Способ оценки состояния мононуклеаров периферической крови у больных туберкулезом легких

Авторы патента:

Рясенский Сергей Станиславович (RU)

Зубарева Галина Мефодьевна (RU)

Рясенский Дмитрий Сергеевич (RU)

Асеев Александр Владимирович (RU)

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2709499:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тверской государственный университет" (RU)

Изобретение относится к способу оценки состояния мононуклеаров периферической крови, включающий определение фосфолипидного спектра мембран мононуклеаров периферической крови. Способ характеризуется тем, что оценку проводят путем определения относительного содержания фракций суммарных лизофосфолипидов, сфингомиелина и фосфатидилхолина фосфолипидного спектра мембран мононуклеаров периферической крови и расчета коэффициента, определяемого по формуле КР=ФХ²/СМ*ЛФЛ, где ФХ – относительное содержание фосфатидилхолина, СМ – относительное содержание сфингомиелина, ЛФЛ – относительное содержание суммарных лизофосфолипидов; при значениях данного коэффициента ниже или равных 6,7 диагностируют снижение функциональной активности мононуклеаров. 3 пр.

Способ оценки состояния мононуклеаров периферической крови у больных туберкулезом легких относится к медицине, а именно к фтизиатрии и может быть использован для раннего выявления функциональных нарушений в иммунной системе и определения показания к корригирующей терапии.

Физиологическое состояние любой клетки организма в том числе и иммуноцитов во многом определяется билипидным слоем их мембран играющих ключевую роль в структурной и функциональной организации этих клеток (Есимова И. Е. Микровязкость и липидный спектр мембраны мононуклеарных лейкоцитов крови у больных туберкулезом легких / И.Е. Есимова, В.В Новицкий, О.И. Уразова и др. // Сибирский медицинский журнал. - 2006. – Т. 66, №8. – С. 15-18).

Мононуклеары и фагоциты играют важную роль в системе противотуберкулезного иммунитета. Нарушения состава и как следствие свойств мембранных структур мононуклеаров отражается на состоянии процессов клеточного метаболизма, времени жизни клеток и эффективности выполнения ими своих функций. Соотношение липидных фракций входящих в состав мембран мононуклеаров определяет её физическое состояние (вязкость, текучесть, проницаемость) и функциональное состояние клетки (Есимова И.Е. Структурные особенности мембран и интенсивность процессов перекисного окисления липидов в мононуклеарах крови при диссеминированном туберкулезе легких / И.Е. Есимова, В.В. Новицкий, А.К. Стрелис и др //Фундаментальные исследования – 2006. - №2. – С. 75 – 76).

Определение основных фосфолипидных фракций мононуклеаров и расчет коэффициента, характеризующего соотношение этих фракций между собой, позволяет оценить состояние мононуклеаров у больных туберкулезом легких.

Из уровня техники известен способ диагностики состояния фагоцитарной защиты (RU 2131609, опубл. 10.06.1999), который позволяет рассчитать индекс активности фагоцитов и определить недостаточность фагоцитарной защиты или её активацию. Также известен способ оценки функциональной активности мононуклеарных фагоцитов у больных туберкулезом легких (SU 1725127, опубл. 07.04.1992), который позволяет определить повышенную и пониженную функциональность моноцитов, где в качестве антигена используют БЦЖ, а регистрацию осуществляют с помощью радиоактивного тимидина.

Недостатками известных способов является то, что определяется активность дифференцированных макрофагов периферической крови, которая не всегда отражает состояние иммуноцитов в зоне казеозного воспаления у больных туберкулезом легких. Оценить можно только фагоцитарную активность макрофагов, что не дает достаточного представления о состоянии мононуклеаров периферической крови. Данные способы не отражают перестройку метаболических процессов в иммуноцитах (активация фосфолипаз, накопление токсических фосфолипидов), происходящую под воздействием противотуберкулезной химиотерапии.

