Антитела против вспомогательного белка рецептора человеческого интерлейкина-1 (il1rap) и их применение

Изобретение относится к области биохимии, в частности к моноклональному антителу, которое специфически связывается с вспомогательным белком рецептора человеческого интерлейкина-1 (IL1RAP). Также раскрыты конъюгат, содержащий указанное антитело, фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело. Раскрыты применение указанного антитела и указанного конъюгата для лечения или диагностики заболеваний, ассоциированных с IL1RAP, способ лечения или диагностики с помощью указанного антитела. Изобретение позволяет эффективно лечить заболевания, ассоциированные с IL1RAP. 20 н. и 124 з.п. ф-лы, 10 пр., 5 табл., 10 ил.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к агентам на основе антител для лечения и диагностики болезней и состояний, ассоциированных с биомаркером IL-1 (в частности, IL1RAP) и/или чувствительных к ингибированию сигнализации IL-1. В частности, предусматриваются агенты на основе антител для лечения и диагностики раков, включая, без ограничения, хронический миелоидный лейкоз (CML), острый миелоидный лейкоз (AML) и раки, ассоциированные с образование солидных опухолей (таких как меланома, рак легкого и рак молочной железы).

Известный уровень техники

Биология интерлейкина-1

Интерлейкин-1 (IL-1) представляет собой сильный провоспалительный цитокин, который может продуцироваться различными типами клеток, включая мононуклеарные фагоциты, в ответ на инфекцию и воспаление. Семейство IL-1 состоит из семи агонистов, включая IL-1α и IL-1β, и трех встречающихся в природе антагонистов рецепторов, включая антагонист рецептора IL-1 (IL-1Ra) (Dinarello, CA, Blood 1996, 87 (6): 2095-147). Два рецептора IL-1, IL-1R типа I и IL-1R типа II, были идентифицированы. Оба рецептора могут взаимодействовать со всеми тремя формами молекул семейства IL-1. IL-1RI отвечает за медиирование IL-1-индуцированной клеточной активации. Однако, комплекс IL-1/IL-1RI не может вырабатывать сигналы сам по себе, и является зависимым от ассоциации со второй рецепторной цепью, вспомогательным белком IL-1R (IL1RAP) (Dinarello, CA, Blood 1996, 87(6): 2095-147). В отличие от IL-1Rl, IL-1RII не индуцирует клеточную активацию при связывании с IL-1 и, Таким образом, IL-1RII функционирует как регуляторный рецептор-ловушка, приводящий к суммарному снижению IL-1, доступного для связывания с IL-1Rl.

Кроме сигнализации IL1, IL1RAP является критическим для медиирования эффектов IL33, посредством комплекса ST2/IL1RAP, и IL36, посредством комплекса IL1Rrp2/IL1RAP (Garlanda et al., Immunity. 2013 Dec 12; 39 (6): 1003-18)

IL-1 является сильнодействующим провоспалительным цитокином, который индуцируется на участках местной инфекции или воспаления и принимает участие в регуляции различных физиологических и клеточных событий (обобщено в Dinarello СА, CHEST, 2000, 118: 503-508 и Dinarello, СА, Clin Exp Rheumatol, 2002, 20 (5 Suppl 27): S1-13). Он способен активировать несколько типов клеток, включая лейкоциты и эндотелиальные клетки. IL-1 индуцирует и амплифицирует иммунологические реакции путем промотирования продуцирования и экспрессии молекул адгезии, цитокинов, хемокинов и других воспалительных медиаторов, таких как простагландин Е₂ и оксид азота (NO). Вследствие этого, местное воспаление амплифицируется и поддерживается. Кроме этого, IL-1-индуцированное продуцирование воспалительных медиаторов приводит к лихорадке, головной боли, гипотензии и потере веса. Дополнительно, IL-1 является гематопоэтическим фактором роста и, как было показано, уменьшает снижение лейкоцитов и тромбоцитов у пациентов при трансплантации спинного мозга. Было также показано, что IL-1 промотирует ангиогенез путем индуцирования продуцирование сосудистого эндотелиального фактора роста, тем самым промотируя образование паннуса и кровоснабжение ревматических суставов. Наконец, было показано, что IL-1 промотирует деградацию кости и хряща при ревматических заболеваниях.

Роль IL-1 в болезни

IL-1 задействован в широком спектре болезней и состояний от подагры до рака (см. обзор Dinarello et al., 2012, Nature Reviews 11: 633-652 и Dinarello, 2014, Mol. Med. 20 (suppl. 1): S43-S58; описания которых включены в данный документ в качестве ссылок), включая:

- болезни суставов, костей и мышц, такие как ревматоидный артрит и остеоартрит;

- наследственные системные аутовоспалительные болезни, такие как семейная средиземноморская лихорадка;

- системные аутовоспалительные болезни, такие как системный ювенильный идиопатический артрит и болезнь Стилла, проявляющаяся во взрослом возрасте;

- обычные воспалительные болезни, такие как подагра и диабет типа 2;

- ишемические болезни с острым проявлением, такие как инфаркт миокарда; и

- рак.

Ряд терапий, направленных на блокирование активности IL-1, получили одобрение и находятся в разработке. Применение IL-1 в качестве мишени началось в 1993 г. с появления анакинра (кинерет; амген), рекомбинантной формы встречающегося в природе антагониста рецептора IL-1 (IL-1Ra), который блокирует активность как IL-1α, так и IL-1β; с тех пор данное средство было использовано для демонстрации роли IL-1 во многих болезнях (см. выше). Анакинра в настоящее время доминирует в области терапии IL-1 благодаря его хорошим показателям безопасности, короткому периоду полувыведения и многочисленным способам применения. Нейтрализация IL-1 с помощью антител или растворимых рецепторов также оказалась эффективной, и в настоящее время получили одобрение растворимый рецептор-ловушка рилонацепт (аркалист; Regeneron) и нейтрализующее моноклональное антитело против lL-1β канакинумаб (иларис, Novartis). Другие терапевтические подходы, включая нейтрализацию IL-1α, терапевтическую вакцину, нацеленную на IL-1β, и химерный IL-1Ra, находятся на стадии начальных клинических испытаний. Кроме этого, были разработаны и проходят испытания активные при пероральном введении ингибиторы продуцирования lL-1 на основе малых молекул, такие как ингибиторы каспазы 1.

IL1RAP как биомаркер при неопластических расстройствах

Опухолевые биомаркеры представляют собой эндогенные белки или метаболиты, количества или модификации которых являются показателями состояния опухоли, характеристик прогрессирования, и отклика на терапии. Они присутствуют в опухолевых тканях или жидкостях организма и охватывают широкий спектр молекул, включая транскрипционные факторы, рецепторы клеточной поверхности и секретируемые белки. Существует большой спрос на эффективные опухолевые маркеры, поскольку они обладают потенциалом снижения смертности от рака, облегчая диагностику раков на ранних стадиях и помогая индивидуализировать лечение. За последнее десятилетие благодаря улучшенному пониманию канцерогенеза и прогрессирования опухоли было выявлено большое число потенциальных опухолевых маркеров. Прогнозируется, что еще большее количество будет открыто в ближайшем будущем благодаря применению современных технологий, таких как тканевые микроматрицы, матрицы антител, и масс-спектрометрия.

Вспомогательный белок рецептора интерлейкина-1 (IL1RAP) был ранее идентифицирован как биомаркер клеточной поверхности, ассоциированный с гематологическими неопластическими расстройствами, такими как хронический миелоидный лейкоз (CML), острый миелоидный лейкоз (AML) и миелодиспластические синдромы (MDS) (например, см. WO 2011/021014, на имя Cantargia AB, et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA 107 (37): 16280-5, Askmyr et al., 2013, Blood. 121 (18): 3709-13 и Barreyro et al., 2012, Blood 120 (6): 1290-8, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок). Недавно была также продемонстрирована пригодность IL1RAP для использования в качестве диагностического и терапевтического биомаркера солидных опухолей, таких как меланомы (см. WO 2012/098407, на имя Cantargia AB, описание которого включено в данный документ в качестве ссылки).

Таким образом, настоящее изобретение направлено на обеспечение усовершенствованных антител для использования в диагностике и лечении болезней и состояний, ассоциированных с биомаркером IL1RAP и/или чувствительных к ингибированию сигнализации IL-1 и/или IL-33.

Сущность изобретения

Первый аспект изобретения предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ("полипептиды антитела") со специфичностью связывания со вспомогательным белком рецептора интерлейкина-1 ("IL1RAP"), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способны ингибировать связывание референсного антитела "CAN04" с человеческим IL1RAP.

К "вспомогательному белку рецептора интерлейкина-1", "IL1RAP" и "IL1-RAP" мы, в частности, относим человеческий белок IL1RAP, например, описанный в GenBank, № доступа ААВ84059, NCBI, референсная последовательность: NP_002173.1 и UniProtKB/Swiss-Prot № доступа Q9NPH3-1 (см. также Huang et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (24), 12829-12832, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки). IL1RAP также известен в научной литературе как IL1R3, C3orf13, FLJ37788, IL-1RAcP и EG3556.

Таким образом, полипептиды антитела по изобретению обладают специфичностью к IL1RAP. Под "специфичностью" мы понимаем, что полипептид антитела способен связываться с IL1RAP in vivo, т.е. в физиологических условиях, в которых IL1RAP существует в организме человека. Предпочтительно, полипептид антитела не связывается ни с каким другим белком in vivo. Такая специфичность связывания может быть определена способами, хорошо известными специалистам, такими как ИФА (твердофазовый иммуноферментный анализ), иммуногистохимия, иммунопреципитация, вестерн-блоттинг и проточная цитометрия с применением трансфецированных клеток, экспрессирующих IL1RAP. Предпочтительно, полипептид антитела способен селективно связываться с IL1RAP, т.е. он связывается с IL1RAP по меньшей мере в 10 раз сильнее, чем с любыми другими белками.

В понятие "референсное антитело CAN04" мы включаем интактное антитело IgG, содержащее вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NOS: 1 и 2, соответственно. Если не указано иное, в данном документе ссылки на "CAN04" относятся к интактному антителу IgG, содержащему (а) тяжелую цепь, содержащую вариабельный участок, представленный SEQ ID NO: 1 и константный участок, представленный SEQ ID NO: 19, и (b) легкую цепь, содержащую вариабельный участок, представленный SEQ ID NO: 2, и константный участок, представленный SEQ ID NO: 18. Альтернативно, гуманизированный вариант CAN04 (hCAN04) может быть использован в качестве референсного антитела. Например, референсное антитело может быть интактным антителом IgG, содержащим (а) тяжелую цепь, содержащую вариабельный участок, представленный любой из SEQ ID NOS: 8-11, и константный участок, представленный SEQ ID NO: 19, и (b) легкую цепь, содержащую вариабельный участок, представленный любой из SEQ ID NOS: 15-17, и константный участок, представленный SEQ ID NO: 18.

Как будет описано ниже, референсное антитело CAN04 связывается с доменом 2 IL1RAP. Таким образом, следует понимать, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению также связывается с доменом 2 IL1RAP

Под "способный ингибировать связывание референсного антитела CAN04 с человеческим IL1RAP" мы понимаем, что присутствие полипептидов антитела по изобретению ингибирует, полностью или частично, связывание CAN04 с человеческим IL1RAP. Такое конкурентное ингибирование связывания может быть определено с применением анализов и способов, хорошо известных специалистам, например, путем использования чипов BIAcore с иммобилизированным IL1RAP и инкубирования с референсным антителом CAN04 с тестируемым полипептидом антитела и без него. Альтернативно, может быть использован подход попарного картирования, при котором референсное антитело CAN04 иммобилизировано на поверхности чипа BIAcore, антиген IL1RAP связывается с иммобилизированным антителом, и затем второе антитело тестируется на способность к одновременному связыванию IL1RAP (см. "BIAcore Assay Handbook", GE Healthcare Life Sciences, 29-0194-00 AA 05/2012; описание которой включено в данный документ в качестве ссылки).

В качестве дополнительной альтернативы, конкурентное ингибирование связывания может быть определено с применением проточной цитометрии. Например, для определения того, способно ли тестируемое антитело ингибировать связывание референсного антитела CAN04 с антигеном клеточной поверхности, клетки, экспрессирующие антиген, могут предварительно инкубироваться с тестируемым антителом в течение 20 мин., после чего клетки промывают и инкубируют с референсным антителом CAN04, конъюгированным с флуорофором, который может детектироваться методом проточной цитометрии. Если предварительная инкубация с тестируемым антителом снижает детектирование референсного антитела CAN04 методом проточной цитометрии, то тестируемое антитело ингибирует связывание референсного антитела с антигеном клеточной поверхности. Если тестируемое антитело проявляет высокую аффинность к IL1RAP, то может быть использован уменьшенный период предварительной инкубации (или даже полный отказ от предварительной инкубации).

В качестве дополнительной альтернативы, конкурентное ингибирование связывания может быть определено с применением метода ИФА (например, как описано в примере J).

В понятие "антитело или его антигенсвязывающий фрагмент" мы включаем по существу интактные молекулы антитела, а также химерные антитела, гуманизированные антитела, выделенные человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антитела, легкие цепи антитела, гомодимеры и гетеродимеры тяжелой и/или легкой цепей антитела, и их антигенсвязывающие фрагменты и производные. Пригодные антигенсвязывающие фрагменты и производные включают, но не обязательно ограничены, фрагменты Fv (например, одноцепочечные Fv и соединенные дисульфидными связями Fv), Fab-подобные фрагменты (например фрагменты Fab, фрагменты Fab' и фрагменты F(ab)₂), одиночные вариабельные домены (например, домены V_H и V_L) и домены антитела (dAbs, включая одиночные и сдвоенные форматы [т.е. dAb-линкер-dAb]). Потенциальные преимущества использования фрагментов антитела, а не целых антител, являются многообразными. Меньший размер фрагментов может приводить к улучшенным фармакологическим свойствам, таким как лучшее проникновение в солидную ткань. Кроме того, антигенсвязывающие фрагменты, такие как фрагменты антител Fab, Fv, ScFv и dAb, могут экспрессироваться в и секретироваться из Е. coli, что позволяет легко продуцировать большие количества указанных фрагментов.

Фраза "антитело или его антигенсвязывающий фрагмент" также должна охватывать миметики антитела (например, не являющиеся антителом каркасные структуры, имеющие высокую степень стабильности, но позволяющие вводить вариабельность в определенных положениях). Квалифицированные специалисты в области биохимии будут знать многие такие молекулы, как описано в Gebauer & Skerra, 2009, Curr Opin Chem Biol 13 (3): 245-255 (описание которой включено в данный документ в качестве ссылки). Типичные примеры миметиков антитела включают: аффитела (также называемые тринектинами; Nygren, 2008, FEBS J, 275, 2668-2676); CTLDs (также называемы тетранектинами; Innovations Pharmac. Technol. (2006), 27-30); аднектины (также называемы монотелами; Meth. Mol. Biol., 352 (2007), 95-109); антикалины (Drug Discovery Today (2005), 10, 23-33); дарпины (DARPins) (анкирины; Nat. Biotechnol. (2004), 22, 575-582); авимеры (Nat. Biotechnol. (2005), 23, 1556-1561); микротела (FEBS J, (2007), 274, 86-95); пептидные аптамеры (Expert. Opin. Biol. Ther. (2005), 5, 783-797); Куниц-домены (J. Pharmacol. Exp. Ther. (2006) 318, 803-809); аффилины (Trends. Biotechnol. (2005), 23, 514-522); аффимеры (Avacta Life Sciences, Wetherby, UK).

В объем изобретения также входят химерные Т-клеточные рецепторы (также известны как химерные рецепторы Т-лимфоцитов, химерные иммунорецепторы, и химерные рецепторы антигенов или CARs) (см. Pule et at., 2003, Cytotherapy 5 (3): 211-26, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки). Эти рецепторы являются генетически модифицированными и позволяют придать произвольную специфичность иммунной эффекторной клетке. Типично, CAR пригодны для придания специфичности моноклонального антитела Т-лимфоцитам; при этом перенос их кодирующей последовательности осуществляется с помощью ретровирусных векторов. Наиболее обычной формой таких молекул являются продукты слияния, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из моноклонального антитела, слитый с CD3-дзета трансмембранным и эндодоменом. Когда Т-клетки экспрессируют такую слитую молекулу, они распознают и уничтожают клетки-мишени, экспрессирующие перенесенную специфичность моноклонального антитела.

Квалифицированным специалистам дополнительно будет понятно, что изобретение также охватывает модифицированные варианты антител и их антигенсвязывающих фрагментов, существующие в настоящее время или еще не разработанные, например, модифицированные путем ковалентного присоединения полиэтиленгликоля или другого пригодного полимера (см. ниже).

Способы получения антител и фрагментов антител хорошо известны специалистам. Например, антитела могут быть получены любым из нескольких способов, которые используют индуцирование in vivo продуцирования молекул антитела, скрининг библиотек иммуноглобулинов (Orlandi. et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349: 293-299, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок) или генерирования молекул моноклональных антител клеточными линиями в культуре. Такие способы включают, без ограничений, методику гибридом, методику В-клеточных гибридом человека, и методику гибридом с применением вируса Эпштейна-Барр (EBV) (Kohler et al., 1975. Nature 256: 4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030; Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62: 109-120, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок).

Пригодные способы продуцирования моноклональных антител также раскрыты в "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки), и в "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки).

Аналогично, фрагменты антитела могут быть получены с применением способов, хорошо известных специалистам (см., например, Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual', Cold Spring Harbor Laboratory, New York, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки). Например, фрагменты антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены путем протеолитического гидролиза антитела или путем экспрессии в Е. coli или клетках млекопитающих (например, культура клеток яичника китайского хомячка или другие системы экспрессии белка) кодирующего ДНК фрагмента. Альтернативно, фрагменты антитела могут быть получены путем гидролиза пепсином или папаином цельных антител обычными способами.

Антитела по изобретению определяют посредством ссылки на вариабельные участки мышиного антитела, обозначенного CAN04, которое содержит:

(a) вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1:

и

(b) вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2:

Термин "аминокислота" в используемом в данном документе значении включает стандартные двадцать генетически закодированных аминокислот и их соответствующие стереоизомеры в D-форме (по сравнению сприродной L-формой), омега-аминокислоты и другие встречающиеся в природе аминокислоты, неприродные аминокислоты (например, α,α-дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты и т.д.) и химически дериватизированные аминокислоты (см. ниже).

В тех случаях, когда аминокислота указывается конкретно, например "аланин" или "Ala" или "А", термин относится как к L-аланину, так и к D-аланину, если явным образом не указано иное. Другие неприродные аминокислоты также могут быть пригодными компонентами для полипептидов по настоящему изобретению, при условии, что полипептид сохраняет желательную функциональную способность. Для приведенных пептидов, каждый кодируемый аминокислотный остаток, в соответствующих случаях, представлен с помощью однобуквенного обозначения, которое соответствует тривиальному названию обычной аминокислоты.

В одном варианте реализации, полипептиды антитела, как они определены в данном документе, содержат или состоят из L-аминокислот.

Квалифицированным специалистам будет понятно, что любое интактное антитело IgG, содержащее вышеуказанные вариабельные участки, может быть использовано как референсное антитело для идентификации полипептидов антитела по изобретению, которые конкурентно ингибируют связывание CAN04 с IL1RAP.

Таким образом, в одном варианте реализации, антитело CAN04, используемое в качестве референсного по отношению к определенному конкурентному связующему агенту (binder), является интактным антителом IgG, содержащим:

(a) тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен SEQ ID NO: 1, привитый к константному участку мышиноного lgG1 или lgG2a

(b) легкую цепь, содержащую вариабельный домен SEQ ID NO: 2, привитый к мышиному константному участку каппа.

