Связывающие молекулы, специфичные к ил-21, и области их применения

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая антитело или антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающееся с ИЛ-21, конъюгат для ингибирования функциональной активности ИЛ-21, содержащий вышеуказанное антитело, фармацевтическую композицию для лечения или профилактики аутоиммунного заболевания или расстройства или реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD), ассоциированной с ИЛ-21, способ лечения или профилактики аутоиммунного заболевания или расстройства у субъекта, способ определения уровней экспрессии ИЛ-21 и способ лечения или профилактики реакции «трансплантат против хозяина», ассоциированной с ИЛ-21. В одном из вариантов осуществления антитело содержит (a) CDR1, CDR2 и CDR3 участка VH, содержащие DYWMH (SEQ ID NO: 7), TIDPSDNYTIYSQNFKG (SEQ ID NO: 8) c заменой аспарагином (N) глютамина (Q) в положении 7 и YGFAMDY (SEQ ID NO: 9) соответственно; и (b) CDR1, CDR2 и CDR3 участка VL, содержащие RASQDISNFLN (SEQ ID NO: 12), YTSRLHS (SEQ ID NO: 13) и QQGHTLPRT (SEQ ID NO: 14). Изобретение расширяет арсенал средств для связывания с ИЛ-21. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 14 ил., 7 табл., 5 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] В настоящей заявке испрашивается приоритет на основании заявки на патент Соединенных Штатов Америки №61/976684, поданной 8 апреля 2014 г., полное содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДОСТАВЛЕННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[0002] Полное содержание предоставленного в электронном виде перечня последовательностей в текстовом файле ASCII (Название: IL21_100P1_seqlist.txt; размер: 55898 байт; № и дата создания 7 апреля 2014 г.), поданного вместе с заявкой, включено в настоящую заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] В настоящей заявке предложены композиции, которые специфически связываются с ИЛ-21 (интерлейкином-21), и способы применения таких композиций, например, для лечения или профилактики воспалительных или аутоиммунных заболеваний или расстройств.

[0004] ИЛ-21 принадлежит к семейству цитокинов, которое включает ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-9 и ИЛ-15, все из которых связываются с собственными (или общими) рецепторами в комплексе с общей гамма-цепью рецептора к цитокинам (γс). Большинство цитокинов в данном семействе исключительно важны как для сохранения, так и для функционирования Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и клеток NK (натуральных киллеров). Рецептор для ИЛ-21 широко распространен на лимфо-гемапоэтических и негемопоэтических клетках, и ИЛ-21 выполняет множество функций.

[0005] Например, взаимодействие ИЛ-21 с ИЛ-21R приводит к активации нескольких сигнальных путей, включая путь Jak/STAT (Davis, ID, et al., (2007) Clin Cancer Res 13, 3630-3636; Fuqua, CF, et al., (2008) Cytokine 44, 101-107; Habib, T, et al., (2002) Biochemistry 41, 8725-8731). Более конкретно, ИЛ-21 активирует STAT1, STAT3 и STAT5, на что указывает усиление фосфорилирования указанных молекул в клетке (Asao, Н, et al., (2001) J Immunol 167, 1-5; Diehl, SA, et al., (2008) J Immunol 180, 4805-4815; Scheeren, FA, et al., (2008) Blood 111, 4706-4715; Zeng, R, et al., (2007) Blood 109, 4135-4142). В частности, было показано, что активация STAT3 играет важнейшую роль в регулировании ответов В-лимфоцитов на ИЛ-21 (Avery, DT, et al., (2008) J Immunol 181, 1767-1779; Avery, DT, et al., J Exp Med 207, 155-171).

[0006] Кроме того, ИЛ-21 вносит вклад в сохранение и функционирование CD8+-Т-лимфоцитов памяти и клеток NK, способствует генерированию Th17 и Т-фолликулярных хелперов (Tfh) у мыши (и, вероятно, у человека) и подавляет генерирование регуляторных Т-лимфоцитов (Treg). Было показано, что ИЛ-21 модулирует активность клеток NK, включая эффекты на их созревание, рост и цитолитическую активность (Spolski, R, and Leonard, WJ, (2008) Curr Opin Immunol 20, 295-301). Кроме того, было показано, что ИЛ-21 способствует выработке ИФНγ (интерферона γ) как первичными клетками NK, так и линией клеток NK человека -NK-92 (Kasaian, МТ, et al., (2002) Immunity 16, 559-569; Strengell, M, et al., (2003) J Immunol 170, 5464-5469). Также ИЛ-21 оказывает целый ряд эффектов на негемапоэтические клетки, такие как клетки стромы, где он индуцирует воспаление за счет высвобождение металлопротеиназ матрикса (МПМ) (Monteleone et al., (2006) Gut 55, 1774-1780).

[0007] Одной недублируемой функцией ИЛ-21 является содействие активации, дифференцировке или гибели В-лимфоцитов во время гуморальных иммунных ответов. Действие ИЛ-21 на В-лимфоциты человека изучалось весьма активно. ИЛ-21 оказывает существенное влияние на выживание, активацию и пролиферацию В-лимфоцитов, а также на дифференцировку В-лимфоцитов в Ig-секретирующие плазмоциты (П) (Avery, DT, et al., (2008) J Immunol 181, 1767-1779; Avery, DT, et al., J Exp Med 207, 155-171); Bryant, VL, et al., (2007) J Immunol 179, 8180-8190; Ettinger, R, et al., (2005) J Immunol 175, 7867-7879; Parrish-Novak, J, et al., (2000) Nature 408, 57-63; Pene, J, et al., (2004) J Immunol 172, 5154-5157). Кроме того, усиление выработки ИЛ-21 характерно для определенных аутоиммунных заболеваний и, вероятно, вносит вклад в выработку аутоантител, а также в развитие патологических особенностей аутоиммунного заболевания. Активация В-лимфоцитов in vivo может запускаться вследствие взаимодействия с активированными Т-лимфоцитами, которые экспрессируют ко-стимулирующие молекулы, такие как CD40L, и приводить к выработке В-лимфоцит-тропных цитокинов, таких как ИЛ-21.

[0008] Гиперэкспрессия ИЛ-21 является признаком многих воспалительных, иммуно-обусловленных или аутоиммунных заболеваний или расстройств, и вероятно является важным пусковым механизмом для выработки антител, а также патологических признаков аутоиммунных заболеваний (Nakou et al., (2013) Clin. Exp. Rheumatol. 31, 172-179). Важная роль ИЛ-21 в стимуляции гуморального иммунного ответа делает его важной мишенью для терапевтических воздействий при состояниях, характеризующихся гиперпродукцией как ИЛ-21, так и патогенных аутоантител (Dolff et al., (2011) Arthritis Res. Ther. 13, R157; Kang et al., (2011) Arthritis Res. Ther. 13, R179; McGuire et al., (2011) Immunity 34, 602-615; Liu et al., (2012) Arthritis Res. Ther. 14, R255; Terrier et al., (2012) Arthritis Rheum. 64, 2001-2011; Li Q et al., (2013) PLoS One 8, e68145; Li Y et al., (2014) Neurol Sci. 35, 29-34). Следовательно, ожидается, что нейтрализация ИЛ-21 в условиях аутоиммунных реакций должна влиять на несколько популяций клеток, которые, как предполагается, участвуют в патогенезе иммуно-обусловленных заболеваний. Такие заболевания или расстройства включают, без ограничений, васкулит, например, вызванный антителами к цитоплазме нейтрофилов (ANCA) или гиганто-клеточный артериит (GCA), синдром Съегрена, воспалительное заболевание кишечника, обыкновенная пузырчатка, волчаночный. нефрит, псориаз, тиреоидит, диабет 1 типа, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ИТП), анкилозирующий спондилит, множественный склероз, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, болезнь Крона, тяжелую миастению, реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD).

[0009] Патогенез ассоциированного с антителами к цитоплазме нейтрофилов (ANCA) васкулита (AAV) характеризуется крупными аутоантителами к протеиназе 3 (PR3) и миелопероксидазе (МРО). В крови распространяются ИЛ-21-продуцирующие CD4+-Т-лимфоциты (Abdulahad et al., (2013) Arth Res & Ther 15:R70). В сыворотке пациентов с AAV присутствует повышенный уровень ИЛ-21 по сравнению со здоровым контролем, и экзогенный ИЛ-21 вызывает секрецию аутоантител ANCA in vitro в мононуклеарных клетках периферической крови, выделенной у пациентов с AAV in vitro. AAV включает в себя грануломатоз с полиангиитом, ранее называемый грануломатоз Вегенера, ГПА, эозинофильный грануломатоз с полиангиитом, известный как синдром Черджа-Стросса (CSS), и микроскопический полиангиит (МПА). Их обычно объединяют вместе, но эпидемиологически частота возникновения и распространение разные. Современное лечение включает кортикостероиды, биологические препараты, например, ритуксимаб, иммуносупрессоры, антибиотики или плазмаферез, но прогноз для пациентов остается плохим. Сохраняется потребность в поиске средств для лечения AAV.

[0010] Синдром Съегрена (СС) представляет собой аутоиммунное заболевание, которое характеризуется аутоантителами, такими как ревматоидный фактор (РФ), а также аутоантителами к нескольким ядерным антигенам, таким как Ro/La. СС является вторым по распространенности аутоиммунным заболеванием после ревматоидного артрита. В США по меньшей мере 1 миллион пациентов с первичным синдромом Съегрена, среди которых 90% - женщины. СС поражает слюнные железы, вызывая, например, сухость во рту и сухость глаз. Кроме того, СС может затрагивать другие органы, включая почки, кровеносные сосуды, легкие, печень, поджелудочную железу, периферическую нервную систему и головной мозг, и ассоциирован с другими аутоиммунными заболеваниям, такими как волчанка и ревматоидный артрит. Значительно повышенные уровни ИЛ-21 в сыворотке крови коррелируют с повышенным уровнем IgG1 и наличием аутоантител (Kang, 2011). Повышенный уровень ИЛ-21 и ИЛ-21R может обнаруживаться в эктопических очагах слюнных желез (Kang, 2011). Кроме того, известно, что ИЛ-21 принимает непосредственное участие в активации и цитотоксичности NK. В слюнных железах пациентов с первичным синдромом Съегрена обнаруживается увеличенное количество ткане-резидентных NK, которые избыточно экспрессируют рецептор NKp30, и коррелирует с показателем очага (Rusakiewicz et al., (2013) Sci. Transl. Med. 5, 195ra96). Указанные NK вовлечены в патогенез посредством прямого взаимного влияния NK и клеток стромы, который приводит к повреждению тканей. ИЛ-21 и его рецептор также экспрессируются в инфильтратах слюнных желез (Kang, 2011), и сообщалось, что ИЛ-21-продуцирующие CCR9+CD4+-Tfh-клетки памяти распространяются в кровеносном русле у большинства пациентов с СС (McGuire, 2011). Кроме того, повышенный уровень Tfh-клеток у пациентов с повышенным уровнем ИЛ-21 ассоциирован с проявлениями за пределами желез (Szabo et al., (2013) Clinical Immunol 147, 95-104). В доклинических исследованиях в моделях на животных была продемонстрирована польза от подавления ИЛ-21 (Liu et al. (2012) J Oral Pathol Med). Средств для излечения СС не существует; современные способы лечения обладают ограниченной эффективностью, и ни один из них не может считаться болезнь-модифицирующим. Легкое или умеренное заболевания лечат симптоматически при помощи препаратов, отпускаемых без рецепта. Тяжелое заболевание в настоящее время лечат гидроксихлорохином, стероидами, метотрексатом, азатиоприном или ритуксимабом, применяемым не по одобренным показаниям. Сохранятся потребность в поиске средств для лечения СС.

[0011] Нейтрализация ИЛ-21 обладает потенциальной практической ценностью при нескольких показаниях, включая первичный СС и васкулит (Kang, 2011; Bae et al., (2012) Allergy Asthma Immunol Res. 4, 351-356; Terrier, 2012; Abdulahad, 2013; Szabo, 2013).

[0012] Активно изучалось действие ИЛ-21 на реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD). Было показано, что, будучи доставленным при помощи гидродинамической генной системы, ИЛ-21 существенно ускоряет GVHD у человека на ксеногенный трансплантат мыши, а также было показано, что он увеличивает количество В-лимфоцитов, плазмоцитов и иммуноглобулина (Wu et al., (2013) Protein Cell 4, 863-871). Напротив, сообщалось, что блокирование ИЛ-21 в данной системе уменьшает повреждение желудочно-кишечного тракта, уровень цитокинов Th1 в селезенке, и защищает от летальных явлений (Hippen et al., (2012) Blood 119, 619-628). Кроме того, сообщалось, что защита от GVHD зависит от генерирования Tregs (Hippen et al., 2012).

[0013] В настоящей заявке предложены композиции, которые специфически связываются с ИЛ-21, и способы применения таких композиций, например, для лечения и профилактики воспалительных, иммуно-обусловленных или аутоиммунных заболеваний или расстройств.

[0014] Согласно конкретному аспекту настоящей заявки предложен способ лечения или профилактики GHVD при помощи композиции, содержащей антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с ИЛ-21. Например, на модели GHVD с ксеногенным трансплантатом мыши было показано, что анти-ИЛ-21 композиция блокирует вновь образующийся ИЛ-21 человека. Данная композиция потенциально подавляет GVHD-индуцированную изнуряющую болезнь и уменьшает смертность, когда ее вводят для лечения, а также для профилактики.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0015] Ниже в обобщенном виде приведены некоторые из основных аспектов настоящего изобретения. Дополнительные аспекты описаны в разделах «Подробное описание изобретения», «Примеры», «Чертежи» и «Формула изобретения» настоящей заявки. Описание в каждом разделе настоящей заявки следует читать совместно с другими разделами. Кроме того, разные варианты реализации, раскрываемые в каждом разделе настоящей заявки, могут сочетаться другими разными путями, и предполагается, что все такие сочетания попадают в сферу настоящего изобретения.

[0016] Согласно настоящей заявке предложены связывающие ИЛ-21 молекулы, например, анти-ИЛ-21-антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, например, моноклональные антитела, способные ингибировать взаимодействие ИЛ-21 и его рецептора и ингибировать активность ИЛ-21.

[0017] В некоторых вариантах реализации отдельная связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с эпитопом ИЛ-21, где связывающая молекула специфически связывается с тем же эпитопом ИЛ-21, что и антитело или антитело-связывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL) 19Е3, 9F11, 8 В6 или 9Н10.

[0018] В некоторых вариантах реализации отдельная связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с эпитопом ИЛ-21, конкурентно ингибирует связывание ИЛ-21 с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, содержит VH и VL 19Е3, 9F11, 8 В6 или 9Н10. В некоторых вариантах реализации VH и VL 19Е3 содержат последовательности SEQ ID №:6 и 11, соответственно, VH и VL 9F11 содержат SEQ ID №:28 и 33, соответственно, VH и VL 8 В6 содержат SEQ ID №:42 и 47, соответственно, a VH и VL 9Н10 содержат SEQ ID №:52 и 57, соответственно.

[0019] В некоторых вариантах реализации отдельная связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с ИЛ-21, содержит VL антитела, где указанный VL содержит аминокислотные последовательности VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением замены четырех, трех, двух или одной аминокислоты в VL-CDRS: SEQ ID №:12, 13 и 14, SEQ ID №:34, 35 и 36, SEQ ID №:48, 49 и 50, или SEQ ID №:58, 59 и 60, соответственно.

[0020] В некоторых вариантах реализации отдельная связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с ИЛ-21, содержит VJ антитела, где указанный VH содержит аминокислотные последовательности VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением замены четырех, трех, двух или одной аминокислоты в VH-CDRS: SEQ ID №:7, 8 и 9, SEQ ID №:29, 30 и 31, SEQ ID №:43, 44 и 45 или SEQ ID №:53, 54 и 55, соответственно.

[0021] В некоторых вариантах реализации отдельная связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с ИЛ-21, содержат VL антитела, где указанный VL содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или 100% идентичную эталонной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №:11, SEQ ID №:17, SEQ ID №:21, SEQ ID №:25, SEQ ID №:33, SEQ ID №:39, SEQ ID №:40, SEQ ID №:47 и SEQ ID №:57.

[0022] В некоторых вариантах реализации отдельная связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с ИЛ-21, содержит VH антитела, где указанный VH содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или 100% идентичную эталонной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №:6, SEQ ID №:15, SEQ ID №:19, SEQ ID №:23, SEQ ID №:28, SEQ ID №:37, SEQ ID №:38, SEQ ID №:42 и SEQ ID №:52.

[0023] В некоторых вариантах реализации указанная связывающая молекула или ее фрагмент содержат антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

[0024] В некоторых вариантах реализации отдельная связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с ИЛ-21, содержат VL и VH, содержащие аминокислотные последовательности VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением замены четырех, трех, двух или одной аминокислоты в одном или более CDR: SEQ ID №:12, 13, 14, 7, 8 и 9, SEQ ID №:34, 35, 36, 29, 30 и 31, SEQ ID №:48, 49, 50, 43, 44 и 45, или SEQ ID №:58, 59, 60, 53, 54 и 55, соответственно.

[0025] В некоторых вариантах реализации отдельная связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с ИЛ-21, где указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит VH и VL, где указанные VH и VL содержат, соответственно, аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или 100% идентичные эталонным аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID №:6 и SEQ ID №:11, SEQ ID №:15 и SEQ ID №:17, SEQ ID №:19 и SEQ ID №:21, SEQ ID №:23 и SEQ ID №:25, SEQ ID №:28 и SEQ ID №:33, SEQ ID №:37 и SEQ ID №:39, SEQ ID №:38 и SEQ ID №:39, SEQ ID №:37 и 40, SEQ ID №:42 и SEQ ID №:47, и SEQ ID №:52 и SEQ ID №:57, соответственно.

[0026] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VH и VL, где указанный VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №:19, а указанный VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №:21. В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат константный участок тяжелой цепи или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации указанный константный участок тяжелой цепи или его фрагмент являются константным участком IgG. В некоторых вариантах реализации константный домен IgG содержит одну или более аминокислотную замену по сравнению с константным доменом IgG дикого типа, где указанный модифицированный IgG демонстрирует увеличенное время полувыведения по сравнению с временем полувыведения IgG, содержащим константный домен IgG дикого типа. В некоторых вариантах реализации константный домен IgG содержит одну или более замен аминокислотных остатков в положениях 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 и 428-436, где нумерация положения аминокислот соответствует указателю ЕС, как указано у Кэбота. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одну аминокислотную замену в указанном константном домене IgG выбирают из группы, состоящей из:

(a) замены аминокислоты в положении по Кэботу 252 на тирозин (Y), фенилаланин (F), триптофан (W) или треонин (Т),

(b) замены аминокислоты в положении по Кэботу 254 на треонин (Т),

(c) замены аминокислоты в положении по Кэботу 256 на серии (S), аргинин (R), глутамин (Q), глутаминовую кислоту (Е), аспарагиновую кислоту (D) или треонин (Т),

(d) замены аминокислоты в положении по Кэботу 257 на лейцин (L),

(e) замены аминокислоты в положении по Кэботу 309 на пролин (Р),

(f) замены аминокислоты в положении по Кэботу 311 на серии (S),

(g) замены аминокислоты в положении по Кэботу 428 на треонин (Т), лейцин (L), фенилаланин (F) или серии (S),

(h) замены аминокислоты в положении по Кэботу 433 на аргинин (R), серии (S), изолейцин (I), пролин (Р) или глутамин (Q),

(i) замены аминокислоты в положении по Кэботу 434 на трипотофан (W), метионин (М), серии (S), гистидин (Н), фенилаланин (F) или тирозин, и

(j) сочетание двух или более из указанных замен.

[0027] В некоторых вариантах реализации указанный константный домен в IgG человека содержит аминокислотные замены по сравнению с константным доменом IgG человека дикого типа в положениях по Кэботу 252, 254 и 256, причем

(a) аминокислота в положении по Кэботу 252 заменена на тирозин (Y),

(b) аминокислота в положении по Кэботу 254 заменена на треонин (Т), и

(c) аминокислота в положении по Кэботу 256 заменена на глутаминовую кислоту (Е).

[0028] В некоторых вариантах реализации указанный константный домен в IgG человека является константным доменом IgG1 человека.

[0029] В некоторых вариантах реализации указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID №:16, SEQ ID №:20 или SEQ ID №:24. В некоторых вариантах реализации константный участок указанной легкой цепи выбирают из группы, состоящей из константного участка каппа человека и константного участка лямбда человека. В некоторых вариантах реализации константный участок указанной легкой цепи является константным участком каппа человека. В некоторых вариантах реализации тяжелая и легкая цепь содержат аминокислотные последовательности SEQ ID №:16 и SEQ ID №:18, SEQ ID №:20 и SEQ ID №:22, или SEQ ID №:24 и SEQ ID №:26, соответственно.

[0030] В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются антителом мыши, гуманизированным антителом, химерным антителом, моноклональным антителом, поликлональным антителом, рекомбинантным антителом, мультиспецифичным антителом или их антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах реализации указанным антигенсвязывающим фрагментом является Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv и sc(Fv)2.

[0031] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с ИЛ-21 человека и ИЛ-21 яванской макаки.

[0032] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его фрагмент не связываются специфически с ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-9 или ИЛ-15 человека.

[0033] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его фрагмент подавляют связывание ИЛ-21 с рецептором ИЛ-21.

[0034] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его фрагмент являются антагонистом активности ИЛ-21.

[0035] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его фрагмент могут ингибировать ИЛ-21-опосредуемое фосфорилирование STAT3 в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) человека.

[0036] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его фрагмент могут ингибировать опосредуемое ИЛ-21 человека и яванской макаки фосфорилирование STAT3 в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) человека.

[0037] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его фрагмент могут ингибировать IL-21-опосредуемую выработку интерферона-гамма (ИФН-γ) клетками NK.

[0038] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его фрагмент могут ингибировать опосредуемую ИЛ-21 человека и яванской макаки выработку интерферона гамма (ИФН-γ) клетками NK. В некоторых вариантах реализации указанными клетками NK являются клетки NK-92 в культуре.

[0039] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его фрагмент могут ингибировать ИЛ-21-опосредуемую дифференцировку В-лимфоцитов в плазмоциты.

[0040] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его фрагмент могут ингибировать опосредуемую ИЛ-21 человека и яванской макаки дифференцировку В-лимфоцитов в плазмоциты.

[0041] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его фрагмент могут ингибировать активируемую CD4+Т-лимфоцитами дифференцировку В-лимфоцитов в плазмоциты.

[0042] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с ИЛ-21 человека со сродством, которое характеризуется константой диссоциации (K_D) приблизительно от 100 пМ приблизительно до 0,1 пМ, измеренной при помощи платформы анализа кинетического исключения (KinExA) 3000.

[0043] В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с ИЛ-21 яванской макаки со сродством, которое характеризуется константой диссоциации (K_D) приблизительно от 100 пМ приблизительно до 0,1 пМ, измеренной при помощи платформы анализа кинетического исключения (KinExA) 3000.

[0044] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладают K_D в отношении ИЛ-21 человека приблизительно 0,515 пМ и K_D к ИЛ-21 яванской макаки приблизительно 0,352 пМ.

[0045] В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его фрагмент конъюгированы с агентом, выбранным из группы, состоящей из противомикробного агента, терапевтического агента, пролекарства, пептида, белка, фермента, липида, модификатора биологического ответа, фармацевтического агента, лимфокина, гетерологичного антитела или его фрагмента, детектируемой метки, полиэтиленгликоля (ПЭГ) и сочетания двух или более из перечисленных агентов.

[0046] В некоторых вариантах реализации композиция содержит антитело или его фрагмент, описываемые в настоящей заявке, и носитель. Предпочтительно, указанный носитель является фармацевтически приемлемым носителем.

[0047] В некоторых вариантах реализации выделенный полинуклеотид содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую VL антитела, где указанный VL содержит аминокислотные последовательности VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены в одном или более из указанных VL-CDR, последовательностям: SEQ ID №:12, 13 и 14, SEQ ID №:34, 35 и 36, SEQ ID №:48, 49 и 50, или SEQ ID №:58, 59 и 60, соответственно.

[0048] В некоторых вариантах реализации выделенный полинуклеотид содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую VH антитела, где указанный VH содержит аминокислотные последовательности VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены в одном или более из указанных VH-CDR, последовательностям: SEQ ID №:7, 8 и 9, SEQ ID №:29, 30 и 31, SEQ ID №:43, 44, и 45, или SEQ ID №:53, 54 и 55, соответственно.

[0049] В некоторых вариантах реализации выделенный полинуклеотид содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую VL антитела, где указанный VL содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или 100% идентичную эталонной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №:11, SEQ ID №:17, SEQ ID №:21, SEQ ID №:25, SEQ ID №:33, SEQ ID №:39, SEQ ID №:40, SEQ ID №:47 и SEQ ID №:57. В некоторых вариантах реализации выделенный полинуклеотид содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую VH антитела, где указанный VH содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или 100% идентичную эталонной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №:6, SEQ ID №:15, SEQ ID №:19, SEQ ID №:23, SEQ ID №:28, SEQ ID №:37, SEQ ID №:38, SEQ ID №:42 и SEQ ID №:52.

[0050] В некоторых вариантах реализации полинуклеотид, описываемый в настоящей заявке, содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL, описываемые в настоящей заявке, которые могут специфически связываться с ИЛ-21. В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с тем же эпитопом, что и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL19E3, 9F11, 8В6 или 9Н10.

[0051] В некоторых вариантах реализации полинуклеотид, описываемый в настоящей заявке, содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие указанный VH или указанный VL, которые связываются с ИЛ-21 человека или яванской макаки.

[0052] В некоторых вариантах реализации предложен вектор, содержащий полинуклеотид, описываемый в настоящей заявке.

[0053] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая полинуклеотид, описываемый в настоящей заявке, или вектор, описываемый в настоящей заявке.

[0054] В некоторых вариантах реализации предложен полинуклеотид или сочетание полинуклеотидов, кодирующих связывающую молекулу или ее антигенсвязывающий фрагмент.

[0055] В некоторых вариантах реализации предложен полинуклеотид или сочетание полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящей заявке.

[0056] В некоторых вариантах реализации композиция содержит полинуклеотид, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую VH, и полинуклеотид, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую VL, где указанные VL и VH содержат аминокислотные последовательности VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены в одном или более CDR, последовательностям: SEQ ID №:12, 13, 14, 7, 8 и 9, SEQ ID №:34, 35, 36, 29, 30 и 31, SEQ ID №:48, 49, 50, 43, 44 и 45, или SEQ ID №:58, 59, 60, 53, 54 и 55, соответственно.

