Комбинированная терапия для лечения рака

Группа изобретений относится к лечению рака. Способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включает введение указанному субъекту в эффективном для лечения количестве антагониста EP4 в сочетании с терапией, выбранной из группы, состоящей из радиотерапии и терапии антителами, отличается тем, что антагонист EP4 представляет собой соединение формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль. Также раскрыты способ создания иммунологической памяти против рака у субъекта и другой вариант способа лечения рака у субъекта. Группа изобретений обеспечивает эффективное лечение солидных злокачественных опухолей. 3 н. и 19 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 пр.

 

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Блокирование с помощью антагонистов сигнализации простагландина E2 (PGE2), осуществляемой через взаимодействие PGE2 с рецептором 4 простагландина E (EP4), как показано, является эффективным для уменьшения воспаления (Chen et al. (2010) British J. Pharmacol. 160, 292-310). PGE2 также является важным компонентом иммуносупрессивного окружения, создаваемого многими солидными опухолями (Whiteside (2010) Expert Opinion in Biological Therapy. 2010, 10, 1019-1035), и показано, что ингибирование сигнализации EP4 антагонистами уменьшает рост опухолей (Terada et al. (2010) Cancer Res. 70, 1606-1615) и опухолевые метастазы в моделях опухолей на животных (Yang et al. (2006) Cancer Res. 66, 9665-9672).

Даже при наличии самых передовых методов лечения рака, в медицине по-прежнему существует потребность в более эффективных методах лечения солидных злокачественных опухолей, особенно злокачественных опухолей, образовавших метастазы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Была изучена противоопухолевая активность различных сочетаний антагониста EP4 с: облучением; антителами к антигену 4 цитотоксических T-лимфоцитов (анти-CTLA4); антителами к лиганду 1 программируемой клеточной гибели (анти-PDL1); антителами к белку 1 программируемой клеточной гибели (анти-PD1) и антиметаболитами. Результаты данного исследования продемонстрировали улучшенную и/или синергетическую противоопухолевую активность сочетания антагониста EP4 с другими видами терапии по сравнению с одним видом терапии, и в некоторых вариантах осуществления это может приводить к созданию иммунологической памяти против опухоли, даже против другой формы рака.

Таким образом, в одном аспекте изобретения предложен способ лечения рака у субъекта, который нуждается в этом, включающий введение антагониста EP4 в сочетании с терапией, выбранной из группы, состоящей из радиотерапии, терапии антителами и химиотерапии антиметаболитами. В более конкретном аспекте изобретения терапию антителами выбирают из группы, состоящей из терапии антителами к CTLA4, терапии антителами к PDL1 и терапии антителами к PD1. В некоторых вариантах осуществления рак является метастатическим раком.

В другом аспекте изобретения предложен способ создания иммунологической памяти у субъекта, который нуждается в этом, включающий введение некоторого количества антагониста EP4 в сочетании с терапией, выбранной из группы, состоящей из радиотерапии, терапии антителами и химиотерапии антиметаболитами. В другом более конкретном аспекте изобретения терапию антителами выбирают из группы, состоящей из терапии антителами к CTLA4, терапии антителами к PDL1 и терапии антителами к PD1.

В другом аспекте изобретения подвергаемый лечению рак выбирают из группы, состоящей из рака молочной железы, рака шейки матки, колоректального рака, рака эндометрия, глиобластомы, рака головы и шеи, рака почки, рак печени, рака легкого, медуллобластомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака кожи и рака мочевыводящих путей.

В более конкретных аспектах изобретения предложены способы лечения рака и/или создания иммунологической памяти, включающие введение соединения формулы (I):

в котором:

одна из групп R_1a и R_1b представляет собой водород, а другая представляет собой метил; или R_1a и R_1b, взятые вместе, образуют циклопропильное кольцо;

R₂ представляет собой метил или фторметил;

R₃ представляет собой метил;

R₄ представляет собой водород, гало, метил, фторметил, метокси или фторметокси;

R₅ представляет собой водород, гало, метил, фторметил, метокси или фторметокси;

R₆ представляет собой водород, гало, метил или метокси;

R₇ представляет собой водород, гало, метил или метокси; и

X представляет собой кислород;

или его фармацевтически приемлемой соли

в сочетании с радиотерапией; в сочетании с терапией анти-CTLA4; в сочетании с терапией анти-PDL1; в сочетании с терапией анти-PD1 и/или в сочетании с химиотерапией антиметаболитами.

Также предложено применение сочетания антагониста EP4 и терапии, выбранной из группы, состоящей из радиотерапии, терапии антителами и/или химиотерапии антиметаболитами, для лечения рака и/или создания иммунологической памяти, как описано в настоящем документе.

Также предложено применение антагониста EP4 в изготовлении лекарственного средства для комбинированной терапии с терапией, выбранной из группы, состоящей из радиотерапии, терапии антителами и/или химиотерапии антиметаболитами, предназначенной для лечения рака и/или создания иммунологической памяти, как описано в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Значительно улучшенная подавляющая рост опухолей активность комбинированной терапии облучение/ER-886046 в сравнении с одним только облучением. Панель A) Средний объем опухолей у мышей, несущих опухоль CT26, которые получали дозу облучения 9 Гр+ER-886046, только дозу облучения 9 Гр или только растворитель. Панель B) Средняя масса тела у мышей, несущих опухоль CT26. Радиационная терапия: одна доза 9 Гр в день 9; дозирование ER-886046: 150 мг/кг, пероральное (п/о) введение ежедневно в дни 9-32. Введение дозы облучения и ER-886046 мышам, несущим опухоль, указано стрелками и чертами, соответственно. N=10-12 на группу. *, p <0,05, t-критерий Стьюдента.

Фигура 2. Графики опухолевого роста отдельных опухолей CT26 при лечении сочетанием облучение/ER-886046 или только облучением. Животные взяты из эксперимента, описанного на фигуре 1. Панель A) Группа, получавшая растворитель. Панель B) Облучение. Панель C) Облучение плюс ER-886046. N=10-12 на группу. Излечение, полная регрессия опухоли; Прогрессирование, быстрый рост опухоли; Стабильность, сопоставимый размер с исходными опухолями до лечения. Радиационная терапия: одна доза 9 Гр в день 9; дозирование ER-886046: 150 мг/кг, пероральное (п/о) введение ежедневно в дни 9-32. Каждая линия соответствует отдельному животному.

Фигура 3. Улучшенное подавление роста опухолей и выживаемость животных при использовании сочетания низкая доза облучения/ER-886046 в сравнении с использованием только низкой дозы облучения. Графики показателей выживаемости животных для указанных групп лечения. Радиационная терапия: одна доза 3 Гр в день 17; дозирование ER-886046: 150 мг/кг, п/о введение ежедневно в дни 17-45. Когда у животного уменьшение массы тела достигало 20% по сравнению с его исходной массой тела или объем опухоли достигал или превышал 2000 мм³, животное удаляли из исследования в соответствии с протоколом. N=10 на группу. *, p <0,05; ***, p <0,001; критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона.

Фигура 4. Продолжительный противоопухолевый эффект с иммунологической памятью при лечении сочетанием ER-886046/облучение. Панель A) Рост опухолей у мышей, излеченных сочетанием ER-886046 и облучения, или у ранее не подвергавшихся воздействию мышей BalB/c, которым инъецировали клетки CT26. Панель B) Рост опухолей при вторичной имплантации опухолей CT26 излеченным мышам или ранее не подвергавшимся воздействию мышам. Панель C) Рост опухолей 4T1 у излеченных мышей или у ранее не подвергавшихся воздействию мышей. N=9-10. Обратите внимание на полное отторжение имплантированной опухоли CT26 и замедленный рост имплантированных опухолей 4T1 у мышей, излеченных комбинированной терапией. ***, p <0,001. 2-сторонний t-критерий Стьюдента. Обратите внимание, что ни одно животное не получало какого-либо лечения.

Фигура 5. Противоопухолевый эффект сочетания ER-886046/облучение в модели двусторонней опухоли. Две опухоли CT26 с одинаковыми размерами были выращены на хозяине путем инъекции клеток CT26 подкожно как в правый, так и в левый бок мышам BalB/c. Опухоль на правом боку облучали в день 9 и день 13, как указано стрелками на панели A. ER-886046 вводили животным ежедневно п/о в дозе 150 мг/кг, как указано чертами. ER-886046 вводили животным в дни 9-27. Панель A) Средний размер опухолей на правом боку, на которые воздействовали облучением и ER-886046. Панель B) Средний размер опухолей на левом боку, которые не были облучены (облучение применяли только к опухолям на правом боку). Обратите внимание, что сочетание облучение/ER-886046, применяемое к опухолям на правом боку, приводило к существенному замедлению роста опухолей того же происхождения на левом боку, к которым не применяли облучение, что указывало на абскопальный эффект. **, p <0,01; н/з, не значимо; t-критерий Стьюдента.

