клеток в контролируемом и искусственном окружении, что дает возможность стабильных и воспроизводимых результатов.

Среда для культивирования клеток предпочтительно представляет собой среду, полученную при помощи способа приготовления по изобретению. По одному из вариантов осуществления среда для культивирования клеток содержит, по меньшей мере, один препарат крови, в частности, плазму и/или сыворотка. Более предпочтительно препарат крови представляет собой сыворотку. По дополнительному варианту осуществления среда для культивирования клеток содержит препараты крови от двух или более доноров. Предпочтительно препараты крови от двух или более доноров выбраны из сыворотки и/или плазмы. Более предпочтительно, продукты от двух или более доноров являются сывороткой. По альтернативному варианту осуществления среда для культивирования клеток представляет собой синтетическую среду.

Существует ряд дополнительных параметров, которым должна удовлетворять среда для культивирования клеток по изобретению. В частности, стандартные факторы для культивирования должны находиться в предопределенных диапазонах. Примерами стандартных факторов для культивирования являются белки, глюкоза, небелковый азот, азот мочевины, азот аминокислот, креатинин, креатин, мочевина, общие липиды, триглицерид, холестерин, липиды, этерифицированные компоненты, фосфолипиды, жирные кислоты, органические кислоты, пируват, цитрат, кетоны.

Таким образом, среда для культивирования клеток по изобретению дополнительно содержит:

- белки в концентрации от 60,0 до 80,0 г/л;

- глюкозу в концентрации от 4,5 до 5,5 ммоль/л;

- небелковый азот в концентрации от 15 до 30 ммоль/л;

- азот мочевины в концентрации от 3,5 до 7,0 ммоль/л;

- азот аминокислот в концентрации от 3,0 до 5,0 ммоль/л;

- креатинин в концентрации от 70,0 до 140,0 мкмоль/л;

- креатин в концентрации от 25,0 до 70,0 мкмоль/л;

- мочевину в концентрации от 3,0 до 5,0 мкмоль/л;

- общие липиды в концентрации от 4,5 до 8,5 г/л;

- триглицериды в концентрации от 0,6 до 2,4 ммоль/л;

- холестерин в концентрации от 4,0 до 6,5 ммоль/л;

- липиды в концентрации от 0,3 до 0,4 ммоль/л;

- этерифицированные компоненты в концентрации от 0,7 до 0,8 ммоль/л;

- фосфолипиды в концентрации от 2,0 до 3,0 ммоль/л;

- жирные кислоты в концентрации от 0,3 до 0,9 ммоль/л;

- органические кислоты в концентрации от 4,0 до 6,0 ммоль/л;

- пируват в концентрации от 0,1 до 0,2 ммоль/л;

- цитрат в концентрации от 0,1 до 0,2 ммоль/л; и/или

- кетоны в концентрации от 0,3 до 0,5 ммоль/л.

Предпочтительно среда для культивирования клеток удовлетворяет всем вышеупомянутым параметрам. По одному из вариантов осуществления среда для культивирования клеток содержит любой один из:

- SHBG в концентрации ниже 29 нмоль/л;

- IGF-1 в концентрации, по меньшей мере, 100 мкг/л;

- IL-6 в концентрации ниже 20 пг/мл; и

- CCL5 в концентрации ниже 3 нг/мл.

По дополнительному варианту осуществления среда для культивирования клеток содержит:

- SHBG в концентрации ниже 29 нмоль/л;

- IGF-1 в концентрации, по меньшей мере, 100 мкг/л;

- IL-6 в концентрации ниже 20 пг/мл; и

- CCL5 в концентрации ниже 3 нг/мл.

Среда для культивирования клеток по изобретению может состоять из смеси препаратов крови. Предпочтительно среда для культивирования клеток содержит в дополнение к смеси препаратов крови дополнительные компоненты. По предпочтительному варианту осуществления дополнительные компоненты выбраны из воды, NaCl, PBS, DTT, TCEP или 2-меркаптоэтанола.

Среда для культивирования клеток по изобретению подходит для культивирования ряда различных клеток. Таким образом, изобретение дополнительно относится к применению среды для культивирования клеток для культивирования клеток. Главным преимуществом является то, что кроме культивирования иммортализованной линии клеток также можно успешно культивировать клетки, полученные от пациента, в частности, клетки иммунной системы или стволовые клетки.