Альтернативно, референсное антитело может быть химерным, интактным антителом IgG, содержащим:

(a) тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен SEQ ID NO: 1, привитый к константному участку человеческого lgGl (например, такому как кодируемый вектором pFUSEss-CHIg-hG1, InvivoGen, San Diego, USA)ую

(b) легкую цепь, содержащую вариабельный домен SEQ ID NO: 2, привитый к человеческому константному участку каппа (например, такому как кодируемый ветором pFUSE2ss-CLIg-hk, InvivoGen, San Diego, USA).

Конкурентное связывание типично возникает потому, что тестовое антитело связывается с, или по меньшей мере очень близко к, эпитопу антигена, с которым связывается референсное антитело (в данном случае, CAN04). Однако, квалифицированным специалистам будет понятно, что конкурентное связывание может также возникать вследствие стерического взаимодействия; таким образом, тестовое антитело может связываться с эпитопом, отличным от того, с которым связывается референсно антитело, но может при этом иметь достаточный размер или конфигурацию, чтобы препятствовать связыванию референсного антитела с антигеном.

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению были идентифицированы после масштабного скрининга большого числа антител против IL1RAP, на основании проявления ими свойств, которые делают их особенно пригодными для использования в качестве диагностических и терапевтических агентов при раке.

Таким образом, в одном варианте реализации, антитело или антигенсвязывающий фрагмент проявляет одно или несколько из следующих свойств:

(a) аффинность связывания (K_D) с человеческим IL1RAP, равная 200 пМ или больше, т.е. K_D≤200 рМ (например, при определении в соответствии с примером А);

(b) перекрестная реактивность с IL1RAP Macaca, fascicularis (например, при определении в соответствии с примером D);

(c) ингибирующее действие на сигнализацию IL1 (IL-1α и/или IL-1β; например, при определении в соответствии с примером Е);

(d) способность индуцировать антитело-зависимую клеточно-медиируемую цитотоксичность (ADCC) в одной или нескольких клеточных линиях рака (таких как клеточные линии CML, ALL и/или меланомы) (например, при определении в соответствии с примером F); и/или

(e) способность к интернализации при связывании с одной или несколькими клеточными линиями рака (такими как клеточная линия CML, AML и/или меланомы) (например, при определении в соответствии с примером G).

Предпочтительно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент проявляет все вышеуказанные свойства.

В альтернативном варианте реализации, антитело или антигенсвязывающий фрагмент проявляет одно или несколько из указанных выше свойств (а), (b), (с) и (е), но не способен индуцировать ADCC.

В одном варианте реализации, антитело или антигенсвязывающий фрагмент способны связываться с эпитопом внеклеточного домена IL1RAP, который перекрывается, по меньшей мере частично, с эпитопом IL1RAP, с которым способно связываться референсное антитело CAN04. Таким образом, антитело или антигенсвязывающий фрагмент может быть способен связываться с эпитопом, расположенным на/внутри домена 2 IL1RAP (см. Wang et al., 2010, Nature Immunology, 11: 905-912, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки), т.е. в пределах аминокислот 135-234 IL1RAP (см. № доступа Q9NPH3 в UniProtKB/Swiss-Prot). Например, эпитоп, с которым (связывается) антитело или антигенсвязывающий фрагмент, может быть расположен в пределах аминокислот 135-154,155-174, 175-194, 195-214, или между аминокислотами 215-234 IL1RAP. Однако, следует понимать, что эпитоп может быть нелинейным.

В одном варианте реализации, полипептид антитела по изобретению содержит или состоит из интактного антитела (такого как антитело lgG1).

В альтернативном варианте реализации, полипептид антитела по изобретению содержит или состоит из антигенсвязывающего фрагмента, выбранного из группы, состоящей из фрагментов Fv (например одноцепочечных Fv и соединенных дисульфидными связями Fv), Fab-подобных фрагментов (например фрагментов Fab, фрагментов Fab' и фрагментов F(ab)₂) и доменных антител (например отдельных V_H вариабельных доменов или V_L вариабельных доменов).

В дополнительном варианте реализации, как описано выше, полипептид по изобретению содержит или состоит из миметика антитела, выбранного из группы, содержащей или состоящей из аффител, тетранектинов (CTLDs), аднектинов (монотел), антикалинов, дарпинов (DARPins) (анкиринов), авимеров, iMabs, микротел, пептидных алтамеров, Куниц-доменов и аффилинов.

В предпочтительном варианте реализации, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом изобретения содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий следующие гипервариабельные участки (CDR):

a) GYAFSSS [SEQ ID NO: 3] или аминокислотную последовательность, имеющую с ним по меньшей мере 60% идентичности последовательностей, например, по меньшей мере 70%, 80%, или 90% идентичности последовательностей;

b) YPGDGN [SEQ ID NO: 4] или аминокислотную последовательность, имеющую с ней по меньшей мере 60% идентичности последовательностей, например, по меньшей мере 70%, 80%, или 90% идентичности последовательностей; и/или

c) GYLDPMDY [SEQ ID NO: 5] или аминокислотную последовательность, имеющую с ним по меньшей мере 60% идентичности последовательностей, например, по меньшей мере 70%, 80%, или 90% идентичности последовательностей.

Таким образом, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR с SEQ ID NOs 3, 4 и 5.

Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность соответствующей области референсного антитела CAN04, т.е. SEQ ID NO: 1.

Однако следует понимать, что низкий уровень мутации (типично, всего одна или две аминокислоты) в последовательности CDR может быть терпимым без потери специфичности антитела или антигенсвязывающего фрагмента по отношению к IL1RAP.

Процент идентичности может быть определен, например, с помощью программы LALIGN (Huang and Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12: 337-357, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки) на веб-сайте службы Expasy (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html) с применением в качестве параметров варианта выбора глобального выравнивания, матрицы стоимости выравнивания BLOSUM62, штрафа за открытие пробела -14, штрафа за продолжение пробела -4. Альтернативно, процент идентичности последовательностей между двумя полипептидами могут быть определен с применением пригодных компьютерных программ, например, программы GAP Группы генетических расчетов Университета Висконсина (University of Wisconsin Genetic Computing Group), и следует понимать, что процент идентичности рассчитывается по отношению к полипептидам с оптимально выравненной последовательностью.

Выравнивание альтернативно может осуществляться с применением программы Clustal W (как описано в Thompson et al., 1994, Nucl. Acid Res. 22: 4673-4680, которая включена в данный документ в качестве ссылки). Могут быть использованы следующие параметры:

- Параметры быстрого попарного выравнивания: Размер участка максимального совпадения (K-tuple(word) size); 1, размер окна (window size); 5, штраф на введение делеции (gap penalty); 3, число верхних диагоналей (number of top diagonals); 5. Метод оценки: х процентов.

- Параметры множественного выравнивания: штраф на введение делеции (gap open penalty); 10, штраф на продолжение делеции (gap extension penalty); 0.05.

- Матрица стоимости выравнивания: BLOSUM.

Альтернативно, для определения локальных выравниваний последовательностей может быть использована программа BESTFIT.

В дополнительном предпочтительном варианте реализации, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом изобретения содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий следующие CDR:

a) GYAFSSSWMN [SEQ ID NO: 6] или аминокислотную последовательность, имеющую с ним по меньшей мере 60% идентичности последовательностей, например, по меньшей мере 70%, 80%, или 90% идентичности последовательностей;

b) RIYPGDGNTHYSGKFKG [SEQ ID NO: 7] или аминокислотную последовательность, имеющую с ней по меньшей мере 60% идентичности последовательностей, например, по меньшей мере 70%, 80%, или 90% идентичности последовательностей; и

c) GYLDPMDY [SEQ ID NO: 5] или аминокислотную последовательность, имеющую с ним по меньшей мере 60% идентичности последовательностей, например, по меньшей мере 70%, 80%, или 90% идентичности последовательностей.

например, полипептид антитела может содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR с SEQ ID NOs 6, 7 и 5.

Как указано выше, референсное антитело CAN04 представляет собой мышиное антитело. Однако компоненты тяжелой и легкой цепей этого антитела могут быть гуманизированы для получения полипептидов антитела, более пригодных для использования на людях, например благодаря их пониженной иммуногенности. Например, CDR с SEQ ID NOs 3, 4 и 5 (или CDR с SEQ ID NOs 6, 7 и 5) могут быть привиты на каркас человеческого вариабельного участка.

Квалифицированным специалистам будет понятно, что в терапии человека предпочтительно используются человеческие или гуманизированные антитела. Гуманизированные формы не-человеческих (например, мышиных) антител представляют собой генетически модифицированные химерные антитела или фрагменты антител, имеющие предпочтительно минимальные участки, выделенные из не-человеческих антител. Гуманизированные антитела включают антитела, в которых определяющие комплементарность области человеческого антитела (антитело-реципиент) заменяются на остатки из определяющей комплементарность области вида, не являющегося человеком (антитело-донор), такого как мышь, крыса или кролик, обладающие желательной функциональностью. В некоторых случаях, каркасные остатки Fv человеческого антитела заменяются на соответствующие не-человеческие остатки. Гуманизированные антитела могут также содержать остатки, не присутствующие ни в антителе-реципиенте, ни в импортируемой определяющей комплементарность области или каркасных последовательностях. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, и типично двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все определяющие комплементарность области соответствуют не принадлежащему человеку антителу, и все, или по существу все, каркасные области соответствуют релевантной человеческой консенсусной последовательности. Гуманизированные антитела оптимально также включают по меньшей мере часть константного участка антитела, такую как область Fc, типично выделенную из человеческого антитела (см., например, Jones et al., 1986. Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок).

Способы гуманизации не принадлежащих человеку антител хорошо известны специалистам. Обычно, гуманизированное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, не принадлежащего человеку. Такие не принадлежащие человеку аминокислотные остатки, которые часто называют импортированными остатками, типично берут из импортируемого вариабельного домена. Гуманизация может быть проведена, по существу, как описано (см., например, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332: 323-327; Verhoeyen et at., 1988, Science 239: 1534-15361; US 4816567, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок), путем замещения человеческих определяющих комплементарность областей на соответствующие определяющие комплементарность области, принадлежащие грызунам. Соответственно, такие гуманизированные антитела являются химерными антителами, в которых участок, существенно меньший, чем интактный вариабельный домен человека, был замещен на соответствующую последовательность вида, не являющегося человеком. На практике, гуманизированные антитела могут быть типично человеческими антителами, в которых некоторые остатки определяющей комплементарность области и, возможно, некоторые каркасные остатки замещены на остатки из аналогичных сайтов антител грызунов.

Человеческие антитела также могут быть идентифицированы с применением различных методик, известных специалистам, включая библиотеки фагового дисплея (см., например, Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581; Cole et al., 1985, в: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147: 86-95, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок).

Таким образом, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению могут быть гуманизированы, например, они могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий одну из следующих аминокислотных последовательностей любой из SEQ ID NOs: 8-11, или аминокислотной последовательности, имеющей с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательностей:

Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOs: 8-11.

В родственном предпочтительном варианте реализации, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи содержащий следующие CDR:

a) SASQGINNYLN [SEQ ID NO: 12] или аминокислотную последовательность, имеющую с ним по меньшей мере 60% идентичности последовательностей, например, по меньшей мере 70%, 80%, или 90% идентичности последовательностей;

b) YTSGLHA [SEQ ID NO: 13] или аминокислотную последовательность, имеющую с ней по меньшей мере 60% идентичности последовательностей, например, по меньшей мере 70%, 80%, или 90% идентичности последовательностей; и/или

c) QQYSILPWT [SEQ ID NO: 14] или аминокислотную последовательность, имеющую с ней по меньшей мере 60% идентичности последовательностей, например, по меньшей мере 70%, 80%, или 90% идентичности последовательностей.

Таким образом, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный участок легкой цепи содержащий CDR с SEQ ID NOs 12,13 и 14.

Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность соответствующей области мышиного референсного антитела CAN04, т.е. SEQ ID NO: 2.

Как и в случае вариабельного участка тяжелой цепи, описанном выше, следует понимать, что вариабельный участок легкой цепи полипептида антитела по изобретению может быть гуманизирован с целью получения агентов, более пригодных для использования людьми. Например, CDR с SEQ ID NOs 12, 13 и 14 могут быть привиты на каркас человеческого вариабельного участка.

Таким образом, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NOs: 15-17, или аминокислотной последовательности, имеющей с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательностей:

Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOs: 15-17.

В одном варианте реализации, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит мышиный вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1 и мышиный вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 2.

Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать гуманизированный вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NOs: 8-11 и гуманизированный вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NOs: 15-17.

Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать:

a) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15;

b) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15;

c) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15;

d) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15;

e) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16;

f) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16;

g) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16;

h) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16;

i) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17;

j) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17;

k) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17; или

l) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17.

Квалифицированным специалистам будет понятно, что вышеописанные гуманизированные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут дополнительно содержать константный участок тяжелой цепи, или его часть (см. ниже).

В одном варианте реализации, полипептид антитела содержит область СН1, СН2 и/или СН3 тяжелой цепи IgG (такой как тяжелая цепь lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4). Таким образом, полипептид антитела может содержать часть или все константные участки из тяжелой цепи lgG1. Например, полипептид антитела может быть фрагментом Fab, содержащим константные участки СН1 и CL, объединенные с любыми из вышеописанных тяжелых и легких вариабельных участков, соответственно.

Аналогично, вышеописанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут дополнительно содержать константный участок легкой цепи, или его часть (см. ниже). Например, полипептид антитела может содержать область CL из каппа- или лямбда-легкой цепи.

Например, полипептид антитела может содержать следующие константные участки:

(a) область С-цепи Ig-каппа (Homo sapiens) (UnitProt № доступа Р01834)

(b) область С-цепи Ig-гамма-1 (Homo sapiens) (UnitProt № доступа Р01857)

В альтернативном варианте реализации, могут быть использованы природные варианты вышеуказанных константных участков (например, см. Jefferis & Lefranc, 2009, MAbs 1 (4): 332-8, описания которой включено в данный документ в качестве ссылки). Например, константный участок легкой цепи (china) может содержать или состоять из SEQ ID NO: ь18, имеющей мутацию W40R и/или V83L, и/или константный участок тяжелой цепи (china) может содержать или состоять из SEQ ID NO: 19, имеющей мутацию K97R, D239E и/или L241M, или без С-концевого лизина/K (где положение аминокислотных мутаций определяется с применением схемы нумерации Eu, которая отличается от нумерации в SEQ ID NOS: 18 и 19; см. Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63: 78-85, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки).

Таким образом, типичные примеры полипептидов антитела по изобретению содержат:

(а) тяжелую цепь, содержащую вариабельный участок SEQ ID NO: 1, 8, 9, 10 или 11, вместе с константным участком SEQ ID NO: 19; и

(b) легкую цепь, содержащую вариабельный участок SEQ ID NO: 2, 15, 16 или 17, вместе с константным участком SEQ ID NO: 18.

В родственном варианте реализации, полипептид антитела может содержать Fc-область антитела (например, области СН2 и СН3 тяжелой цепи IgG). Квалифицированному специалисту будет понятно, что участок Fc может принадлежать антителу IgG, или другому классу антител (таким как IgM, IgA, IgD или IgE). В одном варианте реализации, область Fc взята из антитела lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4.

Область Fc может быть природной (например, частью эндогенно продуцируемого антитела) или могут быть искусственной (например содержащей одну или несколько точковых мутаций по сравнению с природной областью Fc).

Как подробно описано в известном уровне техники, область Fc антитела медиирует его период полувыведения из сыворотки и эффекторные функции, такие как комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и антитело-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP).

Генетическое модифицирование области Fc терапевтического моноклонального антитела или гибридного белка Fc позволяет получать молекулы, лучше пригодные для проявления требуемой от них фармакологической активности (Strohl, 2009, Curr Opin Biotechnol 20 (6): 685-91, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки).

(а) Fc-области, генетически модифицированные с целью увеличения периода полувыведения

Одним из подходов, направленных на повышение эффективности терапевтического антитела, является увеличение его стойкости в сыворотке, что позволяет обеспечить более высокие уровни в циркуляции, менее частое введение и сниженные дозы.

Период полувыведения IgG зависит от его рН-зависимого связывания с неонатальным рецептором FcRn. FcRn, который экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток, связывает IgG Ph-зависимым образом и защищает его от деградации.

Некоторые антитела, селективно связывающие FcRn при рН 6,0, но не при рН 7,4, демонстрируют больший период полувыведения в различных животных моделях.

Было показано, что несколько мутаций, расположенных на границе между доменами СН2 и СН3, такие как T250Q/M428L (Hinton et al., 2004, J Biol Chem. 279 (8): 6213-6, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки) и M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F (Vaccaro et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23 (10): 1283-8, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки), повышают аффинность связывания с FcRn и период полувыведения lgG1 in vivo.

(b) Fc-области, генетически модифицированные с целью изменения эффекторной функции

В зависимости от применения терапевтического антитела или гибридного белка Fc, может быть желательным уменьшить или повысить эффекторную функцию (такую как ADCC).

Для антител, нацеленных на молекулы клеточной поверхности, особенно на иммунных клетках, при определенных клинических показаниях может потребоваться нейтрализация эффекторных функций.

Наоборот, для антител, предназначенных для применения при онкологии (таком как при лечении лейкозов и солидных опухолей; см. ниже), усиление эффекторных функций может улучшать терапевтическую активность.

Четыре изотипа человеческого IgG связывают активирующие Fcγ рецепторы (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), ингибирующий FcγRIIb рецептор, и первый компонент комплемента (C1q) с разными аффинностями, давая очень разные эффекторные функции (Bruhns et al., 2009, Blood. 113 (16): 3716-25, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки).

Связывание IgG с FcγRs или C1q зависит от остатков, расположенных в шарнирной области и домене CH2. Две области домена СН2 являются критическими для связывания FcγRs и C1q, и имеют уникальные последовательности в lgG2 и lgG4. Было показано, что замещения остатков человеческих lgG1 или (of) lgG2 в положениях 233-236 и остатков lgG4 в положениях 327, 330 и 331 значительно снижают ADCC и CDC (Armour et al., 1999, EurJ Immunol. 29 (8): 2613-24; Shields et al., 2001, J Biol Chem. 276 (9): 6591-604, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок). Кроме того, Idusogie et al. продемонстрировал, что замещение аланина в разных положениях, включая K322, значительно снижает активацию комплемента (Idusogie et al., 2000, J Immunol. 164 (8): 4178-84, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки). Аналогично, было показано, что мутации в домене СН2 мышиного lgG2A снижают связывание с FcγRI и C1q (Steurer. et al., 1995. J Immunol. 155 (3): 1165-74, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки).

Многочисленные мутации выполняли в домене СН2 домен человеческого lgG1 и их влияние на ADCC и CDC тестировали in vitro (см. указанные выше ссылки). Примечательно, что замещение аланина в положении 333, как сообщалось, повышает как ADCC, так и CDC (Shields et al., 2001, supra; Steurer et al., 1995, supra). Lazar et al. описали тройной мутант (S239D/I332E/A330L) с более высокой аффинностью к FcγRllla и более низкой аффинностью к FcγRllb, обеспечивающий повышенную ADCC (Lazar et al., 2006, PNAS 103 (11): 4005-4010, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки). Такие же самые мутации были использованы для получения антитела с повышенной ADCC (Ryan et al., 2007, Mol. Cancer Ther. 6: 3009-3018, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки). Richards et al. исследовали немного отличный тройной мутант (S239D/I332E/G236A) с улучшенной аффинностью к FcγRllla и соотношением FcYRIIa/FcγRllb, медиирующим усиленный фагоцитоз клеток-мишеней макрофагами (Richards et al., 2008. Mol Cancer Ther. 7 (8): 2517-27, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки).