Фигура 6. Препятствующая образованию метастазов в легких активность сочетания ER-886046/облучение в модели опухоли 4T1 молочной железы. Клетки 4T1-luc2 подкожно (п/к) вводили мышам BalB/c. Когда средний размер опухолей достигал 100 мм³, опухоли облучали в дозе 9 Гр один раз с ежедневным пероральным введением ER-886046 в дозе 150 мг/кг или без него. Панель A) При завершении исследования в день 27 легочные метастазы у животных анализировали и подсчитывали, используя экспрессию люциферазы. Панель B) Представлены репрезентативные IVIS изображения для каждой группы. Для статистического анализа использовали t-критерий Стьюдента.

Фигура 7. Облучение и ER-886046 действуют синергически, изменяя внутриопухолевый иммунитет. Панель A) Количественное определение миелоидных клеток (CD11b⁺) и цитотоксических T-клеток (CD8⁺) в опухолях CT26, на которые воздействовали только дозой 9 Гр, 9 Гр+ER-886046 или только растворителем. Панель B) Количественное определение супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC клетки, CD11b⁺Gr1⁺) в опухолях. Опухоли облучали один раз в день рандомизации, при этом ER-886046 вводили животным п/о ежедневно в дозе 150 мг/кг в течение 7 последовательных дней после рандомизации. Опухоли анализировали методом проточной цитометрии через день после введения последней дозы ER-886046. **, p <0,01; н/з, не значимо; t-критерий Стьюдента.

Фигура 8. Синергетическая противоопухолевая активность ER-886046 в сочетании с анти-CTLA4 в отношении опухолей B16F10. Панель A) Подавляющая рост опухолей активность сочетания анти-CTLA4 и ER-886046 в отношении опухолей меланомы B16F10, растущих у мышей C57BL/6. Панель B) Изменения массы тела животных в группах лечения. Дозирование анти-CTLA4: 200 мкг для первой внутривенной (в/в) инъекции в день 3 после трансплантации и 100 мкг для других трех в/в инъекций в дни 6, 9 и 12, как указано стрелками. Дозирование ER-886046: 150 мг/кг, п/о ежедневное введение в дни 3-15, как указано чертами. *, p <0,05; **, p <0,01; н/з, не значимо; t-критерий Стьюдента.

Фигура 9. Противоопухолевая активность анти-PDL1 или анти-PD1, усиленная за счет ER-886046, в отношении опухолей CT26. Панель A) Активность сочетания анти-PDL1 плюс ER-886046 и отдельно анти-PDL1. Дозирование анти-PDL1: 200 мкг на в/в инъекцию в дни 9, 12, 15 и 18 после имплантации клеток, как указано стрелками; дозирование ER-886046: 150 мг/кг, п/о ежедневное введение в дни 9-19 после имплантации клеток, как указано чертой. Панель B) Активность сочетания анти-PD1 плюс ER-886046 и отдельно анти-PD1. Дозирование анти-PD1: 200 мкг на в/в инъекцию в дни 9, 12, 15, 18 и 21 после имплантации клеток, как указано стрелками; дозирование ER-886046: 150 мг/кг, п/о ежедневное введение в дни 9-23 после имплантации клеток, как указано чертой. *, p <0,05; ***, p <0,001; t-критерий Стьюдента.

Фигура 10. Повышенная противоопухолевая активность комбинированной терапии сочетанием ER-886046 и химиотерапии антиметаболитами с облучением в сравнении с сочетанием только химиотерапии антиметаболитами с облучением. Противоопухолевая активность сочетания гемцитабин плюс локальное облучение (РТ), используемого для лечения опухолей PAN02 поджелудочной железы у мышей C57BL/6 с применением или без применения ER-886046. Дозирование гемцитабина и РТ: одну дозу 40 мг/кг гемцитабина и одну дозу 6 Гр РТ применяли в день 27 после инъекции клеток опухоли. ER-8806046 вводили ежедневно в количестве 150 мг/кг, начиная со дня 27 после инъекции клеток опухоли и до окончания исследования.

Фигура 11. Дополнительные эксперименты с комбинированной терапией сочетанием ER-886046 и химиотерапии антиметаболитами с облучением в сравнении с сочетанием только химиотерапии антиметаболитами с облучением. Панель A) Дозирование гемцитабина и РТ: одну дозу 40 мг/кг гемцитабина и одну дозу 6 Гр РТ применяли в день 19 после инъекции клеток опухоли. ER-8806046 вводили ежедневно в количестве 150 мг/кг, начиная со дня 19 после инъекции клеток опухоли и до окончания исследования. Панель B) Дозирование гемцитабина и РТ: одну дозу 40 мг/кг гемцитабина и одну дозу 6 Гр РТ применяли в день 12 после инъекции клеток опухоли. ER-8806046 вводили ежедневно в количестве 150 мг/кг, начиная со дня 12 после инъекции клеток опухоли и до окончания исследования. Средние размеры опухолей у мышей, несущих мышиную опухоль PAN02 поджелудочной железы, которые получали растворитель, ER-886046, гемцитабин (гем) плюс облучение (РТ), ER-886046 плюс РТ или ER-886046 плюс гемцитабин и РТ, с использованием указанных доз и режимов введения. A и B представляют независимые исследования. N=8-10 на группу; н/з, не значимо; *, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001; и ****, p <0,0001, двусторонний тест ANOVA.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

«Антагонист EP4» означает соединение, которое ингибирует или блокирует клеточную сигнализацию, запускаемую взаимодействием PGE2 с рецептором EP4. Примеры антагонистов EP4 включают, но не ограничиваются ими, ER-819762, MK-2894, MF 498, ONO-AE3-208, эватанепаг, ONO-AE2-227, CJ-042794, EP4A, BGC201531, CJ-023423, ONO-AE3-240, GW 627368 и AH23848, которые приведены в базе данных IUPHAR в качестве антагонистов рецептора EP4. Дополнительные примеры включают, но не ограничиваются ими, соединения формулы (I), приведенной в настоящем документе, включая ER-885290, ER-885740, ER-885741, ER-886045, ER-886046 (E7046), ER-886074, ER-885290, ER-885740 и ER-885741, которые описаны в WO 2012/039972.

«Антитело к CTLA4» или «анти-CTLA4» означает антитело или антитела, направленные против антигена 4 цитотоксических T-лимфоцитов (CTLA4). Иллюстративные антитела включают, но не ограничиваются ими, антитела, являющиеся антагонистами CTLA4, или антитела к CTLA4, описанные в патентах США №№ 8685394 и 8709417. Некоторые варианты осуществления антитела включают MDX-010 (ипилимумаб, Bristol-Myers Squibb) и CP-675206 (тремелимумаб, Pfizer). В конкретном варианте осуществления антитело представляет собой ипилимумаб.

«Антитело к PDL1» или «анти-PDL1» означает антитело, направленное против лиганда 1 программируемой клеточной гибели (PDL1). Иллюстративные антитела включают, но не ограничиваются ими, антитела, описанные в патентах США №№ 8217149, 8383796, 8552154 и 8617546. В конкретном варианте осуществления антитело представляет собой MPDL3280A (Roche).

«Антитело к PD1» или «анти-PD1» означает антитело, направленное против белка 1 программируемой клеточной гибели (PD1). Иллюстративные антитела включают, но не ограничиваются ими, антитела, описанные в патентах США №№ 7029674, 7488802, 7521051, 8008449, 8354509, 8617546 и 8709417. Конкретные варианты осуществления антитела включают MDX-1106 (ниволумаб, Bristol-Myers Squibb), лабролизумаб (Merck) и пембролизумаб (KEYTRUDA^®, Merck).

«Терапия», «лечить» и «лечение» означают ослабление, подавление и/или обращение вспять прогрессирования рака у субъекта, который нуждается в этом. Термин «лечение» включает любые признаки успеха в лечении или ослаблении рака, в том числе любой объективный или субъективный параметр, такой как ослабление; ремиссия; уменьшение симптомов или способствование тому, что травма, патология или состояние становятся более переносимыми для субъекта; отсрочка или замедление прогрессирования, и так далее. Количественные показатели лечения или ослабления могут быть основаны, например, на результатах медицинского осмотра, гистопатологических тестов и/или диагностических тестов, известных в данной области.

Лечение также может означать уменьшение частоты случаев или отсрочку начала развития рака, либо его рецидивов (например, продление срока ремиссии), по сравнению с ситуацией, когда меры не были приняты.

