Способ определения генотипа человека по мутации ivs14+1ga b 14 интроне гена dpyd


C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2709710:

Общество с Ограниченной Ответственностью ООО "Синтез-Групп" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, заключающийся в применении специфичных олигонуклеотидных последовательностей с регистрацией результатов ЦПР в режиме реального времени с использованием метода анализа кривых плавления (HRM). Реакционные смеси включают специфичные праймеры, а также адаптированный буфер для Taq-полимеразы, позволяющий повысить чувствительность метода. Изобретение позволяет снизить затраты на молекулярно-генетическое исследование, повысить его доступность и точность тестирования за счет применения оригинальных олигонуклеотидных последовательностей и оптимизированных реакционных смесей. 2 пр.

 

Предложенный способ относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и генетики, и может быть использован для определения генотипа человека по мутации c.1236G>A (p. E412E, rs556038477) в 11 экзоне гена DPYD (ENST00000370192.7, RefSeq NM_000110) с отнесением исследуемого образца к гомозиготе по «дикому типу» или гетерозиготе по диагностируемому аллельному варианту.

Фармакогенетическое тестирование с целью прогноза развития токсических и побочных эффектов при проведении лекарственного лечения является одним из активно развивающихся направлений в ДНК-тестировании и постепенно занимает свое место во многих клинических рекомендациях по лечению злокачественных новообразований. Разработка и внедрение способа тестирования полиморфных вариантов в гене DPYD, одобренного FDA (Food and Drug Administration) и включенного в рекомендации ESMO (European Society of Clinical Oncology) для прогнозирования токсичности химиотерапии при лечении ряда злокачественных новообразований, является одним из приоритетных направлений в фармакогенетическом тестировании.

Ген DPYD кодирует фермент дигидропиримидиндегидрогеназу, функциональная недостаточность которой, приводит к развитию 5-фторурацил-ассоциированной токсичности (OMIM 274270) при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода»). ДНК-диагностика, основанная на определении генотипа человека по мутациям и полиморфизмам в гене DPYD, необходима для прогнозирования развития осложнений, ассоциированных с приемом данных лекарственных препаратов, коррекции дозы и схемы проводимого лечения.

Широко распространен способ определения полиморфных вариантов и мутаций в гене DPYD с помощью секвенирования по Сэнгеру всей кодирующей последовательности гена DPYD (Kuilenburg, A. Analysis of severely affected patients with dihydropyrimidine dehydrogenase defeciency reveals large intragenic rearrangements of DPYD and a de novo interstitial deletion del(1)(p13.3p21.3) / Kuilenburg A., Meijer J., Mul A. et al. // Hum.Genet. - 2009. - V. 125. - P. 589–590).

Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования.

Известен способ генотипирования полиморфных вариантов в гене DPYD, основанный на применении метода ПЦР в детекцией результатов в режиме реального времени (Real-time PCR) (Deenen, M. Relationship between Single Nucleotide Polymorphisms and Haplotypes in DPYD and Toxicity and Efficacy of Capecitabine in Advanced Colorectal Cancer / Deenen, M., Tol J., Burylo A. et al. // Clin. Cancer Res. - V. 17. - P. 3455–3468).

Недостатки: высокая стоимость проведения исследования.

Известен способ определения полиморфных вариантов в гене DPYD, основанный на гибридизации на чипах с применением аллель-специфичных зондов (т.н. SNP-array) (Rosmarin, D. Genetic Markers of Toxicity From Capecitabine and Other Fluorouracil-Based Regimens: Investigation in the QUASAR2 Study, Systematic Review and Meta-Analysis / Dan R., Palles C., Church D. et al. // Journal of clinical oncology. - 2014. - V. 32).

Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования, потребность совместимого оборудования.

