Способ получения окрашенного коллагена и определения активности коллагеназы

Настоящее изобретение относится к области энзимологии, биотехнологии и медицинской промышленности, а именно к способу получения окрашенного коллагена с целью использования его в качестве субстрата для определения активности фермента коллагеназы, включающему измельчение коллагена до размера частиц не более 2 мм с влажностью не более 8,0%, с последующей обработкой его раствором красителя RO16, характеризующегося максимумами спектра поглощения при 210±3; 288±2; 360±2; 480±2 нм, при рН суспензии в интервале 6,3-7,5. Настоящее изобретение обеспечивает получение субстрата для определения специфической активности коллагеназы-коллагена, химически связанного с красителем RO16, пригодного для определения специфической активности лекарственных средств на основе коллагеназы из Clostridium histolyticum. 2 табл., 2 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к энзимологии, биотехнологии и медицинской промышленности, в частности, к способу получения окрашенного коллагена как специфического субстрата и способу контроля качества лекарственных средств, содержащих в качестве действующего вещества фермент коллагеназу, продуцируемый культурой Clostridium histolyticum.

Описание предшествующего уровня техники

Коллагеназа представляет собой протеолитический фермент, продуцируемый культурой Clostridium histolyticum. В качестве сопутствующих ферментов, представляющих минорные примеси, культура продуцирует и некоторые другие протеазы. Под действием препаратов, содержащих коллагеназу в качестве действующего вещества, происходит смягчение и рассасывание рубцов, шрамов, контрактур, а также очищение ран, что способствует более быстрому развитию грануляционной ткани. Препарат не действует на интактный эпителий, жировую и мышечную ткани.

Коллагеназа - эндопептидаза, расщепляющая тройную спираль макромолекулы нерастворимого белка коллагена (Experience in the use of collagenase Clostridium histolyticum in the management of Peyronie's disease: current data and future prospects / M.A. Egui Rojo, I. Moncada Iribarren, J. Carballido Rodriguez, J.I. Martinez-Salamanca // Therapeutic Advances in Urology. 2014. V. 6, N 5. P. 192-197. Minimally invasive options in Dupuytren's contracture: aponeurotomy, enzymes, stretching, and fat grafting / A. Murphy, D.H. Lalonde, С. Eaton, K. Denkler, S.E. Hovius, A.A. Smith, A. Martin, A. Biswas, C. Van Nieuwenhoven // Plastic and Reconstructive Surgery. 2014. V. 134, N 5. P. 822-829. Schulze, S.M., Postapproval clinical experience in the treatment of Dupuytren's contracture with collagenase clostridium histolyticum (CCH): the first 1,000 days / S.M. Schulze, J.P. Tursi // Hand (N Y). 2014. V. 9, N 4. P. 447-458. Van Doren, S.R. Matrix metalloproteinase interactions with collagen and elastin / S.R. Van Doren, // Matrix Biology. 2015. V. 44-46. P. 224-231).

Коллаген имеет особую макроструктуру, образованную тройной спиралью, в состав которой в основном входит трипептид Gly-Pro-X (X - остаток пролина или гидроксипролина). Благодаря такой сложной структуре коллаген как субстрат доступен только для высоко специфического фермента коллагеназы.

Коллагеназа может найти широкое применение в офтальмологии, косметологии, хирургии для профилактики и лечения рубцовых образований, адгезивного капсулита, келоидных рубцов, гипертрофированных рубцов, послеоперационных спаек, морщин, целлюлита (Pat. WO 2007089851 А2 Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases / G.L. Sabatino, T.Jr.B.J. Del, P.J. Bassett, H.A. Tharia, A.G. Hitchcock. 9 Aug. 2007).

Особое внимание уделяется перспективности использования коллагеназы в лечении контрактуры Дюпюитрена - заболевания кисти, связанное с Рубцовым перерождением и укорачиванием ладонных сухожилий (Multiple concurrent collagenase Clostridium histolyticum injections to Dupuytren's cords: an exploratory study / Coleman S., Gilpin D., Tursi J., Kaufman G., Jones N., Cohen В. // BMC Musculoskeletal Disorders. 2012. V. 13, N61. Doi:10.1186/1471-2474-13-61. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3409044/pdf/1471-2474-13-61.pdf. (дата обращения: 01.07.2015). Schulze, S.M., Postapproval clinical experience in the treatment of Dupuytren's contracture with collagenase clostridium histolyticum (CCH): the first 1,000 days / S.M. Schulze, J.P. Tursi // Hand (N Y). 2014. V. 9, N 4. P. 447-458. Van Doren, S.R. Matrix metalloproteinase interactions with collagen and elastin / S.R. Van Doren, // Matrix Biology. 2015. V. 44-46. P. 224-231).

