Штамм trichoderma atrobrunneum, обладающий антибактериальной активностью в отношении bacillus anthracis

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм микромицета Trichoderma atrobrunneum, обладающий антибактериальной активностью в отношении Bacillus anthracis, депонирован в ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ F-1434. Штамм микромицета Trichoderma atrobrunneum ВКПМ F-1434 может быть использован в борьбе с возбудителем сибирской язвы в природных очагах ее распространения. Изобретение позволяет повысить выход антибактериальных соединений в отношении возбудителя сибирской язвы. 2 табл., 2 пр.

 

Предлагаемое изобретении относится к области микробиологии и биотехнологии, микроскопическим грибам - продуцентам антимикробных соединений.

Борьба с возбудителем сибирской язвы в природных очагах ее распространения является важнейшей задачей по профилактике заражения бактериальной инфекцией человека и животных.

Основными средствами деконтаминации зараженной возбудителем почвы являются химические дезинфицирующие средства, которые имеют ряд недостатков санитарно-гигиенического и экологического характера (Федорова Л.С. Дезинфицирующие свойства хлорактивиых соединений и средств на их основе (обзор литературы) / Л.С. Федорова, И.М. Цвирова, А.С. Белова, Н.С. Левчук // Ж. Дезинфекционное Дело. - 2011. - №4. - С. 11-19) [1].

Известно, что в отношении бактерии В. anthracis наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладают культуры S. roseus, В. subtilis, Е. coli (Семенова С.А., Галиуллин А.К. Микробные антагонисты для биологической санации скотомогильников // Ученые записки КГАВМ. - Казань. - 2010. - Т. 204. - С. 246-251) [2]. Недостатком применения данных микроорганизмов в качестве деконтаминационного средства является то, что эти условно-патогенные бактерии сами могут являться источниками оппортунистического загрязнения почвы.

Известны штаммы микроскопических грибов Trichoderma spp., обладающие антибактериальной активностью в отношении вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 (Шариков A.M. Выраженная антибиотическая активность грибов рода Trichoderma в отношении штамма В. anthracis СТИ-1 // Научная перспектива. - 2010. - №10. - С. 92-93) [3].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм Т. hamatum F-11 (Патент РФ №2558293) [4], полученный в результате культивирования на жидкой питательной среде, фугат культуральной жидкости которого оказывает антимикробное воздействие на В. anthracis СТИ-1 (вакцинный штамм для иммунизации людей). Однако отсутствуют сведения о том, что этот штамм обладает антибактериальной активностью в отношении промышленного вакцинного штамма для иммунизации сельскохозяйственных животных В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ.

Микромицеты Т. atrobrunneum (телеморфа Т. harzianum Rifai) (J. Bissett. Accepted Trichoderma names in the year 2015 // Bissett J., Gams W., Jaklitsch W., Samuels G.J. IMA FUNGUS - 6 (2): 263-295 (2015)) [5] как антагонисты возбудителя сибирской язвы в литературных источниках в мире не известны.

Задачей изобретения является получение нового продуцента из рода Trichoderma spp.с выраженной антибактериальной активностью в отношении В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ.

Техническим результатом изобретения является новый штамм микромицета Trichoderma spp.с выраженной антибактериальной активностью в отношении В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ и культивированный в оптимизированной питательной среде, позволяющей обеспечить максимальный выход антимикробных соединений.

Поставленная задача и указанный технический результат достигается за счет того, что предложен штамм, Trichoderma atrobrunneum, обладающий антибактериальной активностью в отношении Bacillus anthracis и депонированный в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под номером ВКПМ F-1434.

Штамм гриба Т. harzianum 14/1 получен как моноспоровый клон путем селекции на антимикробную активность из штамма Т. harzianum 14, выделенного из почвы Московской области (Россия).

Штамм Т. harzianum 14/1 идентифицирован как Т. atrobrunneum F.B. Rocha, P. Chaverri & W. Jaklitsch (2015) на основе секвенирования ITS1 и ITS2 участков генома и культурально-морфологическим признакам и депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под номером ВКПМ F-1434.