Благодаря отсутствию эффекторных функций, антитела lgG4 представляют собой предпочтительный подкласс IgG для блокирования рецептора без истощения популяции клеток (т.е. ингибирования сигнализации IL-1). Молекулы lgG4 могут обмениваться половинками молекул посредством динамического процесса, называемого обменом Fab-фрагментами. Это явление может также происходить in vivo между терапевтическими антителами и эндогенным lgG4.

Было показано, что мутация S228P предотвращает этот процесс рекомбинации, что позволяет конструировать менее непредсказуемые терапевтические lgG4-антитела (Labrijn et al., 2009, Nat Biotechnol. 27 (8): 767-71, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки).

Примеры генно-модифицированных областей Fc приведены в Таблице 1 и примере J ниже.

Ссылки к Таблице 1

1. Hinton et al., 2004. J. Biol. Chem. 279 (8): 6213-6)

2. Vaccaro et al., 2005. Nat. Biotechnol. 23 (10): 1283-8)

3. Zalevsky et al., 2010. Nat. Biotechnol. 28 (2): 157-159

4. Armour KL. et al., 1999. Eur J Immunol. 29 (8): 2613-24

5. Shields RL. et al., 2001. J Biol Chem. 276 (9): 6591-604

6. Masuda et al., 2007. Mol Immunol. 44 (12): 3122-31

7. Bushfield et al., 2014. Leukemia 28 (11): 2213-21

8. Okazaki et al., 2004. J Mol Biol.; 336 (5): 1239-49

9. Idusogie et al., 2000. J Immunol. 164 (8): 4178-84

10. Datta-Mannan A. et al., 2007. Drug Metab. Dispos. 35: 86-94

11. Steurer W. et al., 1995. J Immunol. 155 (3): 1165-74

12. Richards et al., 2008. Mol Cancer There. 7 (8): 2517-27

13. US 7960512 B2

14. ЕР 2213683

15. Labrijn AF. et al., 2009. Nat Biotechnol. 27 (8): 767-71

В дополнительном варианте реализации, эффекторная функция области Fc может быть изменена путем модификации углеводных фрагментов в расположенном в нем домене СН2.

Например, известно, что терапевтические антитела, не содержащие или имеющие низкое содержание остатков фукозы в области Fc, могут проявлять повышенную ADCC активность у людей (например, см. Peipp et al., 2008, Blood 112 (6): 2390-9, Yamane-Ohnuki & Satoh, 2009, MAbs 1 (3): 230-26, lida et al., 2009, BMC рак 9; 58 (описания которых включены в данный документ в качестве ссылок). Полипептиды антител с низким содержанием фукозы могут быть получены путем экспрессии в клетках, культивируемых в среде, содержащей ингибитор маннозидазы, такой как кинфуненсин (кинфуненсин) (см. пример I ниже).

Другие способы модификации гликозилирования антитела в формат с низким содержанием фукозы включают применение бактериального фермента GDP-6-дезокси-D-ликсо-4-гексулоза-редуктазы в клетках, неспособных метаболизировать рамнозу (например, с применением технологии GlymaxX® фирмы ProBioGen AG, Berlin, Germany).

Другой способ создания антител с низким содержанием фукозы заключается в ингибировании или истощении альфа-(1,6)-фукозилтрансферазы в антитело-продуцирующих клетках (например с применением технологии Potelligent® CHOK1SV фирмы Lonza Ltd, Basel, Switzerland).

Как было отмечено выше, полипептиды антитела по изобретению могут проявлять ингибирующее действие на сигнализацию IL-1 (см. пример Е), или в дополнение к, или в отсутствие каких-либо Fc-медиируемых эффекторных функций.

В одном варианте реализации, полипептиды антитела по изобретению могут проявлять ингибирующее действие на одно или несколько дополнительных (или альтернативных) цитокинов, входящих в суперсемейство IL-1, включая, без ограничения, IL-33 и/или IL-36.

Интерлейкин-33 (IL-33) индуцирует хелперные Т-лимфоциты, мастоциты, эозинофилы и базофилы на продуцирование цитокинов типа 2. Этот цитокин был ранее назван NF-HEV (ядерный фактор (NF) венул с высоким эндотелием (HEV)), поскольку первоначально он был идентифицирован в этих специализированных клетках. IL-33 медиирует свои биологические эффекты путем взаимодействия с рецепторами ST2 (также известны как IL1RL1) и вспомогательным белком рецептора IL-1 (IL1RAP), активации внутриклеточных молекул в сигнальных путях NF-kB и MAP киназы, которые управляют продуцированном цитокинов типа 2 (например IL-5 и IL-13) поляризованными Th2-клетками. Индукция цитокинов типа 2 с помощью IL-33 in vivo, как считается, индуцирует тяжелые патологические изменения, наблюдаемые в органах слизистой оболочки после введения IL-33.

Интерлейкин-36 (IL-36) представляет собой цитокин, который преимущественно воздействует на наивные CD4+ Т-лимфоциты посредством рецептора IL-36. Известно, что он активирует NF-kB и митоген-активируемые протеинкиназы на участие в патологии кожи. Было также обнаружено, что он активирует пролиферацию Т-лимфоцитов и высвобождение IL-2.

Квалифицированным специалистам будет понятно, что полипептид антитела по изобретению может полностью или частично ингибировать сигнализацию IL-1, IL-33 и/или IL-36. Например, сигнализация может ингибироваться на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 50%, 75% или больше по сравнению с сигнализацией в отсутствие полипептида по изобретению.

Степень ингибирования сигнализации IL-1, IL-33 и/или IL-36 с помощью полипептида по изобретению может быть определена с применением способов, хорошо известных специалистам.

Например, ингибирование сигнализации IL-1 может быть измерено, как описано в примере Е ниже.

Аналогично, ингибирование сигнализации IL-33 может быть измерено, как описано в примере Е.

Ингибирование сигнализации IL-36 может быть измерено способами, известными специалистам. Например, стимулирование с помощью IL-36 синовиальных фибробластов приводит к активации NF-kB и MAP киназы. Альтернативно, IL-36-α, -β и -γ повышают пролиферацию Т-лимфоцитов в ответ на анти-CD3/анти-CD28 стимулирование (см. Vigne et al., 2012, Blood 120 (17): 3478-87, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки).

В одном варианте реализации, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может дополнительно содержать фрагмент для увеличения in vivo периода полувыведения антитела или антигенсвязывающего фрагмента, такой как, без ограничений, полиэтиленгликоль (ПЭГ), человеческий сывороточный альбумин, гликозилирующие группы, жирные кислоты и декстран. Такие дополнительные фрагменты могут быть конъюгированы или иначе объединены со связывающим фрагментом с применением способов, хорошо известных специалистам.

С этой целью может быть использован любой один или несколько из следующих известных способов улучшения периода полувыведения белков:

(а) Пегилирование

Широко используемый способ улучшения периода полувыведения белков заключается в ковалентном присоединении к белку фрагментов полиэтиленгликоля (ПЭГ). ПЭГ представляют собой водорастворимые полимеры, которые благодаря своему большому гидродинамическому объему создают экран вокруг пегилированного лекарственного средства [Molineux, G., Pegylation: engineering improved pharmaceuticals for enhanced therapy. Cancer Treat Rev, 2002. 28 Suppl A: p. 13-6, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки]. Пегилированные белки демонстрируют сниженный почечный клиренс и протеолиз, сниженную токсичность, сниженную иммуногенность и повышенную растворимость [Veronese, F.M. and J.M. Harris, Introduction and overview of peptide and protein pegylation. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54 (4); p. 453-6., Chapman, A.P., PEGylated antibodies and antibody fragments for improved therapy: a review. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54 (4): p. 531-45.]. Пегилирование было использовано в нескольких лекарственных средствах на основе белков, включая первые пегилированные молекулы аспарагиназу и аденозиндеаминазу [Veronese, F.M. and J.M. Harris, Introduction and overview of peptide and protein pegylation. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54 (4): p. 453-6., Veronese, F.M. и G. Pasut, PEGylation, successful approach to drug delivery. Drug Discov Today, 2005. 10 (21): p. 1451-8, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок].

Для получения успешно пегилированного белка, с максимально увеличенным периодом полувыведения и сохраненной биологической активностью, необходимо принимать во внимание несколько важных параметров, которые могут повлиять на результат. Молекулы ПЭГ могут различаться, и варианты ПЭГ, используемые для пегилирования белков, включают ПЭГ и монометокси-ПЭГ. Кроме того, они могут быть линейными или разветвленными [Wang, Y.S., et al., Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54 (4): p. 547-70). Размеры используемых молекул ПЭГ могут меняться и фрагменты ПЭГ в диапазоне размеров от 1 до 40 кДа присоединяли к белкам [Wang, Y.S., et al., Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54 (4): p. 547-70., Sato, H., Enzymatic procedure for site-specific pegylation of proteins. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54 (4): p. 487-504, Bowen, S., et al., Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein. Exp Hematol, 1999. 27 (3): p. 425-32, Chapman, A.P., et al.. Therapeutic antibody fragments with prolonged in vivo half-lives. Nat Biotechnol, 1999. 17 (8): p. 780-3]. Кроме этого, может меняться число фрагментов ПЭГ, присоединенных к белку, и были описаны примеры, содержащие от одного до шести фрагментов ПЭГ, присоединенных к белкам [Wang, Y.S., et al., Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54 (4): p. 547-70., Bowen, S., et al., Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein. Exp Hematol, 1999. 27 (3): p. 425-32]. Кроме того, использовались присутствие или отсутствие линкера между ПЭГ, а также различные реакционноспособные группы для конъюгации. Таким образом, ПЭГ может быть присоединен к N-концевым аминогруппам, или к аминокислотным остаткам с реакционноспособными амино- или гидроксильными группами (Lys, His, Ser, Thr и Tyr) непосредственно или с применением γ-аминомасляной кислоты в качестве линкера. Кроме этого, ПЭГ может быть присоединен к карбоксильным (Asp, Glu, С-концевым) или сульфгидрильным (Cys) группам. Наконец, остатки Gln могут быть специфически пегилированы с применением фермента трансглутаминазы и были описаны алкиламиновые производные ПЭГ [Sato, H., Enzymatic procedure for site-specific pegylation of proteins. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54 (4): p. 487-504].

Было показано, что увеличение степени пегилирования приводит к повышенному in vivo периоду полувыведения. Однако квалифицированным специалистам будет понятно, что процесс пегилирования будет требовать оптимизации для конкретного полипептида антитела на индивидуальной основе.

PEG может быть присоединен по природным дисульфидным связям, как описано в WO 2005/007197, описание которого включено в данный документ в качестве ссылки. Дисульфидные связи могут быть стабилизированы путем добавления химического мостика, который не оказывает нежелательного влияния та третичную структуру белка. Это позволяет использовать селективность конъюгирующего тиола к двум атомам серы. составляющим дисульфидную связь для создания мостика с сайтом специфического присоединения ПЭГ. Таким образом можно избежать необходимости введения в пептид методами генетической инженерии остатков для присоединения целевых молекул.

Различные альтернативные блок-сополимеры также могут быть ковалентно конъюгированы, как описано в WO 2003/059973, описание которого включено в данный документ в качестве ссылки. Терапевтические полимерные конъюгаты могут демонстрировать улучшенные тепловые свойства, кристаллизацию, адгезию, набухание, кроющие свойства, рН-зависимую конформацию и биораспределение. Кроме того, они могут обеспечивать более продолжительную циркуляцию, высвобождение биоактивного вещества в протеолитической и кислотной среде вторичной лизосомы после поглощения клеткой конъюгата путем пинопитоза и более благоприятные физико-химические свойства благодаря характеристикам больших молекул (например, повышенная растворимость лекарственного средства в биологических жидкостях). Ко-блок-сополимеры, содержащие гидрофильные и гидрофобные блоки, образуют в растворе полимерные мицеллы. После диссоциации мицеллы, индивидуальные молекулы блок-сополимера безопасно выводятся из организма.

(b) Гибридные белки

В тех случаях, когда изобретение содержит или иначе основано на использовании миметика антитела (см. выше), следующие типы гибридного белка могут быть пригодными для увеличения периода полувыведения in vivo.

Гибридные белки IgG

Молекулы человеческого иммуноглобулина G (IgG) имеют период полувыведения из циркуляции приблизительно 20 дней. Fc-фрагменты молекул IgG широко использовались для создания гибридных белков, состоящих из Fc-фрагмента и белка с терапевтической применимостью. Такие гибридные белки демонстрируют увеличенный период полувыведения по сравнению с их аналогами, не содержащими Fc-фрагментов. Например, эта стратегия была использована для разработки этанерцепта, противоревматического лекарственного средства, состоящего из гибридного белка, образованного растворимым рецептором человеческого фактор некроза опухоли р75 и Fc-фрагментом человеческого IgG [Goldenberg, M.M., Etanercept, a novel drug for the treatment of patients with severe, active rheumatoid arthritis. Clin Ther, 1999. 21 (1): p. 75-87; discussion 1-2, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки].

Связанные с Fc белки получают путем создания гибридных белков из Fc и антигенсвязывающей области полипептида, представляющего интерес, в соответствии со стандартными протоколами генной инженерии. Fc-группа сливается с С-концом белка, представляющего интерес. Благодаря присутствию остатков цистеина в шарнирной области IgG, гибридные белки Fc экспрессируются в виде соединенных дисульфидными связями гомодимеров. Это дополнительно увеличивает их эффективный размер и период полувыведения из циркуляции. Кроме этого, гомодимерные конструкты могут иметь повышенную функциональную активность благодаря улучшенной авидности по отношению к их рецептору/лиганду по сравнению с соответствующей мономерной формой.

Гибридные белки человеческого сывороточного альбумина

Человеческий сывороточный альбумин (HSA) является самым распространенным природным белком крови в циркуляции и имеет период полувыведения, равный 19 дням [Osborn, B.L., et al., Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in monkeys. J Pharmacol Exp Ther, 2002. 303 (2): p. 540-8, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки]. Таким образом, HSA является пригодным партнером для слияния при создании гибридных белков с улучшенным периодом полувыведения. Гибридные белки HSA демонстрируют более продолжительный период полувыведения благодаря способности HSA стабилизировать белок по отношению к протеолизу и увеличению времени пребывания в организме [Veronese, F.M. and J.M. Harris, Introduction and overview of peptide and protein pegylation. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54 (4): p. 453-6]. Были получены гибридные белки HSA, включая IL-2, IFN-α и -β и гормон роста (GH), и продемонстрировали улучшенные фармакокинетические свойства. Албуферон (HSA-IFNα) и албутропин (HSA-GH) демонстрируют периоды полувыведения, которые у яванского макака в 18 и 6 раз, соответственно, превышают показатели для соответствующих аналогов, не имеющих HSA-группы [Osborn, B.L., et al., Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in monkeys. J Pharmacol Exp Ther, 2002. 303 (2): p. 540-8, Osborn, B.L., et al., Albutropin: a growth hormone-albumin fusion with improved pharmacokinetics and pharmacodynamics in rats and monkeys. Eur J Pharmacol, 2002. 456 (1-3): p. 149-58].

HSA-связанные белки получают путем создания гибридных белков из HSA и белка, представляющего интерес, в соответствии со стандартными протоколами генной инженерии. Группа HSA может быть присоединена к N- или к С-концу. Поскольку модификация присоединяется к концу белка, риск влияния на структуру белка и, тем самым, его функцию, значительно ниже, по сравнению с модификациями, такими как пегилирование, во внутренней части белка. Кроме этого, повышаются шансы избежать воздействия на активный сайт белка благодаря тому, что группа HSA может быть присоединена к N- или С-концу белка, представляющего интерес [Osborn, B.L., et al., Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in monkeys. J Pharmacol Exp Ther, 2002. 303 (2): p. 540-8, Osborn, B.L., et al., Albutropin: a growth hormone-albumin fusion with improved pharmacokinetics and pharmacodynamics in rats and monkeys. Eur J Pharmacol, 2002. 456 (1-3): p. 149-58, Syed, S., K.E. Kelly, и W.P. Sheffield, Inhibition of thrombin by hirudin genetically fused to wild-type or mutant antithrombin. Thromb Res, 1996. 84 (6): p. 419-29], в зависимости от того, какой из вариантов с большей вероятностью даст гибридный белок с сохраненной биологической активностью. Таким образом, в случае албуферона и албутропина, С-конец HSA соединяли с N-концом IFN-α или GH, соответственно, (для) создания функционально активного гибридного белка гирудин-HSA, группу HSA нужно было присоединить к С-концу гирудина. Эти результаты показывают, что свойства белка-мишени определяют, связывание с N- или С-концом будет оптимальным.

(с) Гликозилирование

Было показано, что введение в белок новых содержащих сиаловую кислоту углеводов (гликотехнология) улучшает in vivo период полувыведения. Этот способ может быть использован для природно гликозилированных белков или для белков, которые нормально не содержат гликозилирования [Elliott, S., et al.. Enhancement of therapeutic protein in vivo activities through glycoengineering. Nat Biotechnol, 2003. 21 (4): p. 414-21, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки],

Гликозилирование белков может осуществляться в форме N-связанных или O-связанных углеводов. N-связанные углеводы типично присоединены к консенсусным последовательностям (Asn-X-Ser/Thr), где Х обозначает любую аминокислоту за исключением пролина. O-гликозилирование проходит по остаткам Ser/Thr.

Для продуцирования гликозилированных белков может быть необходимо введение новых сайтов гликозилирования. Для протекания гликозилирования, экспрессия может проводиться в клеточных системах дрожжей, насекомых или млекопитающих. Однако характер гликозилирования в дрожжевых клетках отличается от клеток млекопитающих, давая гипергликозилированные белки, ассоциированные с риском повышенной иммуногенности. В отличие от них, клетки насекомых могут быть предпочтительными, поскольку характер гликозилирования является схожим с клетками млекопитающих, в то время как клеточные циклы являются более короткими и потому процесс экспрессии протекает быстрее. Дарбэпоэтин-α является примером модифицированного человеческого эритропоэтина, экспрессированного в клетках СНО. Он содержит два дополнительных сайта N-гликозилирования, в результате чего период полувыведения in vivo увеличивается в три раза [Elliott, S., et al., Enhancement of therapeutic protein in vivo activities through giycoengineering. Nat Biotechnol, 2003. 21 (4): p. 414-21].

Альтернативным способом гликозилирования является химическое присоединение углеводных групп к белкам. В этом способе, белок экспрессируется голым, например в Е. coli. После экспрессии и очистки, белок гликозилируют с помощью полностью синтетического бесклеточного процесса. Этот способ предлагает большую гибкость по показателям числа, размеров и типа присоединяемых углеводов.

(d) Ацилирование жирными кислотами/миристоилирование

Жирные кислоты обладают высокой аффинностью и высокой способностью к связыванию HSA. Эта характеристика может быть использована для улучшения периода полувыведения белков. Таким образом, жирный ацил может быть присоединен к аминокислотам белков, с образованием в результате этого белков, ацилированных жирным ацилом. После попадания в циркуляцию, группа жирного ацила способна связываться с циркулирующим HSA, что приводит к улучшению in vivo периода полувыведения белка.

Этот способ использовался для разработки инсулина детемир (Insulin detemir), который ацилировали жирным ацилом миристатом в положении Lys^B29 путем обработки инсулина сложными эфирами жирной кислоты гидроксил-сукцинимида в диметилформамиде/ДМСО [Kurtzhals, P., et al., Albumin binding of insulins acylated with fatty acids: characterization of the ligand-protein interaction and correlation between binding affinity and timing of insulin effect in vivo. Biochem J, 1995. 312 (Pt 3): p. 725-31, Hamilton-Wessler, M., et al., Mechanism of protracted metabolic effects of fatty acid acylated insulin, NN304, in dogs: retention of NN304 by albumin. Diabetologia, 1999. 42 (10): p. 1254-63, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок]. В результате этого получили аналог инсулина с увеличенным in vivo периодом полувыведения благодаря связыванию с HSA.