«Эффективное количество» или «эффективное для лечения количество» означает количество, которое эффективно для лечения рака, что отмечено при клиническом тестировании и оценке, наблюдении пациента и/или тому подобном. «Эффективное количество» также может означать количество, которое вызывает поддающееся обнаружению изменение в биологической или химической активности. Поддающиеся обнаружению изменения могут быть обнаружены и/или дополнительно количественно оценены специалистом в данной области с точки зрения соответствующего механизма или процесса. Кроме того, «эффективное количество» может означать количество, которое поддерживает желательное физиологическое состояние, то есть, уменьшает или предотвращает значительное ухудшение и/или способствует улучшению состояния. «Эффективное количество» также может означать терапевтически эффективное количество.

Используемый в настоящем документе термин «субъект» означает субъекта-млекопитающего и, в частности, субъекта-человека, включая мужчин и женщин, в том числе новорожденных, младенцев, несовершеннолетних, подростков, взрослых или пожилых людей, и также включает людей разных рас и народностей.

Используемый в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемая соль» означает относительно нетоксичную соль соединения по изобретению с неорганической или органической кислотой. Такие соли можно получать in situ во время последних стадий выделения и очистки соединений или путем проведения реакции очищенного соединения в его свободной форме отдельно с соответствующей органической или неорганической кислотой и выделения образовавшейся при этом соли. Репрезентативные кислотные соли включают, но не ограничиваются ими, такие соли как ацетат, адипат, аспартат, бензоат, безилат, бикарбонат/карбонат, бисульфат/сульфат, борат, камсилат, цитрат, цикламат, эдизилат, эзилат, формат, фумарат, глуцептат, глюконат, глюкуронат, гексафторфосфат, гибензат, гидрохлорид/хлорид, гидробромид/бромид, гидроиодид/иодид, изетионат, лактат, малат, малеат, малонат, мезилат, метилсульфат, нафтилат, 2-напсилат, никотинат, нитрат, оротат, оксалат, пальмитат, памоат, фосфат/гидрофосфат/дигидрофосфат, пироглютамат, сахарат, стеарат, сукцинат, таннат, тартрат, тозилат, трифторацетат и ксинафоат. В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль гидрохлорид/хлорид.

Используемый в настоящем документе термин «рак» может включать формы рака, возникающие вследствие генетически унаследованных мутаций. Примеры таких форм рака включают, но не ограничиваются ими, рак молочной железы, формы рака, которые могут быть связаны с синдромом Ли-Фраумени, например, детские саркомы, лейкозы и злокачественные опухоли мозга, формы рака, которые могут быть связаны с синдромом Линча, например, рак толстого кишечника, рак желчных протоков, злокачественные опухоли мозга, рак эндометрия, рак почки, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак тонкого кишечника, рак желудка и рак мочеточника, рак легкого, меланома, рак предстательной железы, ретинобластома, рак щитовидной железы и рак тела матки.

Кроме того, рак может возникать в результате приобретенных мутаций, например, мутаций, возникающих из-за диеты, экологических условий и/или образа жизни, либо соматических мутаций. Примеры таких форм рака могут включать, но не ограничиваются ими, рак надпочечника, рак коры надпочечника, рак мочевого пузыря, злокачественную опухоль мозга, первичную злокачественную опухоль мозга, глиому, глиобластому, рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстого кишечника (неограничивающие примеры включают колоректальную карциному, такую как аденокарцинома толстой кишки и аденома толстой кишки), рак эндометрия, рак эпидермиса, рак пищевода, рак желчного пузыря, рак мочеполовой системы, рак головы и шеи, рак почки, рак печени, рак легкого (неограничивающие примеры включают аденокарциному, мелкоклеточный рак легкого и немелкоклеточный рак легкого), лимфомы (неограничивающие примеры включают B-клеточную лимфому, T-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжскинскую лимфому), меланому, злокачественную меланому, злокачественную карциному, злокачественную инсулиному поджелудочной железы, миелому, множественную миелому, рак яичника, рак поджелудочной железы (такой как карцинома экзокринной части поджелудочной железы), рак предстательной железы, почечно-клеточный рак, рак кожи, такой как, помимо других, упомянутых ранее, плоскоклеточная карцинома, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, фолликулярный рак щитовидной железы, опухоль Вильмса, хориокарциному, фунгоидный микоз, злокачественную гиперкальциемию, гиперплазию шейки матки, лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточную лимфому, лимфому Беркитта, острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, миелодиспластический синдром, промиелоцитарный лейкоз, хронический гранулоцитарный лейкоз, острый гранулоцитарный лейкоз, фибросаркому, рабдомиосаркому, астроцитому, нейробластому, рабдомиосаркому, шванному, саркому Капоши, истинную полицитемию, эссенциальную тромбоцитемию, болезнь Ходжкина, неходжскинскую лимфому, саркому мягких тканей, остеогенную саркому, первичную макроглобулинемию, семиному, тератокарциному, остеосаркому, пигментную ксеродерму, кератоакантому и ретинобластому.

«Метастатический рак» означает рак, при котором раковые клетки из органа или части тела распространились (путем «метастазирования») в другие, не соседние органы или части тела. Рак в не соседнем органе или части тела («вторичная опухоль» или «метастатическая опухоль») содержит раковые клетки, происходящие из органа или части тела, из которых рак или раковые клетки распространились. Области, в которых может развиваться вторичная опухоль, включают, но не ограничиваются ими, лимфатические узлы, легкие, печень, головной мозг и/или кости.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист EP4, используемый в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляет собой соединение формулы (I):

в котором:

одна из групп R_1a и R_1b представляет собой водород, а другая представляет собой метил; или R_1a и R_1b, взятые вместе, образуют циклопропильное кольцо;

R₂ представляет собой метил или фторметил;

R₃ представляет собой метил;

R₄ представляет собой водород, гало, метил, фторметил, метокси или фторметокси;

R₅ представляет собой водород, гало, метил, фторметил, метокси или фторметокси;

R₆ представляет собой водород, гало, метил или метокси;

R₇ представляет собой водород, гало, метил или метокси; и

X представляет собой кислород;

или его фармацевтически приемлемую соль.

Соединения формулы (I) известны и их синтез описан в документе WO 2012/039972, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.

Если нет иных указаний, номенклатура, используемая для описания химических групп или фрагментов, упомянутых в настоящем документе, является традиционной, название читают слева направо, точка присоединения к остальной части молекулы указана в правой части названия. Например, группа «метокси» присоединена к остальной части молекулы на кислородном конце. Другие примеры включают метоксиэтил, в котором точка присоединения находится на этильном конце.

Используемый в настоящем документе термин «фторметил» означает метильную группу, замещенную одним или более атомами фтора (например, монофторметил, дифторметил, трифторметил).

Используемый в настоящем документе термин «фторметокси» означает фторметильную группу, определение которой приведено ранее, присоединенную к основной углеродной цепи через атом кислорода.

В некоторых вариантах осуществления формулы (I) одна из групп R_1a и R_1b представляет собой водород, а другая представляет собой метил; R₂ представляет собой метил, дифторметил или трифторметил; R₃ представляет собой метил; R₄ представляет собой хлор, фтор, трифторметил, дифторметил, метил, метокси, дифторметокси или трифторметокси; R₅ представляет собой водород, хлор, фтор, метил или метокси; и R₆ и R₇ представляют собой водород. В некоторых вариантах осуществления R₅ представляет собой водород. В некоторых вариантах осуществления R₄ выбирают из хлора, трифторметила, дифторметила, дифторметокси и трифторметокси.

В некоторых вариантах осуществления формулы (I) R_1a и R_1b, взятые вместе, образуют циклопропильное кольцо; R₂ представляет собой метил, трифторметил или дифторметил; R₃ представляет собой метил; R₄ представляет собой трифторметил, дифторметил, хлор или фтор; и R₆ и R₇ представляют собой водород.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой:

или его фармацевтически приемлемую соль.

В конкретном варианте осуществления соединение формулы (I) представляет собой:

или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен способ подавления роста опухоли или лечения рака, в котором антагонист EP4 вводят в сочетании с дополнительной терапией или средством, полезным для подавления роста опухоли и/или лечения рака, то есть, комбинированная терапия.

В настоящем документе применение двух или более средств/видов терапии (включая антагонисты EP4, радиотерапию, терапию антителами, химиотерапию антиметаболитами или любое их сочетание) «в сочетании» означает, что виды терапии применяют достаточно близко по времени, так что введение или наличие одного из них изменяет биологические эффекты другого. Виды терапии можно применять одновременно (параллельно) или последовательно.