[0057] В некоторых вариантах реализации композиция содержит полинуклеотид, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую VH, и полинуклеотид, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую VL, где VL и VH содержат, соответственно, аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или 100% идентичные эталонным аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID №:6 и SEQ ID №:11, SEQ ID №:15 и SEQ ID №:17, SEQ ID №:19 и SEQ ID №:21, SEQ ID №:23 и SEQ ID №:25, SEQ ID №:28 и SEQ ID №:33, SEQ ID №:37 и SEQ ID №:39, SEQ ID №:38 и SEQ ID №:39, SEQ ID №:37 и 40, SEQ ID №:42 и SEQ ID №:47 и SEQ ID №:52 и SEQ ID №:57, соответственно.

[0058] В некоторых вариантах реализации указанные VH и VL кодируются нуклеотидными последовательностями, которые по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или 100% идентичны эталонным нуклеотидным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID №:5 и SEQ ID №:10, SEQ ID №:27 и SEQ ID №:32, SEQ ID №:41 и SEQ ID №:46, или SEQ ID №:51 и SEQ ID №:56, соответственно.

[0059] В некоторых вариантах реализации полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую VH, и полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую VL, находятся в одном векторе. В некоторых вариантах реализации предложен вектор, описываемый в настоящей заявке.

[0060] В некоторых вариантах реализации полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую VH, и полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую VL, находятся в разных векторах. В некоторых вариантах реализации предложены векторы, описываемые в настоящей заявке.

[0061] В некоторых вариантах реализации композиции, описываемые в настоящей заявке, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат указанный VH и указанный VL, которые могут специфически связываться с ИЛ-21. В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH или VL, могут связываться с ИЛ-21 человека или яванской макаки.

В некоторых вариантах реализации указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут специфически связываться с тем же эпитопом, что и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH или VL 19Е3, 9F11, 8 В6 или 9Н10.

[0062] В некоторых вариантах реализации предложены клетки-хозяева, содержащие полинуклеотиды, описываемые в настоящем изобретении, композиции, описываемые в настоящем изобретении, или вектор или векторы, описываемые в настоящем изобретении.

[0063] В некоторых вариантах реализации способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, включает (а) культивирование клетки, описываемой в настоящей заявке; и (б) выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0064] В некоторых вариантах реализации предложен диагностический агент или набор, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящей заявке.

[0065] В некоторых вариантах реализации способ уменьшения индуцированного ИЛ-21 фосфорилирования STAT3 в ИЛ-21R-экспрессирующей клетке включает приведение указанной клетки в контакт со связывающей молекулой или ее антигенсвязывающим фрагментом, описываемыми в настоящей заявке, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, описываемыми в настоящей заявке, или композицией, описываемой в настоящей заявке.

[0066] В некоторых вариантах реализации способ уменьшения ИЛ-21-опосредуемой выработки ИФН-γ клетками NK включает приведение указанной клетки NK в контакт со связывающей молекулой или ее антигенсвязывающим фрагментом, описываемыми в настоящей заявке, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, описываемыми в настоящей заявке, или композицией, описываемой в настоящей заявке.

[0067] В некоторых вариантах реализации способ уменьшения ИЛ-21-опосредуемой дифференцировки необученных В-лимфоцитов или В-лимфоцитов памяти включает приведение указанного необученного В-лимфоцита или В-лимфоцита памяти в контакт со связывающей молекулой или ее антигенсвязывающим фрагментом, описываемыми в настоящей заявке, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, описываемыми в настоящей заявке, или композицией, описываемой в настоящей заявке.

[0068] В некоторых вариантах реализации дифференцировка плазмоцитов активируется CD4+ Т-лимфоцитами.

[0069] В некоторых вариантах реализации способ лечения воспалительного, иммуно-обусловленного или аутоиммунного заболевания или расстройства у субъекта включает введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества связывающей молекулы или ее антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, или композиции, описываемой в настоящей заявке.

[0070] В некоторых вариантах реализации способ профилактики воспалительного, иммуно-обусловленного или аутоиммунного заболевания или расстройства у субъекта включает введение субъекту, предрасположенному к такому заболеванию или расстройству, эффективного количества связывающей молекулы или ее антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, или композиции, описываемой в настоящей заявке.

[0071] В некоторых вариантах реализации указанным аутоиммунным заболеванием является синдром Съегрена (СС), васкулит (ANCA/GCA), системная красная волчанка или волчаночный нефрит, ревматоидный артрит (РА), болезнь Крона, тяжелая миастения или любое их сочетание.

[0072] В некоторых вариантах реализации указанным иммуно-обусловленным заболеванием или расстройством является GVHD.

[0073] В некоторых вариантах реализации указанный способ профилактики GVHD включает уменьшение или исключение симптомов GVHD.

[0074] В определенном случае уменьшаемыми или исключаемыми симптомами GHVD являются сыпь, волдыри, потеря аппетита, рвота, раннее чувство переполнения желудка после еды, диарея, дискомфорт в животе, вздутие живота, кровь в кале, желтуха, темная моча, дискомфорт в верхней части живота, увеличение массы тела за счет жидкости (отеки), напоминающие артрит симптомы, боль и скованность, сухость глаз, раздражение глаз, язвы во рту, стойкий кашель, одышка, затрудненное дыхание.

[0075] В некоторых вариантах реализации способ подавление прироста массы тела в связи с GHVD включает введение субъекту, страдающему GHVD или предрасположенному к GHVD, связывающей молекулы или ее антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, или композиции, описываемой в настоящей заявке.

[0076] В некоторых вариантах реализации способ уменьшения анемии в связи с GHVD включает введение субъекту, страдающему GHVD или предрасположенному к GHVD, связывающей молекулы или ее антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, или композиции, описываемой в настоящей заявке.

[0077] В некоторых вариантах реализации способ подавления распространения Т-лимфоцитов включает введение субъекту, страдающему GHVD или предрасположенному к GHVD, связывающей молекулы или ее антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, или композиции, описываемой в настоящей заявке.

[0078] В некоторых вариантах реализации способ уменьшения уровня цитокинов у субъекта, страдающего GHVD или предрасположенного к GHVD, включает введение данному субъекту связывающей молекулы или ее антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описываемых в настоящей заявке, или композиции, описываемой в настоящей заявке.

[0079] В некоторых вариантах реализации способ определения уровня экспрессии ИЛ-21 в пробе включает (а) приведение указанной пробы в контакт со связывающей молекулой или ее антигенсвязывающим фрагентом, описываемыми в настоящей заявке, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, описываемыми в настоящей заявке, или композицией, описываемой в настоящей заявке, и (б) определение связывания с ИЛ-21 в указанной пробе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ/ФИГУР

[0080] На ФИГ. 1А показано выравнивание вариабельных участков моноклонального антитела мыши 9F11 (VH: SEQ ID №:28, VL: SEQ ID №:33) и трех гуманизированных вариантов (VH-4 и VH-11: SEQ ID №:41, VH-6: SEQ ID №:42, VL-4 и VL-6: SEQ ID №:43, VL-11: SEQ ID №:44). Остатки, которые различаются между антителами человека и мыши в каркасных участках, выделены . Обратные мутации у мыши в каркасных участках выделены жирным шрифтом, а участки CDR - . На ФИГ. 1 В показано выравнивание вариабельных участков моноклонального антитела мыши 19Е3 (VH: SEQ ID №:6, VL: SEQ ID №:11) и трех гуманизированных вариантов VH (SEQ ID №61, 62 и 63) и двух гуманизированных вариантов VL (SEQ ID №:64 и 65). Остатки, которые различаются между антителами человека и мыши в каркасных участках, выделены . Обратные мутации у мыши в каркасных участках выделены жирным шрифтом, а участки CDR - .

[0081] На ФИГ. 2А и ФИГ. 2В показаны результаты анализа KinExA Dual Curve Fit для концентраций 500 фМ и 50 пМ IgG K44VHa-N56Q (MEDI7169) при конкуренции в жидкой фазе с ИЛ-21 человека (ФИГ. 2А) и яванской макаки (ФИГ 2В).

[0082] На ФИГ. 3А показано действие ИЛ-21 человека и яванской макаки на фосфорилирование STAT3 МКПК человека. НА ФИГ 3В показано подавление вызванной ИЛ-21 человека и яванской макаки активации фосфорилирования STAT3 МКПК человека анти-ИЛ-21 антителами K2Ha-N56Q (перевернутые треугольники), K44VHa-N56Q (MEDI7169) (ромбы) и K44VHa6-N56Q (кружки).

[0083] На ФИГ. 4 показано подавление выработки ИФНγ клетками NK-92, вызванной ИЛ-21 человека (ФИГ. 4А) и яванской макаки (ФИГ. 4В).

[0084] На ФИГ. 5 показано подавление ИЛ-21-индуцированной дифференцировки В-лимфоцитов человека в плазмоциты под действием ИЛ-21 человека (ФИГ 5А) или яванской макаки. На графиках показано снижение уровня IgD^- CD38^hi PC по сравнению с контролем. На ФИГ 5С показано, что в контрольных условиях, при стимуляция ИЛ-21, анти CD40 и анти-IgM антитела приводят к выработке IgG в диапазоне 30-40 мкг/мл к 6-ому дню, а 19Е3.1 и 9F11.1 подавляют выработку Ig.

[0085] На ФИГ. 6А показано, что совместное культивирование В-лимфоцитов с активированными CD4+Т-лимфоцитами приводит к появлению популяции IgD^- CD38^hi PC, причем 68,5% из CD19+-клеток экспрессирует данный генотип плазмоцитов к 7-ому дню. На ФИГ. 6В и 6С показано подавление дифференцировки плазмоцитов при добавлении 19Е3.1 или 9F11.1.

[0086] На ФИГ. 7 показано, что анти-ИЛ21 антитело (19Е3.1) блокирует ИЛ-21 - индуицированное распространение Т-лимфоцитов.

[0087] Т-лимфоциты человека стимулировали рекомбинантным ИЛ-21 человека в сочетании с анти-CD3. Антитело 19Е3.1 добавляли в указанных концентрациях, и распространение Т-клеток оценивали количественно на 4-ый день. Все условия проверяли в двух повторах. Эксперимент проводили с двумя уникальными донорами. Показан один репрезентативный донор.

На ФИГ. 8 показано, что K44VHa-N56Q (MEDI7169) блокирует GVHD-индуцированную изнуряющую болезнь за счет ограничения распространения CD4+-T-лимфоцитов. МКПК донора 1 (12,71×10⁶) или донора 2 (13,46×10⁶) переносили в организм мыши NOD/SCID/γc в день исследования 0. Мыши получали 200 мкг каждого из контрольных моноклональных антител (ФИГ. 8А) или K44VHa-N56Q (ФИГ. 8В), вводимых три раза в неделю, начиная с дня 1. У мышей отбирали кровь раз в две недели и проводили проточную цитометрию с целью определения числа и фенотипа CD45+-лимфоцитов человека. На ФИГ. 8С и ФИГ. 8D показан процент CD45+-лимфоцитов человека, отобранных у мышей, получавших контрольное моноклональное антитело или K44VHa-N56Q, соответственно (от 21-ого дня, донор 1; n=3 контрольное моноклональное антитело, n=5 K44VHa-N56Q). На ФИГ. 8Е и ФИГ. 8F показан процент CD4+ или CD8+ клеток во фракции CD45+-лимфоцитов человека у мышей, получавших контрольное моноклональное антитело или K44VHa-N56Q, соответственно, (от 35-ого дня, донор 2; n=10 контрольное моноклональное антитело + основа ФСБ/n=5 K44VHa-N56Q). При всех условиях отбирались 100 мкл крови и проводилась проточная цитометрия в течение того же времени, так что показанное количество событий отражает относительное количество клеток. Среднее ± стандартная ошибка абсолютных количеств СБ45+-лимфоцитов человека, отобранных из крови на 21-ый день для донора 1, контрольное моноклональное антитело, n=3 (729 111±113899) и K44VHa-N56Q, n=5 (39,104±5,159), Р<0.0357. Для донора 2 контрольное моноклональное антитело и ФСБ объединены, n=10 (237,294±35,628) и K44VHa-N56Q, n=5, (14,980±2,275) Р=0.0007.

[0088] На ФИГ. 9 показано, что K44VHa-N56Q обратимо подавляет распространение клеток человека в организме мышей-реципиентов. МКПК донора 2 (13,46×10⁶) переносили в организм мышей NOD/SCID/γc в день исследования 0. Мы получали 200 мкл основы ФСБ (квадраты) или 200 мкг антитела K44VHa-N56Q (треугольники) или контрольного моноклонального антитела (кружки), вводимых три раза в неделю, с дня -+1 до дня 44. У мышей отбирали кровь раз в две недели и проводили проточную цитометрию с целью определения числа и фенотипа CD45+-лимфоцитов человека. Данные показывают количество отобранных клеток человека. При всех условиях окрашивались 100 мкл крови, и такой же объем отбирали на проточном цитометре, так что показанное количество событий отражает относительное количество клеток.

[0089] На ФИГ. 10 показано, что K44VHa-N56Q защищает от GVHD-индуцированной потери массы и гибели. МКПК донора 1 (12,71×10⁶) переносили в организм мышей NOD/SCID/γc в день исследования 0, и прослеживали потерю массы тела мышей (ФИГ. 10А) и гибель (ФИГ. 10В). Антитела K44VHa-N56Q (треугольники) или контрольное моноклональное антитело (заштрихованные кружки) вводили три раза в неделю, с дня -+1 до дня 31. Животные, не подвергаемые воздействию (белые кружки), не получали клеток человека и никаких моноклональных антител. Процент выживания показывает либо, когда мыши погибали, либо когда достигали 20% потери массы тела и были умерщвлены. Показан один из двух независимых экспериментов от двух разных доноров МКПК.

[0090] На ФИГ. 11 показано подавление пролиферации клеток и выработки цитокинов под действием K44VHa-N56Q. МКПК донора 2 (13,46×10⁶) переносили в организм мышей NOD/SCID/γc в день исследования 0 и проводили инъекцию либо 200 мкг K44VHa-N56Q, или контрольного моноклонального антитела три раза в неделю, начиная с дня 1. У мышей отбирали кровь, и количество цитокинов в сыворотке оценивали, чтобы определить наличие цитокинов, при помощи набора MILLIPLEX MAP с Th17 человека компании «Millipore». Уровень в сыворотке (пг/мл) показан для ИЛ-21 (ФИГ. 11А), интерферона гамма (ФИГ. 11В), фактора некроза опухоли альфа (ФИГ. 11С), ИЛ-9 (ФИГ. 11D), гранулоцитарно-макрофагового колоние-стимулирующнго фактора (ФИГ. 11Е), ИЛ-10 (ФИГ. 11F) и ИЛ-5 (ФИГ. 11G).

[0091] На ФИГ. 12 показано, что подавление пролиферации клеток и выработка цитокинов под действием анти-ИЛ-21 обратимо. МКПК донора 1 (12,71×10⁶) переносили в организм мышей NOD/SCID/γc в день исследования 0 и проводили инъекцию либо 200 мкг K44VHa-N56Q (заштрихованные символы), либо контрольного моноклонального антитела (белые символы) три раза в неделю, начиная с дня 1 и до дня 31, когда введение K44VHa-N56Q было прекращено. У мышей отбирали кровь на 15-ый, 28-ой, 43-ий и 57-ой дни, и определяли количество интерферона гамма (ФИГ. 12А), фактора некроза опухоли альфа (ФИГ. 12 В) и ИЛ-10 (ФИГ. 12С) в сыворотке в указанные моменты времени при помощи набора MILLIPLEX MAP с Th17 человека компании «Millipore». Также у мышей отбирали кровь в 7-ой, 21-ый, 35-ый, 51-ый и 57-ой дни, и определяли количество CD45+-лимфоцитов человека (ФИГ. 12D). Все мыши, получавшие контрольное моноклональное антитело, умерли к 28-ому дню исследования; таким образом, для указанных животных был только один момент времени определения цитокинов.

[0092] На ФИГ. 13 показано, что терапевтическое антитело K44VHa-N56Q защищает субъектов от GVHD. МКПК донора 1 (12,71×10⁶) переносили в организм мышей NOD/SCID/γc в день исследования 0 и отслеживали их выживание. Мышам вводили контрольное моноклональное антитело с 7-ого дня (кружки), K44VHa-N56Q с 7-го дня (треугольники), или K44VHa-N56Q с 14-ого дня (перевернутые треугольники) три раза в неделю в дозе 200 мкг/мышь. Мышей подвергали эвтаназии, когда масса тела снижалась на 20%, или если мышь изнурялась/угасала, или испытывала боль или мучения. Смерть и гуманная эвтаназия применялись как синонимы в целях прослеживания выживания.

[0093] На ФИГ. 14 показано, что K44VHa-N56Q может защищать от GVHD-индуцированной анемии. Мышам проводили инъекции и работали с ними, как было описано для ФИГ. 13. Мыши ранее не подвергались воздействию, т.е. не получали клеток (звездочки), или получали МКПК человека, а затем контрольное моноклональное антитело, начиная с 7-ого дня (кружки), K44VHa-N56Q с 7-го дня (треугольники), или K44VHa-N56Q с 14-ого дня (перевернутые треугольники) три раза в неделю в дозе 200 мкг/мышь. Пробы гепаринизированной цельной крови, отобранной из ретро-орбитального синуса, разводили в соотношении 1:10 для анализа на автоматическом гематологическом анализаторе (Sysmex XT-2000iv). Получаемый клинический анализ крови (ФИГ. 14А) и лейкоцитарная формула (ФИГ. 14С), гематокрит (ФИГ. 14В) и гемаглобин (ФИГ. 14D) домножали на коэффициент разведения десять.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0094] Согласно настоящему изобретению предложены молекулы и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с ИЛ-21. Согласно некоторым вариантам реализации такие молекулы являются антителами и их антигенсвязывающими фрагментами, которые специфически связываются с ИЛ-21. Также предложены родственные полинуклеотиды, композиции, содержащие анти-ИЛ-21 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, и способы получения анти-ИЛ-21 антител и их антигенсвязывающих фрагментов. Дополнительно предложены способы применения анти-ИЛ-21 антител, такие как способы лечения воспалительных, иммуно-обусловленных или аутоиммунных заболеваний или расстройств у субъекта и способы диагностики.

[0095] Чтобы настоящее изобретение было более понятно, сначала вводятся определения некоторых терминов. Дополнительные определения вводятся по ходу подробного описания.

I. Определения

[0096] В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включает указания на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Термины «один», а также термины «один или более» и «по меньшей мере один» могут в заявке применяться взаимозаменяемо.

[0097] Кроме того, «и/или» должно восприниматься как специфическое раскрытие каждого из двух описываемых свойств или компонентов, вместе со вторым или без него. Так, предполагается, что термин «и/или», применяемый в такой фразе, как «А и/или В», включает «А и В», «А или В», «А» (одно), и «В» (одно). Аналогично, предполагается, что термин «и/или», применяемый в такой фразе, как «А, В и/или С» включает каждый из следующих вариантов: А, В и С; А, В или С, А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (одно); В (одно); и С (одно).

[0098] Если не определено иное, все технические и научные термины, применяемые в настоящей заявке, имеют те же значения, которые общеприняты среди специалистов в той области техники, к которой относится данное изобретение. Например, многие термины из применяемых в настоящем изобретении можно найти в словарях Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press.

[0099] Единицы, префиксы и символы приведены в соответствии с Международной системой единиц (СИ). Области числовых значений включают значения, определенные диапазоном. Если не указано другого, аминокислотные последовательности написаны слева направо в ориентации с N-конца к С-концу. Заголовки, приведенные в настоящей заявке, не являются ограничивающими для разных аспектов и вариантов реализации, о которых можно получить общее представление по их полному описанию. Соответственно, термины, которым даны определения чуть ниже, полностью определены ссылкой на описание во всей его полноте.

[00100] Когда варианты реализации описаны с применением формулировки «включающий», также предложены другие аналогичные варианты реализации, описываемые в терминах «состоящий из» и/или «состоящий по существу из».

[00101] В настоящей заявке аминокислоты обозначаются общепринятыми для них трехбуквенными символами или однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогично, нуклеотиды обозначаются общепринятыми для них однобуквенными кодами.

[00102] Термин «ИЛ-21» относится к цитокину интерлейкину-21, и/или его активным фрагментам. ИЛ-21 связывается с рецептором ИЛ-21 на разных клетках иммунной системы, включая сигнальную трансдукцию в тех клетках, которые описаны в других частях настоящей заявки. ИЛ-21 был охарактеризован в наиболее распространенных модельных системах на животных. кДНК и аминокислотные последовательности ИЛ-21 человека можно найти, например, в GenBank под номером доступа ВС066260.1 (SEQ ID №:1) и ААН69124.1 (SEQ ID №:2). кДНК и аминокислотные последовательности ИЛ-21 яванской макаки (Масаса fascicularis) можно найти, например, под номерами SEQ ID №:3 (SEQ ID №:3) и 4 (SEQ ID №:4) в заявке на патент США №2008-0267910 А1 (включена в настоящую заявку посредством ссылки на ее полную версию).

[00103] Термины «ингибирует», «блокирует» и «подавляет» применяются в настоящей заявке взаимозаменяемо и относятся к любому статистически значимому снижению биологической активности, включая полное блокирование активности. Например, «ингибирование» может относиться к снижению биологической активности приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. Соответственно, когда термины «ингибирование» или «подавление» применяются для описания, например, эффекта на путь сигнальной трансдукции от ИЛ-21, например на сигнальную трансдукцию в клетке, экспрессирующей рецептор ИЛ-21 (ИЛ-21R) в присутствии ИЛ-21 (например, фосфорилирование STAT3, выработка интерферона гамма (ИФН-γ) в NK, дифференцировка В-лимфоцитов в плазмоциты или подавление ИЛ-21-запускаемой пролиферации необученных CD4+-T-лимфоцитов человека), данные термины относятся к способности связывающей ИЛ-21 молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела или его антигенсвязывающего фрагмент статистически значимо уменьшать ИЛ-21-индуцированную сигнальную трансдукцию через рецептор ИЛ-21, по сравнению с сигнальной трансдукцией в необработанной (контрольной) клетке. Клетка, которая экспрессирует ИЛ-21 R, может быть клеткой, существующей в природе, или линией клеток (например, Т-лимфоцит, В-лимфоцит, натуральный киллер (NK), дендритная клетка или другой тип клетки лимфоидного ростка) или может быть полученной рекомбинантными способами клеткой при введении нуклеиновой кислоты, кодирующей ИЛ-21R в клетку хозяина. Согласно одному варианту реализации связывающая ИЛ-21 молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может ингибировать ИЛ-21-индуцированную сигнальную трансдукцию в ИЛ-21R-экспрессирующей клетке по меньшей мере на 10%, или по меньшей мере на 20%, или по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90% или приблизительно на 100%, что определяют, например, посредством проточной цитометрии, Вестерн-блоттинга, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) или другими способами, как описано в разделе «Примеры» ниже.

[00104] В настоящей заявке термины «антитело» или «иммуноглобулин» применяются взаимозаменяемо и включают целые антитела и любой его антигенсвязывающий фрагмент или одиночную цепь.

[00105] Типичное антитело содержит по меньшей мере две тяжелых цепи (Н) и две легких цепи (L), соединенные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (в настоящей заявке сокращается VH) и константного участка тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (в настоящей заявке сокращается VL) и константного участка легкой цепи. Константный участок легкой цепи состоит из одного домена С1. Участки VH и VL могут быть дополнительно подразделены на участки гипервариабельности, называемые гипервариабельными участками (CDR), разделенные участками, которые более консервативны, называемыми каркасными участками (FW). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FW, выстроенных с N-конца к С-концу в следующем порядке: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Вариабельные участки тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные участки антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая разные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Примеры антител в настоящей заявке включают продуцируемые гибрид омой моноклональные антитела мыши 19Е3, 9F11, 8Н10 и 8В6, гуманизированные, оптимизированные по сродству, эмбриональные и/или другие варианты указанных антител, и оптимизированные по времени полувыведения из сыворотки анти-ИЛ-21-YТЕ-антитела (например, K44VHa-N56Q K44VHa6-N56Q или K2Ha-N56Q).

[00106] Термин «гуманизирование» означает, что аминокислоты в специфических положениях в антителе подвергнуты обратной мутации с возвратом к зародышевому состоянию.

[00107] Термин «антитело» может относиться к молекуле иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывается с мишенью, такой как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид, или сочетания вышеперечисленных вариантов, за счет распознавания по меньшей мере одного сайта антигена в вариабельном участке молекулы иммуноглобулина. В настоящей заявке термин «антитело» включает интактные поликлональные антитела, фрагменты антител (такие как фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv), одноцепочечные мутанты Fv (scFv), мультиспецифичные антитела, такие как биспецифичные антитела, сгенерированные по меньшей мере из двух интактных антител, химерные антитела, гуманизированные антитела, антитела человека, гибридные белки, содержащие распознающую антиген часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую антиген-распознающий сайт, при условии, что антитела проявляют желаемую биологическую активность. Антитело может принадлежать к любому из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), в зависимости от природы их константных доменов тяжелых цепей, называемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Разные классы иммуноглобулинов обладают разной и хорошо известной структурой субъединиц и трехмерной конфигурацией. Антитела могут быть оголенными или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоизотопы и др.

[00108] Под «блокирующим» антителом или «антагонистическим» антителом понимают антитело, которое подавляет или уменьшает биологическую активность антигена, с которым оно связывается, например, ИЛ-21. Согласно определенным аспектам блокирующие антитела или антагонистические антитела существенно или полностью подавляют биологическую активность антигена. Желательно, чтобы биологическая активность снижалась на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 100%.

[00109] Термин «ИЛ-21 антитело» или «антитело, которое связывается с ИЛ-21» или «анти-ИЛ-21 антитело» относится к антителу, которое способно связываться с ИЛ-21 с достаточным сродством, так чтобы антитело было применимо в качестве терапевтического агента или диагностического реактива, нацеленного на ИЛ-21. Степень связывания анти-ИЛ-21 антитела с неродственным, не-ИЛ-21 белком меньше, чем приблизительно 10% от связывания указанного антитела с ИЛ-21, что измеряют, например, посредством радиоиммуноанализа (РИА), BIACORE® (с применением рекомбинантного ИЛ-21 в качестве анализируемого вещества и антитела в качестве лиганда, или наоборот), KINEXA®, или другого анализа связывания, известного в технике. Согласно определенным вариантам реализации антитело, которое связывается с ИЛ-21, демонстрирует константу диссоциации (K_D)≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤10 пМ, ≤1 пМ или ≤0,1 пМ.

[00110] Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к части интактного антитела и относится к гипервариабельным участкам интактного антитела. Антигенсвязывающим фрагментом антитела могут быть фрагменты полноразмерного антитела. Примеры фрагментов антител включают без ограничения фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, линейные антитела, одноцепочечные антитела (например, ScFvs), и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.