Инъекции коллагеназы в зарубцевавшуюся фасцию, покрывающую сухожилие, приводят к ее распаду и, как следствие, к исчезновению рубца. Использование коллагеназы в лечении контрактуры Дюпюитрена позволяет отказаться от стационарного операционного вмешательства и исключить долгосрочное послеоперационное восстановление. Согласно современным литературным данным, большинство исследований в этом направлении находятся на стадии клинических испытаний (Efficacy and safety of collagenase Clostridium histolyticum in the treatment of proximal interphalangeal joints in dupuytren contracture: combined analysis of 4 phase 3 clinical trials / M.A. Badalamente, L.C. Hurst, P. Benhaim, B.M. Cohen // Journal of Hand Surgery. 2015. V. 40, N 5. 975-983). Например, изучается возможность одновременного лечения двух и более контрактур в одной руке пациента (The efficacy and safety of concurrent collagenase Clostridium histolyticum Injections for 2 Dupuytren contractures in the same hand: a prospective, multicenter study / R.G. Gaston, S.E. Larsen, G.M. Pess, S. Coleman, B. Dean, B.M. Cohen, G.J. Kaufman, J.P. Tursi, L.C. Hurst // Journal of Hand Surgery. 2015. [Epub ahead of print]), подбираются способы введения (Collagenase treatment of Dupuytren's contracture using a modified injection method: a prospective cohort study of skin tears in 164 hands, including short-term outcome / I. Atroshi, A. Lauritzson, E. Ahlgren, J. Waldau, // Acta Orthopaedica. 2015. V. 86, N 3. P. 310-315).

Кроме того, получены положительные результаты применения клостридиальной коллагеназы для лечения болезни Пейрони (Experience in the use of collagenase Clostridium histolyticum in the management of Peyronie's disease: current data and future prospects / M.A. Egui Rojo, I. Moncada Iribarren, J. Carballido Rodriguez, J.I. Martinez-Salamanca // Therapeutic Advances in Urology. 2014. V. 6, N 5. P. 192-197), капсулярного фиброза, вызванного силиконовыми имплантатами (исследования на животных) (The collagenase of the bacterium Clostridium histolyticum for the treatment of capsular fibrosis after silicon implants / S. Fischer, T. Hirsch, Y. Diehm, J. Kiefer, E.M. Bueno, M. Kueckelhaus, T. Kremer, C. Hirche, U. Kneser, B. Pomahac // Plastic and Reconstructive Surgery. 2015. [Epub ahead of print]), трансплантации островков поджелудочной железы, что является важным шагом в лечении диабета I типа (Characterization of collagenase blend enzymes for human islet transplantation / B. Antonioli, I. Fermo, S. Cainarca, S. Marzorati, R. Nano, M. Baldissera, A. Bachi, R. Paroni, C. Ricordi, F. Bertuzzi // Transplantation. 2007. V. 84. P. 1568-1575). Коллагеназа может быть использована в диагностических и лабораторных целях, например, для дезинтеграции тканей in vitro (Pat. US 8715985 B2 Clostridium histolyticum recombinant collagenases and method for the manufacture thereof / F. Bertuzzi, A. Cuttitta, G. Ghersi, S. Mazzola, M. Salamone, G. Seidita. 6 May 2014).

Учитывая перспективность использования коллагеназы в составе препаратов медицинского назначения, актуальной является разработка надежного метода определения коллагеназной активности фермента, продуцируемого Clostridium histolyticum.

Известны способы определения коллагеназной активности, предусматривающие использование как нативного коллагена, так и синтетического субстрата FALGPA (N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala) (Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase from C. histolyticum [Текст] / I. Mandl, J.D. MacLennan, E.L. Howes, R.H. DeBellis, A. Sohler, // Journal of Clinical Investigation. - 1953. - V. 32. - P. 1323-1329. Van Wart, H.E., Steinbrink, D.R. A continuous Spectrophotometric Assay for Clostridium histolyticum Collagenase. Anal. Biochem., 113, 356 (1981)). Коллаген является естественным субстратом для коллагеназы (Von Hippel, Р.Н., et. al., J. Am. Chem. Soc., 82, 2774 (1960)). Сопутствующие минорные примеси, обычно присутствующие в клостридиальной коллагеназе и представляющие собой нейтральную протеазу, клостридиопептидазу В, обладающие протеолитической активностью, оценивают с помощью казеина и синтетического низкомолекулярного субстрата бензоил-аргинин этилового эфира (ВАЕЕ).

