Адаптация вируса гриппа н5 к человеку

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен модифицированный полипептид для лечения или предотвращения инфекции гриппа А, последовательность которого по меньшей мере на 95% идентична последовательности референсного гемагглютинина H5 (ГА H5) или последовательности его соответствующего участка, при этом указанный референсный ГА H5 выбран из группы, состоящей из ГА вируса гриппа A/Egypt/N03450/2009 (“Egy09”) дикого типа и ГА вируса гриппа A/duck/Egypt/ 10185S S/2010 (“Egy 10”). Изобретение может быть использовано для лечения или предотвращения гриппа в медицине. 8 н. и 14 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 1 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственную заявку

[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США №61/762103, поданной 7 февраля 2013 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Поддержка правительства

[0002] Настоящее изобретение было создано при поддержке правительства по контракту № R37 GM057073 с Национальными Институтами Здоровья. Правительство имеет определенные права на данное изобретение.

Уровень техники

[0003] Грипп (также называемый инфлюенца) представляет собой инфекционное заболевание, вызываемое РНК-содержащими вирусами, которые обычно инфицируют млекопитающих и птиц. Птичий грипп, включая штамм H5N1, представляет собой высоко контагиозный и потенциально смертельный патоген, но в настоящее время птичий грипп обладает лишь ограниченной способностью инфицировать человека. Тем не менее, известно, что вирусы птичьего гриппа накапливают мутации, что может влиять на их специфичность к хозяевам и потенциально может позволить им инфицировать человека. Две основные пандемии гриппа прошлого столетия возникли из-за вирусов птичьего гриппа с измененным генетическим составом, что позволило данным вирусам инфицировать человека.

[0004] В связи с постоянной эволюцией вирусов гриппа существуют опасения, что современные штаммы птичьего гриппа могут накапливать мутации, которые влияют на их специфичность к хозяину и могут позволить им инфицировать человека. Расходы в 2005 г., связанные с пандемией гриппа, по всей видимости, являются значительными; угроза такой пандемии привела к тому, что национальные правительства потратили миллиарды долларов на разработку стратегий управления и борьбы с потенциальной пандемией. Соответственно, совершенствование методик эпидемиологического надзора и способов прогнозирования штаммов гриппа, для которых характерен высокий уровень риска, может иметь значение для предотвращения или минимизации опасности возникновения пандемии у человека. Существует общепризнанная необходимость разработки терапевтических агентов, в частности вакцин, для лечения и/или предотвращения инфицирования гриппом, в частности, людей. Также существует необходимость совершенствования технологий идентификации и/или характеристики возникающих штаммов и параметров их инфекционности.

Краткое описание изобретения

[0005] Согласно настоящему изобретению предложены композиции и способы, для применения для обнаружения, лечения и/или предотвращения передачи инфекции гриппа и/или инфицирования гриппом.

[0006] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложены терапевтические агенты, такие как композиции вакцин, для лечения и предотвращения инфицирования и/или передачи инфекции гриппа, в частности, среди людей. Например, в настоящем описании раскрыты гемагглютининовые (ГА) полипептиды, в частности предложены полипептиды ГА Н5, аминокислотные последовательности которых демонстрируют высокую степень идентичности по отношению к референсному гемагглютинину (ГА) (то есть гемагглютинину, с которым проводят сравнение, например, референсному ГА Н5,) или его соответствующей части, но отличаются наличием или отсутствием некоторых определенных признаков, относящихся к их последовательности. В целом, референсный ГА представляет собой ГА, который в существенной степени не опосредует инфицирование и/или передачу инфекции у человека (например, при тестировании с использованием одной или более утвержденных или описанных тест-систем для оценки такого инфицирования и/или передачи инфекции у человека). В некоторых вариантах реализации предложенный полипептид ГА представляет собой полипептид ГА, опосредующий инфицирование и/или передачу инфекции у человека. В некоторых вариантах реализации предложенный полипептид ГА демонстрирует характеристики инфицирования и/или передачи инфекции у человека, сопоставимые с таковыми у референсного ГА, для которого известно, что он опосредует такое инфицирование и/или передачу инфекции у человека.

[0007] Таким образом, согласно настоящему изобретению предложены определенные полипептиды ГА и соответствующие их фрагменты, содержащие их композиции и способы их получения и применения.

[0008] Согласно настоящему изобретению также предложены агенты, которые позволяют детектировать предложенные полипептиды ГА и фрагменты, например, путем непосредственного связывания с ними. В некоторых вариантах реализации такие детектирующие агенты представляют собой или содержат антитела, которые непосредственно связываются с одним или более предложенными полипептидами ГА. В некоторых вариантах реализации детектирующие агенты отличают конкретный предложенный полипептид ГА от одного или более референсных ГА. В некоторых вариантах реализации детектирующие агенты позволяют отличить конкретный предложенный полипептид ГА от одного или более референсных ГА, даже когда последовательность этого предложенного полипептида ГА отличается от последовательности референсного ГА только отсутствием или наличием одного или более признаков, приведенных в настоящем документе; в некоторых таких вариантах 0реализации детектирующий агент делает различия между диагностическими наборами, способами получения композиций вакцин. В некоторых вариантах реализации связывающий агент позволяет отличить конкретный предложенный полипептид ГА от одного или более референсных ГА, даже когда последовательность предложенного полипептида ГА отличается от последовательности референсного ГА только отсутствием или наличием 1, 2, 3, 4 или 5 таких признаков. В некоторых вариантах реализации связывающий агент позволет отличить конкретный предложенный полипептидом ГА от одного или более референсных полипептидов ГА, даже когда последовательность этого конкретного полипептида ГА отличается от последовательности референсного ГА только отсутствием или наличием единственного признака, описанного в настоящем документе.

[0009] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложены способы и реагенты для детектирования, определения характеристик и/или мониторинга инфекции гриппа. В некоторых вариантах реализации предложенные способы и реагенты применяют для детектирования, определения характеристик и/или мониторинга штаммов вируса гриппа, присутствующих в одном отдельно взятом организме (например, в организме одного человека). В некоторых вариантах реализации предложенные методики и реагенты используют для детектирования, определения характеристик и/или мониторинга штаммов вируса гриппа, присутствующих в популяции организмов (например, людей). В некоторых вариантах реализации предложенные способы и реагенты применяют для детекции, характеристики и/или мониторинга штаммов вируса гриппа, присутствующих в некоторой области или в среде.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0010] ФИГ. 1: на ФИГ. 1, части 1А-1С изображены профили связывания типичных ГА H1, Н2 и Н5 пандемического вируса с рецепторами человека и/или птицы. 1А. Аффинность связывания A/South Carolina/1/1918 с рецепторами человека (6'SLN-LN) и рецепторами птицы (3'SLN-LN). 1В. Аффинность связывания A/Albany/6/1958 (A1b58) с рецепторами человека (6'SLN-LN) и рецепторами птицы (3'SLN-LN). 1С. Аффинность связывания A/California/04/2009 с рецепторами человека (6'SLN-LN) и рецепторами птицы (3'SLN-LN). На ФИГ. 1D изображен профиль связывания штамма Viet04H5 НА после введения мутации по LS-домену в рецепторы человека (6'SLN-LN) и рецепторы птицы (3'SLN-LN).

[0011] ФИГ. 2: показаны различия между характерным сайтом связывания рецептора ГА Н2 и характерным сайтом связывания рецептора ГА Н5.

[0012] ФИГ. 3: изображено филогенетическое дерево некоторых подтипов вируса гриппа. Близкородственные подтипы расположены рядом друг с другом.

[0013] ФИГ. 4: на ФИГ. 4, части 4А и 4В, показано наличие или отсутствие специфических признаков сайта связывания рецептора ГА Н5 в разные периоды времени. 4А. Изменение во времени процентной доли изолятов вируса гриппа человека и птицы штамма H5N1, которые приобрели две специфические аминокислотные замены в составе ГА в соответствии с признаками сайта связывания рецептора ГА Н2. 4В. Изменение во времени процентной доли изолятов вируса гриппа человека и птицы, которые приобрели аминокислотные замены в составе ГА в соответствии с признаками сайта связывания рецептора ГА Н2.

[0014] ФИГ. 5: на ФИГ. 5А и 5В изображены профили связывания вируса гриппа дикого типа и его вариантов, мутированных в соответствии с некоторыми вариантами реализации. 5А. Представлено дозозависимое непосредственное связывание ГА вируса дикого типа Viet04 с несколькими рецепторами. 5 В. Представлено дозозависимое непосредственное связывание варианта V2.3 ГА вируса гриппа Viet04 с несколькими рецепторами. Следует обратить внимание на то, что вариантная форма способна к количественному переключению предпочтительного связывания, то есть демонстрирует высокую аффинность связывания с рецепторами человека, конкретно 6'SLN-LN, и минимальное связывание с рецепторами птиц в сравнении с ГА Viet04 дикого типа.

[0015] ФИГ. 6: на ФИГ. 6А показаны типичные профили дозозависимого непосредственного связывания гликановой матрицы с ГА вируса гриппа Egy09 Н5, который эволюционировал в природе таким образом, что соответствует Признакам 1 и 4. За исключением 3'SLN, связывание этого ГА с рецепторами у птиц аналогично связыванию вируса гриппа Viet04. На ФИГ. 6В показаны типичные профили дозозависимого непосредственного связывания гликановой матрицы с мутантным вирусом гриппа Egy09 Е4.2, которому требуется меньше аминокислотных замен для количественного переключения на связывание с рецепторами человека. На ФИГ. 6С показаны типичные профили дозозависимого непосредственного связывания гликановой матрицы с ГА вируса гриппа Egy09 Н5, в котором всего две аминокислотные замены Asn-224→Lys/Gln-226→Leu, соответствующие Признакам 1, 2 и 4. На ФИГ. 6D показаны типичные профили дозозависимого непосредственного связывания гликановой матрицы с мутантом вируса гриппа dkEgy10 Е5.1 с единственной мутацией Gln226→Leu, соответствующей Признакам 1, 2 и 4.

[0016] ФИГ. 7: на ФИГ. 7, части 7А и 7В, показано дозозависимое непосредственное связывание гликановых матриц с LS-мутантами H5N1, принадлежащими к различным штаммам; по оси абсцисс - значения концентраций ГА, по оси ординат - величины сигнала связывания, выраженные в процентах от максимального сигнала. 7А. ГА вируса гриппа A/Egypt/NAMRU-3/06 (Egy06), в составе которого в природе отсутствует сиквон гликозилирования по положениям 158-160. 7В. ГА вируса гриппаА/chicken/R2/07, который является представителем H5N1 и принадлежит к кладе 2.2.1, в составе которого в природе также отсутствует сиквон гликозилирования по положениям 158-160.

[0017] ФИГ. 8: схема для понимания специфичности гликанового рецептора. Гликаны со связями α-2-3 и/или α-2-6 способны находиться в разных топологических формах. Согласно настоящему изобретению возможность ГА-полипептида связываться с некоторыми из этих топологических форм определяет их способность опосредовать инфицирование различных хозяев, например, людей. Как изображено на ФИГ. 8А, в настоящем изобретении выделяют две наиболее релевантные топологические формы: форму "конуса" и форму "зонта". Топологическую форму конуса могут принимать гликаны со связями α-2-3 и/или α-2-6, и она типична для коротких олигосахаридов или разветвленных олигосахаридов, связанных с основной частью (также такую топологическую форму могут принимать некоторые определенные длинные олигосахариды). Топологическую форму зонта могут принимать только гликаны со связями α-2-6 (предположительно из-за конформационного многообразия, обеспечиваемого дополнительной С5-С6 связью, присутствующей при α-2-6-соединении) и, преимущественно, длинные олигосахариды или разветвленные гликаны с длинными олигосахаридными ветвями, в частности, содержащие Neu5Ac α 2-6Gal β 1-3/4GlcNAc-. Как описано в настоящем документе, способность ГА-полипептидов связываться с гликанами топологической формы зонта обеспечивает их связывание с рецепторами человека и/или возможность опосредовать инфицирование человека. На ФИГ. 8В показана топология α-2-3 и α-2-6, определяемая торсионными углами вокруг гликозидной связи трисахаридных мотивов --Neu5Ac α 2-3Gal β l-3/4GlcNAc и Neu5Ac α 2-6Gal β l-4GlcNAc, соответственно. Для характеристики топологии в этих трисахаридных мотивах был определен такой параметр как θ-угол между атомом С2 мотива Neu5Ac и С1 атомами следующих за ним сахаров Gal и GlcNAc.

[0018] ФИГ. 9. Примеры топологической формы конуса. На данной фигуре изображены некоторые (но не исчерпывающие) примеры структур гликанов, принимающих топологическую форму конуса.

[0019] ФИГ. 10. Примеры топологической формы зонта. На данной фигуре изображены некоторые определенные (но не исчерпывающие) примеры структур N- и О-связанных гликанов, принимающих топологическую форму зонта.

[0020] ФИГ. 11. Примеры топологической формы зонта. На данной фигуре изображены некоторые определенные (но не исчерпывающие) примеры структур О-связанных гликанов, принимающих топологическую форму зонта.

Описание элементов последовательностей ГА

Элемент 1 последовательности ГА

[0021] Элемент 1 последовательности ГА представляет собой элемент аминокислотной последовательности, соответствующий участку в области 97-185 аминокислотных остатков (положение остатков определяли при использовании ГА Н3 в качестве референсной последовательности) многих ГА-белков, обнаруженных в природных изолятах вируса гриппа. Этот элемент последовательности имеет следующую базовую структуру:

, причем:

длина X1 составляет приблизительно 30-45 аминокислотных остатков;

длина Х2 составляет приблизительно 5-20 аминокислотных остатков;

длина Х3 составляет приблизительно 25-30 аминокислотных остатков; и

длина Х4 составляет приблизительно 2 аминокислотных остатка.

[0022] В некоторых вариантах реализации длина X1 составляет примерно 35-45, или примерно 35-43, или примерно 35, 36, 37, 38, 38, 40, 41, 42, или 43аминокислотных остатка. В некоторых вариантах реализации длина Х2 составляет примерно 9-15, или примерно 9-14, или примерно 9, 10, 11, 12, 13, или 14 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации длина Х3 составляет примерно 26-28, или примерно 26, 27, или 28 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации Х4 имеет последовательность (G/A) (I/V). В некоторых вариантах реализации Х4 имеет последовательность GI; в некоторых вариантах реализации Х4 имеет последовательность GV; в некоторых вариантах реализации Х4 имеет последовательность AI; в некоторых вариантах реализации Х4 имеет последовательность AV. В некоторых вариантах реализации Элемент последовательности ГА 1 содержит дисульфидную связь. В некоторых вариантах реализации эта дисульфидная связь соединяет аминокислотные остатки, соответствующие положениям 97 и 139 в референсной последовательности (на основании канонической системы нумерации по Н3, используемой в настоящем документе).

[0023] В некоторых вариантах реализации, и в частности в полипептидах Н5, длина X1 составляет примерно 42 аминокислотных остатка, и/или длина Х2 составляет примерно 13 аминокислотных остатков, и/или длина Х3 составляет примерно 26 аминокислотных остатков.

[0024] В некоторых вариантах реализации, и в частности в полипептидах ГА Н5, Элемент последовательности ГА 1 имеет следующую структуру:

, причем:

длина Х1А составляет приблизительно 27-42, или приблизительно 32-42, или приблизительно 32-40, или приблизительно 23-38, или приблизительно 28-38, или приблизительно 28-36, или приблизительно 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, или 40 аминокислотных остатков, а Х2-Х4 как описано выше.

[0025] В некоторых вариантах реализации и, в частности, в полипептидах ГА Н5, Элемент последовательности ГА 1 имеет следующую структуру:

, причем:

длина X1A составляет приблизительно 27-42, ли приблизительно 32-42, или приблизительно 32-40, или приблизительно 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, или 40 аминокислотных остатков, и

длина Х3А составляет приблизительно 23-28, или приблизительно 24-26, или приблизительно 24, 25, или 26 аминокислотных остатков, а Х2 и Х4 как описано выше.

[0026] В некоторых вариантах реализации и, в частности, в полипептидах ГА Н5, Элемент последовательности ГА 1 удлинен (по положениям, соответствующим аминокислотным остаткам 186-193) за счет следующей последовательности:

[0027] В некоторых вариантах реализации и, в частности, в полипептидах ГА Н5, Элемент последовательности ГА 1 включает в себя последовательность:

,

обычно в пределах X1, и, в особенности, начиная с 6 аминокислотного остатка X1.

Элемент последовательности ГА 2

[0028] Элемент последовательности ГА 2 представляет собой элемент аминокислотной последовательности, соответствующий участку в области 324-340 аминокислотных остатков (положения пронумерованы в соответствии с системой нумерации на основе ГА Н3) многих ГА-белков, обнаруженных в природных изолятах вируса гриппа. Этот элемент последовательности имеет следующую базовую структуру:

В некоторых вариантах реализации Элемент последовательности ГА 2 имеет последовательность:

, причем:

длина X1 составляет приблизительно 4-14, или примерно 8-12, или примерно 12, 11, 10, 9 или 8 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации, эта последовательность составляет сайт расщепления в ГА0, что позволяет синтезировать ГА1 и ГА2.

[0029] В некоторых вариантах реализации и, в частности, в полипептидах ГА Н5, Элемент последовательности ГА 2 имеет следующую структру:

, причем:

длина X1A составляет приблизительно 3 аминокислотных остатка; в некоторых вариантах реализации X1A представляет собой G (L/I)F.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0030] Аффинность: В данной области, "аффинность" представляет собой меру прочности, с которой конкретный лиганд (например, полипептид ГА) связывается со своей молекулой-партнером (например, рецептор ГА). Аффинность может быть измерена разными способами. В некоторых вариантах реализации аффинность измеряют путем количественного анализа (например, с помощью анализа связывания с гликаном). В некоторых таких вариантах реализации концентрация связываемой молекулы-партнера может быть зафиксирована (например, концентрация рецепторов ГА, гликана и т.д.) для создания избытка лиганда (например, полипептида ГА), чтобы имитировать физиологические условия (например, связывание ГА вируса с гликанами на клеточной поверхности). В качестве альтернативы или дополнения, в некоторых вариантах реализации можно варьировать концентрацию молекулы-партнера (например, рецепторов ГА, гликана и т.д.) и/или концентрацию лиганда (например, полипептида ГА). В некоторых таких вариантах реализации аффинность (например, аффинность связывания) могут рассматривать в сравнении с контролем (например, с ГА дикого типа, опосредующего инфицирование человека) при сопоставимых условиях (например, одинаковые концентрации).

[0031] Сеть аминокислотных остатков: термин "сеть аминокислотных остатков" используют для обозначения набора аминокислотных остатков в полипептидной цепи, которые, несмотря на то, что они могут быть отделены друг от друга по ходу цепи, кластеризуются рядом друг с другом в пространстве, когда полипептидная цепь принимает свернутую конфигурацию. Сети аминокислотных остатков на поверхности в настоящем документе называют "сетями аминокислотных остатков поверхности", те же, что находятся внутри белка, в настоящем документе называют "сетями аминокислотных остатков ядра".

[0032] Антитело: В настоящем документе термин "антитело" относится к иммуноглобулину, специфически связывающемуся с конкретным антигеном. Термин охватывает иммуноглобулины естественного происхождения, то есть выработанные организмом в результате контакта с антигеном, а также те, что были искусственно синтезированы или сконструированы. В некоторых вариантах реализации термин охватывает любые полипептиды со структурными элементами иммуноглобулинов, достаточными для обеспечения специфического связывания. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Антитело может быть членом любого класса иммуноглобулинов, включая любой из классов иммуноглобулинов человека: IgG, IgM, IgA и IgD. Подходящие под определение антитела включают антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифичные антитела, гуманизированные антитела (включающие участки антител человека), конъюгированные антитела (т.е. антитела, конъюгированные или слитые с другими белками, радиоактивными метками, цитотоксинами), малые модульные иммунофармацевтические (Small Modular ImmunoPharmaceuticals ("SMIPsTM")) белки, одноцепочечные антитела, камелоидные антитела (антитела верблюдовых) или любые фрагменты антител. В настоящем документе термин "антитело" также включает в себя интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, однодоменные антитела (например, однодоменные антитела акулы (например, IgNAR или их фрагменты), мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность.

[0033] Фрагмент антитела: В настоящем документе термин "фрагмент антитела" подразумевает часть интактного антитела такую как, например, антиген-связывающий или вариабельный домен антитела. Примеры фрагментов антитела включают в себя фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; триатела; тетратела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Термин "фрагмент антитела" также включает в себя любые синтетические или сконструированные белки, действующие как антитела, связываясь со специфическим антигеном с образованием комплекса. Например, фрагменты антител, содержащие изолированные фрагменты, фрагменты "Fv", состоящие из вариабельных областей тяжелых и легких цепей, рекомбинантных одноцепочечных белковых молекул, в которых вариабельные области тяжелых и легких цепей соединены белковым линкером ("белки ScFv"), и минимальные распознаваемые единицы, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих гипервариабельную область.

[0034] Антиген: "Антиген" представляет собой молекулу или объект, с которым связывается антитело. В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой полипептид или его часть. В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой часть инфекционного агента, распознаваемую антителами.

[0035] Приблизительно: В настоящем документе термин "приблизительно" или "примерно", применяемый к одной или более рассматриваемым величинам, относится к величине, значение которой сходно со значением указанной величины. В некоторых вариантах реализации термин "приблизительно" или "примерно" относится к диапазону значений, которые входят в 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее с отклонением в любую сторону (больше или меньше) от указанной величины, если не указано иное, или если иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, когда такое значение превышает 100% от возможной величины).

[0036] Связанный с: Термин "связанный с" применяют в настоящем документе для описания наблюдаемой корреляции между двумя предметами или событиями. Например, полипептид могут считать "связанным с" конкретным инфекционным агентом, если его наличие или количество коррелирует с наличием или количеством инфекционного агента. Аналогичным образом, конкретный набор или паттерн признаков сети рецептор-связывающего сайта (СРСС, англ.: Receptor-Binding Site Network (RBSN)) могут считать "связанным с" неким определенным полипептидным структурным элементом (например, фолдом) или функциональным элементом, если наблюдается корреляция между этим набором или паттерном и присутствием этого структурного или функционального элемента.

[0037] Связывание: Следует понимать, что термин "связывание" в настоящем документе, как правило, относится к нековалентной связи между двумя или более объектами. "Непосредственное" связывание подразумевает физический контакт между объектами или фрагментами; непрямое связывание подразумевает физическое взаимодействие путем физического контакта с одним или более промежуточных объектов. Связывание между двумя или более объектами может быть определено в любой из возможных ситуаций, включая те, в которых взаимодействующие объекты или фрагменты рассматривают изолированно или в контексте более сложных систем (например, в случае, если они ковалентно или другим способом связанны с носителем и/или в биологической системе или клетке).

[0038] Биологически активный: В настоящем документе словосочетание "биологически активный" относится к характеристике любого агента, обладающего активностью в биологических системах, и в частности в организме. Например, агент, который, будучи введенным в организм, оказывает на этот организм биологическое действие, считают биологически активным. В определенных вариантах реализации, в которых белок или полипептид является биологически активным, часть этого белка или полипептида, участвующую в осуществлении по меньшей мере одной биологической активности этого белка или полипептида, как правило, называют "биологически активной" частью.

[0039] Характерная часть: В настоящем документе термин "характерная часть" используют, в широком смысле, для обозначения части вещества, наличие (или отсутствие) которой коррелирует с наличием (или отсутствием) определенного признака, свойства или активности этого вещества. В некоторых вариантах реализации характерная часть вещества представляет собой часть, присутствующую в том веществе и родственном ему веществах, которые обладают определенной общим признаком, свойством или активностью, но не в тех, которые этой конкретной общим признаком, свойством или активностью не обладают.

[0040] Характерный пандемический признак: В настоящем документе термин "характерный пандемический признак" представляет собой признак, обнаруженный по меньшей мере в одном референсном пандемическом штамме и отсутствующую по меньшей мере в одном непандемическом штамме. В некоторых вариантах реализации характерный пандемический признак демонстрирует распространение в пандемических штаммах по меньшей мере на 30% большее, чем в непандемических штаммах.

[0041] Характерный элемент последовательности: В настоящем документе словосочетание "характерный элемент последовательности" относится к элементу последовательности, обнаруженному в полимере (например, в полипептиде или нуклеиновой кислоте) и представляющему характерную часть этого полимера. В некоторых вариантах реализации наличие характерного элемента последовательности коррелирует с наличием или уровнем определенной активности или свойства этого полимера. В некоторых вариантах реализации наличие (или отсутствие) характерного элемента последовательности определяет конкретный полимер как принадлежащий (или не принадлежащий) к определенному семейству или группе таких полимеров. Характерный элемент последовательности обычно состоит по меньшей мере из двух мономеров (например, аминокислот или нуклеотидов). В некоторых вариантах реализации характерный элемент последовательности содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более мономеров (например, непрерывно связанных мономеров). В некоторых вариантах реализации характерный элемент последовательности содержит по меньшей мере первый и второй участки последовательно связанных мономеров, отделенных друг от друга одной или более спейсерными областями, длина которых может меняться или не меняться в зависимости от полимера, содержащего элемент последовательности.

[0042] Комбинированная терапия: Термин "комбинированная терапия" в настоящем документе относится к ситуациям, при которых объекту вводят два или более различных фармацевтических агента в пересекающихся по времени режимах так, чтобы он одновременно подвергался воздействию обоих агентов.

[0043] Сравнимые: Термин "сравнимые" в настоящем документе относится к двум или более агентам, объектам, ситуациям, наборам условий и т.д., которые могут быть не идентичны друг другу, но являются в достаточной степени схожими, чтобы было возможно сопоставление между ними, так что выводы обоснованно могут быть сделаны на основании их сходств и различий. Специалистам в данной области техники из контекста будет понятно, какая степень идентичности необходима в тех или иных обстоятельствах для двух и более таких агентов, объектов, ситуаций, наборов условий и т.д., чтобы считать их сравнимыми.