При помощи среды по изобретению, в частности, среды, полученной путем способа по изобретению, были найдены гораздо более высокие скорости наращивания лимфоцитов. «Наращивание» или «клональное размножение», как используют в настоящем документе, означает продукцию дочерних клеток, исходно полученных из одиночной клетки. При клональном размножении лимфоцитов, все потомки обладают одинаковой антигенной специфичностью.

Кроме того, при помощи среды для культивирования по изобретению можно получать повышенное общее число клеток в культуре. В частности, можно получать повышенное общее число наращенных дочерних клеток лимфоцитов с одинаковой антигенной специфичностью.

Таким образом, по одному из вариантов осуществления применения клетки представляют собой клетки иммунной системы, в частности, лимфоциты. Предпочтительно, лимфоциты получены от пациента. По одному из вариантов осуществления лимфоциты выращивают, размножают и/или наращивают в среде для культивирования клеток.

По одному из вариантов осуществления среду для культивирования используют для наращивания T-клеток, полученных из опухоли. Предпочтительно, наращивание включает в себя использование цитокинового коктейля из IL-2, IL-15 и IL-21. По изобретению композиция из IL-2, IL-15 и IL-21 также обозначается как «цитокиновый коктейль».

Как используют в настоящем документе, «интерлейкин 2» или «IL-2» относится к человеческому IL-2 и к его функциональным эквивалентам. Как используют в настоящем документе, «интерлейкин 15» или «IL-15» относится к человеческому IL-15 и к его функциональным эквивалентам. Как используют в настоящем документе, «интерлейкин 21» или «IL-21» относится к человеческому IL-21 и к его функциональным эквивалентам.

Среда для культивирования клеток по изобретению, предпочтительно среда, полученная путем способа по изобретению, в частности, подходит для наращивания лимфоцитов в комбинации с цитокиновой смесью из IL-2, IL-15 и/или IL-21. Предпочтительно в комбинации с этой смесью цитокинов среда для культивирования клеток по изобретению обеспечивает повышенную скорость роста, повышенное общее число наращенных клеток, а также улучшенный профиль клеток. В частности, улучшается созревание и дифференцировка, определяемая фенотипом CD45RA/CCR7. Наконец, было найдено, что наращивание лимфоцитов со смесью цитокинов IL-2, IL-15 и IL-21 приводит к повышенной жизнеспособности клинически значимых лимфоцитов, в частности, T-клеток.

При активной клеточной иммунотерапии повышенные рост и скорость наращивания уменьшают время от получения образца лимфоцитов от пациента до момента возврата стандартных лимфоцитов пациенту. Повышенная жизнеспособность (клинически значимых) лимфоцитов приводит к увеличенному терапевтическому эффекту продукта активной иммунотерапии.

Множество модификаций и других вариантов осуществления, изложенного в настоящем документе изобретения, имеющие преимущество идей, представленных в вышеуказанном описании и связанных с ним чертежах, могут прийти на ум специалисту в области, к которой относится изобретение. Таким образом, следует понимать, что изобретение не ограничено конкретными раскрытыми вариантами осуществления и что модификации и другие варианты осуществления включены в объем прилагаемой формулы изобретения. Хотя в настоящем документе использованы конкретные термины, их используют только в общем и описательном смысле, а не с целями ограничения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Наращивание лимфоцитов в различных средах для культивирования клеток.

Проводили аферез со здоровым донором, примированным NY-ESO-1. После разделения компонентов крови продукт, содержащий лейкоциты, отделяли от остальных.

Клетки суспендировали в среде M1 с 1000 Ед/мл IL-2, 10 нг/мл IL-15 и 10 нг/мл IL-21. Среда, кроме того, содержала 10 мкмоль пептида NY-ESO-1. Клетки хорошо размножались, достигая концентрации 106/мл через 4 суток.

Параллельно наращивали лимфоциты в среде M2 по такому же протоколу. Не выявили значительного размножения лимфоцитов.

Пример 2 - Анализ композиции среды для культивирования клеток

Стандартные тесты не выявили никакого различия между средами для культивирования клеток. Среды M1 и M2 анализировали более подробно с использованием нефелометрии и антител к веществам, перечисленным как компоненты в таблице 1.