Штамм Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 относится к митоспоровым грибам - телеморфам Т. harzianum Rifai. аскомицетного аффинитета: рода Hypocrea, семейства Hypocreaceae, порядка Hypocreales, класса Sordariomycetes, отдела Ascomycota (www.indexfungorum.org).

Культурально-морфологические свойства

- культуральные свойства:

а) на диагностической среде Чапека при +25°С рост быстрый, край колонии неровный, мицелий паутинистый;

б) размер колонии 70-80 мм на 7-10 сутки;

в) воздушный мицелий скудный, паутинистый, до 2 мм в высоту, рыхлый, белого цвета на 7-10 сутки культивирования. Спороношение зеленое обильное, формирующееся концентрическими зонами на воздушном мицелии и в плотных подушечках;

г) цвет обратной стороны колонии - бесцветный;

д) пигмент и экссудат отсутствуют;

е) по мере старения гриб зарастает поверхность чашки Петри и обильно спороносит;

ж) на сусло-агаре колонии растут медленнее, но образуют обильный густой воздушный мицелий и обильно спороносят. На синтетическом обедненном агаре (SNA) колония растет быстрее (80 мм за 7 дней), воздушный мицелий практически отсутствует, спороношение формируется в неправильных подушечках.

- морфология:

а) мицелий септированный, тонкий, неокрашенный;

б) конидиеносцы древовидно разветвленные, формируются в плотных группах и на воздушном мицелии. Фиалиды собраны в группы по 2-5, с расширенной базальной часть и короткой узкой шейкой 5-6*3-5 мкм, терминальные фиалиды более вытянутые (до 10-12 мкм в длину);

в) конидии формируются в слизистых головках, почти шаровидные, яйцевидные 2,5-3,5*2,5-3,0 мкм, гладкие, зеленые;

г) - хламидоспоры не наблюдались. Молекулярно-генетические признаки.

Штамм имеет следующую последовательность, зарегистрированную в GenBank под шифром KJ665383.1:

Степень сходства нового штамма Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 с коллекционными штаммами составляет 98%, что указывает наряду с культурально-морфологическими свойствами его принадлежность к Т. atrobrunneum F.B. Rocha, P. Chaverri & W. Jaklitsch (2015)/

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб, оптимальные температуры роста +24-28°С, рН 7,3. Штамм хорошо усваивает сахарозу, лактозу, глюкозу, фруктозу; минеральные и органические источники азота. Хорошо растет на средах, содержащих сахарозу. Длительность культивирования до массовой споруляции - 7 суток.

Антагонистические свойства.

Штамм гриба Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 обладает антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий: В. coagulans 33,4 мм, В. subtilis 23,5 мм, Е. coli АТСС 25922 22 мм, S. aureus АТСС 25923 12,2 мм по МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратом. Методические указания».

Штамм хранят на агаре Чапека в пробирках при температуре 5-6°С с периодическим пересевом (1 раз в 6-12 недель). Для длительного хранения используют методы лиофилизации и криоконсервирования.

Штамм является не патогенным и нетоксичным микроорганизмом.

Пример 1. Культивирование штамма на жидкой питательной среде.

Новый штамм Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 выращивали 5 суток при температуре +24-28°С в жидкой питательной среде следующего состава: сахароза 15 г/л, NaNO3 2 г/л, K2HPO4 1 г/л, MgSO4×7H2O 0,5 г/л, KCI 0,5 г/л, FeSO4 0,01 г/л, рН7,3±0,2.

Из недельной агаровой культуры Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 готовили на физиологическом растворе суспензию с мутностью 1,5 по стандарту Мак-Фарленда. Засевали стандарт 1:10 в 100 мл жидкой среды Чапека в колбах Эрленмейера на 250 мл с ватно-марлевыми пробками, инкурибовали 5 суток на качалке при темперауре 28°С.

Засев культурой Т. atrobrunneum F-1434 производили из расчета 0,5% инокулята (v/v) к объему среды в реакторе. Выращивали культуру 5 суток при температуре 28,0±0,5°С, перемешивая с частотой 120 оборотов в минуту. В процессе работы ферментера осуществляли постоянный контроль и корректировку рН, температуры и скорости перемешивания, поддерживая значение на установленном уровне.