[0044] Соответствующий: В настоящем документе термин "соответствующий" зачастую используют для обозначения положения/идентичности аминокислотного остатка в рассматриваемом полипептиде (например, полипептиде ГА). Средним специалистам будет понятно, что в целях упрощения, аминокислотные остатки в полипептиде часто обозначают, используя каноническую систему нумерации на основе референсного родственного полипептида, так что аминокислота, "соответствующая" аминокислотному остатку в положении 190, например, совершенно необязательно должна фактически находится в положении 190 в конкретной аминокислотной цепи, а скорее соответствует аминокислотному остатку, находящемся в положении 190 в референсном полипептиде; для специалистов в данной области техники очевидно, как определить "соответствующие" аминокислоты. Как правило, аминокислотные остатки в полипептидах ГА определяют со ссылкой на каноничный ГА вируса гриппа дикого типа Н3 и ссылкой в рассматриваемом полипептиде, которая соответствует аминокислотным остаткам в каноничном ГА вируса гриппа дикого типа Н3, описанным с использованием нумерации аминокислотных остатков, которым они соответствуют.

[0045] Отстоящий на шаг: В настоящем документе аминокислоты, "отстоящие на шаг", представляют собой аминокислоты ГА, оказывающие непрямое воздействие на связывание с гликанами. Например, отстоящие-на-один-шаг аминокислоты могут либо (1) взаимодействовать с непосредственно-связанными аминокислотами; и/либо (2) иным образом влиять на способность непосредственно-связанных аминокислот взаимодействовать с гликанами, связанными с рецепторами ГА клеток хозяина. Отстоящие-на-два-шага аминокислоты либо (1) взаимодействуют с отстоящими-на-один-шаг аминокислотами; и/либо (2) иным образом влияют на способность отстоящих-на-один-шаг аминокислот взаимодействовать с непосредственно-связанными аминокислотами и т.д.

[0046] Непосредственно-связанные аминокислоты: В настоящем документе словосочетание "непосредственно-связанные аминокислоты" относится к аминокислотам ГА-полипептидов, которые напрямую взаимодействуют с одним или более гликанов, связанных с рецепторами ГА клеток хозяина.

[0047] Определять: Многие методологии, описанные в настоящем документе, включают в себя этап "определения". Средним специалистам в данной области техники при чтении настоящего описания будет понятно, что такое "определение" можно использовать или достичь его путем применения любой из множества методик, доступных специалистам в данной области техники, включая, например, конкретные методики, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации определение включает манипуляции с определенным физическим образцом. В некоторых вариантах реализации определение включает рассмотрение и/или манипуляции с данными или информацией, например, с использованием компьютера или иного устройства обработки данных для проведения соответствующего анализа. В некоторых вариантах реализации определение включает получение релевантной информации и/или материалов из источника. В некоторых вариантах реализации определение включает сравнение одной или нескольких признаков образца или объекта с подходящим контролем.

[0048] Лекарственная форма: Термин "лекарственная форма" в настоящем документе используют для обозначения материально дискретной единицы фармацевтической композиции для введения пациенту. "Единичная лекарственная форма" содержит количество активного агента (-ов), эквивалентное однократной дозе, хотя следует понимать, что предписания лечащего врача могут содержать назначение многодозовых лекарственных форм или частичных единичных лекарственных форм, для вводедения в виде однократной дозы.

[0049] Режим дозирования: "режим дозирования" (или "терапевтический режим"), как этот термин используют в настоящем документе, представляет собой набор единичных доз (обычно более одной), которые в индивидуальном порядке вводят субъекту, как правило, с промежутками во времени. В некоторых вариантах реализации данный терапевтический агент имеет рекомендованный режим дозирования, который может включать одну или более доз. В некоторых вариантах реализации режим дозирования включает множество доз, каждая из которых отделена от другой периодами времени одинаковой величины; в некоторых вариантах реализации режим дозирования включает множество доз и по меньшей мере два различных по величине периода времени, отделяющих их друг от друга, режим дозирования включает множество доз режим дозирования коррелирует с конкретным результатом, событием или возможностью таковых.

[0050] Сконструированный: Термин "сконструированный" в настоящем документе описывает полипептид, аминокислотная последовательность которого была отобрана человеком и/или получение которого требует действий со стороны человека. Например, сконструированный ГА-полипептид имеет аминокислотную последовательность, отличную от аминокислотной последовательности ГА природных изолятов вируса гриппа. В некоторых вариантах реализации сконструированный ГА-полипептид имеет аминокислотную последовательность, отличную от аминокислотной последовательности ГА, включенной в базу NCBI.

[0051] Экспрессия: Термин "экспрессия", используемый в отношении нуклеиновых кислот в настоящем документе, относится к одному или более следующих событий: (1) продукции РНК-транскрипта с ДНК-матрицы (например, путем транскрипции); (2) процессинга РНК-транскрипта (например, путем сплайсинга, редактирования, 5'-кэпирования и/или формирования 3'-конца); (3) транскрипция молекулы РНК с образованием полипептида; и/ил (4) посттрансляционная модификация полипептида.

[0052] Фолд: Термин "фолд" используют в настоящем документе в соответствии с пониманием его значения в данной области, относящегося к структурному элементу полипептида, который принимает или способен принимать трехмерную структуру. Например, фолд может представлять собой или содержать одну или более спиралей (например, α-спиралей) и/или одну или более складчатых слоев (например, β-слоев).

[0053] Фолдом: В настоящем документе термин "фолдом" относится к набору полипептидных фолдов, закодированных в геноме организма. Специалистам в данной области техники будет понятно, что в некоторых вариантах реализации фолдом включает в себя все закодированные фолды; в некоторых вариантах реализации фолдом включает в себя полипептидные фолды, представленные в экспрессированных полипептидах (например, во всех экспрессированных полипептидах или полипептидах, экспрессированных только при определенных условиях, таких как конкретные ткани в определенное время развития и т.д.).

[0054] Гликановая матрица: В настоящем документе термин "гликановая матрица" относится к набору гликанов, необязательно иммобилизованных на твердой подложке. В некоторых вариантах реализации гликановая матрица представляет собой совокупность (скопление) гликанов, представленную в виде организованной структуры или паттерна в двух или более местах локализации, физически разделенных в пространстве. Как правило, гликановая матрица будет иметь по меньшей мере 4, 8, 16, 24, 48, 96 или несколько сотен или тысяч дискретных мест локализации. В целом, согласно настоящему изобретению гликановые матрицы могут иметь любой из возможных форматов. В некоторых вариантах реализации гликановая матрица содержит совокупность гликанов, организованных на единственной твердой подложке; в некоторых вариантах реализации гликановая матрица содержит совокупность гликанов, организованных на множестве отдельных твердых подложек, таких, например, как подложки в виде частиц (см., например, заявку на патент США с серийным номером 13/087,332, включенную в настоящее описание посредством ссылки). В некоторых вариантах реализации гликановая матрица представляет собой микрочип, на котором места локализации образцов отделены друг от друга расстоянием, составляющим 50-200 микрон или менее, и/или иммобилизованные гликаны представлены в количествах от нано- до микромолярных или от нано- до пикомолярных количествах. Известные в данной области форматы матриц включают, например, матрицы, в которых каждое отдельное место локализации образцов имеет размер, например, десять микрон. Любая из возможных подложек может быть применена в гликановых матрицах. Например, материалы подложки, которые могут быть применены, включают гидрофобные мембраны, например, нитроцеллюлозу, нейлоновые или поливинилиденфторидные (ПВДФ) мембраны. Такие мембраны хорошо известны в данной области и могут быть получены у таких производителей, как, например, Bio-Rad (Hemel Hempstead, UK). В качестве альтернативы или дополнения подложка, на которой организованы гликаны, может содержать оксиды металлов. Соответствующие оксиды металлов могут быть представлены оксидом титана, оксидом тантала и оксидом алюминия, но не ограничены ими. Примеры этих материалов могут быть получены у таких производителей как, например Sigma-Aldrich Company Ltd (Fancy Road, Poole, Dorset. BH12 4QH UK). Более того, в некоторых вариантах реализации подложки представляют собой или содержат оксиды металлов, синтезированные золь-гель способом. Считается, что такие оксиды металлов обеспечивают большую площадь поверхности в пределах данной микроскопической области, что помогает в иммобилизации углеводсодержащих молекул. В качестве альтернативы или дополнения материалы подложки, которые могут быть применены согласно настоящему изобретению, включают в себя гели, например, силикагели или гель-золи оксида алюминия. Примеры этих материалов могут быть получены у таких производителей как, например, MerckKGaA (Darmstadt, Germany). В некоторых вариантах реализации гликановые матрицы иммобилизованы на подложках, которые могут выдерживать изменения размера или формы в ходе обычного использования. Например, подложка может представлять собой предметное стекло, покрытое компонентным материалом, подходящим для применения в гликановых матрицах. Кроме того, некоторые композитные материалы могут при желании обеспечивать прочность подложки. В некоторых вариантах реализации гликаны непосредственно прикреплены к подложке. В некоторых вариантах реализации гликаны прикреплены к подложке опосредованно, будучи, например, связанными с линкером или носителем (например, полипептидом), прикрепленным к подложке. В некоторых вариантах реализации гликаны ковалентно связаны с подложкой; в некоторых вариантах реализации гликаны нековалентно связаны с подложкой. В некоторых вариантах реализации гликаны обратимо связаны с подложкой (например, путем расщепляемого линкера и/или обратимого нековалентно го взаимодействия). В некоторых вариантах реализации идентичность и/или организация гликанов в гликановой матрице выбрана таким образом, что характеристики связывания рассматриваемого полипептида (например, ГА-полипептида) можно легко оценить. В некоторых вариантах реализации гликановые матрицы, которые могут быть применены согласно настоящему изобретению, содержат один или более гликанов с топологической формой конуса и/или один или более гликанов с топологической формой зонта. В некоторых вариантах реализации гликаны с топологической формой конуса и зонта пространственно отделены друг от друга. В некоторых вариантах реализации множество гликанов с топологической формой конуса или множество гликанов с топологической формой зонта могут быть пространственно локализованы вместе (но необязательно отдельно от гликанов другого типа). В некоторых вариантах реализации гликановые матрицы, которые могут быть применены согласно настоящему изобретению, содержат один или более гликанов со связями α2-3 и/или один или более гликанов со связями α2-6. В некоторых вариантах реализации гликаны со связями α2-3 и гликаны со связями α2-6 пространственно отделены друг от друга. В некоторых вариантах реализации множество гликанов со связями α-2-3 или множество гликанов со связями α-2-6 могут быть пространственно локализованы вместе (но необязательно отдельно от гликанов другого типа). В некоторых вариантах реализации такие матрицы содержат гликаны, составляющие примерно 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более гликанов (например, зонтичных гликанов, которые зачастую будут представлять собой сиалилированные α 2-6-гликаны, в частности длинные сиалилированные α 2-6-гликаны), обнаруженных на рецепторах ГА человека, в частности на рецепторах ГА верхних дыхательных путей. В некоторых вариантах реализации используемые гликановые матрицы содержат все или некоторые из структур гликанов топологической формы конуса и/или зонтика, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации матрицы содержат по меньшей мере примерно 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более этих гликанов.

[0055] Полипептид гемагглютинина (ГА): В настоящем документе термин "полипептид гемагглютинина" (или "ГА-полипептид", "полипептид ГА") относится к полипептиду, аминокислотная последовательность которого содержит по меньшей мере одну характерную последовательность ГА. В данной области техники известно широкое разнообразие аминокислотных последовательностей ГА из изолятов вируса гриппа; действительно, Национальный Центр Биотехнологической Информации (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) поддерживает базу данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/), которая на момент подачи настоящей заявки содержит по меньшей мере 9796 аминокислотных последовательностей ГА. Обратившись к этой базе данных, средние специалисты в данной области техники могут легко идентифицировать последовательности, являющиеся характерными для ГА-полипептидов в целом и/или конкретных полипептидов ГА (например, полипептидов H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, H15 или H16; или ГА, опосредующих инфицирование конкретного хозяина, например, птицы, верблюда, собаки, кошки, куницы, окружающей среды, лошади, человека, леопарда, норки, мыши, тюленя, каменной куницы, свиньи, тигра, кита и т.д.). Например, в некоторых вариантах реализации, ГА-полипептид содержит один или более характерных элементов последовательности, обнаруженных на участках аминокислотной последовательности от примерно 97 до примерно 185, от примерно 324 до примерно 340, от примерно 96 до примерно 100 и/или от примерно 130 до примерно 320 аминокислотных остатков ГА-полипептида, обнаруженного в природном изоляте вируса гриппа. В некоторых вариантах реализации ГА-полипептид имеет аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере один из элементов последовательности 1 или 2 ГА, описанных в настоящем документе.

[0056] Полипептид ГА Н5: В настоящем документе термин "полипептид ГА Н5" описывает полипептид ГА, аминокислотная последовательность которого содержит по меньшей мере один элемент последовательности, характерный для вируса гриппа Н5 и отличающий Н5 от других подтипов ГА. Представители этих элементов могут быть определены путем выравнивания, понятного специалистам в данной области техники.

[0057] Высокоаффинное связывание: Термин "высокоаффинное связывание" в настоящем документе описывает высокую степень прочности, с которой определенный лиганд (например, полипептид ГА) связывается с молекулой-партнером (например, рецептором ГА). Аффинность может быть измерена любым доступным способом, включая известные в данной области. В некоторых вариантах реализации связывание считают высокоаффинным, если значение Kd' составляет примерно 500 пМ или менее (например, менее примерно 400 пМ, примерно 300 пМ, примерно 200 пМ, примерно 100 пМ, примерно 90 пМ, примерно 80 пМ, примерно 70 пМ, примерно 60 пМ, примерно 50 пМ, примерно 40 пМ, примерно 30 пМ, примерно 20 пМ, примерно 10 пМ, примерно 5 пМ, примерно 4 пМ, примерно 3 пМ, примерно 2 пМ и т.д.) при анализе связывания. В некоторых вариантах реализации связывание считают высокоаффинным, если значение аффинности рассматриваемого полипептида выше (например, значение Kd' ниже), чем у выбранного референсного полипептида. В некоторых вариантах реализации связывание считают высокоаффинным, если отношение значения Kd' рассматриваемого полипептида к значению Kd' выбранного референсного полипептида составляет 1:1 или меньше (например, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1. 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 0.1:1, 0.05:1, 0.01:1или меньше). В некоторых вариантах реализации связывание считают высокоаффинным, если значение Kd' рассматриваемого полипептида составляет 100% или меньше (например, примерно 99%, примерно 98%, примерно 97%, примерно 96%, примерно 95%, примерно 90%, примерно 85%, примерно 80%, примерно 75%, примерно 70%, примерно 65%, примерно 60%, примерно 55%, примерно 50%, примерно 45%, примерно 40%, примерно 35%, примерно 30%, примерно 25%, примерно 20%, примерно 15%, примерно 10%, примерно 5%, примерно 4%, примерно 3%, примерно 2%, примерно 1% или меньше) от значения Kd' выбранного референсного полипептида.

[0058] Хозяин: Термин "хозяин" в настоящем документе относится к системе (например, клетке, организму и т.д.), в которой представлен рассматриваемый полипептид. В некоторых вариантах реализации хозяин представляет собой систему, восприимчивую к инфицированию конкретным инфекционным агентом. В некоторых вариантах реализации хозяин представляет собой систему, экспрессирующую рассматриваемый полипептид.

[0059] Сайт связывания IgE: "Сайт связывания IgE" представляет собой участок антигена, который распознают анти-антигенные молекулы IgE. Наличие таких участков является необходимым и/или достаточным условием, приводящим к (i) связыванию антигена с IgE; (ii) перекрестному связыванию анти-антигена IgE; (iii) дегрануляции тучных клеток, содержащих поверхностно связанный анти-антиген IgE; и/или (iv) развитию симптомов аллергии (например, высвобождению гистамина). В целом, сайты связывания IgE конкретных антигенов определяют путем введения этих антигенов или их фрагментов в сыворотку крови особей с аллергией (предпочтительно принадлежащих к тем видам, которым, согласно изобретению, будут вводить композицию). Следует понимать, что разные особи могут производить IgE, распознающие разные эпитопы одного и того же антигена. Таким образом, как правило, необходимо подвергнуть антиген воздействию репрезентативной смеси образцов сыворотки. Например, когда необходимо идентифицировать сайты данного антигена или его фрагмента, распознаваемые IgE человека, объединяют сыворотки предпочтительно по меньшей мере 5-10, предпочтительно по меньшей мере 15, субъектов, демонстрирующих аллергическую реакцию на антиген. Средние специалисты в данной области техники будут осведомлены о подходящей стратегии объединения сывороток в других контекстах.

[0060] Иммунодоминантный: Определенный эпитоп считают "иммунодоминантным", если он (i) отвечает за значительную долю связывания IgE, наблюдаемого с интактным антигеном, и/или (ii) распознается IgE у значительной доли восприимчивых субъектов. Иммунодоминантный эпитоп часто определяют в сравнении с другими исследуемми эпитопами. Например, все эпитопы IgE в данном антигене могут проанализированы одновременно (например, с помощью иммуноблота), а иммунодоминантные эпитопы могут быть идентифицированы по их устойчивости в сравнении с другими эпитопами. Обычно, но не всегда, иммунодоминантный эпитоп будут вносить вклад по меньше мере в 10% связывающей активности, наблюдаемой в подобном исследовании. В качестве альтернативы или дополнения, эпитоп может быть классифицирован как иммунодоминантный, если он распознается IgE в сыворотке значительной доли, предпочтительно большинства, более предпочтительно в сыворотке по меньшей мере примерно 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100%, восприимчивых субъектов.

[0061] Изолированный: Термин "изолированный" в настоящем документе относится к агенту или объекту, который либо (i) отделен от по меньшей мере некоторых компонентов, с которыми он был ассоциирован, когда был изначально образован (будь то в природных или экспериментальных условиях); либо (ii) получен человеком. Изолированные агенты или объекты могут быть отделены от по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или более других компонентов, с которыми он был изначально связан. В некоторых вариантах реализации чистота изолированных агентов составляет более 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

[0062] Длинный олигосахарид: Для целей настоящего описания олигосахарид обычно считают "длинным", если он содержит по меньшей мере одну цепь, содержащую по меньшей мере четыре остатка моносахаридов.

[0063] Низкоаффинная связь: Термин "низкоаффинная связь" в настоящем документе описывает низкую степень прочности, с которой конкретный лиганд (например, ГА-полипептид) связывается с молекулой-партнером (например, рецептором ГА). Как описано в настоящем документе, аффинность может быть измерена любым доступным способом, включая известные в данной области. В некоторых вариантах реализации связь считают низкоаффинной, если значение Kd' составляет 100 пМ или более (например, больше примерно200 пМ, 300 пМ, 400 пМ, 500 пМ, 600 пМ, 700 пМ, 800 пМ, 900 пМ, 1нМ, 1.1.нМ, 1.2 нМ, 1.3 нМ, 1.4 нМ, 1.5 нМ и т.д.). В некоторых вариантах реализации связь считают низокоаффинной, если значение аффинности рассматриваемого полипептида ниже (например, значение Kd' такое же или выше), чем выбранного референсного полипептида. В некоторых вариантах реализации связь считают низокоаффинной, если отношение значения Kd' рассматриваемого полипептида к значению Kd' выбранного референсного полипептида составляет 1:1 или более (например, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1. 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1,2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 или более). В некоторых вариантах реализации связь считают высокоаффинной, если значение Kd' рассматриваемого полипептида составляет 100% или более (например, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% или более) от значения Kd' выбранного референсного полипептида.

[0064] Неприродная аминокислота: Словосочетание "неприродная аминокислота" относится к объекту, обладающему химической структурой аминокислоты (например,: Error! Objects cannot be created from editing field codes..

и, следовательно, способному участвовать в образовании по меньшей мере двух пептидных связей, но входящий в его состав радикал отличается от таковых, существующих в природе. В некоторых вариантах реализации в состав неприродных аминокислот также может входить второй радикал вместо водорода и/или один или более заместителей амино- или карбоксильной группы.

[0065] Пандемический штамм: "Пандемический штамм" вируса гриппа представляет собой штамм, который должен или обладает способностью вызывать пандемическое инфицирование в человеческих популяциях. В некоторых вариантах реализации пандемический штамм приводил к пандемическому инфицированию. В некоторых вариантах реализации такое пандемическое инфицирование включает эпидемическое инфицирование на множестве территорий, и в частности на территориях, отделенных друг от друга (например, горами, водоемами, как части разных континентов и т.д.), таким образом, что инфицирование обычно не передается между ними.

[0066] Полипептид: В целом, "полипептид" представляет собой цепь по меньшей мере из двух аминокислот, соединенных друг с другом пептидной связью. В некоторых вариантах реализации полипептид может содержать по меньшей мере 3-5 аминокислот, каждая из которых связана с другими по меньшей мере одной пептидной связью. Средним специалистам в данной области техники будет понятно, что иногда в состав полипептидов входят "неприродные аминокислоты" или другие объекты, тем не менее способные к интеграции в полипептидную цепь, но это необязательно.

[0067] Преимущественно присутствующий: Термин "преимущественно присутствующий" в настоящем документе относится к наличию объекта (например, аминокислотного остатка) в определенной локации внутри популяции. Например, аминокислота может быть преимущественно присутствовать, если внутри популяции полипептидов конкретная аминокислота присутствует в определенном положении в по меньшей мере примерно 50%, примерно 55%, примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или более полипептидов в пределах релевантной популяции.

[0068] Предотвращение: Термин "предотвращение" в настоящем документе относится к приостановке возникновения и/или снижению частоты и/или тяжести одного или более симптомов конкретного заболевания, расстройства или состояния. В некоторых вариантах реализации предотвращение оценивают на популяционной основе таким образом, что агент считают способным к "предотвращению" конкретного заболевания, расстройство или состояние, если наблюдают статистически значимое снижение частоты и/или интенсивности одного или более симптомов заболевания, расстройства или состояния в популяции, восприимчивой к этому заболеванию, расстройству или состоянию.

[0069] Чистый: В настоящем документе агент или объект является "чистым", если он в существенной степени не содержит других компонентов. Например, препарат, содержащий больше примерно 90% конкретного агента или объекта, обычно считают чистым препаратом. В некоторых вариантах реализации агент или объект являются чистыми по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99%..

[0070] Рецептор-связывающий сайт (РСС): В настоящем документе термин "рецептор-связывающий сайт" или "РСС" включает в себя аминокислотные остатки, охватывающие положения с 56 по 73, 87-96, 127-160 и 183-230 (пронумерованные в соответствии с кристаллической структурой ГА Н5 PDB ID: 2IBX), которые содержат непосредственно-связанные аминокислоты.

[0071] Посевной потенциал: В настоящем документе термин "посевной потенциал" относится к вероятности для агента (например, инфекционного агента, такого как вирус, бактерия и т.д.) распространить инфекцию. В некоторых вариантах реализации посевной потенциал коррелирует со способностью агента (например, инфекционного агента, такого как вирус, бактерия и т.д.) давать начало вариантному потомству. Например, посевной штамм может иметь потомство, вариантное на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.

[0072] Короткий олигосахарид: Для целей настоящего описания олигосахариды обычно считают "короткими", если они содержат менее 4 или определенно менее 3 остатков в любой линейной цепи.

[0073] Сеть рецептор-связывающего сайта (СРСС): Термин "сеть рецептор-связывающего сайта" относится к сети аминокислотных остатков, представляющих собой часть рецептор-связывающего сайта, которые расположены в трехмерном пространстве таким образом, чтобы взаимодействовать одна с другой в условиях свернутой полипептидной цепи. Указанные аминокислотные остатки включают непосредственно связанные аминокислотные остатки, которые осуществляют контакт с гликановым рецептором в топологических формах "конуса" и "зонта".

[0074] Диаграмма сети рецептор-связывающего сайта (СРСС): В настоящем документе термин "диаграмма сети рецептор-связывающего сайта (СРСС)" относится к двухмерной открытой диаграмме сети соединений, которая отражает отношения взаимодействий между аминокислотами в РСС.

[0075] Оценка сети рецептор-связывающего сайта (СРСС): В настоящем документе термин "оценка сети рецептор-связывающего сайта" относится к оценке, присвоенной аминокислотному остатку в полипептиде на основании протяженности сети его взаимодействий с другими аминокислотными остатками в его непосредственном пространственном окружении (как, например, возможность радикала этого остатка взаимодействовать с радикалами других остатков в полипептиде) и/или природы таких взаимодействий, описанных в настоящем документе. Например, как описано в настоящем документе, оценка СРСС варьирует от 0 (отсутствие какой-либо сети) до 1 (максимальная сеть). Чем шире сеть аминокислоты внутри РСС, тем больше она подвержена мутациям.

[0076] Специфичность: Как известно в данной области техники, "специфичность" представляет собой меру способности конкретного лиганда (например, ГА-полипептида) отличать свою молекулу-партнера для связывания (например, рецептор ГА человека и, в частности, рецептор ГА верхних отделов дыхательных путей человека) от других потенциальных партнеров для связывания (например, от рецептора ГА птицы).

[0077] По существу подобные числа: В настоящем документе термин "по существу подобные числа" относится к двум величинам, например, двум оценкам СРСС, имеющих числовые значения, не отличающиеся больше, чем на 30%.