(е) Декстран

Декстран обеспечивает иммобилизацию белка, что приводит к медленному высвобождению и тем самым улучшает период полувыведения белка. Декстран-стрептокиназа выпускается в России для тромболитической терапии. Кроме этого, инсулин, соматостатин (который используется для терапии и диагностики опухолей, экспрессирующих рецепторы соматостатина) и инактивирующее рибосомы лекарственное средство трихосантин, конъюгированные с декстраном, имеют значительно улучшенные периоды полувыведения [Baudys, M., et al., Extending insulin action in vivo by conjugation to carboxymethyl dextran. Bioconjug Chem, 1998. 9 (2): p. 176-83, Chan, W.L., et al., Lowering of trichosanthin immunogenicity by site-specific coupling to dextran. Biochem Pharmacol, 1999. 57 (8): p. 927-34, Wulbrand, U., et al., A novel somatostatin conjugate with a high affinity to all five somatostatin receptor subtypes. Cancer, 2002. 94 (4 Suppi): p. 1293-7, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок].

Помимо фармацевтических средств на основе белков, декстран использовался для улучшения периода полувыведения антибиотиков и цитотоксических лекарственных средств [Yura, H., et al., Synthesis and pharmacokinetics of a novel macromolecular prodrug of Tacrolimus (FK506), FK506-dextran conjugate. J Control Release, 1999. 57 (1): p. 87-99, Nakashima, M., et al., In vitro characteristics and in vivo plasma disposition of cisplatin conjugated with oxidized and dicarboxymethylated dextrans. Biol Pharm Bull, 1999. 22 (7): p. 756-61, Kim, D.S., Y.J. Jung, and Y.M. Kim, Synthesis and properties of dextran-linked ampicillin. Drug Dev Ind Pharm, 2001. 27 (1): p. 97-101, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок],

Конъюгация декстрана осуществляется путем восстановительного аминирования с применением периодат-активируемого декстрана или путем использования цианогенбромида [Wulbrand, U., et al., A novel somatostatin conjugate with a high affinity to all five somatostatin receptor subtypes. Cancer, 2002. 94 (4 Suppl): p. 1293-7, Kim, D.S., Y.J. Jung, and Y.M. Kim, Synthesis and properties of dextran-linked ampicillin. Drug Dev Ind Pharm, 2001. 27 (1): p. 97-101, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок]. Используемый декстран может иметь различные размеры, и использовался декстран в диапазоне от 9 до 82 кДа [Kim, D.S., Y.J. Jung, and Y.M. Kim, Synthesis and properties of dextran-linked ampicillin. Drug Dev Ind Pharm, 2001. 27(1): p. 97-101, Behe, M., et al., Biodistribution, blood half-life, and receptor binding of a somatostatin-dextran conjugate. Med Oncol, 2001. 18 (1): p. 59-64, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок].

Помимо улучшения периода полувыведения лекарственных средств, конъюгация с декстраном может также снижать иммуногенность [Chan, W.L., et al., Lowering of trichosanthin immunogenicity by site-specific coupling to dextran. Biochem Pharmacol, 1999. 57 (8): р. 927-34, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки].

Таким образом, в одном варианте реализации первого аспекта изобретения, полипептид по изобретению представляет собой или содержит "гибридный" полипептид.

Следует понимать, что помимо слияния с фрагментом для улучшения фармакокинетических свойств, полипептид по изобретению также может быть слитым с полипептидом, таким как глутатион-S-трансфераза (GST) или белок А, для облегчения очистки указанного полипептида. Примеры таких слияний хорошо известны квалифицированным специалистам в данной области техники. Аналогично, указанный полипептид может быть слитым с олиго-гистидиновой меткой, такой как His6, или с эпитопом распознаваемым антителом, таким как хорошо известный эпитоп метки Мус. Слияния с любым вариантом или производным указанного полипептида также включены в объем изобретения. Следует понимать, что продукты слияния (или их варианты, производные или продукты слияния), сохраняющие или улучшающие желательные свойства, такие как способность связывания IL-1R или in vivo период полувыведения, являются предпочтительными.

Таким образом, продукт слияния может содержать аминокислотную последовательность, как описано выше, вместе с дополнительным участком, который придает желательный признак указанному полипептиду по изобретению; например, участок может быть полезным для детектирования или выделения полипептида, или способствовать поглощению полипептида клетками. Такой участок может быть, например, биотиновым фрагментом, радиоактивным фрагментом, флуоресцентным фрагментом, например, малым флуорофором или флуорофором зеленого флуоресцентного белка (GFP), как хорошо известно квалифицированным специалистам в данной области техники. Фрагмент может быть иммуногенной меткой, например, меткой Мус, как известно квалифицированным специалистам в данной области техники, или могут быть липофильной молекулой или полипептидным доменом, который способен промотировать клеточное поглощение полипептида, как известно квалифицированным специалистам в данной области техники.

Квалифицированным специалистам будет понятно, что полипептиды антитела по изобретению могут содержать или состоят из одной или нескольких аминокислот, которые были модифицированы или дериватизированы.

Химические производные одной или нескольких аминокислот может быть получены путем реакции с функциональной боковой группой. Такие дериватизированные молекулы включают, например, молекулы, в которых свободные аминогруппы были дериватизированы с образованием гидрохлоридов амина, n-толуолсульфонильных групп, карбоксибензокси групп, m-бутилоксикарбонильных групп, хлорацетильных групп или формильных групп. Свободные карбоксильные группы могут быть дериватизированы с образованием солей, метиловых и этиловых сложных эфиров или других типов сложных эфиров и гидразидов. Свободные гидроксильные группы могут быть дериватизированы с образованием O-ацильных или O-алкильных производных. Также включены в качестве химических производных пептиды, которые сохраняют природные аминокислотные производные двадцати стандартных аминокислот. Например: 4-гидроксипролин может быть замещен на пролин; 5-гидроксилизин может быть замещен на лизин; 3-метилгистидин может быть замещен на гистидин; гомосерин может быть замещен на серии, и орнитин - на лизин. Производные также включают пептиды, содержащие одну или несколько аддиций или делений, при условии, что сохраняется требуемая активность. Другими включенными модификациями являются амидирование, ацилирование терминальной аминогруппы (например, ацетилирование или амидирование тиогликолевой кислотой), карбоксиламидирование терминальных групп (например, аммиаком или метиламином), и подобные модификации терминальных групп.

Квалифицированным специалистам будет также понятно, что соединения - пептидомиметики также могут быть полезными. Термин "пептидомиметик" относится к соединению, которое имитирует конформацию и желательные характеристики конкретного пептида как терапевтического агента.

Например, указанный полипептид включает не только молекулы, в которых аминокислотные остатки соединены пептидными (-CO-NH-) связями, но также молекулы, в которых пептидная связь имеет обратную ориентацию. Такие ретроинверсные пептидомиметики могут быть приготовлены с применением способов, известных специалистам, например, таких как описанные в Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, которая включена в данный документ в качестве ссылки. Этот подход предусматривает приготовление псевдопептидов, содержащих изменения, затрагивающие основную цепь, а не ориентацию боковых цепей. Ретроинверсные пептиды, содержащие связи NH-CO вместо пептидных связей CO-NH, являются гораздо более устойчивыми к протеолизу. Альтернативно, указанный полипептид может быть соединением - пептидомиметиком, в котором один или несколько аминокислотных остатков соединены связью -y(CH₂NH)- вместо обычной амидной связи.

В качестве дополнительной альтернативы, пептидная связь может отсутствовать полностью, при условии, что используется соответствующий линкерный фрагмент, который поддерживает расстояние между атомами углерода аминокислотных остатков; может быть предпочтительным, чтобы линкерный фрагмент имел по существу такое же распределение заряда, и по существу такую же планарность, как и пептидная связь.

Следует также понимать, что указанный полипептид можно удобно заблокировать на его N- или С-конце для снижения чувствительности к экзо-протеолитическому гидролизу.

Различные некодируемые или модифицированные аминокислоты, такие как D-аминокислоты и N-метиламинокислоты, также использовались для модификации пептидов млекопитающих. Кроме этого, предполагаемая биоактивная конформация может быть стабилизирована с помощью ковалентной модификации, такой как циклизация, или путем включения лактама или других типов мостиковых связей, например, см. Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 2636 и Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111: 166, которые включены в данный документ в качестве ссылок.

Полипептиды антитела по изобретению могут быть дополнены функциональным фрагментом, способствующим их предполагаемому применению, например, в качестве диагностического (например, in vivo визуализация) агента или терапевтического агента. Таким образом, в одном варианте реализации, полипептид антитела соединен, прямо или опосредованно, с терапевтическим фрагментом.

В одном варианте реализации, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предшествующих притязаний дополнительно содержит терапевтический (например цитотоксический) фрагмент.

Может быть использован любой пригодный терапевтический фрагмент. Пригодным терапевтическим фрагментом является фрагмент, способный уменьшать или ингибировать рост, или, в частности, убивать раковые клетки (или ассоциированные стволовые клетки или клетки-предшественники). Например, терапевтический агент может быть цитотоксическим фрагментом. Цитотоксический фрагмент может содержать или состоять из одного или нескольких радиоизотопов. Например, один или несколько радиоизотопов могут быть, каждый независимо, выбраны из группы, состоящей из бета-излучателей, оже-излучателей, излучателей конверсионных электронов, альфа-излучателей, и излучателей низкоэнергетических фотонов. Может быть желательным, чтобы один или несколько радиоизотопов каждый независимо имели эмиссионную картину локально поглощенной энергии, которая создает высокую поглощенную дозу вблизи агента. Типичные примеры радиоизотопов могут включать дальнодействующие бета-излучатели, такие как ⁹⁰Y, ³²P, ¹⁸⁶Re/¹⁸⁸Re; ¹⁶⁶Ho, ⁷⁶As/⁷⁷As, ⁸⁹Sr, ¹⁵³Sm; бета-излучатели среднего радиуса действия, такие как ¹³¹l, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁷Cu, ¹⁶¹Tb, ^l05Rh; низкоэнергетические бета-излучатели, такие как ⁴⁵Са или ³⁵S; конверсионные или оже-излучатели, такие как ⁵¹Cr, ⁶⁷Ga, ⁹⁹Tc^m, ¹¹¹In, ^114mln, ¹²³l, ¹²⁵l, ²⁰¹TI; и альфа-излучатели, такие как ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²²³Ас, ²²⁵Ас, ²¹²Pb, ²⁵⁵Fm, ²²³Ra, ¹⁴⁹Tb и ²²¹At. Другие радионуклиды являются доступными и могут быть использованы в терапии.

В одном предпочтительном варианте реализации, полипептид антитела связан с (или иначе помечен) радиоизотопом ¹⁷⁷Lu.

Альтернативно, терапевтический фрагмент может содержать или состоять из одного или нескольких терапевтических (таких как цитотоксических) лекарственных средств, например, цитостатического лекарственного средства; антиандрогенного лекарственного средства; кортизона и его производных; фосфоната; ингибитора тестостерон-5-α-редуктазы; адденда бора; цитокина; тапсигаргина и его метаболитов; токсина (такого как сапорин или калихеамицин); химиотерапевтического агента (такого как антиметаболит); или любого другого терапевтического или цитотоксического лекарственного средства, полезного при лечении раков.

Типичные примеры терапевтических/цитотоксических лекарственных средств могут, например, включать:

- Цитостатики, в частности, имеющие ограничивающие дозу побочные эффекты, включая, без ограничения, циклофосфамид (cyclophosamide), хлорамбуцил, ифосфамид, бусульфан, ломустин, таксаны, эстрамустин фосфат и другие азотистые иприта, антибиотики (включая доксорубицин, калихеамицины и эсперамицин), алкалоиды барвинка, азаридины, платина-содержащие соединения, эндостатин, алкилсульфонаты, нитрозомочевины, триазены, аналоги фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина, ферменты, замещенную мочевину, производные метилгидразина, даунорубицин, амфипатические амины,

- Антиандрогены, такие как флутамид и бикалутамид и их метаболиты;

- Кортизон и его производные;

- Фосфонаты, такие как дифосфонат (diphophonate) и буфосфонат (buphosphonate);

- ингибиторы тестостерон-5-α-редуктазы;

- Адденды бора;

- Цитокины;

- Тапсигаргин и его метаболиты.

Альтернативно, питотоксический фрагмент может содержать или состоять из одного или нескольких фрагментов, пригодных для использования в активапионной терапии, такой как фотонная активационная терапия, нейтронная активационная терапия, нейтрон-индуцированная оже-электронная терапия, терапия синхротронного излучения или активационная терапия низкоэнергетических рентгеновских фотонов.

Например, для полипептидов антитела по изобретению будет существовать потенциал использования синхротронного излучения (или низкоэнергетических рентгеновских лучей) для улучшения лучевой терапии, в первую очередь, с фокусировкой на так называемой фотоактивационной лучевой терапии (PAT), в которой локальное выделение энергии при внешнем ретгеновском облучении усиливается в раковой ткани за счет взаимодействия с предварительно введенным высокоимпедансным (high-Z) нацеливающим на опухоль агентом.

Модальность лечения PAT использует монохроматические рентгеновские лучи из синхротронного источника, такие как обеспечиваемые биомедицинским пучком (biomedical beamline) ID 17 в Европейском источнике синхротронного излучения (European Synchrotron Radiation Facility, ESRF) в Гренобле (Grenoble) и, как предполагается, доступные в будущем из других источников, таких как новый шведский синхротронный источник Max-IV.

Исследования "индуцированной оже-электронной терапии опухолей", которые будут проводиться на строящемся Европейском источнике расщепления (European Spallation Source, ESS) в Лунде (Lund), обеспечат дополнительные потенциальные модальности лечения. Продуцируемые в реакторах тепловые и полутепловые нейтроны уже давно используются для нейтрон-захватной терапии на основе бора (BNCT), как для предклинических экспериментов, так и для лечения опухолей мозга с помощью индуцированных альфа-частиц и ядер отдачи (⁷L) дающих высокую локально поглощенную энергию. Аналогичный подход заключается в использовании нейтронов и пригодных нацеливающих на опухоль молекул, меченых стабильными ядрами с высоким сечением захвата нейтронов. Антитела или пептиды, например, могут быть помечены стабильным гадолинием (¹⁵⁷Gd) и выступать в роли молекулы-мишени для нейтронов, захватываемых Gd-ядром, так называемая гадолиниевая нейтрон-захватная терапия (GdNCT). Используя метод Монте-Карло, рассчитывают распределение дозы в опухоли и окружающих тканях, создаваемой γ-фотонами, нейтронами, отдачами ядер, а также характеристическими рентгеновскими лучами, внутренними конверсионными и оже-электронами гадолиния или других потенциальных элементов.

Необязательно, полипептид антитела по изобретению может дополнительно содержать детектируемый фрагмент. Например, детектируемый фрагмент может содержать или состоять из радиоизотопа, такого как радиоизотоп, выбранный из группы, состоящей из ^99mTc, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr, ¹²³l и ²⁰¹TI. Необязательно, агент может содержать пару детектируемых и цитотоксических радионуклидов, такую как ⁸⁶Y/⁹⁰Y или ¹²⁴l/²¹¹At. Альтернативно, полипептид антитела может содержать радиоизотоп, способный оказывать одновременно многомодальное воздействие как детектируемый фрагмент, а также как цитотоксический фрагмент для обеспечения так называемой "мультимодальной терагностики" (multimodality theragnostics). Связывающие фрагменты могут, таким образом, быть сопряжены с наночастицами, обладающими способностью к мультивизуализации (например, SPECT (однофотонная эмиссионная компьютерная томография), PET (позитронно-эмиссионная томография), MRI (магнитно-резонансная томография), оптическая или ультразвуковая) вместе с терапевтической способностью к использованию цитотоксических лекарственных средств, таких как радионуклиды или химиотерапевтические агенты.

Альтернативно, детектируемый фрагмент может содержать или состоять из парамагнитного изотоп, такого как парамагнитный изотоп, выбранный из группы, состоящей из ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr и ⁵⁶Fe.

В случае, когда полипептид антитела содержит детектируемый фрагмент, этот детектируемый фрагмент может детектироваться с помощью методики визуализации, такой как SPECT, PET, MRI, оптическая или ультразвуковая визуализация.

Терапевтические и/или детектируемые фрагменты (такие как радиоизотоп, цитотоксический фрагмент и т.п.) могут быть присоединены напрямую, или опосредованно, у антителу или его фрагменту. Пригодные линкеры известны специалистам и включают, например, простетические группы, нефенольные линкеры (производные N-сукцимидилбензоатов; додекаборат), хелатирующие фрагменты как макроциклических, так и ациклических комплексонов, таких как производные 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота (DOTA), дефероксамин (DFO), производные диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), производные S-2-(4-изотиоцианатобензил)-1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусной кислоты (NOTA), и производные 1,4,8,11-тетраазациклододекан-1,4,8,11-тетрауксусной кислоты (ТЕТА), производные 3,6,9,15-тетраазабицикло[9.3.1]-пентадека-1(15),11,13-триен-4-(S)-(4-изотиоцианатобензил)-3,6,9-триуксусной кислоты (РСТА), производные 5-S-(4-аминобензил)-1-окса-4,7,10-триазациклододекан-4,7,10-трис(уксусной кислоты) (DO3А) и другие хелатирующие фрагменты.

Одним из предпочтительных линкеров является DTPA, например, как используется в ¹⁷⁷Lu-DTPA-[полипептид антитела по изобретению]. Дополнительным предпочтительным линкером является, DFO, например, как используется в ⁸⁹Zr-DFO-[полипептид антитела по изобретению]. не будут требовать

Однако квалифицированным специалистам будет понятно, что некоторые медицинские применения полипептидов антитела по изобретению не будут требовать присутствия цитотоксического или диагностического фрагмента.

Таким образом, в тех случаях, когда терапевтический эффект антитела по изобретению медиируется ингибированием сигнализации IL-1 (или сигнализации IL-33 и/или IL-36), может быть пригодным "голый" полипептид антитела. Например, если терапевтический эффект медиируется прямым воздействием антитела по изобретению на иммунные клетки, например для уменьшения воспаления, может быть предпочтительным, чтобы антитело не проявляло никакой цитотоксической активности.

Как описано выше, способы продуцирования полипептидов антитела по изобретению хорошо известны специалистам.

Удобно, полипептид антитела представляет собой или содержит рекомбинантный полипептид. Пригодные способы продуцирования таких рекомбинантных полипептидов хорошо известны специалистам, такие как экспрессия в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах (например, см. Green & Sambrook, 2012, молекулярн Cloning, A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor, New York, соответствующие описания в данном документе настоящим включены сюда в качестве ссылок).

Полипептиды антитела по изобретению также могут быть получены с применением коммерчески доступной in vitro системы трансляции, такой как лизат ретикулоцитов кролика или лизат пшеничных зародышей (доступны от фирмы Promega). Предпочтительно, системой трансляции является лизат ретикулоцитов кролика. Для удобства, система трансляции могут быть сопряжена с системой транскрипции, такой как система транскрипции-трансляции TNT (Promega). Эта система обладает преимуществом продуцирования пригодного транскрипта мРНК из кодирующего ДНК полинуклеотида в той же реакции, что и трансляции.

Квалифицированным специалистам будет понятно, что полипептиды антитела по изобретению могут альтернативно быть синтезированы искусственно, например, с применением хорошо известных методов жидкофазного или твердофазного синтеза (таких как t-Вос или Fmoc твердофазный пептидный синтез).

Второй аспект изобретения предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент по первому аспекту изобретения, или компонент его полипептидной цепи. В понятие "молекула нуклеиновой кислоты" мы включаем ДНК (например геномную ДНК или комплементарную ДНК) и молекулы мРНК, которые могут быть одно- или двухцепочечными. Под "выделенный" мы понимаем, что молекула нуклеиновой кислоты не расположена или иначе не находится внутри клетки.

В одном варианте реализации, молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу кДНК.

