Композиция на основе бетулина и слоевищ лишайников, обладающая антибактериальным, противовирусным и детоксикационным действием

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к композиции, обладающей антибактериальным, противовирусным и детоксикационным действием. Твердофазная композиция, обладающая комплексным антибактериальным, противовирусным и детоксикационным действием, представляющая собой ультрадисперсный порошок совместно механохимически активированных слоевищ лишайников рода Cladonia и бетулина в массовом соотношении 4:1, в присутствии 0,7-0,9 мас. % бикарбоната натрия, характеризующаяся тем, что содержит бетулин в концентрации 200±15 мг/г, лишайниковые β-олигосахариды в концентрации 4,2±0,3 мг/г и лишайниковые ароматические кислоты флавоноидного типа антибактериального действия в концентрации 4,6±0,4 мг/г. Вышеописанная композиция обладает повышенной антибактериальной активностью, высокой противовирусной и детоксикационной активностью. 2 табл.

 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к производству лекарственных средств и биологически активных добавок к пище из растительного сырья, комплексного антибактериального, противовирусного и детоксикационного действия.

Целью заявляемого изобретения является создание комплексного твердофазного (ультрадисперсного порошкового) биопрепарата из природного растительного сырья с повышенной антибактериальной и противовирусной активностью.

Композиция представляет из себя механохимически активированный, ультрадисперсный порошок, состоящий из слоевищ лишайников рода Cladonia и чистого бетулина, выделяемого из пробковой ткани на стволах березы

Известна биологически активная добавка к пище - «Бетулин» [1], основным активным веществом которой является пентациклический тритерпеноид ряда лупана - бетулин - основной компонент внешней коры различных видов берез (содержание от 25 до 40 масс. %).

Бетулин обладает выраженным антибактериальным и антиперсистентным (в том числе в отношении стафилококков, стрептококков, микобактерий туберкулеза, K. pneumoniae), а также антивирусным (включая, все формы вируса герпеса простого и паппиломы человека, полиомиелита, лихорадочных и респираторных заболеваний, гриппа типа «А» и птичьего, ВИЧ, гепатита «В» и «С», инфекционного ринотрахеитаи, болезни слизистых - вирус диареи др.) действием [2-7]. Для него также характерны следующие направления действия: антисептическое и ранозаживляющее; противогрибковое; гепатопротекторное, желчегонное, гипохолестеринемическое, противодиабетическое и антиоксидантное; иммуномодуляторное, противоопухлевое и др.

Механизм противовирусных (в отношении РНК-вирусов) и иммуномодуляторных свойств бетулина связан с его вирулицидным и интерфероногенным действием. Бетулин блокирует фрагмент в молекуле вирусного белка, с которым в норме связывается протеиназа. В результате чего вирус лишается возможности инфицировать другие клетки. Бетулин влияет на позднюю стадию репликации вируса, по-видимому, на процесс формирования капсида - конусообразной сердцевины, которая вместе с внутренним нуклеокапсидом обеспечивает правильную упаковку вирусного генома - двух молекул одноцепочечной РНК. В результате сердцевина и внутренний нуклеокапсид принимают неправильную форму, и созревание вирусной частицы не происходит. Любой сбой в процессе расщепления вирусного белка приводит к утрате вирусом инфекционности (вирулентности). Таким образом, бетулин препятствует полноценной репродукции вируса в организме [7, 8]. Преимуществом бетулина является также то, что количество эффективных патогенетичных противовирусных препаратов ограничено, а многие иммуномодуляторы не могут широко применяться в клинической практике из-за токсичности и нежелательных эффектов. Например, препараты интерферона отличает кратковременность действия, необходимость применять в начальной стадии болезни, высокая стоимость. Длительное применение интерферона вызывает тревогу и раздражительность, острые психозы и попытки суицида. Бетулин же не токсичен и не имеет побочных действий. Его минимально летальная доза (ЛД₁₆) составляет 6,5 г/кг, среднелетальная (ЛД₅₀) - 9 г/кг, поэтому согласно Международной токсикологической классификации его можно отнести к IV классу малотоксичных веществ [4]. Бетулин может снижать гиперактивность системы интерферона или повышать ее функциональную активность при гипереактивности, а также способствовать сохранению способности лейкоцитов продуцировать интерферон. Бетулин также значительно активирует фагоцитоз (неспецифические факторы иммунитета), активирует макрофаги (клетки-киллеры), которые начинают активнее поглощать бактерии, вышедшие из-под контроля организма раковые клетки и клетки, пораженные вирусами. [2, 3, 5, 8].