Известен способ ДНК-тестирования мутаций в гене DPYD с помощью ПЦР с последующим анализом длины рестрикционных фрагментов, т.н. ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP analysis) (Uzunkoy, A. Investigation of IVS14+1G>A polymorphism of DPYD gene in a group of Turkish patients with colorectal cancer / Uzunkoy A., Dilmec F., Ozgonul A. et al. // Anticancer Res. - 2007. - V. 27. - P. 3899-3902).

Недостатки: трудоемкость, времязатратность.

Одним из способов диагностики мутаций в гене DPYD является высокоэффективная жидкостная хроматография (Ezzeldin, H. Denaturing high performance liquid chromatography analysis of the DPYD gene in patients with lethal 5-fluorouracil toxicity / Ezzeldin, H., Johnson MR, Okamoto, Y. et al. // Clin. Cancer Res. - 2003. - V. 1. - P. 3021-3028).

Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования, потребность совместимого оборудования.

Задачей заявляемого изобретения является разработка оптимального способа определения генотипа человека по мутации c.1236G>A в 11 экзоне гена DPYD, ответственного за развитие токсических побочных эффектов при назначении 5-фторурацила и его аналогов.

Задача решается путем подбора специфичных оригинальных последовательностей олигонуклеотидов, образующих короткий фрагмент ДНК, который включает фрагмент гена DPYD с искомым вариантом, и оптимизации ПЦР с помощью адаптированного оригинального буфера для Taq-полимеразы. Высокая специфичность заявляемого способа диагностики мутации c.1236G>A достигается за счет оригинального дизайна олигонуклеотидов, позволяющих получить более короткий целевой фрагмент гена.

Техническим результатом заявляемого изобретения является широкая доступность, высокая чувствительность и специфичность при низкой стоимости исследования. Реакционные смеси включают специфичные оригинальные последовательности олигонуклеотидов, а также адаптированный буфер для Taq-полимеразы, позволяющий повысить чувствительность метода. Изобретение позволяет снизить затраты на молекулярно-генетическое исследование, повысить его доступность и точность тестирования за счет применения оригинальных олигонуклеотидных последовательностей и оптимизированных реакционных смесей.

Технический результат достигается путем подбора специфичных оригинальных последовательностей олигонуклеотидов, оптимизации условий проведения ПЦР с использованием оригинального состава буфера для Taq-полимеразы, отработки технических условий для проведения HRM-анализа.

Последовательность специфичных оригинальных олигонуклеотидов приведена в Перечне последовательностей олигонуклеотидов.

Копия перечня последовательностей олигонуклеотидов, представленная на машиночитаемом носителе, идентична перечню последовательностей в печатной форме.

Используются последовательности олигонуклеотидов:

SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2.

Подбор последовательностей олигонуклеотидов включает: дизайн олинуклеотидов, строго комплементарных целевой последовательности ДНК. Длина образуемого фрагмента ДНК составляет 91 пара нуклеотидов.

Состав буфера для Taq-полимеразы: Трис-HCl 67 mM, (NH4)2SO4 166 mM, tween-20 0,1%, глицерин 1%, рН 8,7;

- Режим проведения ПЦР:

1 этап: денатурация при t=95°С в течение 5 мин

2 этап: 50 циклов ПЦР

- денатурация при t=95°С в течение 15 сек

- отжиг олигонуклеотидов при t=58°С в течение 15 сек

- элонгация при t=72°С в течение 40 сек

3 этап: элонгация при t=72° в течение 2 мин.

4 этап: плавление продуктов ПЦР при t=72°-95°C

5 этап: охлаждение и хранение при t=95°-12°C

Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется как во время отжига олигонуклеотидов на каждом цикле ПЦР, так и при плавлении продуктов ПЦР с частотой 45 на 1°C.

Изобретение иллюстрируется фигурой, на которой представлено графическое изображение образцов ДНК с различными генотипами по мутации c.1236G/A.

Изобретение иллюстрируется примерами 1 и 2.

Пример 1.

Ф.И.О.: Пациент M.

Возраст: 1964 г.р.

Диагноз: Cr. сигмовидной кишки.