Квалифицированным специалистам будет понятно, что молекула нуклеиновой кислоты может быть оптимизирована по использованию кодонов для экспрессии полипептида антитела в конкретной клетке-хозяине, например для экспрессии в человеческих клетках (например, см. Angov, 2011, Biotechnol. J. 6 (6): 650-659, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки).

В объем изобретения также включено следующее:

(a) третий аспект изобретения предусматривает вектор (такой как экспрессионный вектор) содержащий молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом изобретения:

(b) четвертый аспект изобретения предусматривает клетку-хозяина (такую как клетку млекопитающего, например клетку человека, или клетку яичника китайского хомячка, например клетки CHOK1SV), содержащую молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом изобретения или вектор в соответствии с третьим аспектом изобретения; и

(c) пятый аспект изобретения предусматривает способ получения полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения, включающий культивирование популяции клеток-хозяев в соответствии с четвертым аспектом изобретения в условиях, при которых экспрессируется указанный полипептид, и выделение из нее полипептида.

Шестой аспект изобретения предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с первым аспектом изобретения и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, адъювант или эксципиент.

Квалифицированным специалистам будет понятно, что дополнительные соединения также могут быть включены в фармацевтические композиции, включая, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, цитрат, EGTA или глутатион.

Фармацевтические композиции могут быть получены способами, известными специалистам, являются достаточно стабильными при хранении и пригодны для введения человеку и животным. Например, фармацевтические композиции могут быть лиофилизированы, например, путем сушки вымораживанием, распылительной сушки, охлаждения разбрызгиванием (spray cooling), или путем использования образования частиц из (методов) сверхкритического образования частиц.

Под "фармацевтически приемлемый" мы понимаем нетоксичный материал, который не снижает эффективность IL1RAP-связывающей активности полипептида антитела по изобретению. Такие фармацевтически приемлемые буферы, носители или эксципиенты хорошо известны специалистам (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000), описания которых включены в данный документ в качестве ссылок).

Термин "буфер" должен обозначать водный раствор, содержащий кислотно-основную смесь с целью стабилизации рН. Примерами буферов являются Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, фосфат, карбонат, ацетат, цитрат, гликолят, лактат, борат, ACES, ADA, тартрат, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, какодилат, CHES, DIPSO, EPPS, этаноламин, глицин, HEPPSO, имидазол, имидазолмолочная кислота, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO и TES.

Термин "разбавитель" должен обозначать водный или неводный раствор с целью разбавления полипептида антитела в фармацевтическом препарате. Разбавитель может быть одним или несколькими из солевого раствора, воды, полиэтиленгликоля, пропиленгликоля, этанола или масел (таких как сафлоровое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло или кунжутное масло).

Термин "адъювант" должен обозначать любое соединение, добавляемое к композиции для увеличения биологического эффекта полипептида антитела по изобретению. Адъювант может быть одним или несколькими веществами из солей цинка, меди или серебра с разными анионами, например,, без ограничений, фторидом, хлоридом, бромидом, йодидом, тиоцианатом, сульфитом, гидроксидом, фосфатом, карбонатом, лактатом, гликолятом, цитратом, боратом, тартратом, и ацетатами с разными по составу ацилами. Адъювант также может быть катионными полимерами, такими как катионные простые эфиры целлюлозы, катионные сложные эфиры целлюлозы, деацетилированная гиалуроновая кислота, хитозан, катионные дендримеры, катионные синтетические полимеры, такие как полиу(винилимидазол), и катионные полипептиды, такие как полигистидин, полилизин, полиаргинин, и пептиды, содержащие такие аминокислоты.

Эксципиент может быть одним или несколькими веществами из углеводов, полимеров, липидов и минеральных веществ. Примеры углеводов включают лактозу, глюкозу, сахарозу, маннит и циклодекстрины, которые добавляют к композиции, например, для облегчения лиофилизации. Примерами полимеров являются крахмал, простые эфиры целлюлозы, целлюлоза карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, альгинаты, каррагенаны, гиалуроновая кислота и ее производные, полиакриловая кислота, полисульфонат, полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид, сополимеры полиэтиленоксида/полипропиленоксида, поливиниловый спирт/поливинилацетат с разными степенями гидролиза, и поливинилпирролидон, все с разными молекулярными весами, которые добавляют в композицию, например, для контроля вязкости, для обеспечения биоадгезии, или для защиты липида от химической и протеолитической деградации. Примерами липидов являются жирные кислоты, фосфолипиды, моно-, ди- и триглицериды, церамиды, сфинголипиды и гликолипиды, все с разными длинами ацильных цепей и насыщенностью, яичный лецитин, соевый лецитин, гидрогенизированный яичный и соевый лецитин, которые добавляют в композицию по причинам, аналогичным указанным для полимеров. Примерами минеральных веществ являются тальк, оксид магния, оксид цинка и оксид титана, которые добавляют в композицию для получения полезных эффектов, таких как уменьшение накопления жидкости или благоприятные пигментные свойства.

Полипептиды антитела по изобретению могут быть введены в состав фармацевтической композиции любого типа, известного специалистам, пригодной для их доставки.

В одном варианте реализации, фармацевтические композиции по изобретению могут иметь форму липосомы, в которой полипептид антитела объединен, помимо других фармацевтически приемлемых носителей, с амфипатическими агентами, такими как липиды, которые существуют в агрегированных формах в виде мицелл, нерастворимых монослоев и жидких кристаллов. Пригодные липиды для приготовления липосом включают, без ограничения, моноглицериды, диглицериды, сульфатиды, лизолецитин, фосфолипиды, сапонин, желчные кислоты и т.п. Пригодные липиды также включают вышеуказанные липиды, модифицированные поли(этиленгликолем) в полярной головной группе для увеличения времени циркуляции в кровотоке. Приготовление таких липосомальных композиций описано, например, в US 4235871, описание которого включено в данный документ в качестве ссылки.

Фармацевтические композиции по изобретению также могут иметь форму биодеградируемых микросфер. Алифатические полиэфиры, такие как поли(молочная кислота) (PLA), поли(гликолевая кислота) (PGA), сополимеры PLA и PGA (PLGA) или поли(капролактон) (PCL), и полиангидриды широко используются в качестве биодеградируемых полимеров в получении микросфер. Получение таких микросфер описано в US 5851451 и ЕР 0213303, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок.

В дополнительном варианте реализации, фармацевтические композиции по изобретению имеют форму полимерных гелей, в которых полимеры, такие как крахмал, простые эфиры целлюлозы, целлюлоза карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, альгинаты, каррагенаны, гиалуроновая кислота и ее производные, полиакриловая кислота, поливинилимидазол, полисульфонат, полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид, сополимеры полиэтиленоксида/полипропиленоксида, поливиниловый спирт/поливинилацетат с разными степенями гидролиза, и поливинилпирролидон используют для загущения раствора, содержащего агент. Полимеры могут также содержать желатин или коллаген.

Альтернативно, полипептид антитела может быть просто растворен в солевом растворе, воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле или маслах (таких как сафлоровое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло или кунжутное масло), трагакантокой камеди, и/или различных буферах.

Следует понимать, что фармацевтические композиции по изобретению могут включать ионы и иметь определенное значение рН для потенцирование действия активного полипептида антитела. Дополнительно, композиции могут быть подвергнуты обычным фармацевтическим операциям, таким как стерилизация и/или могут содержать обычные адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, буферы, наполнители, и т.д.

Фармацевтические композиции в соответствии с изобретением могут быть введены любым пригодным путем, известным квалифицированным специалистам в данной области техники. Таким образом, возможные пути введения включают парентеральный (внутривенный, подкожный и внутримышечный), местный, глазной, назальный, легочный, буккальный, оральный, парентеральный, вагинальный и ректальный. Также возможно введение из имплантатов.

В одном предпочтительном варианте реализации, фармацевтические композиции вводят парентерально, например, внутривенно, интрацеребровентрикулярно, внутрисуставно, интраартериально, интраперитонеально, интратекально, интравентрикулярно, интрастернально, интракраниально, внутримышечно или подкожно, или они могут быть введены методами инфузии. Их удобно использовать в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, достаточное количество солей или глюкозы для приготовления раствора, изотонического с кровью. Водные растворы должны быть соответствующим образом забуферены (предпочтительно до рН от 3 до 9), при необходимости. Приготовление пригодных парентеральных композиций в стерильных условиях легко осуществляется с применением стандартных фармацевтических методик, хорошо известных квалифицированным специалистам в данной области техники.

Композиции, пригодные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и растворенные вещества, которые делают композицию изотонической с кровью предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты и загустители. Композиции могут находиться в однодозовых или многодозовых контейнерах, например, запечатанных ампулах и флаконах, и могут храниться в высушенном вымораживанием (лиофилизированном) состоянии, требующем только прибавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед применением. Приготовленные для немедленного применения растворы и суспензии для инъекций могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток, которые были описаны ранее.

Таким образом, фармацевтические композиции по изобретению являются особенно пригодными для парентерального, например, внутривенного, введения.

Альтернативно, фармацевтические композиции могут быть введены интраназально или путем ингаляции (например, в форме подачи аэрозольного спрея из находящегося под давлением контейнера, насоса, разбрызгивателя или распылителя с применением пригодного пропеллента, такого как дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, гидрофторалкан, такой как 1,1,1,2-тетрафторэтан (HFA 134A3 или 1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан (HFA 227EA3), двуокись углерода или другой пригодный газ). В случае находящегося под давлением аэрозоля, разовая доза может определяться путем обеспечения клапана для подачи отмеренного количества. Находящийся под давлением контейнер, насос, разбрызгиватель или распылитель может содержать раствор или суспензию активного полипептида, например, при использовании смеси этанола и пропеллента в качестве растворителя, который может дополнительно содержать смазывающее вещество, например, сорбитантриолеат. Капсулы и картриджи (сделанные, например, из желатина) для использования в ингаляторе или инсуфляторе могут быть приготовлены таким образом, чтобы они содержали порошкообразную смесь соединения по изобретению и пригодной порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.

Композиции аэрозоля или сухого порошка предпочтительно приготовлены таким образом, чтобы каждая мерная доза или "выброс" содержали по меньшей мере 1 мг соединения по изобретению для доставки пациенту. Следует понимать, что суммарная суточная доза для аэрозоля будет различаться для разных пациентов, и может быть введена в виде разовой дозы или, чаще, кратными дозами, распределенными в течение дня.

Альтернативно, полипептиды антитела по изобретению могут быть введены в форме суппозитория или пессария, или они могут применяться местно в форме примочки, раствора, крема, жидкой мази или присыпки. Соединения по изобретению также могут быть введены трансдермально, например, путем использования кожного пластыря. Они также могут быть введены глазным путем.

Для глазного применения, полипептиды антитела по изобретению могут быть приготовлены в виде микронизированных суспензий в изотоническом стерильном солевом растворе с заданным значением рН, или, предпочтительно, в виде растворов в изотоническом стерильном солевом растворе с заданным значением рН, необязательно в комбинации с консервантом, таким как бензилалкония хлоридом. Альтернативно, они могут быть приготовлены в виде жидкой мази, такой как вазелин.

Для местного применения на коже, полипептид антитела по изобретению может быть приготовлен в виде пригодной жидкой мази, содержащей активное соединение, суспендированное или растворенное, например, в смеси с одним или несколькими из следующих веществ: минеральное масло, вазелиновое масло, белый вазелин, пропиленгликоль, соединение полиоксиэтилена-полиоксипропилена, эмульгирующий воск и вода. Альтернативно, они могут быть приготовлены в виде пригодной примочки или крема, суспендированы или растворены, например, в смеси одного или нескольких из следующих веществ: минеральное масло, сорбитанмоностеарат, полиэтиленгликоль, жидкий парафин, полисорбат 60, воск на основе цетиловых сложных эфиров, петеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и вода.

Фармацевтические композиции будут вводиться пациенту в фармацевтически эффективной дозе. "Терапевтически эффективное количество", или "эффективное количество", или "терапевтически эффективный", в используемом в данном документе значении, относится к такому количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного состояния и схемы введения. Оно представляет собой предварительно определенное количество активного материала, рассчитанное на создание желательного терапевтического эффекта в сочетании с требуемыми добавками и разбавителем, т.е. носителем или средством для введения. Дополнительно, оно должно обозначать количество, достаточное для снижения и, наиболее предпочтительно, предотвращения, клинически значимого дефицита активности, функции и реакции хозяина. Альтернативно, терапевтически эффективное количество является достаточным для того, чтобы вызвать у хозяина улучшение при клинически значащем состоянии. Как понятно квалифицированным специалистам в данной области техники, количество соединения может меняться в зависимости от его специфической активности. Пригодные дозировки могут содержать предварительно определенное количество композиции активного вещества, рассчитанную на создание желательного терапевтического эффекта в сочетании с требуемым разбавителем. В способах производства и применения композиций по изобретению предусматривается терапевтически эффективное количество активного компонента. Терапевтически эффективное количество может быть определено медицинским или ветеринарным работником рядовой квалификации на основании характеристик пациента, таких как возраст, вес, пол, состояние, осложнения, другие болезни и т.д., как хорошо известно специалистам. Введение фармацевтически эффективной дозы может быть осуществлено как простым введением в виде индивидуальной единичной дозы, так и в виде нескольких меньших доз, а также путем многократного введения составных доз с определенными интервалами. Альтернативно, доза (the does) может быть обеспечена в виде непрерывной инфузии на протяжении длительного периода времени.

В контексте диагностического использования полипептидов антитела по изобретению, "фармацевтически эффективное количество", или "эффективное количество", или "диагностически эффективный", в используемом в данном документе значении, относится к такому количеству, которое обеспечивает детектируемый сигнал для диагностики, например, для in vivo визуализации.

Полипептиды антитела могут быть приготовлены в виде композиций с различными концентрациями, в зависимости от эффективности/токсичности используемого полипептида. Например, композиция может содержать активный полипептид антитела в концентрации от 0,1 мкМ до 1 мкМ, более предпочтительно, от 1 мкМ до 500 мкМ, от 500 мкМ до 1 мкМ, от 300 мкМ до 700 мкМ, от 1 мкМ до 100 мкМ, от 100 мкМ до 200 мкМ, от 200 мкМ лр 300 мкМ, от 300 мкМ до 400 мкМ, от 400 мкМ до 500 мкМ, от 500 мкМ до 600 мкМ, от 600 мкМ до 700 мкМ, от 800 мкМ до 900 мкМ или от 900 мкМ до 1 мкМ. Типично, композиция содержит активный полипептид антитела в концентрации от 300 мкМ до 700 мкМ.

Типично, терапевтическая доза полипептида антитела (с терапевтическим фрагментом или без него) для пациента-человека будет иметь значение в диапазоне от 100 мкг до 1 г на введение (в пересчете на вес тела 70 кг, например, от 300 мкг до 700 мг на введение). Например, максимальная терапевтическая доза может иметь значение в диапазоне от 0,1 до 10 мг/кг на введение, например, от 0,1 до 5 мг/кг или от 1 до 5 мг/кг или от 0,1 до 2 мг/кг. Следует понимать, что такая доза может быть введена с разными интервалами, которые определяются онкологом/врачем; например, доза может вводиться ежедневно, два раза в неделю, раз в неделю, раз в две недели или раз в месяц.

Квалифицированным специалистам будет понятно, что фармацевтические композиции по изобретению могут быть введены отдельно или в комбинации с другими терапевтическими агентами, используемыми при лечении раков, такими как антиметаболиты, алкилирующие агенты, антрациклины и другие цитотоксические антибиотики, алкалоиды (alkyloids) барвинка, этопозид, соединения платины, таксаны, ингибиторы топоизомеразы I, антипролиферативные иммунодепрессанты, контикостероиды, половые гормоны и антагонисты гормонов, и другие терапевтические антитела (такие как трастузумаб).

Квалифицированным специалистам будет также понятно, что полипептиды и фармацевтические композиции по настоящему изобретению пригодны для использования как в медицине, так и в ветеринарии. Таким образом, способы по изобретению могут быть использованы при лечении как человека, так и животных, не являющихся человеком (таких как лошади, собаки и кошки). Предпочтительно, однако, пациент является человеком.

Для ветеринарного применения, соединение по изобретению вводят в виде пригодно приемлемой композиции в соответствии с нормальной ветеринарной практикой и ветеринарный врач определяет схему лечения и путь введения, который будет наиболее пригодным для конкретного животного.

Седьмой аспект изобретения предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом изобретения для использования в медицине.

В одном варианте реализации, полипептиды антитела и композиции по изобретению могут быть использованы для лечения пациентов или особ, страдающих от, или с риском возникновения болезни или показания, для которого IL1RAP является биомаркером.

Таким образом, связанный с ним восьмой аспект изобретения предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом изобретения для использования в индуцировании гибели клеток и/или ингибировании роста и/или пролиферации патологических клеток, ассоциированных с неопластическим расстройством у субъекта, или стволовых клеток или их клеток-предшественников, причем эти клетки экспрессируют IL1RAP.

Дополнительный родственный девятый аспект изобретения предусматривает антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом изобретения для использования при лечении и/или диагностике неопластического расстройства у субъекта, где неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

В понятие "лечение" мы включаем как терапевтическое, так и профилактическое лечение пациента. Термин "профилактический" используется таким образом, чтобы он охватывал применение агента, или его композиции, как описано в данном документе, которые или предотвращают, или снижают вероятность неопластического расстройства, или распространение, диссеминацию, или метастазирование раковых клеток у пациента или субъекта. Термин "профилактический" также охватывает применение агента, или его композиции, как описано в данном документе, для предотвращения рецидивирования неопластического расстройства у пациента, который ранее получал лечение от неопластического расстройства.

В понятие "диагноз" мы включаем детектирование раковых клеток, будь то in vivo (т.е. в организме пациента) или ex vivo (т.e. в ткани или образце клеток, извлеченных из организма пациента).

В понятие "неопластическое расстройство, ассоциированное с клетками, экспрессирующими IL1RAP", мы включаем такие расстройства, при которых патологические клетки, вызывающие, прямо или косвенно, расстройство, экспрессируют IL1RAP на клеточной поверхности. Следует понимать, что клетки, экспрессирующие IL1RAP, могут быть раковыми клетками, например, клетками опухоли, per se. Кроме этого, такие клетки включают патологические стволовые клетки (т.е. раковые стволовые клетки, или CSC) и клетки-предшественники, ответственные, прямо или косвенно, за развитие неопластического расстройства у индивидуума. Примеры CSC раскрыт в Visvader & Lindeman, 2008, Nat Rev Cancer 8: 755-768, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки.

Альтернативно, или в дополнение к этому, клетки, экспрессирующие IL1RAP, могут быть ассоциированы опосредованно с неопластическим расстройством, например, они могут медиировать клеточные процессы, необходимые для выживания неопластических клеток. Агент на основе антитела по изобретению может в этом случае быть нацелен на клетки, существенные для кровоснабжения опухоли (ангиогенез), или на клетки, ингибирующие полезный иммунный ответ, направленный против злокачественных клеток (например, супрессорные макрофаги или Т-лимфоциты).

В зависимости от того, является ли терапевтически желательным уничтожение клеток-мишеней, экспрессирующих IL1RAP, могут быть использованы антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом изобретения, способные индуцировать ADCC. Например, в тех случаях когда клетки-мишени IL1RAP являются раковыми клетками (такими как клетки CML, AML, ALL, меланомы, рака легкого и т.д.), может быть предпочтительным, чтобы антитело или антигенсвязывающий фрагмент были способны индуцировать ADCC для уничтожения таких клеток. Однако, следует понимать, что терапевтический полезный эффект также может быть достигнут при использовании антитела или антигенсвязывающего фрагмента, не обладающих активностью ADCC, например, посредством ингибирования сигнализации IL-1 (или IL-33 или IL-36), приводящего к снижению ангиогенеза вблизи опухоли.

