Конъюгат лиганда с цитотоксическим лекарственным средством, способ его получения и применение

Изобретение относится к конъюгату лиганда с цитотоксическим лекарственным средством общей формулы PC-L-D, способу его получения и содержащим его фармацевтическим композициям для получения лекарственных средств для лечения рака. 7 н. и 11 з.п. ф-лы, 5 таб., 53 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее описание относится к новому виду конъюгата лиганда с цитотоксическим лекарственным средством, в частности, оно относится к конъюгату лиганда с цитотоксическим лекарственным средством, способу его получения, содержащей его фармацевтической композиции и применению конъюгата лиганда с цитотоксическим лекарственным средством или фармацевтической композиции.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Химиотерапия остается одним из важнейших противораковых средств, включающих хирургию, радиотерапию и таргетную терапию. Хотя существует множество типов высокоэффективных цитотоксинов, слабая способность этих агентов различать опухолевые и здоровые клетки ограничивает их более широкое применение в клинической практике в связи с токсическими побочными эффектами. Терапевтические антитела стали важным классом биологических противораковых средств благодаря их способности к специфичному связыванию с опухолеассоциированными антигенами. Хотя этот важный класс биологических препаратов можно применять в качестве монотерапии для лечения рака, их терапевтическая эффективность часто ограничена.

В конъюгатах антитела с лекарственным средством (ADC) моноклональное антитело или фрагмент антитела объединены с биологически активным цитотоксином посредством химически стабильного линкера, что позволяет в полной мере реализовать преимущество специфичности связывания антитела с поверхностными антигенами нормальной клетки и опухолевой клетки и высокой эффективности цитотоксина, при этом избежав низкой эффективности антитела и токсических побочных эффектов цитотоксина. Поэтому по сравнению с традиционными химиотерапевтическими лекарственными средствами конъюгаты антитела с лекарственным средством могут правильно распознавать опухолевые клетки и уменьшить вредное воздействие на нормальные клетки.

В более ранних ADC в основном использовали моноклональные антитела, и поэтому некоторым из лекарственных средств было трудно достичь своей мишени из-за иммунного ответа человека. Во-вторых, ранее применяемые эффекторные молекулы, такие как доксорубицин, проявляют низкую биологическую активность, что ограничивает эффективность конъюгатов антителоа с лекарственным средством первого поколения. Кроме того, источник антитела, путь и число линкерных соединений не были оптимизированы.

Кадсила^® (адо-трастузумаб эмтанзин, T-DM1) был утвержден Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США (U.S. FDA) в феврале 2013 г. для лечения пациентов с HER2-положительным прогрессирующим или метастатическим раком молочной железы, резистентным к трастузумабу (Трастузумаб, торговое название: Герцептин®) и паклитакселу. Препараты Милотарг® и Адцетрис® применяют в таргетной терапии против геморрагических кист, тканевая структура которых является относительно простой по сравнению с солидными опухолями. Кадсила® является первым лекарственным препаратом ADC, утвержденным FDA для лечения солидных опухолей.

В препарате Кадсила® высокоактивный митотический ингибитор DM1 связан с трастузумабом компании Roche при помощи технологии от ImmunoGen при среднем соотношении антитела и лекарственного средства приблизительно 3,5. Трастузумаб специфично связывается с раковыми клетками молочной железы у пациента. После эндоцитоза высвобождается DM1, и концентрация DM1 в клетках достаточна для уничтожения клеток посредством митотической катастрофы. T-DM1 поддерживает ингибиторный эффект Герцептина® в отношении антителозависимой клеточной пролиферации, повышая при этом потенциальный эффект цитотоксических лекарственных средств. Поскольку его токсин высвобождается внутрь опухолевых клеток, его побочный эффект не увеличивается по мере увеличения лечебного эффекта.

Пертузумаб (также известный как 2С4, торговое название Перджета) представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело, которое является первым моноклональным антителом, известным как «ингибитор димеризации HER». Пертузумаб блокирует димеризацию HER2 с другими рецепторами HER за счет связывания с HER2. Показано, что пертузумаб ингибирует рост опухоли при раке предстательной железы с гиперэкспрессией или низкой экспрессией HER2.

В отличие от трастузумаба (торговое название Герцептин), который ингибирует биохимический путь нисходящей передачи сигнала посредством связывания с сайтами, локализованными во внеклеточном домене проксимальной области субдомена IV HER2, пертузумаб может эффективно ингибировать гетеродимеризацию HER2 посредством связывания с доменом II (доменом димеризации). Таким образом, трастузумаб может оказывать определенное воздействие только на пациентов с раком с гиперэкспрессией HER2, в частности, на пациентов с раком молочной железы, тогда как пертузумаб, характеризующийся той же мишенью и эндоцитозом, что и трастузумаб, за счет отличающегося механизма действия может иметь более широкий диапазон применения, чем лекарственные средства, блокирующие биохимический путь передачи сигнала HER2, поскольку пертузумаб может прерывать биохимический путь передачи сигнала, опосредованный рецепторами семейства ErbB, после ингибирования димеризации.

В настоящее время существует, в основном, два способа связывания лекарственного средства с образованием ADC: один способ, используемый в Т-DM1, представляет собой статистическую конъюгацию между цитотоксическими лекарственными средствами и свободными аминогруппами антител; а другой способ, используемый в препарате Адцетрис®, представляет собой конъюгацию между цитотоксическими лекарственными средствами и свободными тиолами, образующимися в результате восстановления шарнирной области антитела. В результате обоих способов связывания получают смесь с неравномерным содержанием лекарственного средства. Например, хотя среднее содержание лекарственного средства T-DM1 составляет 3,5, распределение содержания лекарственного средства находится в диапазоне от 0 до 8. Низкое содержание лекарственного средства может влиять на эффективность ADC, в то время как высокое содержание лекарственного средства может вызвать распознавание и разрушение лекарственного средства ADC тканевой макрофагальной системой. Это не только сокращает период полувыведения ADC, но также увеличивает токсические побочные эффекты за счет накопления лекарственного средства в нецелевой ткани. В препарате Адцетрис® для восстановления дисульфидной связи в шарнирной области антитела был использован восстанавливающий агент, который мог повлиять на стабильность самого антитела. Родственные ADC раскрыты в документах WO 2007008603, WO 2013173393, WO 2005081711, WO 2013173391, WO 2013173392, WO 2013173393 и WO 2012010287. В настоящем изобретении предложено новое соединение ADC, которое характеризуется новым путем связывания и новой комбинацией токсина и антитела и, следовательно, обладает более выгодными эффектами.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

С целью усовершенствования лиганда, в частности, эффекта связывания между антителом и лекарственным средством, в настоящем изобретении предложено соединение формулы (PC-L-Dr), содержащее усовершенствованный линкер, или его фармацевтически приемлемая соль или сольват:

где:

каждый из R, R²-R⁷ выбран из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена, гидроксила, циано, алкила, алкокси и циклоалкила;

по меньшей мере один из R⁸-R¹¹ выбран из группы, состоящей из атома галогена, алкенила, алкила и циклоалкила, а остальные R⁸-R¹¹ представляют собой атомы водорода;

или любые два из R⁸-R¹¹ присоединены друг к другу с образованием циклоалкила, и каждый из остальных двух выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила и циклоалкила;

каждый из R¹²-R¹³ выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила и атома галогена;

R¹⁴ выбран из арила или гетероарила, где арил или гетероарил необязательно замещен одной или более групп, выбранных из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена, гидрокси, алкила, алкокси и циклоалкила;

у равно 1-8, предпочтительно 2-5; у представляет собой положительное действительное число, которое может представлять собой целое число или десятичную дробь;

PC представляет собой лиганд; L представляет собой линкер.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения соединение формулы (PC-L-Dr) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват представляет собой соединение формулы (PC-L-D) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

где R²-R¹⁴ являются такими, как определено для формулы (PC-L-Dr).

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения соединение формулы (PC-L-Dr) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват представляет собой соединение формулы (PC-L'-Dr) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

где:

R¹⁵ выбран из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена, гидроксила, циано, алкила, алкокси и циклоалкила;

R¹⁶ выбран из группы, состоящей из алкила, циклоалкила, алкокси и гетероциклила;

n равно 2-6, предпочтительно 2-5;

m равно 0-5, предпочтительно 1-3;

PC, у, n, R, R²-R¹⁴ являются такими, как определено для формулы (PC-L-Dr).

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения соединение формулы (PC-L-Dr) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват представляет собой соединение формулы (PC-L'-D) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

где:

R¹⁵, R¹⁶, m являются такими, как определено для формулы (PC-L'-Dr);

PC, у, n, R, R²-R¹⁴ являются такими, как определено для формулы (PC-L-Dr).

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения соединение формулы (PC-L'-D) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват представляет собой соединение формулы (PC-L'-D1) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

где PC, у, n, m, R²-R¹⁶ являются такими, как определено для формулы (PC-L'-D).

Конъюгаты лиганда с цитотоксическим лекарственным средством по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются указанным:

или их фармацевтически приемлемую соль или сольват.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложено соединение формулы (PC-L-Dr), где PC представляет собой антитело, предпочтительно выбранное из пертузумаба, нимотузумаба и трастузумаба.

Типичные конъюгаты лиганда с цитотоксическим лекарственным средством по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются указанным:

или их фармацевтически приемлемую соль или сольват.

Другой аспект данного изобретения относится к соединению формулы (Dr):

или к его таутомеру, мезомеру, рацемату, энантиомеру, диастереомеру или их смесям, либо к их фармацевтически приемлемым солям, которое может применяться в качестве промежуточного соединения при получении соединения формулы (PC-L-Dr):

где:

каждый из R, R¹-R⁷ выбран из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена, гидроксила, циано, алкила, алкокси и циклоалкила;

по меньшей мере один из R⁸-R¹¹ выбран из группы, состоящей из атома галогена, алкенила, алкила и циклоалкила, а остальные R⁸-R¹¹ представляют собой атомы водорода;

или любые два из R⁸-R¹¹ присоединены друг к другу с образованием циклоалкила, каждый из остальных двух выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила и циклоалкила;

каждый из R¹²-R¹³ выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила и атома галогена;

R¹⁴ выбран из арила или гетероарила, где арил и гетероарил необязательно замещены одной или более группами, выбранными из групп, состоящих из атома водорода, атома галогена, гидрокси, алкила, алкокси и циклоалкила.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения соединение формулы (Dr) представляет собой соединение формулы (D) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

или его таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смеси, либо его фармацевтически приемлемые соли, где R¹-R¹⁴ являются такими, как определено для формулы (Dr).

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения соединение формулы (Dr) представляет собой соединение формулы (D1):

или его таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смеси, либо его фармацевтически приемлемые соли, где R¹-R¹⁴ являются такими, как определено для формулы (D).

Типичные соединения для получения конъюгата лиганда с цитотоксическим лекарственным средством по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются указанным:

Другой аспект настоящего изобретения относится к соединению формулы (L1-Dr):

которое может применяться в качестве промежуточного соединения при получении соединения формулы (PC-L'-D):

где:

n равно 2-6, предпочтительно 2-5;

каждый из R, R¹-R⁷ выбран из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена, гидроксила, циано, алкила, алкокси и циклоалкила;

по меньшей мере один из R⁸-R¹¹ выбран из группы, состоящей из атома галогена, алкенила, алкила и циклоалкила, а остальные R⁸-R¹¹ представляют собой атомы водорода;

или любые два из R⁸-R¹¹ присоединены друг к другу с образованием циклоалкила, каждый из остальных двух выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила и циклоалкила;

каждый из R¹²-R¹³ выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила и атома галогена;

R¹⁴ выбран из арила и гетероарила, где арил или гетероарил необязательно замещены одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена, гидрокси, алкила, алкокси и циклоалкила.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения соединение формулы (L₁-Dr) представляет собой соединение формулы (L₁-D):

где n, R²-R¹⁴ являются такими, как определено для формулы (L₁-Dr).

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения соединение формулы (L₁-D) представляет собой соединение формулы (L₁-D1):

где n, R¹-R¹² являются такими, как определено для формулы (L₁-D).

Типичные пролекарства (с линкером) и промежуточные соединения для получения конъюгата лиганда с цитотоксическим лекарственным средством по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются указанным:

Другой аспект данного изобретения относится к соединению формулы (PC-L₂):

где

PC представляет собой лиганд, предпочтительно антитело, более предпочтительно выбранное из пертузумаба, нимотузумаба и трастузумаба;

R¹⁵ выбран из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена, гидроксила, циано, алкила, алкокси и циклоалкила;

R¹⁶ выбран из группы, состоящей из алкила, циклоалкила, алкокси и гетероциклила;

m равно 0-5, предпочтительно 1-3;

X равно 0-5, предпочтительно 1-3; X представляет собой положительное действительное число, включающее десятичные дроби и целые числа.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения соединение формулы (PC-L₂) выбрано из группы, состоящей из:

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения соединения формулы (PC-L₂), включающему стадии:

1) PC и соединение формулы (PC-L2-A) подвергают взаимодействию в присутствии восстанавливающего агента RA с получением соединения формулы (PC-L2-B); где RA предпочтительно представляет собой цианоборгидрид натрия или триацетоксиборгидрид натрия, более предпочтительно цианоборгидрид натрия;

2) к соединению формулы (PC-L2-B) добавляют агент удаления защиты для удаления защитной группы Т тиольной группы с получением соединения формулы (PC-L2),

где:

Т выбран из группы, состоящей из Н, трет-бутила, ацетила, н-пропионила, изопропионила, трифенилметила, метоксиметила и 2-(триметилсилил)этоксиметила, предпочтительно Н или ацетила;

соединение формулы (PC-L2-A) предпочтительно представляет собой S-(3-карбонилпропил)тиоацетат;

PC, R¹⁵, R¹⁶, m и x являются такими, как определено для формулы (PC-L2).

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения соединения формулы (PC-L'-D), включающему стадии:

соединение формулы (PC-L2) подвергают взаимодействию с соединением формулы (L1-D1) с получением соединения формулы (PC-L'-D);

где PC, m, n, у, R²~R¹⁶ являются такими, как определено для формулы (PC-L'-D).

Настоящее изобретение дополнительно относится к соединению формулы (D-Aa):

или к его таутомеру, мезомеру, рацемату, энантиомеру, диастереомеру или их смесям, либо к их фармацевтически приемлемым солям, которое может применяться в качестве промежуточного соединения для синтеза типичных промежуточных соединений конъюгата лиганда с лекарственным средством ADC по настоящему изобретению,

где:

любые два из R⁸-R¹¹ присоединены друг к другу с образованием циклоалкила, каждый из остальных двух необязательно выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила и циклоалкила;

R¹² выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила и атома галогена;

Р представляет собой атом водорода или защитную группу, и защитная группа предпочтительно представляет собой Boc, Bn, Cbz, наиболее предпочтительно Boc;

R^a выбран из группы, состоящей из гидрокси, амино, алкокси, циклоалкокси и алкиламино.

Настоящее изобретение дополнительно относится к соединению формулы (D-Aa), которое представляет собой соединение формулы (D-A):

или к его таутомеру, мезомеру, рацемату, энантиомеру, диастереомеру или их смесям, либо к их фармацевтически приемлемым солям, которое может применяться в качестве промежуточного соединения для синтеза типичных соединений-пролекарств конъюгата лиганда с лекарственным средством ADC по настоящему изобретению,

где:

любые два из R⁸-R¹² и Р присоединены друг к другу с образованием циклоалкила, каждый из остальных двух необязательно выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила и циклоалкила;

R' выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила и циклоалкила.

Промежуточные соединения (D-Aa) или (D-A) типичного соединения-пролекарства конъюгата лиганда с лекарственным средством ADC по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются указанным:

Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество конъюгата лиганда с цитотоксическим лекарственным средством формулы (PC-L-Dr), формулы (PC-L'-D) или соединения формулы (Dr), формулы (L1-Dr), формулы (D), формулы (L1-D) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, как описано выше, и фармацевтически приемлемые носители, разбавители или вспомогательные вещества.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению конъюгата лиганда с цитотоксическим лекарственным средством формулы (PC-L-Dr), формулы (PC-L'-D) или соединения формулы (Dr), формулы (L1-Dr), формулы (D), формулы (L1-D) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, как описано выше, или содержащей его фармацевтической композиции при получении лекарственного препарата для лечения рака, где рак ассоциирован с экспрессией HER2, HER3 или EGFR.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения рака у млекопитающих, включающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества конъюгата лиганда с цитотоксическим лекарственным средством формулы (PC-L-Dr), формулы (PC-L'-D) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата или соединения формулы (Dr), формулы (L1-Dr), формулы (D), формулы (L1-D) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, как описано выше, или содержащей его фармацевтической композиции, где рак ассоциирован с экспрессией HER2, HER3 или EGFR.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению конъюгата лиганда с цитотоксическим лекарственным средством формулы (PC-L-Dr), формулы (PC-L'-D) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата или соединения формулы (Dr), формулы (L1-Dr), формулы (D), формулы (L1-D) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, как описано выше, или содержащей его фармацевтической композиции при получении препарата для лечения рака у млекопитающих, где млекопитающее представляет собой человека, рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичника, рака желудка, рака эндометрия, рака слюнной железы, рака легкого, рака ободочной кишки, рака почки, колоректального рака, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, острого лимфоцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, острого промиелоцитарного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рецидивирующей анапластической крупноклеточной лимфомы, предпочтительно рака молочной железы, лимфомы Ходжкина или рецидивирующей анапластической крупноклеточной лимфомы; более предпочтительно рака молочной железы, ассоциированного с экспрессией HER2.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения рака у млекопитающих, включающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества конъюгата лиганда с цитотоксическим лекарственным средством формулы (PC-L-Dr), формулы (PC-L'-D) или соединения формулы (Dr), формулы (L1-Dr), формулы (D), формулы (L1-D) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, как описано выше, или содержащей его фармацевтической композиции где млекопитающее представляет собой человека, рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичника, рака желудка, рака эндометрия, рака слюнной железы, рака легкого, рака ободочной кишки, рака почки, колоректального рака, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, острого лимфоцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, острого промиелоцитарного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рецидивирующей анапластической крупноклеточной лимфомы, предпочтительно рака молочной железы, лимфомы Ходжкина или рецидивирующей анапластической крупноклеточной лимфомы; более предпочтительно рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2 уровня 2+ или выше, наиболее предпочтительно рака молочной железы, ассоциированного с экспрессией HER2.

В настоящем изобретении нет необходимости в восстановлении шарнирной области антитела. Звено L, содержащее свободные меркапто группы, связывается с аминогруппами N-концевых аминогрупп и/или остатка лизина антитела. Таким образом, уменьшается влияние на структуру антитела, и структура связи углерод-азот стабильна, с трудом поддается разрушению при циркуляции в организме. За счет дополнительного контроля условий реакции содержание лекарственного средства может распределяться в диапазоне 0~5.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, соответствуют общепринятому пониманию средних специалистов в области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя настоящее изобретение можно осуществлять на практике или тестировать с использованием любого из способов и материалов, аналогичных или эквивалентных описанным в данном документе, в данном документе описаны предпочтительные способы и материалы. Следующие термины используются для описания и защиты настоящего изобретения в соответствии со следующими определениями.

При использовании торгового названия в настоящем изобретении подразумевается, что включено получение продукта под этим торговым названием, дженерик или активная часть лекарственного средства продукта.

Если не указано иное, термины, используемые в описании и формуле изобретения, имеют значения, приведенные ниже.

«Алкил» относится к насыщенной алифатической углеводородной группе, включающей С₁-С₂₀ неразветвленные и разветвленные группы. Предпочтительно, алкильная группа представляет собой алкил, имеющий от 1 до 12 атомов углерода, более предпочтительно от 1 до 10 атомов углерода, и наиболее предпочтительно алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода. Типичные примеры включают, но не ограничиваются указанным, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 1-этил-2-метил пропил, 1,1,2-триметилпропил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2,3-диметилбутил, н-гептил, 2-метилгексил, 3-метилгексил, 4-метилгексил, 5-метилгексил, 2,3-диметилпентил, 2,4-диметилпентил, 2,2-диметилпентил, 3,3-диметилпентил, 2-этилпентил, 3-этилпентил, н-октил, 2,3-диметилгексил, 2,4-диметилгексил, 2,5-диметилгексил, 2,2-диметилгексил, 3,3-диметилгексил, 4,4-диметилгексил, 2-этилгексил, 3-этилгексил, 4-этилгексил, 2-метил-2-этилпентил, 2-метил-3-этилпентил, н-нонил, 2-метил-2-этилгексил, 2-метил-3-этилгексил, 2,2-диэтилпентил, н-децил, 3,3-диэтилгексил, 2,2-диэтилгексил и их изомеры разветвленных цепей. Более предпочтительно, алкильная группа представляет собой низший алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода. Типичные примеры включают, но не ограничиваются указанным, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 1-этил-2-метилпропил, 1,1,2-триметилпропил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2,3-диметилбутил и т.д. Алкильная группа может быть замещенной или незамещенной. Когда она замещена, группа(-ы) заместителя может (могут) быть замещена(-ы) в любой подходящей точке присоединения, и предпочтительно группа(-ы) заместителя представляет(-ют) собой одну или более групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкилоксила, алкилсульфо, алкиламино, атома галогена, тиола, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклического алкокси, циклоалкилтио, гетероциклического алкилтио, оксо группы.

«Циклоалкил» относится к насыщенной и/или частично ненасыщенной моноциклической или полициклической углеводородной группе, имеющей от 3 до 20 атомов углерода, предпочтительно от 3 до 12 атомов углерода, более предпочтительно от 3 до 10 атомов углерода и наиболее предпочтительно от 3 до 8 атомов углерода. Неограниченные примеры моноциклического циклоалкила включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогексадиенил, циклогептил, циклогептатриенил, циклооктил и т.п. Полициклический циклоалкил включает циклоалкил, имеющий спиро кольцо, конденсированное кольцо или мостиковое кольцо.

«Гетероциклил» относится к от 3- до 20-членной насыщенной и/или частично ненасыщенной моноциклической или полициклической углеводородной группе, имеющей один или более гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S(O)_m (где m представляет собой целое число, выбранное из 0-2), в качестве кольцевых атомов, но исключая -O-O-, -O-S- или -S-S- в кольце, и остальные кольцевые атомы представляют собой атомы углерода. Предпочтительно гетероциклил имеет от 3 до 12 атомов, где от 1 до 4 являются гетероатомами, более предпочтительно от 3 до 10 атомов. Неограниченные примеры моноциклического гетероциклила включают, но не ограничиваются указанным, пирролидинил, пиперидил, пиперазинил, морфолинил, тиоморфолинил, гомопиперазинил и т.п. Полициклический гетероциклил включает гетероциклил, имеющий спиро кольцо, конденсированное кольцо или мостиковое кольцо.