Наиболее близким по технической сущности к заявленному решению является способ диагностики хронический заболеваний печени (RU 2167424, опубл. 20.05.2001), позволяющий провести диагностику хронических заболеваний печени, путем анализа липидного спектра крови и расчета коэффициента, определяемого по формуле ФХ²/СМ*ЛФХ, где ФХ – относительное содержание фосфатидилхолина, СМ – относительное содержание сфингомиелина, ЛФХ – относительное содержание лизофосфатидилхолина. Недостатком данного способа является определение липидных фракций сыворотки крови, а не клеточных мембран. Такой способ не дает возможность оценить состояние мононуклеаров периферической крови. Другим недостатком является определение только лизофосфатидилхолина, а не суммарных лизофосфолипидов, обладающих мембранодеструктивным эффектом. Кроме того, исследование проводилось у больных с хроническими заболеваниями печени. Способ не позволяет проводить исследование у больных туберкулезом легких, для оценки состояния мононуклеаров.

Задача, на решение которой направлено данное изобретение заключается в разработке способа, который позволил бы врачу точно оценить состояние мононуклеаров у больных туберкулезом легких и принять решение о проведении корригирующей терапии при первых признаках снижения функциональной активности мононуклеаров, тем самым повысить эффективность противотуберкулезной терапии.

Данная задача достигается за счет того, что в способе оценки состояния мононуклеаров периферической крови оценку проводят путем определения относительного содержания фракций суммарных лизофосфолипидов, сфингомиелина и фосфатидилхолина фосфолипидного спектра мембран мононуклеаров периферической крови и расчета коэффициента КР, определяемого по формуле КР=ФХ²/СМ*ЛФЛ, где ФХ – относительное содержание фосфатидилхолина, СМ – относительное содержание сфингомиелина, ЛФЛ – относительное содержание суммарных лизофосфолипидов; и при значениях КР≤6,7 диагностируют снижение функциональной активности мононуклеаров, требующее проведения корригирующей терапии.

Технический результат заключается в точном и раннем определении состояния мононуклеаров периферической крови у больных туберкулезом легких, позволяющем назначать корригирующую терапию при выявлении снижения их функциональной активности.

Новыми, ранее неизвестными признаками заявленного способа оценки состояния мононуклеаров периферической крови у больных туберкулезом легких являются:

1. Расчет коэффициента КР=ФХ²/СМ*ЛФЛ для мононуклеаров периферической крови больных туберкулезом легких.

2. Определение пределов значения коэффициента КР=ФХ²/СМ*ЛФЛ для мононуклеаров периферической крови больных туберкулезом легких получающих противотуберкулезную химиотерапию, не получающих противотуберкулезную химиотерапию и здоровых лиц.

3. Определение значения коэффициента КР=ФХ²/СМ*ЛФЛ ниже которого диагностируют снижение функциональной активности мононуклеаров.

Способ разработан на основе анализа фосфолипидного спектра мононуклеаров периферической крови 184 больных туберкулезом легких до лечения и после окончания интенсивной фазы основного курса противотуберкулезной химиотерапии (60 доз комбинации противотуберкулезной химиотерапии), а также 36 здоровых добровольцев без выявленной соматической, инфекционной или психической патологии. Полученные данные фосфолипидного спектра мононуклеаров периферической крови позволяют рассчитать коэффициент КР. Данный коэффициент является результатом произведения, то есть, результатом интегрального объединения двух показателей: СМ/ФХ и ФХ/ЛФЛ, то есть, объединяет 2 направления биохимических процессов уменьшение липидной «жидкостности» мембран и изменение активности фосфолипаз с накоплением деструктивных лизофосфолипидов (RU 2167424, опубл. 20.05.2001). Изменение состава фосфолипидов на мембранах мононуклеаров начинается намного раньше изменения фагоцитарной активности мононуклеарных фагоцитов. Опытным путем было установлено, что при значениях данного коэффициента ниже или равными 6,7 диагностируют снижение функциональной активности мононуклеаров, что требует введения корригирующей терапии.

Предлагаемый способ оценки состояния мононуклеаров периферической крови у больных туберкулезом легких осуществляется в следующей последовательности.