В одном варианте реализации, неопластическое расстройство представляет собой неопластическое гематологическое расстройство.

Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть предназначены для использования при лечении и/или диагностике неопластического расстройства, выбранного из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза (CML), миелопролиферативных расстройств (MPD), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфобластного лейкоза (ALL) и острого миелоидного лейкоза (AML).

В дополнительном варианте реализации, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент предназначены для использования при лечении и/или диагностике неопластического расстройства, ассоциированного с образованием солидных опухолей в организме субъекта.

Таким образом, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть предназначены для использования при лечении неопластического расстройства, выбранного из группы, состоящей из рака простаты, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака головного мозга/ЦНС, рака шейки матки, эзофагеального рака, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичников, рака поджелудочной железы и сарком.

В связи с терапевтическими и профилактическими аспектами изобретения, квалифицированным специалистам будет понятно, что связывание полипептида антитела с IL1RAP, присутствующим на поверхности клеток, ассоциированных с неопластическим расстройством, может приводить к модуляции (т.е. увеличению или снижению) биологической активности IL1RAP. Однако, такой модулирующий эффект не является существенным; например, полипептиды антитела по изобретению могут вызывать терапевтический и профилактический эффект просто за счет связывания с IL1RAP на поверхности клеток, ассоциированных с солидной опухолью, которая, в свою очередь, может инициировать индуцирование иммунной системой гибели клеток (например, путем ADCC и/или благодаря присутствию в агенте цитотоксического/радиоактивного фрагмента).

В понятие "биологической активности IL1RAP" мы включаем любое взаимодействие или событие сигнализации, в которых задействован IL1RAP на клетках, ассоциированных с неопластическим расстройством. Например, в одном варианте реализации полипептид антитела способен блокировать связывание одного или нескольких корецепторов с IL1RAP (таких как IL1R1, ST2, C-KIT и/или IL1RL2).

Такое ингибирование биологической активности IL1RAP полипептидом антитела по изобретению может быть полным или частичным. Например, агент может ингибировать биологическую активность IL1RAP на по меньшей мере 10%, предпочтительно, по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%, и наиболее предпочтительно, на 100% по сравнению с биологической активностью IL1RAP в клетках, ассоциированных с неопластическим расстройством, подвергнутых воздействию полипептида антитела. В предпочтительном варианте реализации, полипептид антитела способен ингибировать биологическую активность IL1RAP на 50% или больше по сравнению с биологической активностью IL1RAP в клетках, ассоциированных с неопластическим расстройством, которые не были подвергнуты воздействию полипептида антитела.

Аналогично, следует понимать, что ингибирование роста и/или пролиферациа клеток, ассоциированных с неопластическим расстройством, может быть полным или частичным. Например, полипептид антитела может ингибировать рост и/или пролиферацию клеток, ассоциированных с неопластическим расстройством, на по меньшей мере 10%, предпочтительно, по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%, и наиболее предпочтительно, на 100% по сравнению с ростом и/или пролиферацией клеток, ассоциированных с неопластическим расстройством, которые не были подвергнуты воздействию полипептида антитела.

Десятый аспект изобретения предусматривает (применение) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с первым аспектом изобретения в приготовлении медикамента для лечения или диагностики неопластического расстройства у субъекта, где неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

В одном варианте реализации, неопластическое расстройство представляет собой неопластическое гематологическое расстройство.

Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть предназначены для использования при лечении и/или диагностике неопластического расстройства, выбранного из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза (CML), миелопролиферативных расстройств (MPD), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфобластного лейкоза (ALL) и острого миелоидного лейкоза (AML).

В дополнительном варианте реализации, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент предназначены для использования при лечении и/или диагностике неопластического расстройства, ассоциированного с образованием солидных опухолей в организме субъекта.

Таким образом, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть предназначены для использования при лечении неопластического расстройства, выбранного из группы, состоящей из рака простаты, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака головного мозга/ЦНС, рака шейки матки, эзофагеального рака, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичников, рака поджелудочной железы и сарком.

Одиннадцатый аспект изобретения предусматривает способ лечения или диагностики неопластического расстройства у субъекта, включающий стадию введения субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с первым аспектом изобретения, где неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

В одном варианте реализации, неопластическое расстройство представляет собой неопластическое гематологическое расстройство.

Например, способ может быть (предназначен) для использования при лечении и/или диагностике неопластического расстройства, выбранного из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза (CML), миелопролиферативного расстройства (MPD), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфобластного лейкоза (ALL) и острого миелоидного лейкоза (AML).

В дополнительном варианте реализации, способ предназначен для использования при лечении и/или диагностике неопластического расстройства, ассоциированного с образованием солидных опухолей в организме субъекта.

Таким образом, способ может быть (предназначен) для использования при лечении неопластического расстройства, выбранного из группы, состоящей из рака простаты, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака головного мозга/ЦНС, рака шейки матки, эзофагеального рака, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, лимфомы, рака яичников, рака поджелудочной железы и сарком.

В дополнительном варианте реализации, полипептиды антитела и композиции по изобретению могут быть использованы для лечения пациентов или субъектов, страдающих от, или с риском возникновения болезни или состояния, восприимчивых к лечению ингибитором сигнализации IL-1 (или IL-33 или IL-36).

Таким образом, двенадцатый аспект изобретения предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с первым аспектом изобретения для использования при лечении болезни или состояния, восприимчивых к лечению ингибитором сигнализации IL-1.

Такие состояния или болезненные состояния хорошо известны специалистам (см. Dinarello et al., 2012, Nature Reviews 11: 633-652 и Dinarello, 2014, Mol. Med. 20 (suppl. 1): S43-S58, описания которых включены в данный документ в качестве ссылок) и включают, без ограничений, следующие:

ревматоидный артрит, все типы ювенильного артрита, включая системное начало ювенильного идиопатического артрита (SOJIA), остеоартрит, семейный холодовой аутовоспалительный синдром (FCAS), синдром Макла-Уэльса, младенческое мультисистемное воспалительное заболевание (NOMID), семейную средиземноморскую лихорадку (FMF), пиогенный артрит, гангренозную пиодермию и акне-синдром (PAPA), болезнь Стилла, развившуюся у взрослых, синдром гипериммуноглобулинемии D, сахарный диабет типа 2, синдром активации макрофагов, периодический синдром, ассоциированный с мутацией гена рецептора фактора некроза опухоли, болезнь Блау, анкилозирующий спондилоартрит, острый лихорадочный нейтрофильный дерматоз, волчаночный артрит, болезнь Альцгеймера, псориаз, астму, атеросклероз, саркоидоз, атопический дерматит, системную красную волчанку, буллезный пемфигоид, сахарный диабет типа I, хроническую обструктивную болезнь легких, гастрит, вызванный Helicobacter pylori, воспалительную болезнь кишечника (включая неспецифический язвенный колит и болезнь Крона), гепатит С, ишемически-реперфузионное повреждение, рассеянный склероз, нейссериальный или пневмококковый менингит, туберкулез, синдром Бехчета, септический шок, гомологичная болезнь, астма, диабет типа I, болезнь Альцгеймера, атеросклероз, Т-клеточный лейкоз взрослых, множественную миелому, периодонтит, ожирение и ассоциированные с ожирением болезни (например, метаболический синдром, кардиомегалию, застойную сердечную недостаточность, варикозные вены, синдром поликистоза яичников, гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь (GERD), жировую инфильтрацию печени, колоректальный рак, рак молочной железы, рак матки, хроническую почечную недостаточность, инсульт и гиперурикемию), болезнь межпозвоночных дисков, синдром раздраженной толстой кишки, синдром Шницлера, аллергию/атопический дерматит и подагру.

Блокада сигнализации IL-1 также считается полезной при лечении инфаркта миокарда. Обширные клинические испытания в настоящее время пытаются подтвердить эффективность блокады антитела IL1B (с помощью канакинумаба) после инфаркта миокарда (испытания (trail) CANTOS; см. Ridker et al., 2011, Am Heart Journal 162 (4): 597-605, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки).

Для таких показаний следует понимать, что терапевтический полезный эффект также может быть достигнут с применением антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают IL1RAP и тем самым блокируют сигнализацию IL-1 (или IL-33 или IL-36), ассоциированную с иммунными клетками. Такое антитело может быть модифицировано для удаления ADCC-активности.

Тринадцатый аспект изобретения предусматривает применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с первым аспектом изобретения при изготовлении медикамента для лечения болезни или состояния, восприимчивых к лечению ингибитором сигнализации IL-1 (или IL_33 или IL-36).

Четырнадцатый аспект изобретения предусматривает способ лечения болезни или состояния, восприимчивых к лечению ингибитором сигнализации IL-1 (или IL_33 или IL-36) у субъекта, включающий стадию введения субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с первым аспектом изобретения.

Пятнадцатый аспект изобретения предусматривает способ ADCC-медиируемого лечения или стимулирования (augmentation) болезни или состояния, восприимчивых к лечению ингибитором сигнализации IL-1 (или IL-33 или IL-36) у субъекта, включающий стадию введения субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с первым аспектом изобретения, способного индуцировать ADCC.

Шестнадцатый аспект изобретения предусматривает in vitro способ детектирования раковых клеток у субъекта, включающий:

(a) обеспечение образца клеток (например, белых кровяных стволовых клеток/клеток-предшественников или биопсийной ткани) от тестируемого субъекта;

(b) необязательно, экстракцию и/или очистку клеток, присутствующих в образце;

(c) введение в контакт антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с первым аспектом изобретения с клетками, присутствующими в образце;

(d) определение того, связывается ли полипептид антитела с клетками где связывание полипептида антитела с клетками указывает на присутствие раковых клеток в ткани субъекта.

Семнадцатый аспект изобретения предусматривает in vitro способ идентификации пациента с раком, который получит пользу от лечения антителом или его антигенсвязывающим фрагментом в соответствии с первым аспектом изобретения, включающий:

(a) обеспечение образца раковых клеток (например, белых кровяных стволовых клеток/клеток-предшественников или биопсийной ткани) от пациента, подлежащего тестированию;

(b) необязательно, экстракцию и/или очистку клеток, присутствующих в образце;

(c) введение в контакт антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с первым аспектом изобретения с клетками, присутствующими в образце;

(d) определение того, связывается ли полипептид антитела с клетками

где связывание полипептида антитела с раковыми клетками указывает, что пациент получит пользу от лечения антителом или его антигенсвязывающим фрагментом в соответствии с первым аспектом изобретения.

Квалифицированным специалистам будет понятно, что существует много способов проведения такого анализа. Например, иммунологический анализ может быть или гомогенным, или, более предпочтительно, гетерогенным. Анализ также может быть проведен или в конкурентном, или, более предпочтительно, в неконкурентном формате.

В одном варианте реализации, измеряют экспрессию IL1RAP в образцах крови (лейкоз) или биопсиях (солидные опухоли) от пациентов с применением проточной цитометрии или иммуногистохимии, причем экспрессия выше порогового значения указывает на пациента, который получит пользу от лечения антителом или его антигенсвязывающим фрагментом в соответствии с первым аспектом изобретения.

В предпочтительных вариантах реализации вышеописанных in vitro способов, стадию (d) проводят методом проточной цитометрии, иммуногистохимии или ИФА (твердофазового иммуноферментного анализа).

Однако могут быть использованы другие анализы, пригодные для детектирования взаимодействий антитело-антиген in vitro.

Восемнадцатый аспект изобретения предусматривает способ лечения пациента с раком, включающий введение субъекту, идентифицированному как имеющий рак, с применением способа в соответствии с шестнадцатым или семнадцатым аспектами изобретения, терапевтического агента эффективного при лечении указанного рака. В одном варианте реализации, примером терапевтического агента является полипептид антитела в соответствии с первым аспектом изобретения.

В одном варианте реализации, способ включает:

(a) организацию тестирования образца клеток (например, белых кровяных стволовых клеток/клеток-предшественников или биопсийной ткани) от тестируемого субъекта на присутствие раковых клеток, экспрессирующих IL1RAP выше порогового критерия с применением способа в соответствии с шестнадцатым или семнадцатым аспектами изобретения;

(b) выбор для лечения субъектов, образцы клеток которых при тестировании на стадии (а) содержали раковые клетки с экспрессией IL1RAP выше порогового критерия; и

(c) введение субъекту, выбранному на стадии (b), терапевтического агента, эффективного при лечении указанного рака, например, полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения.

В родственном варианте реализации, способ включает:

(a) получение образца клеток (например, белых кровяных стволовых клеток/клеток-предшественников или биопсийной ткани) от субъекта;

(b) тестирование указанных клеток на присутствие раковых клеток, экспрессирующих IL1RAP выше порогового критерия, с применением способа в соответствии с шестнадцатым или семнадцатым аспектами изобретения;

(c) выбор для лечения субъектов, образцы клеток которых, протестированные на стадии (b), содержат раковые клетки с экспрессией IL1RAP выше порогового критерия; и

(d) введение субъекту, выбранному на стадии (с), терапевтического агента, эффективного при лечении указанного рака, например, полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения.

Предпочтения и варианты для данного аспекта, признака или параметра изобретения должны, если контекст не указывает иное, рассматриваться как раскрытые в комбинации с любыми и всеми предпочтениями и вариантами для вех других аспектов, признаков и параметров изобретения. Например, в одном варианте реализации изобретение предусматривает интактное антитело lgG1, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 для использования при лечении AML.

Перечень или обсуждение очевидно ранее опубликованных документов в данном описании изобретения не должно обязательно рассматриваться как признание того, что указанный документ является частью известного уровня техники или является общеизвестным.

Применение терминов в единственном числе (в английском тексте - с артиклями "а" или "an"), при использовании в сочетании с термином "содержащий" в формуле изобретения и/или в описании изобретения, может означать "один", но также согласуется со значением "один или несколько", "по меньшей мере один", и "один или больше одного".

Эти и другие варианты реализации изобретения будут лучше восприниматься и более понятными при рассмотрении в сочетании с вышеприведенным описанием и сопровождают чертежами. Следует понимать, однако, что вышеуказанное описание, указывающее различные варианты реализации изобретения и его многочисленные конкретные детали, приведено в качестве иллюстрации и не для ограничения. Многие замещения, модификации, добавления и/или перегруппировки могут быть выполнены в объеме изобретения без выхода за пределы его сущности, и изобретение включает все такие замещения, модификации, добавления и/или перегруппировки.

Следующие чертежи являются частью настоящего описания изобретения и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть более понятным со ссылками на один или несколько из этих чертежей в комбинации с детальным описанием конкретных вариантов реализации, представленных в данном документе.

Фигура 1. Связывание типичного антитела по методу непрямого иммуноферментного анализа (indirect ELISA) с человеческим IL-1RAP. Было обнаружено, что типичное антитело по изобретению, CAN04, обладает наибольшей аффинностью к человеческому IL-1RAP.

Фигура 2. Связывание типичного антитела по изобретению (CAN04) с человеческими клетками CML и AML. (А) график показывает значение MFI (средняя интенсивность флуоресценции, СИФ) для леток KU812, окрашенных нацеленными на IL1RAP моноклональными антителами в концентрации 0,1 мкг/1 мл, и показывает, что CAN04 имеет наивысшее значение MFI из сравниваемых антител. (В) CAN04 демонстрирует специфическое связывание с пятью образцами первичного AML. (С) В трех образцах первичного CML, CAN04 демонстрирует специфическое связывание.

Фигура 3. Все типичные гуманизированные варианты антитела CAN04 связываются с экспрессирующими IL1RAP клетками BV173, причем вариант 6 демонстрирует наивысшую среднюю интенсивность флуоресценции.

Фигура 4. Способность типичного антитела CAN04 блокировать сигнализацию (А) IL-1 (3 (B) IL-1α, и (C) IL-33.

Фигура 5. Общее расширение клеток первичного примитивного CML в присутствии IL1b значительно снижается для типичного антитела CAN04 по сравнению как с контрольным, так и с референсным антителом. График показывает объединенные результаты для трех индивидуальных образцов пациентов, нормированных по контролю, состоящему из культивирования без антитела или с изотипным контрольным антителом.

Фигура 6. In vitro анализ ADCC показывает, что типичное антитело CAN04 индуцирует специфическую гибель клеток CML. (А) клетки KU812, LAMA84, и ВV173 специфически гибнут при прибавлении 0,1 мкг/мл CAN04. (В) Гибель клеток, медиируемая типичным антителом CAN04, является дозозависимой, как показано на клетках-мишенях ВV173. (С) Гибель зародышевых клеток от двух пациентов с бластным кризом при CML (хронический миелолейкоз) индуцировалась 1 мкг/мл CAN04. (D) Клетки третьего пациента с бластным кризом при CML. несущие мутацию Т3151, были чувствительными к эффекту ADCC, медиируемому CAN04. Каждый эксперимент проводили по меньшей мере дважды с природными клетками-убийцами (NK) разных доноров, и прведенные данные показывают результаты одного представительного эксперимента для каждого.

Фигура 7. In vitro анализ ADCC, демонстрирующий, что типичное антитело CAN04 является эффективным при индуцировании специфической гибели клеток меланомы (клеточная линия SKMEL5). При всех исследованных концентрациях, вплоть до 0,1 нг/мл, CAN04 демонстрирует высокую специфическую гибель клеток. Эксперимент проводили по меньшей мере дважды с природными клетками-убийцами (NK) разных доноров, и приведенные данные показывают результаты одного представительного эксперимента.

Фигура 8. (А) Конфокальные изображения (один оптический срез, толщина примерно 0.9 мкм), показывающие клетки LAMA, инкубированные в течение 2 часов с CAN04-AF488 конъюгированными антителами (зеленый) на льду, или при 37°С в течение 2 часов, или инкубированные с CAN04-AF488 конъюгированными антителами (зеленый) в течение 16 часов при 37°С. Хорошо заметное связывание антитела с клеточной мембраной большинства клеток может наблюдаться после 2 часов инкубации на льду ("лед 2 ч)". После инкубации в течение 2 часов с CAN04-AF488 конъюгированными антителами (зеленый) при 37°С, помимо связывания с мембраной, антитела начинают заходить в клетки (интернализация) и локализованы также в цитозоле. После 16 часов инкубации при 37°С, связывание с клеточными мембранами продолжает наблюдаться и интернализация антитела приводит к накоплению антител CAN04-AF488 в большинстве клеток. Масштабная полоска (правое изображение) соответствует 20 мкм на всех изображениях. (В) Контроль САN04-специфического связывания и интернализации: Конфокальные изображения (один оптический срез, толщина примерно 0,9 мкм) показывают клетки LAMA, инкубируемые с конъюгированным с AF488 изотипным контрольным антителом на льду или при 37°С в течение 2 часов, или при 37°С в течение 16 часов, изотипное контрольное антитело не демонстрировало специфического связывания при любых из указанных условий. Было отмечено незначительное связывание с клеточными обломками и некротическими клетками (бледно-зеленые). Масштабная полоска (правое изображение) соответствует 20 мкм на всех изображениях.

Фигура 9. Лечение с помощью CAN04 значительно снижает лейкозное бремя (leukemia burden). (А) Частота лейкемических клеток в периферической крови была ниже у мышей, получавших лечение типичным антителом CAN04, по сравнению с изотипным контролем в день 36 после трансплантации (1,20% по сравнению с 22,7%, р<0.0001). (В) Число тромбоцитов (PLT) оставалось на нормальном уровне для CAN04 (р=0,0001). (С) В момент умерщвления частота лейкемических клеток в костном мозге была пониженной для CAN04 (38,7% по сравнению с 91,5%; р<0,0001). (D) Частота лейкемических клеток в селезенке была ниже у мышей, получавших лечение CAN04 по сравнению с изотипным контролем (27,6% по сравнению с 70,4%; р=0,0063).

