Определение циркулирующего тромбина в тесте активации системы комплемента

Изобретение относится к клинической иммунологии и гемостазиологии и может быть использовано для оценки степени внутрисосудистого свертывания крови по функциональной активности тромбина, связанного с циркулирующими фибрин-мономерными комплексами, в тесте активации комплемента. Способ определения активности тромбина, связанного с циркулирующими фибрин-мономерными комплексами в тесте активации комплемента, включает использование цитратной плазмы крови человека, добавление к ней суспензии эритроцитов барана, инкубацию при 37°С в течение 10 минут, измерение оптической плотности пробы на фотометре для иммуноферментного анализа при 620 нм, определение активности тромбина по степени лизиса эритроцитов барана с использованием калибровочного графика, где 100% лизис представляет собой полный лизис эритроцитов барана при добавлении воды, а контроль на спонтанный лизис - 0% лизиса, при лизисе более 10% констатируют повышенную тромбиновую активность плазмы крови. 1 ил., 7 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к клинической иммунологии и гемостазиологии и касается определения степени внутрисосудистого свертывания крови по уровню циркулирующего тромбина, связанного с фибрин-мономерными комплексами, в тесте активации системы комплемента.

Тромбин (3.4.21.5.) - сериновая протеиназа трипсиноподобного действия - является ключевым ферментом сложного каскада реакций, вызывающих свертывание крови. Участие тромбина в гемостазе не ограничено только расщеплением фибриногена. Тромбин взаимодействует различными звеньями многоступенчатого процесса свертывания крови: с тромбоцитами, факторами свертывания плазмы и компонентами стенок сосудов [Струков А.И., Струкова С.Н. Структурно-функциональные основы гемостаза и его патология // Арх. патологии, 1980, 42, №9: 26-45], ускоряя или замедляя тромбогенез. Более того, установлено участие тромбина в биохимических процессах, непосредственно не связанных со свертыванием крови: в активации системы комплемента [Huber-Lang М., Sarma J.V., Zetoune F.S., Rittirsch D et al. Generation of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway // Nature Medicine, 2006, V. 12, №6: 682-687; doi: 10.1038/nm1419]; стимуляции роста клеток [Gandossi E., Lunven C., Berry C.N. Role of clot-assosiated (-derived) thrombin in cell proliferation induced by fibrin clots in vitro // British Journal of Pharmacology (2000) 129, 1021-7]. Bee это свидетельствует о том, что тромбин следует рассматривать как важнейшую биорегуляторную протеиназу.