[00111] Термин «моноклональное антитело» (mAb) относится к однородной популяции антител, участвующей в высокоспецифичном распознавании и связывании с единственной антигенной детерминантой или эпитопом. Они отличаются от поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела на разные антигенные детерминанты. Термин «моноклональное антитело» включает как интактные и полноразмерные антитела, так и фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные (scFv) мутанты, гибридные белки, содержащие антитела и любые другие модифицированные молекулы иммуноглобулинов, содержащие антиген-распознающий сайт. Кроме того, термин «моноклональное антитело» относится к таким антителам, которые получены целым рядом способов, включая без ограничений, гибридому, селекцию с фагами, рекомбинантную экспрессию и трансгенных животных.

[00112] Термин «гуманизированное антитело» относится к антителу, полученному из нечеловеческого (например, мышиного) иммуноглообулина, которое было сконструировано так, чтобы оно содержало минимум последовательностей, не характерных для человека (например, мыши). Обычно гуманизированными антителами являются иммуноглобулины человека, в которых остатки из гипервариабельного участка (CDR) заменены остатками из CDR вида, отличного от человека (например, мыши, крысы, кролика или хомяка), которые обладают желаемой специфичностью, сродством и емкостью (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). В некоторых вариантах реализации остатки каркасного участка Fv (FW) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками в антителе из видов, отличных от человека, которые обладают желаемой специфичностью, сродством и емкостью.

[00113] Гуманизированное антитело может быть дополнительно модифицировано путем замены дополнительных остатков либо в каркасном участке Fv и/или в пределах замененных остатков от вида, отличного от человека, чтобы улучшить и оптимизировать специфичность, сродство и/или емкость антитела. Как правило, гуманизированные антитела будут состоять по существу по меньшей мере из одного, и обычно из двух или трех вариабельных доменов, содержащих все или по существу все участки CDR, которые соответствуют иммуноглобулину вида, отличного от человека, тогда как все или по существу все участки FR являются участками консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может также содержать по меньшей мере часть константного участка или домена иммуноглобулина (Fc), обычно участка из иммуноглобулина человека. Примеры способов, применяемых для генерирования гуманизированных антител, описаны в патентах США №5225539 или 5639641.

[00114] Термин «вариабельный участок» антитела относится к вариабельному участку легкой цепи антитела или к вариабельному участку тяжелой цепи антитела, либо одному, либо в сочетании. Каждый вариабельный участок тяжелых и легких цепей состоит из четырех каркасных областей (FW), соединенных тремя гипервариабельными участками (CDR). CDR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости друг к другу за счет участков FW и, с CDR из другой цепи, что способствует образованию антигенсвязывающего сайта антител. Существует по меньшей мере две методики определения CDR: (1) подход, основанный на межвидовой вариабельности последовательностей (например, Kabat et al Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (A1 - lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Кроме того, иногда в технике применяют сочетание указанных двух подходов для определения CDR.

[00115] Обычно при указании остатка в вариабельном домене применяют систему нумерации по Кэботу (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

[00116] Под нумерацией положений аминокислот по Кэботу понимают систему нумерации, применяемую для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи в компоновке антител в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). В соответствии с данной системой нумерации реальная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или вставке в FW или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать вставку одной аминокислоты (остаток 52а по Кэботу) после остатка 52 Н2 и вставленные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с, и т.д., по Кэботу) после остатка 82 в FW тяжелой цепи.

[00117] Нумерацию остатков по Кэботу можно определить для конкретного антитела по выравниванию участков гомологии в последовательности указанного антитела со стандартной нумеруемой по Кэботу последовательностью. Под нумерацией по Чотиа понимают, напротив, положение структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Конец петли CDR-H1 по Чотиа, когда нумеруется по Кэботу, варьирует от Н32 до Н34 в зависимости от длины петли (это связано с тем, что схема нумерации Кэбота производит вставки в Н35А и Н35В; если не присутствует ни 35А, ни 35В, петля заканчивается в 32; если присутствует только 35А, петля заканчивается в 33; если присутствуют и 35А, и 35В, петля заканчивается в 34). Гипервариабельные участки AnM представляют собой компромисс между CDR по Кэботу и структурными петлями по Чотиа, и применяются в программе для моделирования Oxford Molecular's AbM. См. Таблицу 1.

[00118] IMGT (ImMunoGeneTics) также предложена система нумерации для вариабельных участков иммуноглобулинов, включая CDR. См., например, публикацию Lefranc, М.Р. et al., Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77(2003), которая включена в настоящую заявку посредством ссылки. Система нумерации IMGT была основана на выравнивании более 5000 последовательностей, структурных данных и описании гипервариабельных петель, и позволяет с легкостью сравнивать вариабельные участки и участки CDR для всех видов. Согласно схеме нумерации IMGT VH-CDR1 находится в положениях 26-35, VH-CDR2 - в положениях 51-57, VH-CDR3 - в положениях 93-102, VL-CDR1 - в положениях 27-32, VL-CDR2 - в положениях 50-52, a VL-CDR3 - в положениях 89-97.

[00119] В настоящем описании под последовательностями VH CDR понимают расположение по классической нумерации Кэбота, а именно VH-CDR1 по Кэботу находится в положениях 31-35, VH-CDR2 - в положениях 50-65, VH-CDR3 - в положениях 95-102. VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 также соответствуют расположению по классической нумерации по Кэботу, а именно находятся в положениях 24-34, 50-56 и 89, 97, соответственно.

[00120] Термин «антитело человека» относится к антителу, выработанному в организме человека, или к антителу с аминокислотной последовательностью, соответствующей антителу, выработанному в организме человека, полученному при помощи любого способа, известного в технике. Данное определение антитела человека включает интактные или полноразмерные антитела, их фрагменты и/или антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой и/или легкой цепи антитела человека, например, антитело, содержащие полипептиды легкой цепи из антитела мыши и тяжелой цепи из антитела человека.

[00121] Термин «химерные антитела» относится к антителам, в которых аминокислотная последовательность молекулы иммуноглобулина получена от двух или более видов. Обычно вариабельный участок и легких, и тяжелых цепей соответствует вариабельному участку антител, полученных от одного вида млекопитающих (например, мыши, крысы, кролика, и т.д.) с желаемой специфичностью, сродством и емкостью, тогда как константные участки гомологичны последовательностям в антителах, полученных от другого вида (обычно человека), чтобы исключить иммунный ответ у данного вида.

[00122] Термины «YTE» или «мутант YTE» относится к мутации в Fc IgG1, которая приводит к увеличению связывания с FcRn человека и улучшает показатель времени полувыведения из сыворотки антитела, содержащего такую мутацию. Мутант УТЕ содержит сочетание трех мутаций, M252Y/S254T/T256E (нумерация ЕС, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, D.C.), введенных в тяжелую цепь IgG1. См. патент США №7658921, который включен в настоящую заявку посредством ссылки. Было показано, что мутация YТЕ увеличивает время полувыведения антител из сыворотки крови приблизительно в четыре раза по сравнению с вариантом того же антитела дикого типа (Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-24 (2006); Robbie et al., (2013) Antimicrob. Agents Chemother. 57, 6147-6153). Также см. патент США №7083784, который включен в настоящую заявку посредством ссылки.

[00123] Термин «сродство связывания» как правило относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между отдельным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано другое, в настоящей заявке под «сродством связывания» понимают природное сродство связывания, которое отражает взаимодействие в соотношении 1:1 между членами связывающейся пары (например, антитела и антигена). Сродство молекулы X по отношению к молекуле Y может обычно быть представлена константой диссоциации (K_D). Сродство можно измерять обычными способами, известными в технике, включая способы, раскрываемые в настоящей заявке. Антитела с низким сродством как правило связываются с антигеном медленно и склонны к легкой диссоциации, тогда как антитела с высоким сродством как правило связываются с антигеном быстрее и склонны оставаться связанными с ним дольше. В технике известен целый ряд способов измерения сродства, любой из которых можно применять в целях настоящего изобретения.

[00124] «Активность» обычно выражают как значение IC50 (полумаксимальная ингибирующая концентрация), в нМ или пМ, если не указано другого. IC₅₀ - это медиана ингибирующей концентрации молекулы антитела. В функциональных пробах под IC₅₀ понимают концентрацию, которая снижает биологический ответ на 50% от его максимума. В исследованиях связывания лиганда IC₅₀ - это концентрация, которая снижает связывание лиганда на 50% от максимального уровня специфического связывания. IC₅₀ можно рассчитать любым числом способов, известных в технике.

[00125] Кратность увеличения активности для антител или полипептидов согласно настоящему изобретению по сравнению с эталонным антителом может составлять по меньшей мере приблизительно 2 раза, по меньшей мере приблизительно 4 раза, по меньшей мере приблизительно 6 раз, по меньшей мере приблизительно 8 раз, по меньшей мере приблизительно 10 раз, по меньшей мере приблизительно 20 раз, по меньшей мере приблизительно 30 раз, по меньшей мере приблизительно 40 раз, по меньшей мере приблизительно 50 раз, по меньшей мере приблизительно 60 раз, по меньшей мере приблизительно 70 раз, по меньшей мере приблизительно 80 раз, по меньшей мере приблизительно 90 раз, по меньшей мере приблизительно 100 раз, по меньшей мере приблизительно 110 раз, по меньшей мере приблизительно 120 раз, по меньшей мере приблизительно 130 раз, по меньшей мере приблизительно 140 раз, по меньшей мере приблизительно 150 раз, по меньшей мере приблизительно 160 раз, по меньшей мере приблизительно 170 раз, or по меньшей мере приблизительно 180 раз или более.

[00126] Термин «антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность» или «АЗКЦ» относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig, связанный на рецепторах Fc (FcRs), присутствует на определенных цитотоксических клетках (например, природных киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах) и позволяет указанным цитотоксическим эффекторных клеткам специфически связываться с несущей антиген клеткой-мишенью и впоследствии уничтожать клетку-мишень цитотоксинами. Специфические антитела - IgG, направленные на поверхность клеток-мишеней, «вооружают» цитотоксические клетки и абсолютно необходимы для такого уничтожения. Лизис клеток-мишеней происходит внеклеточно, требует прямого контакта клетки с клеткой, и в нем не участвует комплемент. Предполагается, что помимо антител, влиять на клеточно-опосредованную цитотоксичность могут другие белки, содержащие участки Fc, особенно Fc-гибридные белки, способные связываться специфично с антиген-несущей клеткой-мишенью. Для простоты клеточно-опосредованную цитотоксичность, возникающую вследствие активности Fc-гибридных белков, в настоящей заявке также называют активностью АЗКЦ.

[00127] Полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые «изолированы», представляют собой полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетку или композицию, которые представлены в форме, не обнаруживаемой в природе. Изолированные полипептиды, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетки или композиции включают полипептиды, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетки или композиции, которые были очищены до такой степени, что они уже не находятся в форме, в которой они обнаруживаются в природе. Согласно некоторым вариантам реализации антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые изолированы, по существу являются чистыми.

[00128] Под «субъектом», «индивидуумом», «животным» или «пациентом» понимают любого субъекта, в частности млекопитающее, для которого желательная диагностика, составление прогноза или терапия. Млекопитающие включают людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и зоопарковых животных, включая, например, людей, низших приматов, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс, мышей, лошадей, коров, медведей и т.д.

[00129] Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, которая позволяет проявиться биологической активности активного ингредиента, и которая не содержит дополнительных компонентов, которые неприемлемо токсичны для субъекта, которому данная композиция могла бы вводиться. Такая композиция может быть стерильной.

[00130] В настоящей заявке термин «эффективное количество» относится к количеству, достаточному для выполнения специфической поставленной цели. «Эффективное количество» можно определить эмпирически и стандартным образом, в зависимости от поставленной цели.

[00131] Термин «метка» в настоящей заявке относится к определяемому веществу или композиции, которые конъюгированы напрямую или косвенно с антителом, чтобы получить «меченное» антитело. Метка может быть детектируемой сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или в случае ферментативной метки может катализировать химическое превращение соединения-субстрата или композиции, которое является определяемым.

[00132] Такие термины как «лечение», «лечить» или «облегчение», «облегчать» относятся к терапевтическим мерам, которые позволяют излечить, замедлить, уменьшить симптомы и/или приостановить прогресс диагностированного патологического состояния или расстройства. Таким образом, те, кто нуждаются в лечении, включают субъектов, которые уже страдают расстройством. Согласно определенным вариантам реализации субъект подвергся успешному «лечению» от воспалительного, иммуно-обусловленного или аутоиммунного заболевания или расстройства согласно способам, предложенным в настоящей заявке, если указанный пациент демонстрирует, например, полное, частичное или временное облегчение или исчезновение симптомов, ассоциированных с указанным заболеванием или расстройством.

[00133] Термины «предупреждать» или «профилактика» относятся к профилактическим или превентивным мерам, которые направлены на предупреждение и/или замедление развития рассматриваемого патологического состояния или расстройства. Таким образом, те, кто нуждаются в профилактике, включают субъектов, склонных к развитию указанного расстройства или восприимчивых к нему. Согласно определенным вариантам реализации воспалительное, иммуно-обусловленное или аутоиммунное заболевание или расстройство успешно предупреждено согласно способам, предложенным в настоящей заявке, если у пациента развиваются, например, временные или постоянные, меньшие или менее тяжелые симптомы, ассоциированные с заболеванием или расстройством, или симптомы, ассоциированные с данным заболеванием или расстройством, начинаются позже, чем у пациента, который не подвергся применению способов согласно настоящему изобретению.

[00134] В настоящей заявке термин «полинуклеотид» может включать одну или более «нуклеиновых кислот», «молекул нуклеиновой кислоты» или «нуклеотидных последовательностей» и относится к полимеру из нуклеотидов любой длины, и включает ДНК и РНК. Полинуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями, и/или их аналогами, или любым субстратом, который можно включить в полимер при помощи ДНК- или РНК-полимеразы. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Предшествующее описание применимо ко всем полинуклеотидам, упоминаемым в настоящей заявке, включая РНК и ДНК.

[00135] Под термином «вектор» понимают конструкцию, которая способна доставлять и, согласно некоторым вариантам реализации, экспрессировать один или более из рассматриваемых ген(ов) или последовательности(ей) в клетке хозяине. Примеры векторов включают без ограничений вирусные векторы, векторы экспрессии на основе оголенной ДНК или РНК, плазмиду, космиду или векторы-фаги, векторы экспрессии на основе ДНК или РНК, ассоциированные с катионными конденсирующими агентами, векторы экспрессии на основе ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомы, и определенные клетки эукариот, такие как клетки-продуценты.

[00136] В настоящей заявке термины «полипептид», «пептид» и «белок» применяются взаимозаменяемо и обозначают полимеры из аминокислот любой длины. Указанный полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и они могут чередоваться с неаминокислотами. Указанные термины включают также полимер из аминокислот, который был модифицирован от природы или путем воздействия; например, образование дисульфидных связей, гликозилирование, липидизация, ацетилирование, фосфорилирование или любая другая манипуляция или модификация, такая как конъюгация с меченным компонентом. Также настоящее определение включает, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты и др.), а также другие модификации, известные в технике. Следует понимать, что, поскольку полипептиды согласно настоящему изобретению основаны на антителах, согласно определенным вариантам реализации, указанные полипептиды могут возникать в виде одиночных цепей или ассоциированных цепей.

[00137] Термины "идентичный» или процент «идентичности» в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые одинаковы или обладают определенным процентом нуклеотидов или аминокислот, которые одинаковы, когда их сравнивают и выравнивают (при необходимости вводя гэпы) для максимального соответствия, на считая любые консервативные аминокислотные замены частью идентичности последовательности. Процент идентичности можно измерить при помощи программы для сравнения последовательностей или алгоритмов визуальной оценки. В технике известны разные алгоритмы и программы, которые можно применять, чтобы получить выравнивание аминокислотных или нуклеотидных последовательностей.

[00138] Одним таким неограничивающим примером алгоритма выравнивания последовательности является алгоритм, раскрываемый у Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Set, 87:2264-2268, и модифицированный в Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877, и включенный в программы NBLAST и XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Согласно определенным вариантам реализации, можно применять BLAST с гэпами, как описано у Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Другие программы в общем доступе, которые можно применять для выравнивания последовательностей, включают BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 («Genentech», Южный Сан-Франциско, Калифорния) или Megalign (DNASTAR). Согласно определенным вариантам реализации процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют при помощи программы GAP в программном пакете GGG (например, с применением матрицы NWSgapdna.CMP, штрафа за открытие гэпа 40, 50, 60, 70 или 90 и штрафа за продолжение 1, 2, 3, 4, 5 или 6). Согласно определенным альтернативным вариантам реализации для определения процента идентичности между аминокислотными последовательностями можно применять программу GAP в программном пакете GCG, которая включает алгоритм Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) (например, с применением матрицы BLOSUM 62 или матрицы РАМ250, и штрафа за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за продолжение 1, 2, 3, 4, 5). В качестве альтернативы, согласно определенным вариантам реализации процент идентичности между нуклеотидными или аминокислотными последовательностями определяют при помощи алгоритма Myers and Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Например, процент идентичности можно определить при помощи программы ALIGN (версия 2.0) и при помощи РАМ 120 с таблицей остатков, штрафом за длину гэпа 12 и штрафом за гэп 4. Специалист в данной области техники может определить соответствующие параметры для максимального выравнивания при помощи конкретной программы для выравнивания. Согласно определенным вариантам реализации применяют параметры программы для выравнивания по умолчанию.

[00139] Согласно определенным вариантам реализации процент идентичности "X» первой аминокислотной последовательности второй аминокислотной последовательности рассчитывают как 100×(Y/Z), где Y - количество аминокислотных остатков, учтенных как идентичные совпадения в выравнивании первой и второй последовательностей (которые выравнивают путем визуальной оценки или при помощи конкретной программы выравнивания последовательностей), a Z - общее количество остатков во второй последовательности. Если длина первой последовательности больше, чем длина второй последовательности, процент идентичности первой последовательности по отношению ко второй будет больше, чем процент идентичности второй последовательности по отношению к первой.

[00140] Под «консервативной аминокислотной заменой» понимают замену, при которой один аминокислотный остаток замещается на другой аминокислотный остаток со сходной боковой цепью. В технике были определены семейства аминокислотных остатков со сходными боковыми цепями и включают основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незараженные полярные боковые цепи (например, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замена фенилаланина на тирозин является консервативной заменой. Согласно определенным вариантам реализации консервативные замены в последовательностях полипептидов и антител согласно настоящему изобретению не аннулируют связывания указанного полипептида или антитела, содержащего такую аминокислотную последовательность, с антигеном(ами), т.е., ИЛ-21, с которым связывается указанный полипептид или антитело. Способы идентификации науклеотидных и аминокислотных консервативных замен, которые не исключают связывания с антигеном, хорошо известны в технике (см., например, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); and Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).

II. Анти-ИЛ-21-связывающие молекулы

[00141] Согласно настоящему изобретению предложены ИЛ-21-связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с ИЛ-21. Полноразмерные аминокислотные (АК) и нуклеотидные (НТ) последовательности ИЛ-21 известны в технике. См., например, № доступа в GenBank ВС066260.1 (SEQ ID №:1) и ААН69124.1 (SEQ ID №:2), соответственно, для ИЛ-21, или заявку на патент США №2008-0267910 А1 для ИЛ-21 яванской макаки (Масаса fasciculari) SEQ ID №:3 и 4, соответственно). Согласно некоторым вариантам реализации ИЛ-21 связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в настоящей заявке, являются антителами мыши, гуманизированными антителами или антителами человека. Согласно определенным вариантам реализации указанными ИЛ-21 - связывающими молекулами являются антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Согласно некоторым вариантам реализации ИЛ-21-связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат Fab, Fab', F(ab')2, Fd, одноцепочечные Fv или scFv, связанные дисульфидными связями Fv, домен V-NAR, IgNar, антитело, IgGΔCH2, миниантитело, F(ab')₃, тетратело, триатело, диатело, однодоменное антитело, DVD-Ig, Fcab, mAb², (scFv)₂, или scFv-Fc. Согласно некоторым вариантам реализации указанное антитело является антителом подтипа IgG1 и содержит тройной мутант YTE, который описан выше в разделе «Определения». Конкретные анти-ИЛ-21 антитела или их фрагменты предложены в Таблице 2 и в разделе «Примеры».

[00142] Согласно определенным аспектам настоящей заявки предложена ИЛ-21-связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые могут специфически связываться с тем же эпитопом ИЛ-21, что и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL) 19Е3, 9F11, 8В6 или 9Н10. Также предложена ИЛ-21-связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые могут конкурентно ингибировать, или могут связываться с ИЛ-21 с большим сродством, чем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL 19Е3, 9F11, 8В6 или 9Н10. Как предложено в настоящей заявке, VH и VL 19Е3 содержат SEQ ID №:6 и 11, соответственно, VH и VL of 9F11 содержат SEQ ID №:28 и 33, соответственно, VH и VL 8В6 содержат SEQ ID №:42 и 47, соответственно, a VH и VL 9Н10 содержат SEQ ID №:52 и 57, соответственно.

[00143] Также в настоящей заявке предложена ИЛ-21-связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие участок VL антитела. Согласно определенным аспектам указанный участок VL включает один, две или три VL-CDR, такие как VL-CDR, полностью идентичные или идентичные за исключением восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены, последовательности SEQ ID №:12, SEQ ID №:34, SEQ ID №:48 или SEQ ID №. 58, VLCDR2, полностью идентичные или идентичные за исключением восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены, последовательности SEQ ID №: 13, SEQ ID №:35, SEQ ID №: 49 или SEQ ID №:59, или VLCDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены, последовательности SEQ ID №: 14, SEQ ID №:36, SEQ ID №:50 или SEQ ID №: 60. Согласно определенным аспектам участок VL содержит аминокислотные последовательности VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены VL-CDR последовательностям SEQ ID №:12, 13 и 14, SEQ ID №:34, 35 и 36, SEQ ID №: 48, 49 и 50 или SEQ ID №: 58, 59 и 60, соответственно. Согласно определенным аспектам, участок VL содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%) эталонной аминокислотной последовательности SEQ ID №:11, SEQ ID №: 17, SEQ ID №; 21, SEQ ID №: 25, SEQ ID №:33, SEQ ID №:39, SEQ ID №:40, SEQ ID №:47 или SEQ ID №:57.

[00144] Дополнительно предложена связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с ИЛ-21, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие участок VH антитела. Согласно определенным аспектам указанный участок VH включает один, две или три VH-CDR, такие как VH-CDR1, полностью идентичный или идентичный за исключением восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены, последовательности SEQ ID №: 7, SEQ ID №: 29, SEQ ID №: 43 или SEQ ID №: 53, VH-CDR2, полностью идентичный или идентичный за исключением восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены, последовательности SEQ ID №: 8, SEQ ID №: 30, SEQ ID №: 44 или SEQ ID №: 54 или VH-CDR3, полностью идентичный или идентичный за исключением восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены, последовательности SEQ ID №: 9, SEQ ID №: 31, SEQ ID №: 45 или SEQ ID №: 55. Согласно определенным аспектам участок VH содержит аминокислотные последовательности VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены, VH-CDR последовательностям SEQ ID №: 7, 8 и 9, SEQ ID №: 29, 30 и 31, SEQ ID №: 43, 44 и 45 или SEQ ID №: 53, 54 и 55, соответственно. Согласно определенным аспектам, участок VH содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% эталонной аминокислотной последовательности SEQ ID №:6, SEQ ID №:15, SEQ ID №:19, SEQ ID №:23, SEQ ID №:28, SEQ ID №:37, SEQ ID №:38, SEQ ID №:42 или SEQ ID №:52.

[00145] Согласно специфическим аспектам ИЛ-21-связывающая молекула, предложенная в настоящей заявке, включает анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Например, в настоящей заявке предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с ИЛ-21, содержащие участок VL И участок VH, причем VL и VH совместно содержат аминокислотные последовательности VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены в одном или более CDR, последовательностям: SEQ ID №:12, 13, 14, 7, 8 и 9, SEQ ID №:34, 35, 36, 29, 30 и 31, SEQ ID №:48, 49, 50, 43, 44 и 45 или SEQ ID №:58, 59, 60, 53, 54 и 55, соответственно.

[00146] Например, в настоящей заявке предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с ИЛ-21, содержащие VH и VL, причем указанные VH и VL содержат, соответственно, аминокислотные последовательности, идентичные по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% эталонным аминокислотным последовательностям SEQ ID №:6 и SEQ ID №:11, SEQ ID №:15 и SEQ ID №:17, SEQ ID №:19 и SEQ ID №:21, SEQ ID №:23 и SEQ ID №:25, SEQ ID №:28 и SEQ ID №; 33, SEQ ID №:37 и SEQ ID №:39, SEQ ID №:38 и SEQ ID №:39, SEQ ID №:37 и 40, SEQ ID №:42 и SEQ ID №:47, или SEQ ID №:52 и SEQ ID №:57, соответственно.

[00147] Согласно одному аспекту в настоящей заявке предложено анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL K44VHa-N56Q, VH с аминокислотной последовательностью SEQ ID №:19 и VL с аминокислотной последовательностью SEQ ID №:21.

[00148] Анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящей заявке, например, которые описаны выше, могут быть, например, антителом мыши, гуманизированным антителом, химерным антителом, моноклональным антителом, поликлональным антителом, рекомбинантным антителом, мультиспецифичным антителом или любым их сочетанием. Указанным антигенсвязывающим фрагментом анти-ИЛ-21 антитела может быть фрагмент Fv, фрагмент Fab, фрагмент F(ab')2, фрагмент Fab', фрагмент dsFv, фрагмент scFv или фрагмент sc(Fv)2.

[00149] Согласно одному аспекту в настоящей заявке предложено анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые могут связываться с молекулами ИЛ-21 целого ряда видов, например, указанное антитело или фрагмент могут связываться с ИЛ-21 мыши, ИЛ-21 кролика, ИЛ-21 человека и/или ИЛ-21 яванской макаки. Например, указанное антитело или фрагмент могут связываться с ИЛ-21 человека и ИЛ-21 яванской макаки. Согласно дополнительному примеру указанное антитело или фрагмент могут также связываться с ИЛ-21 мыши.

[00150] Рецептор ИЛ-21 обладает гамма-цепью, общей для целого ряда других рецепторов цитокинов, например, ИЛ-2R, ИЛ-4R, ИЛ-7R, ИЛ-9R и ИЛ-15R. Согласно определенным вариантам реализации предложенные в настоящей заявке анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут специфически связываться с ИЛ-21, например, ИЛ-21 человека и ИЛ-21 яванской макаки, и ИЛ-21 мыши, но не связывается специфически с ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-9 или ИЛ-15 человека.