Традиционный метод определения активности коллагеназы с использованием коллагена из сухожилий быка обладает существенными недостатками. Активность оценивают по количеству образовавшихся продуктов гидролиза и для их количественного определения используют индикатор - нингидрин. Это один из наиболее чувствительных колориметрических методов, но реакция с нингидрином проходит при 100°С (на водяной бане) с использованием органических реактивов, таких как метил- и этилцеллозольв и зависит от присутствия кислорода, поэтому ее проводят в токе азота. Общее время анализа составляет 4-6 ч.

В случае определения ферментативной активности коллагеназы, представляющей собой действующее вещество какого-либо лекарственного средства, использование низкомолекулярного субстрата (FALGPA) нецелесообразно, так как именно высокомолекулярный субстрат, каковым является коллаген, позволяет охарактеризовать коллагеназу в условиях, близких к физиологическим.

Ближайшим аналогом предложенного технического решения является способ определения активности нейтральной коллагеназы (Пат. 2034029 Российская Федерация, МПК C12Q 1/34, C12N 9/50, C12N 9/52, C12N 9/64/ Способ определения активности нейтральной коллагеназы / Т.И. Замыслова, Л.В. Кухарева, Б.И. Фейгельман; заявитель и патентообладатель Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток - №4934907/13; заявл. 08.05.1991; опубл. 30.04.1995) с использованием в качестве субстрата коллагена из дермы крупного рогатого скота (производства "Олайне"), который обрабатывают раствором красителя активного оранжевого ЖТ (по ТУ 6-14-625-85) при рН 8,0 в течение 2 ч при 40°С, затем промывают от избытка красителя водой и высушивают при комнатной температуре. Отношение краситель/коллаген от 20 до 200 мас/мас.

При определении активности коллагеназы данным способом массовое соотношение фермента и субстрата должно составлять 1:100. Дополнительно определяют концентрацию белка в пробе и оптическую плотность фильтрата при полном растворении коллагена, что осуществляют при избытке фермента или соответствующем увеличении длительности реакции гидролиза.

Недостатком данного способа является низкая точность и воспроизводимость метода. В настоящее время краситель активный оранжевый ЖТ снят с производства в силу своей неэффективности при применении в текстильной промышленности, обусловленной слабой прочностью образуемой связи между красителем и субстратом.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является создание нового субстрата для определения специфической активности коллагеназы - коллагена, химически связанного с красителем реактивным (активным) оранжевым RO16, пригодным для определения специфической активности лекарственных средств на основе коллагеназы из Clostridium histolyticum.

Поставленная задача была решена путем применения красителя, молекулы которого способны образовать ковалентные химические связи с гидроксильными и с аминогруппами белковых макромолекул. Это свойство красителя было использовано для получения окрашенного коллагена путем проведения реакции взаимодействия химически активных групп красителя реактивного оранжевого RO16 с аминогруппами аминокислотных остатков, образующих коллагеновые волокна.

Винилсульфоновые активные красители, к которым относится RO16, содержат винилсульфонильную группу -SO₂CH=CH₂ или группу, превращающуюся в винилсульфонильную в процессе окрашивания, обычно β-сульфатоэтилсульфонильную группу -SO₂(CH₂)₂OSO₃Na. Под действием щелочи от этой группы отщепляется остаток серной кислоты и образуется винилсульфонильная группа, взаимодействующая с окрашиваемым веществом, в нашем случае, коллагеном

Краситель - SO₂(CH₂)₂OSO₃Na → Кр - SO₂ - CH = CH₂ + Коллаген - NH₂ → Коллаген - NH - (CH₂)₂SO₂ - Краситель (фиг. 1).