Традиционно системы комплемента и коагуляции рассматривают как отдельные каскадные системы в организме человека и животных. Оба протеолитических каскада состоят из сериновых протеаз с общими структурными характеристиками как высоко консервативные каталитические участки, содержащие аминокислотные остатки серина, гистидина и аспартата [Krem М.М., Di Cera Е.(2002) Nrends Biochem. Sci. 27: 67-74; Esmon C.T. (2004) Tromb. Res. 114: 321-327]. Кроме того, обе системы принадлежат к общей воспалительной сети [Rittirch D., Flier M.F., Ward P.A. (2008) Nat. Rev. Immunol. 8: 776-787] и проявляют некоторые подобные характеристики, соответствующие специализированным функциям их активаторов и ингибиторов. В частности, фактор свертывания XII может активировать C1r и, таким образом, инициирует классический путь активации системы комплемента. В свою очередь С1-ингибитор подавляет не только три пути активации комплемента (классический, альтернативный и лектиновый), но также внутренний коагуляционный путь активации гемостаза (калликреин, фактор XIIa) [Davis А.Е. III, Mejia P., Lu F. (2008) Mol. Immunol. 45: 4057-4063; Ghebrehiwet В., Silverberg M., Kaplan A.P. (1981) J. Exp. Med. 153: 665-676]. В работе Clark и соавт. (2008) показано, что тромбин и плазмин могут участвовать в нетрадиционной активации системы комплемента при регенерации печени даже в отсутствие компонента С4 классического пути и при ингибировании фактора В альтернативного пути активации системы комплемента [Clark A., Weymann A., Hartman Е., Turmelle Y., Carroll М., Thurman J.M. et al. (2008) Vol. Immunol. 45: 3125-3132.]. Тромбин может также действовать как физиологический агонист протеинкиназа С-зависимой регуляции фактора, ускоряющего распад С3-конвертазы системы комплемента и может таким образом обеспечивать отрицательную обратную связь, помогая предотвращать тромбоз при воспалении [Lidington Е.А., Haskard D.O., Mason J.S. (2000) Blood 96: 2784-2792]. При системной воспалительной реакции активация коагуляционного каскада сопровождается глубокой активацией системы комплемента, которая приводит к генерации анафилатоксинов С3а и С5а [Levi М., van der Poll., Buller H.U (2004) Circulation 109: 2698-2704]. Также C5a индуциирует активность тканевого фактора в человеческих эндотелиальных клетках [Ikeda K., Nagasawa K., Horiuchi Т., Nishizaka Н., Niho Y. (1997) Thromb. Haemost. 77: 394-398] и поэтому вовлекается в активацию внешнего коагуляционного пути гемостаза. Кроме того, С5а стимулирует экспрессию тканевого фактора на нейтрофилах через С5а-рецептор, который связан с высокой про-коагулянтной активностью [Ritis K., Doumas М., Mastellos D., Micheli A., Giglis S., Magotti P., et al. (2006). J. Immunol. 177: 4794-4802]. Новые доказательства прокоагулянтных эффектов комплемента получены и представлены в недавних исследованиях, где покзано, что in vitro маннан-связывающий лектин-ассоциированная протеаза-2 лектинового пути активации комплемента способна запускать потребление (активацию) фибриногена с помощью превращения протромбина в тромбин [Krarup A., Wallis R., Presanis S., Gal P., Sim R.B. (2007). Plos ONE 2:е623]. Еще в 1986 году Wiedmer и соавт.показали, что терминальный комплементный комплекс (ТКК), C5b-9, может катализировать расщепление протромбина в тромбин даже в отсутствие фактора V, тем самым специфически повышать тромбоцитарную протромбиназную активность [Wiedmer Т., Esmon С.Т., Sim P.J. (1986). Blood. 68: 875-880]. С другой стороны, С5а оказывает фибринолитический эффект с помощью подавления экспрессии ингибитора-1 плазминогенового активатора в человеческих тучных клетках [Wojta J., Kaun С., Zorn G., Ghannadan M., Hauswirth A.W., Sperr W.R., et aj. (2002) Blood 100: 517-523].

Таким образом, в настоящее время становится очевидным то, что обе каскадные системы могут взаимодействовать более широко, чем ранее предполагалось [Markiewski М.М., Nilsson D., Ekdahl K.N., Mollnes Т.Е., Lambris J.D. (2007) Trends Immunol. 28: 184-192].

В процессе свертывания тромбин адсорбируется на фибрине [Lui Су., Nossel H.L., Kaplan K.L (1979) J. Biol. Chem. 254: 10421-5; Hogg P.J., Jackson C.M. Fibrin monomer protects thrombin from inactivation by heparin-antithrombin III: Implication for heparin efficacy / Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 3619-3623]. Связанный с фибриновым сгустком тромбин сохраняет каталитическую активность, как было показано с освобождением пептида А (ФПА) от фибриногена [Weitz J.I., Hudoba М., Massel D., Maranore J., Hirsh J. (1990). J Clin Invest. 86: 385-391], при гидролизе хромогениого субстрата и укорочением времени коагуляции плазмы крови [Bendayan P., Baccalon Н., Dupouy D., Boneu B. (1994) Thromb Haemost. 71: 576-580]. Фибриновый сгусток, таким образом, ведет себя как резервуар активного тромбина. В таком состоянии тромбин более эффективен, как было показано ингибиторной характеристикой связанного тромбина плазменным физиологическим ингибитором, антитромбином III. Оказалось, что связанный с фибрином тромбин не чувствителен к действию антитромбина III в отличие от жидкофазного тромбина [Weitz J.I., Leslic В., Hudoba М. (1998). Circulation 97: 544-552]. Показано [Beguin S., Kessels H., Hemker H.C. (1993) Thromb Haemost. 69: 811; Kumar N., Beguin S., Hemker H.C. (1994). Thromb Haemost. 72(5): 713-721], что фибрин-связанный тромбин может усиливать образование дополнительно тромбина за счет активации плазменных кофакторов, белков V и VIII. Авторы также показали, что тромбоцит-богатая плазма в присутствии фибрин-связанного тромбина свертывается значительно быстрее за счет укорочения лаг-фазы, предшествующей взрыву при генерации тромбина. Данный факт свидетельствует о том, что тромбоциты находятся в «пред»-активированом состоянии под действием тромбина, связанного с фибриновым сгустком.