[0078] По существу гомологичные последовательности: Словосочетание "по существу гомологичные последовательности" в настоящем документе относится к сравнению между собой аминокислотных или нуклеотидных последовательностей. Как понятно средним специалистам в данной области техники, две последовательности, как правило, считают "по существу гомологичными ", если они содержат гомологичные остатки в соответствующих положениях. Гомологичные остатки могут являться идентичными остатками. В качестве альтернативы, гомологичные остатки могут быть неидентичными остатками со сходными структурными и/или функциональными характеристиками. Например, как известно средним специалистам в данной области техники, некоторые определенные аминокислоты классифицируют как "гидрофобные" или "гидрофильные" и/или как имеющие "полярные" или "неполярные" радикалы. Замену одной аминокислоты на другую такого же типа часто можно считать "гомологичной" заменой. Типичная категоризация аминокислот приведена ниже:

Как хорошо известно в данной области, последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот можно сравнивать, используя любой из существующих алгоритмов, включая те, что доступны в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, gapped BLAST и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Приведенные в качестве примера программы описаны в следующих источниках: Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol, 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; и Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999; все вышеперечисленные источники включены в настоящее описание посредством ссылки. Помимо выявления гомологичных последовательностей, упомянутые выше программы, как правило, дают представление и о степени гомологии. В некоторых вариантах реализации две последовательности считают по существу гомологичными, если по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более их соответствующих остатков на релевантном отрезке гомологичны. В некоторых вариантах реализации указанный отрезок представляет собой всю последовательность. В некоторых вариантах реализации указанный участок представляет собой по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75 по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 125, по меньшей мере 150, по меньшей мере 175, по меньшей мере 200, по меньшей мере 225, по меньшей мере 250, по меньшей мере 275, по меньшей мере 300, м 325, по меньшей мере 350, по меньшей мере 375, по меньшей мере 400, по меньшей мере 425, по меньшей мере 450, по меньшей мере 475, по меньшей мере 500 или более остатков.

[0079] По существу идентичные последовательности: Словосочетание "по существу идентичные последовательности" в настоящем документе относится к сравнению между собой аминокислотных или нуклеотидных последовательностей. Как будет понятно средним специалистам данной области техники, две последовательности, как правило, считают "по существу идентичными", если они содержат идентичные остатки в соответствующих положениях. Как хорошо известно в данной области, последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот можно сравнивать, используя любой из существующих алгоритмов, включая те, что доступны в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, gapped BLAST и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Приведенные в качестве примера программы описаны в следующих источниках: Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; и Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999; все вышеперечисленные источники включены в настоящее описание посредством ссылки. Помимо выявления идентичных последовательностей, вышеупомянутые программы, как правило, дают представление о степени идентичности. В некоторых вариантах реализации две последовательности считают по существу идентичными, если по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% их соответствующих остатков на релевантном отрезке идентичны. В некоторых вариантах реализации указанный отрезок представляет собой всю последовательность. В некоторых вариантах реализации указанный участок представляет собой по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, м 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 125, по меньшей мере 150, по меньшей мере 175, по меньшей мере 200, по меньшей мере 225, по меньшей мере 250, по меньшей мере 275, по меньшей мере 300 по меньшей мере 325, по меньшей мере 350, по меньшей мере 375, по меньшей мере 400, по меньшей мере 425, по меньшей мере 450, по меньшей мере 475, по меньшей мере 500 или более остатков.

[0080] По существу подобные структуры: В настоящем документе термин "по существу подобные структуры" относится к наличию общих структурных признаков, таких как наличие и/или идентичность конкретных аминокислот в определенных положениях (см. определения "общая гомология последовательностей" и "общая идентичность последовательностей"). В некоторых вариантах реализации термин "по существу подобные структуры" относятся к наличию и/или идентичности структурных элементов (например, петель, складок, спиралей, доноров водородной связи, акцепторов водородной связи, паттернов гликозилирования, солевых мостиков и дисульфидных связей). В некоторых вариантах реализации термин "по существу подобные структуры" относится к трехмерной организации и/или ориентации атомов или их групп относительно друг друга (например, расстоянию и/или углам между ними или внутри них в рассматриваемом агенте и референсном агенте).

[0081] Терапевтический агент: В настоящем документе словосочетание "по существу подобные структуры" терапевтический агент" относится к любому агенту, оказывающему требуемый биологический или фармакологический эффект

[0082] Лечение: В настоящем документе термин "лечение" относится к любому способу, применяемому для облегчения, задержки появления, снижения тяжести или числа случаев или результативной профилактики одного или более симптомов или аспектов болезни, расстройства или состояния. Лечение могут проводить до, во время и/или после начала развития симптомов.

[0083] Топологическая форма зонта: Словосочетание "топологическая форма зонта" в настоящем документе относится к пространственной организации, свойственной некоторым определенным гликанам и, в частности, гликанам на рецепторах ГА. Их противопоставляют гликанам, имеющим "топологическую форму конуса", как показано на ФИГ. 8А и 9. Как описано в заявках РСТ №№ PCT/US 09/30056 и PCT/US 07/18160, связывание с гликанами топологической формы зонта представляет собой свойство ГА-белков, опосредующих инфицирование хозяев-людей. Топологическую форму зонта, как правило, принимают только сиалилированные α2-6-гликаны, и она, как правило, типична для длинных (например, длиннее тетрасахаридов) олигосахаридов. В некоторых вариантах реализации гликаны топологической формы зонта представляют собой гликаны, демонстрирующие трехмерную пространственную структуру, по существу подобную структуре, представленной на ФИГ. 8В. В некоторых вариантах реализации гликаны топологической формы зонта представляют собой гликаны, которые контактируют с ГА-полипептидами через аминокислотные остатки, изображенные на ФИГ. 8В. В некоторых вариантах реализации гликаны топологической формы зонта представляют собой гликаны, способные контактировать и/или специфично связываться со связывающим аминокислоты карманом, изображенном на ФИГ. 8В. В некоторых вариантах реализации структурную топологию гликанов классифицируют на основании параметра 0, который определен как угол между С2 в Sia, С1 в Gal и С1 в GlcNAc. Значения θ<100° определяют конусоподобную топологическую форму, которую принимают α2-3- и короткие α2-6-гликаны. Значения θ>110° определяют зонтоподобную топологическую форму, такую как принимаемая α2-6-гликанами. В качестве примера топологической формы зонта приводят угол φ связи Neu5Acα2-6Gal, составляющий около -60. В некоторых вариантах реализации гликаны топологической формы зонта (например, на некотором участке) составляют большую часть длинных (например, множества лактозаминовых единиц) α2-6 - олигосахаридных ветвей, нежели коротких (например, из единичного лактозамина) α2-6-ветвей. Типичные структуры N- и О-связанных гликанов, способных принимать топологическую форму зонта, изображены на ФИГ. 10 и ФИГ. 11. В некоторых вариантах реализации гликаны топологической формы зонта (например, на некотором участке) содержат примерно в 2 раза, примерно в 3 раза, примерно в 4 раза, примерно в 5 раз, примерно в 10 раз, примерно в 20 раз, примерно в 50 раз и более чем в 50 раз более длинные α2-6-олигосахаридные ветви, чем короткие (например, из единичного лактозамина) α2-6-ветви. В некоторых вариантах реализации уникальной особенностью взаимодействий ГА с гликанами топологической формы зонта и/или гликановыми ловушками представляет собой контакт ГА с гликаном, содержащим сиаловую кислоту (СК) и/или аналоги СК в невосстанавливающем конце гликана. В некоторых вариантах реализации цепь олигосахарида по дине представляет собой по меньшей мере трисахарид (за исключением СК и ее аналога).

[0084] В некоторых вариантах гликаны топологической формы зонта представляют собой олигосахариды следующей формы:

Neu5Acα2-6Sug1-Sug2-Sug3

где:

(a) Neu5Ac α2-6 представлен, как правило (но необязательно) на невосстанавливающем конце;

(b) Sug1:

(i) представляет собой гексозу (зачастую, Gal или Glc) или гекзозамин (GlcNAc или GalNAc) в α- или β-конфигурации (зачастую, в β-конфигурации для N- и О-связанных участков и α-конфигурации в случае GalNAcα-, О-связанного с гликопротеином);

(ii) никакие другие сахара, кроме Neu5Acα2-6, не связаны ни с одним из невосстанавливающих положений (кроме случаев, когда Sug1 представляет собой GalNAcα-, О-связанный с гликопротеином); и/или

(iii) несахарные фрагменты, такие как сульфат, фосфат, гуанидин, амин, N-ацетил и т.д., могут быть присоединены по невосстанавливающим положениям (как правило, 6 положению) Sug1 (например, для улучшения контакта с ГА);

(c) Sug2 и/или Sug3 представляет (-ют) собой:

(i) гексозу (как правило, Gal или Glc) или гексозамин (GlcNAc или GalNAc) in α- или β-конфигурации (чаще всего в β-конфигурации); и/или

(ii) сахарные (такие как Fuc) или несахарные фрагменты, такие как сульфат, фосфат, гуанидин, амин, N-ацетил и т.д. могут быть присоединены к невосстанавливающим позициям Sug2, Sug3, и/или Sug4;

(d) Связь между двумя любыми сахарами в олигосахариде, кроме Neu5Acα2-6-связи, может быть 1-2, 1-3, 1-4, и/или 1-6 (как правило, 1-3 или 1-4); и/или

(e) Структура, где Neu5Acα2-6 связан с GalNAcα, О-связанным с гликопротеином, и дополнительные сахара связаны с невосстанавливающим концом GalNAcα, например,

(i) Neu5 Acα2-6(Neu5Acα2-3Galβ1-3)GalNAcα-

(ii) Neu5Acα2-6(Galβ1-3)GalNAcα-.

[0085] Исключительно в качестве примера, в некоторых вариантах реализации олигосахариды топологической формы зонта представляют собой олигосахариды следующего вида: Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβl-4GlcNAc-, Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcβ1-4GlcNAc-, Neu5Acα2-6GlcNAcβ1-3Galβ1-3/4GlcNAc-, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα, Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα, Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα, Neu5Acα2-6GalNAcα-β1-3Galα2-3Neu5Ac, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAcα, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAcα, Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAcα, Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAcα, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-6GalNAcα-β1-3Galα2-3Neu5Ac, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAcα-β1-3/6GlcNAcβ1-4Galα2-3/6Neu5Ac, Neu5Acα2-6GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAc, Neu5Acα2-6GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3/6GalNAc, Neu5Acα2-6GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAc, Neu5Acα2-6Galβ1-3GalNAcβ1-4Galα1-3Galβ1-4Glc, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Neu5Acα2-6Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc, Neu5Acα2-6Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Neu5α2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcα, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα, Neu5Acα2-6GalNAc(β1-3Gal-)β1-4Galβ1-4Glc, Neu5Acα2-6GalNAc(β1-3Gal-)β1-3Galal-4Galβ1-4Glc и их комбинаций.

[0086] Единичная доза: Выражение "единичная доза" в настоящем документе относится к физически дискретной единице фармацевтической композиции, приготовленной в виде состава для введения субъекту. Во многих вариантах реализации единичная доза содержит изначально заданное количество активного агента. В некоторых вариантах реализации единичная доза содержит полную разовую дозу агента. В некоторых вариантах реализации вводят больше одной единичной дозы для достижения полной разовой дозы. В некоторых вариантах реализации требуется, или предполагается, что потребуется, введение множественных доз для достижения предполагаемого эффекта. Единичная доза может быть, например, неким объемом жидкости (например, приемлемого носителя), содержащим изначально заданное количество одного или более терапевтических агентов, изначально заданным количеством одного или более терапевтических агентов в твердой форме, лекарственной формой с замедленным высвобождением или устройством доставки лекарственных средств, содержащим изначально заданное количество одного или более терапевтических агентов, и т.д. Следует понимать, что единичная доза может содержать различные компоненты в дополнение к терапевтическому агенту (агентам). Например, приемлемые носители (например, фармацевтически приемлемые носители), растворители, стабилизаторы, буферы, консерванты и т.д. могут быть включены в состав, как описано ниже. Следует понимать, тем не менее, что общую суточную дозу согласно настоящему изобретению будет определять лечащий врач в рамках здравого медицинского суждения. В некоторых вариантах реализации конкретное значение эффективной дозы для любого конкретного субъекта или организма может зависеть от множества факторов, включая расстройство, которое лечат, и его тяжесть; активность конкретных используемых активных соединений; используемые активные соединения; возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол и диету субъекта; время введения и скорость экскреции конкретного используемого соединения; длительность лечения; лекарственные средства и/или дополнительную терапию, применяемые в комбинации или совместно с конкретным используемым (-ми) соединением (-ми), и другие подобные факторы, хорошо известные в медицине.

[0087] Вакцинация: В настоящем документе термин "вакцинация" относится к введению композиции, предназначенной для генерации иммунного ответа, например, на болезнетворный агент. Вакцинация может быть проведена до, вовремя и/или после воздействия болезнетворного агента и/или развития одного или более симптомов и в некоторых вариантах реализации до, вовремя и/или сразу после воздействия агента. В некоторых вариантах реализации вакцинация включает должным образом распределенное по времени множественное введение композиций вакцин.

[0088] Вариант: В настоящем документе термин "вариант" относится к объекту, демонстрирующему по существу идентичную структуру с референсным объектом, но структурно отличается от референсного объекта наличием или количеством одного или более химических фрагментов в сравнении с референсным объектом. Во многих вариантах реализации вариант также отличается от референсного объекта функционально. В целом, стоит ли считать конкретный объект "вариантом" референсного объекта, зависит от степени его структурной идентичности с референсным объектом. Как будет понятно специалистам в данной области техники, любой биологический или химический референсный объект имеет определенные характерные структурные элементы. Вариант, по определению, представляет собой отдельный химический объект, которое обладает одним или более из этих характерных структурных элементов. В качестве нескольких примеров, небольшая молекула может иметь характерные структурные элементы ядра (например, макроциклическое ядро) и/или один или более характерных боковых фрагментов, так что вариант небольшой молекулы представляет собой молекулу, имеющую такие же структурные элементы ядра и характерные боковые фрагменты, но отличающуюся строением других боковых фрагментов и/или типами связей (например, двойная вместо одинарной, Е-изомер вместо Z-изомера и т.д.) внутри ядра, полипептид может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества аминокислот, имеющих определенные положения друг относительно друга в линейном или трехмерном пространстве и/или способствующих определенной биологической функции, нуклеиновая кислота может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества нуклеотидных остатков, имеющих определенные положения друг относительно друга в линейном или трехмерном пространстве. Например, вариант полипептида может отличаться от референсного полипептида в результате одного или более различий в аминокислотной последовательности и/или одного или более различий в химических фрагментах (например, углеводах, липидах и т.д.), ковалентно связанных с полипептидной основой. В некоторых вариантах реализации вариант полипептида демонстрирует идентичность с полной последовательностью референсного полипептида, составляющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 99%. В качестве альтернативы или дополнения в некоторых вариантах реализации вариант полипептида не имеет по меньшей мере одного характерного элемента последовательности в сравнении с референсным полипептидом. В некоторых вариантах реализации референсный полипептид обладает одной или более биологическими активностями. В некоторых вариантах реализации вариант полипептида имеет одну или более общих биологических активностей с референсным полипептидом. В некоторых вариантах реализации у варианта полипептида отсутствует одна или более биологических активностей в сравнении с референсным полипептидом. В некоторых вариантах реализации вариант полипептида демонстрирует пониженный уровень одной или более биологических активностей в сравнении с референсным полипептидом. Во многих вариантах реализации рассматриваемый полипептид считают "вариантом" исходного или референсного полипептида, если рассматриваемый полипептид имеет аминокислотную последовательность, идентичную исходной, но с небольшим количеством изменений последовательности в определенных положениях. Как правило, менее 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% остатков в варианте замещены в сравнении с исходным полипептидом. В некоторых вариантах реализации в варианте замещены 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 остаток в сравнении с исходным полипептидом. Часто вариант содержит очень небольшое количество (например, менее 5, 4, 3, 2 или 1) замещенных функциональных остатков (то есть остатки, участвующие в обеспечении определенной биологической активности). Кроме того, вариант обычно содержит более 5, 4, 3, 2 или 1 добавлений или делеций в сравнении с исходным полипептидом. При этом размер любых добавлений или делеций, как правило, меньше чем примерно 25, примерно 20, примерно 19, примерно 18, примерно 17, примерно 16, примерно 15, примерно 14, примерно 13, примерно 10, примерно 9, примерно 8, примерно 7, примерно 6 остатков, и обычно меньше чем примерно 5, примерно 4, примерно 3 или примерно 2 остатка. В некоторых вариантах реализации исходный или референсный полипептид представляет собой найденный в природе. Как будет понятно средним специалистам в данной области техники, множество вариантов конкретного рассматриваемого полипептида обычно может быть обнаружено в природе, в частности, если рассматриваемый полипептид представляет собой полипептид инфекционного агента.

[0089] Очень устойчивый к эволюции кластер (ОУЭК): В настоящем документе термины "очень устойчивый к эволюции кластер и "ОУЭК" относятся к кластеру аминокислотных остатков, демонстрирующему высокие значения оценки СРСС и/или низкую толерантность к мутациям. То есть в некоторых вариантах реализации ОУЭК представляет собой такой кластер, мутации в котором, как правило, приводят к нарушению структуры полипептидной цепи и/или ее функции. В некоторых вариантах реализации остатки кластера ОУЭК не имеют положительных значений оценки в матрице замен BLOSUM62.

Побробное описание некоторых вариантов реализации

[0090] Согласно настоящему изобретению предложены, среди прочего, способы и композиции, относящиеся к детектированию, лечению и/или предотвращению передачи инфекции гриппа и/или инфицирования гриппом.

Инфекция гриппа

[0091] Вирус гриппа имеет длинную историю пандемий, эпидемий, возобновлений и вспышек инфекции. Птичий грипп, включая штамм H5N1, представляет собой высококонтагиозный и потенциально смертельный патоген, но обладает ограниченной способностью инфицировать человека.

[0092] Вирусы гриппа представляют собой РНК-вирусы, для которых характерна липидная мембрана, содержащая два гликопротеина, гемагглютинин (ГА) и нейраминидазу (НА), встроенные в мембрану вирусной частицы. Вирусный геном состоит из нескольких одиночных смысловых минус-цепей молекул РНК. Некоторые белки закодированы в вирусном геноме. Нейраминидаза (НА) представляет собой поверхностный гликопротеин вируса, который расщепляет концевые остатки сиаловой кислоты углеводных фрагментов на поверхности инфицированных клеток, способствуя высвобождению вирусного потомства. Гемагглютинин (ГА) представляет собой один из основных поверхностных гликопротеинов вируса и участвует в связывании вируса с сиаловыми кислотами на поверхности восприимчивых клеток (Uiprasertkul et al. Emerg. Infect. Dis. 11:1036, 2005).

[0093] ГА вируса гриппа представляет собой тример на поверхности вирусных частиц. ГА вируса гриппа синтезируется в клетках вирусом после заражения как ГА0, который клеточные протеазы расщепляют по основным сайтам расщепления на зрелые формы ГА1 и ГА2, которые требуются для нормального функционирования этого поверхностного белка и для жизненного цикла вируса. Белок М2 представляет собой белок ионных каналов. ГА, НА и белок М2 представлены в вирусной оболочке, полученной из плазматической мембраны клетки-хозяина. Рибонуклеиновый комплекс состоит из сегмента РНК, связанного с нуклеопротеином (НП) и тремя полимеразами, PA, РВ1 и РВ2. Белок M1 связан как с рибонуклеопротеином, так и с оболочкой.

[0094] Ежегодные эпидемии гриппа возникают, когда антигенные свойства вирусных ГА- и НА-белков изменяются. Механизм изменения антигенности двояк: он включает антигенный сдвиг, вызванный генетической рекомбинацией между вирусами человека и животных после двойного инфицирования клетки-хозяина, способный вызвать пандемию, и антигенетический дрейф, вызванный небольшими изменениями в ГА- и НА-белках на поверхности вирусов, способный вызвать эпидемию гриппа.

[0095] Существует 16 известных подтипов ГА и 9 подтипов НА, и названия разных штаммов вируса гриппа основаны на номере подтипов ГА (гемагглютинина) и НА (нейраминидазы) указанного штамма. На основании сравнения идентичности аминокислотных последовательностей и кристаллических структур подтипы ГА были разделены на две основные группы и четыре меньшие по размеру клады. Разные подтипы ГА не обязательно обладают твердой идентичностью аминокислотных последовательностей, но, в целом, трехмерные структуры разных подтипов ГА сходны друг с другом, но обладают несколькими тонкими отличиями, которые могут быть применены в целях классификации. Например, определенная ориентация дистальных субдоменов по отношению к центральной α-спирали представляет собой одну из структурных характеристик, часто используемую для определения подтипа ГА (Russell et al, 2004 Virology, 325:287, 2004; данный источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Специалисты в данной области техники хорошо знакомы с последовательностями и другими структурными сходствами и отличиями, которые можно применить для того, чтобы определить и/или различить разные подтипы и/или клады вируса гриппа.

[0096] Только три (H1, Н2 и Н3) подтипа ГА из шестнадцати стали приспособлены до такой степени, что способны инфицировать человека. Одна из описанных характеристик ГА, приспособленных для инфицирования человека (например, ГА пандемических подтипов вируса гриппа H1N1 (1918) и H3N2 (1967-68)) представляет собой их способность преимущественно связываться с сиалилированными α2-6-гликанами в сравнении с их предшественниками у птиц, которые преимущественно связываются с сиалилированными α2-3-гликанами (Skehel & Wiley, 2000 Annu Rev Biochem, 69:531; Rogers, & Paulson, 1983 Virology, 127:361; Rogers et al, 1983 Nature, 304:76; Sauter et al, 1992 Biochemistry, 31:9609; Connor et al, 1994 Virology, 205:17; Tumpey et al, 2005 Science, 310:77; все указанные источники включены в настоящее описание посредством ссылки).

[0097] Некоторые кристаллические структуры ГА подтипов H1 (вирус человека и свиньи), Н2 (вирус человека и птицы), Н3 (вирус птицы), Н5 (вирус птицы), связанных с сиалилированными олигосахаридами, доступны и обеспечивают молекулярное понимание сути специфичных аминокислот, участвующих в различных взаимодействиях ГА с указанными гликанами (Eisen et al, 1997 Virology, 232:19; Ha et al., 2001 Proc Natl Acad Sci USA, 98:11181; Ha et al., 2003 Virology, 309:209; Gamblin et al., 2004 Science, 303:1838; Stevens et al., 2004 Science, 303:1866; Russell et al., 2006 Glycoconj J 23:85; Stevens et al, 2006 Science, 312:404; Xu R et al., 2010 J Virol 84(4):1715; Liu J, et al., 2009 Proc Natl Acad Sci USA 106(40): 17175, все указанные источники включены в настоящее описание посредством ссылки).

[0098] Инфицирование вирусом гриппа опосредовано взаимодействием ГА с поверхностью клеток посредством связывания с гликопротеиновым рецептором. Связывание ГА с рецепторами ГА преимущественно опосредовано N-связанными гликанами на рецепторах ГА. В частности, ГА на поверхности вирусных частиц гриппа распознает сиалилированные гликаны, связанные с рецепторами ГА на поверхности клетки-хозяина. После распознавания и связывания клетка-хозяин поглощает вирусную частицу, и вирус становится способен к репликации и продукции множества новых вирусных частиц, которые распространяются по соседним клеткам. Некоторые кристаллические структуры типичных комплексов ГА-гликан были идентифицированы и представлены в таблице 1:

[0099] Рецепторы ГА модифицированы либо сиалилированными α2-3-, либо α2-6-гликанами возле ГА-связывающего сайта рецептора, тип связи рецептор-связанного гликана может влиять на конформацию ГА-связывающего сайта, таким образом оказывая влияние на специфичность рецептора к различным ГА.

[00100] Например, гликан-связывающий карман ГА птицы узок. Согласно настоящему изобретению указанный карман связывается с транс-конформацией сиалилированных α2-3-гликанов и/или с гликанами топологической формы конуса, будь то α2-3- или α2-6-гликаны.

[00101] Рецепторы ГА в тканях птиц, а также в глубоких тканях легких и желудочно-кишечного (ЖК) тракта, характеризуются α2-3-связями сиалилированных гликанов, и, кроме того (согласно настоящему изобретению), они характеризуются гликанами, включающими сиалилированные α2-3- и/или α2-6-гликаны, которые преимущественно принимают топологическую форму конуса. Рецепторы ГА с такими гликанами топологической формы конуса могут быть упомянуты в настоящем документе как РГАТК.

[00102] Рецепторы ГА человека в бронхах и трахее (верхние дыхательные пути), напротив, модифицированы гликанами, которые преимущественно принимают топологическую форму зонта, например, включая многие сиалилированные α2-6-гликаны. В отличие от мотива α2-3, мотив α2-6 имеет дополнительную конформационную степень свободы, благодаря С6-С5-связи (Russell et al., Glycoconj J 23:85, 2006). ГА, связывающиеся с такими сиалилированными α2-6-гликанами, имеют более раскрытый карман связывания для приспособления к многообразию структур, возникающих благодаря этой конформационной свободе. Кроме того, как описано в международных патентных заявках № PCT/US 09/30056 и № PCT/US 07/18160, для ГА может быть необходимым связывание с гликанами (например, с сиалилированными α2-6-гликанами) топологической формы зонта и, в частности, может быть необходимым связывание с такими гликанами топологической формы зонта с высокой аффинностью и/или специфичностью, для того чтобы эффективно опосредовать инфицирование тканей верхних дыхательных путей. Рецепторы ГА с такими гликанами топологической формы зонта могут быть упомянуты в настоящем документе как РГАТЗ.