Компонент Единицы величины M1 M2
Триглицерид ммоль/л 1,1 0,99
Холестерин ммоль/л 4,1 2,8
ЛПВП-холестерин ммоль/л 1,1 0,9
ЛПНП-холестерин ммоль/л 2,5 1,5
Эстрадиол пмоль/л 86 57
T3 пмоль/л 11 12
T4 пмоль/л 4,4 4,5
Кортизол нмоль/л 231 179
Тестостерон нмоль/л 12 12
SHGB нмоль/л 26 31
Инсулин мИЕ/л 7,2 5,0
IGF-1 мкг/л 157 86
S-GH мкг/л 0,3 0,3

Таблица 1

Пример 3 - Анализ плазмы различных доноров

В соответствии с результатами анализа сред для культивирования клеток, получали образцы плазмы от различных профессиональных доноров под наблюдением и анализировали в отношении концентрации эстрадиола, кортизола, инсулина и IGF-1. Результаты представлены в таблице 2.

Компонент Единицы величины P1 P2 P3 P4 P5
Эстрадиол пмоль/л 53 56 58 88 87
Кортизол нмоль/ 231 233 177 235 230
Инсулин мИЕ/л 7,2 4,9 7,3 7,4 7,5
IGF-1 мкг/л 84 154 158 157 156

Таблица 2

Согласно способу по изобретению образцы плазма с P1 до P4 являются невыбранными. Образец плазмы P5 выбран для культивирования лимфоцитов.

Пример 4 - Анализ плазмы различных доноров

Для подтверждения отбора плазмы образцы плазмы с P1 по P5 затем приготовили для культивирования клеток. Лимфоциты, полученные из периферической крови здорового донора, примированного NY-ESO-1, культивировали по вышеописанному протоколу. Наращивание клеток в среде для культивирования из P5 было сравнимо с наращиванием в среде M1 (см. Пример 1).

1. Способ приготовления среды для культивирования лимфоцитов, которая содержит смесь препаратов крови от двух или более доноров, включающий этапы:

a) обеспечения по меньшей мере первого препарата крови от первого из доноров;

b) измерения концентрации по меньшей мере одного показателя качества в первом препарате крови, выбранного из группы, включающей эстрадиол, кортизол, IGF-1, инсулин и SHBG;

c) сравнения измеренной концентрации показателя качества с диапазоном концентраций, предопределенным для показателя качества:

– эстрадиол в концентрации по меньшей мере 65 пмоль/л, предпочтительно по меньшей мере 75 пмоль/л, более предпочтительно по меньшей мере 85 пмоль/л;

- кортизол в концентрации по меньшей мере 190 нмоль/л, предпочтительно по меньшей мере 210 нмоль/л, более предпочтительно по меньшей мере 220 нмоль/л;

- IGF-1 в концентрации по меньшей мере 80 мкг/л, предпочтительно по меньшей мере 120 мкг/л, более предпочтительно по меньшей мере 140 мкг/л; и/или

- SHBG в концентрации ниже 31 нмоль/л, предпочтительно ниже 29 нмоль/л;

d) выбора первого препарата крови для среды для культивирования лимфоцитов, если концентрация, измеренная для показателя качества, находится в предопределенном диапазоне, и, необязательно, преобразование первого выбранного препарата крови в первый обработанный препарат крови или иначе отмена выбора первого препарата крови,

где этапы a)–d) проводят более чем с одним препаратом крови от различных доноров и выбранный препарат крови или обработанные препараты крови комбинируют для формирования среды для культивирования.

2. Способ по п. 1, в котором препарат крови выбран из цельной крови, плазмы, сыворотки или их подгрупп.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором используют дополнительные показатели качества, выбранные из группы, состоящей из интерлейкина 6 (IL-6), интерферона-γ (IFNγ), агониста рецептора интерлейкина 1 (IL-1RA), интерлейкина 5 (IL-5), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), фактора некроза опухоли (TNFα), CCL5 (RANTES), интерлейкина 2 (IL-2) интерлейкина 1b (IL-1b), эотаксина, основного FGF, эпидермального фактора роста (EGF), тромбоцитарного фактора роста (PDGF-88), хемокина 10 с C-X-C мотивом (CXCL-10), интерлейкина 13 (IL-13), интерлейкина 4 (IL-4), MCP1, интерлейкина 8 (IL-8), MIP1a, интерлейкина 10, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), интерлейкина 15 (IL-15), интерлейкина 7 (IL-7) интерлейкина 12p70 (IL12p70), интерлейкина 17a (IL-17a), интерлейкина 9 (IL-9) и интерлейкина 21 (IL-21).