Тромбин белок коагуляционной системы с многогранным воздействием при онкологических заболеваниях с метастазированием. В настоящее время связь между коагуляцией и развитием рака хорошо установлена. Тромбин может также запускать клеточные процессы через протеаза-активируемые рецепторы (ПАР-1 и ПАР-4), приводящие к прогрессированию рака. Получены доказательства участия тромбина в метастазировании рака путем повышения адгезивного потенциала злокачественных клеток. Существуют доказательства участия тромбина на каждой стадии диссеминирования рака: 1) инвазия раковых клеток путем отрыва от первичной опухоли, миграция; 2) поступление в кровяное русло; 3) циркуляция в кровяном русле; 4) выход из кровотока; 5) имплантация в органы и ткани. Недавние исследования обеспечили новые молекулярные данные о генерации тромбина у раковых больных и механизмы, при помощи которых тромбин участвует в трансэндотелиальной миграции, взаимодействии тромбоцитов с опухолевыми клетками, ангиогенезе и других процессах. Хотя отлично известно о роли тромбина в распространении рака, появляются все новые данные о тромбин-опосредованных процессах, которые требуют дальнейших комплексных исследований [Wojtukiewicz M.Z., Hempel D., Sierko E., Tucker S., Honn K.V. (2016) Cancer Metastasis Rev. 35: 213-233].

Другим аспектом роли тромбина при патологических состояниях является ожирение. Ожирение способствует развитию хронического воспалительного и гиперкоагуляционного состояния, которое приводит к сердечно-сосудистым заболеваниям, диабету 2 типа, ожирению печени. Повышенная активность тромбина лежит в основе связанных с ожирением тромбоэмболических событий, но прямые связи между тромбином/фибрином и патологиями, связанными с ожирением, не полностью понятны. В работе Корес с соавт. (2017) иммуногистохимическими методами выявлены внесосудистые отложения фибрина в пределах белой жировой ткани и в печени у мышей, получавших рацион с высоким содержанием жиров, а также у пациентов с ожирением. Мыши, несущие мутантные формы фибриногена (Fibγ^390-396A), неспособные связывать лейкоцитарный α_Мβ₂-интегрин, были защищены от вызванного рационом с высоким содержанием жиров увеличения веса и ожирения. У мышей Fibγ^390-396A заметно ниже системное, жировое и печеночное воспаление с меньшим количеством макрофагов в пределах белой жировой ткани, а также почти полная защита от развития жировой болезни печени и нарушения метаболизма глюкозы. Гомозиготные же тромбомодулин-мутантные мыши Thbd^Pro, у которых повышена функция тромбина, отличались заметным увеличением в весе и воспалительной реакцией при ожирении по сравнению с дикими мышами. Лечение дабигатраном, прямым ингибитором тромбина, ограничивало развитие ожирения, вызванное диетой с высоким содержанием жиров, и подавляло прогрессирование осложнений у мышей с ожирением. В совокупности эти данные подтверждают роль тромбина и фибрина как маркеров системной воспалительной реакции при ожирении [Kopec А.K., Abrahams S.R., Thornton S., Joseph S. Palumbo J.S., Mullins E.S., Divanovic S. Thrombin promotes diet-induced obesity through fibrin-driven inflammation // J Clinlnvest. 2017; 127(8): 3152-3166. doi.10.1172/JCI92744].

Таким образом, роль тромбина, связанного с растворимыми фибрин-мономерными комплексами, остается до конца не исследованным из-за отсутствия методик определения данной формы тромбина, как маркера внутрисосудистой активации свертывающей системы и системы комплемента.

Биохимические методы определения активности тромбина можно разбить на две группы. В первой группе применяются низкомолекулярные пептидные субстраты, которые расщепляются ферментом с образованием окрашенного продукта. Примерами таких субстратов служат H-D-Phe-Pro-Arg-п-нитроанилид (FPR) [Whitton С., Sands D., Lee Т., Chang A., Longstaff C. Thromb Haemost. - 2005. - V. 93. - P. 261-266], h-D-Phe-Pro-Phe-п-нитроанилид (FpF) [Bush L.A., Nelson R.W., Di Cera E. (2006). J. Biol. Chem., 281, 7183-7188]. Данная реакция характеризует активность только каталитического центра тромбина, поэтому корректнее использовать методы второй группы.

