Способ получения меркаптанов путем ферментативного гидрогенолиза дисульфидов
Изобретение относится к способу получения меркаптанов формулы R-SH, включающему следующие стадии: a) приготовление смеси, содержащей: 1) дисульфид формулы R-S-S-R', где R и R', одинаковые или разные, независимо друг от друга означают линейный, разветвленный или циклический углеводородный радикал, содержащий от 1 до 20 атомов углерода, причем указанная цепь является насыщенной или имеет одну или несколько ненасыщенностей в форме двойных или тройных связей, R и R' также способны образовать друг с другом и вместе с атомами серы, с которыми они связаны, циклическую молекулу, содержащую от 4 до 22 атомов, предпочтительно от 5 до 10 атомов, 2) каталитическое количество аминокислоты, содержащей тиоловую группу, или пептида, содержащего тиоловую группу, 3) каталитическое количество фермента, катализирующего восстановление дисульфидного мостика, образованного между двумя эквивалентами указанной аминокислоты, имеющей тиоловую группу, или указанного пептида, содержащего тиоловую группу, 4) каталитическое количество фермента, катализирующего дегидрирование органического восстановителя, используемого на стадии b), 5) каталитическое количество кофактора, общего для двух ферментов, катализирующих восстановление и дегидрирование, b) добавление органического восстановителя в стехиометрическом количестве по отношению к дисульфиду формулы R-S-S-R', c) проведение ферментативной реакции, d) выделение меркаптана формулы R-SH и меркаптана формулы R'-SH, e) необязательное разделение и необязательная очистка меркаптана формулы R-SH и/или меркаптана формулы R'-SH. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.
Настоящее изобретение относится к способу получения меркаптанов, в частности, метилмеркаптана, ферментативным катализом из дисульфидов, в частности, диметилдисульфидов, с использование органических восстановителей.
Меркаптаны широко применяются во множестве областей, например, как пахучие вещества, одоранты для газов, как агенты передачи цепи в полимеризации, как сырье для фармацевтической или косметической промышленности, для синтеза антиоксидантов, противозадирных или антифрикционных присадок для смазок. Эти примеры ни в коей мере не ограничивают применение меркаптанов, известных к настоящему времени и которые могут быть получены способом по изобретению.
В частности, первый из меркаптанов, метилмеркаптан (CH3SH), представляет большой промышленный интерес, в частности, как сырье для синтеза метионина, незаменимой аминокислоты, очень широко использующейся в кормах для животных. Метилмеркаптан также является исходным материалом, широко применяющимся для синтеза многих других молекул.
Меркаптаны можно синтезировать многими способами, такими, как сульфогидратация спиртов, каталитическое или фотохимическое присоединение сероводорода к ненасыщенным органическим соединениям, замещение с помощью сероводорода галогенидов, эпоксидов или органических карбонатов, и др.
В частности, метилмеркаптан обычно получают в крупнотоннажной промышленности из метанола и сероводорода по реакции (1):
| CH3OH+H2S → CH3SH+H2O | (1) |
Недостатками этих способов является то, что они требуют метанола (CH3OH), синтеза сероводорода (H2S, например, из водорода и серы, что также требует синтеза водорода) и приводят к образованию побочных продуктов типа простого диметилового эфира (CH3OCH3), диметилсульфида (CH3SCH3), продуктов крекинга и воды, что подразумевает множество стадий очистки метилмеркаптана.
Описание способов, основанных на этих реакциях, можно найти, например, в таких патентных заявках как WO2013092129, WO2008118925, WO2007028708, WO2006015668 и WO2004096760.
Может быть экономически выгодным (чтобы избежать синтеза метанола) получать метилмеркаптан из моноксида углерода, водорода и сероводорода, согласно следующей схеме синтеза (2):
| CO+2H2+H2S → CH3SH+H2O | (2) |
Однако недостатками этих способов является то, что они требуют синтез-газа (CO/H2) и, следовательно, осуществления парового риформинга углеводородного источника, наличия надлежащих соотношений между CO и H2, то есть должна иметься возможность корректировать отношение CO/H2 посредством реакции, известной как "реакция сдвига водяного газа" (CO+H2O → CO2+H2), а также требуют синтеза H2S.
Эти способы также обычно ведут к образованию больших количеств CO2 как побочного продукта, а также к образованию метана, диметилсульфида и воды. Описание этих способов можно найти, например, в таких патентных заявках как US2010/286448, US2010/094059, US2008/293974, US2007/213564.