Указанный гетероциклил может быть конденсирован с арилом, гетероарилом или циклоалкилом, где кольцо, связанное с исходной структурой, представляет собой гетероциклил. Неограниченные примеры включают, но не ограничиваются указанным:

Гетероциклил может быть необязательно замещенным или незамещенным. Когда он замещен, группа(-ы) заместителя предпочтительно представляет(-ют) собой одну или более групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, атома галогена, тиола, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклического алкокси, циклоалкилтио, гетероциклилтио, оксо.

«Арил» относится к от 6- до 14-членной полностью углеродной моноциклической кольцевой или полициклической конденсированной кольцевой (т.е. каждое кольцо в системе имеет общую пару соседних атомов углерода с другим кольцом в системе) группе, имеющей полностью конъюгированную пи-электронную систему; предпочтительно от 6- до 10-членному арилу, более предпочтительно фенилу и нафтилу и наиболее предпочтительно фенилу. Арил может быть конденсирован с гетероарилом, гетероциклилом или циклоалкилом, где кольцо, связанное с исходной структурой, представляет собой арил. Неограниченные примеры включают, но не ограничиваются указанным:

Арил может быть необязательно замещенным или незамещенным. Когда он замещен, группа(-ы) заместителя предпочтительно представляет(-ют) собой одну или более групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, атома галогена, тиола, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклического алкокси, циклоалкилтио, гетероциклилтио.

«Гетероарил» относится к арильной системе, имеющей от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из О, S и N, и имеющей от 5 до 14 кольцевых атомов. Предпочтительно, гетероарил является от 5- до 10-членным, более предпочтительно 5- или 6-членным, например фурил, тиенил, пиридил, пирролил, N-алкилпирролил, пиримидинил, пиразинил, имидазолил, тетразолил и т.д. Гетероарил может быть конденсирован с кольцом арила, гетероциклила или циклоалкила, где кольцо, связанное с исходной структурой, представляет собой гетероарил. Типичные примеры включают, но не ограничиваются указанным:

и .

Гетероарильная группа может быть замещенной или незамещенной. Когда она замещена, группа(-ы) заместителя предпочтительно представляет(-ют) собой одну или более групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилсульфо, алкиламино, атома галогена, тиола, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклического алкокси, циклоалкилтио, гетероциклического алкилтио.

«Алкокси» относится к группе -О-(алкил) или -O-(незамещенный циклоалкил), где алкил или циклоалкил являются такими, как определено выше. Неограниченные примеры включают метокси, этокси, пропокси, бутокси, циклопропилокси, циклобутилокси, циклопентилокси, циклогексилокси и т.д. Алкокси может быть необязательно замещенным или незамещенным. Когда он замещен, группа(-ы) заместителя предпочтительно представляет(-ют) собой одну или более групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, атома галогена, тиола, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклического алкокси, циклоалкилтио, гетероциклилтио.

«Алкиламино» относится к группе -N-(алкил) или -N-(незамещенный циклоалкил), где алкил или циклоалкил являются такими, как определено выше. Неограниченные примеры алкиламиногрупп включают метиламино, этиламино, пропиламино, бутиламино, циклопропиламино, циклобутиламино, циклопентиламино, циклогексиламино. Алкиламиногруппа может быть необязательно замещенной или незамещенной, и, когда она замещена, группа(-ы) заместителя предпочтительно представляет(-ют) собой одну или более групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, атома галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклоалкилтио.

Термин «связь» относится к ковалентной связи, представленной как «-».

«Гидрокси» относится к группе -ОН.

«Атом галогена» относится к атому фтора, хлора, брома или йода.

«Алкоксикарбонил» относится к группе -С(O)O(алкил) или (циклоалкил), где алкил или циклоалкил являются такими, как определено выше.

«Необязательный» или «необязательно» означает, что описанное впоследствии событие или обстоятельство может, но не должно, наступить, и такое описание включает ситуацию, где это событие или обстоятельство может либо наступить, либо не наступить. Например, «гетероциклическая группа, необязательно замещенная алкилом», означает, что алкильная группа может, но не должна присутствовать, и такое описание включает ситуацию, где гетероциклическая группа замещена алкилом и где гетероциклическая группа не замещена алкилом.

«Замещенный» относится к одному или более атомам водорода в группе, предпочтительно до 5, более предпочтительно от 1 до 3 атомов водорода, независимо замещенным соответствующим числом заместителей. Понятно, что заместители существуют только в их химически возможном положении. Специалист в данной области техники способен определить возможность или невозможность замещения путем экспериментов или теории, не прилагая слишком больших усилий. Например, когда группа амино или гидрокси, имеющая свободный атом водорода, связана с атомами углерода, имеющими ненасыщенные связи (такие как олефиновые связи), она может быть нестабильной.

«Фармацевтическая композиция» относится к смеси одного или более соединений в соответствии с настоящим изобретением или их физиологически/фармацевтически приемлемых солей или пролекарств и других химических компонентов, таких как физиологически/фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества. Цель фармацевтической композиции состоит в том, чтобы облегчить введение соединения в организм и абсорбцию активного ингредиента и, следовательно, проявление его биологической активности.

«Фармацевтически приемлемые соли» относятся к солям конъюгатов лиганда с цитотоксическим лекарственным средством по изобретению, которые являются безопасными и эффективными для млекопитающих и обладают желаемой биологической активностью. Конъюгированное соединение антитела с лекарственным средством по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну аминогруппу и, следовательно, может образовать соль с кислотой. Неограниченные примеры фармацевтически приемлемых солей включают гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, сульфат, бисульфат, цитрат, ацетат, сукцинат, аскорбат, оксалат, нитрат, сорбат, гидрофосфат, дигидрофосфат, салицилат, гидроцитрат, тартрат, малеат, фумарат, формиат, бензоат, мезилат, этансульфонат, бензолсульфонат, пара-толуолсульфонат.

«Сольват» относится к фармацевтически приемлемому сольвату, образованному в результате взаимодействия соединения лиганда с лекарственным средством по настоящему изобретению с одной или более молекулой растворителя. Неограниченные примеры молекул растворителей включают молекулы воды, этанола, ацетонитрила, изопропанола, ДМСО, этилацетата.

«Лиганд» относится к макромолекулярному соединению, способному к распознаванию и связыванию с антигеном или рецептором, ассоциированным с клеткой-мишенью. Роль лиганда состоит в доставке лекарственного средства в целевую популяцию клеток, которые связываются с лигандом. Такие лиганды включают, но не ограничиваются указанным, белковые гормоны, лектины, факторы роста, антитела или другие молекулы, которые связываются с клетками. В одном воплощении настоящего изобретения лиганд выражен как PC, предпочтительно антитело, и лиганд может образовать связь с линкером посредством гетероатома на лиганде.

«Конъюгат лиганда с лекарственным средством» относится к лиганду, связанному с биологически активным цитотоксином посредством химически стабильного линкерного соединения. В одном воплощении настоящего изобретения лиганд предпочтительно представляет собой антитело, и «конъюгат лиганда с лекарственным средством» предпочтительно представляет собой конъюгат антитела с лекарственным средством (ADC), который относится к соединению моноклонального антитела или фрагмента антитела с биологически активным цитотоксином посредством химически стабильного линкерного соединения.

«Антиген или рецептор» может быть идентифицирован лигандом и связан с клеткой-мишенью. Предпочтительные лиганды в настоящем изобретении представляют собой те антигены или рецепторы клеточной поверхности, которые экспрессируются на клетках и/или тканях-мишенях пролиферативных заболеваний, таких как рак. Неограниченные примеры рецептора клеточной поверхности выбраны из рецепторов клеточной поверхности HER2, HER3, HER4, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, Lewis Y, CD56, CD105, VEGFR или GPNMB; наиболее предпочтительно выбраны из рецепторов клеточной поверхности HER2 или EGFR. Конкретным предпочтительным неограниченным примером является трастузумаб, который специфично связывается с мишенью HER2; или пертузумаб, который специфично связывается с мишенью HER2; или нимотузумаб, который специфично связывается с мишенью EGFR.

«Антитело» относится к любой форме антитела, проявляющей желаемую биологическую активность. Таким образом, этот термин используется в его самом широком смысле, в частности, включающем, но не ограничивающимся указанным, полноразмерные антитела, связывающие фрагменты или производные антител. Источники антител включают, но не ограничиваются указанным, моноклональные антитела, поликлональные антитела, антитела, сконструированные методами генной инженерии (например, биспецифические антитела).

«Полноразмерное антитело» относится к молекуле иммуноглобулина (например, IgM), содержащей четыре полипептидных цепи, т.е. две тяжелых цепи и две легких цепи, которые поперечно сшиты дисульфидными связями с образованием полимера. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и константную область тяжелой цепи, и константная область тяжелой цепи содержит три домена: СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (VL) и константную область легкой цепи, и константная область легкой цепи содержит один домен (CL1). Области VH и VL могут быть дополнительно разделены на гипервариабельные области, обозначаемые термином области, определяющие комплементарность (CDR), и более консервативные домены, расположенные между областями комлементарности, называемые каркасными областями (FR).

«Связывающий фрагмент или производное антитела» включает любой полипептид или гликопротеин, который может специфично связываться с антигеном с образованием комплекса, который имеет природное происхождение или получен ферментативным, синтетическим путем или методами генной инженерии. Он обычно содержит по меньшей мере часть антигенсвязывающей области или вариабельной области (например, один или более CDR) исходного антитела и сохраняет по меньшей мере некоторую связывающую специфичность исходного антитела. «Связывающие фрагменты или производные антитела» могут быть образованы из антител, например, в результате преобразования полноразмерного антитела с помощью подходящих стандартных методов, включая протеолитические или рекомбинантные методы генной инженерии (включающие манипуляции с ДНК, экспрессирующей вариабельные области и частично константные области антитела, и ее экспрессию. «Связывающий фрагмент или производное антитела» включает, но не ограничивается указанным,: (i) Fab фрагменты; (ii) F(ab')₂ фрагменты; (iii) Fd фрагменты; (iv) Fv фрагменты; (v) одноцепочечные Fv (scFv); (vi) dAb фрагменты; и (vii) минимальную рекогниционную единицу (например, изолированная область, определяющая комплементарность (CDR)), которая имитирует аминокислотный остаток гипервариабельной области антитела. Другие генно-инженерные молекулы, такие как двухвалентные антитела, трехвалентные антитела, четырехвалентные антитела и микроантитела, также входят в объем «связывающих фрагментов или производных антител».

«Fab фрагмент» состоит из полноразмерных функциональных областей VH и СН1 легкой и тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab не способна образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи.

Область «Fc» содержит два фрагмента тяжелой цепи, содержащих домены антитела СН1 и СН2. Два фрагмента тяжелой цепи удерживаются вместе двумя или более дисульфидными связями и гидрофобными эффектами посредством домена СН3.

«Fab' фрагмент» содержит легкую цепь и функциональные области VH и СН1 тяжелой цепи, а также содержит области между доменами СН1 и СН2, так что межцепочечная дисульфидная связь может быть образована между двумя тяжелыми цепями двух Fab' фрагментов с образованием молекул F(ab')₂.

«Фрагмент F(ab')₂» содержит две легких цепи и две тяжелых цепи, содержащих частичную константную область между доменами СН1 и СН2, так что межцепочечная дисульфидная связь может быть образована между двумя тяжелыми цепями. Таким образом, фрагмент F(ab')₂ образуется двумя фрагментами Fab' посредством межцепочечной дисульфидной связи между двумя тяжелыми цепями.

«Фрагмент Fv» включает функциональную область вариабельной области VH легкой цепи и/или тяжелой цепи.

«Область Fc» соответствует функциональным областям СН2 и СН3 IgG и не обладает антигенсвязывающей активностью, но является сайтом взаимодействия между молекулой антитела и эффекторной молекулой и клеткой.

«Шарнирная область» используется для связывания фрагментов Fab и Fc антитела. В настоящем изобретении она используется для связывания биспецифических слитых белков с фрагментами Fc.

Антитело по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой специфическое антитело к антигену клеточной поверхности клетки-мишени. Неограниченные примеры описаны ниже. Трастузумаб, гуманизированное антитело к HER2 для лечения рака молочной железы, приемлемо для лечения метастатического рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2. Пертузумаб, также известный как 2С4, торговое название Перджета, представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело и является первым моноклональным антителом, известным как «ингибитор димеризации HER», которое сокращает рост опухоли за счет связывания HER2, блокируя димеризацию HER2 с другими рецепторами HER. Показано, что пертузумаб ингибирует рост опухоли при раке предстательной железы с гиперэкспрессией и низкой экспрессией HER2. Пертузумаб утвержден US FDA для лечения HER2-положительного метастатического рака молочной железы. Нимотузумаб представляет собой моноклональное антитело, нацеленное на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), и является гуманизированным моноклональным антителом, которое может применяться для лечения злокачественных опухолей. Гиперэкспрессия EGFR происходит в ряде солидных опухолей, таких как рак головы и шеи, рак легкого, колоректальный рак.

«Цитотоксическое лекарственное средство» относится к химической молекуле, обладающей выраженной способностью к нарушению нормального роста опухолевых клеток. В основном, все цитотоксические лекарственные средства могут уничтожать опухолевые клетки при достаточной высокой концентрации, но в связи с отсутствием специфичности они могут вызвать апоптоз нормальных клеток и вызвать серьезные побочные эффекты при уничтожении опухолевых клеток. В одном воплощении настоящего изобретения цитотоксическое лекарственное средство обозначено как D/D1.

«Линкер» в настоящем изобретении обозначен как L. Он представляет собой химический структурный фрагмент или связь, которые ковалентно связаны с лигандом на одном конце и связаны с цитотоксическим лекарственным средством на другом конце. Структура L в настоящем изобретении показана ниже:

где R¹⁵, R¹⁶, m, n являются такими, как определено для формулы (PC-L'-D).

«Содержание лекарственного средства» относится к среднему числу молекул цитотоксического лекарственного средства, которое несет каждый лиганд в формуле (I), и может быть также выражено в виде отношения числа молекул лекарственного средства к числу молекул антитела. Содержание лекарственного средства может находиться в диапазоне от 1 до 8 молекул цитотоксического лекарственного средства (D) на лиганд (Рс). В одном воплощении настоящего изобретения содержание лекарственного средства выражено как у, а число продуктов лекарственного средства на молекулу ADC после реакции связывания можно определить традиционными способами, такими как спектроскопия в УФ/видимой области, масс-спектрометрия, тестирование с помощью твердофазного иммуносорбентного анализа (ELISA) и характеризация методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

В настоящем изобретении у может быть ограничено числом сайтов связывания. В одном воплощении настоящего изобретения цитотоксическое лекарственное средство связано с N-концевой аминогруппой и/или ε-аминогруппой остатков лизина лиганда посредством линкера. Обычно число молекул лекарственного средства, конъюгированных с антителом в реакции связывания, будет меньше теоретического максимума.

Описанные ниже неограниченные способы можно использовать для контроля содержания конъюгатов лиганда с цитотоксическим лекарственным средством.

(1) контроль молярного отношения связывающего реагента к моноклональному антителу,

(2) контроль времени и температуры реакции,

(3) выбор различных реагентов реакции.

Получение традиционных фармацевтических композиций можно найти в Китайской фармакопее.

«Носитель», используемый в лекарственном препарате по настоящему изобретению, относится к системе, которая может изменить путь поступления и распределение лекарственного средства в организме человека, скорость высвобождения лекарственного средства и доставку лекарственного средства в целевой орган. Системы высвобождения и нацеливания носителя лекарственного средства могут уменьшить деградацию и потерю лекарственного средства, уменьшить побочные эффекты и улучшить биодоступность. Например, полимерные поверхностно-активные вещества (ПАВ), которые можно использовать в качестве носителей, способны к самосборке с образованием различных форм агрегатов за счет своей уникальной амфифильной структуры. Предпочтительными примерами носителей являются такие, как мицеллы, микроэмульсии, гели, жидкие кристаллы, везикулы и т.п. Эти агрегаты обладают способностью к инкапсуляции молекул лекарственного средства, при этом обладая надлежащей способностью к проникновению через мембрану, и могут использоваться в качестве превосходного носителя лекарственного средства.

«Вспомогательное вещество» представляет собой добавку к фармацевтической лекарственной форме, отличающуюся от основного лекарственного средства, которая может также называться адъювантом, такую как адгезивные средства, наполнители, разрыхлители или смазывающие вещества для таблеток; препараты в виде полутвердых мазей; матричные части крема; консерванты, антиоксиданты, корригенты, ароматические вещества, сорастворители, эмульгаторы, солюбилизаторы, регуляторы осмотического давления или красящие вещества для жидких препаратов и т.п.

«Разбавитель», также известный как наполнитель, прежде всего, предназначен для увеличения массы и объема таблетки. Добавление разбавителя не только обеспечивает определенную величину объема, но также уменьшает отклонение дозы основных компонентов, улучшает профиль прессования лекарственного средства. Когда таблетка содержит масляный компонент, к масляному веществу добавляют поглотитель, чтобы сохранить «сухое» состояние для облегчения формования таблеток, такой как крахмал, лактоза, неорганические соли кальция, микрокристаллическая целлюлоза и т.п.

Фармацевтическая композиция может принимать форму стерильного инъекционного водного раствора. Приемлемыми средами и растворителями, которые можно использовать, являются вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Стерильный инъекционный препарат может также представлять собой стерильную инъекционную микроэмульсию масло-в-воде, в которой активный ингредиент растворен в масляной фазе. Например, активный ингредиент можно сначала растворять в смеси соевого масла и лецитина, затем масляный раствор вводят в смесь воды и глицерина с образованием микроэмульсии. Инъекционный раствор или микроэмульсию можно инфузировать в кровоток индивида путем инъекции сосредоточенной массы. Альтернативно, преимуществом может обладать введение инъекционного раствора или микроэмульсии таким путем, чтобы поддерживать постоянную концентрацию в кровообращении настоящего соединения. С целью поддержания такой постоянной концентрации можно использовать устройство непрерывной внутривенной доставки. Примером такого устройства является внутривенная инъекционная помпа Deltec CADD-PLUS™ 5400.

Фармацевтическая композиция может принимать форму стерильной инъекционной водной или масляной суспензии для внутримышечного и подкожного введения. Такая суспензия может быть включена в лекарственную форму с подходящими диспергирующими или увлажняющими агентами, как описано выше, в соответствии с известными методами. Стерильный инъекционный препарат может также представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию, которые готовят в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, раствор готовят в 1,3-бутандиоле. Кроме того, в качестве растворителя или суспензионной среды можно использовать стерильные нелетучие масла. Для этой цели можно использовать любые смешиваемые нелетучие масла, включающие синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, в приготовлении инъекционного препарата можно также использовать жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

«Восстанавливающий агент» представляет собой вещество, которое теряет электроны в окислительно-восстановительной реакции или имеет электронный сдвиг. Восстанавливающий агент в широком смысле представляет собой антиоксидант, который обладает восстанавливающим свойством и может быть окислен, и его продукт называют продуктом окисления. В одном воплощении настоящего изобретения восстанавливающий агент обозначен как RA, и его неограниченные примеры включают H₂, С, СО, Fe, Zn, щелочной металл (обычно используют Li, Na, K), другие активные металлы (такие как Mg, Al, Са, La и т.д.), SnCl₂, щавелевую кислоту, KBH₄, NaBH₄, NaCNBH₃, (CH₃COO)₃BHNa, LiAlH₄, гипофосфорную кислоту, гипофосфит натрия, Na₂SO₃. Предпочтительным восстанавливающим агентом по настоящему изобретению является NaCNBH₃ или (CH₃COO)₃BHNa.

«Меркапто-защитная группа» относится к группе, которая защищает группу меркапто и может быть удалена по окончании реакции так, что реакция протекает только в необходимом положении, тогда как группа меркапто не участвует в реакции с участием химической молекулы, содержащей группы меркапто и другие группы. В одном воплощении настоящего изобретения меркапто-защитная группа обозначена как Т, и ее неограниченные примеры включают -трет-бутил, -ацетил, н-пропионил, -изопропаноил, -трифенилметил, -метоксиметил, -2-(триметилсилил)этоксиметил. Предпочтительной меркапто-защитной группой по настоящему изобретению является ацетил.

СПОСОБ СИНТЕЗА ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Для достижения цели синтеза согласно настоящему изобретению была адаптирована приведенная ниже схема синтеза.

Схема 1

Способ получения соединения формулы (PC-L-DR) согласно настоящему изобретению включает:

Схема 2

Способ получения соединения формулы (PC-L-DR1) согласно настоящему изобретению включает:

Соединение формулы (PC-L2) подвергают взаимодействию с соединением формулы (L1-D1) в растворе ацетонитрила. Соединение формулы (PC-L-DR) получают после обессоливающей очистки на колонке с гелем Sephadex G25;

где PC, m, n, у, R²~R¹⁶ являются такими, как определено для формулы (PC-L-DR).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее настоящее изобретение будет описано с помощью следующих примеров, но эти примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения.

Условия, не указанные в примерах, представляют собой обычные условия, используемые в данной области техники, или условия, рекомендуемые производителями продукции для исходных материалов. Реагенты, которые не указаны, представляют собой традиционные имеющиеся в продаже реагенты.

ПРИМЕРЫ

Структуру соединения идентифицируют методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и/или масс-спектрометрии (МС). Химические сдвиги ЯМР (δ) указаны в 10^-6 (млн^-1). ЯМР определяют на спектрометре Bruker AVANCE-400. Растворители представляют собой дейтерированный диметилсульфоксид (ДМСО-d₆), дейтерированный хлороформ (CDCl₃) и дейтерированный метанол (CD₃OD) с триметилсиланом (TMS) в качестве внутреннего стандарта.

МС определяют с помощью масс-спектрометра FINNIGAN LCQAd (ИЭР, ионизация электрораспылением) (производитель: Thermo, тип: Finnigan LCQ advantage MAX).

Высокоэффективную жидкостную хроматограмму (ВЭЖХ) снимают на спектрофотометре Agilent 1200DAD для высокоэффективного жидкостного хроматографа (хроматографическая колонка Sunfire С18 150×4,6 мм) и спектрометре Waters 2695-2996 для высокоэффективного жидкостного хроматографа (хроматографическая колонка Gimini С18 150×4,6 мм).

Среднюю скорость ингибирования киназы и значения IC₅₀ определяют методом NovoStar ELISA(BMG Co., Германия).

Для тонкослойной хроматографии (ТСХ) используют пластину силикагеля Yantai Huanghai HSGF254 или Qingdao GF254. Размеры пластины силикагеля, используемой в ТСХ, составляют от 0,15 мм до 0,2 мм, а размеры пластины силикагеля, используемой в очистке продукта, составляют от 0,4 мм до 0,5 мм.

В качестве носителя для колоночной хроматографии используют силикагель Yantai Huanghai от 200 до 300 меш.

Известные сырьевые материалы настоящего изобретения получены традиционными способами синтеза в данной области техники или могут быть приобретены у компаний ABCR GmbH & Co. KG, Acros Organnics, Aldrich Chemical Company, Accela ChemBio Inc. или Dari chemical Company и т.д.

Если не указано иное, все реакции можно проводить в атмосфере азота или атмосфере аргона.