Ко второй группе относятся методы, учитывающие эффективность как работы каталитической триады, так и связывания природных субстратов с распознающим участком протеазы. Активность тромбина можно определеить исходя из кривых накопления продуктов реакции PAR1, PAR4, протеина С или фибриногена [Nieman М.Т., Schmaier А.Н. (2007). Biochemistry, 46, 8603-8610; Mullin J.L., Gorkun O.V., Binnie C.G., Lord ST. (2000). J. Biol. Chem., 275, 25329-25246; Pineda A.O., Cantwell A.M., Bush L.A., Rose Т., Di Cera E. (2002). J. Biol. Chem., 97, 807-813.]. Отщепляемые пептиды от фибриногена при активации тромбином определяют хроматографическими методами. При определении фибрина, продукта протеолиза фибриногена тромбином, используются оптико-механические или спектрофотометрические методы тестирования.

Суть оптико-механического метода состоит в перемешивании реакционной смеси магнитной мешалкой, что приводит к наматыванию на нее фибриновых нитей, которые тормозят вращению мешалки вплоть до полной остановки. Время остановки мешалки фиксируется как время сворачивания плазмы. Несмотря на некоторую условность получаемой величины и отсутствии корреляции с кинетическими параметрами, стандартизация реагентов и условий реакции делают время сворачивания хорошо воспроизводимы параметром. Оптико-механический метод, в основном, находит применение в клинических лабораториях, что объясняется небольшим диапазоном определяемой активности тромбина (0,3-0,6 IU на 300 мкл пробы), значительной погрешностью результатов (до 50%) и потребностью в узкоспециализированном оборудовании. [Спиридонова В.А., Рог УюВ., Баранов Ю.В., Дугина Т.Н., Струкова С.М., Копылов A.M. (2003). Биоорг. Химия. 29, 1-4.]. Результаты оптико-механического метода недостоверно отражают степень агрегации фибрина в случае некоторых мутаций, поэтому более предпочтительно использование спектрофотометрических методов исследования агрегированного фибрина [Lefkowitz J.B., DeBoom Т., Weller A., Clarke S., Lavrinets D. (2000). Am J Hematol., 63, 149-155.].

В спектрофотометрических методах определения активности тромбина не используется перемешивание раствора во время реакции. На начальных этапах протеолиза раствор агрегирующего фибрина ведет себя подобно коллоидному раствору, который с течением реакции переходит в гель, образованный трехмерным каркасом агрегированного фибрина и раствора низкомолекулярных соединений, удерживаемого им. Протекание реакции сопровождается помутнением и увеличением вязкости, соответственно для наблюдения можно использовать нефелометрию, турбидиметрию, вискозиметрию.

Тест генерации тромбина является одним из «глобальных» тестов, разработанных в 2001 г. [Hemker H.C., Giesen P., Al Dieri R., Regnault V., de Smedt E., Wagenvoord R., Lecompte Т., (2003) Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma. Pathophysiol. Haemost. Thromb., 33, 4-15.]. Принцип метода заключается в использовании специфического к тромбину флуорогенного субстрата. После предварительной инкубации тромбоцит-богатой плазмы крови в нее вносят буфер, содержащий ионизированный кальций и флуорогенный субстрат. Образующийся тромбин расщепляет субстрат, в результате высвобождается молекула флуорофора, излучение которого автоматически регистрируется флуориметром через равные промежутки времени. Интенсивность свечения пропорциональна концентрации образовавшегося тромбина. На основании измерений с помощью программного обеспечения выстраивается кривая генерации тромбина. В ходе исследования оцениваются: время задержки образования тромбина (лаг-период), максимальная скорость образования тромбина (пик), время достижения максимальной скорости (время пик), количество образовавшегося тромбина (площадь под кривой, эндогенный тромбиновый потенциал) и некоторые другие параметры.

Известен также способ определения генерации анафилатоксина С5а тромбином в отсутствие компонента С3 комплемента у мышей [Huber-Lang М., Sarma J.V., Zetoune F.S., Rittirsch D., Neff T.A., McGuire S.R. et al. (2005). Nature Medicine, 12 (6). doi: 10.1038/nm1419]. Авторами было показано образование активного С5а анафилатоксина при инкубации компонента С5 комплемента человека с тромбином. Генерацию анафилатоксина С5а в данной работе тестировали методом иммуноферментного анализа.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому способу является определение активности тромбина плазмы крови, представленной в работе [Stief T.W. Specific determination of plasmatic thrombin activity (2006). Clinical and Applied Thrombosis/Haemostasis, 12(3): 324-329]. Используя конечную концентрацию хромогенного субстрата менее 0,4 мМоль/л (приблизительное значение константы Михаэлиса для тромбина), аргинина, при концентрации выше 0,8 Моль/л, и фактор II-истощенную плазму авторы проводили коагуляцию с использованием в качестве активатора либо тканевой фактор, либо активатор контактной фазы коагуляции плазмы. Авторами были выявлены активности циркулирующего тромбина на уровне 5,5 мМЕ/мл тромбина.