Вместе с тем, следует отметить, что в связи с низкой растворимостью бетулина в водных средах, его биоусвояемость остается относительно низкой. Повысить биоусвояемость бетулина, в рамках предлагаемой композиции, позволяет комплексообразование с лишайниковыми Р-олгисахаридами.

Известно, что слоевища лишайников рода Cladonia, произрастающих в высоких широтах, содержат большее количество и более широкий спектр структур вторичных лишайниковых веществ из числа лишайниковых ароматических кислот флавоноидного типа: дибензофуранов (изомеры усниновой кислоты), депсидонов (изомеры физодовой кислоты), депсидов (изомеры сферородина, леканоровой, анациевой, рамалиноловой кислот) выраженного антибактериального действия, прежде всего усниновой кислоты [9, 10].

Усниновая кислота обладает также следующими направлениями действия:

- противовоспалительным [11];

- обезболивающим и жаропонижающим [12];

- противоонкологическим [13];

- гастропротекторным и антиоксидантным [14]. Последнее, способствует повышению устойчивости и защите от ультрафиолетового излучения, что важно не только с медицинской, но и с косметологических позиций [15];

- противовирусным, антипротозойным, антипролиферативным, противовоспалительным и обезболивающим [16];

- способствует заживлению ран [17];

- может использоваться для профилактики и лечения десен и патологий парадонта [18];

- используется при лечении туберкулеза [19].

Известен препарат антибактериального действия «Бинан» [16], полученный из лишайников рода цетрария Cetraria [20], включенный в Фармакопею СССР. Активное вещество - натриевая соль усниновой кислоты - отличается высокими антибактериальными свойствами, очень термоустойчива, хорошо сохраняется на протяжении нескольких лет, эффективна против большого разнообразия грамположительных (G+) и некоторых грамотрицательных, кислотоустойчивых бактерий и отдельных грибов, включая мультирезистентные (устойчивые) к антибиотикам штаммы золотистого стафилококка, энтерококка и микобактерий. Причем, усниновая кислота оказывает избирательное действие против стрептококка мутирующего, не вызывая побочных эффектов, отрицательно воздействующих на оральную сапрофитную микрофлору [21-25].

Известен биопрепарат «Ягель-Детокс» [26], содержащий, при его получении по модифицированной биотехнологии [27], до 5,7±0,4 мг/г лишайниковых кислот антибактериального действия, проявляющий выраженные антибактериальные свойства даже в отношении микобактерий туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью [28].

Биопрепарат «Ягель-Детокс» содержит также до 5,2±0,4 мг/г лишайниковых β-олигосахаридов [27], образующихся из лишайниковых β-полисахаридов при механохимической активации слоевищ лишайников. Они способны повышать биоусвояемость и биоактивность «фармаконов» - веществ, образующих с лишайниковыми β-олигосахаридами («активным носителем») супрамолекулярные комплексы при их совместной механохимической активации со слоевищами лишайников. Лишайниковые β-олигосахариды участвуют также в детоксикации внутренних сред организма (кровь, лимфа, межклеточные жидкости) в отношении экзо- и эндотоксинов различной природы, выводя их из организма [29-33].

Следует отметить, что при любом патологическом процессе, в том числе при бактериальных и вирусных инфекциях, в организме идет накопление

Полученная композиция обладает следующими основными повышенными, по сравнению с прототипом, свойствами:

(1) Антибактериальное действие.

Антибактериальные свойства заявляемой композиции определяли in vitro на культурах десяти бактериальных штаммов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (по стандартным и модифицированным методикам [35]) по стандартам мутности культур на 5 и 10 единиц, по сравнению с прототипом: Staphylococcus aureus - 6538-р; Enterofiacter cloacae; Pseudomonas aeruginosa - 33105; Klebsiella pneumoniae; Salmonella enteritidis; гемолитическая E.coli; E.coli M-17; лактозо-негативная E.coli; Escherichia coli - H-257; Proteus vulgaris. Использовались стандартные питательные среды: среда Эндо, молочно-желточно-солевой агар, среда Плоскирева, мясо-пептонный агар (МПА), которые были приготовлены по стандартной прописи [35], с добавлением в питательную среду контрольного (прототип; в количестве 1,5 мг/мл) и исследуемого (заявляемая композиция; в количестве 0,5 мг/мл) образца. Газонным методом был произведен посев культур микроорганизмов и после культивации в термостате при 37,0°С оценивалась интенсивность их роста. Результаты приведены в таблице 2.