Одновременное применение можно осуществлять, например, смешивая два или более средств перед введением или применяя средство/вид терапии в один и тот же момент времени, но в разные участки тела или с использованием разных путей введения, или вводя с очень малыми промежутками времени, так что наблюдаемые результаты не отличаются от тех, которые получены при применении средств/видов терапии в один и тот же момент времени. Например, введение одного или более средств одновременно с облучением можно осуществлять, вводя средство(а) в тот же момент времени, когда проводят облучение, или в достаточно близкие моменты времени, так что наблюдаемые результаты не отличаются от тех, которые получены при применении средства(средств) и облучения в один и тот же момент времени.

Последовательное применение можно осуществлять, применяя средства/виды терапии в разные моменты времени, например, применяя средство/вид терапии в некоторый момент времени до или после применения одного или более других средств/видов терапии, так что применение средств/видов терапии в сочетании усиливает терапевтический эффект при лечении рака. В некоторых вариантах осуществления антагонист EP4 вводят в некоторый момент времени до первичного применения радиотерапии, терапии антителами и/или химиотерапии антиметаболитами. Альтернативно, радиотерапию, терапию антителами и/или химиотерапию антиметаболитами можно проводить в некоторый момент времени до введения антагониста EP4 и, необязательно, вновь проводить в некоторый момент времени после введения антагониста EP4.

В некоторых вариантах осуществления введение антагониста EP4 в сочетании с радиотерапией, терапией антителами и/или химиотерапией антиметаболитами приводит к усилению указанной радиотерапии, терапии антителами и/или химиотерапии антиметаболитами так, что, например, меньшая доза облучения, терапевтических антител и/или химиотерапевтических антиметаболитов может быть эффективной для лечения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения лечение рака может включать абскопальный эффект и/или приводить к развитию иммунологической памяти.

Абскопальный эффект представляет собой явление в лечении метастатического рака, когда локализованное лечение конкретной опухоли или рака, например, с использованием радиотерапии, приводит к уменьшению в размерах и исчезновению не локализованного заболевания, опухолей или рака, например, тех, которые образовались в результате метастазирования, которые находятся далеко от участка, для которого проводят локализованное лечение, таким образом, приводя к исчезновению заболевания, опухолей или рака во всем организме субъекта или пациента. Абскопальный эффект отличается от эффектов, которые могут возникать в тканях, смежных с зоной локализованного лечения, таких как, например, «эффекты свидетеля», которые могут возникать в результате радиотерапии.

«Иммунологическая память» имеет место, когда проводимое лечение от рака облегчает адаптацию иммунной системы и иммунного ответа субъекта или пациента, делая возможным замедление, уменьшение или предотвращение возврата заболевания или рецидива, например, продлевается период ремиссии заболевания, опухоли или рака, которые подвергают лечению у субъекта или пациента. В некоторых вариантах осуществления иммунологическая память может приводить к замедлению, уменьшению или предотвращению развития опухолей или форм рака, которые отличаются от рака, подвергаемого лечению, например, за счет распространения эпитопов.

Антагонист EP4, антитело и/или антиметаболит, описанные в настоящем документе, можно формулировать для введения в фармацевтическом носителе в соответствии с известными методами. Смотри, например, сборник Remington, The Science and Practice of Pharmacy (9^е издание, 1995 г.). В производстве фармацевтического препарата по изобретению активное соединение (включая его физиологически приемлемые соли), как правило, смешивают, в частности, с приемлемым носителем. Носитель, безусловно, должен быть приемлемым, то есть, быть совместимым с любыми другими ингредиентами в препарате и не быть вредным для пациента. Носитель может быть твердым или жидким, или и тем, и другим, и предпочтительно быть сформулированным с соединением в виде стандартно дозированного препарата, например, таблетки, которая может содержать от 0,01 или 0,5% до 95% или 99% по массе активного соединения. Одно или более активных соединений можно включать в препараты по изобретению, которые могут быть получены любым хорошо известным фармацевтическим методом, включающим смешивание компонентов, необязательно, включение одного или более вспомогательных ингредиентов и/или эксципиентов. В некоторых вариантах осуществления любые из композиции(й), носителя(ей), вспомогательного ингредиента(ов,) эксципиента(ов) и/или препарата(ов) по изобретению включают ингредиенты, полученные либо из природных, либо из неприродных источников. В других вариантах осуществления любой компонент композиции(композиций), носителя(ей), вспомогательного ингредиента(ов), эксципиента(ов) и/или препарата(ов) по изобретению может быть предоставлен в стерильной форме. Неограничивающие примеры стерильного носителя включают свободную от эндотоксинов воду или апирогенную воду.

Антагонист EP4, антитело и/или антиметаболит можно вводить субъектам любым подходящим путем введения, в том числе, перорально (включая введение через ротовую полость и также включая введение через орогастральный зонд), внутрибрюшинно, парентерально, с помощью ингаляционного аэрозоля, топически (то есть, как на кожу, так и на слизистые оболочки, включая поверхности воздухоносных путей), чрескожно, ректально, назально (включая введение через назогастральный зонд), подъязычно, трансбуккально, вагинально или с помощью имплантированного резервуара. Используемый в настоящем документе термин «парентеральный» способ введения включает подкожную, внутримышечную, внутрикожную, внутривенную, внутрисуставную, интрасиновиальную, интрастернальную, интратекальную, внутрипеченочную, внутриочаговую и интракраниальную инъекцию или инфузию. В конкретном варианте осуществления антагонист EP4, антитело и/или антиметаболит вводят перорально. В другом конкретном варианте осуществления антагонист EP4, антитело и/или антиметаболит вводят внутривенно.

В некоторых вариантах осуществления количество антагониста EP4, антитела и/или антиметаболита, которые можно объединять с материалами эксципиентов для получения композиции в стандартной лекарственной форме, будет варьироваться в зависимости от получающего лечение субъекта и конкретного пути введения.

В некоторых вариантах осуществления антагонист EP4, антитело и/или антиметаболит предоставлены в виде части стерильной композиции/препарата, содержащего антагонист EP4, антитело и/или антиметаболит и приемлемый носитель и/или эксципиент.

В некоторых вариантах осуществления антагонист EP4 вводят субъекту в эффективном количестве. Эффективное количество, как правило, составляет от 0,01 мг/кг до 500 мг/кг массы тела в сутки. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемые композиции могут быть сформулированы таким образом, что доза соединения, составляющая от 0,01 мг/кг до 200 мг/кг или от 0,01 мг/кг до 100 мг/кг массы тела в сутки, может быть введена пациенту, получающему данные композиции (например, для человека с массой тела 75 кг доза составляет от 0,75 мг до 7,5 г или 15 г). В конкретных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению сформулированы для доставки дозы от 0,01 мг/кг до 70 мг/кг (например, для человека с массой тела 75 кг доза составляет от 0,75 мг до 5,25 г).

В некоторых вариантах осуществления эффективная доза антагониста EP4 составляет от примерно 0,5 до примерно 250 мг/кг, от 1 до примерно 250 мг/кг, от примерно 2 до примерно 200 мг/кг, от примерно 3 до примерно 120 мг/кг, от примерно 5 до примерно 250 мг/кг, от примерно 10 до примерно 200 мг/кг, или от примерно 20 до примерно 120 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления эффективные дозы включают примерно 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 8 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 40 мг/кг, 50 мг/кг, 60 мг/кг, 75 мг/кг, 100 мг/кг, 120 мг/кг, 150 мг/кг, 175 мг/кг, 200 мг/кг, 225 мг/кг, 250 мг/кг и 300 мг/кг. Лекарственные формы могут представлять собой, например, таблетки или капсулы, и эффективную дозу можно предоставлять в одной или более таблетках, капсулах или тому подобном, и принимать один раз в сутки или в течение суток с интервалами, например, 4, 8 или 12 часов. Таблетки или капсулы, например, могут содержать, к примеру, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1250 мг соединения. Например, введение субъекту-человеку антагониста EP4 в некоторых вариантах осуществления может включать ежедневную дозу антагониста EP4 в диапазоне 100-1250, 150-1000, 200-800 или 250-750 мг, и эту ежедневную дозу можно вводить полностью один раз в сутки или ее можно вводить частями в течение суток с определенными интервалами. Можно также изготавливать жидкие препараты, чтобы любую дозу было легко и удобно распределять.

Антитело, например, анти-CTLA4, анти-PDL1 или анти-PD1, перед введением, как правило, будет смешано с нетоксичным, фармацевтически приемлемым носителем (например, обычным солевым раствором или фосфатно-солевым буфером), и может быть введено с использованием любой подходящей медицинской процедуры, включая, например, но без ограничения, внутривенное или внутриартериальное введение, а также инъекцию в цереброспинальную жидкость. В некоторых случаях может быть полезно использовать внутрибрюшинное, внутрикожное, внутриполостное, интратекальное или прямое введение в опухоль или в артерию, снабжающую опухоль кровью.