Были описаны и другие способы, комбинирующие различные реакции, такие, как:
- образование CS2 и H2S из метана и серы:
| CH4+4S → CS2+2H2S | (3) |
- гидрирование CS2:
| CS2+3 H2 → CH3SH+H2S | (4) |
Можно также использовать избыток H2S из реакций (3) и (4) в реакциях с метанолом (реакция 1) или с синтез-газом (реакция 2), чтобы снова получить метилмеркаптан.
Очевидно, что эти способы сочетают недостатки, описанные для реакций (1) и (2), с дополнительной сложностью иметь избыток водорода для осуществления реакции (4). Описания этих способов можно найти в патентной заявке US2011/015443, или, более конкретно для реакции (4), в заявке WO2010046607.
В заявке WO200196290 предлагается способ синтеза метилмеркаптана напрямую из метана и H2S с одновременным получением водорода. Эту прямую реакцию между метаном и H2S осуществляют с помощью пульсирующей плазмы с коронным разрядом. Так как эта заявка не описывает никаких примеров синтеза, сложно представить себе крупномасштабный промышленный процесс синтеза метилмеркаптана по этой технологии. Кроме того, этот способ требует синтеза H2S, если он недоступен.
Со своей стороны, в патентной заявке EP0649837 предлагается способ синтеза метилмеркаптана каталитическим гидрогенолизом с сульфидами переходных металлов, диметилдисульфидом и водородом. Хотя этот способ является эффективным, он требует довольно высоких температур, порядка 200°C, чтобы достичь экономически выгодного уровня производительности.
Специалисты известно также, что получить метилмеркаптан можно путем подкисления водного раствора метилмеркаптида натрия (CH3SNa). Основным недостатком этого способа является получение больших количеств солей, таких как хлорид натрия или сульфат натрия, в зависимости от того, используется ли соляная или серная кислота. Эти водные растворы соли часто очень сложно очистить, и следовые количества оставшихся зловонных продуктов заставляют предполагать, что этот способ вряд ли может быть осуществим в промышленном масштабе.
Способы синтеза меркаптанов выше, чем метилмеркаптан, также имеют множество недостатков. Так, замещение спиртов сероводородом требует высоких температур и часто высоких давлений, и ведет к нежелательным побочным продуктам типа олефинов, простых эфиров и сульфидов.
Каталитическое или фотохимическое присоединение сероводорода к ненасыщенным соединениям часто протекает в чуть более мягких условиях, чем указанные выше, но также ведет к многочисленным побочным продуктам, образующимся в результате изомеризации исходного материала, нерегиоселективного присоединения или двойного присоединения, что приводит к сульфидам. Наконец, способы замещения галогенированных производных создают большие количества отходов и солесодержащих загрязняющих веществ, что сложно совместить с промышленными процессами.
Целью настоящего изобретения является предложить новый способ получения меркаптанов, в частности, метилмеркаптана, который не имеет описанных недостатков известных способов предшествующего уровня, подробно описанных выше.
Более конкретно, первым объектом настоящего изобретения является способ получения меркаптана формулы R-SH, включающий по меньшей мере следующие стадии:
a) приготовление смеси, содержащей:
1) дисульфид формулы R-S-S-R',
2) каталитическое количество аминокислоты, содержащей тиоловую группу, или пептида, содержащего тиоловую группу,
3) каталитическое количество фермента, катализирующего восстановление дисульфидного мостика, образованного между двумя эквивалентами указанной аминокислоты, имеющей тиоловую группу, или указанного пептида, содержащего тиоловую группу,
4) каталитическое количество фермента, катализирующего дегидрирование органического восстановителя, используемого на стадии b),
5) каталитическое количество кофактора, общего для двух ферментов, катализирующих восстановление и дегидрирование,
b) добавление органического восстановителя в стехиометрическом количестве по отношению к дисульфиду формулы R-S-S-R',
c) проведение ферментативной реакции,
d) выделение меркаптана формулы R-SH и меркаптана формулы R'-SH,
e) необязательно разделение и необязательно очистка меркаптана формулы R-SH и меркаптана формулы R'-SH.
Вообще говоря, фермент, катализирующий восстановление дисульфидного мостика, образованного между двумя эквивалентами указанной аминокислоты, содержащей тиоловую группу, или указанного пептида, содержащего тиоловую группу, является ферментом редуктазой. Термин "редуктаза" используется далее в описании для пояснения настоящего изобретения. Аналогично, фермент, катализирующий дегидрирование органического восстановителя, задействованного на стадии b), обычно называют ферментом дегидрогеназой, и термин "дегидрогеназа" выбран в дальнейшем описании для объяснения настоящего изобретения.