эндогенных токсинов, включая медиаторы воспаления (эндотоксины малой и средней молекулярной массы) и др. А при их лечении - продукты превращения синтетических и полусинтетических антибиотиков, обладающие цитостатическим эффектом по отношению к быстро делящимся клеткам, в том числе лейкоцитам и клеткам кроветворных органов. Поэтому обязательной компонентой комплекса лечебного мероприятий должна быть детоксикация не только желудочно-кишечного тракта, но и внутренних сред организма: крови, лимфы, межклеточных жидкостей. Таким образом, в композиции БАД «Ягель-Детокс» присутствуют компоненты, обеспечивающие выраженное антибактериальное действие (усниновая и другие лишайниковые кислоты), а также усиливающие эту активность и, одновременно, осуществляющие детоксикацию внутренних сред организма (лишайниковые β-олигосахариды).

Наиболее близкой к заявляемому изобретению, в отношении комплексного антибактериального и детоксикационного действия, является композиция, получаемая из слоевищ лишайников рода Cladonia с помощью технологии их механохимической активации в воздушной среде на мельнице-активаторе планетарного типа [27] - прототип.

Композиция, получаемая в соответствии с прототипом, характеризуется содержанием лишайниковых ароматических кислот флавоноидного типа антибактериального действия в количестве 5,7±0,4 мг/г и β-олигосахаридов в количестве 5,2±0,4 мг/г.

Вместе с тем, к недостаткам прототипа, по сравнению с заявляемой композицией, следует отнести отсутствие противовирусной активности и недостаточно высокую антибактериальную активность.

Технический эффект (сущность) заявляемого изобретения заключается в увеличении антибактериальной и детоксикационной (in vivo) активности, а также в расширении спектра биологической активности созданной композиции природных биоактивных веществ из слоевищ лишайников и бетулина. А именно в появлении дополнительно противовирусной активности, за счет введения в композицию бетулина в количестве 200±15 мг/г, биоусвояемость которого повышается, благодаря образованию супрамолекулярных комплексов с лишайниковыми β-олигосахаридами. Введение бетулина в композицию повышает также ее детоксикационную активность in vivo, благодаря его гепатопротекторной и иммуномодуляторной активности.

Технический эффект (сущность) заявляемого изобретения достигается за счет того, что при совместной механохимической активации слоевищ лишайника рода Cladonia и бетулина в массовом соотношении 4:1, в присутствии 0,7-0,9 мас. % бикарбоната натрия, в одну технологическую стадию, происходит, во-первых, образование лишайниковых β-олигосахаридов и глубокое диспергирование грубоизмельченного порошка бетулина до образования ультраразмерных частиц. Во-вторых, образуются супрамолекулярные комплексы лишайниковых β-олигосахаридов («активный носитель») с ультразмерными частицами бетулина и с лишайниковыми кислотами антибактериального действия («фармаконы»). Благодаря этому повышается биоусвояемость обоих фармаконов. Соответственно увеличивается антибактериальное действие композиции и de novo появляется ее противовирусное действие. При введении композиции в животный организм увеличивается ее детоксикационная активности за счет аддитивности детоксикационного действия лишайниковых β-олигосахаридов и гепатопротекторной, иммуномодуляторной активности бетулина.

Изобретение может быть реализовано следующим образом.

(1) Слоевища лишайника рода Cladonia подвергаются предварительному грубому помолу на мельнице до размеров частиц 0,6÷0,8 мм. (2) В камеру шаровой мельницы (например, АГО-2, АГО-3 или ЦЭМ-7-80) помещается порошок, полученный по п. 1, и порошок бетулина, ранее выделенный из ткани коры (Betula) по известной методике [34], в массовом соотношении 4:1, а также 0,7-0,9 мас. % бикарбоната натрия. Смесь подвергается механохимической активации в течение 3 минут при 1500 об/мин. Образуется легко биоусвояемый ультрадисперсный порошок с размером частиц 20-60 нм, в составе которого содержатся супрамолекулярные комплексы лишайниковых β-олигосахаридов с бетулином и с лишайниковыми кислотами антибактериального действия, деиммобилизованными из матрицы лишайниковых β-полисахаридов при их частичном разрушении в процессе механохимической активации слоевищ лишайников. Состав получаемой композиции отражен в таблице 1.