В некоторых вариантах осуществления эффективная доза антитела составляет от примерно 5 до примерно 250 мг/кг, от примерно 10 до примерно 200 мг/кг или от примерно 20 до примерно 120 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления эффективные дозы включают 5 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 40 мг/кг, 50 мг/кг, 60 мг/кг, 75 мг/кг, 100 мг/кг, 120 мг/кг, 150 мг/кг, 175 мг/кг, 200 мг/кг, 225 мг/кг, 250 мг/кг и 300 мг/кг. Лекарственные формы могут представлять собой, например, таблетки или капсулы, и эффективную дозу можно предоставлять в одной или более таблетках, капсулах или тому подобном, и принимать один раз в сутки или в течение суток с интервалами, например, 4, 8 или 12 часов. Таблетки или капсулы, например, могут содержать, к примеру, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мг антитела. Можно также изготавливать жидкие препараты, чтобы любую дозу было легко и удобно распределять.

В некоторых вариантах осуществления антитело вводят субъекту в эффективном количестве. Эффективное количество, как правило, составляет от 0,01 мг/кг до 500 мг/кг массы тела в сутки. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемые композиции могут быть сформулированы таким образом, что доза соединения, составляющая от 0,01 мг/кг до 200 мг/кг или от 0,01 мг/кг до 100 мг/кг массы тела в сутки, может быть введена пациенту, получающему данные композиции (например, для человека с массой тела 75 кг доза составляет от 0,75 мг до 7,5 г или 15 г). В конкретных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению сформулированы для доставки дозы от 0,01 мг/кг до 70 мг/кг (например, для человека с массой тела 75 кг доза составляет от 0,75 мг до 5,25 г).

Эффективное количество антитела может составлять, например, 0,05 мг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг или 8 мг/кг на дозу (например, для человека с массой тела 75 кг доза составляет от 3,75 мг до 600 мг).

Дозу антитела можно вводить один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять или более раз в неделю, раз в неделю, раз в две недели или даже раз в три недели на протяжении курса лечения. Введение доз может быть ежедневным, раз в два дня, раз в три дня, раз в четыре дня, раз в пять дней, раз в неделю, раз в две недели или раз в три недели. Препараты, содержащие антитело, можно изготавливать таким образом, чтобы любую дозу было легко и удобно распределять.

«Радиотерапия» означает использование ионизирующего излучения в медицинских целях, в частности, для лечения рака. Предпочтительно, медицинское использование ионизирующего излучения в лечении рака приводит к уменьшению и/или уничтожению раковых клеток в организме субъекта.

Радиотерапию можно применять любым образом, как понятно специалисту в данной области. Примеры излучения, используемого в радиотерапии, включают, но не ограничиваются ими, фотонное, ионизирующее излучение или излучение заряженных частиц, например, рентгеновские лучи или протоны. Примеры радиотерапии включают, но не ограничиваются ими: дистанционную лучевую терапию или телетерапию; брахитерапию или терапию с закрытым источником излучения и системную радиоизотопную терапию или радиотерапию с незакрытым источником излучения.

Доза применяемого облучения может варьироваться в зависимости от рака или опухоли, которые являются мишенью. В некоторых вариантах осуществления дозы облучения могут составлять 80 грей (Гр), 60 Гр, 40 Гр, 20 Гр, 12 Гр, 10 Гр, 9 Гр, 8 Гр, 7 Гр, 6 Гр, 5 Гр, 4 Гр, 3 Гр, 2 Гр или 1 Гр, включая любое промежуточное количество и/или диапазоны количеств. В некоторых вариантах осуществления доза составляет 12 Гр, 9 Гр, 6 Гр или 3 Гр. Дозу облучения можно вводить один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять или более раз в неделю, в течение одной, двух, трех, четырех или пяти, или более недель на протяжении курса лечения.

В некоторых вариантах осуществления антиметаболит вводят субъекту в эффективном количестве. Эффективное количество, как правило, составляет от 0,01 мг/кг до 500 мг/кг массы тела в сутки. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемые композиции могут быть сформулированы таким образом, что доза соединения, составляющая от 0,01 мг/кг до 200 мг/кг или от 0,01 мг/кг до 100 мг/кг массы тела, может быть введена пациенту, получающему данные композиции (например, для человека с массой тела 75 кг доза составляет от 0,75 мг до 7,5 г или 15 г). В конкретных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению сформулированы для доставки дозы от 0,01 мг/кг до 70 мг/кг (например, для человека с массой тела 75 кг доза составляет от 0,75 мг до 5,25 г).

В некоторых вариантах осуществления эффективная доза антиметаболита составляет от примерно 0,5 до примерно 250 мг/кг, от 1 до примерно 200 мг/кг, от примерно 2 до примерно 175 мг/кг, от примерно 3 до примерно 150 мг/кг, от примерно 5 до примерно 125 мг/кг, от примерно 10 до примерно 100 мг/кг или от примерно 20 до примерно 80 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления эффективные дозы включают примерно 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 8 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 40 мг/кг, 50 мг/кг, 60 мг/кг, 75 мг/кг, 100 мг/кг, 120 мг/кг, 150 мг/кг, 175 мг/кг, 200 мг/кг, 225 мг/кг, 250 мг/кг и 300 мг/кг. Дозы могут быть предоставлены, например, в жидкой форме, подходящей для парентерального введения (например, внутривенного), или в форме, подходящей для перорального введения, например, в форме таблеток или капсул, и эффективная доза может быть предоставлена в одной или более таблетках, капсулах или тому подобном. В некоторых вариантах осуществления антиметаболит вводят одновременно с облучением.

Используемые в настоящем документе термины «антитело» и «антитела» включают все типы иммуноглобулинов, в том числе IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, или их фрагменты, которые могут быть подходящими для медицинского применения, описанного в настоящем документе. Антитела могут быть моноклональными или поликлональными и могут быть получены от животного любого вида, включая, например, мышь, крысу, кролика, лошадь или человека. Фрагменты антитела, сохраняющие специфичность связывания с белком или эпитопом, например, CTLA4, PDL1 или PD1, который связывает антитело, используемое по настоящему изобретению, охвачены термином «антитело». Такие фрагменты можно получать известными методами. Антитела могут быть химерными или гуманизированными, в частности, когда их используют для терапевтических целей. Антитело можно получать или производить способами, известными в данной области.

«Терапия антителами» означает использование в медицинских целях антител, которые связывают целевую клетку или белок, для лечения рака и/или стимуляции иммунного ответа у субъекта, результатом чего является узнавание, атака и/или уничтожение раковых клеток в организме субъекта, и в некоторых вариантах осуществления изобретения для активации или стимуляции иммунологической памяти в организме субъекта, результатом чего является последующее узнавание, атака и/или уничтожение раковых клеток в организме субъекта.

«Терапия антителами к CTLA4» означает использование антител, направленных против антигена 4 цитотоксических T-лимфоцитов (анти-CTLA4), для модуляции иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления антитело к CTLA4 ингибирует или блокирует сигнализацию через CTLA4, приводящую к ингибированию активации T-клеток для атаки и уничтожения раковых клеток. Подходящие для этой цели антитела включают, но не ограничиваются ими, антитела, которые являются антагонистами CTLA4, или антитела к CTLA4, описанные в патентах США №№ 8685394 и 8709417. Некоторые варианты осуществления антитела включают MDX-010 (ипилимумаб, Bristol-Myers Squibb) и CP-675206 (тремелимумаб, Pfizer). В конкретном варианте осуществления антитело представляет собой ипилимумаб.

«Терапия антителами к PDL1» означает использование антител, направленных против лиганда 1 программируемой клеточной гибели (анти-PDL1), для модуляции иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления антитело к PDL1 ингибирует или блокирует взаимодействие PDL1 с белком 1 программируемой клеточной гибели (PD1), при этом блокирование взаимодействия между PDL1 и PD1 ингибирует отрицательную регуляцию активации T-клеток за счет PD1 для атаки и уничтожения раковых клеток. Подходящие для этой цели антитела включают, но не ограничиваются ими, антитела, описанные в патентах США №№ 8217149, 8383796, 8552154 и 8617546. В конкретном варианте осуществления антитело представляет собой MPDL3280A (Roche).