Кровь для исследования забирают из вены утром до завтрака. В вакуумную пробирку без наполнителя забирают 10мл крови, после чего в неё добавляется цитрат натрия – 1мл. Пробирку отстаивают при температуре 15°С до разделения цельной крови на 2 слоя. Лейкоплазму разделяют на градиенте плотности 1,083 г/см3 центрифугированием на 7000 об/мин в течении 5 мин. Полученные мононуклеары отмыват и проводят экстракцию липидов смесью хлороформ-метанол (1:2 по объему). Полученный экстракт выпаривают при температуре 15°С в вакууме или токе азота. Полученный экстракт подвергают хроматографическому разделению (используется непрерывная тонкослойная хроматография в горизонтальных камерах). В качестве элюента используют систему растворителей, состоящую из хлороформа, метанола и аммиака в соотношении 13,4:4,6:1. Полученные хроматограммы проявляют в парах серной кислоты при температуре 180°С в течении 20 минут. Далее хроматограммы денситометрируют в отраженном свете. Содержание фракций фосфолипидов рассчитываться по площади соответствующих пиков денситометрической кривой. Для определения процентного содержания конкретной фракции сумма площади всех пиков делится на площадь пика соответствующего фракции.

Оценка состояния мононуклеаров периферической крови было проведено у 184 пациентов с туберкулезом легких и 36 здоровых лиц без диагностированной инфекционной, соматической или психической патологии. Опытным путем установлено, что у здоровых лиц значения коэффициента КР колебалось в пределах от 12,1 до 16,0. У пациентов с туберкулезом легких снижение коэффициента ниже 12 свидетельствовало о снижении функциональной активности мононуклеаров. Снижение противотуберкулезной резистивности подтверждалось снижением фагоцитарной активности по фагоцитарному числу и фагоцитарному индексу.

Пример 1. Больной Б. История 2231. Диагноз: Инфильтративный тубекулез легких, БК+. Подтверждён бактериологически. Получал основной курс противотуберкулезной химиотерапии по 1 стандартному режиму. Значение индекса КР до начала химиотерапии 14,2, после окончания интенсивной фазы химиотерапии 6,1. Оценка состояния мононуклеаров периферической крови выявила снижение их функциональной активности. Назначена корригирующая терапия.

Пример 2. Больной В. История 2462. Диагноз: Инфильтративный тубекулез легких, БК+. Подтверждён бактериологически. Получал основной курс противотуберкулезной химиотерапии по 1 стандартному режиму. Значение индекса КР до начала химиотерапии 13,9, после окончания интенсивной фазы химиотерапии 5,0. Оценка состояния мононуклеаров периферической крови выявила снижение их функциональной активности. Назначена корригирующая терапия.

Пример 3. Больная Н. История 2574. Диагноз: Инфильтративный тубекулез легких, БК+. Подтверждён бактериологически. Получала основной курс противотуберкулезной химиотерапии по 1 стандартному режиму. Значение индекса ФХ²/СМ*ЛФЛ до начала химиотерапии 15,9, после окончания интенсивной фазы химиотерапии 11,3. Оценка состояния мононуклеаров периферической крови не выявила снижение их функциональной активности. Корригирующая терапия не требовалась.

Таким образом, предлагаемый нами способ оценки состояния мононуклеаров периферической крови у больных туберкулезом легких позволяет выявить снижение функциональной активности мононуклеаров периферической крови при снижении значения коэффициента КР ниже или равным 6,7.

Изобретение может быть использовано в диагностических целях для раннего выявления функциональных нарушений в иммунной системе и определения показания к корригирующей терапии.

Способ оценки состояния мононуклеаров периферической крови, включающий определение фосфолипидного спектра мембран мононуклеаров периферической крови, отличающийся тем, что оценку проводят путем определения относительного содержания фракций суммарных лизофосфолипидов, сфингомиелина и фосфатидилхолина фосфолипидного спектра мембран мононуклеаров периферической крови и расчета коэффициента, определяемого по формуле КР=ФХ²/СМ*ЛФЛ, где ФХ – относительное содержание фосфатидилхолина, СМ – относительное содержание сфингомиелина, ЛФЛ – относительное содержание суммарных лизофосфолипидов; при значениях данного коэффициента ниже или равных 6,7 диагностируют снижение функциональной активности мононуклеаров.

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для прогнозирования исхода проникающего ранения глазного яблока у взрослого населения в момент его первичного обращения к врачу-офтальмологу.