Фигура 10. Эффект мутаций с низким содержанием фукозы и Fc на ADCC-активность, определенную с применением клеток SKMEL5. (А) ADCC-активность в SKMEL-5 для CAN04 (Fc-1) с нормальным содержанием фукозы, CAN04 (Fc-1) с низким содержанием фукозы, Fc-4 и Fc-7. (В) ADCC-активность в SKMEL-5 для CAN04 (Fc-1) с нормальным содержанием фукозы, CAN04 (Fc-1) с низким содержанием фукозы, Fc-2 и Fc-3. (С) ADCC-активность в SKMEL-5 для CAN04 (Fc-1) с нормальным содержанием фукозы, CAN04 (Fc-1) с низким содержанием фукозы, Fc-5, Fc-6 и Fc-8.

ПРИМЕРЫ

А. Аффинность связывания типичного антитела по изобретению с белком IL1-RAP

(i) Исследования Biacore - антитела мышиного происхождения против IL1RAP

Материалы и способы

Козий анти-мышиный IgG иммобилизировали на чипе СМ5 в соответствии с техническим руководством набора для захвата и стандартными принципами работы BIAcore T200 (Biacore Life Sciences, GE Healthcare Europe GmbH, Uppsala, Sweden).

Цикл анализа связывания состоит из трех стадий: (i) захват лиганда на поверхности чипа иммобилизованным анти-мышиным антителом; (ii) связывание аналита с захваченным лигандом; и (iii) диссоциация связанного аналита.

Поверхность захвата молекулы регенерируют после каждого цикла связывания с применением рекомендуемых производителем условий.

Все циклы связывания проводят при 25°С.

После пяти пусковых (start-up) циклов, каждое антитело (100 нМ) вводили при расходе 30 мкл/мин, в течение 120 с, в начале цикла; затем вводили аналит (100 нМ) при расходе 30 мкл/мин, в течение 120 с, после чего контролировали фазу диссоциации в течение 300 с.

Проводили тестирование одного типичного антитела по изобретению (CAN04) вместе с двумя сравниваемыми анти-IL1RAP антителами (CAN01 и CAN03).

Результаты и выводы

Результаты приведены в Таблице 2 ниже:

Типичный пример антитела по изобретению, CAN04, демонстрировал наибольшую аффинность к человеческому IL1RAP.

(ii) Исследования методом ELISA - антитела мышиного происхождения против IL1RAP

Материалы и способы

Все анализы проводили методом непрямого ИФА. Все образцы анализировали с двумя параллельными измерениями. Планшеты MaxiSorp 96 Micro Well™ фирмы Nunc покрывали 100 нг рекомбинантного hIL1RAP 21-367 (100 мкл/лунку), разбавленным в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7,4, и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали промывочным буфером для ИФА (0,01 М PBS, 0,05% Tween 20, рН 7,4) с последующей стадией блокирования с применением 150 мкл/лунку блокирующего раствора для ИФА (PBS, 0,5% БСА (бычий сывороточный альбумин), 0,05% Tween 20, рН 7,4). После 1 ч инкубации при комнатной температуре (RT) с перемешиванием планшеты промывали снова с применением промывочного буфера для ИФА. Образцы разбавляли путем трехкратного серийного разведения (в диапазоне от 1000 нг/мл до 0,5 нг/мл) в блокирующем растворе для ИФА и затем переносили на планшет для ИФА, 100 мкл/лунку. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с перемешиванием и затем промывали промывочным раствором для ИФА. Прибавляли 100 мкл/лунку кроличьего анти-мышиного IgG, конъюгированного с щелочной фосфатазой (DAKO, 1:1000) и инкубировали 1 час при комнатной температуре с перемешиванием. Планшеты промывали с последующим прибавлением субстрата (4-нитрофенилфосфата (nitrophenyl phosphatise) динатриевой соли гексагидрат, SIGMA, 1 мг/мл), 100 мкл/лунку. Планшеты после этого инкубировали при комнатной температуре с перемешиванием и оптическое поглощение при 405 нм измеряли непрерывно на протяжении 30 мин. Поглощение в момент времени 0 мин принимали за фоновый сигнал.

Результаты и выводы

Результаты представлены на Фигуре 1

Было обнаружено, что типичное антитело по изобретению, CAN04, обладает наибольшим сигналом связывания с человеческим IL1RAP.

(iii) Исследования методом ELISA - гуманизированные варианты типичного антитела CAN04

Материалы и способы

Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей шестнадцати гуманизированных вариантов CAN04 (hCAN04) были субклонированы в векторы, содержащие человеческие константные домены:

- константный домен каппа - для домена VL [SEQ ID NO: 18]

- константный домен тяжелой цепи IgGlza - для домена VH [SEQ ID NO: 19]

Антитела транзиентно экспрессировались в клетках CHOK1SV в объеме 200 мл (колба для встряхивания).

Антитела очищали методом аффинной хроматографии с белком А.

Очищенные антитела анализировали методами SDS-PAGE (электрофорез на полиакриламидном геле с добавкой додецилсульфата натрия) и SE-HPLC (эксклюзионная ВЭЖХ).

Анализ методом непрямого ИФА проводили, как описано выше, с тем отличием, что образцы разбавляли путем трехкратного серийного разведения начиная с 3,5 нМ, и анализ проводили с четырьмя параллельными измерениями.

Результаты и выводы

Результаты приведены в Таблице 3.

Четыре из шестнадцати гуманизированных вариантов CAN04 продемонстрировали минимальное связывание или отсутствие связывания с IL1RAP (данные не приведены).

В. Связывание типичного антитела по изобретению с клетками, экспрессирующими IL1RAP

(i) Исследования методом проточной цитометрии - антитела мышиного происхождения против IL1RAP

Материалы и способы

Клеточную линию KU812 клеток хронического миелоидного лейкоза (CML) окрашивали антителами против IL1RAP или релевантного изотипного контроля. Для детектирования использовали вторичный анти-mlg-APC.

Одно типичное антитело по изобретению (CAN04) тестировали вместе с семью сравниваемыми (comparator) анти-IL1RAP антителами (CAN01, CAN02, CAN03, CAN05, CAN07, CAN08 и CAN09). Также было включено изотипное антитело отрицательного контроля.

Для анализа первичных лейкемических клеток, три образца пациентов с CML и пять образцов пациентов с острым миелоидным лейкозом (AML) с повышенным содержанием CD34, обогащенные мононуклеарными клетками, окрашивали CAN04-PE в концентрациях 1 мкг/мл и 5 мкг/мл, соответственно, или РЕ-конъюгированным изотипным контролем. Клетки анализировали с применением проточного цитометра FACS CANTO

(BD).

Результаты и выводы

Окрашивание экспрессирующих IL1RAP лейкемических клеток KU812 продемонстрировало более высокую среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) для CAN04 по сравнению с изотипным контролем и другими сравниваемыми антителами, нацеленными на IL1RAP (Фигура 2 А). Мечение зародышевых клеток от пяти пациентов с AML и трех пациентов с CML с применением CAN04 привело к более сильному окрашиванию, чем для изотипного контроля, при анализе методом проточной цитометрии (Фигура 2 В-С). Данные исследования показывают, что CAN04 специфически связывает IL1RAP с более высокой MFI, чем другие протестированные моноклональные антитела на клеточной линии CML, и что CAN04 также связывается с первичными клетками CML и AML.

(ii) Исследования методом проточной цитометрии - гуманизированные варианты антитела CAN04

Материалы и способы

Клетки клеточной линии ВV173 хронического миелоидного лейкоза (CML) окрашивали 1 мкг/мл тестового антитела или релевантным изотипным контролем. Для детектирования использовали вторичный анти-hlgG-PE. Клетки анализировали с применением проточного цитометра FACS CANTO (BD).

Тестируемые антитела включали одно химерное анти-IL1RAP антитело ("chimary") и двенадцать разных гуманизированных вариантов типичного антитела CAN04 по изобретению ("Var1" - "Var12").

Результаты и выводы

Окрашивание экспрессирующих IL1RAP лейкемических клеток ВV173 показало, что гуманизированные варианты CAN04 окрашиваются с разной интенсивностью, но все - на уровнях выше изотипного контроля (см. Фигура 3. Гуманизированные варианты 1, 2, 5, 6, 9 и 10 CAN04 (см. Таблица 3) проявляют наиболее сильное мечение.

С. Картирование домена эпитопа / типичных антител по изобретению

Материалы и способы

Для понимания того, где разные клоны антитела связываются с IL1RAP, был проведен структурный анализ белка, показавший, что внеклеточная часть рецептора может быть разделена на три отдельных домена, которые далее называются доменами 1, 2 и 3 (D1, D2, D3) (см. Wang et al., 2010, Nature Immunology, 11: 905-912, описание которой включено в данный документ в качестве ссылки). Для определения характера связывания доменов для разных клонов антител был сгенерирован ряд конструктов рецептора и связывание с ними было протестировано методом анализа ИФА.

Все анализы проводили методом непрямого ИФА. Все образцы анализировали с двумя параллельными измерениями. Планшеты MaxiSorp 96 Micro Well™ фирмы Nunc покрывали 100 нг Rec hIL1RAP домен123 (aa21-367) (положительный контроль), Rec hIL1RAP домен12 (аа21-234), домен1 (аа21-134) или Rec hIL1RAP домен3 (аа235-367) (100 мкл/лунку), разведенными в 0,01 М PBS, рН 7,4, и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали промывочным буфером для ИФА (0,01 М PBS, 0,05% Tween 20, рН 7,4) с последующей стадией блокирования с применением 150 мкл/лунку блокирующего раствора для ИФА (PBS, 0,5% БСА, 0,05% Tween 20, рН 7,4). После 1 ч инкубации при комнатной температуре (RT) с перемешиванием планшеты промывали снова с применением промывочного буфера для ИФА. CAN01, CAN03, CAN04, CAN05, CAN07, CAN08 и KMT-1 (положительный контроль) разбавляли путем трехкратного серийного разведения (в диапазоне от 1000 нг/мл до 0,5 нг/мл) в блокирующем растворе для ИФА и затем переносили на планшет для ИФА, 100 мкл/лунку. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с перемешиванием и затем промывали промывочным раствором для ИФА. Прибавляли 100 мкл/лунку кроличьего анти-мышиното IgG, конъюгированного с щелочной фосфатазой (DAKO, 1:1000) и инкубировали 1 час при комнатной температуре с перемешиванием. Планшеты промывали с последующим прибавлением субстрата (4-нитрофенилфосфата динатриевой соли гексагидрат, SIGMA, 1 мг/мл), 100 мкл/лунку. Планшеты после этого инкубировали при комнатной температуре с перемешиванием и оптическое поглощение при 405 нм измеряли непрерывно на протяжении 30 мин. Поглощение в момент времени 0 мин принимали за фоновый сигнал.

Одно типичное антитело по изобретению (CAN04) тестировали вместе с девятью сравниваемыми анти-IL1RAP моноклональными антителами (CAN01, CAN02, CAN03, CAN05, CAN07, CAN08, CAN10, и CAN11, вместе с поликлональным анти-IL1RAP антителом (KMT-1) в качестве положительного контроля.

Результаты и выводы

Большинство анти-IL1RAP антител, протестированных с целью подтверждения мишени, связывалось с доменом 3 (D3). Однако типичное антитело CAN04 по изобретению отличается тем, что оно связывается с доменом 2 (D2). Полные данные, касающиеся картирования домена, приведены в Таблице 4 ниже.

D. Специфичность/перекрестная реактивность типичных антител по изобретению

Материалы и способы

Важной особенностью хорошего лидирующего антитела-кандидата является то, что оно перекрестие реагирует с равной или почти равной активностью с гомологическим белком релевантного по токсикологии вида. В соответствии с общими нормативными рекомендациями, предпочтительным сценарием было бы связывание (с белком) одного грызуна и одного не-грызуна, но для антител это условие редко соблюдается, и вместо этого многие лаборатории стремятся идентифицировать любой релевантный по токсикологии вид за исключением приматов.

В данных исследованиях ожидалась перекрестная реактивность с не являющимися человеком приматами, такими как Macaca, mulatta (макака-резус) или Масаса fascicularis (яванский макак), поскольку белок IL1RAP у этих видов имеет 99% гомологии с человеческим белком IL1RAP.

Был выбран ряд потенциально перспективных антител, которые были протестированы на связывание с рекомбинантным IL1RAP (аа21-367) М. fascicularis методом анализа ИФА.

Одно типичное антитело по изобретению (CAN04) тестировали вместе с восемью сравниваемыми анти-IL1RAP моноклональными антителами (CAN01, CAN02, CAN03, CAN07, CAN08, CAN09, Mab676, полученными от R&D, и поликлональным анти-IL1RAP антителом (KMT-1).

Результаты и выводы

Неожиданно, было обнаружено, что несколько из протестированных сравниваемых анти-IL1RAP антител не являются перекрестно реактивными с IL1RAP, в том числе и коммерческое референсное антитело mAb676 от R&D, Таблица 5.

Е. Ингибирование сигнализации IL-1α, IL-1β и IL-33 типичными антителами по изобретению

(i) Эффект CAN04 на сигнализацию IL-1 в клеточной линии HEK-Blue IL-33/IL-1/3

Материалы и способы

Поскольку IL1RAP является функциональной частью комплекса рецептора IL-1, связывание антител с IL1RAP также может ингибировать сигнализацию IL-1. Поскольку было продемонстрировано, что ряд типов опухолевых клеток использует IL-1 как фактор роста, это может быть важным дополнительным механизмом медиирования противоопухолевых эффектов.

Для испытания способности потенциальных перспективных антител-кандидатов блокировать сигнализацию IL-1, был разработан метод анализа для определения IL-1-зависимого репортерного гена. Клетки HEK-Blue IL-33/IL-1β (InvivoGen) реагируют на сигнализацию IL-1 высвобождением щелочной фосфатазы, которую можно определить количественно с помощью колориметрического метода анализа. Для тестирования ингибирующей способности перспективных кандидатов клетки HEK-Blue высеивали в количестве 50000 клеток/лунку и инкубировали с тестируемыми антителами 45 минут, после чего стимулировали с помощью IL-1α, IL-1β или IL-33 в конечной концентрации в анализе, равной 0,3 нг/мл для каждого лиганда. Конечная концентрация антител в анализе составляла от 100 нМ до 0,01 нМ. В контрольных лунках, антитела заменяли на PBS (фосфатно-солевой буфер). Клетки инкубировали при 37°С в течение ночи (o/n), после чего измеряли количество высвобожденной щелочной фосфатазы. Антитела также тестировали на потенциальные агонистические эффекты путем инкубирования клеток в присутствии высокой концентрации антитела (10 мг/мл) без дополнительных раздражителей. Таким образом, любые агонистические эффекты IL-1R будут регистрироваться как высвобождение щелочной фосфатазы.

Одно типичное антитело по изобретению (CAN04) тестировали вместе с двумя сравниваемыми анти-IL1RAP моноклональными антителами (CAN01 и CAN03) и изотипным антителом отрицательного контроля.

Результаты и выводы

Как изображено на Фигуре 4 (А), типичное антитело CAN04 индуцировало выраженное ингибирование сигнализации IL-1β. Сравниваемое антитело CAN03 также продуцировало детектируемое ингибирование, но значительно меньше, чем CAN04. Ни сравнимаемое антитело CAN01, ни изотопный контроль не вызывали какого-либо измеримого ингибирования сигнализации IL1.

Кроме блокирования IL-1β, CAN04 также является сильным ингибитор сигнализации IL-1α и IL-33; см. Фигуры 4 (В) и (С), соответственно.

Ни один из протестированных кандидатов не продемонстрировал никаких агонистических эффектов.

(ii) Эффекты в первичных клетках CML

Материалы и способы

Аспираты костного мозга или периферическую кровь брали у трех пациентов с хроническим миелоидным лейкозом (CML) в хронической фазе. Мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием на Lymphoprep, и образцы обогащали по клеткам CD34+ с применением анти-CD34 антитела и магнитных бусин (Miltenyi biotech.) Клетки CD34+ ранили в жидком азоте до использования, когда их оттаивали и окрашивали антителами против CD34 и CD38. В качестве маркера жизнеспособности использовали пропидия йодид. Используя сортировщик клеток FACS Аria, жизнеспособные клетки CD34+CD38-отсортировывали с плотностью 2500 клеток на лунку в 96-луночные планшеты, обработанные тканевой культурой, содержащие 100 мкл бессывороточной питательной среды Stemspan без добавок. После сортировки, IL1b и тестовое антитело прибавляли в лунки в общем объеме 100 мкл Stemspan для получения конечного объема 200 мкл на лунку с 0-0,4 нг/мл IL1b и 0-10 мкг/мл антитела. Планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО₂, в течение 7 дней, после чего число жизнеспособных (7AAD-) клеток подсчитывали с применением бусин для подсчета клеток Countbright и прибора FACS Canto.

Одно типичное антитело по изобретению (CAN04) тестировали вместе с одним сравниваемым анти-IL1RAP моноклональным антителом (CAN01) и изотипным антителом отрицательного контроля.

Результаты и выводы

Как показано на Фигуре 5, культивирование CD34+CD38- первичных клеток хронической фазы CML в присутствии IL1b приводит к увеличению расширения клеток. IL1-индуцированное увеличение расширения клеток значительно снижается при добавлении в культуру типичного антитела CAN04 (р<0,0001). Также, по сравнению с другим нацеленным на IL1RAP антителом, CAN01, CAN04 является значительно более эффективным в снижении общего расширения клеток (р=0,0022). Мы пришли к выводу, что связывание CAN04 с IL1RAP препятствует стимулированию клеточного расширения, индуцируемого IL1 в первичных примитивных клетках CML.

F. Эффект ADCC (опосредованной антителами клеточной цитотоксичности) типичных антител по изобретению

(i) Клеточные линии хронического миелоидного лейкоза (CML)

Материалы и способы

Клеточные линии KU812, LAMA84 и ВV173 хронического миелоидного лейкоза (CML), или первичные клетки от трех пациентов с CML с бластным кризом использовали в качестве клеток-мишеней в анализе in vitro опосредованной антителами клеточной цитотоксичности (ADCC). Вкратце, клетки-мишени метили PKН26 (Sigma-Aldrich, St Louis, МО) в соответствии с инструкциями производителя, и высеивали на 96-луночный планшет с плотностью 5000-10000 клеток на лунку. Затем, типичное антитело по изобретению, CAN04, или изотипное контрольное антитело, прибавляли в лунки в разных концентрациях и инкубировали в течение 30 мин, после чего прибавляли в каждую лунку 100000 эффекторных NK-клеток. NK-клетки брали у здоровых добровольцев после информированного согласия с применением набора для отрицательной сепарации NK-клеток в соответствии с инструкциями производителя (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany). Неспецифическое человеческое антитело lgG1 использовалось в экспериментах в качестве изотипного отрицательного контроля (Eureka Therapeutics, Emeryville, CA). Степень гибели клеток оценивали путем детектирования 7-ААD-положительных клеток с применением проточного цитометра FACS CANTO (BD). Каждый эксперимент проводили по меньшей мере дважды с NK-клетками от разных доноров.

Результаты и выводы

In vitro анализ ADCC показал, что типичное антитело по изобретению, CAN04, нацеливает NK-клетки на уничтожение клеточных линий KU812, LAMA84 и ВV173 CML в большей степени, чем изотипный контроль (Фигура 6А). Титрование дозы CAN04 с применением клеток-мишеней ВV173 показало, что эффект гибели клеток является дозозависимым, с большей степенью гибели клеток при увеличении концентрации CAN04 (Фигура 6В). Хронический миелоидный лейкоз, развившийся в бластный криз, демонстрирует только транзиентный эффект при лечении ингибиторами тирозинкиназы и, таким образом, создает большие проблемы при лечении. Анализ ADCC с первичными клетками от двух индивидуальных пациентов с бластным кризом при CML показал, что эти клетки были чувствительными к клеточной цитотоксичности, индуцированной CAN04 и NK-клeткaми (Фигypa 6С). Кроме этого, первичные клетки третьего пациента с бластным кризом при CML, имеющего мутацию T315I, придающую резистентность к нескольким ингибиторам тирозинкиназы, проявляли аналогичную чувствительность (Фигура 6D). В общем, эксперименты показали, что CAN04 обладает способностью нацеливать NK-клетки на специфическое уничтожение клеточных линий CML, а также первичных клеток бластного криза CML, и что цитотоксический эффект, индуцированный CAN04, является дозозависимым.