В качестве показателя продуктивности штамма гриба использовали значение сухого веса грибной биомассы. В результате культивирования штамма гриба получают культуральную жидкость со следующими значениями сухого веса грибной биомассы (г/л), в сравнении с получением культуральной жидкости продуцентом при культивировании на питательной среде, указанной в прототипе: соевая мука 30, дрожжевой экстракт 8, калий фосфорнокислый однозамещенный 3,0 (г/л), рН 6,3 (табл. 1).

По показателю продуктивности (сухой вес биомассы гриба) предлагаемая питательная среда значительно превосходит среду прототипа на всех фазах роста продуцента Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434.

Полученную в результате культивирования штамма-продуцента культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин. В результате центрифугирования получают фугат культуральной жидкости (ФКЖ), который используется для определения антибактериальной активности в отношении В. anthracis, 55 - ВНИИВВиМ.

Пример 2. Определение антибактериальной активности.

Вакцинный штамм В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ культивировали 1-2 суток при температуре +24°С. Суспензией суточной культуры с концентрацией 106 КОЕ/мл инокулировали агар Мюллера-Хинтон по 0,2 мл, растирали шпателем и оставляли на 30 мин до полного впитывания в агар. Чашки с газоном инкубируют 1-2 суток при температуре 24±0,5°С.

Для определения антибактериальной активности испытывали две дозы ФКЖ (10 и 100 мкл), которые вносят в 4-х повторностях в лунки диаметром 5 мм на газон тест-культуры вакцинного штамма В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ. При этом применяли следующую шкалу активности: высокая активность - диаметр зоны подавления 21-30 мм и более; умеренная активность - диаметр зоны 10-20 мм: низкая активность - диаметр зоны 6-9 мм.

Для получения более информативных и достоверных данных в отношении активности штамма Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 использовали для сравнения действие ФКЖ штамма прототипа Т. hamatum F-11 против В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ (табл. 2).

* - ошибка измерения зоны подавления роста - 1-2 мм

Установлено, при дозах 10 мкл высокая активность ФКЖ отмечена для Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 и составляет 23-25 мм. Т. hamatum F-11 при дозе 10 мкл проявляет умеренную активность (17-19 мм).

При дозах 100 мкл высокая активность ФКЖ также отмечена для Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 и составляет 43-45 мм. Т. hamatum F-11 при дозе 10 мкл проявляет умеренную активность (31-34 мм).

Следовательно, ФКЖ штамма гриба Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 обладает высокой антибактериальной активностью при различных дозах его использования против В. anthracis 55 - ВНИИВВиМ и может быть рекомендован в качестве продуцента биологического препарата.

Штамм Trichoderma atrobrunneum, обладающий антибактериальной активностью в отношении Bacillus anthracis и депонированный в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под номером ВКПМ F-1434.



 

Похожие патенты:

Изобретение может быть использовано в биотехнологии для производства противобактериального антибиотика ИНА 5812. Антибиотик ИНА 5812 по химическому строению является оригинальным линейно-циклическим гликопептидным соединением, активным в отношении грамположительных патогенов in vitro и высокоэффективным в опытах in vivo при экспериментальном лечении стафилококкового сепсиса у белых мышей.

Изобретение относится к санитарной микробиологии. Питательная среда для выделения бактерий Pseudomonas aeruginosa из водных объектов содержит мясо-пептонный агар, глюкозу, глицерин и сульфат меди (CuSO4×5H2O) при заданном содержании компонентов.

Изобретение относится к фотобиотехнологии. Предложен штамм микроводоросли Bracteacoccus aggregatus (syn.

Изобретение относится к ассоциации микроорганизмов для снижения эмиссии аммиака и/или метана в почве или удобрении и ее применению. Предложенная ассоциация микроорганизмов депонирована в CBS под депозитарным номером NR CBS 134115.

Изобретения относятся к биотехнологии. Предложены реакционная смесь для получения по меньшей мере одного высшего спирта в водной среде, способ получения по меньшей мере одного высшего спирта в водной среде, применение указанной реакционной среды для получения по меньшей мере одного высшего спирта.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам физической стерилизации в лабораториях и ветеринарных клиниках. Предложен способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора.