Из кофакторов, общих для двух ферментов, катализирующих восстановление и дегидрирование (редуктаза и дегидрогеназа), в качестве неограничивающих примеров можно упомянуть флавиновые кофакторы и никотиновые кофакторы. Предпочтительно использовать никотиновые кофакторы, более конкретно, никотинамид аденин динуклеотид (NAD) или, еще лучше, никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH). Перечисленные выше кофакторы используются преимущественно в их восстановленных формах (например NADPH,H+) и/или в их оксидных формах (например NADP+), то есть они могут добавляться в реакционную среду в их восстановленной и/или оксидной формах.
В одном варианте осуществления изобретения аминокислота, содержащая тиоловую группу, и/или пептид, содержащий тиоловую группу, могут находиться в форме дисульфида указанной аминокислоты и/или указанного пептида, соответственно (например, глутатион в форме глутатион дисульфида).
Структура и порядок добавления различных компонентов на определенных выше технологических стадиях a) и b), могут быть реализованы по-разному. Во всех случаях ферментативная реакция на стадии c) запускается добавлением одного из компонентов каталитической системы: фермента, или одного из соединений, добавляемых в стехиометрическом количестве (дисульфид или органический восстановитель), или одного из соединений, добавляемых в каталитическом количестве (аминокислота, содержащая тиоловую группу, или пептид, содержащий тиоловую группу, или дисульфид, соответствующий указанным молекулам, или же кофактор).
Еще более конкретно, объектом настоящего изобретения является способ получения меркаптана формулы R-SH, включающий по меньшей мере следующие стадии:
a') приготовление смеси, содержащей:
- дисульфид формулы R-S-S-R',
- каталитическое количество аминокислоты, имеющей тиоловую группу, или пептида, содержащего тиоловую группу,
- каталитическое количество NADPH,
b') добавление органического восстановителя в стехиометрическом количестве по отношению к дисульфиду и DMDS с каталитическим количеством соответствующего фермента дегидрогеназы,
c') проведение ферментативной реакции,
d') выделение меркаптана формулы R-SH и меркаптана формулы R'-SH,
e') разделение и необязательно очистка меркаптана формулы R-SH и меркаптана формулы R'-SH.
В контексте настоящего изобретения в способе получения меркаптана можно использовать любой дисульфид, соответствующий общей формуле R-S-S-R'. В общей формуле R-S-S-R' радикалы R и R', одинаковые или разные, независимо друг от друга означают линейный, разветвленный или циклический углеводородный радикал, содержащий от 1 до 20 атомов углерода, причем указанная цепь является насыщенной или имеет одну или несколько ненасыщенностей в форме двойных или тройных связей, и R и R' также способны образовать друг с другом и вместе с атомами серы, с которыми они связаны, циклическую молекулу, содержащую от 4 до 22 атомов, предпочтительно от 5 до 10 атомов.
В одном предпочтительном аспекте радикалы R и R', одинаковые или разные, независимо друг от друга выбраны из линейных или разветвленных, насыщенных или ненасыщенных алкильных, циклоалкильных, арильных, алкиларильных или арилалкильных радикалов, содержащих от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 12 атомов углерода, еще более предпочтительно от 1 до 6 атомов углерода и, факультативно, функционализированы одной или более функциональными группами, выбранными из спиртовой, альдегидной, кетоновой, кислотной, амидной, нитрильной или сложноэфирной групп или же из групп, содержащих серу, фосфор, кремний или галоген.
Дисульфид формулы R-S-S-R' способен восстанавливаться, в соответствии со способом по изобретению, до меркаптана формулы R-SH и меркаптана формулы R' SH. Когда R и R' разные, говорят о асимметричных дисульфидах, а когда R и R' одинаковы, дисульфиды называются симметричными. В случае симметричных дисульфидов R-S-S-R предлагаемый изобретением способ ведет к меркаптану формулы R-SH. В одном особенно предпочтительном аспекте изобретения диметилдисульфид (DMDS) используется с целью получения метилмеркаптана CH3SH.
В случае асимметричных дисульфидов R-S-S-R' способ по изобретению приводит к смеси меркаптанов формул R-SH и R'-SH, которую можно использовать как есть или подвергнуть одной или более операциям разделения, хорошо известным специалистам, например, перегонке.