[00151] Анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящей заявке, например, описанные выше, могут включать помимо VH и VL константный участок тяжелой цепи или его фрагмент. Согласно определенным вариантам реализации указанный константный участок тяжелой цепи является константным участком тяжелой цепи человека, например, константным участком IgG человека, например, константным участком IgG1 человека. Как описано в других частях настоящей заявки, согласно определенным аспектам константный участок тяжелой цепи или его фрагмент, например, константный участок IgG человека или его фрагмент, может включать одну или более аминокислотных замен по сравнению с константным доменом IgG дикого типа, причем модифицированный IgG обладает увеличенным временем полувыведения по сравнению с временем полувыведения IgG, содержащего константный домен IgG дикого типа. Например, константный домен IgG может содержать одну или более аминокислотных замен в положениях 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 и 428-436, где нумерация положений аминокислот соответствует указателю ЕС, как указано у Кэбота. Согласно определенным аспектам константный домен IgG может содержать одну или более аминокислотных замен в положении по Кэботу 252 на тирозин (Y), фенилаланин (F), триптофан (W) или треонин (Т), аминокислотных замен в положении по Кэботу 254 на треонин (Т), аминокислотных замен в положении по Кэботу 256 на серии (S), аргинин (R), глутамин (Q), глутаминовую кислоту (Е), аспарагиновую кислоту (D) или треонин (Т), аминокислотных замен в положении по Кэботу 257 на лейцин (L), аминокислотных замен в положении по Кэботу 309 на пролин (Р), аминокислотных замен в положении по Кэботу 311 на серии (S), аминокислотных замен в положении по Кэботу 428 на треонин (Т), лейцин (L), фенилаланин (F) или серии (S), аминокислотных замен по Кэботу 433 на аргинин (R), серии (S), изолейцин (I), пролин (Р), или глутамин (Q), или аминокислотных замен в положении по Кэботу 434 на триптофан (W), метионин (М), серии (S), гистидин (Н), фенилаланин (F) или тирозин. Более конкретно, константный домен IgG может содержать аминокислотные замены по сравнению с константным доменом IgG человека дикого типа, включая аминокислотные замены в положении по Кэботу 252 на тирозин (Y), аминокислотные замены в положении по Кэботу 254 на треонин (Т) и аминокислотные замены в положении по Кэботу 256 на глутаминовую кислоту (Е).

[00152] В настоящей заявке предложено анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в которых тяжелая цепь является YTE-мутированным IgG1, например, указанная тяжелая цепь может содержать аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична эталонной аминокислотной последовательности SEQ ID №:16, SEQ ID №:20 или SEQ ID №:24.

[00153] Анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящей заявке, например, которые описаны выше, могут включать помимо VH и VL и необязательного константного участка тяжелой цепи или его фрагмента константный участок легкой цепи или его фрагмент. Согласно определенным аспектам указанным константным участком легкой цепи является каппа или лямбда константный участок легкой цепи, например, константный участок лямбда человека. Согласно одному конкретному аспекту указанным константным участком легкой цепи является константный участок каппа человека.

[00154] В настоящей заявке предложено анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором легкая цепь содержит константный участок каппа человека, например, легкая цепь может содержать легкую цепь с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична эталонной аминокислотной последовательности SEQ ID №:18, SEQ ID №:22 или SEQ ID №:26. Согласно определенным аспектам в настоящей заявке предложено анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь IgG1 человека с мутацией YTE и легкую цепь каппа человека, причем указанное антитело состоит из последовательностей SEQ ID №:16 и SEQ ID №:18, SEQ ID №:20 и SEQ ID №:22, или SEQ ID №:24 и SEQ ID №:26, соответственно, или любого их антигенсвязывающего фрагмента.

[00155] Анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящей заявке, могут обладать полезными свойствами. Например, указанное антитело или его фрагмент могут ингибировать, подавлять или блокировать связывание ИЛ-21 с рецептором ИЛ-21, например, экспрессируемым на Т-лимфоците, В-лимфоците, натуральном киллере, NK-T-лимфоците или дендритной клетке, или экспрессируемым рекомбинантным путем на клетке не лимфоидного ростка. В качестве дополнительного примера указанное антитело или его фрагмент могут ингибировать связывание ИЛ-21 человека или яванской макаки с рецептором ИЛ-21 человека или яванской макаки, но не ингибировать связывание ИЛ-21 мыши с рецептором ИЛ-21 мыши. Такое анти-ИЛ-21 антитело или его фрагмент могут также ингибировать, подавлять или блокировать разные виды активности, опосредуемой ИЛ-21, т.е., указанное антитело или его фрагмент могут выступать как антагонисты активности ИЛ-21. Согласно определенным аспектам анти-ИЛ-21 антитело или его фрагмент, предложенные в настоящей заявке, могут ингибировать, подавлять или блокировать ИЛ-21-опосредуемое фосфорилирование в пути Jak/STAT, например, ингибировать, подавлять или блокировать фосфорилирование STAT3 в экспрессирующих ИЛ-21R клетках, например, в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) человека.

[00156] Согласно определенным аспектам анти-ИЛ-21 антитело или его фрагмент, предложенные в настоящей заявке, могут ингибировать, подавлять или блокировать ИЛ-21-опосредуемую выработку интерферона-гамма (ИФН-γ) натуральными киллерами. Такое ингибирование может быть зарегистрировано для существующих в природе NK, например, NK человека, или для культивируемых NK, например, NK-92.

[00157] Согласно определенным аспектам анти-ИЛ-21 антитело или его фрагмент, предложенные в настоящей заявке, могут ингибировать, подавлять или блокировать ИЛ-21 - опосредуемую активацию, дифференцировку или гибель B-лимфоцитов во время гуморального иммунного ответа. Например, анти-ИЛ-21 антитело или его фрагмент, предложенные в настоящей заявке, могут ингибировать, подавлять или блокировать ИЛ-21-опосредукемую дифференцировку стимулированных В-лимфоцитов в плазмоциты. Определенные антитела, предложенные в настоящей заявке, могут ингибировать, подавлять или блокировать опосредуемую ИЛ-21 человека и яванской макаки дифференцировку стимулированных В-лимфоцитов в плазмоциты. Согласно определенным аспектам указанные В-лимфоциты могут быть изолированными В-лимфоцитами, к которым ИЛ-21 добавляют экзогенно. Согласно другим аспектам указанные В-лимфоциты могут контактировать, от природы или вследствие совместного культивирования, с активированными CD4+-T-лимфоцитами, которые экспрессируют ИЛ-21. Согласно другим аспектам В-лимфоциты человека могут контактировать, от природы или вследствие совместного культивирования, с активированными CD4+Т-лимфоцитами человека, которые экспрессируют ИЛ-21.

[00158] Согласно определенным аспектам антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящей заявке, могут связываться с ИЛ-21 со сродством, характеризующимся константой диссоциации (K_D) от приблизительно 100 пМ до приблизительно 0,1 пМ, измеренной при помощи платформы анализа кинетического исключения (KinExA) 3000.

[00159] Согласно определенным аспектам анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с ИЛ-21, например, с ИЛ-21 человека или ИЛ-21 яванской макаки, и его антигенными фрагментами с константой диссоциации или K_D менее 10-6 М, или менее чем 10^-7М, или менее чем 10^-8М, или менее чем 10^-9М, или менее чем 10^-10М, или менее чем 10^-11М, или менее чем 10^-12М, или менее чем 10^-13М, или менее чем 10^-14М или менее чем 10^-15М, измеренной при помощи KINEXA® или BIACORE®. Согласно одному аспекту гуманизированное анти-ИЛ-21 антитело K44VHa-N56Q может связываться с ИЛ-21 человека с K_D приблизительно 515 фМ (515×10-15 М) и ИЛ-21 яванской макаки с K_D приблизительно 352 фМ (352×10^-15 М), измеренной при помощи KINEXA®.

[00160] Согласно еще одному варианту реализации анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению связываются с ИЛ-21 и/или его антигенными фрагментами с K_off менее 1×10^-3 с^-1, или менее 2×10^-3 с^-1. Согласно другим вариантам реализации анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с ИЛ-21 и его антигенными фрагментами с K_off менее 10^-3 с^-1, менее 5×10^-3 с^-1, менее 10^-4 с^-1, менее 5×10^-4 с^-1, менее 10^-5 с^-1, менее 5×10^-5 с^-1, менее 10^-6 с^-1, менее 5×10^-6 с^-1, менее менее 5×10^-7 с^-1, менее 10^-8 с^-1, менее 5×10^-8 с^-1, менее 10^-9 с^-1, менее 5×10^-9 с^-1 или менее 10^-10 с^-1, измерерной, например, при помощи KINEXA® или BIACORE®.

[00161] Согласно еще одному варианту реализации анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению связывается с ИЛ-21 и/или его антигенными фрагментами с постоянной скорости ассоциации или скоростью коп по меньшей мере 10⁵ М^-1 с^-1, по меньшей мере 5×10⁵ М^-1 с^-1, по меньшей мере 10⁶ NT¹ с^-1, по меньшей мере 5×10⁶ М^-1 с^-1, по меньшей мере 10⁷ М^-1 с^-1, по меньшей мере 5×10⁷ М^-1 с^-1, или по меньшей мере 10⁸ М^-1 с^-1, или по меньшей мере 10⁹ М^-1 с^-1, измеренной, например, при помощи KINEXA® или BIACORE®.

[00162] Как отмечалось выше, аминокислотная последовательность VH и/или VL может быть, например, на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сходна с последовательностью, установленной в настоящей заявке, и/или содержать 1, 2, 3, 4, 5 или более замен, например, консервативных замен, по сравнению с последовательностью, установленной в настоящей заявке. Анти-ИЛ-21 антитело, содержащее участки VH и VL, которые демонстрируют определенный процент сходства с участком VH или участком VL, или содержат одну или более замен, например, консервативных замен, можно получить посредством мутагенеза (например, сайт-специфичного или ПЦР-опосредованного мутагенеза) в отношении молекул никелиновых кислот, кодирующих участки VH и/или VL, описываемые в настоящей заявке, и последующей проверки кодируемого измененного антитела на предмет связывания с ИЛ-21 и необязательной проверки на предмет сохранения функции при помощи функционального анализа, описанного в настоящей заявке.

[00163] Сродство или авидность антитела к антигену можно определить экспериментально посредством любого подходящего способа, хорошо известного в технике, например, проточной цитометрии, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), или радиоиммуноферментного анализа (РИА), или кинетического анализа (например, анализа KINEXA® или BIACORE™). Легко можно применять анализ в форме анализ f прямого связывания, а также конкурентного связывания. (См. например, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); и способы, описываемые в настоящей заявке). Измеряемое сродство взаимодействия конкретного антигена-антитела может варьировать, если измерять его при разных условиях (например, концентрация солей, pH, температура). Таким образом, измерения сродства и других параметров связывания антигена (например, K_D или Kd, K_on, K_off) проводят с применением стандартизированных растворов антитела и антигена, и стандартизированного буфера, известных в технике и такого как буфер, описываемый в настоящей заявке.

[00164] Также в настоящей заявке предложено анти-ИЛ-21 антитело или его фрагмент, описываемые в настоящей заявке, причем указанное антитело конъюгировано с гетерологичным агентом. Согласно определенным аспектам указанным агентом может быть противомикробный агент, терапевтический агент, пролекарство, пептид, белок, фермент, липид, модификатор биологического ответа, фармацевтический агент, лимфокин, гетерологичное антитело или его фрагмент, детектируемая метка, полиэтиленгликоль (ПЭГ), или сочетание двух или более из указанных агентов. Гетероконъюгаты анти-ИЛ-21 антител более подробно описаны в других частях настоящей заявки.

[00165] Согласно определенным вариантам реализации указанной ИЛ-21-связывающей молекулой является полипептид, который не является антителом. В технике известен целый ряд способов идентификации и получения полипептидов неантител, которые с высоким сродством связываются с белком-мишенью. См., например, Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006), Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J., 275:2668-76 (2008), и Skerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008), каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки на их полное содержание. Согласно определенным вариантам реализации для идентификации/получения ИЛ-21-связывающего полипептида можно применять технологию фагового дисплея. Согласно определенным вариантам реализации указанный полипептид содержит каркас белка определенного типа, выбранного из группы, состоящей из белка А, липокалина, домена фибронектина, домена консенсусных повторов анкирина и тиоредоксина.

III. Связывающие молекулы, которые связываются с тем же эпитопом, что и анти-ИЛ-21 антитела и их антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению

[00166] Согласно определенным вариантам реализации в настоящей заявке предложена ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с тем же эпитопом, что и разные анти-ИЛ-21 антитела, описываемые в настоящей заявке. В настоящей заявке термин «эпитоп» относится к целевой белковой детерминанте, способной связываться с антителом согласно настоящему изобретению. Эпитопы как правило состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или углеводные боковые цепи, и обычно обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с первыми, но не со вторыми утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Такие антитела можно идентифицировать благодаря их способности к перекрестной конкуренции (например, способности конкурентно ингибировать связывание, причем статистически значимо) с такими антителами, как 19Е3, 9F11, 9Н10 или 8В6, в стандартных способах анализа связывания с ИЛ-21. Соответственно, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложены анти-ИЛ-21 антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, например, моноклональные антитела, которые конкурируют за связывание с ИЛ-21 с другим анти-ИЛ-21 антителом или его антигенсвязывающим фрагментом согласно настоящему изобретению, таким как моноклональные антитела мыши 19Е3, 9F11, 9Н10 или 8В6, или гуманизированными вариантами, раскрываемыми в настоящей заявке. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание, например, 19Е3, 9F11, 9Н10 или 8В6 демонстрирует, что тестируемое антитело может конкурировать с таким антителом за связывание с ИЛ-21; такое антитело может согласно неограничивающей теории связываться с тем же или родственным (например, структурно сходным или пространственно расположенным проксимально) эпитопом на ИЛ-21, что и анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, с которыми оно конкурирует. Согласно одному варианту реализации указанное анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с тем же эпитопом на ИЛ-21, что и, например, моноклональные антитела мыши 19Е3, 9F11, 9Н10 или 8В6.

IV. Активность ИЛ-21-связывающих молекул

[00167] Согласно некоторым вариантам реализации ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, могут ингибировать опосредуемую ИЛ-21 сигнальную трансдукцию в ИЛ-21R-экспрессирующих клетках. Например, ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, могут ингибировать опосредуемое ИЛ-21 фосфорилирование STAT3. Кроме того, ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, могут ингибировать выработку ИФНγ клетками NK. Более того, ИЛ-21 - связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, могут ингибировать дифференцировку стимулированных В-лимфоцитов в плазмоциты.

[00168] Согласно некоторым вариантам реализации ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, могут ингибировать опосредуемое ИЛ-21 фосфорилирование STAT3 в ИЛ-21R-экспрессирующих клетках (например, МКПК), что измеряют посредством проточной цитометрии, с IC₅₀ менее чем приблизительно 500 пМ, менее чем приблизительно 350 пМ, менее чем приблизительно 250 пМ, менее чем приблизительно 150 пМ, менее чем приблизительно 100 пМ, менее чем приблизительно 75 пМ, менее чем приблизительно 60 пМ, менее чем приблизительно 50 пМ, менее чем приблизительно 40 пМ, менее чем приблизительно 30 пМ, менее чем приблизительно 20 пМ, менее чем приблизительно 15 пМ, менее чем приблизительно 10 пМ или менее чем приблизительно 5 пМ. Согласно определенным аспектам ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, могут ингибировать опосредуемое ИЛ-21 фосфорилирование STAT3 в ИЛ-21R-экспрессирующих клетках (например, МКПК), что измеряют посредством проточной цитометрии, с IC₅₀ приблизительно 22 пМ, приблизительно 19 пМ, приблизительно 17 пМ, приблизительно 14 пМ, приблизительно 13 пМ, приблизительно 12 пМ, приблизительно 6 пМ, приблизительно 5 пМ или приблизительно 3 пМ. Согласно определенным аспектам ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, могут ингибировать опосредуемое ИЛ-21 яванской макаки фосфорилирование STAT3 в ИЛ-21R-экспрессирующих клетках (например, МКПК), что измеряют посредством проточной цитометрии, с IC₅₀ приблизительно 52 пМ, приблизительно 51 пМ, приблизительно 46 пМ, приблизительно 19 пМ, приблизительно 16 пМ, приблизительно 10 пМ или приблизительно 6 пМ.

[00169] Согласно некоторым вариантам реализации ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, могут ингибировать ИЛ-21 опосредуемую выработку ИФНγ клетками NK, что измеряют посредством сингплексного анализа MSD с ИФНγ человека, с IC₅₀ менее чем приблизительно 100 пМ, менее чем приблизительно 400 пМ, менее чем приблизительно 100 пМ, менее чем приблизительно 75 пМ, менее чем приблизительно 60 пМ, менее чем приблизительно 50 пМ, менее чем приблизительно 40 пМ, менее чем приблизительно 30 пМ, менее чем приблизительно 20 пМ, менее чем приблизительно 15 пМ, менее чем приблизительно 10 пМ или менее чем приблизительно 5 пМ. Согласно определенным аспектам ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут ингибировать опосредуемую ИЛ-21 человека выработку ИФНγ линией клеток NK-92, что измеряют посредством сингплексного анализа MSD с ИФНγ человека, с IC₅₀ приблизительно 99 пМ, приблизительно 93 пМ, приблизительно 55 пМ, приблизительно 41 пМ или приблизительно 20 пМ. Согласно определенным аспектам ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут ингибировать опосредуемую ИЛ-21 яванской макаки выработку ИФНγ линией клеток NK-92, что измеряют посредством сингплексного анализа MSD с ИФНγ человека, с IC₅₀ приблизительно 83 пМ, приблизительно 81 пМ, приблизительно 60 пМ, приблизительно 37 пМ или приблизительно 3 пМ.

[00170] Согласно некоторым вариантам реализации ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут ингибировать опосредуемую ИЛ-21 дифференцировку стимулированных В-лимфоцитов, например, «необученных» В-лимфоцитов и/или В-лимфоцитов памяти, стимулированных анти-СБ40 и анти-IgM F(ab')2, в плазмоциты, например, плазмоциты, вырабатывающие IgG, что измеряют посредством проточной цитометрии или ELISA, с IC₅₀ менее чем приблизительно 150 нМ, менее чем приблизительно 75 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 30 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 1600 пМ, менее чем приблизительно 1400 пМ, менее чем приблизительно 1000 пМ, менее чем приблизительно 800 пМ, менее чем приблизительно 700 пМ или менее чем приблизительно 600 пМ. Согласно определенным аспектам ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, могут ингибировать опосредуемую ИЛ-21 человека дифференцировку стимулированных В-лимфоцитов, например, «необученных» В-лимфоцитов и/или В-лимфоцитов памяти, стимулированных анти-CD40 и анти-IgM F(ab')2, в плазмоциты, например, вырабатывающие IgG плазмоциты, что измеряют посредством цитометрии или ELISA с IC₅₀ приблизительно 115 нМ, приблизительно 47 нМ, приблизительно 1,5 нМ, приблизительно 777 пМ, приблизительно 618 пМ или приблизительно 573 пМ.

Согласно определенным аспектам ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут ингибировать опосредуемую ИЛ-21 яванской макаки дифференцировку стимулированных В-лимфоцитов, например, «необученных» В-лимфоцитов и/или В-лимфоцитов памяти, стимулированных анти-CD40 и анти-IgM F(ab')2, в плазмоциты, например, вырабатывающие IgG плазмоциты, что измеряют посредством цитометрии или ELISA с IC₅₀ приблизительно 74 нМ, приблизительно 30 нМ, приблизительно 9 нМ, приблизительно 1,3 нМ, приблизительно 1,0 нМ, приблизительно 775 пМ или приблизительно 659 пМ. Согласно определенным аспектам ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут ингибировать опосредуемую ИЛ-21 яванской макаки дифференцировку стимулированных В-лимфоцитов в плазмоциты, но не опосредуемую ИЛ-21 человека дифференцировку В-лимфоцитов в плазмоцит.

[00171] Согласно определенным аспектам ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут ингибировать дифференцировку В-лимфоцитов в плазмоциты, запускаемую CD4+Т-лимфоцитами, которые вырабатывают такие костимулирующие молекулы, как CD40L и такие В-лимфоцит-тропные цитокины, как ИЛ-21. Согласно другим аспектам ИЛ-21-связывающая молекула, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут ингибировать ИЛ-21-запускаемую пролиферацию «необученных» СВ4+Т-лимфоцитов человека.

V. Получение анти-ИЛ-21 антител и антигенсвязывающих фрагментов

[00172] Моноклональные анти-ИЛ-21 антитела можно получить при помощи технологий гибридомы, таких как способы, описанные у Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495. При применении способа гибридом мышь, хомяк или другое подходящее животное-хозяин иммунизируют, как описано выше, чтобы вызвать выработку лимфоцитов и антител, которые будут специфически связываться с иммунизирующим антигеном. Также лимфоциты можно иммунизировать in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют и гибридизуют с клеткой подходящей линии миеломы, например, при помощи полиэтиленгликоля, в результате чего образуются клетки гибридомы, которые затем можно подвергать селекции для отсеивания негибридизованных лимфоцитов и клеток миеломы. Гибридомы, которые вырабатывают моноклональные антитела, направленные специфически на избранный антиген, что определяют посредством иммунопреципитации, иммуноблоттинга или путем анализа связывания in vitro (например, радиоиммуноанализ (РИА); твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)), можно затем размножить в культуре in vitro или при помощи стандартных способов (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) или in vivo в опухолях-асцитах в организме животных. Моноклональные антитела затем можно очистить от питательной среды или асцитной жидкости, как описано выше для поликлональных антител.

[00173] В качестве альтернативы анти-ИЛ-21 моноклональные антитела можно также получить при помощи технологий рекомбинантных ДНК, которые описаны в Патенте США №4816567. Полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело, выделяют из зрелых В-лимфоцитов или гибридом, например, посредством РВ-ПЦР (полимеразная цепная реакция в реальном времени) с применением олигонуклеотидных праймеров, которые специфически амплифицируют гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи указанного антитела, и при помощи традиционных процедур определяют их последовательности. Выделенные полинуклеотиды, кодирующие тяжелые и легкие цепи, затем клонируют в подходящие векторы экспрессии, которые при их трансфекции в клетки-хозяева, например, клетки E. coli, клетки почки обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые в другом случае не вырабатывают белок иммуноглобулин, приводят к генерированию моноклональных антител указанными клетками-хозяевами. Также рекомбинантные анти-ИЛ-21 моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты желаемых видов можно выделить из библиотек фагового дисплея, экспрессирующих CDR желаемых видов, как описано у (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol, 222:581-597).

[00174] Полинуклеотид(ы), кодирующий анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно дополнительно модифицировать самыми разными способами с применением технологии рекомбинантных ДНК с целью генерирования альтернативных антител. Согласно некоторым вариантам реализации константные домены легких и тяжелых цепей, например, моноклонального антитела мыши можно заменить на (1) такие участки, например, из антитела человека, чтобы сгенерировать химерное антитело, или (2) на полипептид не-иммуноглобулин, чтобы сгенерировать гибридное антитело. Согласно некоторым вариантам реализации указанные константные области укорачивают или удаляют, чтобы сгенерировать желаемый фрагмент моноклонального антитела. Для оптимизации специфичности, сродства и др. моноклонального антитела, можно применять сайт-направленный мутагенез или мутагенез высокой плотности.

[00175] Согласно определенным вариантам реализации указанное анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является антителом человека или его антигенсвязывающим фрагментом. Антитела человека можно получать напрямую при помощи разных технологий, известных в технике. Можно сгенерировать иммобилизованные В-лимфоциты человека, иммунизированные in vitro или выделенные у иммунизированного индивидуума, которые вырабатывают антитело, направленное на целевой антиген (See, e.g., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; и Патент США 5750373).

[00176] Также указанное анти-ИЛ-21 антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент можно выделять из библиотеки фагов, если такая библиотека фагов экспрессирует антитела человека, как описано, например, у Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381, and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Способы генерирования и применения библиотек фагов, генерирующих антитела, также описаны в Патентах США №5969108, 6172197, 5885793, 6521404; 6544731; 6555313; 6582915; 6593081; 6300064; 6653068; 6706484; и 7264963; а также у Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018 (каждый источник включен в настоящую заявку посредством ссылки на его полное содержание).

[00177] В технике известны стратегии «созревания сродства» и стратегии перетасовки цепей (Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783, включена в настоящую заявку посредством ссылки на ее полное содержание), и их можно применять для генерирования антител человека с высоким сродством или их антигенсвязывающих фрагментов.

[00178] Согласно некоторым вариантам реализации анти-ИЛ-21 моноклональное антитело может быть гуманизированным антителом. Также можно применять способы конструирования, гуманизации или изменения поверхностных свойств антител видов, отличных от человека, или антител человека, и они хорошо известны в технике. Гуманизированное, с измененными поверхностными свойствами или сконструированное аналогичным образом антитело может содержать один или более аминокислотных остатков из источника, отличного от организма человека, например, но без ограничений, от мыши, крысы, кролика, низшего примата или другого млекопитающего. Указанные аминокислотные остатки не из антител человека заменяют остатками, которые часто называют «импортными» остатками, которые обычно взяты из «импортного» вариабельного, константного или другого домена, с известной последовательностью, характерной для антитела человека. Такие импортированные последовательности можно применять для снижения иммуногенности или снижения, повышения или модифицирования связывания, сродства, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, времени полувыведения или любых других соответствующих характеристик, которые известны в технике. Как правило, остатки CDR непосредственно и наиболее существенно участвуют во влиянии на связывание с ИЛ-21. Следовательно, сохраняют часть или все последовательности CDR не из антитела человека или из антитела человека, тогда как последовательности вариабельных и константных участков, не характерных для человека, могут быть заменены на аминокислоты из антитела человека или другие аминокислоты.

[00179] Также антитела могут быть необязательно гуманизированными, с измененными поверхностными свойствами, рекомбинантными или антителами человека, сконструированными так, чтобы у них сохранялось высокой сродство к антигену ИЛ-21 и другие полезные биологические свойства. Для достижения данной цели гуманизированные (или антитела человека) или рекомбинантные анти-ИЛ-21 антитела и антитела с измененными поверхностными свойствами можно получать необязательно в процессе анализа исходных последовательностей и разных концептуальных гуманизированных и рекомбинантных продуктов с применением трехмерных моделей исходных, рекомбинантных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и известны специалистам в данной области техники. Есть компьютерные программы, которые иллюстрируют и показывают вероятные трехмерные конформационные структуры для последовательностей избранных кандидатов-иммуноглобулинов. Просмотр таких изображений позволяет анализировать вероятную роль остатков в функционировании последовательности кандидата-иммуноглобулина, т.е. анализировать, как остатки влияют на способность кандидата-иммуноглобулина связываться со своим антигеном, таким как ИЛ-21. Таким образом, остатки каркасных участков (FW) можно выбирать из консенсусных и импортных последовательностей, и сочетать их так, чтобы получать желаемые характеристики антитела, такие как повышенное сродство к целевому антигену(ам).