Термин «атмосфера азота» или «атмосфера аргона» означает, что реакционная колба оборудована баллоном азота или аргона емкостью 1 л.

Если не указано иное, раствор, используемый в реакциях, относится к водному раствору.

Если не указано иное, в реакциях температура реакции относится к комнатной температуре. Комнатная температура, находящаяся в диапазоне от 20°C до 30°C, является оптимальной температурой реакции.

Приготовление фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ) при pH равном 6,5 в реакции: KH₂PO₄ 8,5 г, K₂HPO₄⋅3H₂O 8,56 г, NaCl 5,85 г, ЭДТА 1,5 г доводили до 2 л в колбе, а затем подвергали ультразвуковой обработке с получением буферного раствора.

Приготовление буферного раствора уксусной кислоты/ацетата натрия при pH равном 4,5 в реакции: 9 г безводного ацетата натрия помещали в колбу, добавляли очищенную воду и доводили до 2 л, затем добавляли 4,9 мл ацетата натрия при перемешивании с получением буферного раствора.

Приготовление фосфатного буферного раствора при pH равном 7,0 в реакции: 39 мл 0,2 М NaH₂PO₄ добавляли к 61 мл 0,2 М Na₂HPO₄ при перемешивании с получением 0,2 М буферного раствора с pH равным 7.

За ходом реакции наблюдали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), где системы элюирования включали: А: дихлорметан и метанол, В: н-гексан и этилацетат, С: петролейный эфир и этилацетат, D: ацетон. Отношение объема растворителя регулировали в соответствии с полярностью соединений.

Системы элюирования для очистки соединений с помощью колоночной хроматографии и тонкослойной хроматографии включали: А: дихлорметан и метанол, В: н-гексан и этилацетат, С: дихлорметан и ацетон, D: этилацетат и дихлорметан, Е: этилацетат, дихлорметан и н-гексан, F: этилацетат, дихлорметан и ацетон. Объемную долю растворителя регулировали в соответствии с полярностью соединения, и в некоторых случаях добавляли небольшое количество щелочного реагента, такого как триэтиламин, или кислого реагента.

Некоторые структуры соединений по настоящему изобретению определяют с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЖХ/МС) на времяпролетном квадрупольном микромасс-спектрометре (Q-TOF). Для ЖХ/МС Q-TOF используют времяпролетный квадрупольный микромасс-спектрометр для точного определения массы Agilent 6530 и ультравысокоэффективный жидкостный хроматограф (УВЭЖХ) Agilent 1290-Infinity (колонка Agilent Poroshell 300SB-C8 5 мкм, 2,1×75 мм).

Известные исходные вещества по настоящему изобретению синтезируют путем адаптации или использования способов, известных в данной области техники, и экспериментальных способов приведенных ниже примеров, которые, если конкретные условия не указаны, проводят в соответствии с традиционными условиями или условиями, рекомендуемыми производителями продукции. Экспериментальные реагенты, для которых конкретные источники не указаны, представляют собой традиционные реагенты, обычно приобретаемые на рынке.

1. Получение антител в качестве промежуточных соединений

Описанные ниже антитела были получены в соответствии с традиционными способами: например, путем конструирования вектора, трансфекции клеток HEK293 (Life Technologies Cat. No. 11625019), очистки и экспрессии.

Последовательности антител

(1) Пертузумаб, способный к специфичному связыванию с мишенью HER2: Последовательность легкой цепи:

Последовательность тяжелой цепи:

(2) Нимотузумаб, способный к специфичному связыванию с мишенью EGFR:

Последовательность легкой цепи:

Последовательность тяжелой цепи:

(3) Трастузумаб, способный к специфичному связыванию с мишенью HER2: Последовательность легкой цепи:

Последовательность тяжелой цепи:

2. Получение лекарственного средства, линкера лекарственного средства, конъюгата лекарственного средства (ADC)

Пример 1

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло [3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

Стадия 1

(1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилат

(4R,5S)-4-метил-5-фенил-3-пропионилоксазолидин-2-он 1b (1,96 г, 9,26 ммоль, получен в соответствии с известным способом Journal of the American Chemical Society, 2003, 125 (50), 15512-15520) растворяли в 25 мл дихлорметана в атмосфере аргона и охлаждали до 0°C. К описанному выше реакционному раствору добавляли по каплям триметиламин (1,49 мл, 10,93 ммоль) и дибутилбора трифторметансульфонат (9,7 мл, 9,72 ммоль), а затем перемешивали в течение 50 мин при 0°C. Полученную в результате смесь охлаждали до -75°C в бане с сухим льдом и ацетоном, затем добавляли 7 мл раствора (1S,3S,5S)-трет-бутил-3-формил-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилата 1а (2,16 г, 9,26 ммоль, получен в соответствии с известным способом US 20100249190) в дихлорметане и перемешивали в течение 1,5 часов при -75°C, затем в течение 2 часов при 0°C, а затем в течение 1 часа при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляли 36 мл смеси фосфатного буферного раствора (pH равно 7,0) и метанола (об./об. 1:3), затем добавляли 36 мл смеси раствора метанола и пероксида водорода (30%) (об./об. 2:1) при 0°C и перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления органической фазы. К остаткам добавляли небольшое количество воды и экстрагировали эфиром (50 мл × 3), последовательно промывали 5% раствором бикарбоната натрия и 150 мл насыщенного раствора хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле системой элюентов В с получением целевого продукта (1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилата 1с (2,4 г, белое вспененное твердое вещество), выход 58,5%.

МС m/z (ИЭР): 345,1 [М-100+1]

Стадия 2

(1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилат

(1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилат 1с (1,4 г, 3,15 ммоль) растворяли в 20 мл дихлорметана и добавляли 1,4 г измельченных молекулярных сит. К смеси добавляли 1,8-бис-диметиламинонафталин (1,75 г, 8,19 ммоль) и триметилоксония тетрафторбор (1,16 г, 7,87 ммоль) при 0°C в атмосфере аргона. Реакционную смесь выдерживали в темноте и перемешивали при комнатной температуре в течение 40 часов. После завершения реакции реакционную смесь фильтровали, и фильтрационный осадок промывали метиленхлоридом. Объединенный фильтрат промывали насыщенным раствором хлорида аммония (50 мл × 4) для удаления избытка 1,8-бис-диметиламинонафталина и промывали насыщенным раствором хлорида натрия (120 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле системой элюентов В с получением целевого продукта (1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-1-метикси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилата 1d (400 мг, белое твердое вещество), выход 27,8%.

МС m/z (ИЭР): 459,4 [М+1]

Стадия 3

(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(трет-бутоксикарбонил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропановая кислота

(1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилат 1d (400 мг, 0,87 ммоль) растворяли в 24 мл тетрагидрофурана и охлаждали до 0°C в атмосфере аргона. Медленно добавляли по каплям 30% пероксид водорода (0,34 мл/0,38 г, 3,31 ммоль), а затем добавляли моногидрат гидроксида лития (62 мг, 1,48 ммоль). Реакционную смесь оставляли для взаимодействия при комнатной температуре на 20 часов. К реакционному раствору добавляли твердый сульфит натрия (440 мг, 3,48 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем добавляли 10 мл воды, и органическую фазу концентрировали при пониженном давлении. Остатки экстрагировали дихлорметаном (40 мл × 2). К отделенной водной фазе добавляли по каплям 2 н. соляную кислоту в ледяной бане, пока раствор не достигал значения pH от 3 до 4. Затем водную фазу экстрагировали этилацетатом (25 мл × 3), и объединенную этилацетатную фазу последовательно промывали водой (50 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (50 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением целевого продукта (2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(трет-бутоксикарбонил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислоты 1е (230 мг, бесцветная жидкость), выход 88,0%.

МС m/z (ИЭР): 200,1 [М-100+1]

Стадия 4

(1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-3-((S)-1-трет-бутокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-иламино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилат

(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(трет-бутоксикарбонил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропановую кислоту 1е (100 мг, 0,334 ммоль) растворяли в 6 мл смешанного растворителя дихлорметана и диметилформамида (об./об. 5:1) и добавляли (S)-трет-бутил-2-амино-3-фенилпропаноат 1f (73,9 мг, 0,334 ммоль, получен в соответствии с известным способом Tetrahedron: Asymmetry, 2006, 17 (4), 603-606), а затем N,N-диизопропилэтиламин (0,29 мл, 67 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (152,3 мг, 0,40 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем добавляли 10 мл воды при перемешивании. Дихлорметановую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле системой элюентов В с получением целевого продукта (1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-3-((S)-1-трет-бутокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-иламино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилата 1g (140 мг, бесцветная вязкая жидкость), выход 83,7%.

МС m/z (ИЭР): 503,3 [М+1]

Стадия 5

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат

(1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-3-((S)-1-трет-бутокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-иламино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилат 1g (140 мг, 0,28 ммоль) растворяли в 2 мл диоксана, а затем добавляли 5,6 М раствор хлорида водорода в диоксане (0,15 мл, 0,835 ммоль). Реакционную систему герметично закрывали, а затем перемешивали в течение 8 часов при комнатной температуре и помещали в холодильник на 12 часов при 0°C. После взаимодействия последовательно добавляли 3 мл дихлорметана, 3 мл воды, 3 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и перемешивали в течение 10 минут. Дихлорметановую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл × 2), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата 1h (86 мг, желтое твердое вещество), выход 76,7%.

МС m/z (ИЭР): 403,4 [М+1]

Стадия 6

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9H-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат 1h (86 мг, 0,213 ммоль), (5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-карбоновую кислоту 1i (136 мг, 0,213 ммоль, получена в соответствии с известным способом WO 2013072813) растворяли в 6 мл смешанного растворителя дихлорметана и диметилформамида (об./об. 5:1), а затем добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,19 мл, 1,065 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (97,4 мг, 0,256 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем добавляли 20 мл воды. Дихлорметановый слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата 1j (120 мг, белое вспененное твердое вещество), выход 54,9%.

МС m/z (ИЭР): 1023,1 [М+1]

Стадия 7

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9H-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат 1j (120 мг, 0,117 ммоль) растворяли в 2 мл дихлорметана и добавляли 2 мл диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-

фенилпропаноата 1k (124 мг, желтая жидкость). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 801,5 [М+1]

Стадия 8

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

Неочищенный продукт (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[1.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенил)пропаноат 1k (90 мг, 0,112 ммоль) растворяли в 1 мл диоксана, а затем добавляли 5,6 М раствор хлорида водорода в диоксане (3 мл). Реакционную смесь герметично закрывали и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановой кислоты 1 (19 мг, белое твердое вещество), выход 22,7%.

МС m/z (ИЭР): 744,6 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,34-7,21 (m, 5Н), 4,76-4,70 (m, 2Н), 4,26-4,19 (m, 1Н), 4,14-4,06 (m, 1Н), 3,91-3,86 (m, 1Н), 3,85-3,77 (m, 1Н), 3,75-3,56 (m, 2Н), 3,44-3,10 (m, 9Н), 2,98-2,83 (m, 1Н), 2,71-2,57 (m, 4Н), 2,26-1,99 (m, 4Н), 1,92-1,77 (m, 1Н), 1,75-1,58 (m, 2Н), 1,49-1,27 (m, 4Н), 1,21-0,95 (m, 18Н), 0,93-0,79 (m, 4Н), 0,76-0,61 (m, 1Н).

Пример 2

(S)-3-(2-хлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропановая кислота

(S)-трет-бутил-2-амино-3-(2-хлорфенил)пропаноат

(S)-2-амино-3-(2-хлорфенил)пропановую кислоту 2а (400 мг, 2,0 ммоль, получена в соответствии с известным способом Journal of the American Chemical Society, 1940, 62, 565-8) растворяли в 10 мл трет-бутилацетата и добавляли перхлорную кислоту (428 мг (70%), 3,00 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. К полученной в результате смеси добавляли 6 мл воды, и органическую фазу промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (3 мл). Водную фазу доводили до рН равного 8 насыщенным раствором бикарбоната натрия и экстрагировали дихлорметаном (5 мл × 3). Органические фазы объединяли, последовательно промывали водой (3 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением целевого неочищенного продукта (S)-трет-бутил-2-амино-3-(2-хлорфенил)пропаноата 2b (400 мг, белое твердое вещество). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия 2

(1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-3-((S)-1-трет-бутокси-3-(2-хлорфенил)-1-оксопропан-2-иламино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилат

(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(трет-бутоксикарбонил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропановую кислоту 1е (110 мг, 0,367 ммоль) растворяли в 6 мл смешанного растворителя дихлорметана и диметилформамида (об./об. 5:1), а затем добавляли неочищенный продукт (S)-трет-бутил-2-амино-3-(2-хлорфенил)пропаноат 2b (94 мг, 0,367 ммоль), N,N-диизопропилэтиламин (0,32 мл, 1,835 ммоль) и 2-(7-аза-1Н-бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (168 мг, 0,44 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1,5 часа, а затем добавляли 10 мл воды при перемешивании. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле системой элюентов В с получением целевого продукта (1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-3-(S)-1-трет-бутокси-3-(2-хлорфенил)-1-оксопропан-2-иламино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилата 2с (112 мг, белое вспененное твердое вещество), выход 56,8%.

МС m/z (ИЭР): 537,3 [М+1]

Стадия 3

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-хлорфенил)пропаноат

(1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-3-((S)-1-трет-бутокси-3-(2-хлорфенил)-1-оксопропан-2-иламино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилату 2с (110 мг, 0,205 ммоль) растворяли в 2 мл диоксана, а затем добавляли 5,6 М раствор хлорида водорода в диоксане (0,13 мл, 0,717 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем помещали в холодильник при 0°С на 6 часов. Затем к реакционной смеси добавляли 5 мл метиленхлорида и 10 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и перемешивали в течение 10 минут. Водную фазу экстрагировали 5 мл дихлорметана. Объединенную метиленхлоридную фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-хлорфенил)пропаноата 2d (99 мг, желтая жидкость). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 437,2 [М+1]

Стадия 4

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-втор-бутил-1-(9H-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-хлорфенил)пропаноат

Неочищенный (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-хлорфенил)пропаноат 2d (99 мг, 0,226 ммоль), (5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-карбоновую кислоту 1i (144,4 мг, 0,226 ммоль) растворяли в 6 мл смешанного растворителя дихлорметана и диметилформамида (об./об. 5:1), а затем добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,2 мл, 1,13 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (103,3 мг, 0,271 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем добавляли 10 мл воды при перемешивании. Метиленхлоридную фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-втор-бутил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-хлорфенил)пропаноата 2е (127 мг, белое вспененное твердое вещество), выход 53,1%.

МС m/z (ИЭР): 1056,4 [М+1]

Стадия 5

(S)-трет-бутил-3-(2-хлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропаноат

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-втор-бутил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-хлорфенил)пропаноат 2е (127 мг, 0,12 ммоль) растворяли в 2 мл дихлорметана, а затем добавляли 2 мл диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 3 часов. Затем реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-3-(2-хлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропаноата 2f (130 мг, желтое липкое вещество). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 834,5 [М+1]

Стадия 6

(S)-3-(2-хлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло [3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропановая кислота

Неочищенный продукт (S)-трет-бутил-3-(2-хлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропаноат 2f (100 мг, 0,12 ммоль) растворяли в 1 мл диоксана, а затем добавляли 3 мл 5,6 М раствора хлорида водорода в диоксане. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов в атмосфере аргона. Затем реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, и остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-3-(2-хлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропановой кислоты 2 (35 мг, белое твердое вещество), выход 35,7%.

МС m/z (ИЭР): 778,7 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,41-7,32 (m, 2Н), 7,31-7,16 (m, 2Н), 4,80-4,65 (m, 2Н), 4,22-4,13 (m, 1Н), 4,10-4,03 (m, 1Н), 3,98-3,91 (m, 1Н), 3,87-3,82 (m, 1Н), 3,73-3,63 (m, 2Н), 3,47-3,12 (m, 9Н), 3,09-3,01 (m, 1Н), 2,67-2,57 (m, 4Н), 2,24-2,11 (m, 3Н), 2,09-1,98 (m, 1Н), 1,89-1,67 (m, 3Н), 1,51-1,25 (m, 4Н), 1,20-0,93 (m, 18Н), 0,92-0,79 (m, 4Н), 0,75-0,66 (m, 1Н).

Пример 3

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

(2S,5S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-5-метилпирролидин-1-карбоксилат

(4R,5S)-4-метил-5-фенил-3-пропионилоксазолидин-2-он 1b (0,992 г, 4,2 ммоль) растворяли в 20 мл дихлорметана и охлаждали до 0°С в атмосфере аргона. К реакционной смеси добавляли триэтиламин (0,69 мл, 4,96 ммоль), а затем добавляли по каплям дибутилбора трифторметансульфонат (4,4 мл, 4,4 ммоль), и смесь перемешивали при 0°С в течение 50 минут. Реакционный раствор охлаждали до -75°С и добавляли 5 мл раствора (2S,5S)-трет-бутил 2-формил-5-метилпирролидин-1-карбоксилата 3а (900 мг, 4,2 ммоль, получен в соответствии с известным способом US 20120195857) в метиленхлориде, а затем перемешивали при -75°С в течение 1,5 часов, при 0°С в течение 1,5 часов и при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем к реакционной смеси добавляли 36 мл смеси фосфатного буфера (pH=7,0) и метанола (об./об. 1:3) при комнатной температуре. Реакционную смесь охлаждали до 0°С и добавляли 36 мл смеси метанола и пероксида водорода (30%) (об./об. 2:1), а затем перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. После завершения реакции органическую фазу концентрировали при пониженном давлении и добавляли 15 мл воды. Водную фазу экстрагировали эфиром (30 мл × 3), и объединенные эфирные фазы последовательно промывали 5% раствором бикарбоната натрия, водой, насыщенным раствором хлорида натрия (150 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле системой элюентов В с получением целевого продукта (2S,5S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-5-метилпирролидин-1-карбоксилата 3b (600 мг, белое твердое вещество), выход 33%.

Стадия 2

(2S,5S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-5-метилпирролидин-1-карбоксилат

(2S,5S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-5-метилпирролидин-1-карбоксилат 3b (600 мг, 1,34 ммоль) растворяли в 15 мл метиленхлорида и добавляли 1 г измельченных молекулярных сит. К смеси добавляли 1,8-бис-диметиламинонафталин (740 мг, 3,45 ммоль) и триметилоксония тетрафторборат (500 мг, 3,38 ммоль) при 0°С в атмосфере аргона. Реакционную смесь оборачивали оловянной фольгой и перемешивали при комнатной температуре в течение 38 часов. После завершения реакции полученную в результате смесь фильтровали, и фильтрационный осадок промывали дихлорметаном. Фильтрат объединяли, и органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида аммония (20 мл × 3) для удаления избытка 1,8-бис-диметиламинонафталина, затем промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (2S,5S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-5-метилпирролидин-1-карбоксилата 3с (200 мг, белое твердое вещество), выход 32%.

Стадия 3

(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановая кислота

(2S,5S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-5-метилпирролидин-1-карбоксилат 3с (200 мг, 0,43 ммоль) растворяли в 22 мл тетрагидрофурана и охлаждали до 0°С в атмосфере аргона. Затем к смеси медленно добавляли по каплям пероксид водорода (186 мг, 1,6 ммоль) и моногидрат гидроксида лития (58 мг, 1,37 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 10 минут, а затем ледяную баню удаляли и далее перемешивали при комнатной температуре в течение 44 часов. После завершения реакции к реакционному раствору добавляли твердый сульфит натрия (220 мг, 1,74 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем добавляли 15 мл воды. Органическую фазу концентрировали при пониженном давлении, и остатки экстрагировали дихлорметаном (20 мл × 2). К водной фазе добавляли по каплям 2 н. соляную кислоту до pH от 3 до 4, затем экстрагировали этилацетатом (20 мл × 3), и этилацетатную фазу последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислоты 3d (120 мг, белое твердое вещество). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия 4

(2S,5S)-трет-бутил 2-((1R,2R)-3-((S)-1-трет-бутокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-иламино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-5-метилпирролидин-1-карбоксилат Неочищенный продукт (2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановую кислоту 3d (106 мг, 0,35 ммоль) растворяли в 4,8 мл смешанного растворителя дихлорметана и диметилформамида (об./об. 5:1), а затем добавляли (S)-трет-бутил-2-амино-3-фенилпропионовую кислоту 1f (80 мг, 0,36 ммоль). К смеси добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,30 мл, 1,74 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (160 мг, 0,42 ммоль) в атмосфере аргона, а затем перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. После завершения реакции к реакционной смеси добавляли 10 мл дихлорметана, а затем последовательно промывали водой (5 мл × 2) и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (2S,5S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-((5)-1-трет-бутокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-иламино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-5-метилпирролидин-1-карбоксилата 3е (138 мг, бесцветная вязкая жидкость), выход 78%.

Стадия 5

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((2S,5S)-5-метилпирролидин-2-ил)пропанамидо)-3-фенилпропаноат

(2S,5S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-((S)-1-трет-бутокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-иламино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-5-метилпирролидин-1-карбоксилат 3е (150 мг, 0,267 ммоль) растворяли в 2,2 мл диоксана, а затем добавляли 4 М раствор хлорида водорода в диоксане (0,160 мл, 0,896 ммоль). Реакционную систему герметично закрывали и перемешивали в течение 7 часов при комнатной температуре, а затем помещали в холодильник на 16 часов при 4°С. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, и к остаткам добавляли 15 мл дихлорметана, а затем охлаждали до 0°С и добавляли по каплям насыщенный раствор бикарбоната натрия для доведения pH до 8. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (8 мл × 2), и органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((2S,5S)-5-метилпирролидин-2-ил)пропанамидо)-3-фенилпропаноата 3f (80 мг, бесцветное вязкое твердое вещество), выход 74%.

Стадия 6

(S)-трет-бутил 2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-втор-бутил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((2S,5S)-5-метилпирролидин-2-ил)пропанамидо)-3-фенилпропаноат 3f (80 мг, 0,198 ммоль), (5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-карбоновую кислоту 1i (136 мг, 0,213 ммоль) растворяли в 4,8 мл смешанного растворителя дихлорметана и диметилформамида (об./об. 5:1), а затем добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,170 мл, 0,98 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (100 мг, 0,263 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 часа. После завершения реакции к реакционной смеси добавляли 15 мл дихлорметана и промывали водой (6 мл × 2). Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (5 мл), и объединенные дихлорметановые фазы последовательно промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил 2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-втор-бутил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата 3g (168 мг, белое вспененное твердое вещество), выход 81%.

Стадия 7

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-втор-бутил-1-(9H-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат 3g (167 мг, 0,16 ммоль) растворяли в 2 мл дихлорметана и добавляли 2 мл диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 3 часов. После завершения реакции реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата 3h (180 мг, желтая жидкость). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 802,6 [М+1]

Стадия 8

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

Неочищенный продукт (S)-трет-бутил 2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат 3h (130 мг, 0,16 ммоль) растворяли в 1 мл диоксана и добавляли 3 мл 5,6 М раствора хлорида водорода в диоксане. Реакционную систему герметично закрывали и перемешивали в течение 12 часов при комнатной температуре. После завершения реакции реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановой кислоты 3 (28 мг, белое твердое вещество), выход 23%.