В способе согласно изобретению можно также использовать смеси одного или нескольких симметричных и/или асимметричных дисульфидов. Возможные смеси дисульфидов могут включать DSO (от disulphide oils, дисульфидные масла), тем самым указанные DSO имеют очень выгодный потенциал применения.
В способе по изобретению полученные меркаптаны обычно выделяют в твердой, жидкой и/или газообразной форме.
Способ получения согласно изобретению основан на ферментативном восстановлении дисульфидов, в частности, диметилдисульфида, органическим восстановителем, являющимся донором водорода, как будет определено ниже, в соответствии со следующей реакцией, проиллюстрированной на примере диметилдисульфида, приводящему к метилмеркаптану при использовании глюкозы как органического восстановителя (донор водорода):
Теперь же было установлено, что эта реакция легко катализируется ферментативной системой, содержащей аминокислоту, имеющую тиоловую группу, или пептид, имеющий тиоловую группу, например, глутатион, в форме ферментативного комплекса "(аминокислота или пептид)/соответствующая редуктаза", регенерируемого органическим соединением - донором водорода, как описано на прилагаемой фигуре 1.
Так, согласно иллюстрации на фигуре 1, пептид (в показанном примере глутатион) восстанавливает дисульфид (на фигуре DMDS) до меркаптана (на фигуре метилмеркаптан), превращаясь в пептид с дисульфидным мостиком (в данном случае глутатион дисульфид). Фермент редуктаза (в данном случае глутатион-редуктаза, классификационный номер EC 1.8.1.7 или EC 1.6.4.2) регенерирует пептид (глутатион), и этот же фермент регенерируется окислительно-восстановительным ферментативным комплексом, хорошо известным специалистам, например, комплексом NADPH/NADP+ (никотинамид аденин динуклеотид фосфат (восстановленная форма и оксидная форма)). В свою очередь, NADP+ регенерируется до NADPH с помощью фермента дегидрогеназы, соответствующей используемому органическому восстановителю (здесь глюкозодегидрогеназа, EC 1.1.1.47) посредством указанного органического восстановителя (в данном случае глюкозы), которая обеспечивает водород (является донором водорода), превращаясь в свою оксидную форму (здесь глюконолактон).
Другими словами, фермент, катализирующий реакцию (представленный глутатион-редуктазой, например, фермент с классификационными номерами EC 1.8.1.7 или EC 1.6.4.2), регенерирует пептид (глутатион), окисляя кофактор (в данном примере NADPH,H+). Оксидную форму (здесь NADP+) восстанавливают затем посредством "рециркулирующего" окислительно-восстановительного ферментативного комплекса, хорошо известного специалистам и содержащего соответствующий фермент дегидрогеназу (в данном случае глюкозодегидрогеназу, например, с классификационным номером EC 1.1.1.47) и органическую восстановительную молекулу (в данном случае глюкозу). В результате получают оксидную форму органического восстановителя (здесь глюконолактон).
Согласно одному наиболее подходящему варианту осуществления, система "глутатион/глутатион дисульфид" в сочетании с ферментом глутатион-редуктазой позволяет, в соответствии с настоящим изобретением, восстановить DMDS до метилмеркаптана.
Глутатион является трипептидом, широко применяющимся в биологии. В восстановленной (глутатион) или в оксидной (глутатион дисульфид) форме это вещество образует важную окислительно-восстановительную пару в клетках. Так, глутатион жизненно необходим для удаления тяжелых металлов из организма. Например, в заявке WO05107723 описывается композиция, в которой глутатион используется для получения хелатообразующего препарата, а в патенте US4657856 указывается, что глутатион позволяет также разложить перекиси, такие как H2O2, на H2O посредством глутатион-пероксидазы. Наконец, глутатион позволяет также восстановить дисульфидные мостики, присутствующие в белках (Rona Chandrawati, "Triggered Cargo Release by Encapsulated Enzymatic Catalysis in Capsosomes", Nano Lett., (2011), vol. 11, 4958-4963).
В соответствии со способом по изобретению, используется каталитическое количество аминокислоты, содержащей тиоловую группу, или пептида, содержащего тиоловую группу, чтобы получить меркаптаны из дисульфидов.