Основным недостатком данного метода является низкая специфичность хромогенного субстрата, использование высокой концентрации аргинина и, как следствие, низкая информативность теста, а также недоступность теста для рутинных исследований.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала лабораторных скрининг-тестов для определения циркулирующего тромбина крови по активации системы комплемента для рутинных исследований.

Технический результат заявленного изобретения заключается в принципиально новом подходе для определения активности циркулирующего тромбина, где в качестве природного субстрата используется компонент С5 системы комплемента, а уровень потребления компонента С5 оценивают по лизису эритроцитов барана при формировании мембрано-атакующего комплекса (C5b-9).

Технический результат достигается тем, что для определения активности циркулирующего тромбина используют аутологичные белки системы комплемента С5, С6, С7, С8 и С9, циркулирующие в плазме крови обследуемого человека. С целью ингибирования образования С5-конвертазы (тотального ингибирования активации трех путей системы комплемента, классического, альтернативного и лектинового) в тесте определения активности циркулирующего тромбина не проводят рекальцификацию цитратной плазмы. При наличии циркулирующего тромбина активируется компонент С5 и формируется мембрано-атакующий комплекс, который определяют по лизису эритроцитов барана. Активность тромбина определяют по калибровочному графику, где 100% лизис представляет собой полный лизис эритроцитов барана при добавлении воды, а контроль эритроцитов на спонтанный лизис - 0% лизиса.

Изобретение поясняется следующими фигурами:

Фиг. 1. Калибровочный график для определения степени лизиса эритроцитов барана по оптической плотности при длине волны 620 нм.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят стандартный забор крови в раствор 3,8% цитрата натрия в соотношении 9:1, готовят тромбоцит-обедненную плазму путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин. Затем для определения активности циркулирующего тромбина в лунки иммунологических планшет с плоским дном вносят по 25 мкл цитратной плазмы, 50 мкл вероналового буфера и 25 мкл суспензии эритроцитов барана (ЭБ) с концентрацией 1,5×10⁸ кл/мл. В качестве контролей используют: контроль на полный лизис ЭБ (25 мкл ЭБ + 75 мкл Н₂О) и контроль на спонтанный лизис ЭБ (25 мкл ЭБ + 75 мкл вероналового буфера). Пробы тщательно перемешивают и инкубируют при перемешивании в термостате для иммунологических 96-ти луночных планшет при 37°С в течение 10 мин. После инкубации измеряют оптическую плотность проб на фотометре для иммуноферментного анализа при 620 нм. Активность тромбина определяют по степени лизиса ЭБ с использованием калибровочного графика, где 100% лизис представляет собой полный лизис эритроцитов барана при добавлении воды, а контроль эритроцитов на спонтанный лизис - 0% лизиса. При лизисе более 10% констатируют повышенную тромбиновую активность плазмы крови.

Пример 1. Определение оптимальной концентрации эритроцитов барана для определения активности циркулирующего тромбина. Эритроциты барана (ЭБ) 3 раза отмывают 0,15 М раствором NaCl центрифугированием в течение 10 мин при 2500 об/мин. Строят график зависимости оптической плотности суспензии эритроцитов (при длине волны 620 нм) от концентрации эритроцитов. Для этого 1% суспензию эритроцитов прогрессивно разводят в плоскодонной 96-ти луночной иммунологической планшете в объеме 25 мкл 0Д5М NaCl, добавляют 75 мкл физиологического раствора, тщательно перемешивают и измеряют на фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 620 нм. Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, наблюдается линейная зависимость оптической плотности суспензии от концентрации ЭБ в растворе до А₆₂₀ равной 0,56 ЕД. Свыше 0,56 ЕД при А₆₂₀ данная зависимость - нелинейная. Поэтому для теста определения активности циркулирующего тромбина нами выбрана концентрация суспензии ЭБ, которая в объеме 100 мкл в 96-луночных планшетах дает оптическую плотность, равную 0,40-0,56 ЕД. Для определения степени лизиса эритроцитов нами предложен калибровочный график, в котором динамику лизиса эритроцитов оценивают по снижению оптической плотности при длине волны 620 нм. За 0% лизиса принимают оптическую плотность контроля эритроцитов на спонтанный лизис (25 мкл ЭБ + 75 мкл вероналового буфера), соответственно за 100% лизис принимают оптическую плотность контроля на полный лизис (25 мкл ЭБ + 75 мкл H₂O) (фиг. 1). Определяют мутность эритроцитов турбидиметрически при длине волны 620 нм после 10 мин инкубации при 37°С и по калибровочному графику определяют степень лизиса (фиг. 1).