Анализ полученных результатов показывает, что благодаря введению в композицию бетулина и повышению его биоусвояемости за счет образования супрамолекулярных комплексов с лишайниковыми β-олигосахаридами антибактериальная активность заявляемой композиции в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов повышается в 9-11 раз, по сравнению с прототипом.

(2) Противовирусное действие.

Противовирусную активность заявляемой композиции in vitro определяли в экспериментах на культурах клеток с вирусами герпеса простого I типа, штамм 1С (HSV-1) и гриппа A.FPV.Rostock.34 (H7N1; FPV). Исследование противовирусной активности проводили методом оценки цитопатического эффекта на перевиваемой культуре клеток рабдомиосаркомы человека (RD) с HSV-1 и методом редукции бляшек на культуре клеток первичных фибробластов эмбрионов кур с FPV [36]. Концентрации заявляемой композиции, подавляющие размножение вирусов на 50% (ЕС₅₀), определяли на основе пробит-анализа и взвешенной линейной регрессии [37].

Установлено отсутствие противовирусной активности прототипа, в то время как ЕС₅₀ заявляемой композиции по отношению к вирусу герпеса HSV-1 составила 4,5 мкМ, к вирусу гриппа FPV - 21 мкМ. Следует отметить, что регистрируемая противовирусная активность заявляемой композиции по отношению к вирусу HSV-1 даже несколько превышает соответствующую активность бетулиновой кислоты (5,1 мкМ), а по отношению к вирусу FPV превышает таковую более чем в 10 раз (>219 мкМ) [38]. По-видимому, это связано с образованием супрамолекулярных комплексов бетулина с лишайниковыми β-олигосахаридами, что повышает эффективность действия бетулина на вирусы [7, 8]. Следует также отметить, что эти результаты получены in vitro, то есть без учета интерфероногенных и иммуномодуляторных свойств бетулина.

(3) Детоксикационное действие.

В связи с тем, что детоксикационная активность бетулина связана с его гепатопротекторным действием [4], определение детоксикационной активности заявляемой композиции могло быть исследовано только in vivo. Поэтому детоксикационную активность заявляемой композиции, по сравнению с прототипом, изучали по изменению в крови концентрации молочной кислоты («токсина усталости») и мочевины крови в результате ежедневного введения в корм белым лабораторным мышам линии CD-1 заявленной композиции в дозе 50 мг/кг либо адекватной дозы прототипа, по сравнению с контролем (отсутствие добавок), на фоне ежедневной повышенной нагрузки в виде 4-минутного плавания, в течение 10 дней. Показано, что при потреблении животными заявляемой композиции на фоне вышеуказанной физической нагрузки снижение уровня молочной кислоты достигало 75-85% (прототипа - 56-72%) по сравнению с контролем (отсутствие добавок); мочевины - 61 и 49%, соответственно.

Таким образом, заявляемая композиция, получаемая в одну технологическую стадию путем совместной механохимической активации слоевищ лишайника рода Cladonia и бетулина в массовом соотношении 4:1, в присутствии 0,7-0,9 мас. % бикарбоната натрия, и содержащая бетулин в концентрации 200±15 мг/г, лишайниковые β-олигосахариды - 4,2±0,3 мг/г и лишайниковые ароматические кислоты флавоноидного типа антибактериального действия в концентрации 4,6±0,4 мг/г, обеспечивает повышение антибактериальной активности в 9-11 раз, появление de novo противовирусной активности, повышение детоксикационной активности в 1,2-1,3 раза, по сравнению с прототипом.

Литература

1. БАД «Бетулин». Свидетельство о государственной регистрации RU 77.99.88.003.Е006199.05.15 от 06.05.2015).

2. Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность // Химия в интересах устойчивого развития. - Т. 13. - 2005. - С. 1-30.

3. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. Терпеноиды лупана - биологическая активность и фармакологические перспективы. 1. Природные производные лупана. 1 часть // Биоорг. химия. - 2006. - Т. 32. - С. 42-55.

4. Кузнецова С.А., Скворцова Т.П., Маляр Ю.Н., Скурыдина Е.С., Веселова О.Ф. Выделение бетулина из бересты березы и изучение его физико-химических и фармакологических свойств // Химия растительного сырья. - №2. - 2013. - С. 93-100.

5. Переславцева А.В., Галайко Н.В. Бетулин как перспективный источник для получения противовирусных препаратов // Вестник Пермского научного центра. - №3. - 2013. - С. 34-41.