Из содержащих тиоловую группу аминокислот, подходящих для применения в способе согласно настоящему изобретению, можно назвать в качестве неограничивающих примеров цистеин и гомоцистеин. В этих случаях использующиеся окислительно-восстановительные ферментативные системы, которые могут регенерировать каталитический цикл точно так же, представляют собой систему цистеин/цистин-редуктаза EC 1.8.1.6 и гомоцистеин/гомоцистеин-редуктаза.
Из пептидов, содержащих тиоловую группу, подходящих для применения в способе согласно настоящему изобретению, можно назвать в качестве неограничивающих примеров глутатион и тиоредоксин. Таким образом, описанную выше систему глутатион/глутатион-редуктаза, можно заменить системой тиоредоксин (CAS No. 52500-60-4)/тиоредоксин-редуктаза (EC 1.8.1.9 или EC 1.6.4.5).
Глутатион и система глутатион/глутатион-редуктаза являются наиболее предпочтительными для настоящего изобретения из соображений стоимости этих соединений и легкости их приобретения.
Из органических восстановителей, которые могут применяться в контексте настоящего изобретения, наиболее предпочтительны соединения, являющиеся донорами водорода, а из них полностью подходят органические восстановители, являющиеся донором водорода и содержащие гидроксильную группу, такие, как спирты, полиолы, сахара и т.д.
Использующийся фермент должен быть способен дегидрировать содержащее водород соединение, подходит, например, алкогольдегидрогеназа. Наиболее подходящим сахаром для использования в способе по настоящему изобретению является глюкоза, использующая вместе с глюкозодегидрогеназой, давая глюконолактон.
В способе согласно изобретению только дисульфиды и глюкоза используются в стехиометрическом количестве, а все другие компоненты (аминокислота или пептид, кофактор (например, NADPH) и оба фермента) используются в каталитических количествах.
Предлагаемый изобретением способ имеет множество преимуществ. Из этих преимуществ можно назвать возможность работать в водном или водно-органическом растворе, в очень мягких условиях по температуре и давлению и в условиях pH, близким к нейтральным. Все эти условия являются типичными для "зеленого" или "экологически устойчивого" биокаталитического процесса.
Другим преимуществом, когда в способе используется диметилдисульфид, является то, что полученный метилмеркаптан, который в условиях реакции находится в газообразном состоянии, выходит из реакционной среды по мере образования. Таким образом, метилмеркаптан можно использовать сразу же по выходе из реактора, в месте, находящемся ниже по потоку. Его можно также легко перевести в жидкое состояние криогенными методами, если желательно выделить его. При необходимости можно ускорить его выведение из реакционной среды, медленно вводя азот путем барботирования.
Диметилдисульфид (DMDS) можно получать в другом месте, например, из метилмеркаптана и окислителя, такого как кислород, сера или водный раствор перекиси водорода, или же из диметилсульфата и дисульфида натрия. DMDS можно также получить из источника дисульфидных масел (DSO), как указано выше, а затем очистить, например, путем реактивной дистилляции, как описано в заявке WO2014033399. Следует отметить, что DSO можно также использовать как есть, без необходимости разделения на различные содержащиеся в этих маслах дисульфиды. В таком случае, применяя способ согласно изобретению, получают смесь меркаптанов.
Когда в качестве дисульфида используется DMDS, способ по изобретению можно рассматривать как способ, позволяющий избежать транспортировки метилмеркаптана из места его получения существующими промышленными путями к месту его применения, если они отличаются. Действительно, при комнатной температуре метилмеркаптан является токсичным и очень плохо пахнущим газом, что значительно усложняет его транспортировку, которая уже строго регламентирована, в отличие от транспортировки DMDS. Следовательно, способ, описанный в настоящем изобретении, можно применять для получения метилмеркаптана непосредственно на месте его позднейшего применения.
Так как DMDS расходуется в реакции, а метилмеркаптан покидает реакционную среду по мере его образования, в реакционной среде накапливается только продукт дегидрирования органического восстановителя, например, глюконолактон, в предположении, что глюкоза и DMDS подаются непрерывно. Когда концентрация глюконолактона превысит точку насыщения в условиях реакции, он будет выпадать в осадок и может быть выделен из реакционной среды любыми средствами, известными специалистам в данной области.
Глюконолактон может иметь различное применение. Например, он используется как пищевая добавка, известная под обозначением E575. Глюконолактон гидролизуется в кислых водных средах, образуя глюконовую кислоту, также применяющуюся как пищевая добавка (E574). Глюконолактон используется также для получения японского соевого творога тофу (см. CN103053703) в пищевой промышленности.