Как видно из фиг. 1, калибровочный график позволяет определять степень лизиса эритроцитов в процентах по оптической плотности пробы без стадии центрифугирования и измерения гемоглобина в супернатанте и последующего расчета степени лизиса эритроцитов по формуле, что существенно упрощает регистрацию результатов анализа активности циркулирующего тромбина по лизису ЭБ в рутинных исследованиях.

Пример 2. Определение активности циркулирующего тромбина по лизису эритроцитов барана. Тест проводят в 96-луночных плоскодонных иммунологических планшетах. Вначале по 25 мкл цитратной плазмы вносят в лунки, затем последовательно добавляют по 50 мкл вероналового буфера и 25 мкл суспензии стандартизованных (А₆₂₀=0,56 оптических единиц) в этом же буфере ЭБ. Параллельно ставят контроли: 3 контроля на полный лизис (25 мкл ЭБ + 75 мкл H₂O); 3 контроля на спонтанный лизис эритроцитов (25 мкл ЭБ + 75 мкл вероналового буфера). Тщательно перемешивают и сразу измеряют оптическую плотность на фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 620 нм (бланк устанавливают против воздуха). После измерения планшеты инкубируют при 37°С в течение 10 мин при постоянном перемешивании. После 10-ти мин инкубации измеряют оптическую плотность при тех же условиях, что описано выше. Проведено исследование циркулирующего тромбина в тесте активации комплемента в 40 пробах цитратной плазмы крови пациентов «НМИЦ профилактической медицины». Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, в 14 пробах наблюдается лизис эритроцитов барана более 10%, что составляет 35% из тестированных 40 проб.

Таким образом, инкубация ЭБ с цитратными плазмами приводит к активации компонента С5 циркулирующим тромбином, генерированным в условиях in vivo, формированию мембрано-атакующего комплекса и лизису ЭБ. Присутствие цитрата натрия в пробе обеспечивает ингибирование активации по классическому пути начиная с С1 комплекса, активация которого иммунными комплексами зависит от присутствия ионов кальция. Отсутствие в среде ионов магния ингибирует формирование и активацию С3-конвертазы, а отсутствие С3-конвертазы также ингибирует формирование С5-концертазы классического пути активации системы комплемента.

Полученные результаты убедительно доказывают четвертый путь активации системы комплемента - тромбиновый путь активации и формирования мембрано-атакующего комплекса и лизиса ЭБ.

Пример 3. Определение тромбина в цитратных плазмах с хромогенным субстратом. Определение активности тромбина в цитратной плазме проводили как описано в прототипе [Stief T.W. Specific determination of plasmatic thrombin activity (2006). Clinical and Applied Thrombosis/Haemostasis, 12(3): 324-329], используя конечную концентрацию хромогенного субстрата 0,38 мМоль/л (в прототипе менее 0,4 мМоль/л). Концентрацию цитратной плазмы использовали 25% в конечном объеме инкубационной системы равной 100 мкл. После добавления 20 мкл хромогенного субстрата (Chromozym® ТН (Tos-Gly-Pro-Arg-pNA), с исходной концентрацией 1,9 мМоль/л) к 80 мкл разведенной цитратной плазмы (конечная концентрация плазмы в пробе составляет 25%) в лунки иммунологической планшеты с плоским дном, тщательно перемешивали и определяли оптическую плотность проб при 405 нм. Пробы инкубировали в течение 10 мин при 37°С и повторно измеряли изменение оптической плотности проб. В качестве контроля использовали тромбин производства «Boehringer Mannheim» (Германия) с активностью 3 NIH и контроль бланка хромогенного субстрата. Для сравнительного анализа использовали активности тромбина в цитратных плазмах и в контроле тромбина использовали изменение оптической плотности пробы при 405 нм в мин. Параллельно определяли тромбиновую активность цитратной плазмы (ТАЦП) в тесте активации комплемента по лизису ЭБ, как описано выше. Полученные результаты представлены в таблице №3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, нами не выявлены прямые зависимости амидолитической активности тромбина по хромогенному субстрату и тромбиновой активности цитратной плазмы в тесте активации комплемента по лизису ЭБ.

