Способ получения усиленного сигнала комбинационного рассеяния света от молекул сывороточного альбумина человека в капле жидкости

Изобретение относится к оптике и биофизике. Cпособ получения усиленного сигнала комбинационного рассеяния света от молекул сывороточного альбумина человека в капле жидкости с помощью плазмонного эффекта, индуцируемого на наночастицах серебра когерентным лазерным излучением, отличается тем, что на серебряную пленку наносят водную каплю, содержащую сывороточный альбумин человека и наночастицы серебра размером 32 нм. Затем лазер фокусируют на участке капли, обладающем наибольшим радиусом кривизны, и детектируют усиленное комбинационное рассеяние молекул белка вблизи поверхности капли. Технический результат заключается в возможности получения повторяемого сигнала гигантского комбинационного рассеяния от молекул белка – сывороточного альбумина человека в растворе, производя его детекцию и последующее определение структуры в нативной форме. 1 ил.

 

Изобретение относится к области физики, а именно к оптике, и представляет способ получения усиленного сигнала комбинационного рассеяния света от молекул сывороточного альбумина человека (до порядков 103) с помощью электромагнитного поля плазмонов, генерируемых под действием когерентного лазерного излучения на структурированных и коллоидных наночастицах серебра. Изобретение может быть использовано в физике, биофизике, медицине.

Известны работы, являющиеся предпосылками заявляемого изобретения. Нижеприведенные примеры составляют часть предпосылок заявляемого изобретения и/или раскрывают методики, которые можно применять к некоторым аспектам заявляемого изобретения.

В частности, в работе (Dasary S. S. R. et al. Gold nanoparticle based label-free SERS probe for ultrasensitive and selective detection of trinitrotoluene // Journal of the American Chemical Society. - 2009. - T. 131. - №. 38. - C. 13806-13812) предложен метод обнаружения ряда взрывчатых веществ в низких концентрациях. Проблема детектирования заключается в неодостаточной степени повторяемости сигнала ГКР, а также в подборе рабочей концентрации вещества, т.к. следы аналита могут быть, как рассеяны в воздухе в малой концентрации, так и содержаться в больших концентрациях и не давать разрешенного спектра. Некоторые из наиболее часто встречаемых взрывчатых веществ, таких как тринитротолуол, гексоген и пентаэритриттетранитрат, имеют очень низкое давление паров, и, как следствие, низкий предел обнаружения. Интенсивные исследования тринитротолуола показали, что данное вещество дает низкий уровень спектрального сигнала и демонстрирует высокую чувствительность к средствам усиления сигнала ГКР. В частности, в работе [Bertone J.F., Spencer K.M., Sylvia J.M. Fingerprinting CBRNE materials using surface-enhanced Raman scattering // Chemical, Biological, Radiological, Nuclear, and Explosives (CBRNE) Sensing IX. - International Society for Optics and Photonics, 2008. - T. 6954. - C. 69540J] приведена методология применения гидроксида натрия для обработки средств усиления спектрального сигнала, созданных на основе золота. Однако в данном способе используется источник лазерного излучения - 100 Вт, что очень высоким значением мощности, которое может нести угрозу повреждения образца. Указанные изобретения применяются для исследования сложных, обладающих низкой интенсивностью рассеяния соединений, таких как бактериальная клетка. Как уже было отмечено, главной особенностью спектроскопии ГКР является присутствие НЧ металла (например, золото и серебро) в контакте с аналитом, в том числе помещение НЧ и аналита на полученную литографическим методом поверхность для возбуждения поверхностного плазмонного-поляритонного резонанса при лазерном воздействии в целях усиления сигнала КР анализируемой молекулы. Применение спектроскопии ГКР обеспечивает быструю и надежную идентификацию соединений в области «отпечатка пальца»; в перспективе спектроскопия ГКР может выступать мощным аналитическим инструментом для точного, специфичного и повторяемого анализа структуры молекул [Tripp R.A., Dluhy R.A., Zhao Y. Novel nanostructures for SERS biosensing // Nano Today. - 2008. - T. 3. - №.3. - C. 31-37]. Спектроскопия ГКР применяется для безметочного молекулярного анализа и может быть использована для определения широкого спектра соединений. Так, эффект ГКР может применяться для анализа ДНК [Kneipp K. et al. Detection and identification of a single DNA base molecule using surface-enhanced Raman scattering (SERS) // Physical Review E. - 1998. - T. 57. - №.6. - C. R6281], лекарственных препаратов [Stokes R.J. et al. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy as a sensitive and selective technique for the detection of folic acid in water and human serum // Applied spectroscopy. - 2008. - T. 62. - №.4. - C. 371-376], пищевых добавок [Lin M. et al. Detection of melamine in gluten, chicken feed, and processed foods using surface enhanced Raman spectroscopy and HPLC // Journal of food science. - 2008. - T. 73. - №.8], клеток и спор [Alexander Т.A., Le D.M. Characterization of a commercialized SERS-active substrate and its application to the identification of intact Bacillus endospores // Applied optics. - 2007. - T. 46. - №.18. - C. 3878-3890]. Основными проблемами выше обозначенных работ являются низкая повторяемость регистрируемого сигнала гигантского комбинационного рассеяния, а также технологическая сложность изготовления подобных структур.