В частности и предпочтительно, в том смысле, что глюконолактон является "отходом" способа согласно настоящему изобретению, он может заменять глюкозу в возможной реакции ферментации для получения либо биоэтанола, либо любой другой молекулы, образующейся в результате ферментации сахара или крахмала.
Действительно, некоторые бактерии могут использовать глюконолактон как источник углерода при ферментации, как описано J.P. van Dijken в "Novel pathway for alcoholic fermentation of gluconolactone in the yeast Saccharomyces bulderi", J. Bacteriol., (2002), Vol. 184(3), 672-678.
В способе согласно изобретению можно использовать и другие сахара, например, можно заменить систему "глюкоза/глюконолактон/глюкозодегидрогеназа" следующей системой: "глюкозо-6-фосфат/ 6-фосфоглюконо-δ-лактон/глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа" (EC 1.1.1.49).
В способе по изобретению можно также использовать спирт вместо сахара, таким образом, использовать следующую общую систему вместо системы глюкоза/ глюконолактон/ глюкозодегидрогеназа: спирт/(кетон или альдегид)/алкоголь-дегидрогеназа (EC 1.1.1) и, более конкретно, систему изопропанол/ацетон/изопропанол-дегидрогеназа (EC 1.1.1.80).
Действительно, когда в качестве дисульфида используется DMDS, эта система позволяет получить смесь, состоящую из метилмеркаптана (MeSH) и ацетона, которая покидает реакционную среду (то есть никакой продукт не накапливается). При желании MeSH и ацетон можно легко разделить простой перегонкой. В случае других дисульфидов, в зависимости от точки кипения образующегося меркаптана и его растворимости в реакционной среде, ацетон можно легко удалить из среды, а меркаптан необязательно можно осадить из реакционной среды для легкого отделения.
Обычно реакционная температура лежит в интервале от 10°C до 50°C, предпочтительно от 15°C до 45°C, более предпочтительно от 20°C до 40°C.
Величина pH при реакции может составлять от 6 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5. pH реакционной среды можно корректировать с помощью буфера. В высшей степени предпочтительно выбирать pH фосфатного буфера равным 7,3.
Давление, применяющееся при реакции, может варьироваться от давления ниже атмосферного до нескольких бар (нескольких сотен кПа), в зависимости от используемых реагентов и оборудования. Действительно, когда в качестве дисульфида используется DMDS, пониженное давление позволяет быстрее откачивать образованный метилмеркаптан, но недостатком его использования является повышение давления насыщенных паров воды и DMDS, которые чуть больше загрязняют образующийся метилмеркаптан. Предпочтительно использовать давление в интервале от атмосферного до 20 бар (2 МПа), еще более предпочтительно работать при давлении от атмосферного до 3 бар (300 кПа).
Способ согласно изобретению можно осуществлять в периодическом или в непрерывном режиме, в стеклянном или металлическом реакторе в зависимости от выбранных рабочих условий и используемых реагентов.
Идеальным мольным отношением органического восстановителя к дисульфиду является стехиометрическое (мольное отношение=1), но его можно варьировать от 0,01 до 100, если специалист найдет это чем-то выгодным, например, непрерывное добавление дисульфида, в то время как восстановитель вводится в реактор с самого начала. Предпочтительно выбирать это мольное отношение так, чтобы оно составляло от 0,5 до 5 на всем масштабе реакции.
Компоненты, присутствующие в каталитических количествах в смеси, приготовленной на вышеописанной стадии a) (аминокислота, содержащая тиоловую группу или пептид, содержащий тиоловую группу, фермент редуктаза, кофактор (такой, например как NADPH)) легко доступны для приобретения или могут быть получены методами, хорошо известными специалисту. Эти разные компоненты могут находиться в твердой или жидкой форме, и для применения в способе согласно изобретению очень предпочтительно растворить их в воде. Использующие ферменты могут быть также привиты на подложку (в случае нанесенных ферментов).
Водный раствор ферментативного комплекса, содержащего аминокислоту или пептид, также может быть восстановлен способами, известными специалисту, например, путем пермеабилизации клеток, которые содержат эти элементы. Этот водный раствор, состав которого приведен в следующем примере 1, может использоваться в весовом содержании от 0,01% до 20% от полного веса реакционной среды. Предпочтительным является содержание от 0,5% до 10%.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению водного раствора ферментативного комплекса, содержащего имеющую тиоловую группу аминокислоту, какая определена выше, или содержащий тиоловую группу пептид, какой определен выше, для синтеза меркаптана из дисульфида.