Пример 4. Определение плазмина в цитратных плазмах с хромогенным субстратом. Определение активности плазмина в цитратной плазме проводили, используя конечную концентрацию хромогенного субстрата 1 мкМоль/л. Концентрацию цитратной плазмы использовали 25% в конечном объеме инкубационной системы равной 100 мкл. После добавления 50 мкл хромогенного субстрата (Chromozym® PL (Tos-Gly-Pro-Lys-pNA), с исходной концентрацией 2 мкМоль/л) к 50 мкл разведенной 50% цитратной плазмы в лунки иммунологической планшеты с плоским дном, тщательно перемешивали и определяли оптическую плотность проб при 405 нм. Пробы инкубировали в течение 10 мин при 37°С и повторно измеряли изменение оптической плотности проб. Ставили контроль бланка хромогенного субстрата. Активность плазмина цитратной плазмы определяли как отношение изменения экстинкции при А₄₀₅ в опытных пробах в минуту (ΔА₄₀₅/МИН). Параллельно в этих же пробах определяли тромбиновую активность цитратной плазмы (ТАЦП) в тесте активации комплемента по лизису ЭБ, как описано выше. Полученные результаты представлены в таблице №4.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, нами также не выявлена зависимость между амидолитической активностью плазмина с хромогенным субстратом и тромбиновой активностью цитратной плазмы в тесте активации комплемента по лизису ЭБ.

Ниже представлена сводная таблица (таблица 5) амидолитической активности тромбина, плазмина и тромбиновая активность цитратной плазмы (ТАЦП) в тесте активации комплемента по лизису ЭБ.

Как видно из данных, представленных в таблице 5, между амидолитическими активностями, как тромбина, так и плазмина и комплемент-активирующей активностью циркулирующего тромбина в тесте лизиса ЭБ какой-либо зависимости не было выявлено. Данные результаты могут свидетельствовать о том, что в активации комплемента роль плазмина явно не прослеживается. В то время как связывание тромбина с растворимыми фибрин-мономерными комплексами или же с антитромбином III, а также модификация тромбина нейтрофильной эластазой при активации нейтрофилов приводит к изменениям специфичности тромбина, что мы и наблюдаем при определении тромбина в тесте активации комплемента по лизису ЭБ. Для подтверждения данной гипотезы нами проведены исследования связывания тромбина с растворимыми фибрин-мономерными комплексами.

Пример 5. Определение связывания тромбина с растворимыми фибрин-мономерными комплексами. Для подтверждения образования комплекса тромбина с растворимыми фибрин-мономерными комплексами были проведены следующие исследования. В опытных пробах цитратную плазму инкубировали 5 мин при 56°С для термокоагуляции фибриногена и растворимых фибрин-мономерных комплексов. Далее коагулированный фибриноген осаждали центрифугированием при 8000 об/мин. В супернатанте определяли тромбиновую активность в тесте активации комплемента по лизису ЭБ, как описано выше. В качестве контроля использовали исходные цитратные плазмы без термокоагуляции фибриногена. Полученные результаты представлены в таблице 6.

Как видно из данных, представленных в таблице 6, тромбин полностью осаждается вместе с термокоагулированным фибриногеном/фибрином. Таким образом, полученные данные полностью подтверждают данные, полученные с тромбином, связанным с фибриновым сгустком, описанным в работе Waitz J.I. и соавт. (1998). Дополнительно были проведены исследования амидолитической активности исходных цитратных плазм (контроль) и супернатанта (опыт) после осаждения термокоагулированного фибриногена с использованием хромогенного субстрата тромбина и плазмина. Условия подробно описаны выше (см. пример 4). Полученные результаты представлены в таблице 7.

Как видно из данных, представленных в таблице 7, амидолитическая активность плазмина и тромбина в отличие от тромбиновой активности плазмы в тесте активации комплемента по лизису ЭБ существенно не меняется в супернатанте по сравнению с амидолитической активностью исходной цитратной плазмы. Интересные данные получены по амидолитической активности плазмина в супернатанте, где почти в 2 раза активность выше, чем в исходной плазме крови. При термокоагуляции фибриногена/фибрина, видимо, происходит диссоциация плазмина от фибриногена/фибрина и за счет этого возрастает амидолитическая активность плазмина в опытных пробах. Далее были проведены исследования гепарино-резистентности тромбина, связанного с растворимыми фибрин-мономерными комплексами.