«Терапия антителами к PD1» означает использование антител, направленных против белка 1 программируемой клеточной гибели PD1 (анти-PD1), для модуляции иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD1 ингибирует или блокирует взаимодействие PD1 с PDL1, при этом ингибирование или блокирование взаимодействия между PDL1 и PD1 ингибирует отрицательную регуляцию активации T-клеток за счет PD1 для атаки и уничтожения раковых клеток. Подходящие для этой цели антитела включают, но не ограничиваются ими, антитела, описанные в патентах США №№ 7029674, 7488802, 7521051, 8008449, 8354509, 8617546 и 8709417. Конкретные варианты осуществления антитела включают MDX-1106 (ниволумаб, Bristol-Myers Squibb), лабролизумаб (Merck) и пембролизумаб (KEYTRUDA^®, Merck).

«Химиотерапия антиметаболитами» означает использование химиотерапевтических антиметаболитов в лечении субъекта. Термин «антиметаболит» относится к группе молекул, которые препятствуют синтезу ДНК и РНК. Примеры антиметаболитов включают, но не ограничиваются ими, антифолаты, фторпиримидины, аналоги дезоксинуклеозидов и тиопурины. Антифолаты включают метотрексат и пеметрексед. Фторпиримидины включают фторурацил и капецитабин. Аналоги дезоксинуклеозидов включают цитарабин, гемцитабин, децитабин, 5-азацитидин (вайдаза), флударабин, неларабин, кладрибин, клофарабин и пентостатин. Тиопурины включают тиогуанин и меркаптопурин. В одном варианте осуществления антиметаболит представляет собой гемцитабин. В другом варианте осуществления антиметаболит представляет собой капецитабин.

Для лучшего понимания изобретения, описанного в настоящем документе, приведены следующие примеры. Следует понимать, что данные примеры предназначены исключительно для иллюстративных целей и не должны быть истолкованы как ограничивающие данное изобретение каким-либо образом.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ СОЧЕТАНИЕМ ER-886046 С ОБЛУЧЕНИЕМ ИЛИ АНТИТЕЛАМИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты и оборудование: ER-886046 получали в компании Eisai Inc. (Andover, MA). Готовое для использования in vivo антитело против CTLA4 (клон 9H10) и его контроль по изотипу получали от компании BioXCell (Wester Lebanon, NH); антитело против PDL1 (клон 10f.9G2) и его контроль (клон LTF-2) получали от компании TONBO Bioscience (San Diego, CA) и антитело против PD1 мыши (клон RMP1-14) и его контроль по изотипу получали от компании BioXcell (Wester Lebanon, NH). Метилцеллюлозу и коллагеназу I приобретали у компании Sigma. Флуоресцентно меченые антитела для CD45 (клон 30-F11), CD8 (клон 53-6.7), CD11b (клон M1/70), Gr1 (клон RB6-8C5) мыши получали от компании eBioscience (San Diego, CA). Биологический облучатель X-RAD 320 от компании Precision X-Ray использовали для облучения опухолей животных. Анализ методом проточной цитометрии проводили с использованием проточного цитометра BD Canto-1 для 6-цветного анализа (BD Biosciences) с программным обеспечением FlowJo версии 7.6. Систему визуализации IVIS spectrum с программным обеспечением Living Image версии 4.3.1 приобретали у компании Perkin Elmer.

Линии клеток: Мышиные клетки CT26 рака толстой кишки (CRL-2638), клетки B16F10 меланомы (CRL-6475) и клетки 4T1 рака молочной железы (CRL-2539) получали из Американской коллекции типовых культур. Экспрессирующие люциферазу клетки 4T1 (4T1-luc2) получали от компании Perkin Elmer. Все клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки во влажной камере при температуре 37°C в атмосфере 5% диоксида углерода и пассировали дважды в неделю до получения количества клеток, необходимого для инокуляции мышей.

Животные: Самок мышей BalB/c и C57BL/6 в возрасте 4-6 недель приобретали у компании Charles River Laboratories. Животных содержали в микроизоляторных клетках, до пяти мышей в клетке, при 12-часовом цикле свет/темнота. Подстил в клетках меняли дважды в неделю. Животных ежедневно наблюдали и отмечали клинические признаки. Все экспериментальные процедуры были одобрены комиссиями лабораторий, занимающихся исследованиями на животных, в Eisai Inc. или в Southern Research Institute, каждая из которых аккредитована AAALAC.

Исследования на животных: In vitro культивируемые раковые клетки собирали, суспендировали в 100 мкл фосфатно-солевого буфера при концентрации клеток 1,0×10⁵ клеток/мл и подкожно (п/к) инъецировали мышам при помощи шприца с иглой 26 G в день 0. В дни после имплантации, указанные на фигурах, мышей рандомизировали на основании размера опухоли, затем лечили облучением в дозе 3 или 9 Гр на курс лечения, анти-PDL1 в дозе 200 мкг/мышь на внутрибрюшинную инъекцию (в/б) или анти-CTLA4 в дозе 200 или 100 мкг/мышь на в/б инъекцию с пероральным введением или без введения ER-886046 в дозе 150 мг/кг. Животные, отнесенные к группам лечения в индивидуальном исследовании, имели близкие значения средней массы опухолей во всех группах. Размер опухолей измеряли дважды в неделю с помощью цифрового штангенциркуля (Mitutoyo Corp), и объем рассчитывали по формуле (l x w²)/2=мм³, где l и w относятся к более длинному и более короткому расстояниям, измеряемым в двух взаимно перпендикулярных направлениях при каждом осмотре. Графики зависимости от времени размеров опухолей (среднее ± SEM) и массы тела (среднее ± SEM) в группах строили с использованием программы GraphPad Prism 6 (Lake Forest, CA). Для статистического анализа использовали t-критерий Стьюдента и критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона.

В случае повторного введения опухолей мышам, не имеющим опухоли после лечения, клетки CT26 и клетки 4T1 индивидуально п/к инъецировали в разные бока одной и той же мыши, рост каждой опухоли измеряли и строили график, как описано выше. Не подвергавшихся воздействию мышей, которые не получали ни инъекции раковых клеток, ни лечения лекарственным средством, включали в качестве контролей. В модели легочных метастазов опухоли 4T1-luc2 клетки инокулировали, и мышей, несущих опухоль, рандомизировали в день 10 на основании размера первичных опухолей. При завершении исследования в день 27 мышам во всех группах лечения интраназально вводили люциферин, легкие извлекали и анализировали на экспрессию люциферазы с использованием прибора IVIS. Количественное определение люциферазной активности в легких выполняли с помощью программы Living Image.

Проточная цитометрия: Опухоли CT26 у животных, получавших или не получавших лечение, хирургически иссекали и физически измельчали, с последующим расщеплением коллагеназой I в концентрации 1 мг/мл при температуре 37°C в течение 1 часа. Смеси отдельных клеток, полученные в результате расщепления, метили путем инкубации с флуоресцентными антителами против антигенов иммунных клеток и анализировали методом проточной цитометрии. Расчеты популяций клеток проводили с помощью программы FlowJo 7.6.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Улучшенная противоопухолевая активность при использовании комбинированной терапии сочетанием ER-886046 с облучением по сравнению с одним только облучением. Для изучения того, усиливает ли лечение ER-886046 противоопухолевый эффект облучения, на опухоли CT26, растущие подкожно у мышей, воздействовали локальным облучением в дозе 9 Гр в день 9 после имплантации опухоли, с последующим ежедневным пероральным введением ER-886046 в течение 4 недель. На фигуре 1, панель A, представлены средние размеры опухолей для групп лечения. Применение только облучения приводило к значительному подавлению роста опухолей в период времени 9-32 дней, с последующим быстрым возобновлением роста опухолей в сравнении с контрольной группой. Напротив, лечение сочетанием ER-886046 и облучения приводило к устойчивому подавлению роста опухолей до окончания исследования в день 49, когда не было отмечено никакого существенного роста опухолей в сравнении с размером опухолей до начала лечения. Противоопухолевая активность в группе, получающей комбинированное лечение, была значительно улучшена по сравнению с группой, получавшей только облучение. Добавление ER-886046 в схему лечения не влияло на общее состояние здоровья и массу тела животных по сравнению с группой, получающей только облучение (фигура 1, панель B).

При сравнении кривых роста отдельных опухолей в группах лечения (фигура 2, панели A-C) было обнаружено, что применение сочетания ER-886046 и облучения приводило к излечению 9 из 12 мышей, и только 1 из 12 опухолей быстро прогрессировала. Напротив, лишь 5 из 11 мышей не имели опухоли по окончании исследования в группе, получавшей только облучение. Более того, сочетание низкой дозы 3 Гр однократного облучения с ER-886046 приводило к значительному увеличению выживаемости животных по сравнению с применением только растворителя или только облучения (фигура 3). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что добавление перорального введения ER-886046 к лечению посредством облучения приводило к значительному усилению противоопухолевой активности облучения как при высокой, так и при низкой дозе в данной доклинической животной модели.