Смесь, которая может использоваться для стадии a) описанного выше способа и которая содержит:
1) дисульфид формулы R-S-S-R',
2) каталитическое количество аминокислоты, имеющей тиоловую группу, или пептида, содержащего тиоловую группу,
3) каталитическое количество фермента, катализирующего восстановление дисульфидного мостика, образованного между двумя эквивалентами указанной аминокислоты, имеющей тиоловую группу, или указанного пептида, содержащего тиоловую группу,
4) необязательно, каталитическое количество фермента, катализирующего дегидрирование органического восстановителя,
5) каталитическое количество кофактора, общего для двух ферментов, катализирующих восстановление и дегидрирование,
где R и R' такие, как определено выше,
является новой и в силу этого составляет часть настоящего изобретения.
В одном варианте осуществления изобретения аминокислота, содержащая тиоловую группу, и/или пептид, содержащий тиоловую группу, может находиться в форме дисульфида указанной аминокислоты и/или указанного пептида, соответственно.
Более конкретно, указанная смесь содержит:
- дисульфид формулы R-S-S-R',
- каталитическое количество аминокислоты, содержащей тиоловую группу, или пептида, содержащего тиоловую группу,
- каталитическое количество фермента редуктазы, соответствующего указанной аминокислоте, содержащей тиоловую группу, или указанному пептиду, содержащему тиоловую группу, и
- каталитическое количество NADPH,
причем R и R' такие, как определено выше.
Изобретение станет более понятным из следующих примеров, не ограничивающих объем изобретения.
Пример 1
В реактор, содержащий 150 мл фосфатного буфера концентрацией 0,1 моль/л и с pH 7,30, вводят 10 мл глутатионового ферментативного комплекса (Aldrich) и 19,2 г (0,1 моль) глюкозы. Раствор ферментативного комплекса содержит: 185 мг (0,6 ммоль) глутатиона, 200 U глутатион-редуктазы, 50 мг (0,06 ммоль) NADPH и 200 U глюкозодегидрогеназы. Реакционную среду нагревают до 25°C при механическом перемешивании. Первый образец отбирают при t=0. Затем в бюретку помещают диметилдисульфид (9,4 г, 0,1 моль) и добавляют по каплям в реактор; реакция начинается. В реактор вводят поток азота. Газохроматографический анализ газов, выходящих их реактора, показывает присутствие почти исключительно азота и метилмеркаптана (некоторые следы воды). Эти выходящие газы улавливают в 20%-ный водный раствор гидроксида натрия. DMDS вводят в течение 6 часов, и реакцию отслеживают методом аргентометрии с потенциометрическим титрованием натриевой соли метилмеркаптана в ловушке на выходе реактора. Кроме того, окончательный газохроматографический анализ реакционной среды подтверждает отсутствие DMDS, а методом СВЭЖХ/масс-спектрометрии были обнаружены следы глюкозы и почти исключительное присутствие глюконолактона.
Пример 2
В реакционную среду из примера 1 в один шаг снова вводят 19,2 г (0,1 моль) глюкозы, и в течение 6 часов по каплям снова добавляют 9,4 г (0,1 моль) DMDS. Реакцию отслеживают как в примере 1, после замены 20%-ного раствора гидроксида натрия на выходе реактора. Анализ, проведенный в конце реакции, подтвердил полное исчезновение DMDS, целиком превратившегося в метилмеркаптан, находящийся в форме натриевой соли в растворе гидроксида натрия. Анализировали только глюконолактон, который был обнаружен в реакционной среде в конце реакции. Этот пример показывает надежность каталитической системы благодаря ее воспроизводимости.