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии. Питательная среда для выделения бактерий Pseudomonas aeruginosa содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, калий сернокислый, магний сернокислый 7-водный, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, фенозан-кислоту, бутилгидрокситолуол, N-цетилпиридиний хлористый 1 водный (ЦГГХ), натрий углекислый, агар бактериологический и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов.

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, экологии, охране окружающей среды. Предложен микробный препарат для утилизации углеводородных загрязнений в водной среде при температуре от +20 до -2,5°С и солености 30±10 г/л.

Изобретение относится к птицеводству и может быть использовано при выращивании цыплят-бройлеров. Способ сохранения продуктивных качеств и жизнеспособности цыплят-бройлеров предусматривает введение в состав рациона птицы комплекса СибМОС ПРО в дозе 1,5 кг/т корма и введение фитобиотика Концентрат витаминный хвойный в воду в дозе 1 мл/л воды.
Изобретение относится к микробиологии. Питательная среда для культивирования Yersinia pestis EV, содержащая пермеат из ретентанта ферментативного гидролизата кукурузной патоки жидкой, разбавленный дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12%, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, натрий сернистокислый, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов.

Изобретение относится к области аналитической химии и заключается в создании пьезоэлектрического сенсора для определения лекарственных веществ фторхинолонового ряда – левофлоксацина и ципрофлоксацина.

Изобретение относится к клинической и санитарной микробиологии. Питательная среда для выделения клебсиелл содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон мясной, дрожжевой экстракт, мезо-инозит, натрий хлористый, соли желчных кислот, кристаллический фиолетовый, нейтральный красный, натрий углекислый, карбенициллин, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к ускоренному и высокочувствительному способу обнаружения бактериальных патогенов. Раскрыт способ обнаружения бактерий, включающий обеспечение одной или более чем одной суспензии, причем каждая содержит по меньшей мере один вид меченых тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению; добавление образца, подлежащего проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий; фильтрацию полученной реакционной смеси; обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги в концентрате; обнаружение несвязанных бактериофагов в фильтрате; обработку полученных сигналов, сгенерированных в результате обнаружения, и вывод результатов обнаружения пользователю.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ культивирования микроорганизма, выбранного из родов Saccharomyces sensu stricto, Kazachstania, Naumovozyma, Nakaseomyces и Vanderwaltozyma, в присутствии гуанидинобутирата в качестве единственного источника азота, включающий встраивание в указанный микроорганизм молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую гуанидинобутиразу c номером EC 3.5.3.7 и функционально связанную с последовательностями промотора и терминатора, последующее культивирование указанного микроорганизма таким образом, что молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гуанидинобутиразу, экспрессируется в указанном микроорганизме, и культивирование указанного микроорганизма в присутствии гуанидинобутирата в качестве единственного источника азота.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для определения показаний к операции программированной санационной релапаротомии при перитоните.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения зоны характеризации аналитической пластины для проведения характеризации популяции микроорганизма в присутствии антимикробного агента методом MALDI, способ характеризации популяции микроорганизма (варианты), аналитическая пластина и средство для характеризации популяции микроорганизма, представляющее собой указанную пластину.

Изобретение относится к биотехнологии. Предлагается способ выделения и идентификации бактерий групп Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ герметизации вещества в выполненном на субстрате множестве ячеек.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способ и система для очистки кокцидиальных ооцист, а также композиция очищенных кокцидиальных ооцист.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения иммобилизованного мицелия базидиального гриба Fomitopsis officinalis. Способ предусматривает культивирование штамма Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961 совместно со штаммом-продуцентом бактериальной целлюлозы Gluconacetobacter hansenii ВКПМ В-10547 на синтетической среде, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт, Na2HPO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, моногидрат лимонной кислоты, рН среды 6,5.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм микромицета Trichoderma atrobrunneum, обладающий антибактериальной активностью в отношении Bacillus anthracis, депонирован в ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ F-1434. Штамм микромицета Trichoderma atrobrunneum ВКПМ F-1434 может быть использован в борьбе с возбудителем сибирской язвы в природных очагах ее распространения. Изобретение позволяет повысить выход антибактериальных соединений в отношении возбудителя сибирской язвы. 2 табл., 2 пр.

Наверх