Этот принцип описан в книге Степанова Б.И. (Степанов, Б.И. Введение в химию и технологию органических красителей [Текст] / Б.И. Степанов // Учебник для ВУЗов. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Химия, 1984. - 592 с.). Получение коллагена, окрашенного красителем RO16

Коллаген из бычьих сухожилий (Sigma, № кат. С9879) измельчают с использованием ножевой мельницы для твердых продуктов типа DM-6 производства компании НТ Machinery (Япония-Тайвань) или аналогичной. Для окрашивания измельченный коллаген помещают в колбу, прибавляют воду очищенную, перемешивают и оставляют до набухания и получения однородной суспензии. Затем готовят раствор красителя в воде и прибавляют к набухшему коллагену. Реакционную смесь перемешивают на орбитальном шейкере при 40°С и 130 об/мл, а затем порционно прибавляют 6% раствор натрия хлорида с интервалом в несколько минут при непрерывном перемешивании, после чего прибавляют 2% раствор карбоната натрия при непрерывном перемешивании на шейкере и выдерживают до окончания реакции в течение нескольких часов.

Окрашенный коллаген отделяют от раствора и многократно отмывают водой, контролируя степень отмывки потенциометрически и по величине оптической плотности промывных вод. Окрашенный коллаген подвергают лиофилизации и последующему измельчению на мельнице в течение 5 мин при 1100 об/мин.

Количество связанного красителя (мкмоль/мг окрашенного коллагена) определяют спектрофотометрически при длине волны 480 нм после кислотного гидролиза образца против пробы, полученной в результате аналогичной обработки исходного коллагена.

Описание процесса получения окрашенного коллагена

Подготовка мельницы:

Рабочую поверхность мельницы обрабатывают безворсовой тканью, смоченной 70% спиртом.

Приготовление 6% раствора натрия хлорида:

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 6,0 г натрия хлорида, прибавляют 80 мл воды очищенной и перемешивают до полного растворения навески, доводят водой очищенной до метки и перемешивают.

Раствор используют свежеприготовленным.

Приготовление 2% раствора карбоната натрия:

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 2,0 г натрия карбоната, прибавляют 80 мл воды очищенной и перемешивают до полного растворения навески, доводят водой очищенной до метки и перемешивают.

Раствор используют свежеприготовленным.

Приготовление раствора красителя RO16:

В химический стакан вместимостью 100 мл помещают 0,200 г красителя реактивного оранжевого RO16, прибавляют 50 мл воды очищенной, подогретой до (70±10)°С и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения красителя. Полученный раствор красителя охлаждают до 40°С на водяной бане.

Измельчение коллагена:

Коллаген измельчают с использованием мельницы при комнатной температуре в течение 5 минут. Размер частиц не более 2 мм.

Окрашивание коллагена:

В коническую колбу вместимостью 250-500 мл помещают 5 г измельченного коллагена, прибавляют 80 мл воды очищенной и перемешивают до получения однородной суспензии. Выдерживают 10 минут и прибавляют 50 мл раствора красителя RO16. Ополаскивают стакан водой очищенной в объеме 20 мл и прибавляют к общей реакционной смеси.

Реакционную смесь перемешивают на орбитальном шейкере при 40°С при 130 об/мин. Через 15 минут дважды прибавляют по 50 мл 6% раствора натрия хлорида с интервалом 5 минут при непрерывном перемешивании. Через 25 минут прибавляют 37,5 мл 2% раствора карбоната натрия при непрерывном перемешивании при 130 об/мин и выдерживают при (40±3)°С в течение 2 часов.

Отмывка коллагена:

Реакционную смесь помещают на сито с размером пор 1 мм и промывают водой очищенной в объеме 3 л. Степень отмывки контролируют по значению рН промывных вод и по оптической плотности при 490 нм.

Реакционную массу дополнительно промывают еще 700 мл воды очищенной, дают стечь избытку воды, помещают на чашку Петри и замораживают при температуре минус (40±3)°С в течение 12 часов для последующей лиофилизации.

Лиофилизация:

Замороженную массу помещают в лиофилизатор при температуре минус (50±3)°С Лиофилизацию проводят в течение 8 часов при температуре минус (50±3)°С и остаточном давлении 8 МРа.

Измельчение:

Высушенную массу помещают в мельницу и измельчают в течение 1 минуты при 1100 об/мин.

Измельченный продукт извлекают из мельницы, взвешивают и помещают в стеклянный флакон вместимостью 50 мл, укупоривают пробкой и закатывают алюминиевым колпачком.

Готовый продукт хранят в сухом, защищенном от света месте при температуре (5±3)°С.

Количественное определение:

Коллаген окрашенный красителем реактивным оранжевым RO16 по предложенному способу содержит от 40 до 60 мкмоль красителя RO16 /г окрашенного коллагена.