[00103] В результате такого пространственного ограничения профилей гликозилирования люди обычно не подвержены инфицированию вирусам, содержащими много ГА птиц дикого типа (например, Н5 ГА птиц). В частности, благодаря тому, что в тех отделах дыхательных путей, которые чаще всего контактируют с вирусом (то есть в трахее и бронхах), не хватает рецепторов с гликанами топологической формы конуса (например, сиалилированными α2-3-гликанами и/или короткими гликанами), и ГА птиц дикого типа обычно связывается преимущественно или исключительно с рецепторами, связанными с гликанами топологической формы конуса (например, сиалилированными α2-3-гликанами и/или короткими гликанами), вирусы птиц редко инфицируют человека.

Полипептиды ГА

[00104] В настоящем изобретении дано определение и описаны некоторые ГА-полипептиды, включая, в частности, полипептиды ГА Н5, демонстрирующие идентичность с полной последовательностью рефернсного ГА и также включающие определенные структурные признаки, описанные в настоящем документе. Согласно настоящему изобретению также предложены фрагменты таких полипептидов ГА, включая характеристические фрагменты (например, фрагменты, аминокислотные последовательности которых включают по меньшей мере один характеристический элемент последовательности). В некоторых вариантах реализации предложенные полипептиды ГА в существенной степени опосредуют связывание с рецептором человека и/или инфицирование человека и/или передачу инфекции (например, по оценке с помощью наиболее стандартных или описанных тест-систем).

[00105] В некоторых вариантах реализации предложенные полипептиды ГА связываются с гликанами топологической формы зонта (например, с длинными сиалилированными α2-6-гликанами, такими как, например, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-) с высокой аффинностью. Например, в некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды связываются с гликанами топологической формы зонта с аффинностью, сравнимой с наблюдаемой для ГА дикого типа, опосредующего инфицирование человека (например, H1N1 НА или H3N2 НА). В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды связываются с гликанами топологической формы зонта с аффинностью, которая составляет по меньшей мере 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% от наблюдаемой в сопоставимых условиях для ГА дикого типа, опосредующего инфицирование человека. В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды связываются с гликанами топологической формы зонта с аффинностью большей, чем наблюдаемая в сопоставимых условиях для ГА дикого типа, опосредующего инфицирование человека.

[00106] В некоторых вариантах реализации аффинность связывания предложенных ГА-полипептидов оценивают в диапазоне концентраций. Такая стратегия обеспечивает получение значительно большего количества информации, в частности при анализе мультиспецифического связывания, чем при анализе с одной концентрацией. В некоторых вариантах реализации, например, аффинность связывания предложенных ГА-полипептидов оценивают при концентрациях в диапазоне по меньшей мере 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8, 9-, 10-кратных концентраций или более.

[00107] В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды демонстрируют высокую аффинность, если они демонстрируют сигнал насыщения при анализе мультиспецифического связывания с гликановой матрицей, такой как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды демонстрируют высокую аффинность, если они демонстрируют сигнал выше примерно 400000 или более (например, выше примерно 500000, 600000, 700000, 800000 и т.д.) в подобных исследованиях. В некоторых вариантах реализации связывающие агенты, описанные в настоящем документе, демонстрируют насыщение связывания с гликанами топологической формы зонта в пределах 2-кратных, 3-кратных, 4-кратных, 5-кратных или более концентраций, а в некоторых вариантах реализации даже в пределах таких высоких концентраций как 10-кратные и более.

[00108] Кроме того, в некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды связываются с гликанами топологической формы зонта (и/или имитаторами гликанов топологической формы зонта) в большей степени, чем с гликанами топологической формы конуса. В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды демонстрируют отношение аффинности связывания с конусными гликанами к аффинности связывания с зонтичными гликанами, составляющее примерно 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2.

[00109] В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды связываются с сиалилированными α2-6-гликанами, в некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды преимущественно связываются с сиалилированными α2-6-гликанами. В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды связываются с множеством различных сиалилированных α2-6-гликанов. В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды не способны связываться с сиалилированными α2-3-гликанами, а в других вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды способны связываться с сиалилированными α2-3-гликанами.

[00110] В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды связываются с рецепторами, обнаруженными в эпителиальных клетках верхних дыхательных путей человека. В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды связываются с рецепторами ГА в бронхах и/или трахее. В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды не способны связываться с рецепторами глубоко в легких, а в некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды способны связываться с рецепторами глубоко в легких.

[00111] В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды связываются по меньшей мере с примерно 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более гликанов, обнаруженных в тканях верхних дыхательных путей человека (например, в эпителиальных клетках).

[00112] В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды характеризуются тем, что с рецептор-связывающим сайтом, используемым пандемическим штаммом вируса гриппа, а в некоторых вариантах реализации конкурирует с этим пандемическим штаммом (или его рецептор-связывающей частью) за связывание с таким сайтом. В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды характеризуются по существу подобными величинами их оценки СРСС и оценки СРСС ГА-полипептида, обнаруженного в пандемическом штамме вируса гриппа.

[00113] В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды проявляют рассматриваемую активность (например, связывание с гликанами топологической формы зонта, посредничество в инфицировании и/или передаче инфекции гриппа человеку и т.д.), например, связывание с гликанами топологической формой зонта, измеренное методом анализа с помощью гликановой матрицы, описанной в настоящем документе, где значение Kd' находится в диапазоне от субпикомолярных до 10 наномолярных, и его уровень относительно связывания с гликанами топологической формы конуса более чем на 2 прядка выше; в некоторых вариантах реализации такой относительный уровень считают в сравнении с другой активности того же самого ГА-полипептида (например, связывание с гликанами топологической формы зонта, посредничество в инфицировании и/или передаче инфекции гриппа человеку и т.д.). В некоторых вариантах реализации такой относительный уровень считают относительно той же активности у другого ГА-полипептида (например, у референсного ГА).

[00114] В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды представляют собой варианты исходного или референсного ГА. В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды имеют аминокислотные последовательности, отличающиеся от исходного или референсного ГА наличием в противовес отсутствию одного или более признаков, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды имеют аминокислотные последовательности, отличающиеся от исходного или референсного ГА наличием в противовес отсутствию единственного признака, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды имеют аминокислотные последовательности, отличающиеся от исходного или референсного ГА наличием в противовес отсутствию 1, 2, 3 или 4 более признаков, описанных в настоящем документе.

[00115] В некоторых вариантах реализации референсный ГА, с которым предложенные ГА-полипептиды демонстрируют определенную степень идентичности последовательности, представляет собой ГА-полипептид, в существенной степени не опосредующий связывание с рецепторами человека и/или инфицирование человека и/или передачу инфекции гриппа; в некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды отличаются от референсного ГА-полипептида, не инфицируещего человека, как наличием в противовес отсутствию одного или более структурного признака, описанного в настоящем документе, так и способностью в существенной степени опосредовать инфицирование человека и/или передачу инфекции гриппа. В некоторых вариантах реализации референсный ГА, с которым предложенные ГА-полипептиды демонстрируют определенную степень идентичности последовательности, в существенной степени не опосредует связывание с рецептором человека и/или инфицирование человека и/или передачу инфекции гриппа; в некоторых таких вариантах реализации предложенные ГА имеют как один или более структурных признаков, описанных в настоящем документе, так и одну или более биологических активностей (например, способность в существенной степени опосредовать связывание с рецепторами человека и/или инфицирование человека и/или передачу инфекции гриппа), общие с инфицирующим-человека референсным ГА.

[00116] Репрезентативные ГА-полипептиды, в существенной степени не опосредующие связывание с рецептором человека и/или инфицирование человека и/или передачу инфекции гриппа (т.е. неинфицирующие человека ГА) включают ГА Н5, например, A/duck/Hunan/795/2002 (клада 2.1), A/Viet Nam/1194/2004 (клада 1), A/Indonesia/5/2005 (клада 2.1.3.2), A/bar-headed goose/Qinghai/1А/2005 (клада 2.2), A/Anhui/1/2005 (клада 2.3.4), A/goose/Guiyang/337/2006 (клада 4), A/Cambodia/R0405050/2007 (клада 1.1), A/common magpie/Hong Kong/5052/2007 (клада 2.3.2.1), A/chicken/Viet Nam/NCVD-016/2008 (клада 7.1), A/Egypt/N03072/2010 (клада 2.2.1), A/Hubei/1/2010 (клада 2.3.2.1)

[00117] Репрезентативные ГА-полипептиды, в существенной степени опосредующие связывание с рецептором человека и/или инфицирование человека и/или передачу инфекции гриппа (т.е. инфицирующие человека ГА) включают, например, штаммы H3N2, которые включают, но не ограничены ими, A/Port Chalmers/1/1973 (H3N2), A/Scotland/840/74 (H3N2), A/Victoria/3/75(H3N2), A/Texas/1/77(H3N2), A/Bangkok/01/1979(H3N2), A/Philippines/2/82(H3N2), A/Christchurch/4/1985(H3N2), A/Mississippi/1/85(H3N2), A/Leningrad/360/1986(H3N2), A/Shanghai/11/87(H3N2), A/Sichuan/02/87(H3N2), A/Beijing/353/89(H3N2), A/Guizhou/54/89(H3N2), A/Beijing/32/92(H3N2), A/Shangdong/9/93(H3N2), A/Johannesburg/33/94(H3N2), A/Wuhan/359/95(H3N2), A/Sydney/5/97(H3N2), А/Moscow/10/99(H3N2), A/Fujian/411/2002(H3N2), A/California/7/2004(H3N2), A/Wellington/1/2004(H3N2), A/Brisbane/10/2007(H3N2), А/Perth/16/2009(H3N2) и A/Victoria/361/2011(H3N2), штаммы H1N1, которые включают, но не ограничены ими, A/Chile/1/83(H1N1), A/Singapore/6/1986(H1N1), A/Bayern/7/95(H1N1), A/Beijing/262/95(H1N1), A/New Caledonia/20/1999(H1N1), A/Solomon Islands/3/2006(H1N1), A/Brisbane/59/2007(H1N1) и A/California/07/2009(H1N1), штаммы H2N2, которые включают, но не ограничены ими, А/Panama/1/66(H2N2) и A/Korea/426/1968(H2N2) и, в некоторых случаях, штаммы H9N2, которые включают, но не ограничены ими, A/guinea fowl/Hong Kong/WF10/99(H9N2), A/wild duck/Nanchang/2-0480/2000(H9N2), A/turkey/Israel/689/2008(H9N2), A/chicken/Zhejiang/HE1/2009(H9N2) и A/chicken/Egypt/115617V/2011(H9N2).

[00118] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложена новая концепция для определения аминокислотных мутаций в гемагглютинине (ГА) циркулирующих штаммов вируса птичьего гриппа, которые могут привести к количественному переключению предпочтительного связывания на гликановые рецепторы человека. В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложена новая концепция для анализа молекулярных признаков гликанового рецептор-связывающего сайта (РСС) ГА вируса гриппа-кандидата относительно его ближайшего филогенетически родственного ГА пандемического вируса гриппа, адаптированного к организму человека. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение демонстрирует, что ГА циркулирующего в настоящее время вируса гриппа-кандидата эволюционировали таким образом, что молекулярные признаки их РСС напоминают таковые ГА пандемического вируса гриппа и требуют меньше аминокислотных замен для переключения специфичности рецептора. Применение указанных предложенных рамок определяет варианты ГА-полипептидов, имеющих признаки последовательности и активности, описанные в настоящем документе.

[00119] В частности, настоящее изобретение описывает четыре структурных признака, которые при их наличии в полипептиде ГА Н5, описанном в настоящем документе, приводят к существенному уровню одной или более активностей, выбранных из группы, состоящей из связывания с рецептором человека, инфицированием человека и/или передачи инфекции гриппа человеку. В некоторых вариантах реализации активность считают существенной, если ее наблюдаемый уровень выше установленного порога. В некоторых вариантах реализации активность считают существенной, если ее наблюдаемый уровень относительно выше уровня референсной активности - такой, как та же активность, характерная для сопоставимого референсного ГА-полипептида, например, нехватка одного или более конкретных элементов или признаков последовательности, или как другая активность того же ГА-полипептида (например, связывание с дугой мишенью).

[00120] Как описано в настоящем документе, в настоящем изобретении определено по меньшей мере четыре структурных признака, которые способствуют соответствующим активностям полипептидов ГА Н5. В частности, согласно настоящему изобретению предложенные ГА-полипептиды обычно демонстрируют уровень идентичности с полной последовательностью референсного ГА-полипептида (например, референсного ГА Н5), составляющий по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, но их последовательность не на 100% идентична референсному ГА в том, что предложенный ГА имеет аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере один из:

1) первого признака, представляющего собой делецию аминокислоты, соответствующей аминокислоте 130 референсного ГА Н5;

2) второго признака, представляющего собой или содержащего

i. Хаа226 + ser228,

ii. Lys224 + Хаа226,

iii. Хаа137 + Хаа226 + ser228,

iv. Xaa1 + gly227 + ser228,

v. Xaa137 + pro221 + Хаа226 + ser228, and

vi. Хаа137 + thr155 + pro221 + Xaa226 + gly227 + ser228;

где Хаа226 выбрана из группы Leu, Ile, Val, Met и Ala, и Xaa137 выбрана из группы Arg, Lys, Gln, Glu, His и Asn;

3) третьего признака, представляющего собой или содержащего

i. glu188 + Xaa192 + Хаа193,

ii. asp187 + Xaa193, and

iii. Хаа193; and

где Xaa192 выбрана из группы Arg, Thr, Ala, Val, Leu и Ile, и Хаа193 выбрана из группы Thr, Ala, Lys, Arg и His; и

4) дополнительного признака, представляющего собой или содержащего

i. ala160,

ii. asn158 + ala160, и

iii. asn158 + thr160,

где указанные положения аминокислот во втором, третьем и четвертом признаках соответствуют положениям, указанным для референсного ГА Н5.

Нуклеиновые кислоты и системы экспрессии

[00121] Согласно настоящему изобретению также предложены нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептиды, описанные в настоящем документе, включая, например, ГА-полипептиды, антитела и т.д. и/или их фрагменты. Согласно настоящему изобретению также предложены нуклеиновые кислоты, которые комплементарны и/или гибридизуются с указанными кодирующими нуклеиновыми кислотами.

[00122] В некоторых вариантах реализации предложенные нуклеиновые кислоты являются одноцепочечными, в некоторых вариантах реализации они являются двуцепочечными.

[00123] В некоторых вариантах реализации предложенные нуклеиновые кислоты имеют последовательности и длины, как будет понятно специалистам в данной области техники, подходящие для их применения в качестве праймеров, зондов, аптамеров, миРНК, антисмысловых последовательностей и т.д. В качестве нескольких примеров, такие нуклеиновые кислоты могут быть применены в качестве праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР), как зонды для гибридизации (включая гибридизацию in situ) и/или как праймеры для ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

[00124] В некоторых вариантах реализации нуклеиновые кислоты могут представлять собой или содержать ДНК и/или РНК. В некоторых вариантах реализации предлагаемые в изобретении нуклеиновые кислоты могут содержать один или несколько неприродных нуклеотидов; в других вариантах реализации предлагаемые в изобретении аминокислоты содержат только природные нуклеотиды.

[00125] Согласно настоящему изобретению также предложены системы экспрессии, включая системы in vitro, клеточные системы и организмы, продуцирующие предложенные полипептиды и/или их фрагменты

Детектирующие агенты

[00126] Согласно настоящему изобретению предложены агенты, которые детектируют (например, через непосредственное или непрямое связывание) предложенные ГА-полипептиды.

[00127] В некоторых вариантах реализации предложенные детектирующие агенты связываются, непосредственно или опосредованно, с одним или более предложенных ГА-полипептидов. В некоторых вариантах реализации предложенные детектирующие агенты специфично связываются с одним или более предложенных ГА-полипептидов. В некоторых вариантах реализации предложенные детектирующие агенты отличают предложенные ГА-полипептид от референсного ГА-полипептида, с которым предложенный ГА-полипептид демонстрирует определенную степень идентичности полной последовательности, описанной в настоящем документе, и/или имеет аминокислотную последовательность, отличающуюся от предложенного ГА-полипептида по одному или более признакам, описанным в настоящем документе.

[00128] В некоторых конкретных вариантах реализации предложенные детектирующие агенты представляют собой антитела или антителоподобные объекты, которые связываются с предложенными ГА-полипептидами. В некоторых конкретных вариантах реализации такие антитела или антителоподобные объекты специфически связываются с предложенными ГА-полипептидами. В некоторых конкретных вариантах реализации такие антитела или антителоподобные объекты являются селективными по отношению к предложенным ГА-полипептидам и их родственным референсным ГА. В некоторых конкретных вариантах реализации такие антитела или антителоподобные объекты являются селективными по отношению к предложенным ГА-полипептидам и другими идентичным ГА, отличающимся только наличием или отсутствием одного или более признаков, изложенных в настоящем документе.

Антитела

[00129] В некоторых вариантах реализации антитела или антителоподобные объекты, связывающиеся с предложенными ГА-полипептидами, связываются таким образом, что препятствуют связыванию между этими ГА-полипептидами и рецептором ГА, так что уровень наблюдаемого связывания снижен в присутствии антител или антителоподобных объектов в сравнении с их отсутствием. В некоторых вариантах реализации антитела или антителоподобные объекты, связывающиеся с предложенными ГА-полипептидами, связываются таким образом, что в существенной степени не препятствуют связыванию между этими ГА-полипептидами и рецептором ГА.

[00130] Пригодные антитела, которые связываются с предложенными ГА-полипептидами и могут быть применены согласно настоящему изобретению, включают антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифичные антитела, гуманизированные антитела (включающие участки антител человека), конъюгированные антитела (т.е. антитела, конъюгированные или слитые с другими белками, радиоактивными метками, цитотоксинами), малые модульные иммунофармацевтические (Small Modular ImmunoPharmaceuticals ("SMIPs™")) белки, одноцепочечные антитела, камелоидные антитела (антитела верблюдовых) или любые фрагменты антител. В настоящем документе термин "антитело" также включает в себя интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, однодоменные антитела (например, однодоменные антитела акулы (например, IgNAR или их фрагменты), мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность. Полипептиды антител для применения в настоящем изобретении могут быть любого типа (например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM).

[00131] В настоящем документе "фрагменты антител" содержат часть интактного антитела такую как, например, антиген-связывающий или вариабельный домен антитела. Примеры фрагментов антитела включают в себя фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; триатела; тетратела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Термин "фрагменты антител" также включает в себя любые синтетические или сконструированные белки, действующие как антитела, связываясь со специфическим антигеном с образованием комплекса. Например, фрагменты антител, содержащие изолированные фрагменты, фрагменты "Fv", состоящие из вариабельных областей тяжелых и легких цепей, рекомбинантных одноцепочечных белковых молекул, в которых вариабельные области тяжелых и легких цепей соединены белковым линкером ("белки ScFv"), и минимальные распознаваемые единицы, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих гипервариабельную область.

[00132] Антитела могут быть созданы с применением способов, хорошо известных в данной области техники. Например, протоколов производства антител, описанных Харлоу и Лэйном (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (1988)). Как правило, антитела могут быть получены в мыши, крысе, морской свинке, хомяке, верблюде, ламе, акуле или другом подходящем хозяине. В качестве альтернативы антитела могут быть получены в курице при производстве молекул IgY (Schade et al., (1996) ALTEX 13(5):80-85). В некоторых вариантах реализации пригодные для настоящего изобретения антитела представляют собой антитела человекообразных приматов. Например, общие рекомендации по производству антител для терапевтического применения в бабуинах могут быть найдены, например, в международной патентной публикации авторства Голденберга с коллегами (Goldenberg et al.) № WO 91/11465 (1991), и в публикации Лосмана с коллегами (Losman et al., Int. J. Cancer 46: 310 (1990)). В некоторых вариантах реализации моноклональные антитела могут быть приготовлены с использованием гибридомного способа (Milstein and Cuello, (1983) Nature 305(5934):537-40.). В некоторых вариантах реализации моноклональные антитела также могут быть созданы рекомбинантными способами (Патент США №4,166,452, 1979).

[00133] В некоторых вариантах реализации антитела, пригодные для настоящего изобретения, могут включать человеческие или гуманизированные антитела. Гуманизированные формы нечеловеческих антител представляют собой химерные Ig, цепи Ig или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие субпоследовательности антител), содержащие минимальные последовательности, полученные из нечеловеческих Ig. Как правило, гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков, внедренных из источника, отличного от человека. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто называют "импортными" остатками, которые, как правило, бывают взяты из "импортного" вариабельного домена. Гуманизацию осуществляют путем замены участков, определяющих комплементарность (УОК, complementarity determining regions (CDRs)) грызунов или последовательностей УОК для соответствующих последовательностей антител человека (Riechmann et al., Nature 332(6162):323-7, 1988; Verhoeyen et al., Science. 239(4847): 1534-6, 1988.). Такие "гуманизированные" антитела представляют собой химерные антитела (Патент США №4,816,567, 1989), в которых по существу меньшая последовательность, чем интактный человеческий вариабельный домен, была заменена соответствующей последовательностью из организма видов, отличных от человека. В некоторых вариантах реализации гуманизированные антитела представляют собой типичные антитела человека, в которых некоторые остатки УОК, а также, вероятно, и некоторые остатки каркасных участков (КУ, framework regions (FR)), заменены соответствующими остатками из аналогичных сайтов антител грызунов. Гуманизированные антитела включают человеческие Ig (реципиентные антитела), в которых остатки из УОК реципиента заменены остатками из УОК видов, отличных от человека (донорские антитела), таких как мышь, крыса или кролик, имеющих требуемую специфичность, афинность и емкость. В некоторых случаях соответствующие нечеловеческие остатки заменяют остатки участков Fv человеческих Ig. Гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не были обнаружены ни в указанном реципиентном антителе, ни в импортируемых остатках УОК или каркасных остатках. В целом, гуманизированные антитела содержат по существу все из по меньшей мере одного, а обычно из двух, вариабельных доменов, в которых большая часть, если не все, областей указанных УОК соответствуют таковым из консенсусной последовательности нечеловеческого Ig, и многие, если не все КУ представляют собой участки консенсусной последовательности человеческого Ig. Оптимально гуманизированные антитела также содержат по меньшей мере часть константной области (Fc) Ig, как правило, человеческого (Riechmann et al., Nature 332(6162):323-7, 1988; Verhoeyen et al., Science. 239(4847): 1534-6, 1988.).

[00134] Человеческие антитела также могут быть получены с применением различных способов, включая библиотеки фаговых дисплеев (Hoogenboom et al., Mol Immunol. (1991) 28(9):1027-37; Marks et al., J Mol Biol. (1991) 222(3):581-97) и получение моноклональных антител человека (Reisfeld and Sell, 1985, Cancer Surv. 4(1):271-90). Аналогично, введение генов Ig человека трансгенным животным, у которых эндогенный Ig был частично или полностью инактивирован, может быть применено для синтеза человеческих антител. При стимуляции наблюдается продукция антител, которая имеет близкое сходство во всех отношениях с наблюдаемой у человека, включая рекомбинацию генов, сборку и репертуар антител (Fishwild et al., High-avidity human IgG kappa monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice, Nat Biotechnol. 1996 July; 14(7):845-51; Lonberg et al., Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 1994 April 28; 368(6474):856-9; Lonberg and Huszar, Human antibodies from transgenic mice, Int. Rev. Immunol. 1995; 13(1):65-93; Marks et al, By-passing immunization: building high affinity human antibodies by chain shuffling. Biotechnology (NY). 1992 July; 10(7):779-83).

Аптамеры

[00135] В некоторых вариантах реализации предложенные детектирующие агенты представляют собой аптамеры. Аптамеры представляют собой макромолекулы, состоящие из нуклеиновой кислоты (например, ДНК, РНК), которая плотно связана с конкретной молекулярной мишенью (например, с гликаном топологической формы зонта). Конкретный аптамер может быть описан линейной нуклеотидной последовательностью и, как правило, его длина составляет 15-60 нуклеотидов. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что цепь нуклеотидов в аптамере создает внутримолекулярные взаимодействия, которые сворачивают указанную молекулу в сложную трехмерную структуру, и эта трехмерная структура позволяет аптамеру плотно связываться с поверхностью его молекулы-мишени. Учитывая чрезвычайное разнообразие молекулярных форм всех возможных нуклеотидных последовательностей, существующих во вселенной, аптамеры могут быть получены для широкого круга молекулярных мишеней, включая белки и малые молекулы. В дополнение к высокой специфичности аптамеры обладают очень высокой аффинностью к своим мишеням (например, аффинности в диапазоне значение от пикомолярных до низких наномолярных для белков). Аптамеры являются химически стабильными и их можно прокипятить или заморозить без потери активности. Поскольку они представляют собой синтетические молекулы, аптамеры могут быть подвергнуты множеству модификаций, которые могут оптимизировать их функцию для конкретных целей. Например, аптамеры могут быть модифицированы таким образом, чтобы резко снизить их чувствительность к деградации ферментами в крови для применения в условиях in vivo. Кроме того, аптамеры могут быть модифицированы таким образом, чтобы изменить их биодоступность или время нахождения в плазме.

[00136] Идентификация и/или характеристика аптамеров, которые связываются (непосредственно или опосредованно и/или специфично) с предложенными ГА-полипептидами, может быть достигнута любым из множества вариантов подходов, как будет понятно средним специалистам в данной области техники.

[00137] Например, аптамеры могут быть отобраны с применением методики SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) method (Tuerk et al., Science 249:505, 1990). Как правило, методология SELEX включает обеспечение большой (например, 1015 различных молекул) библиотеки молекул нуклеиновых кислот, приведенных в контакт с объектом-мишенью (например, с предложенным ГА-полипептидом или его фрагментом). Объект приводят в контакт с представителями библиотеки в течение промежутка времени и в условиях, достаточных для обеспечения возникновения взаимодействия (например, специфичного взаимодействия).