Мыши, излеченные в результате комбинированного лечения сочетанием ER-886046 и облучения, имели противоопухолевую иммунологическую память. Не имеющих опухолей мышей из описанного выше исследования дополнительно наблюдали в течение 2 месяцев, до этого момента у них все еще отсутствовали рецидивы опухолей. Для проверки того, имели ли эти освободившиеся от опухолей в результате комбинированного лечения мыши иммунологическую память в отношении опухолей, которые были отторгнуты, клетки той же линии CT26 инъецировали в другой участок тела мышей и рост опухолей контролировали в течение последующих 1,5 месяцев. Поразительно, но у всех мышей, которым повторно вводили опухолевые клетки, рост опухолей полостью отсутствовал. Напротив, инъекции такого же количества клеток CT26 подобранным по возрасту животным приводили к быстрому росту опухолей (фигура 4, панель A). Более того, вторичная имплантация клеток CT26 через 1,5 месяца после первой, опять-таки, не приводила к поддающемуся обнаружению росту опухолей у излеченных мышей (фигура 4, панель B). Интересно, что при инъекции клеток другой, полностью отличающейся линии, 4T1, излеченным мышам отторжения опухолей не происходило, однако скорость роста была значительно снижена по сравнению с контрольной группой (фигура 4, панель C). Данные результаты отчетливо свидетельствуют, что у мышей, излеченных в результате комбинированного лечения сочетанием ER-886046 и облучения, развивалась иммунологическая память, специфичная для опухолевых антигенов. Подавление роста опухолей 4T1 у излеченных мышей указывает на существование эффекта распространения эпитопов у излеченных мышей, который является очень благоприятным эффектом для пациентов с опухолями.

Абскопальный эффект комбинированного лечения сочетанием ER-886046 и облучения в животной модели. Индукция противоопухолевого иммунного ответа может быть системной и, следовательно, очень ценной при лечении метастатического рака, имеющего множество очагов в организме одного хозяина. Для имитации множества метастатических очагов у мышей авторы изобретения вызывали рост опухолей CT26 одновременно на двух боках отдельной мыши путем подкожного введения раковых клеток. Опухоли на правом боку у мышей подвергали воздействию как облучения, так и ER-886046. Опухоли на левом боку у мышей подвергали воздействию только ER-886046. Результаты измерения опухолей на правом боку у мышей, на которые воздействовали как облучением, так и ER-886046, свидетельствовали о лучшем подавлении роста опухолей по сравнению с опухолями, на которые воздействовали только облучением или только ER-886046 (фигура 5, панель A). Более того, опухоли на левом боку у мышей, на которые воздействовали только ER-886046 без облучения, демонстрировали значительно сниженную скорость роста опухолей по сравнению с теми случаями, когда ER-886046 не использовали (фигура 5, панель B). Эти результаты показывают, что сочетание локального облучения и системного введения ER-886046 приводит к подавлению роста опухоли, которая не была облучена, и, таким образом, свидетельствуют о наличии абскопального эффекта на рост метастатических опухолей.

Направленный против спонтанного метастазирования эффект комбинированной терапии сочетанием ER-886046 и облучения. Для проверки того, имеет ли сочетание ER-886046 и облучения противометастатический эффект, экспрессирующие люциферазу опухоли 4T1-luc2 молочной железы мышей выращивали подкожно у мышей BalB/c. Первичные опухоли лечили растворителем, ER-886046, однократным облучением в дозе 9 Гр и сочетанием ER-886046 и облучения. Облучение проводили в день 9 и ER-886046 перорально вводили ежедневно в дни 9-27. В день 27 мышам во всех группах лечения интраназально вводили люциферин, легкие извлекали и анализировали на экспрессию люциферазы. Количественная оценка экспрессии люциферазы показала значительное снижение только в группе комбинированного лечения (фигура 6, панель A, панель B), что указывало на уменьшение спонтанного метастазирования в легкие.

Изменение внутриопухолевой инфильтрации иммунных клеток при комбинированной терапии сочетанием ER-886046 и облучения. Для изучения влияния комбинированной терапии сочетанием ER-886046 и облучения на внутриопухолевый иммунитет, иммунные клетки в опухолях CT26, которые подвергали комбинированному лечению или только облучению, анализировали методом проточной цитометрии. Применение только облучения приводило к значительному увеличению частоты инфильтрации опухолей как CD8⁺ T-клетками, так и CD11b⁺ миелоидными клетками, и добавление ER-886046 к облучению не влияло существенно на частоту инфильтрации клеток обоих типов. С другой стороны, только комбинированная терапия приводила к снижению пропорции Gr1⁺ клеток среди CD45⁺CD11b⁺ клеток, указывая на снижение частоты возникновения супрессорных клеток миелоидного происхождения при применении комбинированной терапии сочетанием ER-886046 и облучения по сравнению с применением растворителя или только облучения.

Синергетическая противоопухолевая активность сочетания ER-886046 и анти-CTLA4 в доклинической модели. Анти-CTLA4 (ипилимумаб) в настоящее время является одобренным иммунотерапевтическим средством для лечения метастатической меланомы, которое блокирует сигнализацию CTLA4 в иммунных клетках, особенно T-клетках. Для исследования того, влияет ли лечение ER-886046 на противоопухолевую активность анти-CTLA4, авторы изобретения тестировали эффекты комбинированной терапии сочетанием ER-886046 и анти-CTLA4 в модели мышиной меланомы B16F10. Как показано на фигуре 8, панель A, препарат ER-886046 сам по себе имел минимальную активность в данной модели, и анти-CTLA4 само по себе проявляло некоторую, но статистически не значимую активность. Однако сочетание ER-886046 и анти-CTLA4 в лечении демонстрировало весьма значительную противоопухолевую активность. Никакого снижения массы тела животных не наблюдали при применении комбинированной терапии. Результаты указывали на синергетическую противоопухолевую активность сочетания ER-886046 и анти-CTLA4 в данной доклинической модели.

ER-886046 повышает эффективность противораковых иммуннотерапевтических средств анти-PD1 и анти-PDL1 в доклинической модели. Анти-PD1 и анти-PDL1 в настоящее время проходят клинические испытания для потенциального применения в качестве противораковых иммунотерапевтических средств. Для изучения потенциального комбинированного эффекта ER-886046 с каждым из средств, авторы изобретения тестировали комбинированную терапию в модели опухоли CT26. Анти-PDL1 демонстрировало некоторую, но не значительную активность против роста опухолей (фигура 9, панель A), в то время как анти-PD1 проявляло значительную активность само по себе (фигура 9, панель B). В обоих случаях добавление ER-886046 приводило к большей противоопухолевой активности по сравнению с использованием только анти-PD1 или анти-PDL1, что указывает на преимущество использования для лечения рака сочетания ER-886046 и этих иммунотерапевтических средств на основе антител.

ВЫВОД

Сочетание ER-886046 с облучением, анти-CTLA4, анти-PDL1 или анти-PD1 демонстрировало значительную противоопухолевую активность в доклинических животных моделях. Включение ER-886046 в комбинированную терапию приводит к усиленному подавлению опухолевого роста и даже отторжению опухолей по сравнению с применением отдельного средства или способа самих по себе и, таким образом, может иметь терапевтическое применение в клинике для лечения пациентов, страдающих раком.

ПРИМЕР 2: КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ СОЧЕТАНИЕМ ER-886046 С ОБЛУЧЕНИЕМ И ХИМИОТЕРАПИЕЙ АНТИМЕТАБОЛИТАМИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты и оборудование: ER-886046 (Chen et al. British J Pharmacol, (2010) 160, 292-310), специфический антагонист рецептора 4 простагландина E₂, получали в компании Eisai Inc. (Andover, MA). Гемцитабина гидрохлорид и метилцеллюлозу приобретали у компании Sigma (St Louis, MO). Биологический облучатель X-RAD 320 от компании Precision X-Ray использовали для облучения опухолей животных.

Линии клеток и животные: Мышиные клетки CT26 рака толстой кишки и клетки PAN02 рака поджелудочной железы получали из Американской коллекции типовых культур и репозитария Отдела диагностики и лечения рака (DCTD) Национального института рака, соответственно. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки во влажной камере при температуре 37°C в атмосфере 5% диоксида углерода и пассировали дважды в неделю до получения количества клеток, необходимого для инокуляции мышей. Самок мышей BalB/c и C57BL/6 в возрасте 4-6 недель приобретали у компании Charles River Laboratories. Животных содержали в микроизоляторных клетках, до пяти мышей в клетке, при 12-часовом цикле свет/темнота. Подстил в клетках меняли дважды в неделю. Животных ежедневно наблюдали и отмечали клинические признаки. Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных компании Eisai Inc. Лаборатории, в которых проводили эксперименты с животными, аккредитованы AAALAC.