4. Способ по п. 3, в котором определенный диапазон концентраций на основании объема препарата крови составляет:

- ниже 3 нг/мл для CCL5,

- ниже 500 пг/мл для эотаксина,

- ниже 100 пг/мл для PDGF-88 и CXCL-10,

- ниже 200 пг/мл для IL-10,

- ниже 50 пг/мл для IL-13,

- ниже 20 пг/мл для IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL12p70, IL-15, IL-17a, IL-21, основного FGF, EGF, IFNγ, GCSF, GM-CSF, MCP1, MIP1a, MIP1b, PDGF, IL-1RA и TNFα.

5. Способ приготовления среды для культивирования лимфоцитов, которая содержит смесь препаратов крови от двух или более доноров, включающий этапы:

a) обеспечения по меньшей мере первой смеси препаратов крови от двух или более доноров;

b) измерения концентрации по меньшей мере одного показателя качества в первой смеси, выбранного из группы, включающей эстрадиол, кортизол, IGF-1, инсулин и SHBG;

c) сравнения измеренной концентрации показателя качества с диапазоном концентраций, предопределенным для показателя качества:

– эстрадиол в концентрации по меньшей мере 65 пмоль/л, предпочтительно по меньшей мере 75 пмоль/л, более предпочтительно по меньшей мере 85 пмоль/л;

- кортизол в концентрации по меньшей мере 190 нмоль/л, предпочтительно по меньшей мере 210 нмоль/л, более предпочтительно по меньшей мере 220 нмоль/л;

- IGF-1 в концентрации по меньшей мере 80 мкг/л, предпочтительно по меньшей мере 120 мкг/л, более предпочтительно по меньшей мере 140 мкг/л; и/или

- SHBG в концентрации ниже 31 нмоль/л, предпочтительно ниже 29 нмоль/л;

d) выбора первой смеси для среды для культивирования лимфоцитов, если концентрация, измеренная для показателя качества находится в предопределенном диапазоне, в ином случае отмена выбора первой смеси.

6. Способ по п. 5, в котором препарат крови выбран из цельной крови, плазмы, сыворотки или их подгрупп.

7. Способ по п. 5 или 6, в котором измеряют дополнительный показатель качества, выбранный из группы, состоящей из интерлейкина 6 (IL-6), интерферона-γ (IFNγ), агониста рецептора интерлейкина 1 (IL-1RA), интерлейкина 5 (IL-5), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), фактора некроза опухоли (TNFα), CCL5 (RANTES), интерлейкина 2 (IL-2) интерлейкина 1b (IL-1b), эотаксина, основного FGF, эпидермального фактора роста (EGF), тромбоцитарного фактора роста (PDGF-88), хемокина 10 с C-X-C мотивом (CXCL-10), интерлейкина 13 (IL-13), интерлейкина 4 (IL-4), MCP1, интерлейкина 8 (IL-8), MIP1a, интерлейкина 10, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), интерлейкина 15 (IL-15), интерлейкина 7 (IL-7) интерлейкина 12p70 (IL12p70), интерлейкина 17a (IL-17a), интерлейкина 9 (IL-9) и интерлейкина 21 (IL-21).

8. Способ по п. 7, в котором определенный диапазон концентраций на основании объема препарата крови составляет:

- ниже 3 нг/мл для CCL5,

- ниже 500 пг/мл для эотаксина,

- ниже 100 пг/мл для PDGF-88 и CXCL-10,

- ниже 200 пг/мл для IL-10,

- ниже 50 пг/мл для IL-13,

- ниже 20 пг/мл для IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL12p70, IL-15, IL-17a, IL-21, основного FGF, EGF, IFNγ, GCSF, GM-CSF, MCP1, MIP1a, MIP1b, PDGF, IL-1RA и TNFα.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что способ включает выбор донора, включающий:

a) обеспечение препарата крови от донора;

b) измерение концентрации по меньшей мере одного показателя качества в препарате крови первого донора, выбранного из группы, включающей эстрадиол, кортизол, IGF-1, инсулин и SHBG;

c) сравнение измеренной концентрации показателя качества с диапазоном концентраций, предопределенным для показателя качества:

– эстрадиол в концентрации по меньшей мере 65 пмоль/л, предпочтительно по меньшей мере 75 пмоль/л, более предпочтительно по меньшей мере 85 пмоль/л;

- кортизол в концентрации по меньшей мере 190 нмоль/л, предпочтительно по меньшей мере 210 нмоль/л, более предпочтительно по меньшей мере 220 нмоль/л;

- IGF-1 в концентрации по меньшей мере 80 мкг/л, предпочтительно по меньшей мере 120 мкг/л, более предпочтительно по меньшей мере 140 мкг/л; и/или

- SHBG в концентрации ниже 31 нмоль/л, предпочтительно ниже 29 нмоль/л;

d) выбор донора для донорства плазмы или сыворотки, если величина концентрации для пула плазмы или концентрация, измеренная для показателя качества находится в предопределенном диапазоне, в ином случае отмена выбора первого донора.