6. Уткина Т.М., Казакова О.Б., Иедведева Н.И., Картошова О.О. Структурно-функциональная характеристика производных бетулина // Антибиотики и химиотерапия. - Т. 56, №11-12. - 2011. - С. 3-6.

7. Флехтер О.Б., Бореко Е.И., Нигматуллина Л.Р., Третьякова Е.В., Павлова Н.И., Балтина Л.А., Николаева С.Н., Савинова О.В., Еремин В.Ф., Галин Ф.З., Толстиков Г.А. Синтез и противовирусная активность амидов и конъюгатов бетулоновой кислоты с аминокислотами // Биоорганическая химия. - Т. 30, №1. - 2004. - С. 89-98.

8. http://betulin.com/upload/iblock/45a/45a49f21e455a6262e6c79ae944a13ac.pdf.

9. Прокопьев И.А., Порядина Л.Н., Филиппова Г.В., Шеин А.А. Содержание вторичных метаболитов в лишайниках сосновых лесов Центральной Якутии // Химия растительного сырья. - №3. - 2016. - С. 73-78.

Ю.Ахременко Я.А., Прокопьев И.А., Поляниченко А.А., Федоров А.А. Антибактериальная активность вторичных метаболитов лишайников в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов // Тезисы доклада на XI молодежной школе-конференции с международным участием. Москва, 01-02 ноября 2016 г. М.: Изд-во ООО «МАКС Пресс». - С. 110-112.

11. K. (2002) Usnic acid. - Phytochemistry 61 (7), p. 729-736.

12. Okuyama E, Umeyama K, Yamazaki M, Kinoshita Y, Yamamoto Y (1995). Usnic acid and diffractic acid as analgesic and antipyretic components of Usnea diffracta. - Planta Medica. 61: p. 113-115.

13. Groeneweg J, S, Cellular mechanisms of the anticancer effects of the lichen compound usnic acid. - Planta Medica, 2010 Jul; 76(10): p. 969-974.

14. Odabasoglu F, Cakir A, Suleyman H, Asian A, Bayir Y, Halici M, Kazaz C. Gastroprotective and antioxidant effects of usnic acid on indomethacin-induced gastric ulcer in rats. - J. Ethnopharmacol., 2006 Jan 3; 103(1): p. 59-65.

15. Kohlhardt-Floehr,C.Boehm F, Troppens S, Lademann J, Truscott TG. (2010) Pro-oxiant and antioxidant behaviour of usnic acid from lichens under UVB irradiation studies on human cells. - J. Photochem Photobiol. B. 101(1): p. 97-102.

16. Машковский M.Д. Лекарственные средства: в 2 т. Т. 2. - 14-е изд., перераб, испр. и доп. М. Изд-во «Новая Волна», 2000. 608 с.

17. Nunes, P. et al. Collagen-based films containing liposome-loaded usnic acid as dressing for dermal burn healing / Journal of Biomedicine and Biotechnology, Volume 2011, Article ID 761593, 9 pages.

18. Chifiriuc MC, Oprea E, Bucur M, Enache G, Saviuc C, In vitro study of the inhibitory activity of usnic acid on dental plaque biofilm / Roum Arch Microbiol Immunol. 2009 Oct-Dec; 68(4): p. 215-222.

19. Еникеев А.Х., Еникеева Р.А. Экстракт cetraria islandica ach. сухой, таблетированная форма // патент РФ Патент РФ 2321419 от 10.04.2008, приоритет от 02.06.2006.

20. Рассадина, 1957; Атлас лекарственных растений, 1962; фармакопейная статья ФС 42-766-73.

21. Брызгалова В.А. Материалы по изучению антибактериальных свойств препарата Бинан / в Кн. «Новый антибиотик бинан или натриевая соль усниновой кислоты» // под ред. Лазарев Н.В., Савич В.П. М.-Л. Изд-во АН СССР. 1957. стр. 85-89.

22. Гофрен А.Г. Отчет о местном применении Бинана в хирургической амбулаторной практике. / в Кн. «Новый антибиотик бинан или натриевая соль усниновой кислоты» // под ред. Лазарев Н.В., Савич В.П. М.-Л. Изд-во АН СССР. 1957. - стр. 123-128.

23. Капацинский Е.В. К вопросу о применении препарата Бинан в хирургической практике. / в Кн. «Новый антибиотик бинан или натриевая соль усниновой кислоты» // под ред. Лазарев Н.В., Савич В.П. М.-Л. Изд-во АН СССР. 1957. - стр. 134-139.