[00138] Для физической изоляции аптамеров, которые взаимодействуют с объектом-мишенью, и/или их амплификации, может быть использована любая из множества методик, известных в данной области техники. В некоторых вариантах реализации для таких изолированных аптамеров, которые могут представлять новую библиотеку, богатую представителями, связывающимися с рассматриваемым объектом, может быть проведен повторный скрининг для дальнейшей идентификации связывающихся аптамеров, например, демонстрирующих определенный уровень аффинности и/или специфичности.

[00139] Как правило, после 5-15 циклов повторяющихся селекции, разделения и процесса амплификации библиотека сводится к небольшому числу аптамеров, которые плотно связываются с молекулой-мишенью. Отдельные молекулы аптамера можно изолировать, определить их нуклеотидные последовательности и измерить и/или сравнить их свойства в отношении аффинности и/или специфичности связывания.

[00140] Изолированные аптамеры могут быть усовершенствованы, например, для удаления нуклеотидов, которые не вносят вклад в связывание с мишенью и/или структуру аптамера, таким образом производимые аптамеры обрезают до их основного связывающего домена. Например, см. Jayasena, Clin. Chem. 45:1628, 1999 для обзора технологии аптамеров; все положения указанной публикации включены в настоящее описание посредством ссылки.

Конкурирующие агенты

[00141] Согласно настоящему изобретению предложены системы для идентификации и/или характеристики агентов, конкурирующих с предложенными ГА-полипептидами за связывание с рецепторами ГА и, в частности, с рецепторами ГА человека. Такие агенты могут быть полезны, например, при лечении или предотвращении инфекции, опосредованной ГА-полипептидом, имеющим один или более признаков, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации детектирующие агенты, описанные выше (включая, например, антитела и/или аптамеры) также представляют собой конкурирующие агенты. В некоторых вариантах реализации конкурирующие агенты не представляют собой детектирующие агенты и/или не связываются непосредственно и/или опосредованно с предложенными ГА-полипептидами.

Композиции

[00142] Согласно настоящему изобретению предложены композиции, которые в качестве активного агента включают предложенные ГА-полипептиды и их фрагменты, кодирующие их нуклеиновые кислоты, продуцирующие их системы экспрессии, детектирующие их детектирующие агенты и/или конкурирующие с ними за взаимодействие с одним или более рецепторов ГА конкурирующие агенты.

Композиции для диагностики и наблюдения

[00143] Согласно настоящему изобретению предложены разнообразные композиции, подходящие для детектирования, идентификации и/или характеристики вирусов и/или инфекций гриппа. В конкретных вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложены содержащие детектирующие агенты композиции, которые могут быть приведены в контакт с клиническими, патологическими образцами или пробами из окружающей среды в целях выявления, например, наличия или уровня содержания конкретного штамма вируса гриппа, степени прогрессирования инфицирования вирусом гриппа и т.д.

[0001] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложены композиции и/или наборы, которые специфично детектируют ГА-полипептиды, описанные в настоящем документе с определенными характеристиками связывания с гликанами и/или инфекционности. Такие композиции или наборы могут включать детектирующие агенты, например, такие как антитела, специфично распознающие некоторые определенные ГА-полипептиды (например, те, что связываются с гликанами топологической формы зонта и/или сиалилированными α2-6-гликанами и/или длинными сиалилированными α2-6-гликанами), которые могут быть применены для специфического детектирования таких ГА-полипептидов, например, с помощью методики ELISA, иммунофлуоресценции и/или иммуноблоттинга.

[0002] Антитела, которые связываются с ГА-полипептидами также могут быть применены в реакциях нейтрализации вирусов, в которых образцы обрабатывают антителом, специфичным к рассматриваемым полипептидам ГА, и тестах на способность вирусов инфицировать культивируемые клетки относительно необработанных образцов. Если вирус в образце содержит указанные ГА-полипептиды, антитело нейтрализует вирус и предотвратит инфицирование этим вирусом культивируемых клеток. В качестве альтернативы или дополнения указанные антитела также могут быть применены в тестах ингибирования ГА, в которых белок ГА изолируют из данного образца, обрабатывают антителом, специфичным к конкретному полипептиду ГА или ряду ГА-полипептидов и тестируют его на способность к агглютинации эритроцитов относительно интактного образца. Если вирус в образце содержит указанный ГА-полипептид, антитело нейтрализует активность ГА-полипептида и предотвратит агглютинацию эритроцитов (Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL Press, 1988; www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_CDS_CSR_NCS_2002_5/en/index.html; www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index.html). В других вариантах реализации указанные агенты могут включать нуклеиновые кислоты, специфически связывающиеся с нуклеотидами, кодирующими конкретные ГА-полипептиды, что может быть применено для специфического детектирования таких ГА-полипептидов с помощью ОТ-ПЦР или гибридизации in situ (www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_CDS_CSR_NCS_2002_5/en/index.html; www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index.html). В некоторых вариантах реализации нуклеиновые кислоты, изолированные из образца перед детектированием амплифицируют. В некоторых вариантах реализации диагностические агенты могут быть детектируемо помечены.

[0003] Согласно настоящему изобретению также предложены наборы, содержащие реагенты в соответствии с изобретением для производства вирусов гриппа и вакцин. Состав таких наборов включает, но не ограничен ими, экспрессионные плазмиды, содержащие ГА, кодирующие рассматриваемые ГА-полипептиды (нуклеотиды (или фрагменты, такие как характерные фрагменты)). В качестве альтернативы или дополнения наборы могут содержать экспрессионные плазмиды, экспрессирующие рассматриваемый ГА-полипептид (или его характерные или биологически активные части). Экспрессионные плазмиды, не содержащие вирусные гены, также могут быть включены для того, чтобы пользователи могли включить нуклеотиды ГА любого исследуемого вируса гриппа. Клетки млекопитающих также могут быть включены в набор, включая клеточные линии Vero и MDCK, но не ограничиваясь ими. В некоторых вариантах реализации диагностические агенты могут быть детектируемо помечены.

[0004] В некоторых вариантах реализации наборы для применения согласно настоящему изобретению могут включать референсный образец, инструкцию по работе с образцами, проведению теста, инструкцию по интерпретации результатов, буферы и/или другие реагенты, необходимые для проведения теста. В некоторых вариантах реализации наборы могут включать панель антител.

[0005] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения гликановые матрицы, обсуждаемые выше, могут быть применены в качестве диагностических средств и/или наборов.

[0006] В некоторых вариантах реализации предлагаемые в изобретении гликановые матрицы и/или наборы применяют для проведения исследований типа доза-ответ для оценки связывания ГА-полипептидов с гликанами топологической формы зонта в многократных дозах (например, как описано в настоящем документе). Такие исследования позволяют получить ценную информацию о характеристиках связывания тестируемых ГА-полипептидов, и являются особенно ценными при оценке специфичного связывания. Исследования дозозависимого связывания позволили обнаружить много ценных применений. Так, например, они могут быть полезны при отслеживании эволюции характеристик связывания в рядах родственных вариантов ГА-полипептидов, для выяснения, возникают ли указанные ряды в ходе естественной эволюции, преднамеренного конструирования или комбинации этих двух вариантов.

[0007] В некоторых вариантах реализации предлагаемые в изобретении гликановые матрицы и/или наборы применяют для индукции, идентификации и/или селекции связывающих агентов (например, ГА-полипептидов и/или вариантов ГА-полипептидов), обладающих желательные характеристики связывания. Например, в некоторых вариантах реализации предлагаемые в изобретении гликановые матрицы и/или наборы используют для оказания эволюционного (например, скрининг и/или селекция) давления на популяцию связывающихся с полипептидами агентов (например, ГА-полипептиды).

[0008] В некоторых вариантах реализации предложенные наборы содержат инструкцию по применению.

Терапевтические композиции

[00144] Согласно настоящему изобретению предложены разнообразные композиции, которые содержат или иным образом доставляют ГА-полипептиды или их фрагменты, детектирующие агенты и т.д., описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации предложенные композиции являются подходящими для лечения инфекции гриппа до или после начала инфекции и/или развития одного или более симптомов инфекции.

[00145] Изобретение включает лечение инфекции гриппа путем введения указанных предложенных в настоящем изобретении терапевтических композиций. В некоторых вариантах реализации предложенные в настоящем изобретении терапевтические композиции вводят субъекту, страдающему от или восприимчивому к инфекции гриппа. В некоторых вариантах реализации субъект считают страдающим от инфекции гриппа, если субъект демонстрирует один или более симптомов обычно ассоциированных с инфекцией гриппа. В некоторых вариантах реализации о субъекте известно или предполагается, что он был подвергнут воздействию вируса гриппа. В некоторых вариантах реализации субъект считают восприимчивым к инфекции гриппа, если о субъекте известно или предполагается, что он был подвергнут воздействию вируса гриппа. В некоторых вариантах реализации о субъекте известно или предполагается, что он был подвергнут воздействию вируса гриппа, если субъект был в контакте с другими индивидуумами, о которых известно или подозревается, что они были инфицированы вирусом гриппа, и/или если субъект находится или находился в локации, в которой инфекция гриппа известна как или считается превалирующей..

[00146] В некоторых вариантах реализации субъектов, страдающих от или восприимчивых к инфекции гриппа, тестируют на наличие антител к предлагаемым в изобретении связывающим агентам до, во время и после введения предлагаемых в изобретении терапевтических композиций. В некоторых вариантах реализации субъектам, имеющим такие антитела, не вводят терапевтические композиции, содержащие предлагаемые в изобретении связывающие агенты. В некоторых вариантах реализации подходящую дозу фармацевтической композиции и/или связывающего агента выбирают на основании детектирования (или его отсутствия) указанных антител.

[00147] В некоторых вариантах реализации выбор конкретного субъекта для лечения, конкретного связывающего агента или композиции и/или конкретной дозы или режима введения зафиксирован, например, в письменной, печатной или электронной форме хранения.

[00148] Предлагаемые в изобретении терапевтические композиции могут быть введены до или после развития одного или более симптомов инфекции гриппа.

[00149] В целом, терапевтические композиции будут содержать терапевтический агент в дополнение к одному или более неактивных агентов, таких как стерильный биосовместимый носитель, включая стерильную воду, раствор солей, забуференный раствор солей или раствор декстрозы, но не ограничиваясь ими. В качестве альтернативы или дополнения композиция может содержать любую из разнообразных добавок, таких как стабилизаторы, буферы, вспомогательные вещества (например, сахара, аминокислоты и т.д.) или консерванты.

[00150] Приведенные в качестве примера неактивные агенты включают, например, стерильный биосовместимый носитель включая стерильную воду, раствор солей, забуференный раствор солей или раствор декстрозы, но не ограничиваясь ими. В качестве альтернативы или дополнения может быть применен любой из множества растворителей, дисперсионных сред, разбавителей или других жидких носителей, дисперсионных или суспензионных вспомогательных веществ, разрыхлителей, поверхностно-активных агентов, изотонических агентов, загущающих или эмульгирующих агентов, консервантов, буферных агентов, твердых связующих веществ, гранулирующих агентов, смазок, красящих агентов, подсластителей, ароматизаторов, вспомогательных веществ и тому подобных, подходящих для конкретного состава или желательной лекарственной формы. В источнике Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21е Издание, A.R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; данный источник включен в настоящее описание посредством ссылки) раскрыты различные вспомогательные вещества, используемые в разработке терапевтических композиций, и известные способы их получения. За исключением тех случаев, когда любое обычное вспомогательное вещество до такой степени несовместимо с веществом или его производными, что способствует появлению какого-либо нежелательного биологического эффекта или иного вредоносного взаимодействия с любым другим компонентом фармацевтической композиции, его применение предполагается в рамках настоящего изобретения.

[00151] В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция будет содержать терапевтический агент, который инкапсулирован, захвачен или связан внутри липидных пузырьков, биодоступной и/или биосовместимой и/или биоразлагаемой матрицы или других микрочастиц.

[00152] В некоторых вариантах реализации предложенные композиции дополнительно содержат один или более адъювантов. Любой адъювант может быть применен согласно настоящему изобретению. Известно большое число адъювантов, полезная подборка из многих из них составлена Национальными Институтами Здоровья (National Institutes of Health) и может быть найдена в интернете (www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf). См. также Allison (1998, Dev. Biol. Stand., 92:3-11; данный источник включен в настоящее описание посредством ссылки), Unkeless et al. (1998, Annu. Rev. Immunol., 6:251-281; данный источник включен в настоящее описание посредством ссылки), и Phillips et al. (1992, Vaccine, 10:151-158; данный источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Сотни различных адъювантов известны в данной области техники и могут быть применены в практике настоящего изобретения.

[00153] Терапевтические композиции могут быть введены в любом количестве и любым способом, эффективным для лечения и/или вакцинации. Точное требуемое количество будет варьировать от субъекта к субъекту, в зависимости от принадлежности к определенному виду, возраста, общего состояния субъекта, тяжести инфекции, конкретной композиции, способа ее введения, типа ее активности и тому подобного. Терапевтические композиции, как правило, приготовлены в единичной лекарственной форме для простоты введения и единообразия дозировки. Тем не менее, следует понимать, что общая суточная доза композиций в настоящем изобретении будет определяться лечащим врачом в рамках здравого медицинского суждения. Конкретный терапевтически эффективный размер дозы для любого конкретного субъекта или организма будет зависеть от множества факторов, включая расстройство, которое лечат и/или от которого вакцинируют, и тяжесть указанного расстройства, активности конкретной используемой композиции вакцины, время полужизни композиции после введения, возраст, вес тела, общее здоровье, пол и диету субъекта; время введения, путь введения и уровень экскреции конкретных использованных компонентов, лекарства, применяемые в комбинации или совместно с конкретным использованным компонентом и другие подобные факторы, хорошо известные в области медицины.

[00154] Терапевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены любым путем. В некоторых вариантах реализации терапевтические композиции согласно настоящему изобретению вводят различными путями, включая оральный (РО), внутривенный (IV), внутримышечный (IM), внутриартериальный, интрамедуллярный, интратекальный, подкожный (SQ), внутрижелудочковый, трансдермальный, интрадермальный, ректальный (PR), вагинальный, внутрибрюшинный (IP), внутрижелудочный (IG), местный (например, с помощью пудры, мазей, кремов, гелей, лосьонов и/или капель), через слизистую оболочку, интраназальный, буккальный, энтеральный, витреальный, подъязычный, интратрахеальную инсталляцию, бронхиальную инсталляцию и/или ингаляции, с помощью орального спрея, назального спрея и/или аэрозоля и/или через катетер воротной вены.

[00155] В настоящее время введение путем орального спрея или аэрозоля (например, ингаляцией) представляет собой наиболее часто используемое для доставки терапевтических агентов непосредственно к легким и дыхательной системе. Тем не менее, изобретение охватывает доставку предлагаемых в изобретении фармацевтических композиций подходящим способом, принимая во внимание возможные достижения в науках о доставке лекарств.

[00156] В некоторых вариантах реализации препараты для ингаляционной доставки содержат множество частиц. В некоторых вариантах реализации средний размер частиц составляет 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 микрон. В некоторых вариантах реализации препараты для ингаляционной или аэрозольной доставки приготавливают в виде сухого порошка. В некоторых вариантах реализации препараты для ингаляционной или аэрозольной доставки приготавливают в виде влажного порошка, например, путем включения увлажняющего агента. В некоторых вариантах реализации увлажняющий агент выбран из группы, состоящей из воды, солевого раствора или другой жидкости с физиологичным значением pH.

[00157] В некоторых вариантах реализации предлагаемые в изобретении композиции вводят в виде капель в нос или щечный карман. В некоторых вариантах реализации доза может содержать множество капель (например, 1-100, 1-50, 1-20, 1-10, 1-5 и т.д.)

[00158] В некоторых вариантах реализации предлагаемые в изобретении композиции вводят с использованием устройства, которое доставляет отмеренную дозу композиции (например, связывающего агента).

[00159] Подходящие устройства для применения в доставке интрадермальных терапевтических композиций, описанных в настоящем документе, включают устройства с короткими иглами такие, как устройства, описанные в патенте США №4,886,499, патенте США №5,190,521, патенте США №5,328,483, патенте США №5,527,288, патенте США №4,270,537, патенте США №5,015,235, патенте США №5,141,496, патенте США №5,417,662. Интрадермальные композиции также могут быть введены с помощью устройств, которые ограничивают эффективную длину проникновения иглы в кожу, таких как описанные в WO 99/34850, включенном в настоящее описание посредством ссылки, и их функциональных эквивалентов. Также подходящими являются реактивные инжекторные устройства, доставляющие жидкие вакцины в дерму с помощью жидкоструйного инжектора или с помощью иглы, которая прокалывает роговой слой и производит впрыск струи, которая достигает дермы. Реактивные инжекторные устройства описаны, например, в патенте США №5,480,381, патенте США №5,599,302, патенте США №5,334,144, патенте США №5.993.412, патенте США №5,649,912, патенте США №5,569,189, патенте США №5,704,911, патенте США №5,383,851, патенте США №5,893,397, патенте США №5,466,220, патенте США №5,339,163, патенте США №5,312,335, патенте США №5,503,627, патенте США №5.064.413, патенте США №5,520,639, патенте США №4,596,556, патенте США №4,790,824, патенте США №4,941,880, патенте США №4,940,460, WO 97/37705 и WO 97/13537. Также подходящими являются баллистические устройства для доставки порошков/частиц, которые используют сжатый газ для разгона вакцины в виде порошка через слои кожи к дерме. Кроме того, традиционные шприцы могут быть применены для классического способа интрадермального введения способом Манту.

[00160] Общие соображения о разработке и производстве фармацевтических агентов можно найти, например, в источнике Remington: Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.

[00161] Предлагаемые в изобретении терапевтические композиции могут быть введены в любых дозах, подходящих для получения желаемого результата. В некоторых вариантах реализации желаемый результат представляет собой уменьшение интенсивности, тяжести и/или частоты, и/или задержку начала развития одного или более симптомов инфекции (например, инфекции гриппа).

[00162] Терапевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены либо отдельно, либо в комбинации с одним или более других терапевтических агентов. Под термином "в комбинации с" не подразумевает, что агенты должны быть введены в одно и то же время и/или приготовлены в составе для совместной доставки, хотя эти способы доставки и находятся в рамках настоящего изобретения. Композиции могут быть введены одновременно с, до или после одной или более желаемых терапевтических процедур. Следует отметить, что терапевтически активные агенты, применяемые в комбинации, могут быть введены вместе в составе одной композиции или раздельно в составе разных композиций. В целом, каждый агент будет введен в той дозе и/или по тому временному графику, что определен для указанного агента.

[00163] В некоторых вариантах реализации предлагаемые в изобретении терапевтические композиции приготовлены с обеспечением уменьшения иммуногенности включенных в них агентов. Например, в некоторых вариантах реализации включенный активный агент ассоциирован с (например, связан с) агентом, таким как полиэтиленгликоль и/или карбоксиметилцеллюлоза, который маскирует его иммуногенность. В некоторых вариантах реализации включенный агент дополнительно гликозилирован, что снижает его иммуногенность.

[00164] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложены наборы для введения предлагаемых в изобретении терапевтических композиций. Например, в некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен набор, содержащий по меньшей мере одну дозу связывающего агента. В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен набор, содержащий начальную единичную дозу и последующую единичную дозу связывающего агента. В некоторых таких вариантах реализации начальная единичная доза больше, чем последующая единичная доза или обе дозы одинаковы.

[00165] В некоторых вариантах реализации предлагаемые в изобретении наборы (в особенности те, что для введения предлагаемых в изобретении композиций) содержат по меньшей мере один компонент устройства доставки, например, ингалятора. В некоторых таких вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложены наборы, содержащие по меньшей мере один компонент устройства доставки, например, ингалятора и дозу связывающего агента.

Композиции вакцин

[00166] В некоторых конкретных вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложены терапевтические композиции, которые представляют собой композиции вакцин для применения в предотвращении инфекций гриппа, в особенности, когда такие инфекции опосредованы адаптированным к человеку ГА Н5. В некоторых вариантах реализации такие композиции вакцин содержат один или более предложенных ГА-полипептидов или их фрагментов, кодирующие их нуклеиновые кислоты, продуцирующие их системы экспрессии и/или конкурирующие агенты, которые конкурируют с ними за взаимодействие с одним или более рецепторов ГА. В некоторых вариантах реализации такие композиции вакцин содержат один или более адъювантов для содействия или стимуляции иммунного ответа у индивидуума, которому вводят композицию вакцины.

[00167] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложены вакцины и введение указанных вакцин субъекту-человеку. В некоторых вариантах реализации вакцины представляют собой композиции, содержащие одно из следующего (1) инактивированный вирус, (2) живой ослабленный вирус гриппа, например, вирус с дефектами репликации, (3) предложенные в изобретении ГА-полипептиды или их фрагменты, детектирующие агенты, связывающие агенты, нуклеиновые кислоты, системы экспрессии, клетки или организмы, описанные в настоящем документе.

[00168] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложены инактивированные вакцины против гриппа. В некоторых вариантах реализации инактивированные вакцины против гриппа содержат один из трех антигенных препаратов: инактивированные цельные вирионы, части вирионов, для чего очищенные вирусные частицы разрушают с помощью детергентов или других реагентов для растворения липидной оболочки ("сплит-вакцины") или очищенные ГА-полипептиды ("субъединичные" вакцины). В некоторых вариантах реализации вирус может быть инактивирован обработкой формальдегидом, β-пропиолактоном, эфиром, эфиром с детергентом (таким как Tween-80), цетилтриметиламмоний-бромидом (ЦТАБ) и Triton 101, дезоксихолатом натрия и три-н-бутил фосфатом. Инактивация может быть произведена до или после очистки аллантоисной жидкости (для вирусов, полученных в яйцах); вирионы изолируют и очищают (Nicholson et al., eds., Textbook of Influenza, Blackwell Science, Maiden, MA, 1998). Для оценки активности вакцины может быть применена простая радиальная иммунодиффузия (ПРИ) (Schild et al., Bull. World Health Organ., 52:43-50 & 223-31, 1975; Mostow et al., J. Clin. Microbiol, 2:531, 1975).

[00169] Согласно настоящему изобретению также предложены живые ослабленные вакцины против гриппа и способы ослабления, хорошо известные в данной области техники. В некоторых вариантах реализации ослабления достигают за счет использования обратной генетики, такой как сайт-направленный мутагенез.

[00170] В некоторых вариантах реализации вирус гриппа для применения в вакцинах культивируют в яйцах, например, в яйцах курицы, содержащих эмбрионы, и в таком случае забираемый материал представляет собой аллантоисную жидкость. В качестве альтернативы или дополнения вирус гриппа может быть получен с помощью любого способа с использованием тканевой культуры для культивирования вируса. Подходящие клеточные субстраты для культивирования вируса включают, например, клетки почки собаки, такие как MDCK, или клетки из клона MDCK, MDCK-подобные клетки, клетки почки обезьяны, такие как клетки линии AGMK, включая клетки линии Vero, культивируемые в виде постоянных линий клетки эпителия, клетки линии 293Т, клетки линии BK-21, клетки линии CV-1 или любые другие типы клеток млекопитающих, подходящие для продукции вируса гриппа (включая клетки эпителия верхних дыхательных путей) для применения в вакцинах, легко доступные в коммерческих источниках (например, АТСС, Rockville, Md.). Подходящие клеточные субстраты также включают клетки человека, такие как клетки линии MRC-5. Подходящие клеточные субстраты не ограничены только клеточными линиями, например, первичные культуры клеток, такие как фибробласты эмбриона курицы, тоже включены.

[00171] В некоторых вариантах реализации предложенные в изобретении вакцины дополнительно содержат один или более адъювантов. Например, соли алюминия (Baylor et al., Vaccine, 20:S18, 2002) и монофосфорил липид A (MPL; Ribi et al., (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407, 1986)) могут быть применены в качестве адъювантов в вакцинах для человека. В качестве альтернативы или дополнения в настоящее время испытывают в качестве адъювантов в вакцинах для человека новые соединения, такие как MF59 (Chiron Corp., http://www.chiron.com/investors/pressreleases/2005/051028.html), CPG 7909 (Cooper et al., Vaccine, 22:3136, 2004), и сапонины, такие как QS21 (Ghochikyan et al., Vaccine, 24:2275, 2006).

[00172] Кроме того, в данной области техники известно, что некоторые адъюванты повышают иммуногенность вакцин от гриппа, такие как поли-бис-карбоксилатфенокси-фосфазен (РССР; Payne et al., Vaccine, 16:92, 1998), интерферон γ (Cao et al., Vaccine, 10:238, 1992), блок-сополимер P1205 (CRL1005; Katz et al., Vaccine,. 18:2177, 2000), интерлейкин-2 (ИЛ-2; Mbwuike et al., Vaccine, 8:347, 1990) и полиметилметакрилат (PMMA; Kreuter et al., J. Pharm. Sci., 70:367, 1981).

[00173] В некоторых вариантах реализации предложенные в изобретении композиции вакцин не включают адъюванты (например, предложенные композиции по существу не содержат адъювантов). В некоторых вариантах реализации предложенные в изобретении композиции вакцин не включают алюминиевые адъюванты (например, предложенные композиции по существу не содержат алюминия).

[00174] В некоторых вариантах реализации композиции вакцин приготовлены в виде состава или иным образом приспособлены или подготовлены для введения до развития симптомов и/или до воздействия. Специалистам в данной области техники, тем не менее, будет понятно, что во многих вариантах реализации композиции вакцин в качестве альтернативы или дополнения могут быть введены после воздействия, инфицирования и/или развития симптомов.