МС m/z (ИЭР): 746,7 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,31-7,14 (m, 5Н), 4,79-4,67 (m, 2Н), 4,25-4,13 (m, 1Н), 4,10-3,97 (m, 2Н), 3,77-3,66 (m, 1Н), 3,60-3,52 (m, 1Н), 3,51-3,42 (m, 1Н), 3,41-3,12 (m, 7H), 2,97-2,85 (m, 1H), 2,67 (d, 3Н), 2,48-2,40 (m, 2H), 2,30-2,02 (m, 4H), 1,93-1,73 (m, 2H), 1,70-1,55 (m, 1H), 1,53-1,28 (m, 5H), 1,26-1,11 (m, 7H), 1,10-0,99 (m, 14H), 0,98-0,83 (m, 4H).

Пример 4

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноилхлорид

К 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановой кислоте 4а (1,5 г, 7,10 ммоль, получена в соответствии с известным способом Journal of Medcinal Chemistry, 2013, 56 (24), 9955-9968) добавляли каплю N,N-диметилформамида, а затем добавляли по каплям 15 мл оксалилхлорида при энергичном перемешивании в атмосфере аргона после охлаждения в бане с сухим льдом. Затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После завершения реакции реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и остатки растворяли в метиленхлориде и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноилхлорида 4b. Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия 2

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((5)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 1 (17 мг, 0,023 ммоль) растворяли в 1 мл дихлорметана и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (20 мкл, 0,115 ммоль). Затем к смеси добавляли по каплям заранее приготовленный раствор 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноилхлорида 4b (7,9 мг, 0,034 ммоль) в дихлорметане в атмосфере аргона в ледяной бане, а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов. После завершения реакции добавляли 10 мл метанола, и реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановой кислоты 4 (9 мг, белое твердое вещество), выход 42%.

МС m/z (ИЭР): 937,4 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,37-7,17 (m, 5Н), 6,84-6,79 (m, 2Н), 4,80-4,71 (m, 2Н), 4,69-4,56 (m, 2Н), 4,26-4,19 (m, 1Н), 4,14-4,07 (m, 1Н), 3,92-3,86 (m, 1Н), 3,84-3,78 (m, 1Н), 3,77-3,60 (m, 1Н), 3,55-3,47 (m, 2Н), 3,42-3,23 (m, 5Н), 3,18-3,12 (m, 2Н), 3,07-3,03 (m, 2Н), 3,02-2,82 (m, 2Н), 2,66-2,58 (m, 2Н), 2,54-2,46 (m, 1Н), 2,46-2,38 (m, 2Н), 2,30-2,14 (m, 2Н), 2,09-1,99 (m, 1Н), 1,90-1,78 (m, 1Н), 1,75-1,56 (m, 6Н), 1,48-1,28 (m, 6Н), 1,20-0,79 (m, 22Н), 0,77-0,69 (m, 1Н).

Пример 5

(S)-3-(2-хлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропановая кислота

(S)-3-(2-хлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропановую кислоту 2 (18 мг, 0,023 ммоль) растворяли в 1 мл дихлорметана и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,02 мл, 0,115 ммоль). К смеси добавляли по каплям заранее подготовленный раствор 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноилхлорида 4b (7,9 мг, 0,034 ммоль) в дихлорметане в атмосфере аргона в ледяной бане, а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Реакционную смесь гасили 5 мл метанола, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-3-(2-хлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропановой кислоты 5 (6 мг, белое твердое вещество), выход 26,6%.

МС m/z (ИЭР): 971,5 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,42-7,34 (m, 2Н), 7,33-7,19 (m, 2Н), 6,83-6,78 (m, 2Н), 4,83-4,70 (m, 2Н), 4,68-4,56 (m, 2Н), 4,24-4,16 (m, 1Н), 4,13-4,05 (m, 1Н), 4,03-3,95 (m, 1Н), 3,91-3,84 (m, 1Н), 3,76-3,65 (m, 1Н), 3,54-3,48 (m, 2Н), 3,47-3,18 (m, 5Н), 3,17-2,96 (m, 6Н), 2,67-2,58 (m, 2Н), 2,53-2,38 (m, 3Н), 2,28-2,18 (m, 2Н), 2,09-2,00 (m, 1Н), 1,92-1,57 (m, 7Н), 1,51-1,28 (m, 6Н), 1,21-0,82 (m, 22Н), 0,78-0,69 (m, 1Н).

Пример 6

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 3 (18 мг, 0,024 ммоль) растворяли в 1 мл дихлорметана и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,02 мл, 0,12 ммоль). К смеси добавляли по каплям заранее приготовленный раствор 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноилхлорида 4b (8,3 мг, 0,036 ммоль) в дихлорметане в атмосфере аргона в ледяной бане. Описанную выше реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Реакционную смесь гасили 5 мл метанола, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановой кислоты 6 (7 мг, белое твердое вещество), выход 30,9%.

МС m/z (ИЭР): 939,5 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,30-7,15 (m, 5Н), 6,83-6,78 (m, 2Н), 4,78-4,69 (m, 2Н), 4,69-4,56 (m, 2Н), 4,24-4,12 (m, 1Н), 4,10-3,96 (m, 2Н), 3,60-3,44 (m, 3Н), 3,41-3,22 (m, 4Н), 3,16-3,10 (m, 2Н), 3,07-3,02 (m, 2Н), 3,01-2,86 (m, 2Н), 2,52-2,38 (m, 4Н), 2,31-2,15 (m, 3Н), 2,09-1,99 (m, 1Н), 1,91-1,77 (m, 2Н), 1,71-1,56 (m, 5Н), 1,52-1,28 (m, 9Н), 1,26-1,14 (m, 6Н), 1,11-0,77 (m, 18Н).

Пример 7

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло [3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановая кислота

(S)-трет-бутил-2-амино-3-(2-фторфенил)пропаноат

(S)-бутил-2-амино-3-(2-фторфенил)пропаноат 7а (400 мг, 2,18 ммоль, получен в соответствии с известным способом Advanced Synthesis & Catalysis, 2012, 354 (17), 3327-3332) растворяли в 10 мл трет-бутилацетата и добавляли перхлорную кислоту (300 мг (70%), 3,3 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. После завершения реакции добавляли 6 мл воды, и органическую фазу промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (3 мл). Водную фазу доводили до pH равного 8 насыщенным раствором бикарбоната натрия и экстрагировали дихлорметаном (5 мл ×3). Органические фазы объединяли, последовательно промывали водой (3 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-амино-3-(2-фторфенил)пропаноата 7b (390 мг, желтое масло). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия 2

(2S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутокси)-3-(2-фторфенил)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилат

(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(трет-бутоксикарбонил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропановую кислоту 1е (100 мг, 0,334 ммоль) растворяли в 6 мл смешанного растворителя дихлорметана и диметилформамида (об./об. 5:1) и добавляли неочищенный продукт (S)-трет-бутил-2-амино-3-(2-фторфенил)пропаноат 7b (80 мг, 0,334 ммоль), N,N-диизопропилэтиламин (0,29 мл, 1,67 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (152,3 мг, 0,40 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 часа. После завершения реакции к реакционной смеси добавляли 10 мл воды при перемешивании, и дихлорметановую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутокси)-3-(2-фторфенил)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилата 7с (173 мг, бесцветная жидкость), выход 99,5%.

МС m/z (ИЭР): 521,2 [М+1]

Стадия 3

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат

(1S,3S,5S)-трет-бутил-3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутокси)-3-(2-фторфенил)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксилат 7с (173 мг, 0,33 ммоль) растворяли в 2 мл диоксана и добавляли 5,6 М раствор хлорида водорода в диоксане (0,21 мл, 1,16 ммоль). Смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем помещали в холодильник на 12 часов при 0°С. Затем реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении и добавляли 5 мл дихлорметана и 10 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и перемешивали в течение 10 минут. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (5 мл × 3). Объединенную дихлорметановую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноата 7d (77 мг, желтая жидкость). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 421,2 [М+1]

Стадия 4

(S)-трет-бутил 2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9H-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат

Неочищенный продукт (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат 7d (77 мг, 0,183 ммоль), (5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9H-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-карбоновую кислоту 1i (116,8 мг, 0,183 ммоль) растворяли в 6 мл смешанного растворителя дихлорметана и диметилформамида (об./об. 5:1), а затем добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,16 мл, 0,915 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (84 мг, 0,22 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем к реакционной смеси добавляли 6 мл воды, и дихлорметановую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл) и высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9H-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноата 7е (190,5 мг, желтое липкое твердое вещество), выход 100%.

МС m/z (ИЭР): 1040,6 [М+1]

Стадия 5

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат 7е (190,5 мг, 0,183 ммоль) растворяли в 1,5 мл дихлорметана и добавляли 2 мл диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 3 часов. После завершения реакции реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноата 7f (150 мг, желтое липкое вещество). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 818,5 [М+1]

Стадия 6

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло [3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановая кислота

Неочищенный продукт (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат 7f (150 мг, 0,183 ммоль) растворяли в 1 мл диоксана и добавляли 3 мл 5,6 М раствор хлорида водорода в диоксане. Полученную в результате смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение 12 часов при комнатной температуре. После завершения реакции реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, и остаточный растворитель быстро экстрагировали этиловым эфиром. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановой кислоты 7 (28 мг, белое твердое вещество), выход 20%.

МС m/z (ИЭР): 762,7 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,38-7,18 (m, 2Н), 7,13-7,01 (m, 2Н), 4,80-4,67 (m, 2Н), 4,30-4,15 (m, 1Н), 4,13-4,01 (m, 1Н), 3,96-3,83 (m, 2Н), 3,75-3,60 (m, 2Н), 3,42-3,11 (m, 9Н), 3,06-2,95 (m, 1Н), 2,70-2,58 (m, 4Н), 2,28-2,01 (m, 4Н), 1,88-1,70 (m, 3Н), 1,57-1,25 (m, 4Н), 1,22-0,95 (m, 18Н), 0,92-0,80 (m, 4Н), 0,78-0,65 (m, 1Н).

Пример 8

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановая кислота

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановую кислоту 7 (25 мг, 0,033 ммоль) растворяли в 3 мл дихлорметана и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,029 мл, 0,164 ммоль). К смеси добавляли по каплям заранее приготовленный раствор 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноилхлорида 4b (11,3 мг, 0,049 ммоль) в дихлорметане в атмосфере аргона в ледяной бане, а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Затем к реакционной смеси добавляли 5 мл воды и перемешивали в течение 20 минут. Органическую фазу высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановой кислоты 8 (7 мг, желтое липкое вещество), выход 22,4 %.

МС m/z (ИЭР): 955,4 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,36-7,30 (m, 1Н), 7,29-7,21 (m, 1Н), 7,17-7,02 (m, 2Н), 6,83-6,79 (m, 2Н), 4,81-4,71 (m, 2Н), 4,69-4,55 (m, 2Н), 4,25-4,15 (m, 1Н), 4,13-4,04 (m, 1Н), 3,96-3,85 (m, 2Н), 3,70-3,61 (m, 1Н), 3,55-3,46 (m, 3Н), 3,40-3,21 (m, 4Н), 3,18-3,10 (m, 2Н), 3,07-2,96 (m, 4Н), 2,67-2,56 (m, 2Н), 2,54-2,34 (m, 3Н), 2,29-2,17 (m, 2Н), 2,10-1,99 (m, 1Н), 1,89-1,57 (m, 7Н), 1,52-1,28 (m, 6Н), 1,21-1,11 (m, 4Н), 1,07-0,96 (m, 6Н), 0,95-0,81 (m, 12Н), 0,80-0,69 (m, 1Н).

Пример 9

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

(S)-трет-бутил-2-формил-4-метиленпирролидин-1-карбоксилат

(S)-трет-бутил-2-(гидроксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбоксилат 9а (1,32 г, 6,19 ммоль, получен в соответствии с известным способом из Journal of Organic Chemistry, 2003, 68 (10), 3923-3931) растворяли в 15 мл дихлорметана и охлаждали до 0°С. К смеси добавляли N,N-диизопропилэтиламин (5,38 мл, 30,9 ммоль), диметилсульфоксид (7,26 г, 92,9 ммоль) и комплекс триоксида серы с пиридином (7,26 г, 92,9 ммоль) в атмосфере аргона и перемешивали при 0°С в течение 3 часов. Затем реакционную смесь гасили фосфатным буферным раствором (pH равно 7) и последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-формил-4-метиленпирролидин-1-карбоксилата 9b (1,1 г, светло-желтая жидкость), выход 84,2%.

Стадия 2

(S)-трет-бутил 2-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-4-метиленпирролидин-1-карбоксилат

(4R,5S)-4-метил-5-фенил-3-пропионилоксазолидин-2-он 1b (1,43 г, 6,15 ммоль) растворяли в 30 мл дихлорметана и охлаждали до 0°С в атмосфере аргона. К раствору добавляли триэтиламин (0,98 мл, 7,08 ммоль) и дибутилбора трифторметансульфонат (6,65 мл, 6,65 ммоль), а затем перемешивали при 0°С в течение 50 мин. Реакционную смесь охлаждали до -78°С и добавляли заранее приготовленный раствор (S)-трет-бутил-2-формил-4-метиленпиррол идин-1 -карбоксилата 9b (1,43 г, 6,15 ммоль) в дихлорметане, затем смесь перемешивали при -78°С в течение 2 часов, при 0°С в течение 1 часа, при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь гасили смесью 36 мл фосфатного буфера (pH равен 7) и метанола (об./об. 3:1), затем добавляли смесь метанола и пероксида водорода (об./об. 1:2) при 0°С и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После завершения реакции метанол и органическую фазу удаляли. Остаточную водную фазу экстрагировали метиленхлоридом, органические фазы объединяли, последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-4-метиленпирролидин-1-карбоксилата 9с (810 мг, белое вспененное твердое вещество), выход 30%.

МС m/z (ИЭР): 354,2 [М-100+1]

Стадия 3

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-4-метиленпирролидин-1-карбоксилат

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-4-метиленпиррол идин-1-карбоксилат 9с (810 мг, 1,82 ммоль) растворяли в 15 мл дихлорметана и добавляли измельченные молекулярные сита и карбонат калия (1,25 г, 9,11 ммоль), метилтрифторметансульфонат (897,7 мг, 5,47 ммоль), затем смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. После завершения реакции реакционный раствор фильтровали, и фильтрационный осадок промывали дихлорметаном. Органические фазы объединяли и концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-4-метиленпирролидин-1-карбоксилата 9d (280 мг, белое вспененное твердое вещество), выход 33,5%.

МС m/z (ИЭР): 359,2 [М-100+1]

Стадия 4

(2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановая кислота

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-4-метиленпирролидин-1-карбоксилат 9d (400 мг, 0,87 ммоль) растворяли в 20 мл тетрагидрофурана и добавляли моногидрат гидроксида лития (62,2 мг, 1,484 ммоль). Реакционную смесь охлаждали до 0°С в атмосфере аргона, а затем добавляли по каплям 30% пероксид водорода (112,7 мг, 3,31 ммоль). Смесь оставляли для взаимодействия при комнатной температуре на 12 часов. После завершения реакции к реакционному раствору добавляли сульфит натрия (416 мг, 3,3 ммоль), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Тетрагидрофуран концентрировали при пониженном давлении, и остатки растворяли в воде и экстрагировали дихлорметаном. Водную фазу разбавляли разбавленной соляной кислотой для доведения pH до 3-4, а затем экстрагировали дихлорметаном (30 мл × 3). Объединенные органические фазы последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислоты 9е (230 мг, бесцветная жидкость). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 298,2 [М-1]

Стадия 5

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутокси)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-4-метиленпирролидин-1-карбоксилат

(2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановую кислоту 9е (220 мг, 0,735 ммоль) растворяли в 6 мл дихлорметана и добавляли (S)-трет-бутил-2-амино-3-фенилпропаноат 1f (178,8 мг, 0,809 ммоль), N,N-диизопропилэтиламин (0,51 мл, 2,94 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (363 мг, 0,956 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 3 часов. После завершения реакции реакционный раствор последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутокси)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-4-метиленпирролидин-1-карбоксилата 9f (271 мг, белое твердое вещество), выход 66%.

МС m/z (ИЭР): 503,3 [М+1]

Стадия 6

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-4-метиленпирролидин-2-ил)пропанамидо)-3-фенилпропаноат

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутокси)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-4-метиленпирролидин-1-карбоксилат 9f (270 мг, 0,537 ммоль) растворяли в 4 мл 1,4-диоксана и добавляли 4 М раствор хлорида водорода в диоксане (0,335 мл, 1,881 ммоль). Смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре и помещали в холодильник на 12 часов при 0-4°С. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и остатки растворяли в метиленхлориде и добавляли насыщенный раствор бикарбоната натрия для доведения pH до 8-9. Водную фазу экстрагировали метиленхлоридом. Органические фазы объединяли, последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-4-метиленпирролидин-2-ил)пропанамидо)-3-фенилпропаноата 9g (210 мг, светло-желтое масло). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 403,4 [М+1]

Стадия 7

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9H-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат

Неочищенный продукт (S)-трет-бутил 2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-4-метиленпирролидин-2-ил)пропанамидо)-3-фенилпропаноат 9g (210 мг, 0,521 ммоль), (5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-карбоновую кислоту 1i (365,9 мг, 0,547 ммоль) растворяли в 6 мл дихлорметана и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,4537 мл, 2,609 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (257,8 мг, 0,678 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 2 часов. После завершения реакции реакционный раствор последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата 9h (345 мг, белое вспененное твердое вещество), выход 64,7%.

МС m/z (ИЭР): 1022,5 [М+1]

Стадия 8

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9H-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат 9h (345 мг, 0,337 ммоль) растворяли в 2 мл дихлорметана и добавляли 3 мл диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 2 часов. После завершения реакции реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((5)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата 9i (375 мг, желтое масло). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 800,5 [М+1]

Стадия 9

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

К неочищенному продукту (S)-трет-бутил 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноату 9i (370 мг, 0,462 ммоль) добавляли 7 мл 4 М раствора хлорида водорода в диоксане. Реакционную смесь герметично закрывали и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. После завершения реакции реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановой кислоты 9 (30 мг, белое твердое вещество), выход 11,9%.

МС m/z (ИЭР): 744,7 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 10,57 (s, 1Н), 10,00 (s, 1Н), 8,41-8,26 (m, 2Н), 7,52-6,99 (m, 5Н), 5,34 (s, 1Н), 5,02-4,95 (m, 4Н), 4,38-4,33 (m, 2Н), 4,16 (m, 2Н), 3,93-3,75 (m, 3Н), 3,49-3,07 (m, 6Н), 2,94-2,32 (m, 16Н), 2,30-2,01 (m, 4Н), 1,75-1,65 (m, 2Н), 1,32-0,83 (m, 16Н).

Пример 10

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 9 (22 мг, 0,0295 ммоль) растворяли в 3 мл дихлорметана и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (19 мг, 0,1479 ммоль). Смесь охлаждали до 0°С и добавляли по каплям заранее приготовленный раствор 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноилхлорида 4b (10,1 мг, 0,0443 ммоль) в дихлорметане. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 2,5 часов. Затем реакционную смесь гасили метанолом, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановой кислоты 10 (1,3 мг, белое липкое вещество), выход 4,6%.

МС m/z (ИЭР): 937,9 [М+1]

Пример 11

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановая кислота

(S)-трет-бутил-6-формил-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилат

(S)-трет-бутил-6-(гидроксиметил)-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилат 11а (2,37 г, 10,4 ммоль, получен в соответствии с известным способом Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2013, 23 (9), 2653-2658) растворяли в 40 мл дихлорметана и охлаждали до 0°С. К раствору добавляли N,N-диизопропилэтиламин (10,8 мл, 62,5 ммоль), диметилсульфоксид (12,2 г, 156,4 ммоль) и комплекс триоксида серы с пиридином 6,63 г, 41,7 ммоль) в атмосфере аргона. Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 3 часов. После завершения реакции реакционную смесь гасили добавлением фосфатного буфера (pH равен 7) и последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-6-формил-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилат 11b (2 г, желтая жидкость), выход 88%.

Стадия 2

(S)-трет-бутил-6-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилат

(4R,5S)-4-метил-5-фенил-3-пропионилоксазолидин-2-он 1b (2 г, 8,88 ммоль) растворяли в 35 мл дихлорметана и добавляли по каплям триэтиламин (1,42 мл, 10,2 ммоль) в атмосфере аргона. Смесь охлаждали до 0°С и добавляли по каплям дибутилбора трифторметансульфонат (9,59 мл, 9,59 ммоль), а затем перемешивали при 0°С в течение 50 минут. Добавляли предварительно приготовленный раствор (S)-трет-бутил-6-формил-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилата 11b (2 г, 8,88 ммоль) в дихлорметане при 78°С и перемешивали при -78°С в течение 2 часов, затем перемешивали при 0°С в течение 1 часа при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь гасили добавлением смеси фосфатного буфера (pH равен 7,0) и метанола (об./об. 3:1). Добавляли смесь метанола и пероксида водорода (об./об. 1:2) при 0°С, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После концентрирования при пониженном давлении остатки растворяли в воде и экстрагировали метиленхлоридом. Органические фазы объединяли, последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученные в результате остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-6-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилата 11с (1,8 г, белое вспененное твердое вещество), выход 44,2%.

МС m/z (ИЭР): 459,4 [М+1]

Стадия 3

(S)-трет-бутил-6-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилат

(S)-трет-бутил-6-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилат 11с (1,8 г, 3,92 ммоль) растворяли в 30 мл дихлорметана и добавляли измельченные молекулярные сита. Добавляли карбонат калия (3,78 г, 27,48 ммоль) и метилтрифторметансульфонат (3,22 г, 19,64 ммоль) в атмосфере аргона, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. После завершения реакции реакционный раствор фильтровали, и фильтрационный осадок промывали дихлорметаном. Органические фазы объединяли и концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов А, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-6-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилата 11 d (930 мг, бесцветное масло), выход 50,2%.

МС m/z (ИЭР): 473,4 [М+1]

Стадия 4

(2R,3R)-3-((S)-5-(трет-бутоксикарбонил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропановая кислота

(S)-трет-бутил-6-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилат 11d (1,03 г, 2,8 ммоль) растворяли в 20 мл тетрагидрофурана и добавляли моногидрат гидроксида лития (155 мг, 3,7 ммоль). Добавляли по каплям 30% пероксид водорода (939 мг, 8,28 ммоль) в атмосфере аргона. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. После завершения реакции к реакционному раствору добавляли сульфит натрия (1,04 г, 8,28 ммоль), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Тетрагидрофуран концентрировали при пониженном давлении, и остатки растворяли в воде и экстрагировали дихлорметаном. Водную фазу разбавляли разбавленной соляной кислотой для доведения pH до 3-4, а затем экстрагировали дихлорметаном (30 мл × 5). Объединенные органические фазы последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (2R,3R)-3-((S)-5-(трет-бутоксикарбонил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислоты 11е (700 мг, бесцветная вязкая жидкость). Продукт использовали на следующей стадии без очистки.