10. Среда для культивирования лимфоцитов, приготовленная способом по любому из пп. 1-8, которая содержит:

- эстрадиол в концентрации по меньшей мере 65 пмоль/л, предпочтительно по меньшей мере 75 пмоль/л, более предпочтительно по меньшей мере 85 пмоль/л;

- кортизол в концентрации по меньшей мере 190 нмоль/л, предпочтительно по меньшей мере 210 нмоль/л, более предпочтительно по меньшей мере 220 нмоль/л;

- IGF-1 в концентрации по меньшей мере 100 мкг/л, предпочтительно по меньшей мере 130 мкг/л, более предпочтительно по меньшей мере 140 мкг/л; и/или

- SHBG в концентрации ниже 31 нмоль/л, предпочтительно ниже 29 нмоль/л.

11. Среда для культивирования лимфоцитов по п. 10, содержащая по меньшей мере один препарат крови, в частности плазму и/или сыворотку.

12. Среда для культивирования лимфоцитов по п. 10 или 11, дополнительно содержащая:

- CCL5 в концентрации ниже 3 нг/мл;

– эотаксин в концентрации ниже 500 пг/мл;

– PDGF-88 и/или CXCL-10 в концентрации ниже 100 пг/мл;

– IL-10 в концентрации ниже 200 пг/мл;

- IL-13 в концентрации ниже 50 пг/мл;

- IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL12p70, IL-15, IL-17a, IL-21, основной FGF, EGF, IFNγ, GCSF, GM-CSF, MCP1, MIP1a, MIP 1b, PDGF, IL-1RA и/или TNFα в концентрации ниже 20 пг/мл.

13. Среда для культивирования лимфоцитов по любому из пп. 11–13, дополнительно содержащая:

- белки в концентрации от 60,0 до 80,0 г/л;

- глюкозу в концентрации от 4,5 до 5,5 ммоль/л;

- небелковый азот в концентрации от 15 до 30 ммоль/л;

- азот мочевины в концентрации от 3,5 до 7,0 ммоль/л;

- азот аминокислот в концентрации от 3,0 до 5,0 ммоль/л;

- креатинин в концентрации от 70,0 до 140,0 мкмоль/л;

- креатин в концентрации от 25,0 до 70,0 мкмоль/л;

- мочевину в концентрации от 3,0 до 5,0 мкмоль/л;

- общие липиды в концентрации от 4,5 до 8,5 г/л;

- триглицериды в концентрации от 0,6 до 2,4 ммоль/л;

- холестерин в концентрации от 4,0 до 6,5 ммоль/л;

- липиды в концентрации от 0,3 до 0,4 ммоль/л;

- этерифицированные компоненты в концентрации от 0,7 до 0,8 ммоль/л;

- фосфолипиды в концентрации от 2,0 до 3,0 ммоль/л;

- жирные кислоты в концентрации от 0,3 до 0,9 ммоль/л;

- органические кислоты в концентрации от 4,0 до 6,0 ммоль/л;

- пируват в концентрации от 0,1 до 0,2 ммоль/л;

- цитрат в концентрации от 0,1 до 0,2 ммоль/л; и/или

- кетоны в концентрации от 0,3 до 0,5 ммоль/л.

14. Среда для культивирования лимфоцитов по любому из пп. 10–13, дополнительно содержащая PBS.

15. Применение среды по любому из пп. 10–14 для культивирования лимфоцитов.

16. Применение по п. 15, где культивирование включает выращивание, размножение и/или наращивание лимфоцитов в среде для культивирования лимфоцитов.

17. Применение по п. 16, где культивирование осуществляют в присутствии по меньшей мере одного антигена и цитокинового коктейля из IL-2, IL-15 и IL-21.



 

Похожие патенты:

Патент ru2708199

Наверх