Комбинированная терапия

[00175] Терапевтические композиции, описанные в настоящем документе, могут быть введены либо отдельно, либо в сочетании с одним или более терапевтическими агентами, включая, но не ограничиваясь ими, вакцины и/или антитела. Словосочетание "в сочетании с" не подразумевает, что агенты должны быть введены в одно и то же время и/или оформлены в состав для совместной доставки, хотя эти способы доставки и находятся в рамках настоящего изобретения. В целом, каждый агент будет введен в той дозе и в соответствии с тем временным графиком, которые установлены для этого агента. Кроме того, изобретение охватывает доставку предложенных в изобретении терапевтических композиций в сочетании с агентом, который может улучшать их биодоступность, снижать или модифицировать их метаболизм, ингибировать их выведение или модифицировать их распределение в теле. Несмотря на то, что фармацевтические композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут быть применены для лечения любого субъекта (например, любого животного), нуждающегося в лечении, наиболее предпочтительно их применение для лечения человека. В некоторых вариантах реализации предложенные в изобретении терапевтические композиции вводят в сочетании с одним или более противовирусными агентами (например, Осетальмивиром [тамифлю], Занамивиром [Релеза] и т.д.) и/или сиалидазой. В некоторых вариантах реализации предложенные в изобретении терапевтические композиции вводят в сочетании с одним или более других способов терапии (например, обезболивающими, деконгестантами, подавителями кашля, снотворными и т.д.), часто используемыми для лечения инфекции гриппа или ее симптомов.

Применение

[00176] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложены технологии и методологии для лечения, мониторинга и даже прогнозирования эволюции последовательностей ГА штаммов вируса птичьего гриппа.

Лечение инфекций гриппа

[00177] Согласно настоящему изобретению предложены способы лечения инфекции гриппа. В некоторых вариантах реализации такие способы включают введение одного или более предложенных в настоящем изобретении ГА-полипептидов или их фрагментов, кодирующих их нуклеиновых кислот, продуцирующих их систем экспрессии и/или конкурирующих агентов, которые конкурируют с ними за взаимодействия с одним или более рецепторов ГА, нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых вариантах реализации ГА-полипептиды или их фрагменты, кодирующие их нуклеиновые кислоты, продуцирующие их системы экспрессии и/или конкурирующие агенты, которые конкурируют с ними за взаимодействия с одним или более рецепторов ГА, ингибируют способность ГА (например, ГА, экспрессированного но поверхности вируса гриппа) к связыванию с гликанами топологической формы зонта (например, гликанов, связанных с эпителиальными тканями таких верхних отделов дыхательных путей человека, как трахеи и бронхи).

[00178] В некоторых вариантах реализации ГА-полипептиды или их фрагменты, кодирующие их нуклеиновые кислоты, продуцирующие их системы экспрессии и/или конкурирующие агенты, которые конкурируют с ними за взаимодействия с одним или более рецепторов ГА, предложенные в настоящем изобретении, применяют в лечении одного или более следующих симптомов: лихорадка, боль в горле, мышечные боли, сильная головная боль, кашель, слабость, общее недомогание, пневмония, тошнота и/или рвота. В некоторых вариантах реализации эти симптомы вызваны инфекцией гриппа.

[00179] В некоторых вариантах реализации предложенные в изобретении фармацевтические композиции вводят субъекту, страдающему от или восприимчивому к инфекции гриппа. В некоторых вариантах реализации субъект считают страдающим от инфекции гриппа, если у него проявляются один или более симптомов, обычно связанных с инфекцией гриппа. В некоторых вариантах реализации о субъекте известно или подозревают, что он подвергся воздействию инфекции гриппа. В некоторых вариантах реализации субъект считают восприимчивым к инфекции гриппа, если о субъекте известно или предполагается, что он подвергся воздействию вируса гриппа. В некоторых вариантах реализации о субъекте известно или предполагается, что он подвергся воздействию вируса гриппа, если субъект был в контакте с другими индивидуумами, о которых известно или подозревается, что они были инфицированы вирусом гриппа, и/или если субъект находится или находился в локации, в которой инфекция гриппа известна как или считается превалирующей.

[00180] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения инфекции гриппа, включающий стадии (1) обеспечение пациента, проявляющего симптомы инфекции гриппа, и (2) введение терапевтического количества одного или нескольких ГА-полипептидов или их фрагментов, кодирующих их нуклеиновых кислот, продуцирующих их систем экспрессии и/или конкурирующих агентов, которые конкурируют с ними за взаимодействия с одним или более рецепторов ГА, пациенту. В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения инфекции гриппа, включающий стадии (1) обеспечение пациента, страдающего от инфекции гриппа, и (2) введение терапевтического количества одного или нескольких ГА-полипептидов или их фрагментов, кодирующих их нуклеиновых кислот, продуцирующих их систем экспрессии и/или конкурирующих агентов, которые конкурируют с ними за взаимодействия с одним или более рецепторов ГА, пациенту. В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения инфекции гриппа, включающий стадии (1) обеспечение пациента, восприимчивого к инфекции гриппа, и (2) введение терапевтического количества одного или нескольких ГА-полипептидов или их фрагментов, кодирующих их нуклеиновых кислот, продуцирующих их систем экспрессии и/или конкурирующих агентов, которые конкурируют с ними за взаимодействия с одним или более рецепторов ГА, пациенту.

[00181] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения инфекции гриппа, включающий стадии (1) обеспечение пациента, проявляющего симптомы, и/или страдающего, от и/или восприимчивого к инфекции гриппа, и (2) введение субстанции, конкурирующей с ГА-полипептидами (например, с ГА-полипептидами, связанными с частицами вируса гриппа) за связывание с гликанами топологической формы зонта в тканях верхних дыхательных путей.

[00182] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения и/или задержки начала развития инфекции гриппа, состоящий из стадий (1) обеспечение пациента, восприимчивого к инфекции гриппа, и (2) введение терапевтического количества одного или нескольких ГА-полипептидов или их фрагментов, кодирующих их нуклеиновых кислот, продуцирующих их систем экспрессии и/или конкурирующих агентов, которые конкурируют с ними за взаимодействия с одним или более рецепторов ГА, пациенту.

Наблюдение/мониторинг

[00183] До появления настоящего изобретения влияние мутаций на количественную аффинность связывания гликан-рецептор ГА Н5 не были охарактеризованы. В настоящем документе представлены, среди прочего, способы определения и понимания требований для количественного переключения преимущественного связывания ГА Н5 на рецепторы человека характерным для ГА, адаптированных к организму человека в контексте изменений в молекулярном окружении рецептор-связывающего сайта, образом. В некоторых вариантах реализации сочетание структурного анализа и анализа сети со взаимодействиями между остатками объединены для определения мутаций в рецептор-связывающем сайте ГА Н5, который количественно переключает преимущественное связывание с гликанами на рецептор человека сходным с ГА пандемических штаммов H1 и Н2 образом.

[00184] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложены способы мониторинга популяции на предмет инфекционного для человека и/или передающегося человеку гриппа. В некоторых вариантах реализации предложены способы определения пандемического риска для штаммов гриппа. В некоторых вариантах реализации способ мониторинга гриппа включает стадии получения образца из источника, предположительно содержащего грипп, введения указанного образца в контакт с одним или более агентов, специфично связывающихся с полипептидами ГА Н5, детектирования связывания агента с образцом таким образом, чтобы определить наличие и/или количество ГА Н5 в образце. В некоторых вариантах реализации связывание одного или более агентов с образцом свидетельствует о наличии инфективного для человека ГА Н5. В некоторых вариантах реализации связывание одного или более агентов с образцом свидетельствует об отсутствии инфективного для человека ГА Н5.

[00185] В некоторых вариантах реализации способы согласно настоящему изобретению могут быть применены для анализа любого из множества источников образцов, включая источники среды, источники, представляющие собой пациентов-людей, источники, представляющие собой животных, например. В некоторых вариантах реализации анализ одного или более источников проводят по меньшей мере дважды. В некоторых вариантах реализации каждый анализ отделен промежутком времени, для того чтобы сделать возможным, например, проведение долгосрочного мониторинга субъекта или популяции. В некоторых вариантах реализации указанный период времени может составлять 1 час, 12 часов, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев или 1 год.

Детектирование и/или характеристика пригодных агентов и/или взаимодействий

[00186] Согласно настоящему изобретению предложены различные технологии для идентификации и/или характеристики пригодных агентов (например, агентов, пригодных для лечения, предотвращения и/или анализа инфекции гриппа) и/или взаимодействий.

[00187] Например, множество исследований связывания и/или форматов связывания пригодны для идентификации и/или характеристики пригодных агентов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения используют системы анализа взаимодействий связывания между ГА-полипептидами и рецепторами ГА. В некоторых таких вариантах реализации способы анализа включают стадии 1) обеспечения источника ГА-полипептидов или их связывающих компонентов; 2) обеспечения источника рецепторов ГА или их связывающих компонентов и 3) введения в контакт обеспеченных источников между собой в условиях и в течение времени, достаточных для оценки связывания между ГА-полипептидами (или их связывающими компонентами) и рецепторами ГА (или их связывающими компонентами). Такие подходы можно применять, например, для идентификации или характеристики исследуемых ГА-полипептидов, в частности, вариантов ГА-полипептидов, и/или для идентификации и/или характеристики агентов, которые связываются с ними и/или ингибируют их взаимодействие с рецепторами ГА.

[00188] В некоторых вариантах реализации подходящие источники ГА-полипептидов или их связывающих компонентов включают патологические образцы, такие как кровь, сыворотка/плазма, мононуклеарные клетки периферической крови/лимфоциты периферической крови (МКПК/ЛПК), мокрота, моча, кал, мазки из зева, мазки поражений кожи, спинномозговая жидкость, цервикальные мазки, образцы гноя, пищевые матрицы и ткани различных частей тела, таких как мозг, селезенка и печень, но не ограничены ими. В качестве альтернативы или дополнения, другие подходящие источники образцов, содержащих ГА-полипептиды включают, но не ограничены ими, источники среды, такими как почва, вода и флора. Другие источники включают лабораторные образцы, например, сконструированные ГА-полипептиды, разработанные и/или полученные исследователями. Другие источники, которые не были перечислены, также могут быть применимы. В некоторых вариантах реализации источники (и/или образцы, введенные в контакт с рецепторами ГА или их связывающими компонентами) содержат интактные вирусы или вирусоподобные частицы, в некоторых вариантах реализации такие источники и/или образцы содержат ГА-полипептиды. В некоторых вариантах реализации ГА-полипептиды используют в виде тримера.

[00189] В некоторых вариантах реализации подходящие источники ГА-полипептидов или их связывающих компонентов включают образцы тканей; в некоторых вариантах реализации подходящие источники включают изолированные рецепторы ГА или их связывающие части. В некоторых вариантах реализации подходящие источники включают совокупности гликанов, например, гликановые матрицы, содержащие гликаны рецептора ГА. В некоторых вариантах реализации подходящие источники включают совокупности гликанов, содержащие α2-3- и/или α2-6-гликаны. В некоторых вариантах реализации подходящие источники включают совокупности гликанов, содержащие гликаны топологической формы конуса и/или зонта. В некоторых вариантах реализации подходящие источники включают гликаны, обнаруженные на рецепторах ГА верхних дыхательных путей человека

[00190] Следует понимать, что множество связывающих взаимодействий могут быть с пользой изучены согласно настоящему изобретению. В дополнение к взаимодействию ГА-полипептид-рецептор ГА различные взаимодействия антитело-антиген или другие взаимодействия лиганд-мишень могут быть изучены, как описано в настоящем документе. Например, взаимодействия между ГА-полипептидом и детектирующим или конкурирующим агентом могут быть проанализированы в присутствии или при отсутствии рецепторов ГА (или их связывающих компонентов).

[00191] В некоторых вариантах реализации один или оба взаимодействующих компонента, используемые в исследовании связывания, детектируемо помечают (непосредственно или опосредованно) до, во время или после стадии введения в контакт. В некоторых таких вариантах реализации по меньшей мере один взаимодействующий компонент пространственно локализован, например, на матрице. В качестве примера, в некоторых вариантах реализации детектируемо помеченный ГА-полипептид или его связывающий компонент приводят в контакт с совокупностью гликанов, например, на матрице, на которой разные гликаны отчетливо локализованы. В некоторых таких вариантах реализации связывание могут оценивать путем детектирования и/или определения количества локализованной метки (например, с использованием сканирующего устройства).

[00192] В качестве альтернативы или дополнения, связывание между или среди взаимодействующих компонентов или объектов может быть измерено с помощью, например, калориметрических, флуоресцентных или радиоактивных систем детектирования или других способов мечения или других способов, не требующих метки. В целом, флуоресцентное детектирование обычно включает использование первого взаимодействующего партнера (например, ГА-полипептида или его связывающего компонента или рецептора ГА или его связывающей части), который является меченным или будет помечен флуоресцентной молекулой и мониторинг флуоресцентных сигналов. В качестве альтернативы или дополнения один или оба один или оба взаимодействующих компонента могут быть помечены с помощью метки (например, биотина или стрептавидина, эпитопом антигена, нуклеиновой кислотой и т.д.), которая сама по себе детектируемо взаимодействует с партнером (например, стрептавидином или биотином, антителом, комплементарной нуклеиновой кислотой).

[00193] В некоторых вариантах реализации могут быть применены способы тушения флуоресценции, в которых один взаимодействующий компонент или объект флуоресцентно помечен, а другой представлен в контексте, который подавляет флуоресценцию, если/когда происходит связывание.

[00194] В качестве альтернативы или дополнения для исследования связывания можно использовать живые клетки или образцы тканей, которые культивируют в присутствии радиоактивного вещества, получая в результате радиоактивно меченый зонд. Связывание в таких вариантах реализации может быть детектировано путем измерения радиоактивного излучения.

[00195] Такие способы применимы для определения факта связывания и/или степени связывания между взаимодействующими компонентами или объектами. В некоторых вариантах реализации такие способы могут быть дополнительно применены для идентификации и/или характеристики агентов, препятствующих или иным образом воздействующих на исследуемое взаимодействие.

[00196] Конкретное применение способов, описанных в настоящем документе, заключается, например, в идентификации того, действительно ли молекула, для которой подозревают возможность взаимодействия с углеводами, способна к такому взаимодействию, или того, обладает ли молекула непредвиденными способностями к взаимодействию с углеводами.

[00197] Согласно настоящему изобретению также предложены способы применения совокупностей гликанов, например, для детектирования конкретного агента в тестовом образце. Например, такие способы могут включать стадии (1) введения в контакт совокупности гликанов (например, гликановой матрицы) с тестовым образцом (например, с образцом, о котором известно, что он содержит ГА-полипептид) и (2) детектирования связывания любого агента в тестовом образце с совокупностью гликанов.

[00198] Исследования связывания можно применить согласно настоящему изобретению, например, для определения кинетики взаимодействий между связывающим агентом и гликаном. Например, передоложенные в настоящем изобретении способы для определения кинетики взаимодействия могут включать стадии (1) введения в контакт совокупности гликанов и образца, содержащего тестируемый агент, и (2) измерения кинетики взаимодействия между связывающим агентом и гликаном (гликанами).

[00199] Кинетику взаимодействия между связывающимися объектами или компонентами (например, связывающий агент и гликаны в совокупности, например, на матрице) можно измерить по изменениям в реальном времени, например, калориметрических или флуоресцентных сигналов, как подробно описано выше. Конкретное применение таких способов заключается, например, в определении того, способен ли конкретный связывающий агент взаимодействовать с конкретным углеводом с большей степенью связывания, нежели способен другой агент, взаимодействующий с тем же углеводом.

[00200] В некоторых вариантах реализации исследования связывания, описанные в настоящем документе, и конкретные исследования связывания, характеризующие взаимодействия между ГА-полипептидами или их связывающими компонентами и рецепторами ГА или их связывающими компонентами, выполняют в диапазоне концентраций одного или обоих взаимодействующих компонентов или объектов.

[00201] В некоторых вариантах реализации исследования связывания (и/или инфицирования и/или передачи инфекции гриппа) выполняют на или применяют к животному-хозяину. В настоящем документе "животное-хозяин" включает любое моделирование на животных, подходящее для исследования гриппа. Например, животным-хозяином, подходящим для настоящего изобретения, может быть любое млекопитающее-хозяин, включая приматов, хорьков, кошек, собак, коров, лошадей, грызунов, таких как мыши, хомяки, кролики и крысы. В некоторых вариантах реализации животное-хозяин, используемое для настоящего изобретение, представляет собой хорька. В частности, в некоторых вариантах реализации животное-хозяин не было подвергнуто воздействию или инфицированию вирусом до введения предложенного в изобретении связывающего агента (необязательно в составе предложенной в изобретении композиции). В некоторых вариантах реализации животное-хозяин прививают, инфицируют или иным образом подвергают воздействию вируса до или одновременно с введением предложенного в изобретении связывающего агента. Животное-хозяин, используемое в практике настоящего изобретения, могут привить, инфицировать или иным образом подвергнуть воздействию вируса любым способом, известным в данной области техники. В некоторых вариантах реализации животное-хозяин, используемое в практике настоящего изобретения, могут привить, инфицировать или иным образом подвергнуть воздействию вируса интраназально.

[00202] В некоторых вариантах реализации подходящее животное-хозяин может иметь распределение гликанов топологической формы зонта против гликанов топологической формы конуса и/или α2-6-гликанов против α2-3-гликанов сходное с распределением, обнаруженным в дыхательных путях человека. Например, предполагают, что хорек в качестве животного-хозяина может быть более репрезентативным, чем мышь, при использовании для моделирования заболевания, обусловленного вирусами гриппа, у людей (Tumpey, et al. Science (2007) 315; 655-659). He желая быть связанными какой-либо теорией, в настоящее изобретение включили идею, что у хорька распределение гликанов в дыхательных путях может быть в большей степени подобным распределению гликанов в дыхательных путях человека, чем у мыши с человеком.

[00203] Наивных и/или привитых животных можно использовать для любого из возможных исследований. Например, такое моделирование на животных можно применить для исследований передачи вируса, как известно в данной области техники. Предполагают, что использование хорьков в исследованиях передачи вируса может достоверно прогнозировать то, как вирус передается у человека. Например, передача вируса гриппа от привитых животных (например, хорьков) по воздуху наивным животным известна в данной области техники. (Tumpey, et al. Science (2007) 315; 655-659). Исследования передачи вируса можно применять для тестирования предложенных в изобретении полипептидов связывающих агентов (например, ГА-полипептидов). Например, предложенные в изобретении связывающие агенты можно вводить до, во время или после исследований передачи вируса с целью определения эффективности указанного связывающего агента в блокировании вирусного связывания и/или инфективности у животного-хозяина. С применением информации, полученной в исследованиях передачи вируса у животного-хозяина можно прогнозировать эффективность связывающего агента в блокировании вирусного связывания и/или инфективности у человека.

Получение полипептидов

[00204] Предложенные полипептиды (например, ГА-полипептиды, антитела и т.д. и/или их фрагменты, такие как характерные фрагменты) можно получать с помощью любых доступных средств.

[00205] Полипептиды могут быть получены, например, с использованием системы клетки-хозяина, сконструированной для экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих исследуемый полипептид. В некоторых вариантах реализации такие кодирующие нуклеиновые кислоты являются гетерологичными по отношению к системе клетки-хозяина, и их вводят в систему посредством вмешательства со стороны человека. В качестве альтернативы или дополнения на систему клетки-хозяина могут воздействовать для того, чтобы они экспрессировали указанный закодированный полипептид на определенном уровне (например, на повышенном) и/или в определенное время.

[00206] Специалистам в данной области техники следует быть в курсе широкого спектра систем клеток-хозяев, которые можно соответствующим образом применить для получения полипептидов, как описано в настоящем документе. Например, полипептиды можно получить в клеточных системах бактерий, млекопитающих, птиц или растений. В некоторых вариантах реализации используют эукариотические клеточные системы. В некоторых вариантах реализации используемые клеточные системы представляют собой или содержат интактные ткани и/или организмы. В качестве нескольких примеров в некоторых вариантах реализации предложенные полипептиды представляют собой полипептиды, экспрессировнные в клеточных системах яйца, бакуловируса, растения, дрожжей, пермиссивной клеточной линии почки собаки MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) или клеточной линии Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки).

[00207] В качестве альтернативы или дополнения предложенные полипептиды можно синтезировать in vitro, например, с использованием систем транскрипции и/или трансляции in vitro или путем химического синтеза.

[00208] В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды (или определенные их части) могут получать в интактных вирусах или вирусоподобных частицах.

[00209] В некоторых вариантах реализации предложенные ГА-полипептиды (или определенные их части) могут выделить и/или очистить из вируса гриппа. Например, вирус могут культивировать в яйце, таком как куриное яйцо, с эмбрионом, в таких случаях забираемый материал представляет собой аллантоисную жидкость. В качестве альтернативы или дополнения вирус могут культивировать в системе культуры ткани. Подходящие клеточные субстраты для культивирования вирусов включают, например, клетки почки собаки, такие как клетки линии MDCK или клетки из клона MDCK, MDCK-подобные клетки, клетки почки обезьяны, такие как клетки линии AGMK, включая клетки линии Vero, культивируемые эпителиальные клетки в виде непрерывных клеточных линий, клетки линии 293Т, клетки линии BK-21, клетки линии CV-1, или любой другой тип клеток млекопитающих, подходящих для получения вируса гриппа для вакцин, легко доступные в коммерческих источниках (например, в АТСС, Rockville, Md.). Подходящие клеточные субстраты также включают клетки человека, такие как клеточная линия MRC-5. Подходящие клеточные субстраты не ограничены клеточными линиями, например, они также включают первичные клетки, такие как фибробласты эмбриона курицы.

[00210] Кроме того, средним специалистам в данной области техники будет понятно, что полипептиды и, в частности, ГА-полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть созданы, определены, выделены и/или получены путем культивирования клеток или организмов, продуцирующих полипептид (будь то отдельный полипептид или в качестве части комплекса, в том числе в качестве части вирусной частицы или вируса), в условиях, позволяющих проведение быстрого скрининга и/или селекции полипептидов, которые демонстрируют желаемые характеристики связывания и/или активности, описанные в настоящем документе.

Примеры

Пример 1: Дизайн и характеристика новых вариантов ГА Н5 Введение

[00211] Вирус гриппа А представляет значительную угрозу для всемирного здоровья и с точки зрения сезонных вспышек, и, также, с точки зрения способности вируса птиц (антигенно нового для человека) приспосабливаться к человеческому организму в качестве хозяина. Внезапное появление антигенно нового штамма 2009 H1N1 в результате множественной рекомбинации генных сегментов птичьего, свиного и человеческого вирусов гриппа существенно повлияло на мировую экономику и подчеркнуло острую необходимость надлежащего надзора для большей готовности к таким спонтанным пандемическим вспышкам в будущем. Характерной особенностью адаптированных к организму человека вирусов, таких как H1N1, H2N2 и H3N2, представляет собой количественно высокую аффинность связывания вирусного ГА с рецепторами человека по отношению к его связыванию с рецепторами птиц на уровне от низкого до минимального.

[00212] Аминокислотные мутации гликопротеина (ГА) вирусной поверхности и полимеразы (полимеразного В2 белка, polymerase basic protein 2, РВ2) сделали возможной аэрогенную передачу птичьего изолята гриппа H1N1 (Van Hoeven et al., 2009 PNAS, 106:3366). Среди подтипов птичьего гриппа, для которых известна способность инфицировать людей, H5N1 имеет самый высокий уровень смертности. Поэтому жизненно важно внедрять новые стратегии для усовершенствования мониторинга эволюции указанных вирусов H5N1 и отслеживания их потенциал адаптации к человеку в качестве хозяина.

[00213] Высоко патогенный подтип гриппа A H5N1 вызывает обеспокоенность всемирным здоровьем, учитывая, что он уже приводил к нескольким локализованным вспышкам с высоким уровнем смертности у людей (~ 60%) с 2003 г. (Neumann et al., 2010 Cell Res., 20:51; Guan et al., 2009 Rev Sci Tech, 28:39). Тем не менее, подтип H5N1 до сих пор не адаптирован к человеку в качестве хозяина настолько, чтобы обеспечить стабильную передачу от человека к человеку воздушно-капельным (или аэрогенным) путем.

[00214] ГА из птичьего подтипа обычно связывается с сиалилированными α2→3-гликанами (или рецепторами птиц) (Ge et al., 2011 Crit Rev Microbiol., 37:157). Отличительный признак подтипов, адаптированных к организму человека, таких как H1N1, H2N2 и H3N2, представляет собой количественное переключение предпочтительного связывания на рецепторы с сиалилированными α2→6-гликанами (или рецепторы человека), которое определяют по высокой относительной аффинности к рецепторам человека по отношению к рецепторам птиц. Указанное количественное переключение, как было показано, коррелирует с передаваемостью пандемических вирусов H1N1 и H2N2 воздушно-капельным путем у хорьков (Tumpey et al., 2007 Science, 315:655; Srinivasan et al., 2008 PNAS, 105:2800; Pappas et al., 2010 PLoS One, 5:e11158; Viswanathan et al., 2010 PLoS One, 5:e13768). Таким образом, необходимым определяющий фактор приспособления к организму человека адаптированных к организму птиц подтипов H5N1 представляет собой приобретение их ГА мутаций, которые количественно переключают предпочтительное связывание на рецепторы человека (Ge et al., 2011 Crit Rev Microbiol., 37:157; Shriver et al., 2009 Chem Biol., 16:803). Ha определении мутаций, которые переключают специфичность связывания ГА Н5 с рецепторами гликанов, было сосредоточено внимание в ряде предыдущих исследований (Gambaryan et al., 2006 Virology, 344:432; Stevens et al., 2006 Science, 312:404; Yamada et al., 2006 Nature, 444:378; Chandrasekaran et al., 2008 Nat Biotechnol., 26:107; Stevens et al., 2008 J Mol Biol., 381:1382; Wang et al., 2009 PNAS, 106:18137; Watanabe et al., 2012 Trends In Microbiology, 20:11). Некоторые из указанных исследований включали анализ связывания ГА Н5 с природными вариациями рецептор-связывающего сайта (РСС) с гликановыми рецепторами (Yamada et al., 2006 Nature, 444:378). В других исследованиях мутировали ГА Н5 для включения ключевых изменений для адаптации к организму человека ГА Н2/Н3 (Q226L и G228S или LS) и/или ГА H1 (E190D, G225D или DD). Ни один из вариантов ГА Н5, будь то сконструированный или обнаруженный в природном источнике, не показал количественного переключения связывания с рецепторами человека в характерной для адаптированных к организму человека ГА "пандемических" штаммов манере (таких как 1918 H1N1, 1958 H2N2 и 2009 H1N1, см. ФИГ. 1).