МС m/z (ИЭР): 314,4 [М+1]

Стадия 5

(S)-трет-бутил-6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутокси)-3-(2-фторфенил)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилат

Неочищенный продукт (2R,3R)-3-((S)-5-(трет-бутоксикарбонил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропановую кислоту 11е (350 мг, 1,117 ммоль) растворяли в 6 мл дихлорметана и добавляли (S)-трет-бутил-2-амино-3-(2-фторфенил)пропаноат 7b (267 мг, 1,117 ммоль). К смеси добавляли N,N-диизопропилэтиламин (720 мг, 5,587 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (509,8 мг, 1,341 ммоль) в атмосфере аргона, а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. После завершения реакции реакционный раствор последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутокси)-3-(2-фторфенил)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилата 11f (570 мг, бесцветное масло), выход 95,3%.

МС m/z (ИЭР): 535,3 [М+1]

Стадия 6

(S)-трет-бутил-3-(2-фторфенил)-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)пропанамидо)пропаноат

(S)-трет-бутил-6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутокси)-3-(2-фторфенил)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)-5-азаспиро[2.4]гептан-5-карбоксилат 11f (570 мг, 1,049 ммоль) растворяли в 8 мл 1,4-диоксана и добавляли 4 М раствор хлорида водорода в диоксане (0,749 мл, 4,196 ммоль). Смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре и помещали в холодильник на 12 часов при 0-4°С. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и остатки растворяли в метиленхлориде. Добавляли по каплям насыщенный раствор бикарбоната натрия для доведения pH до 8-9, и водную фазу экстрагировали метиленхлоридом. Органические фазы объединяли, последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением целевого неочищенного продукта (S)-трет-бутил-3-(2-фторфенил)-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)пропанамидо)пропаноата 11g (440 мг, светло-желтое масло). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 435,4 [М+1]

Стадия 7

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат

Неочищенный продукт (S)-трет-бутил-3-(2-фторфенил)-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)пропанамидо)пропаноат 11g (440 мг, 1,013 ммоль), (5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-карбоновую кислоту 1i (645,8 мг, 1,013 ммоль) растворяли в 10 мл дихлорметана и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,88 мл, 5,06 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (500,5 мг, 1,317 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 2 часов. После завершения реакции реакционный раствор последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9H-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноата 11h (570 мг, белое твердое вещество), выход 53,4%.

МС m/z (ИЭР): 1054,9 [М+1]

Стадия 8

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9H-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат 11h (560 мг, 0,531 ммоль) растворяли в 2 мл дихлорметана и добавляли 6 мл диэтиламина. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часов. После завершения реакции реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноата 11i (550 мг, белое липкое вещество). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 832,5 [М+1]

Стадия 9

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановая кислота

К неочищенному продукту (S)-трет-бутил 2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноату 11i (450 мг, 0.541 ммоль) добавляли 7 мл 4 М раствора хлорида водорода в диоксане. Реакционную смесь герметично закрывали и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. После завершения реакции реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановой кислоты 11 (403 мг, белое твердое вещество), выход 96%.

МС m/z (ИЭР): 776,7 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,30-7,22 (m, 2Н), 7,12-7,04 (m, 2Н), 4,72-4,68 (m, 2Н), 4,13-4,07 (m, 2Н), 3,96-3,94 (m, 1Н), 3,70-3,66 (m, 2Н), 3,50-3,47 (m, 2Н), 3,40-3,37 (m, 3Н), 3,34-3,28 (m, 4Н), 3,26-3,22 (m, 2Н), 3,11 (s, 1H), 3,05-2,91 (m, 2Н), 2,67-2,65 (m, 3Н), 2,57-2,43 (m, 2Н), 2,39-2,28 (m, 2Н), 2,25-2,16 (m, 3Н), 1,93-1,88 (m, 2H), 1,55-1,43 (m, 2H), 1,23-1,21 (d, 2H), 1,16-1,08 (m, 3H), 1,08-0,97 (m, 10H), 0,89-0,83 (m, 3H), 0,66-0,53 (m, 3H), 0,46-0,43 (m, 2H).

Пример 12

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановая кислота

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановую кислоту 11 (150 мг, 0,193 ммоль) растворяли в 7 мл дихлорметана и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (87,3 мг, 0,677 ммоль). Реакционную смесь охлаждали до 0°С в атмосфере аргона и добавляли по каплям заранее приготовленный раствор 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноилхлорида 4b (57,6 мг, 0,251 ммоль) в дихлорметане, а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь гасили метанолом и концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановой кислоты 12 (14,7 мг, белое твердое вещество), выход 7,8%.

МС m/z (ИЭР): 969,9 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,29-7,23 (m, 2Н), 7,10-7,04 (m, 2Н), 6,79-6,78 (m, 2Н), 4,69-4,54 (m, 3Н), 4,18-4,07 (m, 3Н), 3,98-3,92 (m, 1Н), 3,75-3,71 (m, 2Н), 3,50-3,47 (m, 3Н), 3,42-3,39 (m, 2Н), 3,34-3,32 (m, 5Н), 3,27-3,19 (m, 4Н), 3,09-2,95 (m, 5Н), 2,49-2,47 (m, 2Н), 2,41-2,36 (m, 2Н), 2,29-2,18 (m, 3Н), 2,09-2,02 (m, 2Н), 1,90-1,87 (m, 2Н), 1,63-1,59 (m, 4Н), 1,49 (s, 2Н), 1,32-1,28 (m, 3Н), 1,21-1,12 (m, 3Н), 1,00-0,81 (m, 12Н), 0,62-0,55 (m, 3Н), 0,46-0,40 (m, 2Н).

Пример 13

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

Способ получения был аналогичен способу, описанному в Примере 11, за исключением того, что материал стадии 5 был заменен (2R,3R)-3-((S)-5-(трет-бутоксикарбонил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислотой 11е и (S)-трет-бутил 2-амино-3-фенилпропаноатом 1f для получения целевого продукта (S)-2-(2R,3R)-3-((S)-5-(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановой кислоты 13 (219 мг, белое твердое вещество).

МС m/z (ИЭР): 758,7 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,31-7,19 (m, 5Н), 4,70-4,68 (m, 2Н), 4,14-4,03 (m, 2Н), 3,95-3,93 (m, 1Н), 3,69-3,66 (m, 2Н), 3,48-3,45 (m, 2Н), 3,43-3,38 (m, 3Н), 3,34-3,29 (m, 4Н), 3,23-3,21 (m, 2Н), 3,11 (s, 1Н), 2,97-2,89 (m, 2Н), 2,67-2,65 (m, 3Н), 2,51-2,43 (m, 2Н), 2,39-2,27 (m, 2Н), 2,21-2,06 (m, 3Н), 1,88-1,82 (m, 2Н), 1,41-1,39 (m, 2Н), 1,23-1,21 (d, 2Н), 1,16-1,10 (m, 3Н), 1,08-0,98 (m, 10Н), 0,89-0,84 (m, 3Н), 0,63-0,52 (m, 3Н), 0,46-0,43 (m, 2Н).

Пример 14

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 13 (120 мг, 0,158 ммоль) растворяли в 5 мл дихлорметана и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (71,5 мг, 0,554 ммоль). Смесь охлаждали до 0°С в атмосфере аргона и добавляли по каплям заранее приготовленный раствор 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноилхлорида 4b (47,1 мг, 0,2059 ммоль) в дихлорметане, а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. После завершения реакции добавляли 1 мл метанол и перемешивали в течение 10 минут. Смесь концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановой кислоты 14 (5,1 мг, белое твердое вещество), выход 3,39%.

МС m/z (ИЭР): 951,9 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,29-7,18 (m, 5Н), 6,80-6,79 (m, 2Н), 4,75-4,61 (m, 3Н), 4,21-3,99 (m, 3Н), 3,94-3,91 (m, 1Н), 3,74-3,70 (m, 2Н), 3,51-3,44 (m, 3Н), 3,42-3,37 (m, 2Н), 3,34-3,28 (m, 5Н), 3,23-3,21 (m, 4Н), 3,10-2,86 (m, 5Н), 2,49-2,36 (m, 4H), 2,32-2,17 (m, 3Н), 2,12-2,03 (m, 2H), 1,88-1,80 (m, 2H), 1,67-1,58 (m, 4H), 1,49 (s, 2H), 1,37-1,26 (m, 3Н), 1,22-1,13 (m, 3Н), 1,00-0,83 (m, 12H), 0,63-0,51 (m, 3Н), 0,43-0,40 (m, 2H).

Пример 15

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(пара-толил)пропановая кислота

(S)-трет-бутил-2-амино-3-(пара-толил)пропаноат

(S)-2-амино-3-(пара-толил)пропановую кислоту 15а (400 мг, 2,23 ммоль, получена в соответствии с известным способом Organic & Biomolecular Chemistry, 2004, 2 (18), 2684-2691) растворяли в 10 мл mpem-бутилацетата. К смеси добавляли перхлорную кислоту (336,3 мг (70%), 3,34 ммоль) в атмосфере аргона и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. После реакции добавляли 10 мл воды. Водную фазу доводили до pH равного 8 насыщенным раствором бикарбоната натрия и экстрагировали дихлорметаном (5 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-амино-3-(пара-толил)пропаноата 15b (370 мг, белое твердое вещество), выход 70%.

Способ получения был аналогичен способу, описанному в Примере 1, за исключением того, что исходный материал на стадии 4 был заменен (2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(трет-бутоксикарбонил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислотой 1е и (S)-трет-бутил-2-амино-3-(пара-толил)пропаноатом 15b для получения целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(пара-толил)пропановой кислоты 15 (30 мг, белое твердое вещество).

МС m/z (ИЭР): 758,8 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,19-7,07 (m, 4Н), 4,82-4,68 (m, 2Н), 4,30-4,18 (m, 1Н), 4,15-4,05 (m, 1Н), 3,89-3,84 (m, 1Н), 3,83-3,76 (m, 1Н), 3,74-3,62 (m, 2Н), 3,47-3,12 (m, 9Н), 2,89-2,79 (m, 1Н), 2,70-2,59 (m, 4Н), 2,34-2,03 (m, 7Н), 1,91-1,75 (m, 1Н), 1,73-1,53 (m, 2Н), 1,50-1,24 (m, 4Н), 1,22-0,92 (m, 18Н), 0,90-0,79 (m, 4Н), 0,75-0,64 (m, 1Н).

Пример 16

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло [3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(тиофен-2-ил)пропановая кислота

(S)-трет-бутил-2-амино-3-(тиофен-2-ил)пропаноат

(S)-2-амино-3-(тиофен-2-ил)пропановую кислоту 16а (400 мг, 2,33 ммоль, получена в соответствии с известным способом European Journal of Organic Chemistry, 2006, (5), 1113-1116) растворяли в 10 мл трет-бутил ацетата. Смесь охлаждали до 0°С в атмосфере аргона и добавляли по каплям перхлорную кислоту (352 мг (70%), 3,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, а затем добавляли воду и доводили до pH равного 8-9 насыщенным раствором бикарбоната натрия и экстрагировали дихлорметаном. Органические фазы объединяли, последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-амино-3-(тиофен-2-ил)пропаноата 16b (370 мг, светло-желтое масло). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 228,3 [М+1]

Способ получения был аналогичен способу, описанному в Примере 1, за исключением того, что исходный материал на стадии 4 был заменен (2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(трет-бутоксикарбонил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислотой 1е и (S)-трет-бутил-2-амино-3-(тиофен-2-ил)пропаноатом 16b для получения целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(тиофен-2-ил)пропановой кислоты 16 (18 мг, белое твердое вещество).

МС m/z (ИЭР): 527,6 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 11,00 (s, 1Н), 8,44 (s, 1Н), 7,17-7,15 (d, 1Н), 6,94-6,88 (d, 2Н), 4,97-4,95 (m, 2Н), 4,10-4,08 (m, 1Н), 3,85-3,83 (m, 2Н), 3,71-3,69 (m, 2Н), 3,52-3,50 (m, 2Н), 3,37-3,34 (m, 12Н), 3,06-3,04 (m, 2Н), 2,80-2,78 (m, 2Н), 2,3-2,26 (m, 4Н), 1,64-1,59 (m, 3Н), 1,48-1,46 (m, 2Н), 1,31-1,259 (m, 12Н), 1,08-0,98 (m, 8Н), 0,89-0,82 (m, 4Н).

Пример 17

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло [3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(3-фторфенил)пропановая кислота

(S)-трет-бутил-2-амино-3-(3-фторфенил)пропаноат

(S)-2-амино-3-(3-фторфенил)пропановую кислоту 17а (549 мг, 3 ммоль, получена в соответствии с известным способом of Advanced Synthesis & Catalysis, 2012, 354 (17), 3327-3332) растворяли в 15 мл трет-бутилацетата. К смеси добавляли перхлорную кислоту (450 мг (70%), 4,5 ммоль) в атмосфере аргона при 0°С, затем перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. После реакции добавляли 30 мл воды, и органическую фазу последовательно промывали 20 мл 1 н. соляной кислоты и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Водную фазу объединяли, доводили до рН равного 8-9 насыщенным раствором бикарбоната натрия и экстрагировали дихлорметаном (100 мл × 2). Органические фазы объединяли, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-амино-3-(3-фторфенил)пропаноата 17b (600 мг, масло). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Способ получения был аналогичен способу, описанному в Примере 1, за исключением того, что исходный материал на стадии 4 был заменен (2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(трет-бутоксикарбонил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислотой 1е и (S)-трет-бутил-2-амино-3-(3-фторфенил)пропаноатом 17b для получения целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((3)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(3-фторфенил)пропановой кислоты 17 (25 мг, белое твердое вещество).

МС m/z (ИЭР): 762,8 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,29-7,21 (m, 1Н), 7,08-6,87 (m, 3Н), 4,81-4,73 (m, 1Н), 4,72-4,67 (m, 1Н), 4,61-4,53 (m, 1Н), 4,29-4,22 (m, 1Н), 4,15-4,06 (m, 1Н), 3,99-3,93 (m, 1Н), 3,75-3,58 (m, 2Н), 3,43-3,12 (m, 9Н), 2,99-2,90 (m, 1Н), 2,69-2,60 (m, 4Н), 2,30-1,97 (m, 4Н), 1,87-1,77 (m, 1Н), 1,63-1,53 (m, 1Н), 1,49-1,36 (m, 1Н), 1,18-0,92 (m, 22Н), 0,91-0,82 (m, 4Н), 0,81-0,71 (m, 1Н).

Пример 18

S-(3-оксопропил)этантиоат 18а (0,35 мг, 2,65 мкмоль) растворяли в 0,45 мл ацетонитрила. К пертузумабу в буферном растворе уксусной кислоты/ацетата натрия (10,85 мг/мл, 4,5 мл, 0,488 ммоль) при pH 4,5 добавляли раствор S-(3-оксопропил)этантиоата 18а в ацетонитриле, а затем добавляли по каплям 1,0 мл водного раствора цианоборгидрида натрия (7,06 мг, 112 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 2 часов. После завершения реакции остатки обессоливали и очищали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при pH 6,5) с получением раствора целевого продукта 18b, который использовали непосредственно на следующей стадии.

Стадия 2

К раствору 18b (15,0 мл) добавляли 0,45 мл 2,0 М раствора гидроксиламина гидрохлорида и перемешивали при 25°С в течение 30 минут. Реакционный раствор обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) с получением раствора пертузумаб-пропантиол 18 с (концентрация 1,65 мг/мл, 22,6 мл)

Стадия 3

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо) 4 (1,09 мг, 1,16 мкмоль) растворяли в 1,1 мл ацетонитрила и добавляли раствор пертузумаб-пропантиола 18с (1,65 мг/мл, 11,3 мл). После перемешивания при 25°С в течение 4 часов реакционную смесь обессоливали на колонке с силикагелем SepHadex G25 (фаза элюирования: 0,05М раствор ФСБ при рН 6,5) и фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 18 в буферном растворе ФСБ (0,75 мг/мл, 19,5 мл), который затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148119,54 (M_Ab+0D), 149331,45 (M_Ab+1D), 150407,02 (M_Ab+2D), 151297,79 (M_Ab+3D), 152448,85 (M_Ab+4D), 153782,23 (M_Ab+5D).

среднее значение: y=2,0.

Пример 19

(S)-3-(2-хлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропановую кислоту 5 (1,39 мг, 1,43 мкмоль) растворяли в 1,1 мл ацетонитрила и добавляли раствор пертузумаб-пропантиола 18 с (1,65 мг/мл, 11,3 мл) и перемешивали при 25°С в течение 4 часов. Реакционную смесь обессоливали и очищали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ, рН 6,5), фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 19 в буферном растворе ФСБ (0,78 мг/мл, 20,0 мл), а затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148119,68 (M_Ab+0D), 149308,79 (M_Ab+1D), 150194,76 (M_Ab+2D), 151354,52 (M_Ab+3D), 152410,57 (M_Ab+4D), 153375,31 (M_Ab+5D).

среднее значение: y=1,9.

Пример 20

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-метилпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 6 (1,08 мг, 1,15 мкмоль) растворяли в 1,25 мл ацетонитрила, добавляли раствор пертузумаб-пропантиола 18с (1,50 мг/мл, 12,5 мл) и перемешивали при 25°С в течение 4 часов. Реакционную смесь обессоливали и очищали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ, рН 6,5), фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 20 в буферном растворе ФСБ (0,74 мг/мл, 19,0 мл), а затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: ЖХ/МС Q-TOF 148253,27 (M_Ab+0D), 149263,59 (M_Ab+1D), 150315,25 (M_Ab+2D), 151334,45 (M_Ab+3D), 152383,92 (M_Ab+4D), 153446,37 (M_Ab+5D).

среднее значение: y=2,2.

Пример 21

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановую кислоту 8 (3,0 мг, 3,0 мкмоль) растворяли в 1,0 мл ацетонитрила и добавляли раствор пертузумаб-пропантиола 18 с (2,11 мг/мл, 10,0 мл), перемешивали при 25°С в течение 4 часов. Затем описанную выше реакционную смесь обессоливали и очищали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ, рН 6,5), фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 21 в буферном растворе ФСБ (1,31 мг/мл, 12,5 мл), а затем хранили в холодильнике при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148312,73 (M_Ab+0D), 149515,61 (M_Ab+1D), 150459,55 (M_Ab+2D), 151521,47 (M_Ab+3D), 152580,02 (M_Ab+4D).

среднее значение: у=1,7.

Пример 22

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-метиленпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 10 (1,50 мг, 1,60 мкмоль) растворяли в 1,0 мл ацетонитрила и добавляли раствор пертузумаб-пропантиола 18с (2,11 мг/мл, 10,0 мл) и перемешивали при 25°С в течение 4 часов. Реакционную смесь обессоливали и очищали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ, рН 6.5), фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0.2 мкм с получением целевого продукта 22 в буферном растворе ФСБ (1,28 мг/мл, 13,0 мл), а затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148411,82 (M_Ab+0D), 149412,97 (M_Ab+1D), 150468,08 (M_Ab+2D), 151496,41 (M_Ab+3D), 152580,37 (M_Ab+4D).

среднее значение: у=2,1.

Пример 23

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановую кислоту 12 (0,86 мг, 0,89 мкмоль) растворяли в 0,6 мл ацетонитрила и добавляли раствор пертузумаб-пропантиола 18 с (2,06 мг/мл, 6,0 мл) и перемешивали при 25°С в течение 4 часов. Реакционную смесь обессоливали и очищали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ, рН 6,5), фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 23 в буферном растворе ФСБ (0,70 мг/мл, 15 мл), а затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148092,94 (M_Ab+0D), 149296,82 (M_Ab+1D), 150339,86 (M_Ab+2D), 151416,51 (M_Ab+3D), 152516,25 (M_Ab+4D), 153422,64 (M_Ab+5D).

среднее значение: y=1,7.

Пример 24

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 14 (0,73 мг, 0,78 мкмоль) растворяли в 0,6 мл ацетонитрила и добавляли раствор пертузумаб-пропантиола 18с (2,06 мг/мл, 6,0 мл) и перемешивали при 25°С в течение 4 часов. Реакционную смесь обессоливали и очищали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ, рН 6,5), фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 24 в буферном растворе ФСБ (0,68 мг/мл, 15,5 мл), а затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148094,99 (M_Ab+0D), 149277,83 (M_Ab+1D), 150343,15 (M_Ab+2D), 151359,29 (M_Ab+3D), 152478,14 (M_Ab+4D), 153449,92 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=1,6.

Пример 25

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановая кислота

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)пиррол идин-1-карбоксилат (4R,5S)-4-метил-5-фенил-3-пропионилоксазолидин-2-он 1b (4,6 г, 20,1 ммоль) растворяли в 80 мл дихлорметана и охлаждали до 0°С в атмосфере аргона. К реакционному раствору добавляли по каплям триэтиламин (3,2 мл, 23,1 ммоль) и дибутилбора трифторметансульфонат (20 мл, 20,7 ммоль) при 0°С и перемешивали при 0°С в течение 50 минут, затем добавляли по каплям 5 мл заранее приготовленного раствора (S)-трет-бутил-2-формилпирролидин-1-карбоксилата 25а (4 г, 20,1 ммоль, получен в соответствии с известным способом Journal of the American Chemical Society, 2011, 133 (42), 16901-16910) в дихлорметане при -75°C и перемешивали в течение 1 часа при -75°С, затем 2 часа при 0°С и 1 час при комнатной температуре. К реакционному раствору добавляли смесь 60 мл фосфатного буфера (рН равно 7,0) и метанола (об./об. 1:3). Добавляли смесь 60 мл метанола и пероксида водорода (30%) (об./об. 2:1) при 0°С и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После завершения реакции органическую фазу концентрировали при пониженном давлении и добавляли 15 мл воды. Водную фазу экстрагировали эфиром (30 мл × 3), и эфирную фазу объединяли, последовательно промывали 5% раствором бикарбоната натрия, водой, насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилата 25b (2,26 г, белое вспененное твердое вещество), выход 24,9%.

МС m/z (ИЭР): 333,3 [М-100+1]

Стадия 2

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилат

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилат 25b (2 г, 4,62 ммоль) растворяли в 20 мл дихлорметана и добавляли 2 г измельченных молекулярных сит.К смеси добавляли 1,8-бис-диметиламинонафталин (2,57 г, 12 ммоль), триметилоксония тетрафторборат (1,71 г, 11,5 ммоль) при 0°С в атмосфере аргона и перемешивали при комнатной температуре в течение 17 часов. Реакционную смесь фильтровали, и фильтрационный осадок промывали дихлорметаном. Фильтрат объединяли, и органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида аммония (20 мл × 3) и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилата 25 с (1,3 г, белое вспененное твердое вещество), выход 63%.