[00180] Гуманизацию, изменение поверхностных свойств или конструирование анти-ИЛ-21 антител или их антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению можно проводить любым известным способом, без ограничений таким как описаны в Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Патентах США №5639641, 5723323; 5976862; 5824514; 5817483; 5814476; 5763192; 5723323; 5766886; 5714352; 6204023; 6180370; 5693762; 5530101; 5585089; 5225539; 4816567, 7557189; 7538195; и 7,342,110; заявках на международные патенты PCT/US 98/16280; PCT/US 96/18978; PCT/US 91/09630; PCT/US 91/05939; PCT/US 94/01234; PCT/GB 89/01334; PCT/GB 91/01134; PCT/GB 92/01755; публикациях заявок на международные патенты № WO 90/14443; WO 90/14424; WO 90/14430; и публикации заявки на европейский патент № ЕР 229246; каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки на его полное содержание, включая ссылки, процитированные в настоящей заявке.

[00181] Анти-ИЛ-21 антитела и их антигенсвязывающие фрагменты можно также получать в организме трансгенных мышей, содержащих локусы иммуноглобулина человека, которые способны при иммунизации вырабатывать полный репертуар антител человека в отсутствии выработки эндогенных иммуноглобулинов. Такой подход описан в патентах США №5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016.

[00182] Согласно определенным вариантам реализации предложен фрагмент анти-ИЛ-21 антитела. Традиционно указанные фрагменты получают в процессе протеолитического расщепления интактных антител (например, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81). Согласно определенным вариантам реализации фрагменты анти-ИЛ-21 антитела получают рекомбинантным способом. Фрагменты антител Fab, Fv и scFv также можно экспрессировать в клетках E.coli или других клетках-хозяевах, и секретировать из них, что позволяет получать такие фрагменты в больших количествах. Такие фрагменты анти-ИЛ-21 антител можно также выделить из библиотек фагов антител, обсуждаемых выше. Фрагменты анти-ИЛ-21 антител могут быть также линейными антителами, которые описаны в патенте США №5641870. Специалистам в данной области техники должны быть очевидны другие способы получения фрагментов антител.

[00183] Согласно настоящему изобретению способы можно адаптировать для получения одноцепочечных антител, специфичных в отношении ИЛ-21 (см., например, патент США №4946778). Кроме того, способы можно адаптировать для конструирования библиотек экспрессии Fab (см., например, Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)), чтобы была возможна быстрая и эффективная идентификация моноклональных фрагментов Fab с желаемой специфичностью к ИЛ-21, или его производным, фрагментам, аналогам или гомологам. Фрагменты антител можно получать при помощи способов, известных в технике, включая без ограничения: (а) фрагмент F(ab')2, получаемый путем расщепления молекулы антитела пепсином; (б) фрагмент Fab, генерируемый путем восстановления дисульфидных мостиков во фрагменте F(ab')2, (в) фрагмент Fab, генерируемый путем обработки молекулы антитела папаином и восстановителем, и (г) фрагменты Fv.

[00184] Согласно определенным аспектам анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно модифицировать, чтобы увеличить время их полувыведения из сыворотки. Этого можно достичь, например, путем включения эпитопа связывания рецептора реутилизации или фрагмента антитела посредством мутации соответствующего участка в антителе или фрагменте антитела или путем включения эпитопа в пептидную метку, которые затем объединяются в антитело или фрагмент антитела на любом из концов или посередине (например, путем синтеза ДНК или пептидов), или путем мутации YTE. В технике известны другие способы увеличения времени полувыведения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из сыворотки, например, конъюгация с гетерологичной молекулой, такой как ПЭГ.

[00185] Гетероконъюгаты анти-ИЛ-21 антител и их антигенсвязывающих фрагментов также попадают в объем настоящего изобретения. Гетероконъюгаты антител состоят из двух ковалентно связанных антител. Например, было сделано предположение, что такие антитела нацеливают иммунные клети на нежелательные клетки (см, например, патент США №4676980). Предполагается, что гетероконъюгаты анти-ИЛ-21 антител и их антигенсвязывающих фрагментов можно получить in vitro известными способами в области химии синтеза белков, включая способы с участием агентов, образующих поперечные связи. Например, иммунотоксины можно сконструировать при помощи реакции дисульфидного обмена или путем образования тиоэфиных связей. Примеры подходящих реагентов для данной цели включают иммунотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат.

[00186] Модифицированные анти-ИЛ-21 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые предложены в настоящей заявке, могут содержать вариабельный участок любого типа, который обеспечивает ассоциацию указанного антитела или полипептида с ИЛ-21. В этой связи вариабельный участок может содержать или быть получен из организма млекопитающего любого типа, у которого индуцируют гуморальный ответ, и оно генерирует иммуноглобулины на желаемый антиген. Сам по себе вариабельный участок анти-ИЛ-21 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может происходить, например, из антитела человека, мыши, низших приматов (например, яванской макаки, макак и др.) или волка. Согласно некоторым вариантам реализации и вариабельные, и константные участки модифицированных анти-ИЛ-21 антител или антигенсвязывающих фрагментов происходят из антитела человека. Согласно другим вариантам реализации вариабельные участки совместимых антител (обычно, получаемые из нечеловеческого источника) можно сконструировать или изготовить специально для улучшения связывающих свойств или для уменьшения иммуногенности указанной молекулы. Согласно данному аспекту вариабельные участки, применимые в настоящем изобретении, можно гуманизировать или изменять другим способом путем включения импортируемых аминокислотных последовательностей.

[00187] Согласно определенным вариантам реализации вариабельные домены как в тяжелых, так и в легких цепях анти-ИЛ-21 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента изменяют путем по меньшей мере частичной замены одного или более CDR и/или частичной замены каркасных участков и изменения последовательности. Хотя CDR могут быть получены из антитела того же класса или даже подкласса, что и антитело, из которого происходят каркасные участки, предполагается, что указанные CDR будут получены из антитела другого класса, и согласно определенным вариантам реализации из антитела других видов. Не обязательно заменять все CDR на полные CDR из донорского вариабельного участка, чтобы перенести антигенсвязывающую способность от одного вариабельного домена к другому. Скорее необходимо переносить те остатки, которые необходимы для сохранения активности антигенсвязывающего сайта. Если учесть объяснение, которое дано в патентах США №5585089, 5693761 и 5693762, получение функционального антитела со сниженной иммуногенностью вполне входит в компетенцию специалистов в данной области техники, либо путем проведения стандартных экспериментов, либо методом проб и ошибок.

[00188] Специалисты в данной области техники должны понимать, что несмотря на изменения в вариабельном участке модифицированные анти-ИЛ-21 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению будут включать антитела (например, полноразмерные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты), в которых по меньшей мере части или более доменов константных участков была удалена или по-другому изменена так, чтобы придать желаемые биохимические характеристики, такие как усиленная локализация в опухоли или уменьшенное время полувыведения из сыворотки по сравнению с антителом с приблизительно такой же иммуногенностью, содержащим нативный или неизмененный константный участок. Согласно некоторым вариантам реализации константный участок модифицированных антител будет содержать константный участок из антитела человека. Модификации константного участка, совместимого с настоящим изобретением, включают вставки, делеции или замены одной или более аминокислот в одном или более доменах. То есть, модифицированные антитела, раскрываемые в настоящей заявке, могут содержать изменения или модификации в одной или более из трех константных доменов тяжелых цепей (CH1, СН2 или СН3) и/или в константном домене легкой цепи (CL). Согласно некоторым вариантам реализации предусмотрены модифицированные константные участки, в которых один или более доменов частично или полностью делетированы. Согласно некоторым вариантам реализации указанные модифицированные антитела могут содержать конструкты или варианты с делетироваными доменами, где был удален весь домен СН2 (конструкты ΔСН2). Согласно некоторым вариантам реализации исключенный домен константного участка может быть заменен на короткий аминокислотный спейсер (например, 10 остатков), который придает некоторую молекулярную гибкость, обычно нарушенную из-за отсутствия константного участка.

[00189] В технике известно, что помимо конфигурации константный участок опосредует несколько эффекторных функций. Например, связывание С1 компонента комплемента с антителами активирует систему комплемента. Активация комплемента важна при опсонизации и лизисе клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительный ответ, а также может участвовать в аутоиммунной гиперчувствительности. Также антитела связываются с клетками через участок Fc, с рецепторным сайтом Fc на участке антитела Fc, связываясь с рецептором Fc на поверхности клетки. Существует целый ряд рецепторов Fc, которые специфичны в отношении разных классов антител, включая IgG (гамма-рецепторы), IgE (эта-рецепторы), IgA (альфа-рецепторы) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антитела с рецепторами Fc на поверхности клеток запускает ряд важных и разнообразных биологических реакций, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителами клеток-мишеней (называется антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью или АЦКЗ), выделение воспалительных медиаторов, плацентарный перенос и контроль над выработкой иммуноглобулинов.

[00190] Согласно определенным вариантам реализации предложены анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для изменения эффекторных функций, которые в свою очередь влияют на биологический профиль вводимого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Например, делеция или инактивация (посредством точечной мутации или других способов) домена константного участка может уменьшить связывание с рецептором Fc циркулирующего модифицированного антитела. В других вариантах реализации может быть так, что модификации константных участков, соответствующих настоящему изобретению, уменьшают связывание комплемента и, таким образом, снижают время полувыведения из сыворотки и неспецифическую ассоциацию конъюгированного цитотоксина. Некоторые другие модификации константного участка можно применять, чтобы исключить дисульфидные связи или олигосахаридные группы, что позволяет усилить локализацию благодаря повышенной специфичности к антигену или гибкости антитела. Аналогично, модификации в константном участке согласно настоящему изобретению можно легко произвести при помощи хорошо известных биохимических или молекулярных рекомбинантных технологий, которые находятся в компетенции специалистов в данной области техники.

[00191] Согласно определенным вариантам реализации ИЛ-21-связывающая молекула, которая является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, не обладает одной или более эффекторными функциями. Например, согласно некоторым вариантам реализации указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не обладает активностью антителзависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) и/или активностью комплемент-зависимой цитотоксичности (КЗЦ). Согласно определенным вариантам реализации анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связываются с рецептором Fc и/или факторами комплемента. Согласно определенным вариантам реализации анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не обладают эффекторной функцией.

[00192] Согласно определенным вариантам реализации анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть сконструированы путем слияния домена СН3 напрямую с шарнирной областью соответствующих модифицированных антител или их фрагментов. В других конструктах между шарнирным участком и модифицированными доменами СН2 и/или СН3 может быть введен пептидный спейсер. Например, можно экспрессировать совместимые конструкты, в которых домен СН2 был удален, а оставшийся домен СН3 (модифицированный или немодифицированный) соединен с шарнирным участком спейсером из 5-20 аминокислот. Такой спейсер можно добавлять, например, чтобы регуляторные элементы константного домена оставались свободными и доступными, или чтобы шарнирная область оставалась гибкой. Аминокислотные спейсеры могут, в некоторых вариантах реализации, обладать доказанной иммуногенностью и вызывать нежелательный иммунный ответ на указанный конструкт. Следовательно, согласно определенным вариантам реализации любой спейсер, вводимый в конструкт, может быть относительно неиммуногенным, или даже вообще исключен, чтобы сохранять желаемое биохимические качества модифицированных антител.

[00193] Кроме делеции целых доменов константного участка анти-ИЛ-21 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в настоящей заявке, можно модифицировать путем частичной делеции или замены немногих или даже одной аминокислоты в константном участке. Например, мутации в единственной аминокислоте в избранных областях домена СН2 может быть достаточно, чтобы существенно уменьшить связывание с Fc и тем самым повысить локализацию в опухоли. Аналогично, можно частично или полностью удалить один или более доменов константных участков, которые контролируют эффекторные функции (например, связывание с комплементом C1Q). Такие частичные делеции константных участков могут улучшат избранные характеристики антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (например, время полувыведения из сыворотки), при сохранении других желаемых функций, ассоциированных с интактным доменом подвергнутого изменению константного участка. Кроме того, константные участки раскрываемых анти-ИЛ-21 антител и их антигенсвязывающих фрагментов можно модифицировать путем мутации или замены одной или более аминокислот, которые улучшают профиль получаемого конструкта. В связи с этим возможно нарушить активность, обеспечиваемую консервативным сайтом связывания (например, связывание с Fc), сохранив по существу конфигурацию и профиль иммуногенности модифицированного антитела иди его антигенсвязывающего фрагмента. Определенные варианты реализации могут включать добавление одной или более аминокислот в константный участок для улучшения желаемых характеристик, таких как уменьшение или увеличение эффектоной функции или обеспечение присоединения большего числа цитотоксина или углевода. Согласно таким вариантам реализации может быть желательно ввести или реплицировать специфические последовательности, полученные из избранных доменов константных участков.

[00194] Также настоящее изобретение включает в себя варианты и эквиваленты, которые по существу гомологичны анти-ИЛ-21 антителам мыши, химерным, гуманизированным анти-ИЛ-21 антителам или анти-ИЛ-21 антителам человека, или их антигенсвязывающим фрагментам, описанным в настоящей заявке. Например, они могут содержать консервативные замены - мутации, т.е., замену одной или более аминокислот на сходную аминокислоту. Например, под консервативной заменой понимают замену аминокислоты на другую аминокислоту в пределах того же общего класса, например, одной кислой аминокислоты на другую кислую аминокислоту, одной основной аминокислоты на другую основную аминокислоту, или одной нейтральной аминокислоты на другую нейтральную аминокислоту. Специалисты в данной области техники хорошо знают, что означает консервативная аминокислотная замена.

[00195] Анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно дополнительно модифицировать так, чтобы оно содержало дополнительные химические группы, которые в норме не являются частью указанного белка. Такие группы могут также уменьшать или устранять любые нежелательные побочные эффекты белков и т.п. Обзор таких групп можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).

VI. Полинуклеотиды, кодирующие ИЛ-21-связывающие молекулы и их экспрессия

[00196] В настоящей заявке предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептид, который специфически связывается с ИЛ-21 или его антигенсвязывающий фрагмент. Например, согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует анти-ИЛ-21 антитело или кодирует антигенсвязывающий фрагмент такого антитела. Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть в форме РНК или в форме ДНК. ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК; и может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и если она одноцепочечная, то может быть кодирующей цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью.

[00197] Согласно определенным вариантам реализации полинуклеотид может быть изолированным. Согласно определенным вариантам реализации полинуклеотид может быть по существу чистым. Согласно определенным вариантам реализации полинуклеотид может быть кДНК или может быть получен из кДНК. Согласно определенным вариантам реализации полинуклеотид может быть получен рекомбинантным способом. Согласно определенным вариантам реализации полинуклеотид может содержать кодирующую последовательность для зрелого полипептида, объединенного в той же рамке считывания с полинуклеотидом, который помогает, например, при экспрессии и секреции полипептида из клетки-хозяина (например, лидерная последовательность, которая функционирует как секреторная последовательность для управления транспортом полипептида из клетки). Полипептид, содержащий лидерную последовательность, является белком-предшественником, и лидерная последовательность может отщепляться от него для образования зрелой формы полипептида. Также указанные полинуклеотиды могут кодировать ИЛ-21-связывающий белок-предшественник, который представляет собой зрелый белок плюс дополнительные аминокислотные остатки на 5'-конце.

[00198] Согласно определенным аспектам настоящей заявки предложен изолированный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую VL антитела, причем указанный VL содержит аминокислотные последовательности VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены в одном или более из VL-CDR, последовательностям: SEQ ID №:12, 13 и 14, SEQ ID №:34, 35 и 36, SEQ ID №:48, 49 и 50 или SEQ ID №:58, 59 и 60, соответственно.

[00199] Также в настоящей заявке предложен изолированный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую VH антитела, причем указанный VH содержит аминокислотные последовательности VH-CDR 1, VH-CDR2 и VH-CDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены в одном или более из VH-CDR, последовательностям: SEQ ID №:7, 8 и 9, SEQ ID №:29, 30 и 31, SEQ ID №:43, 44 и 45 или SEQ ID №:53, 54 и 55, соответственно.

[00200] Также в настоящей заявке предложен изолированный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую VL антитела, причем указанный VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична эталонной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №:11, SEQ ID №:17, SEQ ID №:21, SEQ ID №:25, SEQ ID №:33, SEQ ID №:39, SEQ ID №:40, SEQ ID №:47 и SEQ ID №:57.

[00201] Кроме того, в настоящей заявке предложен изолированный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую VH антитела, причем указанный VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична эталонной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №:6, SEQ ID №:15, SEQ ID №:19, SEQ ID №:23, SEQ ID №:28, SEQ ID №:40, SEQ ID №:37, SEQ ID №:38, SEQ ID №:42 и SEQ ID №:52.

[00202] Согласно определенным аспектам антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH или VL, кодируемые полинуклеотидом, описанным выше, могут специфически связываться с ИЛ-21, например, ИЛ-21 человека или яванской макаки. В определенных вариантах реализации такое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут специфически связываться с тем же эпитопом, что и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL 19Е3, 9F11, 8В6 или 9Н10. Согласно определенным аспектам в настоящей заявке предложен полинуклеотид или сочетание полинуклеотидов, кодирующих связывающую молекулу, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с ИЛ-21.

[00203] Дополнительно предложен вектор, содержащий полинуклеотид, описанный выше. Подходящие векторы описаны в других разделах настоящей заявки и известны специалистам в данной области техники.

[00204] Согласно определенным аспектам в настоящей заявке предложена композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая полинуклеотид или вектор, как описаны выше, необязательно дополнительно содержащая одну или более носителей, растворителей, вспомогательных веществ или других добавок.

[00205] Согласно определенным аспектам в настоящей заявке предложена композиция, содержащая: полинуклеотид, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую VH, и полинуклеотид, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую VL. Согласно данному аспекту VL и VH вместе могут содержать аминокислотные последовательности VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, полностью идентичные или идентичные за исключением восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотной замены в одном или более из CDR, последовательностям: SEQ ID №:12, 13, 14, 7, 8 и 9, SEQ ID №:34, 35, 36, 29, 30 и 31, SEQ ID №:48, 49, 50, 43, 44 и 45, или SEQ ID №:58, 59, 60, 53, 54 и 55, соответственно.

[00206] Согласно дополнительным аспектам в настоящей заявке предложена полинуклеотидная композиция, содержащая: полинуклеотид, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую VH, и полинуклеотид, которые содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую VL, причем указанные VL и VH содержат, соответственно, аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичные эталонным аминокислотным последовательностям: SEQ ID №:6 и SEQ ID №:11, SEQ ID №:15 и SEQ ID №:17, SEQ ID №:19 и SEQ ID №:21, SEQ ID №:23 и SEQ ID №:25, SEQ ID №:28 и SEQ ID №:33, SEQ ID №:40 и SEQ ID №:39, SEQ ID №:37 и SEQ ID №:39, SEQ ID №:38 и SEQ ID №:39, SEQ ID №:37 и 40, SEQ ID №:42 и SEQ ID №:47 или SEQ ID №:52 и SEQ ID №:57, соответственно.

[00207] Согласно определенным аспектам указанные VH и VL кодируются нуклеотидными последовательностями, которые по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичны нуклеотидным последовательностям SEQ ID №:5 и SEQ ID №:10, SEQ ID №:27 и SEQ ID №:32, SEQ ID №:41 и SEQ ID №:46 или SEQ ID №:51 и SEQ ID №:56, соответственно.

[00208] В полинуклеотидной композиции, раскрываемой выше, полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую VH, и полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую VL, могут находиться в одном векторе или могут быть в отдельных векторах. Следовательно, в настоящей заявке предложены один или более векторов, содержащих полинуклеотидную композицию, описанную выше.

[00209] В некоторых вариантах реализации полинуклеотидная композиция, кодирующая VH и VL, описанные выше, может кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который может специфически связываться с ИЛ-21, например, ИЛ-21 человека или яванской макаки. Согласно некоторым аспектам указанная полинуклеотидная композиция кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые могут специфически связываться с тем же эпитопом, что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащего VH и VL 19Е3, 9F11, 8B6 или 9Н10.

[00210] Также в настоящей заявке предложена клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид, полинуклеотидную композицию или вектор, предложенные выше, где клетка-хозяин может, в некоторых вариантах реализации, экспрессировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с ИЛ-21. Такую клетку-хозяин можно применять при реализации способа получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, предложенных в настоящей заявке, причем указанный способ включает (а) культивирование клетки-хозяина и (б) выделение экспрессированного указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из указанной клетки-хозяина.

[00211] Согласно определенным вариантам реализации указанные полинуклеотиды содержат кодирующую последовательность для зрелого ИЛ-21-связывающего полипептида, например, анти-ИЛ-21 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, соединенных в той же рамке считывания с маркерной последовательностью, которая позволяет, например, очистить кодируемый полипептид. Например, такой маркерной последовательностью может быть гексагистидиновая метка, доставляемая вектором pQE-9, чтобы обеспечить очистку зрелого полипептида, соединенного с маркером в случае бактериального хозяина, или маркерной последовательностью может быть гемагглютининовая (ГА) метка, полученная из белка гемагглютинина вируса гриппа, когда применяют клетку-хозяина из организма млекопитающих (например, клетки COS-7).

[00212] Также предложены варианты полинуклеотидов. Варианты полинуклеотидов могут содержать изменения в кодирующих областях, некодирующих областях, или в тех, и в других. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полинуклеотидов содержат изменения, которые приводят к молчащим заменам, вставкам или делециям, но не приводят к изменению свойств или активности кодируемого полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полинуклеотидов получают в результате молчаливых замен вследствие вырожденности генетического кода. Варианты полинуклеотидов можно получать с самыми разными целями, например, чтобы оптимизировать экспрессию кодонов для конкретного хозяина (смена кодонов в мРНК человека на те, которые предпочтительны для бактериального хозяина, такого как Е. coli). Также предложены векторы и клетки, содержащие полинуклеотиды, описанные в настоящей заявке.

[00213] Согласно некоторым вариантам реализации последовательность ДНК, кодирующую ИЛ-21-связывающую молекулу, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, можно сконструировать путем химического синтеза с применением автоматического синтезатора ДНК. Такие олигонуклеотиды можно разработать на основе аминокислотной последовательности желаемого полипептида и выбора тех кодонов, которые предпочтительны в клетке-хозяине, в которой будет вырабатываться рассматриваемый рекомбинантный полипептид. Для синтеза последовательности изолированного полинуклеотида, кодирующего рассматриваемый изолированный полипептид, можно применять стандартные способы. Например, для конструирования гена с возможной последовательностью, восстановленной по полипептиду, можно применять полную аминокислотную последовательность. Также можно синтезировать ДНК-олигомер, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретный изолированный полипептид. Например, можно синтезировать несколько маленьких олигонуклеотидов, кодирующих части желаемого полипептида, а затем сшить их. Отдельные олигонуклеотиды обычно содержат 5' или 3' «липкие» концы для комплементарной сборки.

[00214] После сборки (путем синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другого способа) полинуклеотидные последовательности, кодирующие конкретный рассматриваемый изолированный полипептид, можно ввести в вектор экспрессии и функционально связать с последовательностью, регулирующей экспрессию, подходящую для экспрессии указанного белка в желаемом хозяине. Чтобы достичь веского уровня экспрессии трансфецируемого гена в организме хозяина, ген можно функционально связать или ассоциировать с последовательностями, регулирующими экспрессию на уровне транскрипции и трансляции, которые функциональны у избранного для экспрессии хозяина.

[00215] Согласно определенным вариантам реализации для амплификации и экспрессии ДНК, кодирующей анти-ИЛ-21 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, применяют рекомбинантные векторы экспрессии. Рекомбинантные векторы экспрессии являются реплицируемыми конструктами ДНК, которые содержат синтетические или полученные из кДНК фрагменты ДНК, кодирующие полипептидную цепь анти-ИЛ-21 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, функционально связанные с соответствующими элементами регуляции транскрипции или трансляции, полученными из генов млекопитающих, микроорганизмов, вирусов или насекомых. Как правило единица транскрипции содержит комплекс из (1) генетического элемента или элементов, выполняющих регуляторную функцию при экспрессии генов, например, промоторы или энхансеры транскрипции, (2) структурную или кодирующую последовательность, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в белок, и (3) соответствующие последовательности инициации и терминации транскрипции и трансляции, которые описаны ниже. Такие регуляторные элементы могут включать последовательность оператора для управления транскрипцией. Может быть дополнительно включена способность реплицироваться в организме хозяина, которую обычно придают при помощи точки начала репликации. Участки ДНК функционально связаны, когда они функционально взаимодействуют друг с другом. Например, ДНК для сигнального пептида (секреторная лидерная последовательность) функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется как предшественник, который участвует в секреции указанного полипептида; промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если она контролирует транскрипцию указанной последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что он делает возможной трансляцию. Структурные элементы, предназначенные для применения в системах экспрессии в клетках дрожжей, включают лидерную последовательность, которая делает возможной внеклеточную секрецию транслируемого белка клеткой-хозяином. В качестве альтернативы, когда рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, указанный белок может включать В-концевой остаток метионина. Данный остаток может необязательно впоследствии отщепляться от экспрессируемого рекомбинантного белка с образованием конечного продукта.

[00216] Выбор последовательности, регулирующей экспрессию, и вектор экспрессии должен зависеть от выбора хозяина. Можно применять широкий спектр сочетаний хозяев для экспрессии/векторов. Применимые векторы экспрессии для эукариотических клеток включают, например, векторы, содержащие последовательности, регулирующие экспрессию, из SV40, вируса папиломы крупного рогатого скота, аденовируса и цитомегаловируса. Применимые векторы экспрессии для бактериальных хозяев включают известные бактериальные плазмиды, такие как плазмиды из E. coli, включая pCR 1, pBR322, рМВ9 и их производные, более широкий спектр плазмид хозяев, такие как М13 и нитчатые фаги на основе одноцепочечной ДНК.

[00217] Подходящие клетки-хозяева для экспрессии ИЛ-21 - связывающей молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента включают клетки прокариот, дрожжей, насекомых или высших эукариот под контролем соответствующих промоторов. Прокариоты включают грамположительные или грамотрицательные организмы, например, E. coli или палочки. Клетки высших эукариот включают общепринятые линии клеток, происходящих из организма млекопитающих, описанные ниже. Также можно применять системы трансляции в бесклеточной среде. Дополнительную информацию о способах получения белка, включая получение антител можно найти, например, в публикации патента США №2008/0187954, патентах США №6413746 и 6660501, и публикации заявки на международный патент № WO 04009823, каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки на ее полное содержание.