1. Способ получения меркаптана формулы R-SH, включающий по меньшей мере следующие стадии:
a) приготовление смеси, содержащей:
1) дисульфид формулы R-S-S-R',
где R и R', одинаковые или разные, независимо друг от друга означают линейный, разветвленный или циклический углеводородный радикал, содержащий от 1 до 20 атомов углерода, причем указанная цепь является насыщенной или имеет одну или несколько ненасыщенностей в форме двойных или тройных связей, R и R' также способны образовать друг с другом и вместе с атомами серы, с которыми они связаны, циклическую молекулу, содержащую от 4 до 22 атомов, предпочтительно от 5 до 10 атомов,
2) каталитическое количество аминокислоты, содержащей тиоловую группу, или пептида, содержащего тиоловую группу,
3) каталитическое количество фермента, катализирующего восстановление дисульфидного мостика, образованного между двумя эквивалентами указанной аминокислоты, имеющей тиоловую группу, или указанного пептида, содержащего тиоловую группу,
4) каталитическое количество фермента, катализирующего дегидрирование органического восстановителя, используемого на стадии b),
5) каталитическое количество кофактора, общего для двух ферментов, катализирующих восстановление и дегидрирование,
b) добавление органического восстановителя в стехиометрическом количестве по отношению к дисульфиду формулы R-S-S-R',
c) проведение ферментативной реакции,
d) выделение меркаптана формулы R-SH и меркаптана формулы R'-SH,
e) необязательное разделение и необязательная очистка меркаптана формулы R-SH и/или меркаптана формулы R'-SH.
2. Способ по п. 1, включающий по меньшей мере следующие стадии:
a') приготовление смеси, содержащей:
- дисульфид формулы R-S-S-R',
- каталитическое количество аминокислоты, имеющей тиоловую группу, или пептида, содержащего тиоловую группу,
- каталитическое количество фермента редуктазы, соответствующей аминокислоте, имеющей тиоловую группу, или пептиду, содержащему тиоловую группу
- каталитическое количество NADPH,
b') добавление органического восстановителя в стехиометрическом количестве по отношению к дисульфиду и DMDS с каталитическим количеством соответствующего фермента дегидрогеназы,
c') проведение ферментативной реакции,
d') выделение меркаптана формулы R-SH и меркаптана формулы R'-SH,
e') разделение и необязательная очистка меркаптана формулы R-SH и/или меркаптана формулы R'-SH.
3. Способ по любому из предыдущих пунктов, где радикалы R и R', одинаковые или разные, выбраны независимо друг от друга из линейных или разветвленных, насыщенных или ненасыщенных алкильных, циклоалкильных, арильных, алкиларильных или арилалкильных радикалов, содержащих от 1 до 12 атомов углерода, еще более предпочтительно от 1 до 6 атомов углерода и, необязательно, функционализированы одной или более функциональными группами, выбранными из спиртовой, альдегидной, кетоновой, кислотной, амидной, нитрильной или сложноэфирной групп или же из групп, содержащих серу, фосфор, кремний или галоген.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где дисульфид формулы R-S-S-R' является диметилдисульфидом.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где аминокислота, содержащая тиоловую группу, или пептид, содержащий тиоловую группу, выбраны из цистеина, гомоцистеина, глутатиона и тиоредоксина.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где органический восстановитель представляет собой органическое соединение, являющееся донором водорода и содержащее гидроксильную группу, и выбрано из спиртов, полиолов, сахаров и т.д.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где органический восстановитель выбран из глюкозы, глюкозо-6-фосфата и изопропанола.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где pH реакционной среды составляет от 6 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где мольное отношение органический восстановитель/дисульфид составляет от 0,5 до 5, на всем продолжении реакции, наиболее предпочтительно указанное мольное отношение равно 1.
10. Применение водного раствора ферментативного комплекса, содержащего аминокислоту, имеющую тиоловую группу, или пептид, имеющий тиоловую группу, для синтеза меркаптана из дисульфида способом по любому из пп. 1-9.
11. Смесь для получения меркаптана, содержащая:
1) дисульфид формулы R-S-S-R',
2) каталитическое количество аминокислоты, имеющей тиоловую группу, или пептида, содержащего тиоловую группу,
3) каталитическое количество фермента, катализирующего восстановление дисульфидного мостика, образованного между двумя эквивалентами указанной аминокислоты, имеющей тиоловую группу, или указанным пептидом, содержащим тиоловую группу,
4) каталитическое количество фермента, катализирующего дегидрирование органического восстановителя,
5) каталитическое количество кофактора, общего для двух ферментов, катализирующих восстановление и дегидрирование,
причем R и R' такие, как определено в п. 1.
12. Смесь по п. 11, содержащая:
- дисульфид формулы R-S-S-R',
- каталитическое количество аминокислоты, содержащей тиоловую группу, или пептида, содержащего тиоловую группу,
- каталитическое количество фермента редуктазы, соответствующей указанной аминокислоте, содержащей тиоловую группу, или указанному пептиду, содержащему тиоловую группу, и
- каталитическое количество NADPH,
причем R и R' такие, как определено в п. 1.