Способ диагностики молекулярных фенотипов остеоартрита // 2706733

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, ревматологии, ортопедии и травматологии, и может быть использовано для диагностики молекулярных фенотипов остеоартрита.

Способ комбинированного лечения немелкоклеточного рака легкого ib - iii стадии с использованием персонализированной периоперационной химиотерапии // 2706718

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Предложен способ комбинированного лечения немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) IB - III стадии.

Способ прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии // 2706683

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и репродуктологии, и касается прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия.

Способ полуколичественной оценки белка pdcd4 иммуногистохимическим методом // 2706005

Изобретение относится к патологической анатомии и может быть использовано для полуколичественной визуальной оценки синтеза регуляторного белка PDCD4 в гистологических срезах ткани иммуногистохимическим методом с детекцией в ядре и цитоплазме.

Способ для оценки и лечения или профилактики нарушенных уровней полярных липидов в плазме // 2705208

Группа изобретений относится к фармации и медицине. Предложено применение композиции в получении жидкого продукта для профилактики или лечения индивидуума, имеющего нарушенные уровни в плазме одного или нескольких полярных липидов: фосфатидилхолина (РС) PC aa C36:6, PC aa C38:0, PC aa C38:6, PC aa C40:6, PC ae C40:6 и ряда других, причём указанная композиция включает по меньшей мере один витамин группы В, выбранный из витамина B6, витамина B12 и витамина B9 (варианты).

Способ прогнозирования развития неспецифических осложнений острых кишечных инфекций с синдромом гемоколита у детей // 2704132

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и инфектологии, и касается прогнозирования развития неспецифических осложнений острых кишечных инфекций с синдромом гемоколита у детей.

Скрининг-тест для определения функциональной активности классического пути системы комплемента // 2704121

Изобретение относится к медицинской иммунологии и может быть использовано для определения функциональной активности классического пути системы комплемента. Для этого проводят реакцию лизиса эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА), с 1% сывороткой крови человека.

Способ диагностического прогнозирования уровня холинэстеразы в сыворотке крови у лиц, экспонированных винилхлоридом // 2704117

Изобретение относится к области медицины, а именно профилактической медицине, и раскрывает способ прогнозирования значений концентрации холинэстеразы в сыворотке крови у работающих в условиях экспозиции винилхлоридом со стажем более 5 лет.

Способ оценки риска (прогнозирования) послеоперационных осложнений хирургического лечения геморроя // 2704004

Изобретение относится к области медицины, хирургии и проктологии и раскрывает способ оценки риска послеоперационных осложнений хирургического лечения геморроя путем исследования крови.

Способ диагностики мембранодеструктивного эффекта противотуберкулезной химиотерапии // 2709504

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и применяется для диагностики мембранодеструктивного эффекта противотуберкулезной химиотерапии. Для этого проводят хроматографическое исследование липидного спектра плазмы крови. Далее у больных туберкулезом легких, получающих противотуберкулезную химиотерапию, определяют относительное содержание фракции лизофосфатидилхолина плазмы крови. При значениях выше 12% диагностируют мембранодеструктивный эффект противотуберкулезной химиотерапии. Изобретение может быть использовано в диагностических целях для раннего выявления мембранодеструктивного эффекта противотуберкулезной химиотерапии и определения показания к проведению корригирующей терапии. 3 пр.

Способ диагностики стадии фиброза печени у пациентов с хроническим вирусным гепатитом с // 2709507