[00218] Для экспрессии рекомбинантных ИЛ-21-связывающих молекул, например, анти-ИЛ-21 антител или их антигенсвязывающих фрагментов с преимуществами можно применять разные системы на основе культур клеток млекопитающих или насекомых. Экспрессию рекомбинантных белков в клетках млекопитающих можно проводить, поскольку такие белки как правило правильно скручиваются, модифицируются должным образом и полностью функциональны. Примеры подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих включают линии НЕК-293 и НЕК-293Т, линии COS-7 из клеток почек обезьяны, описанные у (Cell 23:175, 1981), и другие линии клеток, включая, например, L-клетки, С127, 3Т3, линию клеток яичников китайского хомячка (СНО), HeLa и ВНК. Векторы экспрессии для клеток млекопитающих могут содержать нетранскрибируемые элементы, такие как точка начала репликации, подходящий промотор и энхансер, соединенные с геном, который требуется экспрессировать, и другие 5' или 3'-фланкирующие нетраснкрибируемые последовательности, и 5' или 3'-нетранскрибирующие последовательности, такие как необходимые сайты связывания хромосом, сайт полиаденилирования, сайты донора и акцептора сплайсированного фрагмента и последовательности терминации транскрипции. Системы для на основе бакуловируса получения гетерологичных белков в клетках насекомых рассматриваются у Luckow and Summers, BioTechnology 6:47 (1988).

[00219] ИЛ-21-связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, полученные при помощи трансформированного хозяина, можно очищать в соответствии с любым подходящим способом. Такие стандартные способы включают хроматографию (например, ионообменную, аффинную хроматографию и колоночную хроматографию молекулярных сит), центрифугирование, дифференциальное растворение, или можно применять любую другую стандартную технологию для очистки белка. Чтобы было легче очищать белок путем прохождения через соответствующую аффинную колонку, можно присоединить к белку такие аффинные метки, как гексагистидин, домен связывания мальтозы, последовательность оболочки вируса гриппа и глутатион-8-трансферазу. Изолированные белки также можно охарактеризовать физически при помощи таких технологий, как протеолиз, ядерный магнитный резонанс и рентгеновская кристаллография.

[00220] Например, надосадочные жидкости из систем, которые секретируют рекомбинантный белок в питательную среду, можно сначала концентрировать при помощи имеющегося в продаже фильтра для концентрирования белка, например, блока ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon. После этапа концентрирования концентрат можно нанести на соответствующую матрицу для очистки. В качестве альтернативы можно применять анионообменные смолы, например, матрицу или субстрат, содержащие выступающие диэтиламиноэтиловые (ДЭАЭ) группы. Матрицы могут быть из акриламида, агарозы, декстрана, целлюлозы или других типов, обычно применяемых при очистке белка. В качестве альтернативы можно применять катионообменный этап. Подходящие катионные обменники включают разные нерастворимые матрицы, состоящие из сульфопропильных или карбоксиметильных групп. Кроме того, для дальнейшей очистки ИЛ-21-связывающей молекулы можно применять один или более этапов высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ВЭЖХ-ОФ) с применением гидрофобных сред для ВЭЖХ-ОФ, например, силикагеля с выступающими метальными или другими алифатическими группами. Для получения однородного рекомбинантного белка можно также применять некоторые или все из вышеперечисленных этапов очистки, в разных сочетаниях.

[00221] Рекомбинантный ИЛ-21-связывающий белок, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные в культуре бактерий, можно выделить, например, путем первичной экстракции из конгломерата клеток, последующего одного или более этапов концентрирования, этапов высаливания, водной ионообменной хроматографии или эксклюзионной хроматографии. В качестве конечных этапов очистки можно применять высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Клетки микроорганизмов, применяемые при экспрессии рекомбинантного белка, можно разрушать любым традиционным способом, включая циклы замораживания-размораживания, обработку ультразвуком, механическое разрушение или применение лизирующих агентов.

[00222] Способы, известные в технике для очистки антител и других белков, также включают, например, способы, описанные в публикации патента США №2008/0312425, 2008/0177048 и 2009/0187005, каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки на ее полное содержание.

VI. Способы лечения с применением терапевтических анти-ИЛ-21 антител

[00223] Предложены способы применения ИЛ-21-связывающих молекул, например, анти-ИЛ-21 антител, включая их антигенсвязывающие фрагменты, варианты и производные, для лечения пациентов, страдающих заболеванием, ассоциированным с экспрессией ИЛ-21 или ИЛ-21-секретирующими клетками. Под «ИЛ-21-секретирующими» клетками понимают клетки, экспрессирующие ИЛ-21, например, активированные Т-хелперы. Способы определения экспрессии ИЛ-21 хорошо известны в технике и включают без ограничений способы ПЦР, иммуногистохимию, проточную цитометрию, Вестерн-блот, ELISA и подобные.

[00224] Следующее обсуждение относится к способам диагностики и способам лечения разных заболеваний и расстройств при помощи ИЛ-21-связывающей молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, которые сохраняют желаемые свойства анти-ИЛ-21 антител, предложенных в настоящей заявке, например, способные специфически связывать ИЛ-21 и противодействовать активности ИЛ-21. Согласно некоторым вариантам реализации ИЛ-21-связывающие молекулы являются антителами мыши, человека или гуманизированными антителами. Согласно некоторым вариантам реализации анти-ИЛ-21-антитело идентично моноклональным антителам мыши 19Е3, 9F11, 9Н10 или 8В6. Согласно некоторым вариантам реализации анти-ИЛ-21-антитело получают из одного из моноклональных антител мыши 19Е3, 9F11, 9Н10 или 8В6. Согласно определенным вариантам реализации полученное антитело является гуманизированным антителом. Согласно другим вариантам реализации ИЛ-21-связывающа молекула содержит YTE-мутированный константный участок IgG1 человека. Согласно специфическим вариантам реализации указанной ИЛ-21-связывающей молекулой является K44VHa-N56Q.

[00225] Согласно одному варианту реализации лечение включает нанесение или введение ИЛ-21-связывающих молекул, например, анти-ИЛ-21 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, предложенных в настоящей заявке, субъекту или пациенту, или нанесение или введение указанной ИЛ-21-связывающей молекулы на изолированную ткань или линию клеток от субъекта или пациента, причем указанный субъект или пациент страдают заболеванием, симптомом заболевания или предрасположены к заболеванию. Согласно еще одному варианту реализации лечение также включает нанесение или введение фармацевтической композиции, содержащей ИЛ-21-связывающую молекулу, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, предложенные в настоящей заявке, субъекту или пациенту, или нанесение или введение фармацевтической композиции, содержащей ИЛ-21-связывающую молекулу, на изолированную ткань или линию клеток от субъекта или пациента, которые страдают заболеванием, симптомом заболевания или предрасположены к заболеванию.

[00226] ИЛ-21-связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела его антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, предложенные в настоящей заявке, применимы при лечении разных воспалительных, иммуно-обусловленных или аутоиммунных заболеваний или расстройств. Такие воспалительные, иммуно-обусловленные или аутоиммунные заболевания или расстройства могут включать заболевание, запускаемое В-лимфоцитами, или заболевание, запускаемое Т-лимфоцитами. Согласно одному варианту реализации предложены ИЛ-21-связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела его антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные для применения при лечении или профилактике воспалительных, иммуно-обусловленных или аутоиммунных заболеваний или расстройств. Примеры воспалительных, иммуно-обусловленных или аутоиммунных заболеваний или расстройств включают без ограничений васкулиты, например, вызванный антителами к цитоплазме нейтрофилов (ANCA) васкулит, ANCA-ассоциированный васкулит (AAV) или гиганто-клеточный артериит (GCA), синдром Съегрена, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), обыкновенную пузырчатку, волчаночный нефрит, псориаз, тиреоидит, диабет I типа, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), анкилозирующий спондилит, множественный склероз, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, болезнь Крона, тяжелую миастению, оптикомиелит (NMO), связанное с IgG4 заболевание, системный склероз, инсулин-зависимый сахарный диабет (ИЗСД), анкилозирующий спондилит и реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD). Согласно одному варианту реализации предложены ИЛ-21-связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела его антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные для применения при лечении или профилактике заболеваний или злокачественных новообразований, запускаемых В-лимфоцитами. Пример злокачественных новообразований, запускаемых В-лимфоцитами, может включать фолликулярную лимфому (ФЛ), диффузную В-крупноклеточную лимфому (ДВККЛ), лимфому Ходжкина (ЛХ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), мантийноклеточную лимфому, лимфосаркому Беркитта, болезнь Вальденстрема и множественную миелому (ММ). Согласно одному варианту реализации предложены ИЛ-21-связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела его антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные для применения при лечении или профилактике заболеваний или злокачественных новообразований, запускаемых Т-лимфоцитами. Пример злокачественных новообразований, запускаемых Т-лимфоцитами, может включать ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому, которая является злокачественным новообразованием, запускаемым фолликулярными Т-хелперами (Tfh), апластическую крупноклеточную лимфому, Т-клеточный лейкоз взрослых, кожную Т-клеточную лимфому и синдром Сезари.

[00227] В соответствии со способами настоящего изобретения для индукции положительного терапевтического ответа в плане аутоиммунного ответа применяют по меньшей мере одну ИЛ-21-связывающую молекулу, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, согласно определению в других разделах настоящей заявки. Под «положительным терапевтическим ответом» в плане аутоиммунного лечения понимают любое улучшение патологических состояний, ассоциированных с активностью указанных связывающих молекул, например, анти-ИЛ-21 антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных, и/или улучшение симптомов, ассоциированных с данным заболеванием. Таким образом, например, улучшение заболевания может характеризоваться полным ответом. Под «полным ответом» понимают отсутствие клинически определяемого заболевания с нормализацией любых предыдущих результатов лабораторных диагностических исследований. Такой ответ в некоторых вариантах реализации может сохраняться, например, в течение одного месяца после лечения при помощи способов согласно настоящему изобретению. В качестве альтернативы улучшение заболевания может быть классифицировано как частичный ответ.

[00228] Клинический ответ можно оценить при помощи способов скрининга, таких как магниторезонансная томография (МРТ), рентгенография, компьютерная томография (КТ), проточная цитометрия или сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS), гистология, макроскопические патологическое исследование и биохимический анализ крови, включая без ограничений изменения, выявляемые при помощи ELISA, ELISPOT, РИА, хроматографии и т.п. Помимо указанных положительных терапевтических ответов у субъекта, подвергшегося терапии ИЛ-21-связывающей молекулой, например, анти-ИЛ-21 антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, может проявляться положительное действие улучшения в плане симптомов, ассоциированных с указанным заболеванием.

[00229] Также предложено применение ИЛ-21-связывающих молекул, например, анти-ИЛ-21 антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных, для диагностического мониторинга уровня белков (например, уровня ИЛ-21) в крови или ткани как часть процедуры клинической оценки, например, для определения эффективности конкретного режима лечения. Например, определение может быть облегчено, если соединить указанное антитело с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ включают разные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, биолюминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолиноэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиокианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритин; пример люминесцентного вещества включает люминол; примеры биолюминесцентных веществ включают люциферазу, люциферин и акварин; а примеры подходящих радиоактивных веществ включают ¹²⁵1, ¹³¹I, ³⁵S или ³Н.

VII. Фармацевтические композиции и способы введения

[00230] Способы получения и введения ИЛ-21-связывающих молекул, например, анти-ИЛ-21 антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных, предложенные в настоящей заявке для субъекта, нуждающегося в такой молекуле, хорошо известны специалистам в данной области техники или легко ими определяются. Путь введения указанной ИЛ-21-связывающей молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, может быть, например, пероральным, парентеральным, ингаляционным или местным. В настоящей заявке термин «парентеральный» включает, например, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, внутримышечный, подкожный, ректальный или вагинальный путь введения. Хотя явно подразумевается, что все указанные формы введения попадают в сферу настоящего изобретения, еще одним примером формы для введения может быть раствор для инъекций, в частности для внутривенной или внутриартериальной инъекции или капельного введения. Обычно подходящая фармацевтическая композиция может содержать буфер (например, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат), необязательно стабилизирующий агент (например, альбумин человека) и др. Согласно другим способам, совместимым с замыслом, описанным в настоящей заявке, ИЛ-21-связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21-антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, предложенные в настоящей заявке, можно доставлять напрямую в очаг нежелательной популяции клеток, увеличивая воздействие на желаемую ткань терапевтического агента. Согласно одному варианту реализации введение проводят непосредственно в дыхательные пути, например, путем ингаляции или интраназального введения.

[00231] Как обсуждается в настоящей заявке, ИЛ-21-связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21-антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, предложенные в настоящей заявке, можно вводить в фармацевтически эффективном количестве для лечения in vivo ИЛ-21-обусловленного заболевания, такого как воспалительные иммуно-обусловленные или аутоиммунные заболевания или расстройства. В этом отношении следует иметь в виду, что раскрываемые здесь связывающие молекулы могут быть преобразованы в лекарственные формы, чтобы облегчить введение и способствовать стабильности активного агента. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый, нетоксичный, стерильный носитель, такой как физиологический раствор, нетоксичные буферы, консерванты и т.п. В целях настоящей заявки под фармацевтически эффективным количеством ИЛ-21-связывающей молекулы, например, анти-ИЛ-21-антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, конъюгированного или неконъюгированного, понимают количество, достаточное для достижения эффективного связывания с мишенью или получения пользы, например, для облегчения симптомов заболевания или патологического состояния, или чтобы определить вещество в клетке. Подходящие лекарственные формы для применения при реализации способов лечения, раскрываемых в настоящей заявке, описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980).

[00232] Определенные фармацевтические композиции, предложенные в настоящей заявке, можно вводить перорально в составе приемлемой лекарственной формы, например, капсул, таблеток, водных суспензий или растворов. Определенные фармацевтические композиции также можно вводить в форме назального аэрозоля или ингаляции. Такие композиции можно приготовить в форме растворов в физиологическом растворе, с применением бензилового спирта или других подходящих консервантов, активаторов всасывания для повышения биодоступности и/или других традиционных растворителей или разрыхлителей.

[00233] Количество ИЛ-21-связывающей молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела или его фрагмента, варианта или производного, которые могут сочетаться с веществами носителя для получения единичной лекарственной формы, будет варьировать в зависимости от субъекта, которого лечат, и конкретного способа введения. Композицию можно вводить однократно, многократно или в течение заданного периода времени в форме инфузии. Режимы дозирования также можно корректировать, чтобы достичь оптимального желаемого ответа (например, терапевтический или профилактический ответ).

[00234] В соответствии со сферой настоящего изобретения анти-ИЛ-21 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные можно вводить человеку или другому животному в соответствии с указанными выше способами лечения в количестве, достаточном для достижения терапевтического действия. Указанные анти-ИЛ-21 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, предложенные в настоящей заявке, можно вводить такому человеку или другому животному в традиционной лекарственной форме, полученной путем сочетания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, предложенных в настоящей заявке, с традиционным фармацевтически приемлемым носителем или растворителем согласно известным технологиям. Форма и характер фармацевтически приемлемого носителя или растворителя может быть продиктована количеством активного ингредиента, с которым его сочетают, путем введения и другими хорошо известными факторами. Также можно применять смесь, содержащую один или более видов ИЛ-21-связывающих молекул, например, анти-ИЛ-21 антител, или его антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных согласно настоящему изобретению.

[00235] Под «терапевтически эффективной дозой или количеством» или «эффективным количеством» понимают количество ИЛ-21-связывающей молекулы, например, антитела или антигенсвязывающего фрагмента, варианта или его производного, которое при введении вызывает положительный терапевтический ответ в том, что касается лечения пациента с заболеванием или патологическим состоянием, которое требуется лечить.

[00236] Терапевтически эффективные дозы композиций согласно настоящему изобретению для лечения ИЛ-21-обусловленных заболеваний, таких как воспалительные, иммуно-обусловленные или аутоиммунные заболевания или расстройства, варьирует в зависимости от множества различных факторов, включая средства введения, целевой сайт, психологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, другие вводимые лекарственные препараты, и является ли воздействие терапевтическим или профилактическим. Обычно пациентом является человек, но отличные от человека млекопитающие, включая трансгенных млекопитающих, также могут подлежать лечению. Лечебные дозы можно титровать при помощи стандартных способов, известных специалистам в данной области техники, чтобы оптимизировать безопасность и эффективность.

[00237] Количество по меньшей мере одной ИЛ-21-связывающей молекулы, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, которое требуется вводить, может легко определить специалист в данной области техники без ненужного экспериментирования, исходя из настоящего раскрытия. Факторы, влияющие на режим введения и соответствующее количество по меньшей мере одной ИЛ-21-связывающей молекулы, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, включают без ограничений тяжесть заболевания, анамнез заболевания, а также возраст, рост, массу, состояние здоровья и физическое состояние индивидуума, подвергающегося лечению. Аналогично, количество ИЛ-21-связывающей молекулы, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, которое требуется вводить, будет зависеть от режима введения и от того, будут ли субъекту вводить однократную дозу или многократные дозы указанного агента.

[00238] Также в настоящей заявке предложено применение ИЛ-21-связывающей молекулы, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, для лечения воспалительного, иммуно-обусловленного или аутоиммунного заболевания или расстройства, например, васкулита, например, васкулита ANCA или GCA, синдрома Съегрена, системной красной волчанки и/или волчаночного нефрита, ревматоидного артрита, болезни Крона, тяжелой миастении или GVHD.

[00239] В настоящей заявке также предложено применение ИЛ-21-связывающей молекулы, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, для лечения производства лекарственного препарата для лечения воспалительного, иммуно-обусловленного или аутоиммунного заболевания или расстройства, например, васкулита, например, васкулита ANCA или GCA, синдрома Съегрена, системной красной волчанки и/или волчаночного нефрита, ревматоидного артрита, болезни Крона, тяжелой миастении или GVHD.

VIII. Диагностика

[00240] В настоящей заявке также предложен способ диагностики, применимый при диагностике ИЛ-21-обусловенного заболевания, такого как воспалительные, иммуно-обусловленные или аутоиммунные заболевания или расстройства, который включает измерение уровня экспрессии белка ИЛ-21 в ткани или в жидкой среде организма, отобранной у индивидуума, и сравнение измеренного уровня экспрессии со стандартным уровнем экспрессии ИЛ-21 в здоровой ткани или жидкой среде организма, причем повышение уровня экспрессии по сравнению со стандартным уровнем указывает на расстройство, которое можно лечить при помощи ИЛ-21-связывающей молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

[00241] Анти-ИЛ-21 антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, варианты и производные, предложенные в настоящей заявке, можно применять для оценки уровня белка ИЛ-21 в биологическом образце с применением классических иммунологических способов, известных специалистам в данной области техники (например, см. Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 707:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)). Другие основанные на антителах способы, применимые для определения экспрессии белка ИЛ-21, включают иммуноанализ, такой как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммунопреципитацию или Вестерн-блоттинг.

[00242] Под «оценкой уровня экспрессии полипептида ИЛ-21» понимают качественное или количественное измерение или оценку уровня полипептида ИЛ-21 в первом биологическом образце напрямую (например, путем определения или оценки абсолютного уровня белка) или относительно (например, путем сравнения с уровнем полипептида, ассоциированного с заболеванием, во втором биологическом образце). Уровень экспрессии ИЛ-21-полипептида в первом биологическом образце можно измерять или оценивать и сравнивать со стандартным уровнем полипептида ИЛ-21, причем стандарт берут из второго биологического образца, отобранного от индивидуума, на страдающего указанным расстройством, или он является определенным путем усреднения уровней из популяции индивидуумов, не страдающих указанным расстройством. Как общепринято в технике, если «стандартный» уровень полипептида ИЛ-21 известен, его можно легко применять в качестве стандартного уровня для сравнения.

[00243] Под «биологическим образцом» понимают любой биологический образец, полученный от индивидуума, из линии клеток, из культуры ткани или другого источника клеток, потенциально экспрессирующих ИЛ-21. Способы получения биопсийного образца ткани и жидких сред организма от млекопитающих хорошо известны в технике.

IX. Наборы, содержащие ИЛ-21-связывающие молекулы

[00244] Также в настоящей заявке предложены наборы, которые содержат ИЛ-21-связывающую молекулу, например, анти-ИЛ-21 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящей заявке, и которые применяют для реализации способов, описываемых в настоящей заявке. Согласно определенным вариантам реализации набор содержит по меньшей мере одно очищенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в одном или более контейнерах. Согласно некоторым вариантам реализации указанные наборы содержат компоненты, необходимые и/или достаточные для проведения анализа, включая контрольные образцы, инструкции по проведению анализа и любые необходимые компьютерные программы для анализа и представления результатов. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что раскрываемые ИЛ-21-связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, можно легко включить в одну из указанных форм наборов, которые хорошо известны в технике.

X. Иммунологический анализ

[00245] Предложенные в настоящей заявке ИЛ-21-связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела или антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные молекул, предложенных в настоящей заявке, можно оценивать при помощи иммуноспецифичного связывания при помощи любого способа, известного в технике. Виды иммунологического анализа, которые можно применять, включают без ограничений системы конкурентного и неконкурентного анализа с применением технологий, таких как Вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализ, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), ELISPOT, «сендвич»-иммуноанализ, анализ на основе иммунопреципитации, реакции с преципитинами, реакции диффузной преципитации в геле, анализ на основе иммунодиффузии, анализ на основе агглютинации, анализ с фиксацией комплемента, иммунорадиометрический анализ, флуоресцентный иммуноанализ, иммуноанализ с белком А, и многие другие. Такие виды анализа являются стандартными и хорошо известны в технике (см., например, Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки на ее полное содержание).

[00246] ИЛ-21-связывающие молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, предложенные в настоящей заявке, можно применять в гистологических исследованиях, таких как иммунофлуоресценция, иммуно-электронная микроскопия или при неиммунологическом анализе, при детекции in situ ИЛ-21, или его консервативных вариантов или пептидных фрагментов. Детекцию in situ можно проводить путем извлечения гистологического образца у пациента и его контактирования с меченной ИЛ-21-связывающей молекулой, например, анти-ИЛ-21 антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, например, контактирования путем наслаивания меченой ИЛ-21-связывающей молекулы (например, антитела или фрагмента) на биологический образец. При применении такой процедуры возможно определять не только наличие ИЛ-21, или консервативных вариантов или пептидных фрагментов, но также их распределение в исследуемой ткани. Специалисты в данной области техники должны с легкостью понимать, что, применяя настоящее изобретение, можно модифицировать любой из широкого спектра гистологических способов (таких как процедуры окрашивания), чтобы достичь такой детекции in situ.

[00247] Активность связывания конкретного множества ИЛ-21-связывающих молекул, например, анти-ИЛ-21 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, можно определять в соответствии с хорошо известными способами. Специалисты в данной области техники способны определить рабочие и оптимальные условия проведения анализа для каждого определения, применив стандартное экспериментирование.

[00248] Способы и реагенты, подходящие для определения характеристик связывания изолированной молекулы ИЛ-21-связывающей молекулы, например, анти-ИЛ-21 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или измененного/мутантного производного, известны в технике и/или доступны в продаже. В продаже есть оборудование и программное обеспечение, разработанное для такого кинетического анализа (например, BIAcore®, программа BIAevaluation®, «GE Healthcare»; программа KINEXA®, «Sapidyne Instruments»).

[00249] При реализации настоящего изобретения на практике должны применяться, если не указано другого, традиционные способы биологии клетки, культивирования клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые попадают в компетенцию специалистов в данной области техники. Такие способы полностью объяснены в литературе. Например, см. Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); и Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).

[00250] Общие принципы конструирования антител установлены в Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press). Общие принципы конструирования белков установлены в Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Общие принципы связывания антители и гаптенов-антител установлены в: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); и Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.). Кроме того, стандартные способы в иммунологии, известные в технике и не описанные особо, в целом соответствуют способам в Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) и Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).

[00251] Авторитетные справочники, где установлены общие принципы иммунологии, включают Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevere, Amsterdam); Goldsby et ah, eds. (2000) Kuby Immunology (4th ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby); Abbas et al (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall 2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

[00252] Все источники, процитированные выше, а также источники, цитируемые в настоящей заявке, включены в нее посредством ссылки на их полное содержание.

[00253] Следующие примеры предложены для иллюстрирования, но не для ограничения.

ПРИМЕРЫ

[00254] Варианты реализации настоящего изобретения можно охарактеризовать дополнительно путем ознакомления со следующими неограничивающими примерами, в которых подробно описано получение определенных антител согласно настоящему изобретению и способы применения антител согласно настоящему изобретению. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что могут быть реализовано множество модификаций, как материалов, так и методов, которые не будут выходить за пределы объема настоящего изобретения.

Пример 1. Получение и гуманизация анти-ИЛ-21 моноклонального антитела мыши

Иммунизация мышей и генерирование гибридомы анти-ИЛ-21

[00255] Самки мышей Balb/c в возрасте 6 недель получали 8 циклов внутрибрюшинных (в/б) и метатарзальных инъекций очищенного рекомбинантного ИЛ-21 человека, чередуясь с белком ИЛ-21 яванской макаки, конъюгированного с БСА (бычий сывороточный альбумин) (Набор БСА Imject Maleimide-Activated, «Pierce»). Если кратко, начиная с 1-го дня мышей иммунизировали путем в/б введения 10 мкг и метатарзального введения 2,5 мкг иммуногена, эмульгированного в Imject Alum (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Иммунизация длилась 28 дней с интервалами 4 дня. Пробы крови отбирали в 15-ый и 28-ой дни путем отбора крови из ретроорбитального пространства в пробирки для разделения сыворотки. Сыворотку анализировали посредством ELISA, напрямую определяя связывание ИЛ-21 и конкуренцию с ИЛ-2К. На основании титров нейтрализации в конкурентном ELISA мышей отбирали для введения предварительной дополнительной дозы 10 мкг ИЛ-21 человека, конъюгированного с БСА и умерщвляли на 30-ый день. У животных отбирали спленоциты и клетки лимфатических узлов и гибридизовали их с клетками миеломы P3-X63-Ag8.653 с применением ПЭГ для генерации гибридом. Анти-ИЛ-21-специфичные гибридомы выявляли в процессе скрининга надосадочной жидкости гибридом, в ELISA для оценки прямого связывания и конкуренции, как было описано выше. Положительные гибридомы также дополнительно проверяли на нейтрализующую активность в пробе на основе клеток с применением отрицательной модуляции фосфорилирования STAT3 в качестве начала отсчета (ИЛ-21 запускает передачу сигнала через STAT3). Затем нейтрализующие гибридомы клонировали в ограниченном разведении и распространялись для очистки антитела.