[00215] В последнее время в двух исследованиях авторства Имаи с коллегами (Imai et al., 2012 Nature, In Press) и Херфста с коллегами (Herfst et al., 2012 Science, 336:1534) показали, что специфические наборы мутаций в ГА из человеческих изолятов H5N1 A/Vietnam/1203/2004 (Viet04) и A/Indonesia/5/2005 (Ind05) соответственно переключают предпочтения рецептора и делают возможной передачу вируса воздушно-капельным путем у хорьков в вирусах, обладающих указанными вариантами ГА Н5. Из этих исследований очевидно, что разница в генетическом фоне и стратегиях давления отбора дают начало различным наборам аминокислотных замен в ГА Viet04 и Ind05, связанных с аэрогенной передачей вируса у хорьков. На основании этих исследований в другом исследовании авторов Рассел и др. (Russell et al., 2012 Science, 336:1541) применяли математическое моделирование и статистический анализ нуклеотидных последовательностей ГА и полимеразы РВ2 для оценки возможности приобретения специфических изменений аминокислот в Viet04 и Ind05 штаммами H5N1 в контексте их филогенетической дивергенции. Основываясь на анализах последовательности, данное исследование указывает на то, что существует четкая дивергенция последовательности в современных ГА H5N1 (таких как клада 2.2.1) и генетические изменения, выявленные в ГА Viet04 и Ind04 могут быть не единственными, приводящими к передаче воздушно-капельным путем.

[00216] Эволюция последовательности ГА Н5в частности имеет большое значение для аминокислотных замен в его РСС, необходимых для количественного переключения его преимущественного связывания на рецепторы человека. В данном контексте без ответа остается вопрос о том, как современный ГА Н5 будет переключать связывание на рецептор человека в контексте других молекулярных изменениях в его РСС вследствие дивергенции последовательности с прототипическими штаммами, такими как Viet04 и Ind04 (Watanabe et al., 2012 Trends In Microbiology, 20:11; Watanabe et al., 2011 PLoS Pathogens, 7:e1002068). Этот вопрос имеет особое значение, учитывая, что с момента выделения ГА 2006 Н5 заметно дивергировали с прототипическими штаммами Viet04 и Ind04, на которых было сосредоточено внимание во многих из исследований, рассмотренных выше.

[00217] Описанное в настоящем документе представляет собой новую концепцию для систематического изучения РСС ГА Н5 с учетом эволюции его последовательности и структурной топологии его природного рецептора у птиц. Ранее авторы настоящего изобретения разработали концепцию для распознавания связывания ГА с рецептором птицы и человека на основании трехмерной структурной топологии указанных рецепторов. Рецептор птиц, связываясь с ГА, образовывал конформационное пространство, напоминающее конус (и, следовательно, для описания данного использовали термин конусоподобная топологическая форма). Большинство контактов ГА Н5 (с использованием кристаллической структуры Viet04 (Stevens et al., 2006 Science, 312:404; Stevens et al., 2008, J Mol Biol, 381:1382)) с рецепторами птиц принимают конусоподобную топологическую форму, включающую мотив Neu5Acα2-3Gal. Аминокислоты в РСС ГА Н5, участвующие в указанном взаимодействии преимущественно лежат в основе РСС, включая остатки Ser-136 в петле-130, Trp-153 и Ile-155 в петле-150, Lys-222, Gln-226 в петле-220 с дополнительными специфическими контактами с Glu-190, Lys-193 и Leu-194 в петле-190 в верхней части указанного РСС (ФИГ. 2).

[00218] Некоторые определенные приспособленные к организму человека ГА известны, включая различные сезонные и пандемические штаммы подтипов H1N1, H3N2 и пандемического подтипа H2N2. На основании филогенетической "близости" ГА Н5 к ГА Н2 (ФИГ. 3) адаптированный к организму человека ГА H2N2 (A/Albany/6/58 or Alb58), связанный с рецептором человека, выбрали для противопоставления со структурным анализом ГА Н5, связанным с рецептором птицы (Stevens et al., 2006 Science, 312:404; Stevens et al., 2008, J Mol Biol, 381:1382). Штамм Alb58 выбрали в качестве репрезентативного штамма H2N2 с учетом того, что он представляет собой прототипический пандемический штамм и его свойства количественного связывания с гликановыми рецепторами и фенотипические свойства (такие как аэрогенная передача) были изучены. Поскольку данные рентгеноструктурного анализа кристаллической структуры ГА Alb58 недоступны, основанная на гомологии модель для данного ГА была построена с использованием шаблона кристаллической структуры другого адаптированного к организму человека ГА Н2 (A/Singapore/1/57) (кристаллизованный совместно с рецептором человека), который обладает высокой идентичностью последовательности с ГА Alb58.

Результаты

[00219] Было обнаружено, что рецептор человека, связанный с ГА, занимает большее конформационное пространство, напоминающее формой зонт, от полностью закрытого до полностью открытого. Соответственно, для определения такого рецептора можно использовать термин зонтоподобная топологическая форма. В зонтоподобной топологической форме рецептора человека есть две области: базовая область, содержащая мотив Neu5Acα2→6Galβ1→, и добавочная область, содержащая остатки сахаров, за пределами этого мотива (как правило, GlcNAcβ1→3Galp1→). Эти две области охватывают более широкий диапазон взаимодействующих аминокислот в РСС ГА Н2. Сравнение ГА Н5, связанного с рецептором птицы конусоподобной топологической формы, и ГА Н2, связанного с рецептором человека зонтоподобной топологической формы, показывает по меньшей мере четыре важных отличия (ФИГ. 2). Во-первых, состав петли-130 ГА Н2 отличен от ГА Н5, так как содержит делецию в положении 130 (нумерация по Н3). Во-вторых, аминокислоты в "основе" РСС (такие, как аминокислоты в положениях 136-138, 219-228), которые играют роль во взаимодействии с мотивом Neu5Acα2→6Galβ1→, отличаются. В-третьих, "верхушка" РСС изначально содержащая "петлю-190" (остатки 188-196), которая взаимодействует с добавочной областью рецептора человека, в ГА Н2 отличается (в частности, по положениям 188, 189, 192 и 193). В-четвертых, положение 158 гликозилировано в ГА Н5, но не в ГА Н2. Гликозилирование по данному сайту может потенциально служить препятствием добавочной области рецептора человека (см. Stevens et al., 2008, J Mol Biol, 381:1382).

[00220] В данном примере указанные четыре основных отличия разделили на молекулярные признаки, различающие РСС ГА Н2 и ГАН5. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают возможным, что внесение аминокислотных замен для преобразования РСС ГА Н5 в РСС ГА Н2 путем приведения в соответствие с указанными четырьмя признаками приведет к количественному переключению связывания ГА Н5 на рецепторы человека.

[00221] Для понимания эффекта созданных аминокислотных замен в контексте других остатков РСС разработан показатель (сеть РСС или СРСС) для понимания сети взаимодействий между ключевыми остатками РСС, которые образуют контакт с гликановым рецептором соответствующей топологической формы, и другими остатками в их ближайшем пространственном окружении. Оказывающую влияние взаимосвязь между ключевыми остатками РСС и их окружением представляют с использованием двумерной диаграммы открытой сети соединений (диаграммы СРСС). Протяженность сети взаимодействий аминокислоты в РРС количественно определяют с использованием нормированной оценки сети (оценка СРСС), которая варьирует от 0 (отсутствие какой-либо сети) до 1 (максимально развитая сеть). Чем шире сеть аминокислоты в РСС, тем больше она структурно подвержена мутациям. В рамках этого примера указанные сетевые связи внутри РСС направляли процесс преобразования РСС ГА Н5 в РСС ГА Н2 путем приведения в соответствие с указанными четырьмя признаками как описано в нижеследующих примерах.

[00222] Приведение в соответствие с Признаком 1 включает введение замен в петлю-130, а именно путем введения делеций. Указанная делеция в петле-130 влияет на диаграмму СРСС, включающую положения 131, 133 и 155. Остатки в положении 131 и 133 имеют низкую оценку СРСС (<0,4) в ГА Н5 и поэтому могут легко мутировать для соответствия диаграмме СРСС, включающей указанные положения в ГА Н2. Приведение в соответствие Признаку 2 включает замены в комбинации положений остатков в петле-130 и петле-220 на базе РСС. В ГА Н5 Gln-226 играет ключевую роль в контактах с мотивом Neu5Acα2→3Gal- рецептора птиц, и Ser-137 Gln-226 вовлечены в сеть со взаимодействием между остатками.

[00223] С другой стороны, в ГА Н2 соответствующие Leu-226 и Arg-137 не связаны. Arg-137 и Ser-228 в ГА Н2 обеспечивают дополнительные стабилизирующие контакты с сиаловой кислотой. Таким образом, согласно настоящему изобретению один из путей к соответствию Признаку 2 включает замену остатков в положениях 137 и 226 в ГА Н5 для соответствия диаграмме СРСС ГА Н2. Остаток в положении 137 являлся легко мутирующим, учитывая его низкую оценку СРСС в ГА Н2 и Н5 (~0,01). Тем не менее, остаток в положении 226 имеет гораздо более высокую оценку СРСС ГА Н2 и Н5 (>0,25). Изменения этого остатка, следовательно, также включает введение других замен, а именно: замена Gly-228→Ser в дополнение к мутации Ser-137→Arg. В то время как мутация Gln-226→Leu регулирует переключение контактов с мотива Neu5Acα2→3Gal- to Neu5Acα2→6Gal-, мутации Ser-137→Arg и Gly-228→Ser обеспечивают дополнительную стабилизацию петли-130 и петли-220 на базе РСС Н5 с точки зрения разветвленности межаминокислотной сети и улучшенных контактов с гликановым рецептором (Stevens et al., 2006 Science, 312:404; Stevens et al., 2008, J Mol Biol, 381:1382). Такая стабилизация также может быть достигнута путем мутации Asn-224 в Lys или Arg (Arg-224 замечен в ГА пандемического H1N1 1918 года), так как это расширит его сеть меж-аминокислотных взаимодействий на Asp-96, Leu-97 и Pro-99 (ФИГ. 2). Таким образом, соответствие с Признаком 2 также может быть достигнуто комбинированием мутаций по положению 224. Диаграмма СРСС остатка в положении 221 ГА Н5 идентична диаграмме СРСС остатка 221 ГА Н2, хотя ГА Н5 имеет в этой позиции Ser, а ГА Н2 имеет в этой позиции Pro (ФИГ. 2). Скорее всего, Pro регулирует конформацию и ориентацию боковой цепи соседнего остатка Lys-222, который играет ключевую роль в образовании контактов ГА Н2 с рецептором человека. Таким образом, замена дает возможность более полного соответствия Признаку 2.

[00224] Третий признак, который различает РСС ГА Н2 и Н5, имеет много отличий в отношении остатков в положениях 188, 189, 192 и 193 и диаграмм СРСС, описывающих сети их взаимодействий (ФИГ. 2). Остатки Ala-188, А1а-189, и Thr-192 в ГА Н5 не имеют каких-либо контактов с другими остатками в РСС. С другой стороны, остатки Glu-188, Thr-189 и Arg-192 вовлечены во множественные сети взаимодействий. Таким образом, приведение в соответствие с Признаком 3 включает введение аминокислотных замен по позициям 188, 189, 192, и 193 в ГА Н5 для приведения в соответствие с их соответствующей сетью со взаимодействиями в ГА Н2. Учитывая, что оценки СРСС всех указанных остатков в ГА Н5 являются низкими (<0,1), они легко поддаются мутациям. Наконец, приведение в соответствие с Признаком 4 включает удаление гликозилирования по положению 158. Этого можно достичь путем мутации Asn-158 в таком остатке, как Asp, или путем мутации Thr-160 в Ala. С применением этих молекулярных признаков в качестве направляющей основы в настоящем примере впервые продемонстрировано количественное переключение связывания ГА Н5 на рецепторы человека.

[00225] После описания РСС ГА Н5 в отношении признаков, отличающих его от РСС ГА Н2, полная последовательность ГА Н5 (2959 полноразмерных неизбыточных последовательностей из базы GISAID EpiFlu (platform.gisaid.org/epi3/)) была исследована на предмет указанных признаков, взамен поисков специфических отличительных признаков адаптивных к организму человека мутаций, описанных в предыдущих исследованиях (Stevens et al., 2008, J Mol Biol, 381:1382; Russell et al., 2012, Science, 336:1541; Neumann et al., 2012, PLoS pathogens, 8:e1002932; Maines et al., 2011, Virology, 413:139).

[00226] Указанные результаты этого анализа (ФИГ. 4) сделали возможным отслеживание указанных признаков в контексте естественной эволюции ГА Н5 и представили следующие четыре ключевых наблюдения: 1) ГА Н5 из многих современных птичьих и человеческих изолятов (после 2007 года) уже приобрели делецию в петле-130 и, следовательно, стали близки к соответствию Признаку 1, 2) некоторые из указанных штаммов также приобрели такие замены в петле-220, как мутации Asn-224→Lys и Ser221→Pro, и, следовательно, стали близки к соответствию Признаку 2, 3) ключевые аминокислотные замены уже были обнаружены в "спирали-190", конкретно по положениям 188, 192 и 193, что увеличивает близость к соответствию Признаку 3, и 4) потерю гликозилирования по положению 158 (Признак 4) также обнаружили во многих последовательностях ГА Н5, начиная с 1959 года. В контексте указанных ключевых структурных признаков РСС ГА, указанная делеция в петле-130 с одновременной потерей гликозилирования (Признаки 1 и 4) в одном и том же ГА стали важнейшим изменением, обнаруженным в эволюции ГА Н5 за счет дальнейшей диверсификации последовательностей клады 2 после 2007 года (ФИГ. 4А). Значительный рост процента изолятов, обладающих указанными ключевыми признаками, имел место, начиная с их возникновения в 2007 году. Филогенетический анализ последовательностей указанных изолятов демонстрирует их принадлежность кладе 2.1.1. Относительно меньший процент изолятов H5N1 приобрел аминокислотные замены в "спирали-190", приблизившись к соответствию Признаку 3 РСС Н2 (ФИГ. 4В), и эти изоляты принадлежат кладе 7 (Davis et al., 2010, Avian diseases, 54:307). Примечательно, что мы обнаружили, что указанная потеря гликозилирования сопутствует делеций в петле-130, но не наоборот. Эти данные свидетельствуют о том, что специфические современные штаммы ГА Н5 не только значительно дивергировали с более старыми человеческими изолятами (такими как Viet04), но и приобрели также ключевые молекулярные признаки, необходимые для соответствия РСС ГА пандемического Н2.

[00227] На основании отслеживания молекулярных признаков сквозь естественную эволюцию последовательностей ГА Н5, ГА разных клад и периодов времени выбрали для валидации нашего подхода. ГА Viet04 были наиболее далеки в отношении соответствия признакам и, следовательно, согласно прогнозам требуют наибольшего числа мутаций для соответствия признакам для переключения. Другие ГА выбрали либо из клады 2.2.1, либо из клады 7, которые гораздо в большей степени близки к РСС ГА Н2 в контексте соответствия признакам и, следовательно, согласно прогнозам требуют гораздо меньшего числа мутаций для переключения связывания на рецепторы человека. Формы дикого типа и мутантные формы указанных ГА систематически генерировали и рекомбинантно экспрессировали и их гликан-связывающие свойства оценили в дозозависимом анализе непосредственного связывания (25). Полученные результаты приведены в таблице 2.

[00228] Как и предсказывала модель, описанная в настоящем примере, 13 аминокислотных замен, введенных для полного соответствия Признакам 1,2 и 3 (включая объединение сети меж-остатковых взаимодействий), при введении во Viet04 (V2.3 в таблице 2) количественно переключает его связывание на рецептор человека, если сравнивать с диким типом (ФИГ. 5). Аффинность связывания V2.3 с рецептором человека, количественно определенная с помощью константы Kd' видимого связывания, описанной ранее (Srinivasan et al., 2008, Proc Natl Acad Sci, 105:2800) (Kd' ~ 3 пМ), была представлена в том же диапазоне, что и рассчитанная для ГА H1N1 (Srinivasan et al., 2008, Proc Natl Acad Sci, 105:2800). В то время как частично соответствующие одному или двум признакам, таким как Признак 2 (Gln-226→Leu/Gly-228→Ser) и 4 (Thr-160→Ala) (V2.1 в таблице 2), демонстрировали значительно возросшее связывание с рецепторами человека, этот мутант также сохранял высокую аффинность связывания с рецептором птиц, что не является характеристикой количественного переключения. Соответствие Признаку 2 также исследовали с помощью альтернативной стратегии улучшения меж-остатковых и РСС-гликановых контактов, включая петлю-220, путем введения мутаций Gln-226→Leu/Asn-224→Lys в контексте соответствия Признаку 4 (Thr-160→Ala (V2.2 в таблице 2)). Указанные мутанты демонстрируют очень низкое гликан-рецепторное связывание, и потому было невозможно определить аффинность связывания для определения его как количественного переключения. Таким образом, в настоящем примере и в случае клады 1 таким ГА, как Viet04, для количественного переключения может потребоваться соответствие как минимум трем Признакам.

[00229] Среди ГА клады 2.2.1 для дальнейших исследований был выбран современный человеческий изолят A/Egypt/N03450/2009 (or Egy09), так как он был признан лучшим репрезентативным штаммом в 2.2.1 благодаря его высокой степени подобия последовательности консенсусной последовательности клады 2.2.1. В ГА Egy09 уже были делеция в петле-130 и потеря гликозилирования по положению 158, в результате чего он соответствовал Признакам 1 и 4 (таблица 2). Кроме того, диаграмма СРСС, включающая Glu-131, Ser-133 и Thr-155 в ГА Egy09, была идентична соответствующей диаграмме, содержащей Thr-131, Thr-133 и Thr-155 в ГА Alb58 (диаграмма СРСС не показана). Параллельно, диаграмма СРСС, включающая остатки Ala-188 и Thr-192 в Egy09 были подобны соответствующей диаграмме, включающей остатки Glu-188 и Arg-192 в ГА РСС Н2. В результате, в соответствии с прогнозом анализа "соответствия признакам" в настоящем примере ГА Egy09 требовал меньше аминокислотных замен для соответствия всем четырем Признакам (Е4.2 в таблице 2) для количественного переключения его связывания на рецепторы человека (ФИГ. 6А и 6В). Аффинность Е4.2 к человеческим рецепторам количественно определили с помощью Kd'~25 пМ. Соответствие Признаку 2 благодаря альтернативной стратегии введения Gln-226→Leu и Asn224→Lys в Egy09, которая привела к образованию мутанта ГА, в котором достигнуто соответствие признакам 1, 2 и 4 (Е4.3), который также демонстрировал видимое количественное переключение связывания с рецепторов птиц на рецепторы человека (ФИГ. 6С). Аффинность связывания Е4.3 с рецептором человека составляла ~50 пМ. Таким образом, даже в случае клады 2.2.1 соответствие 3 из 4 признаков количественно переключало его предпочтительное связывание на рецепторы человека. Кроме того, РСС Egy09, по-видимому, эволюционировал таким образом, что всего двух аминокислотных замен было достаточно для соответствия 3 из 4 признаков для достижения переключения связывания с характеристическим рецептором человека, необходимого для передачи вируса.

[00230] В свете нашего успеха в приведении в соответствие признаку 2 с помощью всего двух аминокислотных замен в Egy09 и того факта, что Asn-224→Lys обнаружили в нескольких современных изолятах H5N1, мы стремились определить, появилась ли указанная мутация в природе в какой-либо из последовательностей ГА клады 2.2.1. В результате этого поиска среди отобранных последовательностей мы выбрали другой ГА клады 2.2.1 - ГА A/duck/Egypt/10185SS/2010 (Egy10), которому потребуется только замена Gln→226 Leu для соответствия 3 из 4 признаков. В соответствии с этим прогнозом Egy10 требуется только единичная мутация спаренных оснований, приводящая к замене Gln-226→Leu для количественного переключения его предпочтительного связывания на рецепторы человека с константой аффинности связывания Kd'~100 пМ (ФИГ. 6D) образом, сходным с пандемическим ГА 2009 H1N1, и Egy10 преодолевает необходимый порог для передачи вируса (ФИГ. 1).

[00231] Среди ГА клады 7 выбрали chicken/Vietnam/NCVD-093/08 (ckViet08), так как он был признан лучшим представителем указанной клады и уже приобрел аминокислотные замены в "петле-190" конкретно по положениям 188, 192 и 193, что приближает его к соответствию Признаку 3 РСС ГА Н2. В этом ГА систематические аминокислотные замены для соответствия Признаку 1 (введение делеций в петлю-130 и мутации Leu-133→Thr), Признаку 2 (LS + Ser137→Arg), Признаку 3 (Asn-187→Asp and Met-193→Thr), и Признаку 4 (потеря гликозилирования по положению 158) количественно переключает его предпочтительное связывание на рецепторы человека (V4.3 в таблице 2).

[00232] Таким образом, с помощью нового подхода для определения молекулярных признаков, характеризующих РСС ГА Н5, этот пример демонстрирует, что ГА из определенных современных изолятов H5N1 клады 2.2.1 требует всего одну аминокислотную мутацию Gln226→Leu для количественного переключения его связывания на рецептор человека. Подход, описанный в настоящем примере, подчеркивает необходимость анализа признаков РСС, которые будут количественно переключать связывание на рецептор человека. Как явствует из указанного подхода для ГА Н5, существуют различные способы приведения в соответствие признаков РСС, и количество требуемых для адаптации к организму человека аминокислотных замен представляет собой вариабельный параметр, который в существенной степени зависит от естественной эволюции последовательности ГА Н5. В самом деле, когда одни и те же аминокислотные замены, делающие возможной аэрогенную передачу вируса Ind05 у хорьков, ввели в репрезентативный ГА клады 2.2.1, были обнаружены кардинально другие свойства связывания с гликанами (ФИГ. 7). Кроме того, соответствующий только Признаку 2 (мутации Asn-224→Lys и Gly226→Leu) и Признаку 4 в отсутствие делеций в петле-130 ГА клады 1, такой как Viet04, демонстрировал по существу низкие сигналы связывания с гликанами. Эти данные подчеркивают важность предложенного в настоящем изобретении подхода, захватывающего признаки РСС в контексте эволюции ГА Н5, вместо простого применения конкретных аминокислотных замен, описанных для Viet04 (Imai et al., 2012, Nature, 486:420) или Ind05 (Herfst et al., 2012, Science, 336:1534), в качестве отправной точки для адаптации к организму человека всех ГА Н5.

[00233] Филогенетический анализ ГА Н5, которые естественно приобрели Признаки 1 и 4, показал, что они принадлежат кладе 2.2.1, а те ГА, которые приобрели Признак 3, принадлежат кладе 7. Стоит отметить, что ГА из штаммов, принадлежащих к указанным кладам, близки к адаптации к организму человека. Важно отметить, что, помимо Ser137→Arg, Gln226→Leu и Gly228→Ser, все остальные аминокислотные замены - а также делеция в петле-130 - были обнаружены в H5N1 (в более современных штаммах после 2006), а также эти замены выдержали эволюцию последовательности ГА H5N1. Таким образом, одна предполагаемая стратегия надзора, описанная в настоящем примере, может включать мониторинг совместного возникновения этих замен в циркулирующих в настоящее время ГА Н5. Следует отметить, что большинство современных попыток мониторинга сосредоточены в азиатской части материка (Китай, Вьетнам, Таиланд). Тем не менее, все человеческие изоляты H5N1, принадлежащие кладе 2.2.1, происходят из Египта и Израиля. Важным будет тщательный мониторинг эволюции штаммов клады 2.2.1 и клады 7. Большая часть внимания, сосредоточенного на адаптации H5N1 к организму человека, и стратегий вакцинации была сосредоточена вокруг штаммов 2003-2006 гг. Пять одобренных в настоящее время человеческих вакцин против H5N1 для клинического применения также созданы на основании штаммов более ранних клад.

[00234] В настоящем примере использовали показатель, который сравнивает антигенную идентичность между ГА (Tharakaraman, K. et al.; рукопись подана для печати) для соотнесения антигенной идентичности с кросс-реактивным нейтрализующим антисывороточным ответом у хорьков. Данный анализ показал, что низкая антигенная идентичность коррелирует со скудной перекрестной защитой. Продолжив данный анализ, мы показали, что штаммы 2003-2006 гг., такие как Viet04 и Ind05, имеют общую низкую идентичность с кладой 2.2.1 и кладой 7. Следовательно, одобренные в настоящее время человеческие вакцины против H5N1 едва ли эффективно защищают от инфицирования формами дикого типа и мутантными формами штаммов клады 2.2.1 и клады 7, описанными в настоящем исследовании. Результаты нашего подхода предлагают идеи, которые могут быть значимы при наблюдении эволюции современных штаммов H5N1, а также могут расширить существующие стратегии вакцинации для лучшей пре-пандемической подготовки на случай возможной вспышки H5N1 в человеческой популяции.