МС m/z (ИЭР): 447,3 [М+1]

Стадия 3

(2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановая кислота

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-((4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенилоксазолидин-3-ил)-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилат 25 с (1,3 г, 2,9 ммоль) растворяли в 80 мл тетрагидрофурана. Раствор охлаждали до 0°С в атмосфере аргона и добавляли по каплям 30% пероксид водорода (1,25 г, 11 ммоль) и моногидрат гидроксида линия (207 мг, 4,95 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. После завершения реакции к реакционному раствору добавляли твердый сульфит натрия (1,47 г, 11,6 ммоль), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли небольшое количество воды, и органическую фазу концентрировали при пониженном давлении. Добавляли небольшое количество воды для растворения остатков и экстрагировали дихлорметаном (50 мл × 2). К водной фазе добавляли соляную кислоту до рН равного 3 и экстрагировали дихлорметаном (40 мл × 3). Органическую фазу промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислоты 25d (870 мг, бесцветное масло). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия 4

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутокси)-3-(2-фторфенил)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилат

(2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановую кислоту 25d (100 мг, 0,368 ммоль) растворяли в 6 мл дихлорметана и 1,8 мл диметилформамида и добавляли (S)-/трет-бутил-2-амино-3-(2-фторфенил)пропаноат 7b (97 мг, 0,405 ммоль). К смеси добавляли N,N-диизопропилэтиламин (237,8 мг, 5,587 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (509,8 мг, 1,341 ммоль) в атмосфере аргона и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем к реакционной смеси добавляли 10 мл дихлорметана и последовательно промывали водой, насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутокси)-3-(2-фторфенил)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилата 25е (157 мг, бесцветное масло), выход 83,9%.

МС m/z (ИЭР): 509,3 [М+1]

Стадия 5

(S)-трет-бутил-3-(2-фторфенил)-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-пирролидин-2-ил)пропанамидо)пропаноат

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутокси)-3-(2-фторфенил)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилат 25е (157 мг, 0,308 ммоль) растворяли в 2 мл диоксана и добавляли 4 М раствор хлорида водорода в диоксане (0,193 мл, 1,08 ммоль). Реакционную систему герметично закрывали и перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем помещали в холодильник на 12 часов при 4°С. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, и остатки растворяли в дихлорметане и промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном. Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-3-(2-фторфенил)-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((5)-пирролидин-2-ил)пропанамидо)пропаноата 25f (100 мг, бледно-желтое маслянистое). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 407,2 [М-1]

Стадия 6

(S)-трет-бутил-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат

(S)-трет-бутил-3-(2-фторфенил)-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-пирролидин-2-ил)пропанамидо)пропаноат 25f (100 мг, 0,244 ммоль), (5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-карбоновую кислоту 1i (156,1 мг, 0,244 ммоль) растворяли в 7,5 мл смешанного растворителя дихлорметана и диметилформамида (об./об. 4:1) и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (158 мг, 1,224 ммоль). К смеси добавляли 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (121 мг, 0,318 ммоль) в атмосфере аргона и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем реакционную смесь разбавляли дихлорметаном, последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноата 25g (242 мг, бледно-желтое маслянистое), выход 96,5%.

МС m/z (ИЭР): 1028,4 [М+1]

Стадия 7

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат

(S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-1-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)пиррол идин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат 25g (242 мг, 0,235 ммоль) растворяли в 3 мл дихлорметана и добавляли 3 мл диэтиламина. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, а затем концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноата 25h (250 мг, желтое маслянистое). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 806,7 [М+1]

Стадия 8

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановая кислота

Неочищенный продукт (S)-трет-бутил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропаноат 25h (262 мг, 0,325 ммоль) помещали в реакционную колбу и добавляли 7 мл 4 М раствора хлорида водорода в диоксане. Реакционную смесь герметично закрывали и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Затем реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, и остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-

фторфенил)пропановой кислоты 25 (50 мг, белое твердое вещество), выход 28,4%

МС m/z (ИЭР): 750,7 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,35-7,30 (m, 1Н), 7,20-7,15 (m, 1Н), 7,09-6,09 (m, 2Н), 4,81-4,75 (m, 1Н), 4,70-4,64 (m, 1Н), 4,15-4,13 (m, 1Н), 4,05-4,03 (m, 1Н), 3,84-3,81 (m, 1Н), 3,69-3,64 (m, 1Н), 3,55-3,51 (m, 1Н), 3,48-3,13 (m, 13Н), 3,03-2,91 (m, 2Н), 2,66-2,53 (m, 3Н), 2,47-2,45 (m, 1Н), 2,40-2,33 (m, 2Н), 2,27-2,23 (m, 1Н), 2,17-2,11 (m, 2Н), 1,96-1,85 (m, 3Н) 1,63-1,40 (m, 4Н), 1,21-1,14 (m, 3Н) 1,09-0,94 (m, 12Н), 0,87-0,84 (m, 3Н).

Пример 26

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановая кислота

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановую кислоту 25 (20 мг, 0,026 ммоль) растворяли в 3 мл дихлорметана, а затем добавляли N,N-диизопропилэтиламин (13,7 мг, 0,106 ммоль). Смесь охлаждали до 0°С в атмосфере аргона, а затем добавляли по каплям заранее приготовленный раствор 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноилхлорида 4b (10,1 мг, 0,0443 ммоль) в дихлорметане и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь гасили метанолом, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановой кислоты 26 (7 мг, белое твердое вещество), выход 28,5%.

МС m/z (ИЭР): 941,6 [М-1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,32-7,21 (m, 2Н), 7,10-7,00 (m, 2Н), 6,80-6,78 (m, 2Н), 4,75-4,55 (m, 3Н) 4,12-4,06 (m, 2Н), 3,93-3,89 (m, 1Н), 3,87-3,78 (m, 2Н), 3,69-3,63 (m, 1Н), 3,52-3,47 (m, 3Н) 3,44-3,28 (m, 3Н) 3,21-3,10 (m, 4Н), 3,04-2,96 (m, 4Н), 2,53-2,40 (m, 4Н), 2,35-2,18 (m, 2Н), 2,13-2,00 (m, 2Н), 1,94-1,75 (m, 4Н), 1,68-1,56 (m, 5Н), 1,37-1,27 (m, 4Н), 1,20-1,13 (m, 3Н) 1,05-0,81 (m, 18Н).

Пример 27

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-метоксифенил)пропановая кислота

(S)-2-амино-3-(2-метоксифенил)пропановую кислоту 27а (250 мг, 1,28 ммоль, получена в соответствии с известным способом Chemical Communications (Cambridge, United Kingdom), 2013, 49 (70), 7744-766) растворяли в 7 мл трет-бутилацетата. К раствору добавляли перхлорную кислоту (270 мг (70%), 1,88 ммоль) в атмосфере аргона и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем к реакционной смеси добавляли 10 мл дихлорметана и доводили до рН равного 8 насыщенным раствором бикарбоната натрия. Водную фазу отделяли и экстрагировали дихлорметаном (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением целевого продукта (S)-трет-бутил-2-амино-3-(2-метоксифенил)пропаноата 27b (280 мг, светло-желтое масло), выход 87%.

Способ получения был аналогичен способу, описанному в Примере 1, за исключением того, что исходный материала стадии 4 был заменен (2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислотой 25d и (S)-трет-бутил-2-амино-3-(2-метоксифенил)пропаноатом 27b для получения целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-метоксифенил)пропановой кислоты 27 (22 мг, беловатое твердое вещество).

МС m/z (ИЭР): 760,7 [М-1].

Пример 28

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-метоксифенил)пропановая кислота

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-метоксифенил)пропановую кислоту 27 (18 мг, 0,023 ммоль) растворяли в 5 мл дихлорметана. К раствору добавляли по каплям N,N-диизопропилэтиламин (12,19 мг, 0,29 ммоль), а затем добавляли заранее приготовленный раствор 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноилхлорида 4b (6,5 мг, 0,028 ммоль) в дихлорметане при 0°С и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь гасили метанолом, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-метоксифенил)пропановой кислоты 28 (4 мг, белое твердое вещество), выход 18,2%.

МС m/z (ИЭР): 955,5 [М+1]

Пример 29

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(пара-толуил)пропановая кислота

Способ получения был аналогичен способу, описанному в Примере 25, за исключением того, что исходный материал был заменен (2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислотой 25d и (S)-трет-бутил-2-амино-3-(пара-толил)пропаноатом 15b для получения целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(пара-толил)пропановой кислоты 29 (20 мг, белое твердое вещество).

МС m/z (ИЭР): 746,6 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,17-7,05 (m, 4Н), 4,84-4,67 (m, 2Н), 4,27-4,15 (m, 1Н), 4,12-4,05 (m, 1Н), 3,89-3,82 (m, 1Н), 3,78-3,63 (m, 2Н), 3,57-3,47 (m, 1Н), 3,43-3,11 (m, 7Н), 2,92-2,79 (m, 1Н), 2,67 (d, 3Н) 2,52-2,44 (m, 1Н), 2,40-2,15 (m, 7Н), 2,12-2,01 (m, 1Н), 1,95-1,69 (m, 3Н) 1,67-1,49 (m, 2Н), 1,48-1,27 (m,4Н),1,23-1,12 (m, 5Н), 1,11-0,95 (m, 14Н), 0,94-0,84 (m, 3Н).

Пример 30

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-дикосо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(пара-толуил)пропановая кислота

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(пара-толил)пропановую кислоту 29 (12 мг, 0,016 ммоль) растворяли в 1 мл дихлорметана. К раствору добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,014 мл, 0,08 ммоль) в атмосфере аргона, а затем добавляли по каплям заранее приготовленный раствор 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил) гексаноилхлорида 4b (5,54 мг, 0,024 ммоль) в дихлорметане при 0°С и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Реакционную смесь гасили метанолом и концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(пара-толил)пропановой кислоты 30 (4 мг, белое твердое вещество), выход 26,5%.

МС m/z (ИЭР): 939,4 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,22-7,03 (m, 4Н), 6,85-6,78 (m, 2Н), 4,83-4,55 (m, 3Н) 4,27-3,97 (m, 3Н) 3,90-3,62 (m, 3Н) 3,59-2,95 (m, 14Н), 2,94-2,79 (m, 1Н), 2,54-2,35 (m, 3Н) 2,34-2,12 (m, 5Н), 2,08-1,99 (m, 1Н), 1,93-1,72 (m, 3Н) 1,71-1,51 (m,5Н),1,48-1,24 (m, 8Н), 1,23-1,12 (m, 3Н) 1,11-0,78 (m, 17Н).

Пример 31

(S)-3-(3-хлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропановая кислота

(S)-2-амино-3-(3-хлорфенил)пропановую кислоту 31а (600 мг, 3 ммоль) растворяли в 15 мл трет-бутилацетата. К раствору добавляли перхлорную кислоту (450 мг (70%), 4,5 ммоль) в атмосфере аргона при 0°С и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Затем к реакционной смеси добавляли 30 мл воды, и органическую фазу последовательно промывали 20 мл 1 н. соляной кислоты и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Водную фазу объединяли и доводили до рН равного 8-9 добавлением по каплям насыщенного раствора бикарбоната натрия и экстрагировали дихлорметаном (100 мл × 2). Органические фазы объединяли, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-амино-3-(3-хлорфенил)пропаноата 31b (500 мг, масло). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Способ получения был аналогичен способу, описанному в Примере 25, за исключением того, что исходный материал на стадии 4 был заменен (2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислотой 25d и (S)-трет-бутил-2-амино-3-(3-хлорфенил)пропаноатом 31b для получения целевого продукта (S)-3-(3-хлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропановой кислоты 31 (4 мг, белое твердое вещество).

МС m/z (ИЭР): 766,6 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ 7,31-7,12 (m, 4Н), 4,73-4,51 (m, 2Н), 4,22-4,05 (m, 1Н), 3,92-3,83 (m, 1Н), 3,76-3,65 (m, 1Н), 3,62-3,51 (m, 1Н), 3,50-3,12 (m, 9Н), 3,09-2,98 (m, 1Н), 2,59-2,39 (m, 4Н), 2,38-2,24 (m, 1Н), 2,23-2,17 (m, 1Н), 2,16-2,01 (m, 3Н) 2,00-1,85 (m, 2Н), 1,84-1,76 (m, 1Н), 1,73-1,57 (m, 2Н), 1,43-1,27 (m, 5Н), 1,25-1,14 (m, 3Н) 1,10-0,95 (m, 13Н), 0,94-0,83 (m, 5Н).

Пример 32

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(3-фторфенил)пропановая кислота

Способ получения был аналогичен способу, описанному в Примере 25, за исключением того, что исходный материал на стадии 4 был заменен (2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислотой 25d и (S)-трет-бутил-2-амино-3-(3-фторфенил)пропаноатом 17b для получения целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(3-фторфенил)пропановой кислоты 32 (33,5 мг, белое твердое вещество).

МС m/z (ИЭР): 750,7 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,31-7,28 (m, 1Н), 7,08-6,95 (m, 3Н)4,77-4,69 (m, 2Н), 4,09-3,94 (m,3Н) 3,69-3,66 (m, 2Н), 3,48-3,44 (m, 2Н), 3,38-3,36 (m, 3Н) 3,34-3,28 (m, 6Н), 3,26-3,19 (m, 2Н), 3,13 (m, 1Н), 3,01-2,91 (m, 2Н), 2,67-2,65 (m, 2Н), 2,54-2,47 (m, 2Н), 2,34-2,28 (m, 2Н), 2,18-2,00 (m, 2Н), 1,98-1,77 (m, 2Н), 1,55-1,42 (m, 2Н), 1,08-0,98 (m, 18Н), 0,88-0,83 (m, 3Н).

Пример 33

(S)-3-(2,4-дихлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропановая кислота

(S)-2-амино-3-(2,4-дихлорфенил)пропановую кислоту 33а (1,3 г, 5,57 ммоль, получена в соответствии с известным способом International Journal of Peptide & Protein Research, 1987, 30 (1), 13-21) растворяли в 10 мл трет-бутилацетата. К раствору добавляли по каплям перхлорную кислоту (1,2 г (70%), 8,36 ммоль) при 0°С в атмосфере аргона и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Реакционную смесь разбавляли метиленхлоридом и добавляли по каплям насыщенный раствор бикарбоната натрия, пока значение рН не достигало 8-9. Водную фазу экстрагировали метиленхлоридом. Органические фазы объединяли, последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-амино-3-(2,4-дихлорфенил)пропаноата 33b (3,4 г, светло-желтое масло). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Способ получения был аналогичен способу, описанному в Примере 25, за исключением того, что исходный материал на стадии 4 был заменен (2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислотой 25d и (S)-трет-бутил-2-амино-3-(2,4-дихлорфенил)пропаноатом 33b для получения целевого продукта (S)-3-(2,4-дихлорфенил)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)пропановой кислоты 33 (23 мг, белое твердое вещество).

МС m/z (ИЭР): 800,6 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,43-7,42 (m, 1H), 7,26-7,23 (m, 2H), 4,75-4,67 (m, 2H), 4,14-4,04 (m, 2H), 4,00-3,98 (m, 1H), 3,91-3,89 (m, 1H), 3,68-3,67 (m, 3H), 3,39-3,26 (m, 12H), 3,21-3,12 (m, 3H), 2,67-2,64 (m, 3H), 2,50-2,46 (m, 3H), 2,31-2,28 (m, 2H), 2,17-2,15 (m, 2H), 2,02-2,00 (m, 4H), 1,90-1,88 (m, 2H), 1,74-1,72 (m, 2H), 1,39-1,37 (m, 2H), 1,06-0,98 (m, 12H).

Пример 34

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(орто-толил)пропановая кислота

(S)-2-амино-3-(орто-толил)пропановую кислоту 34а (100 мг, 0,55 ммоль, получена в соответствии с известным способом International Journal of Peptide & Protein Research, 1987, 30 (1), 13-21) растворяли в 2,5 мл трет-бутилацетата и добавляли по каплям перхлорную кислоту (107 мг (70%), 0,83 ммоль) в атмосфере аргона. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, а затем разбавляли 5 мл дихлорметана и добавляли по каплям насыщенный раствор бикарбоната натрия для доведения до рН равного 8. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (5 мл × 3). Органические фазы объединяли, последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-трет-бутил-2-амино-3-(орто-толуил)пропаноата 34b (140 мг, бесцветное масло). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Способ получения был аналогичен способу, описанному в Примере 25, за исключением того, что исходный материал на стадии 4 был заменен (2R,3R)-3--((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)лирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислотой 25d и (S)-трет-бутил-2-амино-3-(орто-толил)пропаноатом 34b для получения целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(орто-толил)пропановой кислоты 34 (40 мг, белое твердое вещество).

МС m/z (ИЭР): 746,8 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 8,41-8,39 (d, 1Н), 8,19-8,17 (d, 1Н), 7,18-7,05 (m, 4Н), 4,80-4,78 (d, 1Н), 4,71-4,69 (d, 1Н), 3,86-3,84 (m, 1Н), 3,76-3,72 (m, 1Н), 3,69-3,63 (m, 2Н), 3,48-3,42 (d, 2Н), 3,38-3,23 (m, 5Н), 3,20-3,12 (m, 4Н), 2,98-2,87 (m, 2Н), 2,66-2,65 (d, 3Н) 2,53-2,50 (d, 1Н), 2,46-2,44 (d, 1Н), 2,41-2,26 (m, 4Н), 2,21-2,14 (m, 2Н), 2,10-2,04 (m, 1Н), 1,87-1,85 (m, 2Н), 1,77-1,74 (m, 1Н), 1,62-1,53 (m, 2Н), 1,33-1,28 (m, 3Н) 1,23-1,21 (d, 2Н), 1,16-1,14 (d, 2Н), 1,08-0,96 (m, 14Н), 0,90-0,84 (m, 3Н).

Пример 35

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(тиофен-2-ил)пропановая кислота

Способ получения был аналогичен способу, описанному в Примере 25, за исключением того, что исходный материал на стадии 4 был заменен (2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислотой 25d и (S)-трет-бутил-2-амино-3-(тиофен-2-ил)пропаноатом 16b для получения целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(тиофен-2-ил)пропановой кислоты 35 (2,6 мг, белое твердое вещество).

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,21-7,19 (m, 1Н), 6,91-6,90 (m, 2Н), 4,80-4,65 (m, 2Н), 4,16-4,08 (m, 2Н), 3,93-3,90 (m, 1Н), 3,70-3,66 (m, 2Н), 3,55-3,52 (m, 1Н), 3,48-3,45 (m, 2Н), 3,40-3,26 (m, 6Н), 3,25-3,13 (m, 4Н), 2,96-2,82 (t, 1Н), 2,69-2,65 (d, 3Н) 2,52-2,47 (m, 2Н), 2,39-2,29 (m, 1Н), 2,21-2,14 (m, 2Н), 1,92-(s, 3Н) 1,63-1,61 (m, 2Н), 1,40-1,29 (m, 3Н) 1,23-1,14 (m, 3Н) 1,10-0,98 (m, 13Н), 0,88-0,85 (t, 3Н).

Пример 36

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановую кислоту 26 (5,45 мг, 5,78 мкмоль) растворяли в 1,2 мл ацетонитрила и добавляли раствор пертузумаб-пропантиола 18с (7,56 мг/мл, 12 мл) и перемешивали при 25°С в течение 4 часов. Затем реакционную смесь обессоливали и очищали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ, рН 6,5), фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 36 в буферном растворе ФСБ (3,51 мг/мл, 27,5 мл), а затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148094,39 (M_Ab+0D), 149111,06 (M_Ab+1D), 150167,12 (M_Ab+2D), 151188,93 (M_Ab+3D), 152243,46 (M_Ab+4D), 153272,96 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=1,9.

Пример 37

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-метоксифенил)пропановую кислоту 28 (1,75 мг, 1,83 мкмоль) растворяли в 0,9 мл ацетонитрила, добавляли раствор пертузумаб-пропантиола 18с (2,31 мг/мл, 9,0 мл) и перемешивали при 25°С в течение 6 часов. Затем реакционную смесь обессоливали и очищали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ, рН 6,5), фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 37 в буферном растворе ФСБ (1,35 мг/мл, 13,0 мл), а затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148093,25 (M_Ab+0D), 149281,78 (M_Ab+1D), 150474,33 (M_Ab+2D), 151372,72 (M_Ab+3D), 152373,24 (M_Ab+4D), 153469,40 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=2,3.

Пример 38

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(пара-толил)пропановую кислоту 30 (1,07 мг, 1,14 мкмоль) растворяли в 1,25 мл ацетонитрила и добавляли раствор пертузумаб-пропантиола 18c (1,5 мг/мл, 12,5 мл) и перемешивали при 25°С в течение 4,5 часов. Реакционную смесь обессоливали и очищали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ, рН 6,5), фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 38 в буферном растворе ФСБ (0,74 мг/мл, 17,5 мл), а затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148247,08 (M_Ab+0D), 149265,32 (M_Ab+1D), 150276,10 (M_Ab+2D), 151334,50 (M_Ab+3D), 152392,21 (M_Ab+4D), 153388,72 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=2,4.

Пример 39

S-(3-оксопропил)этантиоат 18а (2,44 мг, 18,5 мкмоль) растворяли в 3,0 мл ацетонитрила. К раствору нимотузумаба в буферном растворе уксусной кислоты/ацетата натрия (10,22 мг/мл, 30 мл, 0,204 ммоль) при рН 4,3 добавляли раствор S-(3-оксопропил)этантиоата 18а в ацетонитриле, а затем добавляли по каплям 1,2 мл водного раствора цианоборгидрида натрия (49,86 мг, 793 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 2 часов. Сначала реакционный раствор очищали буферным раствором ФСБ (250 мл), содержащим 10% ацетонитрил, ультрафильтрацией 30 КДа, затем очищали с помощью ультрафильтрационной кассеты 30 КДа, используя буферный раствор ФСБ (200 мл) при рН равном 6,5, чтобы удалить непрореагировавший S-(3-оксопропил)этантиоат 18а и цианоборгидрид натрия, с получением целевого продукта 39b в буферном растворе ФСБ (приблизительно 75 мл), который использовали непосредственно на следующей стадии.

Стадия 2

К 39b в буферном растворе ФСБ (75,0 мл) добавляли 2,0 мл 2,0 М раствора гидроксиламина гидрохлорида, а затем помещали на водяную баню со встряхиванием при 25°С на 30 минут. Реакционный раствор очищали ультрафильтрацией 30 КДа с буфером ФСБ с рН равном 6,5 с получением целевого продукта нимотузумаб-пропантиола 39с в буферном растворе ФСБ (концентрация 5,38 мг/мл, 55 мл).

Стадия 3

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо) 4 (4,48 мг, 4,78 мкмоль) растворяли в 1,1 мл ацетонитрила и добавляли нимотузумаб-пропантиол в буферном растворе ФСБ 39с (5,38 мг/мл, 11 мл). После встряхивания на водяной бане при 25°С в течение 4 часов реакцию останавливали.