Известно изобретение «Подложка для биочипа и способ ее изготовления» (патент RU №2411180, 2011 г., G01N 33/48), содержащее сходный с используемым в заявленном способе принцип выбора и конструирования устройства, состоящего из поверхности и наночастиц благородных металлов (Ag, Au, Pt).

Недостатком данного изобретения является как сложность изготовления конструкции, так и использование фотохромного или фототерморефрактивного стекла. Известно, что стекло, в отличие от поверхностей серебра и золота дает существенно больший паразитный сигнал флуоресценции и рассеяния, наличие которого сильно затрудняет выделение эффективного сигнала аналита. Такая конструкция крайне неудобна для использования с наночастицами платины, имеющими пик плазмонного поглощения в области 200-240 нм, в то время как серебряные и золотые поверхности позволяют регистрировать спектры диффузного отражения в данной области.

За прототип выбрано изобретение «Оптический датчик с многослойной плазменной структурой для усовершенствованного обнаружения химических групп посредством SERS. (Патент RU №2361193 С2). Изобретение включает в себя оптический сенсор для использования с лазерным пучком возбуждения в видимом или ближнем инфракрасном диапазоне и детектор на основе спектроскопии комбинационного рассеяния, для обнаружения наличия химических групп в аналите, нанесенном на датчик. Датчик располагается на подложке в виде плазмон-резонансного зеркала, сформированного на чувствительной поверхности подложки. На подложку нанесен слой плазмон-резонансных частиц. Над слоем частиц размещен слой оптически прозрачного диэлектрика толщиной до 40 нм, разделяющий зеркало и слой частиц. Слой частиц обладает следующими характеристиками: А) периодической матрицей плазмон-резонансных частиц, имеющих покрытие, способное связывать молекулы аналита; Б) однородные размеры и формы частиц в выбранном диапазоне размеров 50-200 нм; В) регулярное периодическое расстояние между частицами, меньшее длины волны лазерного пучка возбуждения. Форма частиц может быть варьируема: сфероиды, стержни, цилиндры, нанопроволоки, трубки, тороиды или другие формы, которые, в случае однородности, могут располагаться с регулярной периодичностью. Данное устройство способно обнаруживать аналит с коэффициентом усиления считываемого сигнала комбинационного рассеяния до 1012-1014. Подложка данного изобретения выполнена на основе серебра, золота или алюминия и имеет толщину слоя 30-500 нм. Нанесенные частицы имеют размер в пределах 50-150 нм и могут быть сформированы из серебра, золота или алюминия целиком или в виде частиц, имеющих оболочку, сформированную из этих металлов.

Изобретение включает в себя способ обнаружения химических групп в аналите с коэффициентом усиления 1010-1012. При осуществлении способа на практике, молекулы аналита связываются с плазмон-резонансными частицами в слое частиц оптического датчика вышеописанного типа, чувствительная поверхность облучается лазерным пучком в видимом или ближнем инфракрасном диапазоне, и спектр комбинационного рассеяния, обусловленный облучением, регистрируется. Способ может быть полезен для обеспечения коэффициента усиления, по меньшей мере, 10, и, таким образом, позволяет обнаруживать химические группы в одной или малом количестве молекул аналита. Способ позволяет анализировать спектр комбинационного рассеяния при мощности облучающего пучка 1-100 мкВт.