[00256] На протяжении всего цикла получения гибридом применяли конкурентный ELISA, чтобы идентифицировать мышей с хорошим ответом после иммунизации ИЛ-21, затем проводили скрининг тем же способом для нейтрализации гибридом. Если кратко, в планшеты для ELISA Maxisorp (NUNC) наносили 2 мкг/мл ИЛ-21R-Fc в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и оставляли при 4°C в течение ночи. Затем планшеты блокировали 3% БСА в ФСБТ (ФСБ + 0,1% Tween) при комнатной температуре в течение одного часа. Параллельно пробы крови последовательно разводили (для отбора животных с хорошим ответом), или нормировали концентрации IgG в надосадочной жидкости гибридом и прединкубировали с 2 нМ биотинилированного ИЛ-21. После прединкубации смесь добавляли в каждую лунку планшета для ELISA и далее инкубировали при комнатной температуре в течение получаса. После отмывки в каждую лунку добавляли смесь стрептавидин-пероксидаза хрена и определяли уровень связанного ИЛ-21 как показатель ингибирования взаимодействия ИЛ-21/ИЛ-21R-Fc тестируемыми пробами крови или IgG гибридомы.

Выделение, клонирование, секвенирование, экспрессия и очистка анти-ИЛ-21 моноклональных антител мыши

[00257] Надосадочную жидкость из культур гибридом анализировали в плане их способности ингибировать взаимодействие ИЛ-21/ИЛ-21R-Fc в соответствии с процедурой, описанной для конкурентного ELISA. Позитивные образцы подвергали клонированию в ограниченном разведении (LDC), чтобы обеспечить клональность. После подтверждения функциональных свойств субклонов, их подвергали молекулярному клонированию.

[00258] мРНК из гибридом выделяли при помощи набора Dynabeads mRNA Direct Kit в соответствии с инструкциями производителя. мРНК затем превращали в кДНК посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой с применением обратной транскриптазы Superscript III. Чтобы исключить погрешность ПЦР, синтезировали два комплекта кДНК. Указанные кДНК применяли в качестве матриц для амплификации вариабельных участков легкой и тяжелой цепи антител (VL и VH). ПЦР проводили с применением высокоточной полимеразы Taq от «Invitrogen» и набора праймеров для Ig мыши от «Novagen», который включал шесть наборов праймеров для VH и семь наборов праймеров для VL. Амплиицированные ПЦР-продукты VL и VH очищали и клонировали в векторы pCR 2.1 Торо от «Invitrogen», которые легко сшивают последовательности ДНК с Т-А-совместимыми концами. Трансформированные клетки E.coli инкубировали на чашках Петри с агаром X-gal/Carb. Колонии бактерий, содержащие ПЦР-вставки, становились белыми. Колонии белого цвета отбирали случайным образом для ПЦР для подтверждения вставки.

[00259] Для секвенирования было отобрано сорок восемь белых колоний из каждой трансформации. Колонии засевали в планшеты на 96 лунок со средой LB/Carb, и затем отпечатывали на чашки Петри с агаром LB/Carb. Колонии, которые росли на чашках с агаром, секвенировали с применением прямого праймера М13. На основании результатов секвенирования были созданы праймеры, которые могли позволить амплифицировать в ходе ПЦР VL и VH с добавлением сайтов для рестриктаз, которые совместимы с вектором экспрессии IgG человека рОЕ. Проводили расщепление рестриктазами и сшивку, чтобы клонировать VL и VH в вектор и получить конструкт химерного антитела, содержащий вариабельный участок из антитела мыши и константный участок из антитела человека. ДНК-плазмиду трансфецировали в клетки 293F с применением реагента для трансфекции 293. Уровень экспрессии IgG в надосадочных жидкостях культуры клеток оценивали при помощи Octet. IgG в надосадочной жидкости очищали при помощи колонок, покрытых белком-А. Очищенный IgG анализировали на SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия).

[00260] Для оценки перекрестной реактивности клонов-лидеров применяли ELISA. Исследуемые цитокины включали ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-9 и ИЛ-15. В планшеты для ELISA Maxisorp (NUNC) наносили 2 мкг/мл разных цитокинов в ФСБ и оставляли при 4°C в течение ночи. Затем планшеты блокировали 3% БСА в ФСБТ (ФСБ + 0,1% Tween) при комнатной температуре в течение одного часа. Очищенные IgG клонов-лидеров последовательно разводили в ФСБТ+3% БСА, и затем указанную смесь добавляли в каждую лунку планшета для ELISA и далее инкубировали при комнатной температуре в течение получаса. После отмывки в каждую лунку добавляли вторичное антитетело-пероксидазу хрена и оставляли на 1 час. Лунки отмывали ФСБТ, а затем добавляли сначла ФСБТ, а потом ФСБ и раствор ТМВ от «Pierce» с целью определения вторичного антитела. Спустя 5 мин реакцию останавливали путем добавления 1H раствора соляной кислоты. Затем проводили считывание на планшетном ридере для ELISA на длине волны 450 нм, чтобы определить связывание.

Гуманизация разных анти-ИЛ-21 моноклоанльных антител мыши

[00261] Моноклональное антитело мыши 9F11 генерировали и описывали при помощи MedImmune, и оно показало желаемую биологическую активность с KD связывания 10 нМ с ИЛ-21. Работу по гуманизации проводили в компании «Shanghai ChemPartner Со» с применением технологии прививки CDR. Проверяли свойства успешно гуманизированных антител-кандидатов 9F11-4, 9F11-6 и 9F11-11 (результаты представлены ниже). Последовательности вариабельных участков 9F11 и гуманизированных клонов 9F11 показаны на Фигуре 1А. [00262] Гуманизацию моноклонального антитела мыши 19Е3 проводили путем прививки CDR из 19Е3 в избранные каркасы из зародышевого антитела человека. Последовательности вариабельного участка тяжелой цепи (VH) и вариабельного участка легкой цепи (VL) моноклонального антитела мыши 19Е3 сравнивали с последовательностями зародышевого антитела человека, доступными в базах данных NCBI общего доступа. Акцепторные каркасные участки антитела человека идентифицировали на основе максимальной гомологии последовательностей. При выборе оптимального акцепторного каркасного участка применяли несколько других критериев, включая соответствие по критическим остаткам (зона Верньера, остатки канонического класса и поверхностные остатки VH/VL), иммуногенность (зародышевая частота), стабильность и экспрессию. В данном случае в качестве акцепторного каркасного участка для VH были идентифицировано одно зародышевое семейство - VH1-46. Гены J-Сегмента сравнивались с исходными последовательностями по каркасному участку 4, и для VH были выбраны J-сегменты и JH4. Для достижения максимальной гомологии последовательности акцептора VL были объединены три отдельных каркасных участка из трех разных зародышевых антител человека, чтобы сконструировать оптимальную гибридную зародышевую акцепторную последовательность. Шаблон из антитела человека, избранный для цепи VL, именуемый К1, представлял собой сочетание из O14 (Каркас 1), O18 (Каркас2), L23 (Каркас3) и JK1 (Каркас 4). Гомология каркасных участков меду последовательностью мыши и шаблоном из антитела человека составила 71% для VH и 79% для VL.

[00263] Были идентифицированы критические остатки в каркасном участке антитела мыши, которые, как предполагалось, влияют на петли CDR, стабилизируют структуру вариабельных участков и влияют на VH и VL межцепочечную упаковку и/или взаимодействие, и они были селективно введены обратно в зародышевые каркасные участки из антитела человека для максимального сохранения эпитопа связывания и сродства 19Е3. В данном случае остатки из антитела мыши в положениях 44V и 87F, подверглись обратной мутации в шаблоне цепи VL из шаблона антитела человека, как второй шаблон акцепторного каркасного участка, названного К2. Выравнивание исходной VL цепи с указанными акцепторными каркасными участками показано на Фигуре 1 В.

[00264] Для цепи VH были сконструированы два дополнительных шаблона акцепторных каркасных участков из антитела человека как способ идентифицировать каркасный участок, который мог бы влиять на активность связывания 19Е3, если полный акцепторный шаблон из антитела человека (На) утрачивал активность связывания. Был сконструирован один шаблон под названием НЬ путем соединения каркасного участка 1 из антитела мыши и шаблона VH1-46/JH4 из антитела человека; другой шаблон, названный Нc, был сконструирован путем соединения каркасного участка 3 из антитела мыши и шаблона VH1-46/JH4 из антитела человека. Выравнивание исходной VH цепи с указанными акцепторными каркасными участками показано на Фигуре 1 В.

[00265] Чтобы сгенерировать гуманизированное антитело, остатки CDR по нумерации по Кэботу соединяли в сконструированные акцепторные каркасные области и для VH, и для VL. Всего при помощи GeneART было синтезировано три гена гуманизированный VH (На, Hb и Hc) и два гена VL (К1 и К2), затем их клонировали в вектор экспрессии IgG1. Был сгенерирован набор гуманизированных вариантов, и они были охарактеризованы в биохимических и биологических тестах. Для оценки ИЛ-21-связывающей активности указанных гуманизированных вариантов был разработан конкурентный анализ для эпитопа HTRF. Полностью гуманизированный шаблон VH На проявлял ИЛ-21-связывающую активность, сопоставимую с активностью VH 19Е3 мыши, а также активностью гибридных вариантов Hb и Hc. К2 - гуманизированный шаблон VL с двумя остатками из антитела мыши в положениях 44V и 87F - проявлял более высокую активность связывания, чем у полностью гуманизированного варианта К1. Было показано, что полученный гуманизированный вариант обладает сродством связывания с антигеном и специфичностью к эпитопам, сходными с данными показателями у to 19Е3. Чтобы минимизировать содержание остатков из антитела мыши в гуманизированном варианте с наилучшим поведением (K2Ha), остаток из антитела мыши в положении 87F заменили на сопоставимый остаток из антитела человека, но не 44V, который был критичен сохранения активности связывания с ИЛ-21. В тяжелой цепи 19Е3 в положении 56 CDR2 был идентифицирован сайт гликозилирования по N-концу (NYT) с высоким риском, и здесь была введена замена N на Q. Итоговое гуманизированное антитело (K44VHaN56Q) всего с одним остатком из антитела мыши проявляло неотличимую активность связывания при сравнении с 19Е3 мыши и демонстрировало биологическую активность в 2-3 раза выше, чем у 19Е3 во всех проведенных биологических тестах.

[00266] Моноклональное антитело мыши 9F11 демонстрировало желаемую биологическую активность с К_D связывания с ИЛ-21 10 нМ. Работу по гуманизации проводили в компании «Shanghai ChemPartner Со» с применением технологии прививки CDR. Проверяли свойства успешно гуманизированных антител-кандидатов 9F11-4, 9F11-6 и 9F11-11 (результаты представлены ниже), и было показано, что указанные антитела полностью сохранили активность связывания и биологическую активность в отношении ИЛ-21 по сравнению с исходным антителом мыши 9F11. Последовательности вариабельных участков 9F11 и гуманизированных клонов 9F11 показаны на Фигуре 1.

[00267] Свойства разных анти-ИЛ-21 антител, предложенных в настоящей заявке, показаны в Таблице 2.

Пример 2. Сродство связывания K44VHa-N56Q с рекомбинантным ИЛ-21 человека и яванской макаки

[00268] В данном примере описано определение равновесной константы связывания в жидкой фазе (K_D) для взаимодействия K44VHa-N56Q с ИЛ-21 человека и яванской макаки. Равновесная константа диссоциации (K_D) для взаимодействия K44VHa-N56Q с ИЛ-21 человека (hu) и яванской макаки (cyno) измеряли при помощи платформы анализа кинетического исключения (KinExA) 3000 (Sapidyne, Boise, ID). Аликвоты по 50 мг гранул азлактона (Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс) покрывали huИЛ-21 (полученным от компании «Protein Sciences/ADPE") или cynoИЛ-21 (полученным от компании «Protein Sciences/ADPE") в концентрациях 75 или 150 мкг/мл в соответствии с инструкциями производителя прибора. Гранулы отмывали и блокировали в 1 М Трис-буфере, pH 8 («Invitrogen», Карлсбад, Калифорния), содержащих 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА, «Sigma-Aldrich», Сент-Луис, Пенсильвания) и хранили при 4°C до применения. Объемы партий K44VHa-N56Q готовили в концентрациях 500 фМ и 50 пМ (серии 500 фМ и 50 пМ K44VHa-N56Q, соответственно) в буфере для проб (фосфатно-солевой буфер, «Invitrogen»), рН 7.4, 0,1% БСА, 0,02% азида натрия (NaN₃, «Sigma-Aldrich»)); каждый объем распределяли на 2 отдельных набора из 13 пробирок (1 на каждую серию). В 1 пробирку из каждой серии добавляли ИЛ-21 человека или яванской макаки в концентрации 4 нМ (50 пМ K44VHa-N56Q) или 100 пМ (серия 500 фМ K44VHa-N56Q), затем проводили последовательное разведение в 11 оставшихся пробирках, оставляя 1 пробирку для пробы в каждой серии как контроль K44VHa-N56Q, только рецептор. Конечные концентрации ИЛ-21 человека или яванской макаки в отдельных смесях проб варьировали от 1,95 фМ до 100 пМ (500 фМ K44VHa-N56Q), и от 78,1 фМ до 4 нМ (50 пМ K44VHa-N56Q). Указанные смеси проб уравновешивали при комнатной температуре в течение 2-7 дней и анализировали на платформе KinExA. Суспензии покрытых ИЛ-21 гранул азлкатона разводили до 30 мл инструментальным буфером (ФСБ, pH 7,4, 0,02% NaN3) во флаконе с гранулами и закрепляли в приборе KinExA. Для последовательного переноса гранул из азлактона/ИЛ-21 в капиллярную кювету в приборе применяли задаваемую пользователем программу синхронизации, и индивидуальные смеси проб наносились поверх покрытых ИЛ-21 гранул. Раствор несвязанной пробы удаляли путем отмывки гранул инструментальным буфером. Через гранулы пропускали раствор DyLight649-меченного овечьего анти-huIgG(H+L) вторичного реагента («Thermo Scientific))), чтобы определить рецептор (K44VHa-N56Q), который остался связанным с ИЛ-21-покрытыми гранулами. Гранулы повторно отмывали инструментальным буфером, чтобы удалить избыток (несвязанную) метки. Измеряли уровень флуоресценции, который остается ассоциированным с гранулами, и сигнал переводили в процент свободного рецептора (K44VHa-N56Q). В интервалах между пробами упаковку с гранулами вымывали из проточной кюветы и замещали свежими гранулами из азлактона, покрытыми ИЛ-21 в качестве подготовки к следующей пробе. Когда данные были собраны для всех проб в каждой серии (500 фМ и 50 пМ K44VHa-N56Q), генерировали изотерму, которая на графике показывает количество свободного K44VHa-N56Q, определенного при каждой концентрации ИЛ-21. Полученные 2 кривые связывания затем оценивали путем анализа дуальной кривой с применением программы оценки, прилагаемой к прибору (программа KinExA Pro, v. 2.0.1.26, Sapidyne), из которых получали индивидуальные K_D для каждого взаимодействия.

[00269] Связывание K44VHa-N56Q tc ИЛ-21 человека и яванской макаки измеряли посредством KinExA. K44VHa-N56Q готовили в сериях с 2 концентрациями: 500 фМ и 50 пМ, и ИЛ-21 человека или ИЛ-21 яванской макаки последовательно разводили в рамках каждой серии. Когда достигалось равновесие, для измерения концентрации свободного K44VHa-N56Q, оставшегося в каждой смеси пробы, применяли прибор КinЕхА. Это делали путем регистрации уровня флуоресценции, который остается ассоциированным с гранулами, покрытыми ИЛ-21, после того как пробы каждой смеси пропускали через гранулы, и затем на них воздействовал анти-IgG реагент с флуоресцентной меткой. Строили график зависимости количества зарегистрированного свободного K44VHa-N56Q от концентрации huIL-21 или cynoIL-21, и для подгонки каждого набора данных моделью сродства к одному сайту применяли программу оценки, прилагаемую к платформе KinExA. Программа KinExA в целом подгоняет обе кривые связывания (500 фМ и 50 пМ IgG) в анализе дуальной кривой (Фигуры 2А и 2В, соответственно), извлекая оптимальные решения для нескольких параметров одновременно и рассчитывая истинную константу связывания в жидкой фазе. При указанных условиях K_D для связывания K44VHa-N56Q с белком huИЛ-21 по расчетам составила 515 фМ (95% ДИ для K_D: 279-844 фМ), а связывание K44VHa-N56Q с белком cynoИЛ-21 по расчетам составило 352 фМ (95% ДИ для K_D: 134-685 фМ).

[00270] K44VHa-N56Q продемонстрировало слабое связывание с ИЛ-21 мыши со сродством в районе мкМ, что было измерено при помощи платформы KinExA.

Пример 3. Исследования механизма действия для анти-ИЛ-21 моноклопальных антител

Анти-ИЛ-21 клоны блокируют ИЛ-21-индуцированное фосфорилирование STAT3

[00271] Способность очищенных анти-ИЛ-21 антител ингибировать индуцированное ИЛ-21 человека и яванской макаки фосфорилирование STAT3 (pSTAT3) определяли, как описано ниже.

[00272] Если кратко, все мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) человека выделяли из пробирки СРТ (BD Vacutainer) после центрифугирования в соответствии с инструкциями производителя. Анти-ИЛ-21 антитела предварительно инкубировали с ИЛ-21 яванской макаки (20 пМ) в планшетах на 96 лунок с круглым дном в течение 60 минут при 37 градусах. После такой инкубации МКПК (0,4×10⁶ на лунку) быстро добавляли в каждую лунку и инкубировали с ИЛ-21 /IgG в течение 15 минут при 37 градусах. После стимуляции клетки фиксировали в течение 10 минут (при 37 градусах) с 100 мкл/лунку предварительного нагретого лизирующего/фиксирующего буфера (BD Phosflow), а затем проводили пермеабилизацию на льду в течение 30 минут с 225 мкл/лунку Perm Buffer III (BD Phosflow). Клетки отмывали дважды (ФСБ/2% БСА) и окрашивали анти-STAT3 (pY705, BD Phosflow) в течение 30 минут при комнатной температуре. Клетки отмывали при помощи буфера для окрашивания и анализировали на проточном цитометре LSRII (BD Biosciences) с применением программы FACSDiva.

[00273] Стимуляция ИЛ-21 человека и яванской макаки, как описано, вызывала 3-5-кратное увеличение уровня pSTAT3 в общем пуле МКПК человека (Фигура 3А). Репрезентативные графики, демонстрирующие ингибирование ИЛ-21-индуцированной инактивации pSTAT3 анти-ИЛ-21 антителами, показаны на Фигуре 3В. Все исследуемые клоны достигали 100% ингибирования в данном анализе. Значения IC50 анти-ИЛ-21 клонов в анализе с pSTAT3 приведены в обобщенном виде в Таблице 3. Указанные данные показывают, что описываемые анти-ИЛ-21 антитела способны ингибировать ранние события передачи сигнала на выходе с ИЛ-21R.

[00274] Было показано, что K44VHa-N56Q слабо связывается с ИЛ-21 мыши. Стимуляция спленоцитов мыши ИЛ-21 мыши вызывала 4-кратное увеличение внутриклеточного уровня фосфорилированного STAT3. K44VHa-N56Q не могло ингибировать фосфорилирование STAT3, вызванное ИЛ-21 мыши. Указанные данные свидетельствуют о том, что K44VHa-N56Q не нейтрализует биологическую активность ИЛ-21 мыши.

[00275] ИЛ-21 является членом семейства цитокинов рецепторов γ_с, которые используют обычную гамма-цепь совместно со специфическим рецептором(ами), в опосредовании биологической активности. Лимфоциты из крови человека стимулировали γ_c - цепи с применением цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-15 или ИЛ-21 в присутствии или отсутствии K44VHa-N56Q или контрольного антитела человека IgG1-YTE. Передачу сигнала на последующих уровнях измеряли путем оценки фосфорилирования молекул STAT3, соответствующего каждому цитокину. K44VHa-N56Q не оказывало действия на передачу сигнала на последующих уровнях, связанную с цитокинами ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 или ИЛ-15. Указанные данные показывают, что K44VHa-N56Q действует специфично, нейтрализуя путь ИЛ-21 в клетках человека.

[00276] Передача сигнала с ИЛ-21 через его собственный рецептор приводит к активации и фосфорилированию STAT3. Данные, описанные в настоящей заявке, демонстрируют, что K44VHa-N56Q может ингибировать активацию pSTAT3 в ответ на ИЛ-21 и человека, и яванской макаки, но не ИЛ-21 мыши. Кроме того, данное ингибирование специфично для ИЛ-21, поскольку K44VHa-N56Q не влияет на активацию молекул STAT после активации родственных рецепторов цитокинов γ_c, таких как рецепторы для ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 или ИЛ-15. Следовательно, K44VHa-N56Q является мощным и специфичным ингибитором событий передачи сигнала с ИЛ-2111.

Блокировка ИЛ-21 подавляет выработку ИФНγ клетками NK-92

[00277] Действие очищенных анти-ИЛ-21 антител на ИЛ-21-индуцированную выработку ИФНγ клетками ВК-92 оценивали следующим образом.

[00278] Клетки NK-92 выращивали в полной питательной среде, которая состояла из основной среды MEM alpha Glutamax с добавлением бикарбоната натрия (1,5 г/л), инозитола (0,2 М, Sigma Aldrich), 2-меркаптоэтанола (0,1 мМ), фолиевой кислоты (0,02 мМ, Sigma Aldrich), рекомбинантного ИЛ-21 (100 Е/мл, R&D Systems), лошадиной сыворотки (12,5%) и фетальной бычьей сыворотки (12,5%). Все реагенты были приобретены у компании «Invitrogen», если не указано другое. Клетки отмывали и повторно суспендировали в среде, которая не содержала ИЛ-2, в течение 16-24 часов перед стимуляцией ИЛ-21. Чтобы оценить активность анти-ИЛ-21 клонов, антитела предварительно инкубировали с ИЛ-21 человека или яванской макаки (200 пМ) в планшете на 96 лунок с плоским дном в течение 60 минут при 37 градусах. 0,5×105 клеток NK-92 затем добавляли в планшет и инкубировали при 37 градусах в течение 24 часов. Выработку ИФНγ количественно оценивали в надосадочной жидкости с применением синглплексного анализа MSD с ИФНγ человека в соответствии с инструкциями производителя (Meso Scale Discovery).

[00279] Способность анти-ИЛ-21 клонов ингибировать индуцированную ИЛ-21 человека и яванской макаки выработку ИФНγ клетками NK-92 показана на Фигуре 4. Клоны K2Ha-N56Q, K(44V)Ha-N56Q и K(44V)Ha6-N56Q были способны полностью ингибировать выработку ИФНγ в указанных культурах, с близкой активностью в отношении ИЛ-21 человека и яванской макаки. В Таблице 4 показаны итоговые значения IC50 для клонов, оцениваемых в анализе с клетками NK-92. Указанные данные демонстрируют, что исследуемые анти-ИЛ-21 антитела модулируют активность клеток NK-92, что продемонстрировано полной блокировкой выработки ИФНγ через 24 часа.

Дифферернцировка плазмоцитов, индуцированная экзогенным ИЛ-21, подавляется анти-ИЛ-21 клонами

[00280] Чтобы определить эффект анти-ИЛ-21 антител на активность В-лимфоцитов, проводили анализ дифференцировки плазмоцитов.

[00281] МКПК человека выделяли из пробирок СРТ (BD Vacutainer) после центрифугирования в соответствии с инструкциями производителя. Проводили отрицательную селекцию на В-лимфоциты с применением реагентов для разделения клеток MACS (набор для выделения В-лимфоцитов человека II, Miltenyi Biotec). Чистота В-лимфоцитов при применении данного способа составляла стандартно >97%. Примечательно, препараты всех В-лимфоцитов, выделенные с применением данного способа, содержат популяции как «необученных» В-лимфоцитов, так и В-лимфоцитов памяти, но плазмоциты исключались благодаря экспрессии CD43, на которые нацелен комплекс антител для селекции в наборе MACS. Питательной средой для данных экспериментов была среда RPMI 1640 («Invitrogen») с добавлением 10% ФБС, пенициллина-стрептомицина (100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина), 2-меркаптоэтанола (55 мкМ), L-глутамина (2 мМ) и HEPES (5 мМ). Анти-ИЛ-21 антитела прединкубировали в планшетах на 96 лунок с круглым дном со стимулирующим комплексом, который включал ИЛ-21 человека или яванской макаки (2 нМ), анти-CD40 (0,1 мкг/мл, IgG овцы, «R&D Systems»), и анти-IgM F(ab')2 (5,0 мкг/мл, «Jackson ImmunoResearch Laboratories))), в течение 60 минут при 37 градусах. Затем добавляли 0,5-1,0×10⁵ В-лимфоцитов в планшет до конечного объема 150 мкл.

[00282] После стимуляции в течение 6 дней клетки окрашивали и анализировали посредством проточной цитометрии, чтобы количественно оценить частоту появления плазмоцитов в культуре. Клетки отмывали (ФСБ/2% ФБС) и окрашивали в течение 30 минут при 4 градусах с анти-IgD (ФИТС (флуоресцеин изотиоцианат) или РЕ); анти-CD38 (аллофикоцианин, клон НВ7) («BD Pharmingen»), и анализировали на проточном цитометре LSRII с применением программы FACSDiva. Кроме того, отбирали надосадочную жидкость и количественно оценивали выработку Ig при помощи ELISA. Если кратко, в планшет на 96 лунок с плоским дном наносили 5 мкг/мл овечьего анти-человеского IgG, разведенного в ФСБ, («Bethyl Laboratories») и оставляли на ночь при 4°C. Планшеты отмывали и блокировали 0,2% БСА в ФСБ. Надосадочную жидкость разводили и инкубировали в планшетах в течение ночи. Связанный Ig определяли при помощи комплекса овечьего анти-человеческого IgG-щелочной фосфатазы (0,2 мкг/мл, «Bethyl Laboratories))), разведенного в блокирующем буфере. Реакцию в планшетах ускоряли при помощи таблеток р-нитрофенилфосфата SigmaFast («Sigma Aldrich») и измеряли специфическое поглощение на длине волны 405 нм с применением планшетного ридера SpectraMax («Molecular Devices»).