Выполнено молекулярно-генетическое исследование по заявляемому способу - анализ последовательности кодирующей части гена дигидропиримидиндегидрогеназы (DPYD) на предмет наличия герминальной мутации c.1236G>A (p.E412E, rs556038477), ассоциированной с повышенной токсичностью при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода») в процессе ПХТ.

Результат: При исследовании ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, герминальных мутаций в 11 экзоне гена DPYD не выявлено.

Пример 2.

Ф.И.О.: Пациент K.

Возраст: 1957 г.р.

Диагноз: Cr. желудка.

Выполнено молекулярно-генетическое исследование по заявляемому способу - анализ последовательности кодирующей части гена дигидропиримидиндегидрогеназы (DPYD) на предмет наличия герминальной мутации c.1236G>A (p.E412E, rs556038477), ассоциированной с повышенной токсичностью при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода») в процессе ПХТ.

Результат: При исследовании ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, в 11 экзоне гена DPYD выявлена герминальная мутация c.1236G>A (p.E412E, rs556038477) в гетерозиготном состоянии.

Выявленная герминальная мутация c.1236G>A в гене DPYD зарегистрирована в международных базах данных dbSNP и Ensembl.genome как высоко-патогенный клинически значимый вариант, ассоциированный с высоким риском развития токсичности при использовании 5-фторурацила и капецитабина («Кселода»).

Перечень последовательностей олигонуклеотидов

<110> FSBI “N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology” of the Ministry of Health of the Russian Federation.

<120> Способ определения генотипа человека по мутации IVS14+1G>A в 14 интроне гена DPYD.

<160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 2

<210> SEQ ID NO: 1

<211> LENGTH: 22

<212> TYPE: PCR-primer

<213> ORGANISM: Human

<400> SEQUENCE: 1

GGC TGC ATA TTG GTG TCA AAG T 22

<210> SEQ ID NO: 2

<211> LENGTH: 23

<212> TYPE: PCR-primer

<213> ORGANISM: Human

<400> SEQUENCE: 2

AAA CAT TCA CCA ACT TAT GCC AA 23

Способ определения генотипа человека по мутации c.1236G>A в 11 экзоне гена DPYD, включающий проведение ПЦР в режиме реального времени с детекцией результатов с помощью метода анализа кривых плавления (HRM), отличающийся использованием специфичных последовательностей олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1 и SEQ ID: NO 2 и оптимизацией ПЦР с помощью применения адаптированного буфера для Taq-полимеразы состава: Трис-HCl 67 mM, (NH4)2SO4 166 mM, tween-20 0,1%, глицерин 1%, рН 8,7.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Описано иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих консенсусную последовательность полного протективного антигена S вируса БВРС на основании последовательностей генов белка S современных штаммов вируса БВРС 2015-2017 гг.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения иммобилизованной библиотеки фрагментов ДНК нуклеиновой кислоты-мишени со штрихкодами с использованием иммобилизованных на носителе транспозомных комплексов для захвата специфических фрагментов ДНК.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-РНК, включающий выделение тотальной РНК из тканевых проб глиом и перифокальной зоны, обратную транскрипцию, с последующей амплификацией в режиме реального времени RT-PCR, отличающийся тем, что используют высокоспецифичные праймеры для генетических локусов EGFR, MSI1, PSMC4, ТВР, RPLO, и микро-РНК hsa-miR-92-1-5р, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p, анализируют полученные данные и вычисляют коэффициент относительной экспрессии Е с использованием трех высокоспецифичных референсных генов: PSMC4, ТВР, RPLO и двух референсных высокоспецифичных микро-РНК: hsa-miR-126-5р, hsa-miR-7-5p, сравнивают полученные значения Е в опухолевой ткани с контрольными и при значениях EEGFR<0,5 или EEGFR>1,5, EMSI1<0,5 или EMSI1>1,5, Ehsa-miR-92a-1-5p<0,5 или Ehsa-miR-92a-1-5p>1,5 хотя бы по одному локусу у пациента диагностируется глиома высокой степени злокачественности III, IV; отсутствие изменений экспрессии указанных локусов относительно контроля свидетельствует о соответствии опухоли II степени злокачественности.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, заключающийся в применении специфичных олигонуклеотидных последовательностей с регистрацией результатов ЦПР в режиме реального времени с использованием метода анализа кривых плавления (HRM).