Несовершенство данного изобретения заключается в технологической сложности изготовления подобного сенсора, что также обуславливает его высокую стоимость. Другим недостатком сенсора является невозможность детекции белков в водной капле раствора, что является важным для их исследования в нативной форме.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа детектирования структуры сывороточного альбумина человека в нативной форме с помощью получения сигнала усиленного комбинационного рассеяния (до порядков 103) электромагнитным полем плазмонов, генерируемых под действием когерентного лазерного излучения на поверхности сферических наночастиц и структурированной поверхности серебра в капле водного раствора белка.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения усиленных спектров комбинационного рассеяния света от молекул сывороточного альбумина человека, помещенного в водную каплю, содержащую наночастицы серебра, согласно изобретению, на слой представляющий из себя электрохимически осажденную серебряную пленку на медную основу наносят водную каплю содержащую сывороточный альбумин человека и наночастицы размером 32 нм, а затем фокусируют лазер на участке капли, обладающем наибольшим радиусом кривизны и детектируют усиленное комбинационное рассеяние молекул белка вблизи поверхности капли.

Заявленный способ позволяет получать повторяемый сигнал гигантского комбинационного рассеяния от молекул белка - сывороточного альбумина человека в растворе, произведя, таким образом, его детекцию и последующее определение структуры в нативной форме.

Заявленный способ основан на эффекте агломерации и самоупорядочивания наночастиц серебра на вблизи участков большой кривизны капли, в результате чего благодаря областям «горячих» точек интенсивность рассеяния возрастает. Также в способе применяется эффект поверхностного плазмонного резонанса на шероховатой серебряной поверхности, дополнительно усиливающий сигнал аналита. Детекция белковых молекул начинается с создания НЧ серебра методом химического восстановления с помощью тетраборгидрата натрия, используемого для химического синтеза серебра и золота.

Боргидридный золь серебра синтезировали методом восстановления нитрата серебра тетраборгидридоборатом (боргидридом) натрия. В охлажденный до 0°C водный раствор боргидрида натрия концентрацией 2⋅10-3 М при интенсивном перемешивании по каплям добавляли раствор нитрата серебра концентрацией 10-3 М. Процесс восстановления серебра проходит по уравнению:

Концентрация полученного раствора была рассчитана в соответствии с формулой

где: r - радиус частиц серебра, m=50,1 г - масса серебра в раствор; ρ=10,5 г/см3 - плотность серебра.

Таким образом, НЧ серебра были восстановлены из соли нитрата серебра. Раствор отстаивали сутки в темном месте для выпадения крупных агрегаций наночастиц в осадок, после чего раствор фильтровали фильтром с размером пор 200 нм. Наличие максимумов плазмонного поглощения контролировалось с помощью спектрофотометра с ожидаемым максимумом на длине волны равной 420 нм. Размер частиц контролировался с помощью фотон-корреляционной спектроскопии и составлял 32 нм. Далее, полученный гидрозоль серебра быстро, в количестве 1 мл с помощью автоматической пипетки смешивали с 1 мл белкового раствора, после чего наносили на предварительно химически очищенную тонкую пленку серебра, осажденную на медную подложку. После чего получали, при облучении лазерным излучением и последующей детекцией, сигнал усиленного комбинационного рассеяния. Контроль снимали на химически очищенном кварцевом стекле с нанесением раствора родамина 6ж без наночастиц.

Затем рассчитывали коэффициент усиления гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) по формуле:

где ISERS, IRS - интенсивность ГКР и КР на выбранной частоте соответственно, CSERS и CRS - концентрация веществ в эксперименте с ГКР и КР соответственно. Коэффициент усиления повторяемого сигнала с использованием заявленной конструкции составлял порядка 103 раз.

По результатам детекции и записи сигнала гигантского комбинационного рассеяния с помощью заявленного изобретения проводилась последующая идентификация структуры белка - сывороточного альбумина человека.

Создание тонких пленок серебра на подготовленные подложки проводили по методике, описанной в [Слежкин В.А., Горлов Р.В. Плазмонный резонанс в сплошных серебряных электрохимических и химических пленках и его проявление в спектрах флуоресценции молекул родамина 6Ж в тонких пленках поливинилового спирта // Известия КГТУ. - 2011. - №.20. - С. 115-122], на собранной в лаборатории установке, схема которой изображена на Фиг. 1. Перед нанесением серебра поверхность медной подложки дополнительно полировали пастой ГОИ до получения металлического блеска. Затем поверхность промывалась этиловым спиртом, после чего производилось обезжиривание в растворе 5% карбоната натрия. Электроосаждение серебра проводили при комнатной температуре и режиме плотности тока 0,5 А/см2 в течение 15 мин, в результате чего была получена наноструктурированная серебряная пленка толщиной 5 мкм. Длительность процесса электроосаждения τе (в мин) рассчитывалась по формуле (3), являющейся следствием закона Фарадея:

где η=100% - выход по току; j - плотность тока, А/см2; k=4,0245 г/(А⋅ч) - электрохимический эквивалент серебра; ρ р - плотность серебра, г/см3; δ - толщина покрытия, мкм.