[00283] Стимуляция В-лимфоцитов человека, как описано выше, Ил-21 человека или яванской макаки приводила к генерированию популяции плазмоцитов IgD^- CD38^hi (Фигуры 5А и 5В). Несколько клонов, включая 19Е3.1, 9F11.1 и 9Н10.1 были способны полностью подавлять дифференцировку плазмоцитов при указанных условиях (Фигуры 5А и 5 В). Клон 18 В6.1 подавлял дифференцировку плазмоцитов, вызываемую ИЛ-21 яванской макаки, го не человека. Итоговые значения IC50 для анти-ИЛ-21 клонов приведены в Таблице 5. Кроме того, в контрольных условиях стимуляции ИЛ-21 анти-CD40 и анти-IgM приводила к выработке Ig в диапазоне 30-40 мкг/мл к 6-ому дню (Фигура 5С). Клоны 19Е3.1 и 9F11.1 подавляют секрецию Ig В-лимфоцитами человека дозозависимым образом (Фигура 5С). Клон 19Е3.1 был способен ингибировать выработку IgG в ответ ИЛ-21 как человека, так и яванской макаки на >99%, тогда как 9F11.1 подавлял выработку IgG под действием ИЛ-21 человека и яванской макаки на 97% и 79%, соответственно. В совокупности указанные данные свидетельствуют о том, что анти-ИЛ-21 клоны способны значительно подавлять дифференцировку плазмоцитов человека и секрецию Ig под действием экзогенного ИЛ-21 человека и яванской макаки.

Анти-ИЛ-21 клоны подавляют дифференцировку плазмоцитов, индуцируемую активированными CD4+-T-лимфоцитами

[00284] Оценивалась способность анти-ИЛ-21 клонов блокировать дифференцировку плазмоцитов, вызываемую активированными CD4+-T-лимфоцитами в анализе с совместным культивированием, как описано ниже.

[00285] МКПК человека выделяли из пробирок СРТ (BD Biosciences) после центрифугирования. Проводили отрицательную селекцию на В-лимфоциты и CD4+-T-лимфоциты с применением реагентов для разделения клеток MACS (Miltenyi Biotec). Чистота полной популяции В-лимфоцитов и CD4+-T-лимфоцитов составляла стандартно >97%. СЭ4+-Т-лимфоциты обрабатывали митомицином-С (30 мкг/мл, «Sigma Aldrich») в течение 30 минут при 37°C, затем отмывали и давали покой в полной среде при 37°C в течение еще 30 минут. 1,0×10⁵ обработанных митомицином С CD4+Т-лимфоцитов и 0,5×10⁵ очищенных В-лимфоцитов (на лунку) совместно культивировали в конечном объеме 200 мкл с гранулами с анти-CD3/анти-CD28 (соотношение Т-лифоцитов и гранул 5:1). Для всех экспериментов питательной средой была RPMI 1640 («Invitrogen») с добавлением 10% ФБС, пенициллина-стрептомицина (100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина), 2-меркаптоэтанола (55 мкМ), L-глутамина (2 мМ) и HEPES (5 мМ). Анти-ИЛ-21 антитела добавляли к культурам в концентрации 0-200 нМ. После 7-дневного культивирования количество плазмоцитов определяли посредством проточной цитометрии. Клетки отмывали (ФСБ/2% БСА) и окрашивание в течение 30 минут при 4 градусах анти-IgD (ФИТС или РЕ); анти-CD38 (аллофиокакин, клон НВ7) («BD Pharmingen) и анализировали на проточном цитометре при помощи программы FACSDiva Software. Для всех условий данные набирали в одно и то же время, так что показанное количество событий отражает относительное количество клеток. Однако общее число клеток определяли при помощи AccuCount Particles («Spherotech»).

[00286] Совместное культивирование В-лимфоцитов с активированными CD4+Т-лимфоцитами приводило к появлению популяции плазмоцитов IgD^- CD38^hi PC, причем 68,5% CD19+-клеток экспрессировали данный фенотип плазмоцитов к 7-ому дню (Фигура 6А). Добавление 19Е3.1 или 9F11.1 приводило к подавлению дифференцировки плазмоцитов дозозависимым образом, причем каждое из антител достигало максимума подавления - 80% и 78%, соответственно (Фигуры 6В и 6С). Указанные данные свидетельствуют о том, что анти-21 клоны могут в значительной мере блокировать дифференцировку плазмоцитов, индуцируемую ИЛ-21, вырабатываемым вновь активированными Т-лимфоцитами.

Анти-ИЛ-21 клон подавляет распространение «необученных» СР4+Т-лимфоцитов

[00287] Было показано, что ИЛ-21 поддерживает пролиферацию CD4+Т-лимфоцитов при субоптимальных условиях инициации. «Необученные» CD4+Т-лимфоциты человека очищали и стимулировали in vitro анти-CD3 и ИЛ-21 в присутствии или отсутствии исходного антитела 19Е3.1. Пролиферацию оценивали путем измерения накопления АТФ через четыре дня в культуре. Как сообщалось ранее, определяемое количество АТФ прямо пропорционально количеству метаболически активных клеток в культуре. 19Е3.1 ослабляло ИЛ-21-индуцированную пролиферацию (средняя IC50=61,02 пМ для двух доноров) дозозависимым образом. Указанные данные показывают, что исходное антитело K44VHa-N56Q (MEDI7169) 19Е3.1 подавляет запускаемую ИЛ-21 пролиферацию в «необученных» CD4+Т-лимфоцитах человека (Фигура 7).

Фармакокинетика

[00288] Фармакокинетика (ФК) K44VHaN56Q - YTE антитела - оценивали в трех исследованиях, где применяли обезьян в качестве животной модели, что позволяет предсказывать ФК с разумной точностью (Oitate et al., Drug Metab. Pharmacokinet. 26 (4): 423-430 (2011)). Для прогнозирования ФК у человека, шкалируемой из данных, полученных на животных, основным параметром является клиренс; более низкое значение клиренса указывает на то, что молекула не может оставаться в организме. Значения Кл для K44VHaN56Q у обезьян варьирует от 1,08 до 4,37 мл/д/кг. Типичные терапевтические антитела, такие как Бевацизумаб (Авастин®), Даклизумаб (Зенапакс®), Инфликсимаб (Ремикейд®) и Ритуксимаб (Ритуксан®), ассоциированы с соответствующими значениями Кл 5,78, 5,30, 11,5 и 17,0 (мл/д/кг) (Dong et al., Clin Pharmacokinet. 50(2): 131-142 (2011). Предполагается масса тела обезьяны 3 кг). Указанные значения Кл больше, чем расчетные значения для K44VHaN56Q. Следовательно, предполагается, что K44VHaN56Q остается в организме дольше, чем типичное терапевтическое антитело.

Пример 4. Профилактика реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD) при помощи анти-ИЛ-21 моноклональных антител

Модель ксеногенной GVHD на мышах

[00289] GVHD развивается, когда переносимые (донорские) Т-лимфоциты распознают чужеродные антигены, представляемые молекулами MHC/HLA (главного комплекса гистосовместимости/антигена лейкоцитов человека) хозяина (реципиента). У мышей с недостаточностью по γ-цепи рецептора NOD/SCID/IL-2 (NSG) отсутствуют зрелые Т- и В-лимфоциты, функциональные NK и макрофаги. Такие мыши демонстрируют снижение передачи сигналов от цитокинов в связи с утратой рецептора γс.

[00290] В ксеногенной модели GVHD МКПК человека переносят мышам NSG-реципиентам. Поскольку у мышей присутствует иммунодефицит, клетки человека не отторгаются иммунной системой мыши. Клетки человека распознают окружение организма мыши как чужеродное, активируются и пролиферируют. Активированные клетки человека производят «цитокиновую бурю», которая приводит к сильному иммунореактивному каскаду, который поражает печень, желудочно-кишечный тракт и кожу, в итоге приводя к гибели животного. Из крови мышей с GVHD удается выделить большое число клеток, способных вырабатывать ИЛ-21.

[00291] В исследовании профилактики применяли тридцать пять самок мышей NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ; The Jackson Laboratories, Бар Харбор, Мэн). На начало исследования возраст мышей был 5-7 недель, масса - 16,8 - 22,4 грамм.

Выделение периферической крови человека

[00292] Кровь человека отбирали у двух здоровых доноров в пробирки для приготовления клеток (СРТ) (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния), содержащие гепарин натрия. Мононуклеарные клетки выделяли из пробирок СРТ в соответствии с инструкциями производителя. Если кратко, пробирки центрифугировали при комнатной температуре в течение 25 минут при 1700×g. После центрифугирования мононуклеарные клетки отбирали. Клетки отмывали дважды в ФСБ путем центрифугирования в течение 10 минут при относительной центробежной силе 400×g. Затем клетки подсчитывали и ресуспензировали в соответствующем количестве ФСБ и хранили при комнатной температуре до инъекций (сразу после последней отмывки).

Антитела

[00293] В данном примере в качестве контрольных моноклональных антител применяли антитела IgG1κ-YTE человека (NIP-228-YTE; MedImmune, Кембридж, Великобритания). Контрольное моноклональное антитело разливали аликвотами и замораживали в матричный растворе при -80°C. Рецептурным буфером был раствор 25 мМ гистидина, 7% сахарозы, 0,02% (масса/объем) полисорбата 80, при pH 6,0. Раствор для введения готовили путем разведения аликвоты матричного раствора (60,6 мг/ил) фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до концентрации 1 мг/мл. Рабочие препараты хранили при 4-8°С.

[00294] K44VHa-N56Q (MEDI7169) хранили при -80°C в виде разлитого на аликвоты и замороженного матричного раствора. Рецептурным буфером был раствор 25 мМ гистидина, 7% сахарозы, 0,02% (масса/объем) полисорбата 80, при pH 6,0. Раствор для введения готовили путем разведения аликвоты матричного раствора (47,6 мг/ил) фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до концентрации 1 мг/мл. Рабочие препараты хранили при 4-8°C.

Введение клеток человека, лечение и оценка GVHD

[00295] Введение проводили, как показано в Таблице 6. Если кратко, 12,71×10⁶ очищенных МКПК человека от донора 2 вводили внутрибрюшинно самкам мышей NSG в возрасте 5-7 недель в день 0. Перед введением МКПК, начиная с 1-го дня три раза в неделю внутрибрюшинно вводили двести микрограмм (в объеме 200 мкл) K44VHa-N56Q (MEDI7169), контрольного моноклонального антитела, или такой же объем одного ФСБ (основа).

[00296] Массу тела измеряли индивидуально на протяжении всего исследования, по меньшей мере один раз в неделю. Мышей умерщвляли, когда у них определялась 20% потеря массы тела, или если мыши были истощены/агонизировали или исапытывали боль и другие мучения. Гибель и гуманная эвтаназия применялись как синонимы в целях отслеживания выживания.

Оценка количества и фенотипа Т-лимфоцитов посредством проточной цитометрии

[00297] У мышей отбирали кровь из ретроорбитального синуса и помещали ее в микропробирки с гепарином. Во всех экспериментах во все моменты времени применяли 100 мкл крови. Этап лизиса эритроцитов проводили при помощи лизирующего буфера АСК («Life Technologies», Гранд-Айленд. Нью-Йорк), оставшиеся клетки инкубировали с блокатором TruStain Fc (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния), в соотношении 1:4, 10 минут, затем окрашивали в течение 30 минут при 4°C со следующим комплексом антител, чтобы визуализировать CD4 и CD8-T-лимфоциты: У500-конъюгированное антитело к CD45 человека (клон HI130; BioLegend, Сан-Диего, Калифорния), AF700- конъюгированное антитело к CD4 человека (клон RPA-T4; BioLegend, Калифорния) и BV711-конъюгированное антитело к CD8 человека (клон RPA-T8; BioLegend, Сан-Диего, Калифорния). Пробы промывали, фиксировали в 2% формальдегиде и пропускали через проточный цитометр Becton Dickinson LSR II с применением компьютерной программы FACSDiva. Пробы анализировали при помощи программы FlowJo (версия 9). Клетки человека идентифицировали как клетки, которые экспрессировали антиген человека CD45. Окрашенную кровь (100 мкл) для всех условий отбирали на LSRII в том же объеме, таким образом, число показанных событий отражало относительное количество клеток для разных лечебных воздействий.

Оценка цитокинов человека в сыворотке, отобранной у леченных мышей при помощи мультиплексного ELISA

[00298] Долевые пробы сыворотки отбирали и анализировали при помощи мультиплексного набора human Th17 multiplex kit (магнитные гранулы, предварительно смешанные) («Merck Millipore», Биллерика, Масачуссетс) на анализаторе Luminex 200 в соответствии с инструкциями производителя.

[00299] Применяли программу GraphPad Prism (версия 6.0d для Mac OS X). Результаты по уровню цитокинов у мышей, получавших K44VHa-N56Q (MEDI7169), сравнивали с результатами у мышей, получавших контрольное моноклональное антитело (Донор 1) или контрольное моноклональное антитело и ФСБ (основа) (Донор 2). Указанные данные анализировали при помощи критерия Стьюдента для одной выборки с коррекцией Велша, если определяемый разброс не отличался значимо по F-критерию, и тогда проводили анализ по критериям Манна-Уитни. Р<0,05 для всех значимых различий.

K44VHa-N56Q (MEDI7169) подавляет вызываемое экзогенной GVHD истощение и распространение Т-лимфоцитов

[00300] Сообщалось, что ИЛ-21 влияет на функцию Т-лимфоцитов. Так, изучалась способность K44VHa-N56Q (MEDI7169) подавлять развитие ксеногенной GVHD, которая в основном опосредуется CD4+Т-лимфоцитами. МКПК человека вводили мышам NSG с иммунодефицитом, как было описано выше, и ко дню 21 наблюдали истощающее заболевание у мышей, которые получали контрольное моноклональное антитело (моноклональное антитело IgG1 человека) (Фигура 8А) или основу - ФСБ. Мыши, которые получали 200 мкг K44VHa-N56Q (MEDI7169) три раза в неделю, начиная с 1-го дня, выглядели здоровыми (Фигура 8В), и их состояние было неотличимо от контрольных мышей, которым не вводили клеток человека. Анализ крови выявил, что у мышей, которые получали контрольное моноклональное антитело (или ФСБ), клетки CD45+ человека распространились (Фигура 8С). По сравнению с ними мыши, которые получали K44VHa-N56Q (MEDI7169), демонстрировали значимо сниженное присутствие CD45+клеток человека в крови (Фигура 8D). У мышей, получавших контрольное моноклональное антитело, данное распространение CD45+-клеток человека включало главным образом CD4-положительные клетки (Фигура 8Е), тогда как процент CD4-положительных клеток был значимо снижен у мышей, получавших K44VHa-N56Q (MEDI7169), что отмечалось на 35-ый день (Фигура 8F). Указанные результаты согласуются с подавлением под действием K44VHa-N56Q (MEDI7169) распространения CD4+-T-лимфоцитов у после трансплантации МКПК человека мышам с иммунодефицитом.

[00301] При наблюдении за мышами в течение некоторого времени было отмечено, что животные, получавшие основу ФСБ или контрольное моноклональное антитело, демонстрировали стабильное увеличение числа CD45+-клеток. Однако указанные клетки не распространялись у мышей, которые получали K44VHa-N56Q (MEDI7169) (Фигура 9). Важно, что было показано, что приблизительно через 3 недели после прекращения введения K44VHa-N56Q (MEDI7169) CD45+-клетки начинали распространяться, и затем снова уменьшали распространение при возобновлении лечения (Фигура 9). Указанные данные демонстрируют, что K44VHa-N56Q (MEDI7169) может значительно подавлять распространение Т-лимфоцитов, и данное действие обратимо при прекращении лечения.

K44VHa-N56Q (MEDI7169) предупреждает вызванную GVHD потерю массы и гибель

[00302] Потерю массы тела и выживание отслеживали у мышей, которым не вводили клеток человека (интактные), или которым вводили МКПК человека с основой - ФСБ, контрольное моноклональное антитело или K44VHa-N56Q (MEDI7169), начиная за один день (День - 1) до введения мышам МКПК человека. Было показано, что мыши, которым вводили ФСБ или контрольное моноклональное антитело, быстро теряли массу (Фигура 10А) и либо умирали, либо были умерщвлены, когда масса тела снижалась на 20%. Все мыши (n=16), которым вводили ФСБ или контрольное моноклональное антитело в двух разных исследованиях, либо умерли, либо были умерщвлены к 37-ому дню исследования после введения МКПК человека (Фигура 10В). В отличие от них все мыши (n=10), которым вводили K44VHa-N56Q (MEDI7169), выживали и оставались здоровыми приблизительно до прекращения введения K44VHa-N56Q (MEDI7169) (Фигура 10В). В одном эксперименте мыши оставались здоровыми приблизительно в течение 20 дней после прекращения введения K44VHa-N56Q (MEDI7169), а затем их состояние быстро ухудшилось и они умерли или были умерщвлены вскоре после 31-го дня исследования (Фигура 10В). В отдельном исследовании, где применяли МКПК второго донора, мыши оставались жизнеспособными приблизительно в течение 40 дней после прекращения введения K44VHa-N56Q (MEDI7169). Указанные данные демонстрируют, что K44VHa-N56Q (MEDI7169) защищает от смертности, и что данное действие обратимо при прекращении лечения.

K44VHa-N56Q (MEDI7169) подавляет выработку нескольких цитокинов, и данное действие обратимо

[00303] У мышей, получавших клетки от донора 1 (Фигура 11) и донора 1 (Фигура 12), отбирали сыворотку в разные моменты времени и анализировали ее на предмет экспрессии 25 цитокинов с применением системы MILLIPLEX MAP компании «Millipore». Более половины из исследуемых цитокинов были ниже уровня определения. Для цитокинов, которые поддавались определению, K44VHa-N56Q (MEDI7169) вызывало значимое уменьшение ГМ-КСФ (гранулоцито-макрофаго-колониестимулирующий фактор), ИЛ-10 и ФНО (фактор некроза опухоли) в двух раздельных экспериментах. В одном эксперименте ИФНγ был значимо снижен и показывал тенденцию к снижению во втором эксперименте. Было показано, что ИЛ-17А и ИЛ-9 значимо снижались в одном из двух экспериментов. В обоих экспериментах было показано значимое повышение уровня ИЛ-5 (Фигура 11).

Клинический анализ крови (КАК) проводили при помощи гематологического анализатора Sysmex XT-2000iv, и важно отметить, что у мышей с повышенным уровнем ИЛ-5 не отмечалось повышения количества эозинофилов. Было показано, что ИЛ-+21 был повышен в обоих экспериментах. Повышение уровня ИЛ-21 согласуется с результатами, полученными в исследовании токсичности у яванских макак, в котором повышенный уровень ИЛ-21 отражал количество циркулирующего препарата, который связывался с цитокином и нейтрализовывал его.

[00304] Как показано на Фигуре 9, K44VHa-N56Q (MEDI7169) подавлял распространение CD4+Т-лимфоцитов, и данное действие было обратимо при прекращении введения препарата. Это было подтверждено во втором исследовании (Фигура 12). Примечательно, что после распространения клеток уровень нескольких цитокинов также повышался, включая ФИО, ИФНγ и ИЛ-10 (Фигура 12). Указанные данные показывают, что анти-ИЛ-21-антитело, а именно K44VHa-N56Q (MEDI7169), подавляет распространение Т-лимфоцитов и выработку цитокинов, и оба эффекта обратимы, когда введение K44VHa-N56Q (MEDI7169) прекращают.

Пример 5. Лечение реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD) с применением анти-ИЛ-21 моноклональных антител

Схема эксперимента

[00305] В исследовании терапевтического действия участвовали двадцать самок мышей NSG (NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Wj1/SzJ; The Jackson Laboratories, Бар Харбор, Мэн). В начале исследования возраст мышей был 8 недель, а масса составляла 18,00-22,3 грамма.

[00306] Кровь людей отбирали и готовили, как было описано выше в Примере 4.

[00307] Контрольные и исследуемые моноклональные антитела получали, обрабатывали и хранили, как описано выше в Примере 4.

[00308] Введение проводили, как показано в Таблице 7. Если кратко, 12×10⁶ очищенных МКПК человека от донора 1 вводили внутрибрюшинно самкам мышей NSG в возрасте 8 недель в день 0. Начиная с 7-го дня три раза в неделю внутрибрюшинно вводили двести микрограмм (в объеме 200 мкл) K44VHa-N56Q (MEDI7169) или контрольного моноклонального антитела. Другой группе вводили K44VHa-N56Q (MEDI7169) (200 мкг в 200 мкл) в/б три раза в неделю, начиная с 14-го дня.

[00309] Оценку GVHD, количества и фенотипа Т-лимфоцитов, а также цитокинов человека в сыворотке проводили, как описано выше в Примере 4.

Автоматическая оценка клинического анализа крови

[00310] Для оценки общего содержания лейкоцитов, а также содержания эритроцитов, гематокрита и гемоглобина применяли автоматический гематологический анализатор Sysmex XT-2000iv (Sysmex America, Манделей, Иллинойс). В дни 7, 14 и 21 у мышей отбирали кровь из ретроорбитального синуса в микропробирку с гепарином. Делали разведение 1:10 (20 мкл каждой пробы цельной крови разводили в 180 мкл ФСБ), затем пробы вводили в анализатор, и полученные данные умножали на коэффициент разведения десять.

Терапевтическое воздействие K44VHa-N56Q (MEDI7169) защищает мышей от GVHD

[00311] Чтобы узнать, способно ли антитело K44VHa-N56Q (MEDI7169), вводимое в терапевтических целях, защитить мышей от GVHD, МКПК человека вводили, как описано выше, и K44VHa-N56Q (MEDI7169) вводили через 7 или 14 дней после инъекции клеток человека. Как показано на Фигуре 13, мыши, которые получали контрольное моноклональное антитело, начинали умирать в первые две недели после введения клеток человека, и все умерли к 26-ому дню. Мыши, которые получали K44VHa-N56Q (MEDI7169) в 7-ой день, были полностью защищены от вызванной GVHD гибели. Мыши, которые получали K44VHa-N56Q (MEDI7169) в 14-ый день (после того, как контрольные мыши начали умирать), были защищены частично; 2 из 5 мышей в группе 14-ого дня выжили после 26-го дня, когда все контрольные мыши уже умерли. У мышей, которым вводили клетки человека и контрольное моноклональное антитело в 7-ой день, развилась тяжелая вызванная GVHD анемия. Мыши, которые получали K44VHa-N56Q (MEDI7169) с 7-го дня, были способны поддерживать более высокие нормальные показатели содержания эритроцитов, гематокрита и гемоглобина, которые были ближе к тем интактным животным, которым не вводили клеток (Фигура 14).

[00312] Указанные данные демонстрируют, что анти-ИЛ-21 антитело, а именно K44VHa-N56Q, защищало мышей от GVHD путем уменьшения или устранения симптомов, ассоциированных с заболеванием.

***

[00313] Предшествующее описание конкретных вариантов реализации должно в полной мере показать общий характер изобретения, которое другие могут, применив знания из области компетенции специалистов в данной области техники, легко модифицировать и/или адаптировать для разных областей применения, таких как специфические варианты реализации, без лишних экспериментов, не отклоняясь от общей концепции настоящего изобретения. Следовательно, подразумевается, что такие варианты адаптации и модификации попадают в значение и спектр эквивалентов раскрываемых вариантов реализации, на основании идей и руководства, представленных в настоящей заявке. Следует понимать, что применяемые в настоящей заявке формулировки и терминология предназначены для описания, но не для ограничения, так что терминология и формулировки настоящего описания должны интерпретироваться специалистами в данной области техники в свете идей и руководства. Настоящее изобретение дополнительно описано в следующей формуле изобретения.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), причем

(a) CDR1, CDR2 и CDR3 участка VH содержит DYWMH (SEQ ID NO: 7), TIDPSDNYTIYSQNFKG (SEQ ID NO: 8) c заменой аспарагином (N) глютамина (Q) в положении 7 и YGFAMDY (SEQ ID NO: 9) соответственно; и

(b) CDR1, CDR2 и CDR3 участка VL содержит RASQDISNFLN (SEQ ID NO: 12), YTSRLHS (SEQ ID NO: 13) и QQGHTLPRT (SEQ ID NO: 14) соответственно; и

(c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с ИЛ-21.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, причем

(a) указанный VН содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19;

и

(b) указанный VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.

3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1, 2, содержащие константный участок тяжелой цепи, отличающиеся тем, что указанный константный участок тяжелой цепи содержит константный домен IgG.

4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, отличающиеся тем, что константный домен IgG содержит одну или более аминокислотных замен по сравнению с константным доменом IgG дикого типа и обладает увеличенным временем полувыведения по сравнению с временем полувыведения IgG, содержащего константный домен IgG дикого типа.

5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 3 или 4, отличающиеся тем, что константный домен IgG является константным доменом IgG1 человека.

6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, содержащие аминокислотную последовательность тяжелой цепи (HC), выбранную из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 24.

7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, содержащие аминокислотную последовательность легкой цепи (LC) SEQ ID NO: 18, SEO ID NO: 22 или SEQ ID NO: 26.

8. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-7, содержащие (a) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 20; и (b) аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 22.

9. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, отличающееся тем, что указанное антитело является гуманизированным антителом, химерным антителом, моноклональным антителом, рекомбинантным антителом.

10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv и sc(Fv)2.

11. Конъюгат для ингибирования по меньшей мере одной функциональной активности ИЛ-21, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10, конъюгированное противомикробным агентом, терапевтическим агентом, пролекарством, пептидом, белком, ферментом, липидом, модификатором биологического ответа, фармацевтическим агентом, лимфокином, гетерологичным антителом или его фрагментом, детектируемой меткой, полиэтиленгликолем (ПЭГ), причем указанный конъюгат необязательно ингибирует дифференцировку CD4+ T-лимфоцит-активированных В-лимфоцитов в плазмоциты.

12. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики аутоиммунного заболевания или расстройства или реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD), ассоциированной с ИЛ-21, содержащая эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-10 или конъюгата по п. 11 и необязательно один или более из фармацевтически приемлемых носителя, разбавителя или вспомогательного вещества.

13. Способ лечения или профилактики аутоиммунного заболевания или расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-10 или фармацевтической композиции по п. 12, где указанное аутоиммунное заболевание представляет собой синдром Съегрена (СС), ANCA-ассоциированный васкулит (AAV), гигантоклеточный артериит (GCA) васкулит, системную красную волчанку, волчаночный нефрит, ревматоидный артрит (РА), болезнь Крона, тяжелую миастению, обыкновенную пузырчатку, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ИТП), диабет I типа, связанное с IgG4 заболевание или любую их комбинацию.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что указанным аутоиммунным заболеванием является системная красная волчанка.

15. Способ определения уровней экспрессии ИЛ-21 в образце, включающий (а) приведение указанного образца в контакт с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-10; и (б) определение связывания с ИЛ-21 в указанном образце.

16. Способ лечения или профилактики реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD), ассоциированной с ИЛ-21, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-10 или фармацевтической композиции по п. 12.