24. Заугольников С.Д. Экспериментальное изучение противотрихомонадной активности Бинана. / в Кн. «Новый антибиотик бинан или натриевая соль усниновой кислоты» // под ред. Лазарев Н.В., Савич В.П. М.-Л. Изд-во АН СССР. 1957. - стр. 177-180.

25. Бутомо В.Г. Наблюдения над терапевтическим применением Бинана при лечении трихомонадного кольпита и эрозий шейки матки. / в Кн. «Новый антибиотик бинан или натриевая соль усниновой кислоты» // под ред. Лазарев Н.В., Савич В.П. М.-Л. Изд-во АН СССР. 1957. - стр. 181-190.

26. БАД «Ягель-Детокс». Свидетельство о государственной регистрации RU 77.99.11.003.Е.003704.05.13 от 20.05.2013.

27. Кершенгольц Б.М., Киселев А.А., Кунгурцев С.В. Твердофазная композиция, обладающая антибактериальным и детоксикационным действием // Патент №2657782, приоритет от 09.08.2017. Опубл. 15.06.2018.

28.Винокурова М.К., Евдокимова Н.Е., Павлов Н.Г., Кершенгольц Б.М., Аньшакова В.В. Способ применения «Ягель-Детокс» в качестве средства для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью // Патент РФ №2673555 от 28.11.2018, приоритет от 22 мая 2017 г.

29. Аньшакова В.В., Степанова А.В., Уваров Д.М., Смагулова А.Ш., Наумова К.Н., Васильев П.П., Кершенгольц Б.М. Актопротекторная активность комплексного биопрепарата на основе таллома лишайников и родиолы розовой // Экология человека. 2015. №5. С. 46-51.

30. K.N. Naumova, V.V. Anshakova, B.M. Kershengolts Nonspecific adaptive reactions of athletes: evaluation and correction // Journal of Biopharmaceuticals. - 2015. - №4. P. 238-239.

31. Аньшакова В.В. Повышение активности действующего вещества лишайниковыми β-олигосахаридами // Биофармацевтический журнал. - 2012. - Т. 4. №4. - С. 42-46.

32. Кершенгольц Б.М., Киселев А.А., Кунгурцев С.В., Шаройко В.В. Твердофазная композиция природных биоактивных ингредиентов для коррекции метаболических нарушений при сахарном диабете второго типа // Патент РФ №2661622, приоритет от 28.08.2017. Опубл. 17.07.2018.

33. Кершенгольц Б.М., Киселев А.А., Кунгурцев С.В., Наумова К.Н. Твердофазная композиция, обладающая актопротекторным, адаптогенным и детоксикационным действием // Патент №2661623, приоритет от 28.08.2017. Опубл. 17.07.2018.

34. Сироткин Г.В., Стернин Ю.И. Способ получения бетулина // Патент РФ 2172178, приоритет от 29.11.2000. Опубл. 20.08.2001.

35. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам // Методические указания, утвержденные главным государственным санитарным врачом РФ 04.03.2004.

36. Бореко Е.И., Павлова Н.И., Зайцева Г.В., Михайлопуло И.А. Противовирусная активность 2-дезокси-2-фторогуанозина в отношении вирусов гриппа и простого герпеса в культурных клетках // Вопросы вирусологии. - 2001. - №5. - С. 40-42.

37. K.P. Fung K.Р. A computer program in BASIC for estimation of ED₅₀ and LD₅₀ // Computers in Biology and Medicine. - 1989. - V. 19, №2. - P. 131-135.

38. N.I. Pavlova, O.V. Savinova, S.N. Nikolaeva, E.I. Boreko, O.B. Flekhter. Antivirial activity of betulin, betulinic and betulonic acids against some enveloped and non-enveloped // Fititerapia. - 2003. - V. 74. - P. 489-492.

Твердофазная композиция, обладающая комплексным антибактериальным, противовирусным и детоксикационным действием, представляющая собой ультрадисперсный порошок совместно механохимически активированных слоевищ лишайников рода Cladonia и бетулина в массовом соотношении 4:1, в присутствии 0,7-0,9 мас. % бикарбоната натрия, характеризующаяся тем, что содержит бетулин в концентрации 200±15 мг/г, лишайниковые β-олигосахариды в концентрации 4,2±0,3 мг/г и лишайниковые ароматические кислоты флавоноидного типа антибактериального действия в концентрации 4,6±0,4 мг/г.