Исследования на животных: In vitro культивируемые раковые клетки собирали, суспендировли в 100 мкл холодного HBSS буфера при концентрации клеток 1,0×10⁶ клеток/мл (клетки CT26) или 1,0×10⁷ клеток/мл (клетки PAN02) и подкожно (п/к) инъецировали мышам при помощи шприца с иглой 26 G в день 0. В дни, указанные на фигурах, мышей рандомизировали на основании размера опухоли, затем лечили только локальным облучением, только гемцитабином (внутривенное введение), только ER-886046 (пероральное введение) или сочетанием этих вариантов лечения. Животные, отнесенные к группам лечения в индивидуальном исследовании, имели близкие значения средней массы опухолей во всех группах. Размер опухолей измеряли дважды в неделю с помощью цифрового штангенциркуля (Mitutoyo Corp), и объем рассчитывали по формуле (l x w²)/2=мм³, где l и w относятся к более длинному и более короткому расстояниям, измеряемым в двух взаимно перпендикулярных направлениях при каждом осмотре. Графики зависимости от времени размеров опухолей (среднее ± SEM) в группах строили с использованием программы GraphPad Prism 6 (Lake Forest, CA). Двусторонний тест ANOVA использовали для статистических расчетов среди групп. N=8-10 в каждой группе лечения.

При сравнении выживаемости животных несущее опухоль животное, у которого опухоль вырастала до размера, в 10 раз превышающего исходный размер опухоли до лечения, считали достигшим конечной точки и удаляли из исследования. Графики зависимости выживаемости животных (в процентилях) от времени строили с использованием программы GraphPad Prism 6, логарифмический ранговый критерий использовали для статистических расчетов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Превосходная противоопухолевая активность комбинированной терапии сочетанием ER-886046 и химиотерапии антиметаболитами с облучением по сравнению с терапией сочетанием только антиметаболитов с облучением. Для оценки того, улучшает ли добавление ER-886046 к сочетанию химиотерапии антиметаболитами с облучением противораковую активность в доклинической животной модели, проводили несколько исследований с использованием мышиных опухолей PAN02 поджелудочной железы, которые росли подкожно у мышей C57BL/6, которые получали лечение РТ и гемцитабином плюс РТ, в обоих случаях с применением или без применения ER-886046. В первом исследовании РТ и гемцитабин применяли один раз в день 27 после инокуляции клеток опухоли, в то время как ER-886046 вводили ежедневно со дня 27 и до окончания исследования. На фигуре 10 показаны средние размеры опухолей в группах лечения из данного исследования. Сочетание РТ плюс гемцитабин проявляло слабую, но статистически значимую задерживающую рост опухолей активность. ER-886046 сам по себе был более эффективен, чем сочетание РТ плюс гемцитабин. Тройное сочетание ER-886046, РТ и гемцитабин демонстрировало наилучшую противоопухолевую активность среди групп лечения, и активность была значительно выше, чем в случае сочетания только РТ плюс гемцитабин. Важно отметить, что отсутствовало значимое различие в противоопухолевой активности между группой тройного сочетания и группой ER-886046 плюс РТ, это указывало на то, что противоопухолевая активность в случае тройного сочетания в основном была результатом действия ER-886046 и РТ.

Во втором и третьем исследованиях с использованием той же модели рака поджелудочной железы PAN02 наблюдали аналогичную превосходную противоопухолевую активность тройного сочетания ER-886046, РТ и гемцитабина по сравнению с лечением любым из средств в отдельности или сочетанием гемцитабин плюс РТ, как показано на фигуре 11, панели A и B. РТ и гемцитабин вводили один раз в день 19 (фигура 11, панель A) или день 12 (фигура 11, панель B), в то время как ER-886046 вводили ежедневно, начиная со дня 19 (фигура 11, панель A) или дня 12 (фигура 11, панель B) и до конца каждого исследования. Примечательно, что пять из восьми животных с опухолями были исцелены при лечении тройным сочетанием ко дню 36 после инокуляции клеток опухоли, в то время как другие схемы лечения не приводили к исцелению (фигура 11, панель B). В совокупности данные результаты демонстрируют наличие синергии между ER-886046 и гемцитабином плюс РТ в сдерживании и/или отторжении сформировавшихся опухолей в доклинической модели.

Все варианты лечения в этих трех исследованиях хорошо переносились животными, не вызывая смерть или значительное снижение массы тела.

ВЫВОД

Приведенные данные свидетельствуют о том, что сочетание ER-886046 и химиотерапии антиметаболитами с облучением имело значительную тормозящую опухолевый рост активность в моделях рака на иммунокомпетентных животных. Комбинированное лечение сочетанием ER-886046 плюс химиотерапия антиметаболитами с облучением отличалось значительно повышенной противоопухолевой активностью по сравнению с лечением сочетанием только химиотерапии антиметаболитами с облучением и, таким образом, оно может иметь терапевтическое применение в клинике для лечения рака.

1. Способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту в эффективном для лечения количестве антагониста EP4 в сочетании с терапией, выбранной из группы, состоящей из радиотерапии и терапии антителами, отличающийся тем, что антагонист EP4 представляет собой соединение формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что рак выбирают из группы, состоящей из: рака молочной железы, рака шейки матки, колоректального рака, рака эндометрия, глиобластомы, рака головы и шеи, рака почки, рак печени, рака легкого, медуллобластомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака кожи, меланомы и рака мочевыводящих путей.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что рак представляет собой метастатический рак.

4. Способ создания иммунологической памяти против рака у субъекта, который нуждается в этом, включающий введение указанному субъекту в эффективном для лечения количестве антагониста EP4 в сочетании с терапией, выбранной из группы, состоящей из: радиотерапии и терапии антителами.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что терапия представляет собой радиотерапию.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанное создание иммунологической памяти включает абскопальный эффект.

7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что терапия представляет собой терапию антителами.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что терапию антителами выбирают из группы, состоящей из: терапии антителами к CTLA4, терапии антителами к PDL1 и терапии антителами к PD1.

9. Способ по любому из пп. 4-8, отличающийся тем, что антагонист EP4 представляет собой соединение формулы (I):

в котором:

одна из групп R_1a и R_1b представляет собой водород, а другая представляет собой метил; или R_1a и R_1b, взятые вместе, образуют циклопропильное кольцо;

R₂ представляет собой метил или фторметил;

R₃ представляет собой метил;

R₄ представляет собой водород, галоген, метил, фторметил, метокси или фторметокси;

R₅ представляет собой водород, галоген, метил, фторметил, метокси или фторметокси;

R₆ представляет собой водород, галоген, метил или метокси;

R₇ представляет собой водород, галоген, метил или метокси; и

X представляет собой кислород;

или его фармацевтически приемлемую соль.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанное соединение формулы (I) выбирают из группы, состоящей из:

или их фармацевтически приемлемых солей.

11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанное соединение формулы (I) представляет собой:

или его фармацевтически приемлемую соль.

12. Способ по п.9, отличающийся тем, что рак выбирают из группы, состоящей из рака молочной железы, рака шейки матки, колоректального рака, рака эндометрия, глиобластомы, рака головы и шеи, рака почки, рак печени, рака легкого, медуллобластомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака кожи, меланомы и рака мочевыводящих путей.

13. Способ по п.9, отличающийся тем, что рак представляет собой метастатический рак.

14. Способ по п.9, отличающийся тем, что иммунологическая память включает распространение эпитопов.

15. Способ по п. 9, дополнительно включающий применение химиотерапии антиметаболитами в сочетании с антагонистом EP4 и терапией, выбранной из группы, состоящей из: радиотерапии и терапии антителами.

16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что антиметаболит представляет собой аналог дезоксинуклеозида.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что аналог дезоксинуклеозида представляет собой гемцитабин.

18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что антиметаболит представляет собой капецитабин.

19. Способ лечения рака у субъекта, который нуждается в этом, включающий введение указанному субъекту в эффективном для лечения количестве антагониста EP4 в сочетании с химиотерапией антиметаболитами, где антагонист EP4 представляет собой соединение формулы

или его фармацевтически приемлемую соль.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что антиметаболит представляет собой аналог дезоксинуклеозида.

21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что аналог дезоксинуклеозида представляет собой гемцитабин.

22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что антиметаболит представляет собой капецитабин.