В 3 термостойкие пробирки вместимостью 20 мл помещают по 25 мг (точная навеска) коллагена окрашенного красителем RO16, прибавляют 2 мл хлористоводородной кислоты, разведенной водой очищенной в два раза, тщательно перемешивают. В 4-ю пробирку помещают 25 мг (точная навеска) коллагена из бычьих сухожилий, 2 мл хлористоводородной кислоты разведенной водой очищенной в два раза (контрольный раствор). Все пробирки закрывают фольгой и выдерживают при 130°С в течение 3 часов на песчаной бане. Пробирки извлекают из песчаной бани и охлаждают на воздухе в течение 15 минут. Содержимое всех пробирок количественно переносят в мерные колбы вместимостью 50 мл, доводят объем до метки водой очищенной и перемешивают. Измеряют оптическую плотность растворов при длине волны 480 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения.

По калибровочному графику определяют количество микромоль красителя в растворе.

Количество микромоль красителя RO16 в 1 г окрашенного коллагена определяют по формуле:

где N_К - содержание красителя RO16 в испытуемом растворе, определенное по калибровочному графику, мкмоль/л;

V - объем реакционной смеси, 50 мл;

m - масса навески, мг.

Построение калибровочного графика:

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,050 г (точная навеска) красителя реактивного оранжевого RO16, прибавляют 70 мл воды очищенной и перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают. В термостойкие пробирки вместимостью 20 мл помещают раствор красителя, содержащий 50; 100; 150; 200; 250; 300 мкг красителя и 2 мл кислоты хлористоводородной предварительно разведенной водой очищенной в два раза, перемешивают и минерализуют при 130°С на песчаной бане в течение 3 часов. После завершения выдержки пробирки извлекают из песчаной бани и охлаждают на воздухе в течение 15 минут. Содержимое всех пробирок количественно переносят в мерные колбы емкостью 10 мл, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают. Измеряют оптическую плотность растворов при длине волны 480 нм результаты измерений представлены в таблице 1. На основе этих результатов строят калибровочный график зависимости оптической плотности раствора от содержания красителя в образце окрашенного коллагена (фиг. 2).

Полученный субстрат - окрашенный коллаген используют для определения специфической активности коллагеназы и измеряют продукты ферментативного гидролиза в растворе. На основании полученных экспериментальных данных вычисляют специфическую активность коллагеназы, которая выражается в единицах коллагеназной активности.

За единицу коллагеназной активности (ЕД) принято количество коллагеназы, приводящее к увеличению оптической плотности при длине волны 490 нм, вызванному ферментативным расщеплением 1 мг коллагена, окрашенного красителем реактивным оранжевым RO16 в стандартных условиях реакции.

Пример 1

Коллаген из бычьих сухожилий измельчают на мельнице ДМ-6, отбирают 5 г продукта и помещают в колбу объемом 500 мл, добавляют 80 мл воды очищенной. Туда же добавляют 50 мл раствора, содержащего 0,1 г красителя RO16.

Смесь перемешивают на шейкере при 40°С при 130 об/мин, через 15 мин добавляют дважды 50 мл 6% раствора натрия хлорида, через 25 мин добавляют еще 37,5 мл 2% раствора карбоната натрия и выдерживают 2 часа. Затем реакционную смесь помещают на сито и промывают 3 л воды. После удаления избытка воды смесь помещают на чашку Петри, замораживают при температуре минус 40°С и лиофилизируют. Высушенную смесь измельчают на мельнице 20 мин при 1100 об/мин.

Полученный субстрат представляет собой ватообразные волокна оранжевого цвета; рН суспензии окрашенного коллагена в воде очищенной 7,07; потеря в массе при высушивании 5,8%; количественное определение красителя в 1 г окрашенного коллагена 58 мкмоль; размер частиц не более 2 мм. Спектр поглощения кислотного гидролизата образца окрашенного коллагена имеет максимум при 213 нм, 288 нм, 361 нм и 479 нм.

Пример 2

Коллаген из бычьих сухожилий измельчают на мельнице ДМ-6, отбирают 5 г продукта и помещают в колбу объемом 500 мл, добавляют 80 мл воды очищенной. Туда же добавляют 50 мл раствора, содержащего 0,1 г красителя RO16.

Смесь перемешивают на шейкере при 40°С при 130 об/мин, через 15 мин добавляют дважды 50 мл 6% раствора натрия хлорида, через 25 мин добавляют еще 37,5 мл 2% раствора карбоната натрия и выдерживают 2 часа. Затем реакционную смесь помещают на сито и промывают 3 л воды. После удаления избытка воды смесь помещают на чашку Петри, замораживают при температуре минус 40°С и лиофилизируют. Высушенную смесь измельчают на мельнице 20 мин при 1100 об/мин.