Реакционную смесь обессоливали и очищали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) с получением неочищенного целевого продукта 39 в буферном растворе ФСБ (2,96 мг/мл, 20,5 мл), который дополнительно концентрировали приблизительно до 6 мл центрифугированием и повторно обессоливали и очищали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) с получением целевого продукта 39 в буферном растворе ФСБ (4,25 мг/мл, 11,8 мл), а затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 150188,68 (M_Ab+0D), 151234,76 (M_Ab+1D), 152248,46 (M_Ab+2D), 153419,10 (M_Ab+3D), 154312,17 (M_Ab+4D), 155358,48 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=2,2.

Пример 40

(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-2-азабицикло[3.1.0]гексан-3-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановую кислоту 8 (4,32 мг, 4,52 мкмоль) растворяли в 1,1 мл ацетонитрила и добавляли нимотузумаб-пропантиол 39с в буферном растворе ФСБ (5,38 мг/мл, 11 мл). После встряхивания на водяной бане при 25°С в течение 4 часов реакцию останавливали.

Полученную в результате смесь обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) с получением неочищенного целевого продукта 40 в буферном растворе ФСБ (2,92 мг/мл, 20 мл), который дополнительно концентрировали приблизительно до 5,5 мл и повторно обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) с получением целевого продукта 40 в буферном растворе ФСБ (4,25 мг/мл, 11,6 мл), затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 150186,98 (M_Ab+0D), 151374,09 (M_Ab+1D), 152287,22 (M_Ab+2D), 153353,26 (M_Ab+3D), 154501,80 (M_Ab+4D), 155575,57 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=2,2.

Пример 41

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-диоксо-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановую кислоту 26 (4,45 мг, 4,72 мкмоль) растворяли в 1,1 мл ацетонитрила и добавляли нимотузумаб-пропантиол 39с в буферном растворе ФСБ (5,38 мг/мл, 11 мл). После встряхивания на водяной бане при 25°С в течение 4 часов реакцию останавливали.

Полученную в результате смесь обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) с получением неочищенного целевого продукта 41 в буферном растворе ФСБ (2,96 мг/мл, 20 мл), который дополнительно центрифугировали и концентрировали приблизительно до 5,5 мл и повторно обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) с получением целевого продукта 41 в буферном растворе ФСБ (4,33 мг/мл, 11 мл), затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 150186,05 (M_Ab+0D), 151362,44 (M_Ab+1D), 152261,90 (M_Ab+2D), 153438,29 (M_Ab+3D), 154339,30 (M_Ab+4D), 155511,23 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=2,3.

Пример 42

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(2-фторфенил)пропановую кислоту 12 (0,56 мг, 0,58 мкмоль) растворяли в 0,42 мл ацетонитрила и добавляли раствор нимотузумаб-пропантиола 39c (2,06 мг/мл, 4,2 мл). После встряхивания на водяной бане при 25°С в течение 5 часов реакцию останавливали.

Реакционную смесь обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) с получением неочищенного целевого продукта 42 в буферном растворе ФСБ (0,74 мг/мл, 10 мл), который дополнительно центрифугировали с получением приблизительно 5,5 мл и повторно обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) с получением целевого продукта 42 в буферном растворе ФСБ (1,15 мг/мл, 6 мл), затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 150188,42 (M_Ab+0D), 151387,82 (M_Ab+1D), 152472,27 (M_Ab+2D), 153528,33 (M_Ab+3D).

среднее значение: у=1,0.

Пример 43

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-5-азаспиро[2.4]гептан-6-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 14 (0,60 мг, 0,63 мкмоль) растворяли в 0,42 мл ацетонитрила и добавляли раствор нимотузумаб-пропантиола 39с (2,06 мг/мл, 4,2 мл). После встряхивания на водяной бане со встряхивателем при 25°С в течение 5 часов реакцию останавливали.

Реакционную смесь обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) с получением неочищенного целевого продукта 43 в буферном растворе ФСБ (0,78 мг/мл, 9,5 мл), который дополнительно центрифугировали и концентрировали приблизительно до 5,5 мл и повторно обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 M раствор ФСБ при рН 6,5) с получением целевого продукта 43 в буферном растворе ФСБ (1,16 мг/мл, 6 мл), затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 150188,39 (M_Ab+0D), 151251,46 (M_Ab+1D), 152442,90 (M_Ab+2D), 153507,73 (M_Ab+3D).

среднее значение: у=1,0.

Пример 44

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

Стадия 1

(2S,4S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-((R)-4-бензил-2-оксооксазолидин-3-ил)-1-гидрокси-2-метил-3-оксопропил)-4-фторпирролидин-1-карбоксилат

(R)-4-бензил-3-пропионилоксазолидин-2-он 44b (21 г, 90 ммоль, получен в соответствии с известным способом Tetrahedron Letters, 1999, 40 (36), 6545-6547) растворяли в 300 мл дихлорметана и охлаждали до 0°С в атмосфере аргона. К реакционному раствору добавляли по каплям тетрахлорид титана (9,8 мл, 1,1 ммоль) при 0°С, и раствор постепенно изменял цвет с бесцветного на желтый с образованием желтого твердого вещества. Медленно добавляли по каплям N,N-диизопропилэтиламин (40 мл, 225 ммоль) с образованием белого дыма, и раствор изменял цвет с желтого на красновато-коричневый. Смесь перемешивали при 0°С в течение 1 часа, а затем охлаждали до -78°С и добавляли 50 мл (2S,4S)-трет-бутил-4-фтор-2-формилпирролидин-1-карбоксилата 44а (21,27 г, 98 ммоль, получен в соответствии с известным способом Tetrahedron: Asymmetry, 2014, 25 (3), 212-218) в дихлорметане и перемешивали еще в течение 1,5 часов при -78°С. За завершением реакции следили с помощью ТСХ. К реакционному раствору добавляли 200 мл раствора бикарбоната натрия (5%), и водную фазу экстрагировали дихлорметаном (300 мл × 2). Органические фазы объединяли, последовательно промывали водой (200 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (200 мл), высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (2S,4S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-((R)-4-бензил-2-оксооксазолидин-3-ил)-1-гидрокси-2-метил-3-оксопропил)-4-фторпирролидин-1-карбоксилата 44с (19 г, светло-желтое твердое вещество), выход 43,2%.

МС m/z (ИЭР): 351,06 [М-100+1]

Стадия 2

(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-гидрокси-2-метилпропановая кислота

(2S,4S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-((R)-4-бензил-2-оксооксазолидин-3-ил)-1-гидрокси-2-метил-3-оксопропил)-4-фторпирролидин-1-карбоксилат 44с (19 г, 42 ммоль) растворяли в 200 мл тетрагидрофурана и 50 мл воды и охлаждали до 0°С в атмосфере аргона. Медленно добавляли по каплям 30% пероксид водорода (17,2 мл, 147 ммоль), и добавляли 80 мл моногидрата гидроксида линия (2,86 г, 68 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 5 часов. К реакционному раствору добавляли 100 мл раствора сульфита натрия (21,2 г, 168 ммоль) и дополнительно перемешивали при 25°С в течение 16 часа. После завершения реакции органическую фазу концентрировали при пониженном давлении, и остатки промывали дихлорметаном (200 мл × 3). Водную фазу доводили до рН равного 3 1 н. соляной кислотой и экстрагировали дихлорметаном (200 мл × 4). Органические фазы объединяли и концентрировали при пониженном давлении. Остатки растворяли в 350 мл раствора бикарбоната натрия (5%), промывали дихлорметаном (200 мл × 2). Водную фазу доводили до рН равного 3 2 н. соляной кислотой, экстрагировали этилацетатом (200 мл × 5), и органическую фазу объединяли, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-гидрокси-2-метилпропановой кислоты 44d (11,6 г, светло-желтая вязкая жидкость). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 191,47 [М-100+1]

Стадия 3

(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановая кислота

(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-гидрокси-2-метилпропановую кислоту 44d (11,6 г, 39,8 ммоль) растворяли в 200 мл тетрагидрофурана и добавляли метилйодид (91 г, 640 ммоль) в атмосфере азота при 0°С. Затем добавляли порциями гидрид натрия (7,32 г (60%), 183 ммоль) и перемешивали при 0°С в течение 48 часов. Затем реакционную смесь гасили добавлением 500 мл ледяной воды, а затем гасили этилацетатом (150 мл). Водную фазу промывали этиловым эфиром (150 мл × 2), доводили до рН равного 3 2 н. соляной кислотой и экстрагировали этилацетатом (250 мл × 3). Органическую фазу объединяли, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислоты 44е (8,0 г, светло-желтая вязкая жидкость), выход 65,6%.

МС m/z (ИЭР): 205,68 [М-100+1]

Стадия 4

(2S,4S)-трет-бутил-4-фтор-2-((1R,2R)-1-метокси-3-(((S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилат

(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановую кислоту 44е (580 мг, 1,9 ммоль) растворяли в 15 мл ацетонитрила и добавляли (S)-метил-2-амино-3-фенилпропаноата гидрохлорид 44f (480 мг, 2,2 ммоль, получен в соответствии с известным способом Journal of Heterocyclic Chemistry, 2013, 50 (2), 320-325), N,N-диизопропилэтиламин (1,42 мл, 8 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (1,07 г, 2,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Когда реакция была завершена согласно ТСХ, реакционную смесь разбавляли 40 мл этилацетата, последовательно промывали насыщенным раствором хлорида аммония (20 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (2S,4S)-трет-бутил-4-фтор-2-((1R,2R)-1-метокси-3-(((S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилата 44g (750 мг, белое твердое вещество), выход 83,2%.

МС m/z (ИЭР): 222,62 [М-100+1]

Стадия 5

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата трифторацетат

(2S,4S)-трет-бутил-4-фтор-2-((1R,2R)-1-метокси-3-(((S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилат 44g (738 мг, 1,58 ммоль) растворяли в 15 мл дихлорметана и добавляли по каплям трифторуксусную кислоту (3 мл, 30 ммоль), затем перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Когда реакция была завершена согласно ТСХ, реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-метил 2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата трифторацетата 44h (1,24 г, желтая вязкая жидкость). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 236,39 [М+1]

Стадия 6

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата трифторацетат 44h (572 мг, 1,56 ммоль) и (5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-карбоновую кислоту 44i (868 мг, 1,56 ммоль, получена в соответствии с известным способом WO 2007008848) растворяли в 15 мл ацетонитрила и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (2,0 мл, 12 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (890 мг, 2,34 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Когда реакция была завершена согласно ТСХ, реакционную смесь разбавляли 50 мл этилацетата, последовательно промывали насыщенным раствором хлорида аммония (30 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (30 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В и систему элюентов А, с получением целевого продукта (S)-метил-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата 44j (1,4 г, белое вспененное твердое вещество), выход 99,9%.

МС m/z (ИЭР): 898,99 [М+1]

Стадия 7

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат 44j (180 мг, 0,2 ммоль) растворяли в 0,5 мл метанола, 0,5 мл тетрагидрофурана и 0,5 мл воды, а затем охлаждали до 0°С и добавляли моногидрат гидроксида линия (34 мг, 0,8 ммоль). Смесь перемешивали при 23°С в течение 2 часов. Когда реакция была завершена на основании мониторинга ТСХ и МС, реакционную смесь разбавляли 2 мл воды, добавляли 1 н. соляную кислоту до доведения рН до приблизительно 4,5 и экстрагировали этилацетатом (5 мл × 3). Объединенные органические фазы высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановой кислоты 44k (160 мг, светло-желтое вспененное твердое вещество). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 883,73 [М-1].

Стадия 8

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

Неочищенный продукт (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)-4-фторпиррол идин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 44k (160 мг, 0,2 ммоль) растворяли в 10 мл безводного этанола и добавляли 30 мг палладия на углероде (10%). Реакционную систему три раза продували водородом и перемешивали при 23°С в течение 15 часов. Когда реакция была завершена согласно ТСХ, реакционную смесь фильтровали через целит, чтобы удалить палладий на углероде, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением 120 мг остатков. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановой кислоты 44 (29 мг, белое твердое вещество), выход 21,5%.

МС m/z (ИЭР): 749,94 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,29-7,14 (m, 5Н), 4,81-4,71 (m, 2Н), 4,18-4,13 (m, 2Н), 4,05-4,03 (m, 2Н), 3,84-3,81 (m, 1Н), 3,63-3,60 (m, 1Н), 3,58-3,52 (m, 1Н), 3,48-3,13 (m, 14Н), 3,00-2,91 (m, 1Н), 2,66-1,81 (m, 11Н), 1,63-1,38 (m, 2Н), 1,21-1,10 (m, 5Н), 1,09-0,94 (m, 14Н), 0,91-0,82 (m, 3Н).

Пример 45

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 44 (1,0 г, 1,34 ммоль) растворяли в 20 мл ацетонитрила и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,53 мл, 3,0 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (560 мг, 1,48 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 23°С в течение 30 минут и добавляли 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановую кислоту 4а (300 мг, 1,41 ммоль). Когда реакция была завершена согласно ТСХ, к реакционной смеси добавляли 50 мл этилацетата и концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной флэш-хроматографией, элюируя системами элюентов В и А, с получением 1,0 г неочищенного целевого продукта, который дополнительно очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановой кислоты 45 (140 мг, белое твердое вещество), выход 11%.

МС m/z (ИЭР): 942,67 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,34-7,14 (m, 5Н), 6,83-6,80 (m, 2Н), 5,20-5,10 (m, 1Н), 5,01-4,96 (m, 1Н), 4,78-4,57 (m, 2Н), 4,18-4,01 (m, 2Н), 4,00-3,80 (m, 1Н), 3,56-3,41 (m, 5H), 3,35-3,24 (m, 10H), 3,19-2,90 (m, 4H), 2,60-2,40 (m, 4H), 2,39-2,00 (m, 4H), 1,93-1,58 (m, 6H), 1,50-1,10 (m, 7H), 1,09-0,82 (m, 21H).

Пример 46

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропановая кислота

Стадия 1

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-фторфенил)-1-метокси-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилат(2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановую кислоту 25d (1,0 г, 3,5 ммоль) растворяли в 15 мл ацетонитрила и добавляли (S)-метил-2-амино-3-(4-фторфенил)пропаноата гидрохлорид 46а (820 мг, 4 ммоль, получен в соответствии с известным способом Tetrahedron, 2003, 59 (21), 3719-3727), N,N-диизопропилэтиламин (2,7 мл, 15 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (1,9 г, 5,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 23°С в течение 12 часов. Когда реакция была завершена согласно ТСХ, реакционную смесь разбавляли 50 мл этилацетата и последовательно промывали насыщенным раствором хлорида аммония (30 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (30 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя систему элюентов В, с получением целевого продукта (S)-трет-бутил 2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-фторфенил)-1-метокси-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилата 46b (1,35 г, белое твердое вещество), выход 82,6%.

МС m/z (ИЭР): 366,46 [М-100-1].

Стадия 2

(S)-метил-3-(4-фторфенил)-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-пирролидин-2-ил)пропанамидо)пропаноата трифторацетат

(S)-трет-бутил-2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-фторфенил)-1-метокси-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилат 46b (1,34 г, 2,87 ммоль) растворяли в 20 мл дихлорметана и добавляли по каплям трифторуксусную кислоту (3 мл, 30 ммоль) и перемешивали при 23°С в течение 12 часов. Когда реакция была завершена согласно ТСХ, реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-метил-3-(4-фторфенил)-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-пирролидин-2-ил)пропанамидо)пропаноата трифторацетата 46с (1,92 г, желтая вязкая жидкость). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 366,85 [М+1]

Стадия 3

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропаноат

(S)-метил-3-(4-фторфенил)-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-пирролидин-2-ил)пропанамидо)пропаноата трифторацетат 46с (367 мг, 1,0 ммоль) и (5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-карбоновую кислоту 44i (549 мг, 1,0 ммоль) растворяли в 10 мл ацетонитрила и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (1,24 мл, 7 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (570 мг, 1,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 23°С в течение 12 часов. Когда реакция была завершена согласно TCX, реакционную смесь разбавляли 30 мл этилацетата и последовательно промывали насыщенным раствором хлорида аммония (20 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя системами элюентов В и А с получением целевого продукта (S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропаноата 46d (760 мг, белое вспененное твердое вещество), выход 84,6%.

МС m/z (ИЭР): 898,10 [М+1]

Стадия 4

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропановая кислота

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропаноат 46d (180 мг, 0,2 ммоль) растворяли в 0,5 мл метанола, 0,5 мл тетрагидрофурана и 0,5 мл воды и охлаждали до 0°С, а затем добавляли моногидрат гидроксида линия (34 мг, 0,8 ммоль) и перемешивали при 23°С в течение 2 часов. Когда реакция была завершена на основании мониторинга ТСХ и МС, реакционную смесь разбавляли 2 мл воды, добавляли 1 н. соляную кислоту до доведения рН до приблизительно 4,5 и экстрагировали этилацетатом (5 мл × 3). Объединенные органические фазы высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропановой кислоты 46е (160 мг, белое твердое вещество). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС m/z (ИЭР): 883,78 [М-1]

Стадия 5

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропановая кислота

Неочищенный продукт (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-втор-бутил)-5,8-диизопропил-12-метокси-4,10-диметил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазатетрадекан-14-оил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропановую кислоту 46е (160 мг, 0,2 ммоль) растворяли в 10 мл безводного этанола и добавляли 30 мг палладия на углероде (10%). Из реакционной смеси три раза вытесняли воздух водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов. Когда реакция была завершена согласно ТСХ, реакционную смесь фильтровали через целит, чтобы удалить палладий на углероде, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением 130 мг остатков. Остатки очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропановой кислоты 46 (34 мг, белое твердое вещество), выход 25,2%.

МС m/z (ИЭР): 749,94 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,31-7,24 (m, 2Н), 7,02-6,92 (m, 2Н), 4,48-4,58 (m, 2Н), 4,22-4,11 (m, 1Н), 3,85-3,40 (m, 4Н), 3,39-3,04 (m, 14Н), 3,00-2,90 (m, 1Н), 2,66-2,40 (m, 5Н), 2,39-2,02 (m, 4Н), 1,99-1,75 (m, 3Н) 1,73-1,24 (m, 3Н) 1,20-1,10 (m, 4Н), 1,09-0,95 (m, 16Н), 0,94-0,80 (m, 3Н).

Пример 47

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропановая кислота

6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексановую кислоту 4а (434 мг, 2,06 ммоль) растворяли в 20 мл ацетонитрила и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (844 мл, 6,55 ммоль) и 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (781 мг, 1,87 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 23°С в течение 30 минут и добавляли (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропановую кислоту 46 (1,4 г, 1,87 ммоль). Когда реакция была завершена согласно ТСХ, к реакционной смеси добавляли 50 мл этилацетата и концентрировали при пониженном давлении. Остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя системами растворителей В и А, с получением неочищенного целевого продукта, 1,2 г, который дополнительно очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с получением целевого продукта (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропановой кислоты 47 (670 мг, белое твердое вещество), выход 37,9%.

МС m/z (ИЭР): 944,54 [М+1]

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 12,80 (br,s, 1Н), 8,56-8,52 (m, 1Н), 8,42-8,20 (m, 1Н), 8,18-8,10 (m, 1Н), 7,30-7,18 (m, 2Н), 7,07-6,75 (m, 4Н), 4,64-4,34 (m, 3Н) 4,08-3,94 (m, 1Н), 3,80-3,50 (m, 2Н), 3,46-2,70 (m, 15H), 2,50-1,80 (m, 6H), 1,73-1,38 (m,7H), 1,30-1,10 (m, 12H), 1,09-0,62 (m, 20H).

Пример 48

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 45 (1,1 мг, 1,16 мкмоль) растворяли в 1,1 мл ацетонитрила и добавляли нимотузумаб-пропантиол 39с в буферном растворе ФСБ (1,63 мг/мл, 11,4 мл). После перемешивания на водяной бане со встряхивателем при 25°С в течение 4 часов реакционную смесь обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) и фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 48 в буферном растворе ФСБ (0,75 мг/мл, 19,8 мл), затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 150186,5 (M_Ab+0D), 151364,1 (M_Ab+1D), 152262,3 (M_Ab+2D), 153435,7 (M_Ab+3D), 154499,6 (M_Ab+4D), 155427,5 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=2,0.

Пример 49

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропановую кислоту 47 (1,1 мг, 1,16 мкмоль) растворяли в 1,1 мл ацетонитрила и добавляли нимотузумаб-пропантиол 39с в буферном растворе ФСБ (1,63 мг/мл, 11,4 мл). После перемешивания на водяной бане со встряхивателем при 2 5°С в течение 4 часов реакционную смесь обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) и фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 49 в буферном растворе ФСБ (0,75 мг/мл, 19,8 мл), затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 150185,5 (M_Ab+0D), 151364,7 (M_Ab+1D), 152261,2 (M_Ab+2D), 153436,2 (M_Ab+3D), 154499,9 (M_Ab+4D), 155428,6 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=2,0.

Пример 50

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 45 (1,09 мг, 1,16 мкмоль) растворяли в 1,1 мл ацетонитрила и добавляли раствор пертузумаб-пропантиола 18с (1,65 мг/мл, 11,3 мл). После перемешивания на водяной бане со встряхивателем при 25°С в течение 4 часов реакционную смесь обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) и фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0.2 мкм с получением целевого продукта 50 в буферном растворе ФСБ (0,75 мг/мл, 19,5 мл), затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148095,6 (M_Ab+0D), 149111,5 (M_Ab+1D), 150165,3 (M_Ab+2D), 151184,7 (M_Ab+3D), 152255,2M_Ab+4D), 153297,5 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=2,0.

Пример 51

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропановую кислоту 47 (1,09 мг, 1,16 мкмоль) растворяли в 1,1 мл ацетонитрила и добавляли раствор пертузумаб-пропантиола 47с (1,65 мг/мл, 11,3 мл). После перемешивания на водяной бане со встряхивателем при 25°С в течение 4 часов реакционную смесь обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) и фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 51 в буферном растворе ФСБ (0,75 мг/мл, 19,5 мл), затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148096,2 (M_Ab+0D), 149112,2 (M_Ab+1D), 150165,4 (M_Ab+2D), 151184,8 (M_Ab+3D), 152255,1 (M_Ab+4D), 153297,6 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=2,0.

Пример 52

Стадия 1

5-(3-оксопропил)этантиоат 18а (0,35 мг, 2,65 мкмоль) растворяли в 0,45 мл ацетонитрила. К трастузумабу в буферном растворе уксусной кислоты/ацетата натрия (10,0 мг/мл, 4,5 мл, 0,304 мкмоль) при рН 4,5 добавляли раствор S-(3-оксопропил)этантиоата 18а в растворе ацетонитрила, а затем добавляли по каплям 1,0 мл водного раствора цианоборгидрида натрия (7,06 мг, 112 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 2 часов. После завершения реакции реакционную смесь очищали обессоливанием на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) с получением раствора целевого продукта 52b, который использовали непосредственно на следующей стадии.