Пример 6. Определение ингибирования циркулирующего тромбина, связанного с фибрин-мономерными комплексами, гепарином в тесте активации комплемента по лизису эритроцитов барана. Предварительно в тесте определения активности контактного пути коагуляции цитратной плазмы при рекальцификации подбирали эффективную дозу гепарина с 25% плазмой. Для этого раствор гепарина (10 мг/мл) прогрессивно раститровали на 16 лунок в объеме 25 мкл, добавляли по 25 мкл вероналового буфера, цитратной плазмы и 10% раствора хлорида кальция, разведенного 32 раза. Ставили контроли плазмы без гепарина и бланка плазмы. Пробы инкубировали 30 мин при 37°С и степень коагуляции определяли турбидиметрически при длине волны 450 нм. При концентрации 0,15 мкг/мл гепарина в пробе наблюдается полное ингибирование коагуляции 25% цитратной плазмы при рекальцификации. Для дальнейших исследований нами использована концентрация гепарина в 2 раза превышающая эффективную концентрацию в тесте рекальцификации, т.е. 0,3 мкг/мл. Описание эксперимента. В опытную пробу, содержащую 25 мкл вероналового буфера, 25 мкл цитратной плазмы и 25 мкл стандартизованных эритроцитов барана (1,5x10 кл/мл), добавляли 25 мкл раствора гепарина (1 мкг/мл). Ставили следующие контроли: Контроль системы (не содержал гепарина); контроль ЭБ на спонтанный лизис (25 мкл ЭБ + 75 мкл вероналового буфера); контроль полного лизиса (25 мкл ЭБ+75 мкл дистиллированной воды). Пробы тщательно перемешивали и инкубировали 10 мин при 37°С при постоянном перемешивании. После инкубации степень лизиса определяли турбидиметрически при длине волны 620 нм на фотометре для иммуноферментного анализа. Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии ингибирования циркулирующего тромбина, связанного с растворимыми фибрин-мономерными комплексами при данных концентрациях гепарина.

Таким образом, разработан принципиальной новый тест определения внутрисосудистого свертывания крови путем определения функциональной активности тромбина, связанного с циркулирующими фибрин-мономерными комплексами, с использованием физиологического субстрата, компонента С5 аутологичной системы комплемента. Протеолиз С5 компонента определяют по формированию мембрано-атакующего комплекса (C5b-9) и лизиса эритроцитов барана. Для ингибирования комплемента и формирования С5-конвертаз по трем путям активации комплемента (классическому и лектиновому - C4bC2aC3b, альтернативному - C3bBbC3b), используется цитратная плазма, т.е. не требуется дополнительные реактивы для проведения теста. Следующим достоинством теста является использование метода турбидиметрии для оценки степени лизиса эритроцитов барана и инкубация в течение 10 мин, что многократно упрощает тест и исключает многократный контакт оператора с биоматериалом. При необходимости тест может быть продолжен, т.е. пробы далее инкубируют для усиления степени лизиса эритроцитов барана. Тест также может быть использован для поиска и скрининга препаратов, ингибирующих тромбин, связанный с циркулирующими фибрин-мономерными комплексами. Как было нами показано, что такая форма тромбина является резистентной к действию препаратов гепарина. Учитывая наличие протеазо-активируемых рецепторов на мембранах органов и тканей выявление тромбина, связанного с циркулирующими фибрин-мономерными комплексами, в тесте активации комплемента до 10% лизиса эритроцитов барана можно считать нормой.

Способ определения активности тромбина, связанного с циркулирующими фибрин-мономерными комплексами в тесте активации комплемента, включающий использование цитратной плазмы крови человека, добавление к ней суспензии эритроцитов барана, инкубацию при 37°С в течение 10 минут, измерение оптической плотности пробы на фотометре для иммуноферментного анализа при 620 нм, определение активности тромбина по степени лизиса эритроцитов барана с использованием калибровочного графика, где 100% лизис представляет собой полный лизис эритроцитов барана при добавлении воды, а контроль на спонтанный лизис - 0% лизиса, при лизисе более 10% констатируют повышенную тромбиновую активность плазмы крови.