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ проведения ПЦР в режиме реального времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям 337C/G гена fshr (rs43745234), состоит в том, что используются:прямой праймер прямой праймер 5'-GAATTGAAAAGGCCAACAACC-3',обратный праймер 5'-CACCAGAATACAGAAGTTCTTACAGA-3',FSHR337C - аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд-5'-FAM-CATCGACCCTGATGCC BHQ1-3',FSHR337G - аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд5'-VIC-CATCGACGCTGATGC-BHQ1-3'.Изобретение позволяет повысить надежность детекции аллелей 337C/G (rs43745234) гена fshr, упростить анализ и сократить время его проведения до 1,5 часов.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую две копии синтетического гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека, штамм Escherichia coli SG20050/p280_2GM - продуцент указанного полипептида и способ получения полипептида со свойствами ГМ-КСФ.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложена частица рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) для применения в лечении мукополисахаридоза I типа (MPS I), имеющая AAV-капсид и имеющая упакованный в него 5’ инвертированный концевой повтор (ITR), ген альфа-L-идуронидазы человека (hIDUA) под контролем регуляторных последовательностей, которые контролируют его экспрессию, и 3’ ITR AAV, где упомянутый ген hIDUA имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, которая кодирует функциональную альфа-L-идуронидазу человека, а также композиция и применение.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложена рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты для получения аланина в рекомбинантном микроорганизме Е.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой генетическую конструкцию, несущую оптимизированный по представленности кодонов, GC-составу, наличию полиА участков и структуре образуемой мРНК ген консенсусного гликопротеина (белка G) вируса бешенства.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ модификации целевого геномного локуса в клетке млекопитающего, включающий в себя: введение в клетку нуклеазного агента, который осуществляет одно- или двухцепочечный разрыв в пределах целевого геномного локуса; введение в клетку первого большого нацеливающего вектора (LTVEC), который имеет длину по меньшей мере 10 т.п.н.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан ДНК аптамер нуклеиновой кислоты, обладающий способностью к специфическому связыванию и ингибированию TLR-4 и содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, или его функционально эквивалентный вариант, имеющий по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Также описан комплекс, обладающий способностью к специфическому связыванию и ингибированию TLR-4, содержащий аптамер и функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из детектируемого реагента, лекарственного средства и наночастицы. Представлен способ детекции TLR-4 в образце in vitro, включающий i) приведение указанного образца в контакт с аптамером по любому из пп. 1–4 или комплексом по любому из пп. 9–14, и ii) выделение указанного аптамера или комплекса, не связанного с TLR-4, iii) детекцию присутствия аптамера или комплекса, связанного с TLR-4, присутствующим в указанном образце. Представлена фармацевтическая композиция для лечения патологии, характеризующейся увеличением экспрессии TLR-4, содержащая терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного аптамера по любому из пп. 1–4 или по меньшей мере одного комплекса по любому из пп. 9–14, необязательно в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или растворителем. Изобретение расширяет арсенал ингибиторов TLR-4. 5 н. и 19 з.п. ф-лы, 10 ил., 6 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, заключающийся в применении специфичных олигонуклеотидных последовательностей с регистрацией результатов ЦПР в режиме реального времени с использованием метода анализа кривых плавления. Реакционные смеси включают специфичные праймеры, а также адаптированный буфер для Taq-полимеразы, позволяющий повысить чувствительность метода. Изобретение позволяет снизить затраты на молекулярно-генетическое исследование, повысить его доступность и точность тестирования за счет применения оригинальных олигонуклеотидных последовательностей и оптимизированных реакционных смесей. 2 пр.

Наверх