Изобретение относится к области медицины и может найти применение в диагностике стадии фиброза печени у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС). Согласно предлагаемому способу определяют методом ДНК комет степень повреждений ДНК лимфоцитов периферической крови, осуществляют клинический и общетерапевтический биохимический анализ крови, с использованием предсказательной математической модели по результатам анализов пациентов с ХВГС находят коэффициенты порядковой логистической регрессии с регуляризацией, с помощью которых рассчитывают значение вспомогательных показателей es1 и es2 по формулам es1=exp(-0,933-0.0498*Возраст+0,410*Эритроциты-0,0128*АСТ-0,014*АЛТ-0,053*Глобулины-0,023*%ДНК в хвосте кометы+0,0278*Гемоглобин); es2=exp(-6,497-0,043*Возраст+2,417*Эритроциты-0,012*АСТ-0,014*АЛТ-0,053*Глобулины-0,023*%ДНК в хвосте кометы+0,0,27*Гемоглобин), где ехр - экспоненциальная функция; возраст - возраст пациента (в годах); Эритроциты – содержание эритроцитов; ACT – аспартатаминотрансфераза; АЛТ – аланинаминотрансфераза; Глобулин – содержание глобулина в периферической крови, г/л; %ДНК в хвосте кометы – содержание ДНК в хвосте кометы лимфоцитов периферической крови у i-того пациента (%). Затем вычисляют значения вероятности P для каждой стадии фиброза по формулам и устанавливают ту стадию фиброза печени, которая соответствует максимальному значению вероятности. Изобретение обеспечивает повышение достоверности и точности определения стадии фиброза печени и характеризуется малой инвазивностью и безопасностью для пациентов. 3 табл., 1 пр.

Способ сравнительного исследования эффективности локальных кровоостанавливающих средств в эксперименте in vitro // 2709517

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу сравнительного исследования эффективности локальных кровоостанавливающих средств (ЛКС) в эксперименте in vitro, отличающемуся тем, что из полотна ЛКС с помощью Dermo-Punch получают цилиндр диаметром, равным внутреннему сечению Dermo-Punch и вакутайнера, образцы ЛКС и вакутайнеры выдерживают в термостате при +37°С 10 минут, после чего забирают кровь вакуумным способом и в течение 15 секунд на дно вакутайнера погружают локальные кровоостанавливающие средства, пробирки закупоривают и инкубируют 30 минут при +37°С, затем центрифугируют для получения сыворотки крови, исследуют концентрацию кальция в плазме крови и сравнивают значения в контрольной группе, в которой не производилось погружение образца в кровь донора, и группах исследования, и если значения концентрации кальция в группе исследования меньше, чем в контрольной и других группах, то это свидетельствует о выраженной эффективности локального кровоостанавливающего средства. Изобретение обеспечивает повышение точности и объективизацию исследований при разработке экспериментальных образов гемостатических средств локального действия. 1 табл., 1 пр.

Способ культивирования одиночной в-клетки // 2709531

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к способу получения В-клеток, секретирующих антиген-специфические антитела. Для получения B-клеток проводят следующие этапы: получение B-клеток из крови кролика; мечение IgG+-B-клеток и/или CD138+-B-клеток; инкубацию B-клеток при температуре 37°C в течение одного часа в среде для совместного культивирования перед размещением меченых B-клеток в виде одиночных клеток с последующим совместным культивированием с фидерными клетками в среде для совместного культивирования; выбор B-клетки, пролиферирующей на этом этапе; получение B-клетки. Способ также может включать этап центрифугирования размещенных по отдельности В-клеток перед совместным культивированием. Фидерными клетками являются мышиные клетки EL-4 B5, а фидерная смесь содержит интерлейкин-1-бета, фактор некроза опухоли альфа, клетки золотистого стафилококка штамма Cowan, BAFF, интерлейкин-2, и/или интерлейкин-10, и/или интерлейкин-6, и/или интерлейкин-4. Для получения антител берут популяцию зрелых B-клеток, полученную из крови кролика; проводят мечение IgG+-B-клеток и/или CD138+-B-клеток по меньшей мере одной флуоресцентной меткой; инкубируют B-клетки при температуре 37°C в течение одного часа в среде для совместного культивирования перед размещением одиночных клеток из популяции меченых B-клеток в отдельные контейнеры; культивируют размещенные по отдельности B-клетки в присутствии фидерных клеток и фидерной смеси; определяют специфичность связывания антител и аминокислотную последовательность вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител путем ПЦР с обратной транскрипцией; вводят нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела для экспрессии антитела; вводят нуклеиновую кислоту в клетку; культивируют клетку и выделяют антитело из клетки или клеточного супернатанта. Группа изобретений позволяет быстро охарактеризовать специфичность связывания моноклональных антител, полученных из отдельных В-клеточных клонов, полученных из крови кролика. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 13 табл., 22 пр.