Полученный субстрат представляет собой ватообразные волокна оранжевого цвета; рН суспензии окрашенного коллагена в воде очищенной 7,19; потеря в массе при высушивании 6,1%; количественное определение красителя в 1 г окрашенного коллагена 52 мкмоль; размер частиц не более 2 мм. Спектр поглощения кислотного гидролизата образца окрашенного коллагена имеет максимум при 209 нм, 287 нм, 360 нм и 480 нм.

Пример 3

Коллаген из бычьих сухожилий измельчают на мельнице ДМ-6, отбирают 5 г продукта и помещают в колбу объемом 500 мл, добавляют 80 мл воды очищенной. Туда же добавляют 50 мл раствора, содержащего 0,1 г красителя RO16.

Смесь перемешивают на шейкере при 40°С при 130 об/мин, через 15 мин добавляют дважды 50 мл 6% раствора натрия хлорида, через 25 мин добавляют еще 37,5 мл 2% раствора карбоната натрия и выдерживают 2 часа. Затем реакционную смесь помещают на сито и промывают 3 л воды. После удаления избытка воды смесь помещают на чашку Петри, замораживают при температуре минус 40°С и лиофилизируют. Высушенную смесь измельчают на мельнице 20 мин при 1100 об/мин.

Полученный субстрат представляет собой ватообразные волокна оранжевого цвета; рН суспензии окрашенного коллагена в воде очищенной 6,56; потеря в массе при высушивании 6,2%; количественное определение красителя в 1 г окрашенного коллагена 58 мкмоль; размер частиц не более 2 мм. Спектр поглощения кислотного гидролизата образца окрашенного коллагена имеет максимум при 209 нм, 287 нм, 360 нм и 480 нм.

Пример 4

Коллаген из бычьих сухожилий измельчают на мельнице ДМ-6, отбирают 5 г продукта и помещают в колбу объемом 500 мл, добавляют 80 мл воды очищенной. Туда же добавляют 50 мл раствора, содержащего 0,1 г красителя RO16.

Смесь перемешивают на шейкере при 40°С при 130 об/мин, через 15 мин добавляют дважды 50 мл 6% раствора натрия хлорида, через 25 мин добавляют еще 37,5 мл 2% раствора карбоната натрия и выдерживают 2 часа. Затем реакционную смесь помещают на сито и промывают 3 л воды. После удаления избытка воды смесь помещают на чашку Петри, замораживают при температуре минус 40°С и лиофилизируют. Высушенную смесь измельчают на мельнице 20 мин при 1100 об/мин.

Полученный субстрат представляет собой ватообразные волокна оранжевого цвета; рН суспензии окрашенного коллаген в воде очищенной 7,9; потеря в массе при высушивании 7,9%; количественное определение красителя в 1 г окрашенного коллагена 60 мкмоль; размер частиц не более 2 мм. Спектр поглощения кислотного гидролизата образца окрашенного коллагена имеет максимум при 212 нм, 288 нм, 361 нм и 480 нм.

В результате анализа полученных образцов окрашенного коллагена можно сформулировать основные характеристики продукта: он должен представлять собой ватообразные волокна оранжевого цвета. рН суспензии окрашенного коллагена в воде очищенной от 6,6 до 7,3, потеря в массе при высушивании не более 8%, количественное содержание красителя должно быть в интервале от 40 до 60 мкмоль на 1 г окрашенного коллагена, размер частиц не более 2 мм, спектры поглощения кислотного гидролизата должны иметь максимумы при 210±3 нм, 288±2 нм; 360±2 нм; 480±2 нм, полная характеристика представлена в таблице 2.

Настоящее изобретение представляет собой способ получения стандартизованного субстрата - окрашенного коллагена, позволяющего надежно определять специфическую активность лекарственных средств на основе коллагеназы с использованием оригинальной методики.

Способ получения окрашенного коллагена с целью использования его в качестве субстрата для определения активности фермента коллагеназы, включающий измельчение коллагена до размера частиц не более 2 мм с влажностью не более 8,0% с последующей обработкой его раствором красителя RO16, характеризующегося максимумами спектра поглощения при 210±3; 288±2; 360±2; 480±2 нм, при рН суспензии в интервале 6,3-7,5.