Стадия 2

К раствору 52b (приблизительно 15,0 мл) добавляли 0,45 мл 2,0 М раствора гидроксиламина гидрохлорида, и реакционную смесь встряхивали при 25°С в течение 30 минут. Реакционный раствор обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ) с получением раствора целевого продукта трастузумаб-пропантиола 52с (концентрация 1,65 мг/мл, 22,6 мл).

Стадия 3

(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)-4-фторпирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту 45 (1,1 мг, 1,2 мкмоль) растворяли в 1,1 мл ацетонитрила и добавляли раствор трастузумаб-пропантиола 52с (1,65 мг/мл, 11,3 мл). После помещения на встряхиватель при 25°С на 4 часа реакционную смесь обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) и фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 52 в буферном растворе ФСБ (0,72 мг/мл, 20 мл), затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148062,9 (M_Ab+0D), 149235,2 (M_Ab+1D), 150259,8 (M_Ab+2D), 151268,2 (M_Ab+3D), 152341,9 (M_Ab+4D), 153356,4 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=2,0.

Пример 53

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-(4-фторфенил)пропановую кислоту 47 (1,12 мг, 1,2 мкмоль) растворяли в 1,1 мл ацетонитрила и добавляли раствор трастузумаб-пропантиола 52с (1,65 мг/мл, 11,3 мл). После помещения на встряхиватель при 25°С на 4 часа реакционную смесь обессоливали на колонке с силикагелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М раствор ФСБ при рН 6,5) и фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм с получением целевого продукта 53 в буферном растворе ФСБ (0,70 мг/мл, 20,5 мл), затем хранили при 4°С.

Характеристические пики ЖХ/МС Q-TOF: 148065,2 (M_Ab+0D), 149244,6 (M_Ab+1D), 150254,9 (M_Ab+2D), 151280,9 (M_Ab+3D), 152301,6 (M_Ab+4D), 153457,9 (M_Ab+5D).

среднее значение: у=2,0.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Тестовый пример 1: Тест на ингибирование пролиферации опухолевых клеток in vitro соединением формулы (D)

1. Цель эксперимента

Цель данного эксперимента состоит в тестировании in vitro ингибиторного действия соединения формулы (D) в соответствии с настоящим изобретением на пролиферацию опухолевых клеток HepG2 (клеток печеночно-клеточной карциномы человека, банк клеток Китайской академии наук, №TCHu 72) и опухолевых клеток А549 (аденокарциномы легкого человека, банк клеток Китайской академии наук, №TCHu150). Клетки обрабатывали различными концентрациями соединения in vitro, после 76 часов инкубации пролиферацию клеток определяли с помощью реагента CCK-8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo, №CK04), и активность соединения in vitro оценивали в соответствии со значением IC₅₀.

2. Протокол эксперимента

Далее описан пример способа тестирования пролиферации in vitro клеток HepG2 с целью иллюстрации тестирования соединений в соответствии с настоящим изобретением на ингибиторную активность в отношении пролиферации опухолевых клеток in vitro. Этот способ также применим без ограничений к тестам на ингибирование пролиферации in vitro на других опухолевых клетках.

2.1 Пролиферация клеток

Клетки HepG2 в логарифмической фазе роста один раз промывали ФСБ (фосфатный буфер, ThermoFisher) и добавляли 2-3 мл трипсина (0,25% трипсин-ЭДТА (1х), Gibico, Life Technologies) для расщепления на 2-3 мин. После полного расщепления клеток добавляли 10-15 мл питательной среды для культивирования клеток (среда DMEM/F12, Invitrogen; 10% (об/об)). Расщепленные клетки HepG2 элюировали и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 мин. Супернатант отбрасывали, а затем добавляли 10-20 мл питательной среды для культивирования клеток, чтобы ресуспендировать клетки с получением суспензии отдельных клеток.

2.2 Посев клеток

Суспензию отдельных клеток HepG2 перемешивали, и плотность клеток доводили до 6×10⁴ клеток/мл питательной средой для культивирования клеток. Суспензию клеток с отрегулированной плотностью перемешивали до однородности и наносили в 96-луночный планшет для клеточных культур по 100 мкл/лунка. Планшеты инкубировали в 5% СО₂ инкубаторе при 37°С в течение 18-20 часов.

2.3 Подготовка соединения

Соединение растворяли в ДМСО (диметилсульфоксид, Shanghai Titan Technology Co., Ltd.) с получением раствора для хранения, имеющего исходную концентрацию 10 мМ.

10 мкл 10 мМ раствора соединения вносили в лунки первой колонки 96-луночного планшета с U-образным дном (планшет 1 для образцов), в каждую лунку с образцом соединения первой колонки вносили 90 мкл ДМСО, т.е. в начальной точке исходный раствор был разведен в 10 раз. Затем выполняли разведение с 3-кратным градиентом, разводя концентрацию каждого соединения в 10 раз. В качестве разбавителя использовали раствор ДМСО. В 12-ю колонку вносили 60 мкл 100% ДМСО, а в 11-ю колонку вносили 20 мкл 1 мМ положительного контрольного лекарственного средства.

Брали новый 96-луночный планшет с U-образным дном (планшет 2 для образцов), и каждый образец в планшете 1 для образцов разводили в 20 раз полной питательной средой. Затем брали новый 96-луночный планшет с U-образным дном (планшет 3 для образцов), и образец в каждой лунке в планшете 2 для образцов подвергали конечному 10-кратному разведению.

2.4 Нанесение образца

После завершения предварительного культивирования клеток 96-луночный планшет для клеточных культур извлекали, и супернатант отбрасывали. Каждое разведение образца в 96-луночном планшете 3 для образцов последовательно вносили в 96-луночный планшет для клеточных культур в количестве 100 мкл/лунка. Каждый образец соединения тестировали в двух повторностях при каждой концентрации. Процедура нанесения не должна была превышать 30 мин. После завершения операции добавления 96-луночный планшет для клеточных культур инкубировали при 37°С в течение приблизительно 76 часов в 5% CO₂ инкубаторе.

2.5 Процедура окрашивания

Брали 96-луночный планшет для клеточных культур, и в каждую лунку вносили CCK-8 по 100 мкл/лунка. Планшет для клеточных культур осторожно постукивали с перемешиванием более 10 раз и инкубировали при 37°С в течение 2 часов в 5% СО₂ инкубаторе.

2.6 Считывание планшета

96-луночный планшет для клеточных культур брали и помещали в считывающее устройство для микропланшетов (PerkinElmer, VICTOR 3) и измеряли оптическую плотность при 450 нм с использованием считывающего устройства.

В соответствии с описанной выше процедурой тестировали ингибиторную активность соединения в соответствии с настоящим изобретением в отношении пролиферации опухолевых клеток А549 in vitro. Питательная среда для культивирования клеток также представляла собой DMEM/F12.

3. Анализ данных

Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel и Graphpad Prism 5. Результаты представлены в Таблице 1.

Тестовый пример 2: Тест на ингибирование пролиферации опухолевых клеток in vitro конъюгатом антитела с лекарственным средством по настоящему изобретению, нацеленным на HER2

Цель данного эксперимента состоит в тестировании ингибиторного действия на пролиферацию in vitro конъюгата антитела с лекарственным средством, нацеленного на HER2, в соответствии с настоящим изобретением в отношении опухолевых клеток SK-BR-3 (клетки рака молочной железы человека, АТСС, НТВ-30). Клетки обрабатывали различными концентрациями соединения in vitro, после 76 часов инкубации пролиферацию клеток определяли с помощью реагента CCK-8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo, No. CK04), и активность соединения in vitro оценивали в соответствии со значением IC₅₀.

В соответствии со способом тестирования, описанным в Тестовом примере 1, тестовыми клетками были SK-BR-3, а питательная среда для культивирования клеток представляла собой среду Маккоя 5А (Gibco, №16600-108), содержащую 10% фетальную бычью сыворотку (ФБС). Релевантные соединения тестировали, результаты представлены в Таблице 2.

Вывод: Конъюгаты антитела с лекарственным средством, нацеленные на HER2, в соответствии с настоящим изобретением обладают значимым ингибиторным действием на пролиферацию опухолевых клеток SK-BR-3.

Тестовый пример 3: Тест на ингибирование пролиферации опухолевых клеток in vitro конъюгатом антитела с лекарственным средством по настоящему изобретению, нацеленного на EGFR

Цель данного эксперимента состоит в тестировании ингибиторного действия на пролиферацию in vitro конъюгата антитела с лекарственным средством, нацеленного на EGFR, в соответствии с настоящим изобретением в отношении опухолевых клеток НСС827 (клетки немелкоклеточного рака легкого, банк клеток Китайской академии наук, №TCHu153). Клетки обрабатывали различными концентрациями соединения in vitro, после 76 часов инкубации пролиферацию клеток определяли с помощью реагента CCK-8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo, No. CK04), и активность соединения in vitro оценивали в соответствии со значением IC₅₀.

В соответствии со способом тестирования, описанным в Тестовом примере 1, тестовые клетки представляли собой НСС827, а питательная среда для культивирования клеток представляла собой среду RPMI1640 (Invitrogen), содержащую 10% (об./об.) фетальную бычью сыворотку (ФБС). Релевантные соединения тестировали, результаты представлены в Таблице 3.

Вывод: Конъюгаты антитела с лекарственным средством, нацеленные на EGFR, в соответствии с настоящим изобретением обладают значимым ингибиторным действием на пролиферацию опухолевых клеток НСС827.

Тестовый пример 4: Тест на степень ингибирования опухоли NCI-N87

1. Цель эксперимента

Оценить и сравнить действие конъюгатов антитела с цитотоксином в соответствии с настоящего изобретения на трансплантированные опухоли клеток NC1-N87 (клетки рака желудка человека с гиперэкспрессией HER2, АТСС, CRL-5822) в линии бестимусных мышей.

2. Тестируемые лекарственные средства

Исследуемый образец: соединение 18, соединение 21, соединение 36.

Положительный контроль: пертузумаб, трастузумаб.

Способ приготовления: все готовили в физиологическом растворе.

3. Подопытные животные

Бестимусные мыши линии BALB/cA, 6-7 недель, самки, приобретенные у Shanghai Slack Experimental Animal Co., Ltd. Номер сертификата: SCXK (г. Шанхай) 2012-0002. Кормовая среда: Уровень отсутствия специфичной патогенной флоры (SPF).

4. Методики тестирования

Бестимусным мышам инокулировали подкожно клетки рака желудка человека NCI-N87, и животных рандомизированно делили на группы (Д0) после роста опухоли до 100-200 мм³. Дозировка и схема введения представлены в Таблице 4. Объем опухоли у мышей измеряли 2-3 раза в неделю, измеряли массу тела и регистрировали данные.

Объем опухоли (V) рассчитывают по следующей формуле:

V=1/2×a×b²

где: а и b представляют собой длину и ширину соответственно.

Т/С(%)=(Т-Т₀)/(С-С₀)×100%, где Т и С представляют собой объем опухоли в конце эксперимента; Т₀ и С₀ представляют собой объем опухоли в начале эксперимента.

Д0: Время первого введения; пертузумаб и трастузумаб: Первое удвоение дозы; Значение Р сравнивали с контрольной группой, получавшей растворитель; использовали адаптированный t-критерий Стьюдента. Количество мышей в начале эксперимента составляло: Контрольная группа n=12, Подопытная группа n=6.

5. Результат

Соединения по настоящему изобретению могут значимо ингибировать рост опухоли с гиперэкспрессией HER2, подкожно трансплантированной бестимусным мышам NCI-N87, и мыши, несущие опухоли, лучше переносили описанные выше лекарственные средства.

Тестовый пример 5. Тест на эффективность антитела EGFRV3 и его ADC в отношении трансплантированной опухоли НСС827 у бестимусных мышей

1. Цель эксперимента

В данном тесте бестимусных мышей использовали в качестве тестовых животных для оценки эффективности соединения ADC 39 и 40 по настоящему изобретению в отношении трансплантированной опухоли немелкоклеточного рака легкого человека НСС827 у бестимусных мышей после многократной интраперитонеальной инъекции.

Эффект ингибирования опухоли наблюдали после многократной интраперитонеальной инъекции одного из соединений ADC 39 и 40 по настоящему изобретению, и эксперимент был завершен в день 38 после введения. Результаты теста показали, что степень ингибирования опухоли соединением ADC 39 (0,05 мг/мышь) составляет 62,78%, и различие является статистически значимым по сравнению с контрольной группой (р менее 0,05). Степень ингибирования опухоли соединением ADC 40 (0,025 мг/мышь) составляет 49,20%, что не является статистически значимым по сравнению с группой, получавшей бланковый контрольный раствор. Степень ингибирования опухоли соединением ADC 40 (0,05 мг/мышь) составляет 86,8%, что является статистически значимым по сравнению с группой, получавшей бланковый контрольный раствор (р менее 0,01). Степень ингибирования опухоли соединением ADC 40 (0,1 мг/мышь) составляет 93,41%, что является статистически значимым по сравнению с группой, получавшей бланковый контрольный раствор (р менее0,05).

2. Тестируемые лекарственные средства и материалы

2.1 Тестируемые лекарственные средства

Соединения ADC по настоящему изобретению: соединение ADC 39, соединение ADC 40.

2.2 Способ приготовления лекарственного средства

Все готовили в физиологическом растворе.

2.3 Тестовые животные

Бустимусные мыши, SPF, 16-20 г, самки, приобретенные у Shanghai Xi Puer Bikai Experimental Animal Co., Ltd. Номер сертификата: SCXK (г. Шанхай) 2008-0016.

3. Протокол теста

Трансплантацию опухолевых клеток проводили после адаптации бестимусных мышей к условиям лаборатории в течение трех дней. Клетки НСС827 инокулировали подкожно в области ребер справа (4×10⁶ + 50% матригель/мышь). В день 21 после инокуляции вводили исследуемое лекарственное средство, когда рост опухоли достигал 209,41+25,93 мм³ (д1). Конкретная доза и способ введения представлены в Таблице 5.

Объем опухоли у мышей измеряли два раза в неделю, массу тела бестимусных мышей определяли путем взвешивания, и данные регистрировали.

Статистическое программное обеспечение Excel: среднее значение рассчитывают как среднее арифметическое; стандартное отклонение (SD) рассчитывают как STDEV; стандартную ошибку рассчитывают как STDEV/SQRT; значение Р между различными группами рассчитывают как TTEST.

Объем опухоли (V) рассчитывают как: V=1/2×L_длина×L_ширина²

Относительный объем (RTV)=V_T/V₀

Степень ингибирования опухоли (%)=(C_RTV-T_RTV)/C_RTV (%)

где V₀ и V_T представляют собой объем опухоли в начале эксперимента и в конце эксперимента соответственно. C_RTV и T_RTV представляют собой относительный объем опухоли контрольной группы, получавшей бланковый раствор, и подопытной группы в конце эксперимента соответственно.

4. Результат

Результаты эксперимента показали, что степень ингибирования опухоли соединением ADC 39 (0,05 мг/мышь) составляет 62,78% в день 38, и различие является статистически значимым (р менее 0,05) по сравнению с контрольной группой, получавшей бланковый раствор. Степень ингибирования опухоли соединением ADC 40 (0,025 мг/мышь) составляет 49,20%, что не отличается статистически значимо от группы, получавшей бланковый контрольный раствор (Р более 0,05). Степень ингибирования опухоли соединением ADC 40 (0,05 мг/мышь) и соединением ADC 40 (0,1 мг/мышь) составляет 86,8% и 93,41% соответственно, что статистически значимо отличается от группы, получавшей бланковый контрольный раствор (Р менее 0,01). Кроме того, противоопухолевый эффект соединения ADC 40 в трех различных по дозе группах является дозозависимым.

1. Соединение формулы (PC-L-D) или его фармацевтически приемлемая соль:

где:

каждый из R²-R⁷ выбран из C_1-6 алкила;

любые два из R⁸-R¹¹ присоединены друг к другу с образованием C_3-8 циклоалкила, каждый из остальных двух выбран из группы, состоящей из атома водорода, C_1-6 алкила и C_3-8 циклоалкила;

каждый из R¹²-R¹³ выбран из группы, состоящей из атома водорода и C_1-6 алкила;

R¹⁴ выбран из C_6-10 арила и гетероарила, где C_6-10 арил или гетероарил необязательно замещены одной или более групп, выбранных из группы, состоящей из атома галогена, C_1-6 алкила и C_1-6 алкокси; при этом гетероарил относится к гетероарильной системе, имеющей от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из O, S и N, и имеющей от 5 до 10 кольцевых атомов;

y равно 1–8;

PC представляет собой антитело; L представляет собой линкер.

2. Соединение (PC-L-D) или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, в котором y равно 2–5.

3. Соединение (PC-L-D) или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, которое представляет собой соединение (PC-L'-D) или его фармацевтически приемлемую соль:

где:

R¹⁵ выбран из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена, C_1-6 алкила;

R¹⁶ представляет собой C_1-6 алкил;

n равно 2-6, предпочтительно 2-5;

m равно 0-5, предпочтительно 1-3;

PC, y, R²-R¹⁴ являются такими, как определено в п. 1.

4. Соединение (PC-L'-D) или его фармацевтически приемлемая соль по п. 3, которое представляет собой соединение (PC-L'-D1) или его фармацевтически приемлемую соль:

;

где PC, y, n, m, R²-R¹², R¹⁴-R¹⁶ являются такими, как определено в п. 3.

5. Соединение (PC-L-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1–4, где соединение выбрано из группы, состоящей из:

где PC, y являются такими, как определено в п. 1.

6. Соединение (PC-L-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1–5, где PC выбрано из пертузумаба, нимотузумаба или трастузумаба.

7. Соединение (PC-L-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп.1-6, где соединение выбрано из группы, состоящей из:

где y является таким, как определено в п. 1.

8. Соединение формулы (D):

или его энантиомер, диастереомер или их смеси или его фармацевтически приемлемые соли,

где:

R¹ представляет собой атом водорода;

каждый из R²-R⁷ выбран из C_1-6 алкила;

любые два из R⁸-R¹¹ присоединены друг к другу с образованием C_3-8 циклоалкила, каждый из остальных двух выбран из группы, состоящей из атома водорода, C_1-6 алкила и C_3-8 циклоалкила;

R¹⁴ выбран из C_6-10 арила и гетероарила, где C_6-10 арил или гетероарил возможно замещены одной или более групп, выбранных из группы, состоящей из атома галогена, C_1-6 алкила и C_1-6 алкокси;

каждый из R¹²-R¹³ выбран из группы, состоящей из атома водорода и C_1-6 алкила;

при этом гетероарил относится к гетероарильной системе, имеющей от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из O, S и N, и имеющей от 5 до 10 кольцевых атомов.

9. Соединение формулы (D) по п. 8, которое представляет собой соединение формулы (D1):

или его энантиомер, диастереомер или их смеси или его фармацевтически приемлемые соли, где R¹-R¹², R¹⁴ являются такими, как определено в п. 8.

10. Соединение формулы (D) по любому из пп. 8–9, где соединение выбрано из группы, состоящей из:

11. Соединение формулы (L₁-D):

где:

n равно 2–6, предпочтительно 2–5;

каждый из R²-R⁷ выбран из C_1-6 алкила;

любые два из R⁸-R¹¹ присоединены друг к другу с образованием C_3-8 циклоалкила, каждый из остальных двух выбран из группы, состоящей из атома водорода, C_1-6 алкила и C_3-8 циклоалкила;

каждый из R¹²-R¹³ выбран из группы, состоящей из атома водорода и C_1-6 алкила;

R¹⁴ выбран из C_6-10 арила и гетероарила, где C_6-10 арил или гетероарил необязательно замещены одной или более групп, выбранных из группы, состоящей из атома галогена, C_1-6 алкила и C_1-6 алкокси;

при этом гетероарил относится к гетероарильной системе, имеющей от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из O, S и N, и имеющей от 5 до 10 кольцевых атомов.

12. Соединение формулы (L₁-D) по п. 11, где соединение выбрано из группы, состоящей из:

13. Способ получения соединения формулы (PC-L’-D) по п. 3, включающий стадии:

соединение формулы (PC-L2) подвергают взаимодействию с соединением формулы (L1-D1) с получением соединения формулы (PC-L’-D);

где каждый из R²-R⁷ выбран из C_1-6 алкила;

любые два из R⁸-R¹¹ присоединены друг к другу с образованием C_3-8 циклоалкила, каждый из остальных двух выбран из группы, состоящей из атома водорода, C_1-6 алкила и C_3-8 циклоалкила;

каждый из R¹²-R¹³ выбран из группы, состоящей из атома водорода и C_1-6 алкила;

R¹⁴ выбран из C_6-10 арила и гетероарила, где C_6-10 арил или гетероарил необязательно замещены одной или более групп, выбранных из группы, состоящей из атома галогена, C_1-6 алкила и C_1-6 алкокси;

при этом гетероарил относится к гетероарильной системе, имеющей от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из O, S и N, и от 5 до 10 атомов в кольце;

y равно 1–8;

R¹⁵ выбран из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена и C_1-6 алкила;

R¹⁶ выбран из C_1-6 алкила;

n равно 2-6, предпочтительно 2-5;

m равно 0-5, предпочтительно 1-3;

PC представляет собой антитело.

14. Соединение формулы (D-A):

или его энантиомер, диастереомер или их смеси или его фармацевтически приемлемые соли,

где:

любые два из R⁸-R¹¹ присоединены друг к другу с образованием C_3-8 циклоалкила, остальные два необязательно выбраны из группы, состоящей из атома водорода, C_1-6 алкила и C_3-8 циклоалкила;

R¹² выбран из группы, состоящей из атома водорода и C_1-6 алкила;

P представляет собой атом водорода или защитную группу, и защитная группа предпочтительно представляет собой Boc, Bn или Cbz, наиболее предпочтительно Boc;

R' представляет собой атом водорода.

15. Соединение формулы (D-A) по п. 14, где соединение выбрано из группы, состоящей из:

и .

16. Фармацевтическая композиция для применения в лечении рака, содержащая терапевтически эффективное количество конъюгата лиганда с цитотоксическим лекарственным средством по любому из пп. 1–7, или лекарственное средство по любому из пп. 8–12, или его фармацевтически приемлемую соль и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.

17. Применение конъюгата лиганда с цитотоксическим лекарственным средством по любому из пп. 1–7, или лекарственного средства по любому из пп. 8–12, или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции по п. 16 при получении лекарственного препарата для лечения рака, где рак ассоциирован с экспрессией HER2 или EGFR.

18. Конъюгат лиганда с цитотоксическим лекарственным средством по любому из пп. 1–7 или лекарственное средство по любому из пп. 8–12, или его фармацевтически приемлемая соль, или фармацевтическая композиция по п. 16 для применения при получении препарата для лечения рака, где млекопитающее представляет собой человека, рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичника, рака желудка, рака эндометрия, рака слюнной железы, рака легкого, рака ободочной кишки, рака почки, колоректального рака, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, острого лимфоцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, острого промиелоцитарного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы и рецидивирующей анапластической крупноклеточной лимфомы, предпочтительно рака молочной железы, лимфомы Ходжкина или рецидивирующей анапластической крупноклеточной лимфомы; более предпочтительно рака молочной железы.