После осаждения слоя серебра изменяли шероховатость поверхности путем процесса анодного растворения поверхности пленки серебра при экспериментально установленной плотности тока j=5 мА/см2 серебряной пленки на слой толщиной 0,5 мкм. В заключение серебряную поверхность промывали дистиллированной водой в течение 10 минут и высушивали при температуре 400°C.

Способ получения усиленного сигнала комбинационного рассеяния света от молекул сывороточного альбумина человека в капле жидкости с помощью плазмонного эффекта, индуцируемого на наночастицах серебра когерентным лазерным излучением, отличающийся тем, что на серебряную пленку наносят водную каплю, содержащую сывороточный альбумин человека и наночастицы серебра размером 32 нм, а затем фокусируют лазер на участке капли, обладающем наибольшим радиусом кривизны, и детектируют усиленное комбинационное рассеяние молекул белка вблизи поверхности капли.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области автоматического контроля условий гидратообразования природного газа и может быть использовано для изучения условий гидратообразования на различных материалах в условиях залежей углеводородов и магистральных трубопроводов.

Изобретение относится к области автоматического контроля условий гидратообразования природного газа и может быть использовано для изучения условий гидратообразования на различных материалах в условиях залежей углеводородов и магистральных трубопроводов.

Изобретение относится к области автоматического контроля условий гидратообразования природного газа и может быть использовано для изучения условий гидратообразования на различных материалах в условиях залежей углеводородов и магистральных трубопроводов.

Изобретение относится к оптическим сенсорам и может быть использовано для детектирования различных веществ или иных наноразмерных объектов и определения концентрации веществ в очень малых количествах молекул с использованием комбинационного рассеяния света.

Изобретение относится к оптическим сенсорам и может быть использовано для детектирования различных веществ или иных наноразмерных объектов и определения концентрации веществ в очень малых количествах молекул с использованием комбинационного рассеяния света.

Изобретение относится к области оптических сенсоров, определяющих молекулярный состав вещества методом гигантского комбинационного рассеяния света. Сенсорный элемент для селективного усиления сигнала гигантского комбинационного рассеяния света от анализируемых веществ состоит из зеркальной металлической пленки, наноструктурированного диэлектрического слоя, металлических наночастиц, расположенных на поверхности диэлектрического слоя.

Изобретение относится к области оптических сенсоров, определяющих молекулярный состав вещества методом гигантского комбинационного рассеяния света. Сенсорный элемент для селективного усиления сигнала гигантского комбинационного рассеяния света от анализируемых веществ состоит из зеркальной металлической пленки, наноструктурированного диэлектрического слоя, металлических наночастиц, расположенных на поверхности диэлектрического слоя.

Изобретение относится к области аналитического приборостроения и касается способа газоанализа природного газа (ПГ). При осуществлении способа производят однократную регистрацию спектров спонтанного комбинационного рассеяния (СКР) эталонных молекулярных газовых компонентов, входящих в состав ПГ.

Изобретение относится к области измерительной техники и касается КР-газоанализатора. Газоанализатор включает в себя непрерывный лазер, газовую кювету, два объектива, голографический фильтр, блокирующий излучение в области длины волны лазера, спектральный прибор, сопряженный с многоканальным фотодетектором, и блок управления.

Изобретение относится к области контроля качества пищевых продуктов и касается способа контроля на основе рамановской спектроскопии медикаментов, добавленных в оздоровительные пищевые продукты.

Изобретение относится к оптике и биофизике. Cпособ получения усиленного сигнала комбинационного рассеяния света от молекул сывороточного альбумина человека в капле жидкости с помощью плазмонного эффекта, индуцируемого на наночастицах серебра когерентным лазерным излучением, отличается тем, что на серебряную пленку наносят водную каплю, содержащую сывороточный альбумин человека и наночастицы серебра размером 32 нм. Затем лазер фокусируют на участке капли, обладающем наибольшим радиусом кривизны, и детектируют усиленное комбинационное рассеяние молекул белка вблизи поверхности капли. Технический результат заключается в возможности получения повторяемого сигнала гигантского комбинационного рассеяния от молекул белка – сывороточного альбумина человека в растворе, производя его детекцию и последующее определение структуры в нативной форме. 1 ил.

Наверх