Материалы и методы

Клонирование, синтез бакуловирусов, экспрессия и очистка ГА

[00235] Последовательности ГА дикого типа и варианта ГА кодон-оптимизировали для экспрессии в клетках насекомых и синтезировали на DNA2.0 (Menlo Park, СА). Синтезированные гены затем субклонировали в плазмиде pAcGP67A, и с помощью системы Baculogold (BD Biosciences, San Jose, СА) в соответствии с инструкцией производителя получали бакуловирусы. Затем рекомбинантные бакуловирусы использовали для инфицирования клеток суспензионной линии Sf9, культивированных в BD Baculogold Мах-ХР SFM (BD Biosciences, San Jose, СА). За указанной инфекцией наблюдали и на 3-4 день после инфицирования собирали кондиционированную среду. Растворимый ГА из собранной кондиционированной среды очищали с помощью аффинной хроматографии с никелем (колонки HisTrap HP, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Элюированные фракции, содержащие ГА, объединяли, концентрировали, и буфер в них заменяли на IX фосфатно-солевой буфер (PBS) с рН 8,0 (Gibco) с использованием центрифужных колонок 100K MWCO (Millipore, Billerica, MA). Количество очищенного белка оценивали способом с применением бицинхониновой кислоты (ВСА) (Pierce).

[00236] Указанный ген подвергали оптимизации кодонов для экспрессии у млекопитающих, синтезировали (DNA2.0, Menlo Park, СА) и субклонировали в модифицированном векторе pcDNA3.3 для экспрессии под контролем промотора CMV. Рекомбинантную экспрессию ГА проводили в суспензионной культуре клеток HEK 293-F FreeStyle (Invitrogen, Carlsbad, СА), культивируемой в экспрессионной среде 293-F FreeStyle Expression Medium (Invitrogen, Carlsbad, СА), поддерживаемой при температуре 37°С, влажности 80% и 8% СО2. Клетки трансфецировали с помощью полиэтиленимина Max (PEI-МАХ, PolySciences, Warrington, РА) плазмидой, содержащей ген ГА, и собирали на седьмой день после инфицирования. Супернатант отделяли центрифугированием, фильтровали через 0.45 мкм фильтровальную систему (Nalgene, Rochester, NY) дополняли разведенным в соотношении 1:1000 коктейлем ингибиторов протеаз (Calbiochem), фильтровали и дополняли разведенным в соотношении 1:1000 коктейлем ингибиторов протеаз (EMD Millipore, Billerica, MA). ГА очищали от супернатанта с помощью колонок His-trap (GE Healthcare) в системе AKTA Purifier FPLC. Элюированные фракции, содержащие ГА, объединяли, концентрировали и буфер в них заменяли на IX PBS рН 7.4 с помощью центрифужных колонок 100K MWCO (Millipore, Billerica, MA). Количество очищенного белка оценивали способом ВСА (Pierce, Rockford, IL).

[00237] В настоящем примере применяли обе системы экспрессию Важно отметить, что при сравнении гликан-связывающих свойств ГА, полученного из бакуловируса, с ГА из материала, полученного путем экспрессии у млекопитающих, не обнаружили никаких отличий.

Гомологичное моделирование ГА

[00238] Структурную модель тримера ГА Alb58 построили с помощью программного обеспечения для гомологичного моделирования MODELLER. Для построения указанной модели в качестве шаблона использовали найденную (solved) кристаллическую структуру гемагглютинина A/Singapore/1/57c рецептором человека (PDB: 2WR7), имеющего последовательность H1, на 99% идентичную Alb58. В ходе моделирования лиганд (рецептор человека) скопировали из структуры шаблона в структуру модели. Окончательную модель минимизировали для избавления от внутренних ограничений.

Дозозависимое непосредственное связывание ГА дикого типа и варианта ГА с гликанами рецептора ГА.

[00239] Для исследования мультивалентных взаимодействий ГА-гликан использовали описанный ранее покрытую стрептавидином матрицу, содержащую репрезентативные биотинилированные α2→3 и α2→6-. 3'SLN, 3'SLN-LN, 3'SLN-LN-LN LN представляют собой репрезентативные рецепторы птицы. 6'SLN и 6'SLN-LN представляют собой репрезентативные рецепторы человека. LN соответствует лактозамину (Galβl-4GlcNAc), и 3'SLN и 6'SLN соответственно соответствуют Neu5Acα2-3 и Neu5Acα2-6, связанным с LN. Биотинилированные гликаны были получены в Консорциуме функциональной гликомики (Consortium of Functional Glycomics) через их программу запроса ресурсов. Покрытые стрептавидином 384-луночные планшеты с высокой емкостью связывания (Streptavidin-coated High Binding Capacity 384-well plates (Pierce)) загрузили на всю емкость каждой лунки путем инкубирования лунок с 50 мкм 2.4 мкМ биотинилированных гликанов в течение ночи при 4°С. Избыток гликанов удалили тщательной отмывкой в PBS. Тримерное звено ГА состоит из трех мономеров ГА (и, соответственно, содержит три РСС, по одному для каждого мономера). Пространственное расположение биотинилированных гликанов в лунках покрытой стрептавидином матрицы благоприятствует связыванию только с одним из трех указанных мономеров ГА тримерного звена ГА. Таким образом, в целях специфичного увеличения мультивалентности взаимодействий ГА-гликан рекомбинантные белки ГА предварительно связаны в комплексы с первичными и вторичными антителами в мольном соотношении, составляющем 4:2:1 (ГА:первичные:вторичные). Идентичное для всех ГА расположение 4 тримеров ГА в прекомплексе допускает сравнение между их аффинностями связывания с гликанами. Исходный раствор, содержащий соответствующие количества меченного гистидином белка ГА, первичных антител (IgG мыши против 6Х His-метки, Abeam) и вторичных антител (HRP-конъюгированные IgG козла против мыши, Santacruz Biotechnology) в соотношении 4:2:1, инкубировали на льду в течение 20 мин. Соответствующие количества прекомплексированного стокового ГА доводили до 250 мкл с помощью 1% BSA в PBS. 50 мкл указанного прекомплексированного ГА добавляли в каждую из покрытых гликаном лунок и инкубировали при комнатной температуре в течение 3 ч. с последующими стадиями отмывки в PBS и PBST (1X PBS + 0.05% Tween-20). Сигнал связывания определяли на основании активности HRP с использованием набора тест-системы с пероксидазой и индикатором Amplex Red (Amplex Red Peroxidase Assay kit (Invitrogen, CA)) в соответствии с инструкцией производителя. Эксперименты повторяли трижды. Минимальный сигнал связывания наблюдали в выборках отрицательного контроля, включающих связывание предварительно связанных в комплексы единиц с лунками без гликанов и связывание антител отдельно с лунками с гликанами. Параметры связывания, согласованность (n) и константа видимого связывания (Kd'), для связывания ГА-гликан рассчитали путем аппроксимирования значения среднего сигнала связывания (из трижды проведенного анализа) и концентрации ГА для линеаризованной формы уравнения Хилла:

в котором у представляет собой частичное насыщение (средний сигнал связывания/максимальный наблюдаемый сигнал связывания). В целях сравнения значений Kd', значения, указанные в настоящем исследовании, соответствуют соответствующим репрезентативным птичьему (3'SLN-LN or 3'SLN-LN-LN) и человеческому (6'SLN-LN) рецепторам, для которых была получена лучшее соответствие указанному выше уравнению и такое же значение наклона (n ~ 1,3).

[00240] Как отмечали выше, при сравнении гликан-связывающих свойств ГА, полученного из бакуловируса, с ГА из материала, полученного путем экспрессии у млекопитающих, не обнаружили никаких отличий.

Определение структуры сети остатков РСС (СРСС).

[00241] Координаты комплексов рецептор ГА Н5 птиц и ГА Alb58-рецептор человека загружали на сервер PDBePISA (http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html) для определения ключевых остатков в РСС ГА, которые вступают в контакт с соответствующими гликановыми рецепторами (применяли усечение интерфейса на 30%). Для указанных остатков окружение определяли, используя порог расстояния, составляющий 7 Ả, и контакты, включающие предполагаемые водородные связи (включая водные мостики), дисульфидные связи, пи-связи, полярные взаимодействия, солевые мостики, Ван-дер-ваальсовы взаимодействия (неводородные), возникающие между парами остатков в пределах указанного порогового расстояния, вычисленного как было описано ранее (Soundararajan et al., 2011, Sci. Rep., 1). Эти данные собирали в массив из восьми матриц атомных взаимодействий. Затем рассчитывали взвешенную сумму указанных восьми матриц атомных взаимодействий для получения единой матрицы, которая учитывает силу атомных взаимодействий между парами остатков в пределах РСС с использованием значений, полученных из относительных энергий атомных взаимодействий (Soundararajan et al., 2011, Sci. Rep., 1). Сеть взаимодействий между остатками, вычисленная таким образом, генерирует матрицу, описывающую все контакты, в которые вступают ключевые остатки РСС с пространственно близкими соседними остатками в их окружении. Каждый элемент i, j представляет собой сумму оценок ветви всех ветвей между остатками i и j. Уровень оценки разветвленности сети для каждого остатка вычисляли путем суммирования по строкам матрицы, которые должны были соответствовать степени "разветвленности сети" для каждого остатка. Уровень оценки разветвленности сети нормировали (оценка СРСС) с максимальной оценкой для каждого белка, так что оценки варьировали от 0 (отсутствие какой-либо сети) до 1 (максимальная сеть).

Анализ последовательности ГА Н5 и оценка ключевых признаков

[00242] В общей сложности 6014 последовательностей ГА Н5 были загружены из базы данных EpiFlu. Из них рассматривали только те последовательности, которые имели законченные кодирующие области, включающие старт- и стоп-кодоны. В целях предотвращения ошибок вследствие многообразия представленных последовательностей все группы идентичных последовательностей из набора данных представляли посредством старейшей последовательности из группы. Оставшиеся 2959 последовательностей упорядочили по времени выделения, выровняли и рассчитали скорость возникновения каждого признака (определенную как процентную долю последовательностей данного года, содержащих указанный признак).

1. Модифицированный полипептид для лечения или предотвращения инфекции гриппа А, последовательность которого по меньшей мере на 95% идентична последовательности референсного гемагглютинина H5 (ГА H5) или последовательности его соответствующего участка, при этом указанный референсный ГА H5 выбран из группы, состоящей из: ГА вируса гриппа A/Egypt/N03450/2009 (“Egy09”) дикого типа и ГА вируса гриппа A/duck/Egypt/ 10185S S/2010 (“Egy 10”), и

причём последовательность указанного полипептида дополнительно содержит:

a) первый признак, который представляет собой делецию аминокислоты, соответствующей аминокислоте в петле референсного ГА H5, включающей остатки 127-136 (петля-130), согласно канонической системе нумерации по H3;

b) второй признак, который представляет собой Lys224 + Leu226;

c) третий признак, выбранный из группы, состоящей из:

(i) Asp187 + Arg193 и

(ii) Arg193; и

d) четвёртый признак, выбранный из группы, состоящей из:

(i) Ala160 и

(ii) Asn158 + Ala160;

при этом положения аминокислот в указанных признаках соответствуют положениям, указанным для референсного ГА H5, и

причём указанный модифицированный полипептид ГА характеризуется большей предпочтительностью связывания с α-2-6-гликанами, чем с α-2-3-гликанами, по сравнению с предпочтительностью, которую демонстрирует референсный ГА Н5.

2. Полипептид по п. 1, где длина указанного полипептида составляет от 98 до 400 аминокислот, включительно.

3. Полипептид по п. 1, где длина указанного элемента последовательности пептида составляет от 98 до 230 аминокислот, включительно.

4. Модифицированный полипептид для лечения или предотвращения инфекции гриппа А, последовательность которого по меньшей мере на 95% идентична последовательности референсного гемагглютинина H5 (ГА H5) или последовательности его соответствующего участка, при этом указанный референсный ГА H5 представляет собой Egy09, и причём последовательность указанного полипептида дополнительно содержит:

a) первый признак, который представляет собой делецию аминокислоты, соответствующей аминокислоте в петле референсного ГА H5, включающей остатки 127-136 (петля-130), согласно канонической системе нумерации по H3;

b) второй признак, который представляет собой Lys224 + Leu226;

c) третий признак, выбранный из группы, состоящей из:

(i) Asp187 + Arg193 и

(ii) Xaa193; и

d) четвёртый признак, который представляет собой Аsn158 + Ala160,

при этом положения аминокислот в указанных признаках соответствуют положениям, указанным для референсного ГА H5, и причём указанный модифицированный полипептид ГА характеризуется большей предпочтительностью связывания с α-2-6-гликанами, чем с α-2-3-гликанами, по сравнению с предпочтительностью, которую демонстрирует референсный ГА Н5.

5. Модифицированный полипептид для лечения или предотвращения инфекции гриппа А, последовательность которого по меньшей мере на 95% идентична последовательности референсного гемагглютинина H5 (ГА H5) или последовательности его соответствующего участка, при этом указанный референсный ГА H5 представляет собой Egy09, и причём последовательность указанного полипептида дополнительно содержит:

a) первый признак, который представляет собой делецию аминокислоты, соответствующей аминокислоте в петле референсного ГА H5, включающей остатки 127-136 (петля-130), согласно канонической системе нумерации по H3;

b) второй признак, который представляет собой Lys224 + Leu226;

c) третий признак, который представляет собой Asp187 + Arg193; и

d) четвёртый признак, который представляет собой Аsn158 + Ala160,

при этом положения аминокислот в указанных признаках соответствуют положениям, указанным для референсного ГА H5, и причём указанный модифицированный полипептид ГА характеризуется большей предпочтительностью связывания с α-2-6-гликанами, чем с α-2-3-гликанами, по сравнению с предпочтительностью, которую демонстрирует референсный ГА Н5.

6. Модифицированный полипептид для лечения или предотвращения инфекции гриппа А, последовательность которого по меньшей мере на 95% идентична последовательности референсного гемагглютинина H5 (ГА H5) или последовательности его соответствующего участка, при этом указанный референсный ГА H5 представляет собой Egy10, и причём последовательность указанного полипептида дополнительно содержит:

а) первый признак, который представляет собой делецию аминокислоты, соответствующей аминокислоте в петле референсного ГА H5, включающей остатки 127-136 (петля-130), согласно канонической системе нумерации по H3;

b) второй признак, который представляет собой Lys224 + Leu226;

c) третий признак, который представляет собой Asp187 + Arg193; и

d) четвёртый признак, который представляет собой Ala160,

при этом положения аминокислот в указанных признаках соответствуют положениям, указанным для референсного ГА H5, и причём указанный модифицированный полипептид ГА характеризуется большей предпочтительностью связывания с α-2-6-гликанами, чем с α-2-3-гликанами, по сравнению с предпочтительностью, которую демонстрирует референсный ГА Н5.

7. Композиция вакцины для лечения или предотвращения инфекции гриппа А, содержащая в эффективном количестве по меньшей мере один антиген, который представляет собой полипептид по любому из пп. 1, 4-6 или часть указанного полипептида и фармацевтически приемлемый носитель.

8. Композиция вакцины по п. 7, где длина указанного полипептида составляет от 98 до 400 аминокислот, включительно.

9. Композиция вакцины по п. 7, где длина указанного элемента последовательности пептида составляет от 98 до 230 аминокислот, включительно.

10. Способ получения композиции вакцины по п. 7, включающий:

обеспечение эффективного количества по меньшей мере одного антигена, представляющего собой полипептид по любому из пп. 1, 4-6 или часть указанного полипептида; и

приготовление указанного обеспеченного по меньшей мере одного антигена в виде композиции вакцины.

11. Способ по п. 10, согласно которому длина указанного полипептида составляет от 98 до 400 аминокислот, включительно.

12. Способ по п. 10, согласно которому длина указанного элемента последовательности пептида составляет от 98 до 230 аминокислот, включительно.

13. Диагностический набор для определения пандемической опасности штамма вируса гриппа А H5, содержащий по меньшей мере одно антитело, специфично связывающееся с полипептидом по любому из пп. 1, 4-6, или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела, и инструкции, причём указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела получены с применением модифицированного полипептида по любому из пп. 1, 4-6.

14. Диагностический набор по п. 13, где длина указанного полипептида составляет от 98 до 400 аминокислот, включительно.

15. Диагностический набор по п. 13, где длина указанного элемента последовательности пептида составляет от 98 до 230 аминокислот, включительно.

16. Диагностический набор по п. 13, где указанный полипептид по п. 1 не гликозилирован по положению, соответствующему положению 158 референсной последовательности.

17. Диагностический набор по п. 13, дополнительно содержащий антитело, связывающееся с референсным ГА H5, не инфицирующим человека.

18. Способ определения присутствия и/или количества вируса гриппа А, обладающего инфективным для человека ГА H5, в образце, который включает:

a) получение образца из источника с подозрением на содержание вируса гриппа;

b) приведение указанного образца в контакт с одним или более агентом, специфически связывающимся с полипептидом ГА H5 по любому из пп. 1-6;

c) детектирование связывания указанного агента с указанным образцом и, таким образом, определение наличия и/или количества вируса гриппа, обладающего указанным ГА H5 в указанном образце,

причём указанный один или более агент получен с применением модифицированного полипептида по любому из пп. 1-6, и при этом указанный один или более агент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или аптамер.

19. Способ по п. 18, согласно которому указанный источник представляет собой источник из окружающей среды.

20. Способ по п. 18, согласно которому указанный источник представляет собой пациента-человека.

21. Способ по п. 18, согласно которому указанные стадии получения, приведения в контакт и детектирования повторяют по меньшей мере один раз через некоторый промежуток времени после того, как указанные первые стадии получения, приведения в контакт и детектирования были завершены.

22. Способ по п. 18, дополнительно включающий приведение в контакт образца из указанного источника с одним или более агентом, специфически связывающимся с ГА H5, не инфицирующим человека.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и иммунологии, и заключается в модификации теста для in vitro диагностики туберкулезного плеврита. Данный тест основан на определении числа мононуклеарных клеток плевральной жидкости, продуцирующих интерферон-гамма в ответ на стимуляцию антигенами Mycobacterium tuberculosis.

Изобретение относится к области медицины, а именно иммунологии, и может быть использовано для лечения и профилактики иммунозависимых болезней с хроническим воспалительным синдромом.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая антитело или антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающееся с ИЛ-21, конъюгат для ингибирования функциональной активности ИЛ-21, содержащий вышеуказанное антитело, фармацевтическую композицию для лечения или профилактики аутоиммунного заболевания или расстройства или реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD), ассоциированной с ИЛ-21, способ лечения или профилактики аутоиммунного заболевания или расстройства у субъекта, способ определения уровней экспрессии ИЛ-21 и способ лечения или профилактики реакции «трансплантат против хозяина», ассоциированной с ИЛ-21.

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической диагностике, и может быть использовано для неинвазивной оценки интенсивности апоптотических процессов у больных сахарным диабетом 1 типа.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, гинекологии, перинатологии и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики поражения центральной нервной системы плода при срочных родах при беременности, осложненной гестационным сахарным диабетом.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно онкологии и клинической биохимии, и предназначена для ранней диагностики почечно-клеточной карциномы. Способ диагностики почечно-клеточной карциномы включает определение наличия в сыворотке крови антител к зрительному аррестину - аррестину 1.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования развития туберкулеза у здоровых людей. Способ прогнозирования развития туберкулеза у здоровых людей, заключающийся в проведении комплекса иммунологических исследований у лиц с положительными результатами иммунологических тестов, при этом в образцы подготовленной плазмы крови добавляют туберкулезные антигены ESAT-6/SFP-1, затем способом динамического светорассеяния проводят определение и анализ образовавшихся иммунных комплексов и их изотипов и при содержании IgG3, IgE, IgG1+IgG3, IgG3+IgE, IgG1+IgE выше 1,0% устанавливают риск развития туберкулеза.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения активности системы комплемента по классическому пути в тесте коагуляции фибриногена, включающий использование сыворотки крови человека в качестве источника комплемента и обработанной 9,1% поливинилпирролидоном с молекулярной массой 35000 цитратной плазмы в качестве источника протромбинового комплекса с фактором XII и фибриногеном.

Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики или мониторинга почечной функции у индивидуума, включающего определение уровня проэнкефалина или его фрагментов в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, которое выполняют более одного раза у одного индивидуума, и установление корреляции уровня последующего измерения проэнкефалина или его фрагментов с почечной функцией у индивидуума, где относительное снижение указанного уровня в течение последующего измерения является прогностическим для улучшения почечной функции у индивидуума или где относительное повышение указанного уровня в течение последующего измерения является прогностическим для ухудшения почечной функции у индивидуума и где указанную общую воду организма выбирают из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, мочу, спинномозговую жидкость (СМЖ) и слюну.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано при прогнозировании летального исхода при гипертензионно-гидроцефальном синдроме у доношенных новорожденных с врожденной цитомегаловирусной инфекцией.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложена нуклеиновая кислота для получения белка гемагглютинина (НА) гриппа типа B в растении, содержащая регуляторную область, активную в растении, и энхансер экспрессии, активный в растении, причем регуляторная область и энхансер экспрессии функционально связаны с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный гемагглютинин гриппа типа В (НА), причем в модифицированном НА между субъединицами НА1 и НА2 полностью удалена протеолитическая петля, при этом протеолитическая петля содержит одноосновный или многоосновный сайт расщепления, при этом нуклеиновая кислота не содержит длинную межгенную область вируса желтой карликовости бобов (BeYDV LIR) и короткую межгенную область BeYDV (BeYDV SIR), а также предложены способ получения модифицированного белка, клетка и растение, экспрессирующие модифицированный белок.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения вакцинного антигена вируса гриппа, включающий стадию фрагментирования биологической мембраны, связанной с данным вакцинным антигеном путем приведения данной биологической мембраны в контакт по меньшей мере с одним каликсареном, где вирус гриппа выбран из вирусов гриппа A и вирусов гриппа B, дополнительно включающий стадию диализа вакцинного антигена; вакцину против вируса гриппа, включающую эффективное количество вакцинного антигена вируса гриппа, полученного способом, по любому из пп.

Изобретение относится к биохимии. Описано выделенное антитело или его связывающий фрагмент, способные связываться с гемагглютинином вируса гриппа А и нейтрализовать по меньшей мере один подтип группы 1 и по меньшей мере 1 подтип группы 2 вируса гриппа A, которые содержат HCDR1 с последовательностью SEQ ID NO:113, HCDR2 с последовательностью SEQ ID NO:114, HCDR3 с последовательностью SEQ ID NO:115, LCDR1 с последовательностью SEQ ID NO:118, LCDR2 с последовательностью SEQ ID NO:119 и LCDR3 с последовательностью SEQ ID NO:120.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу продуцирования вирусоподобной частицы (VLP) в растении, а также к способу индукции иммунного ответа к вирусу гриппа подтипа В или НЗ у субъекта и способу получения композиции для индукции иммунного ответа к вирусу гриппа подтипа В или Н3 у субъекта с его использованием.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модифицированным гемагглютининам (ГА) вируса гриппа, и может быть использовано в медицине при получении лекарственного средства для лечения или предотвращения инфекции, вызванной вирусом гриппа Н5.

Представленные изобретения относятся, в частности, к гибридному белку, содержащему вариант нуклеопротеидного антигена из штамма вируса гриппа типа А, содержащий точечные мутации Е339А и R416A, слитый с вариантом домена олигомеризации С4bр курицы, в частности IMX313T и IMX313P.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения вирусоподобных частиц (VLP) в растении, который включает введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, и функционально связанную с химерной нуклеотидной последовательностью, в растение или часть растения, последующую инкубацию растения или его части в условиях, обеспечивающих экспрессию нуклеиновой кислоты с получением VLP.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены рекомбинантный полипептид гемагглютинин (НА) вируса гриппа для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H3N2, молекула нуклеиновой кислоты, его кодирующая, и вектор экспрессии, слитый белок и вирусоподобная частица (VLP), содержащие указанный полипептид НА, и выделенная клетка для выработки и экспрессии указанной VLP, а также композиция, содержащая указанные полипептид, VLP и слитый белок, и способ вызова иммунного ответа в отношении вируса гриппа H3N2.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены рекомбинантный полипептид гемагглютинин (НА) вируса гриппа для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H5N1, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 2-568 SEQ ID NO: 1, кодирующая его нуклеиновая кислота, содержащие предложенный полипептид слитый белок и вирусоподобная частица (VLP) для вызова ответа на вирус гриппа H5N1, вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, и выделенная клетка, его содержащая, композиция и способ вызова иммунного ответа против вируса гриппа H5N1, а также способ иммунизации субъекта.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описано получение оптимизированных полипептидов HA вируса гриппа H1N1, вызывающих иммунный ответ с широким спектром активности в отношении изолятов вируса гриппа H1N1.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложена нуклеиновая кислота для получения белка гемагглютинина (НА) гриппа типа B в растении, содержащая регуляторную область, активную в растении, и энхансер экспрессии, активный в растении, причем регуляторная область и энхансер экспрессии функционально связаны с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный гемагглютинин гриппа типа В (НА), причем в модифицированном НА между субъединицами НА1 и НА2 полностью удалена протеолитическая петля, при этом протеолитическая петля содержит одноосновный или многоосновный сайт расщепления, при этом нуклеиновая кислота не содержит длинную межгенную область вируса желтой карликовости бобов (BeYDV LIR) и короткую межгенную область BeYDV (BeYDV SIR), а также предложены способ получения модифицированного белка, клетка и растение, экспрессирующие модифицированный белок.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен модифицированный полипептид для лечения или предотвращения инфекции гриппа А, последовательность которого по меньшей мере на 95 идентична последовательности референсного гемагглютинина H5 или последовательности его соответствующего участка, при этом указанный референсный ГА H5 выбран из группы, состоящей из ГА вируса гриппа AEgyptN034502009 дикого типа и ГА вируса гриппа AduckEgypt 10185S S2010. Изобретение может быть использовано для лечения или предотвращения гриппа в медицине. 8 н. и 14 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 1 пр.

Наверх