(ii) Клеточные линии меланомы

Материалы и способы

Клеточная линия SKMEL-5 злокачественной меланомы использовалась в качестве мишени для in vitro анализа антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Вкратце, клетки-мишени метили РKН26 (Sigma-Aldrich, St Louis, МО) в соответствии с инструкциями производителя, и высеивали на 96-луночный планшет с плотностью 5000-10000 клеток на лунку. Затем, CAN04 или изотипное контрольное антитело прибавляли в лунки в разных концентрациях и инкубировали в течение 30 мин, после чего прибавляли в каждую лунку 100000 эффекторных NK-клеток. NK-клетки брали у здоровых добровольцев после информированного согласия с применением набора для отрицательной сепарации NK-клеток в соответствии с инструкциями производителя (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany). В качестве контроля в экспериментах использовалось неспецифическое человеческое антитело lgG1 (Eureka Therapeutics, Emeryville, CA). Степень гибели клеток оценивали путем детектирования 7-AAD-положительных клеток с применением проточного цитометра FACS CANTO (BD). Каждый эксперимент проводили по меньшей мере дважды с NK-клетками, взятыми у разных доноров

Результаты и выводы

In vitro анализ ADCC показал, что CAN04 нацеливает NK-клетки на уничтожение клеточной линии SKMEL-5 в значительно большей степени, чем соответствующий изотипный контроль (Фигура 7). Титрование дозы CAN04 показало, что CAN04 эффективно индуцирует ADCC при низких концентрациях (Фигура 7). Таким образом, эти данные показывают, что CAN04 обладает способностью нацеливать NK-клетки на специфическое уничтожение клеток SKMEL-5 дозозависимым образом (и что CAN04).

G. Интернализация типичных антител по изобретению

Материалы и способы

Клетки и условия культивации: Клетки LAMA-84, клеточная линия, выделенная у пациента с хроническим миелоидным лейкозом в фазе бластного криза, была получена от DSMZ (Braunschweig, Germany) и культивировалась в соответствии с рекомендациями поставщика. Вкратце, клетки культивировали в RPM11640 с 10% FBS (сыворотка плода коровы), 1% глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина в (атмосфере с) 5% CO2, 37°С. Клеточные культуры делили до плотности 0,5×10⁶ клеток/мл каждые 2-3 дня. Клетки использовали на протяжении до 12 пассажей после получения от DSMZ.

Клетки из суспензии слеточной линии LAMA-84 промывали раз фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) с добавкой 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и ресуспендировали в PBS-БСА с добавкой 5% человеческой АВ+ сыворотки фирмы Sigma и в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Меченое с помощью AlexaFluor488 (AF488) IL-1RAP селективное антитело CAN04, или изотипное сопоставимое контрольное антитело, прибавляли до конечной концентрации 10 мкг/мл. Клетки помещали на лед (инкубировали на льду) или при 37°С в течение 2 или 16 часов.

Для анализа изображений, пропущенных методом конфокальной микроскопии (конфокальный микроскоп LSM 510 Meta Zeiss), клетки промывали дважды в PBS-1% БСА, кратковременно центрифугировали с последующим ресуспендированием в 3% параформальдегиде (в PBS) для фиксации в течение 20 минут (при 4°С). Клетки затем центрифугировали, ресуспендировали в PBS, содержащем 0.001% Triton X-100 (PBS-TX) и ядерный маркер (DAPI), и оставляли для инкубирования в течение 5 минут при комнатной температуре. После кратковременного центрифугирования клетки ресуспендировали в PBS-TX и помещали в микроскопические кюветы со стеклянным дном. Клетки затем оставляли для прикрепения на час. Графические данные собирали путем конфокального сканирования клеток, получая изображения высокого разрешения флуоресценции AlexaFluor488 в тонких оптических срезах по центру клеток (определяемому по ядерному маркеру). Дополнительные анализы связывания антител с клеточной мембраной и/или интернализированных антител осуществляли путем компьютерных анализов изображений (Zeiss Zen2010).

Результаты и выводы

Структурное соотношение между связыванием CAN04 с клеточной мембраной и его способностью проникать в клетки ("интернализироваться") было продемонстрировано с помощью графических данных высокого разрешения, зарегистрированных с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, и анализа графических данных.

Графические данные представлены на Фигуре 8.

Н. Терапевтическая эффективность in vivo типичного антитела по изобретению

Материалы и способы

Неподготовленным мышам NOD/SCID прививали летальные дозы клеток MA9Ras, предварительно полученных трансформацией клеток CD34⁺ человеческой пуповинной крови путем ретровирусной интеграции кДНК, направляющих экспрессию гибрида MLL/AF9 и активированного гена NRAS. Лейкозным мышам вводили типичное антитело CAN04, нацеленное на IL1RAP, или соответствующее изотипное контрольное антитело. Антитела вводили путем интраперитонеальных инъекций два раза в неделю на протяжении эксперимента, причем первую дозу вводили в день три после трансплантации. Каждая доза антитела составляла 500 мкг, за исключением первой, которая представляла собой болюс 1000 мкг. Мышей умертвляли при появлении признаков тяжелой болезни, таких как искривление позвоночника, неопрятная шерсть и пониженная подвижность, или вследствие солидных опухолей.

Результаты и выводы

Иммунодефицитным мышам прививали человеческие лейкемические клетки и вводили CAN04, моноклональное антитело, нацеленное на IL1RAP. Частота лейкемических клеток в периферической крови была значительно снижена в день 36 после трансплантации, и число тромбоцитов оставалось нормальным у мышей, получавших CAN04, по сравнению с изотипным контрольным антителом, что указывает на более функциональный гемопоэз (Фигура 9А-В). Введение CAN04 приводило к значительному снижению лейкемических клеток в костном мозге и селезенке (Фигура 9С-D). Мы пришли к выводу, что иммунотерапия, направленная против IL1RAP, снижает человеческий лейкоз в периферической крови, костном мозге и селезенке, в модели ксенотрансплантата MA9Ras. Полученные результаты поддерживают аиммунотерапию, направленную против IL1RAP, в качестве новой перспективной терапевтической стратегии при AML.

I. Эффект (а) антител с низким содержанием фукозы и (b) мутаций Fc на ADCC-активностъ

Материалы и способы

Вариант вариабельного домена гуманизированной тяжелой цепи CAN04 (содержащий SEQ ID No: 9), субклонировали в вектор, содержащий человеческий константный домен IgGlza (SEQ ID NO: 19).

Вариант вариабельного домена гуманизированной легкой цепи CAN04 (содержащий SEQ ID No: 16), субклонировали в вектор, содержащий человеческий константный домен каппа (SEQ ID NO: 18).

Для изучения влияния низкого содержания фукозы, антитело hCAN04 "Fc-1" (см. ниже) транзиентно экспрессировали путем котрансфекции полученных векторов в клетки НЕK293, культивируемые в среде, содержащей кинфуненсин (Kinfunensine). Антитело Fc-1, продуцируемое путем экспрессии в отсутствие кинфуненсина, использовали в качестве контроля с "нормальным содержанием фукозы".

Для определения того, как различные Fc-модифицированные мутанты hCAN04 влияют на ADCC-активность, генетически модифицированные варианты hCAN04 были получены следующим образом:

Fc-1 = (гуманизированный CAN04 с Fc дикого типа; т.е. hCAN04 вариант 6 в Таблице 3)

Fc-2 = (как Fc-1, но с мутациями S239D/S298A/I332E)

Fc-3 = (как Fc-1, но с мутациями S239D/A330L/I332E)

Fc-4 = (как Fc-1, но с мутациями S239D/I332E)

Fc-5 = (как Fc-1, но с мутациями S298A/E333A/K334A)

Fc-6 = (как Fc-1, но с мутацией N297Q)

Fc-7 = (как Fc-1, но с мутацией N297S)

Fc-8 = (как Fc-1, но с мутациями P247I/A339Q)

где положение аминокислотных мутаций определяется с применением схемы нумерации Eu, которая отличается от нумерации в SEQ ID NOS: 18 и 19 выше; см. Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63: 78-85).

Антитела очищали методом аффинной хроматографии с белком А.

Анализы ADCC проводили с применением клеточной линии SKMEL5.

Результаты и выводы

Вариант hCAN04 с низким содержанием фукозы, продуцированный в присутствии кинфуненсина, превосходил по своим характеристикам вариант CAN04 с нормальным содержанием фукозы (Фигура 10).

Эффект мутации Fc на ADCC-активность зависел от проведенной мутации (мутаций). Таким образом:

(a) ADCC-активность у вариантов Fc-6 и Fc-7 гуманизированного CAN04 полностью отсутствовала;

(b) ADCC-активность у вариантов Fc-3, Fc-4, и Fc-5 гуманизированного CAN04 была усилена, даже по сравнению с вариантом CAN04 с низким содержанием фукозы;

(c) ADCC-активность у варианта Fc-8 гуманизированного CAN04 была схожей с формой CAN04 с низким содержанием фукозы

(d) ADCC-активность у варианта Fc-2 гуманизированного CAN04 была схожей с формой CAN04 с нормальным содержанием фукозы.

Пример J-Анализ конкурентного связывания методом ELISA

Протокол

- Все образцы должны анализироваться с двумя параллельными измерениями

- Наносят на планшет Nunc-MaxiSorp 96 Micro Well™ покрытие 100 мкл/лунку рекомбинантного hlL1RAP 21-367 (1 мкг/мл), разведенного в 0,01 М PBS, pH 7,4

- инкубируют планшет в течение ночи при 4°С

- Промывают планшет промывочным буфером для ИФА (0,01 М PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4)

- Прибавляют 150 мкл/лунку блокирующего раствора для ИФА (PBS, 0,5% БСА, 0,05% Tween 20, pH 7,4)

- Инкубируют планшет в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) при перемешивании

- Промывают планшет промывочным буфером для ИФА

- Прибавляют в лунки образцы тестируемых объектов (например, mAb 1, mAb 2) (100 мкл/лунку, 10 мкг/мл)

- Инкубируют планшет в течение 1 ч при комнатной температуре

- Промывают планшет промывочным буфером для ИФА

- Прибавляют во все лунки раствор референсного антитела CAN04 (100 мкл/лунку, 1 мкг/мл)

- Инкубируют планшет в течение 1 ч при комнатной температуре

- Промывают планшет промывочным буфером для ИФА

- Прибавляют 100 мкл/лунку пригодного вторичного антитела (, конъюгированного с щелочной) кролика против мышиного IgG, конъюгированного со щелочной фосфатазой (если тестируемыми объектами являются человеческие антитела, то пригодным вторичным антителом будет козье антитело против мышиного IgG (Fc-специфическое)-щелочная фосфатаза, SIGMA, A1418)

- Инкубируют планшет в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании

- Промывают планшет промывочным буфером

- Прибавляют 100 мкл субстрата pNPP на лунку.

- (4-нитрофенилфосфата динатриевой соли гексагидрат, SIGMA, 1 мг/мл).

- Инкубируют планшет при комнатной температуре при перемешивании и измеряют оптическое поглощение при 405 нм непрерывно в течение 30 мин. поглощение в момент времени 0 мин принимают за фоновый сигнал.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> Cantargia AB

<120> Novel antibodies and uses thereof

<130> CANBA/P57678PC

<150> GB1403875.6

<151> 2014-03-05

<160> 19

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr His Tyr Ser Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Gly Glu Gly Tyr Leu Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Gly Leu His Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ile Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 3

Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 4

Tyr Pro Gly Asp Gly Asn

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 5

Gly Tyr Leu Asp Pro Met Asp Tyr

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 6

Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn

1 5 10

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 7

Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr His Tyr Ser Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Glu Gly Tyr Leu Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Glu Gly Tyr Leu Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Gln Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Glu Gly Tyr Leu Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Gln Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Glu Gly Tyr Leu Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 12

Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 13

Tyr Thr Ser Gly Leu His Ala

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 14

Gln Gln Tyr Ser Ile Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 15

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Gly Leu His Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ile Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 16

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Gly Leu His Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ile Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 17

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Gly Leu His Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ile Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 18

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 18

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 19

<211> 330

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine derived antibody sequence

<400> 19

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<---

1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент со специфичностью связывания с вспомогательным белком рецептора человеческого интерлейкина-1 (IL1RAP), содержащие

(i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три CDR из вариабельной области, определенной в SEQ ID NO: 1, или ее гуманизированной версии, определенной в SEQ ID NO: 8, 9, 10 или 11; и

(ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую три CDR из вариабельной области, определенной в SEQ ID NO: 2, или ее гуманизированной версии, определенной в SEQ ID NO: 15, 16 или 17.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент проявляют следующие свойства:

- аффинность связывания (K_D) с человеческим IL1RAP в размере ≤ 200 пМ;

- перекрестная реактивность с IL1RAP Macaca fascicularis (яванский макак);

- ингибирующее действие на сигнализацию IL1;

- способность индуцировать ADCC в одной или нескольких раковых клеточных линиях; и

- способность к интернализации при связывании с одной или несколькими клеточными линиями рака.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов, содержащие или состоящие из интактного антитела.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1 или 2, содержащие или состоящие из антигенсвязывающего фрагмента, выбранного из группы, состоящей из фрагментов Fv, Fab-подобных фрагментов и доменных антител.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:1 или его гуманизированную версию, определенную в SEQ ID NO: 8, 9, 10 или 11, и вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, или его гуманизированную версию, определенную в SEQ ID NO: 15, 16 или 17.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 8-11, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 15-17.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, содержащие:

- вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15;

- вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15;

- вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15;

- вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15;

- вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16;

- вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16;

- вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16;

- вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16;

- вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17;

- вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17;

- вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17; или

- вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов, содержащие константный участок тяжелой цепи, или его часть, и константный участок легкой цепи, или его часть.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 9, отличающиеся тем, что константный участок тяжелой цепи принадлежит подтипу иммуноглобулина, выбранному из группы, состоящей из lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 10, отличающиеся тем, что константный участок тяжелой цепи принадлежит подтипу иммуноглобулина lgG1.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 11, отличающиеся тем, что константный участок тяжелой цепи содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19 или ее варианта, содержащего мутацию K97R, D239E или L241M или не содержащего С-концевой лизин.

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 9, отличающиеся тем, что константный участок легкой цепи представляет собой легкую цепь каппа или лямбда.

14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 13, отличающиеся тем, что константный участок легкой цепи представляет собой легкую цепь каппа.

15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 14, отличающиеся тем, что константный участок легкой цепи содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18 или ее варианта, имеющего мутацию W40R или V83L.

16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов, содержащие область Fc.

17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 16, отличающиеся тем, что область Fc не встречается в природе.

18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 17, отличающиеся тем, что область Fc содержит одну или несколько мутаций, указанных в Таблице 1.

19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов, не содержащие или имеющие низкое содержание остатков фукозы в области Fc.

20. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является гликозилированным.

21. Конъюгат со специфичностью связывания с IL1RAP человека, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов и дополнительно содержащий фрагмент для увеличения in vivo периода полужизни агента.

22. Конъюгат по п. 21, отличающийся тем, что фрагмент для увеличения in vivo периода полужизни выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), человеческого сывороточного альбумина, жирных кислот и декстрана.

23. Конъюгат по п. 22, отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются пегилированными.

24. Конъюгат по любому из пп. 21-23, отличающийся тем, что полипептид антитела дополнительно содержит детектируемый фрагмент.

25. Конъюгат по п. 24, отличающийся тем, что детектируемый фрагмент содержит или состоит из радиоизотопа.

26. Конъюгат по п. 25, отличающийся тем, что радиоизотоп выбирают из группы, состоящей из ^99mTc, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr, ¹²³l и ²⁰¹TI.

27. Конъюгат по п. 26, отличающийся тем, что радиоизотоп представляет собой ⁸⁹Zr.

28. Конъюгат по любому из пп. 21-27, отличающийся тем, что полипептид антитела содержит пару детектируемого и цитотоксического радионуклидов.

29. Конъюгат по п. 28, отличающийся тем, что радиоизотоп способен одновременно проявлять мультимодальное действие как детектируемый фрагмент, а также как цитотоксический фрагмент.

30. Конъюгат по п. 29, отличающийся тем, что детектируемый фрагмент содержит или состоит из парамагнитного изотопа.

31. Конъюгат по п. 30, отличающийся тем, что парамагнитный изотоп выбирают из группы, состоящей из ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr и ⁵⁶Fe.

32. Конъюгат по любому из пп. 24-31, отличающийся тем, что детектируемый фрагмент детектируется с помощью метода визуализации.

33. Конъюгат для уменьшения или ингибирования роста или уничтожения клеток, экспрессирующих IL1RAP, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-20 и дополнительно содержащий цитотоксический фрагмент.

34. Конъюгат по п. 33, отличающийся тем, что цитотоксический фрагмент содержит или состоит из радиоизотопа.

35. Конъюгат по п. 34, отличающийся тем, что радиоизотоп выбирают из группы, состоящей из бета-излучателей, оже-излучателей, излучателей конверсионных электронов, альфа-излучателей и излучателей низкоэнергетических фотонов.

36. Конъюгат по п. 35, отличающийся тем, что радиоизотоп имеет характер эмиссии локально абсорбированной энергии, создающий высокое поглощение дозы вблизи агента.

37. Конъюгат по любому из пп. 34-36, отличающийся тем, что радиоизотоп выбирают из группы, состоящей из дальнодействующих бета-излучателей, бета-излучателей среднего радиуса действия, низкоэнергетических бета-излучателей, конверсионных или оже-излучателей и альфа-излучателей.

38. Конъюгат по п. 37, отличающийся тем, что радиоизотоп представляет собой ¹⁷⁷Lu.

39. Конъюгат по п. 33, отличающийся тем, что цитотоксический фрагмент содержит или состоит из цитотоксического лекарственного средства.

40. Конъюгат по п. 39, отличающийся тем, что цитотоксическое лекарственное средство выбирают из группы, состоящей из цитостатического лекарственного препарата, антиандрогенного лекарственного препарата, кортизона и его производных, фосфоната, ингибитора тестостерон-5-α-редуктазы, адденда бора, цитокина, тапсигаргина и его метаболитов; токсина; химиотерапевтического агента или любых других цитотоксических лекарственных препаратов, применимых при лечении неопластических расстройств.

41. Конъюгат по п. 40, отличающийся тем, что цитотоксический лекарственный препарат является пригодным для использования в активационной терапии, такой как фотонная активационная терапия, нейтронная активационная терапия, нейтрон-индуцированная оже-электронная терапия, терапия синхротронного излучения или активационная терапия низкоэнергетических рентгеновских фотонов.

42. Конъюгат по любому из пп. 33-41, отличающийся тем, что полипептид антитела дополнительно содержит детектируемый фрагмент.

43. Конъюгат по п. 42, отличающийся тем, что детектируемый фрагмент содержит или состоит из радиоизотопа.

44. Конъюгат по п. 43, отличающийся тем, что радиоизотоп выбирают из группы, состоящей из ^99mTc, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr, ¹²³l и ²⁰¹TI.

45. Конъюгат по п. 44, отличающийся тем, что радиоизотоп представляет собой ⁸⁹Zr.

46. Конъюгат по любому из пп. 33-45, отличающийся тем, что полипептид антитела содержит пару детектируемого и цитотоксического радионуклидов.

47. Конъюгат по п. 46, отличающийся тем, что радиоизотоп способен одновременно проявлять мультимодальное действие как детектируемый фрагмент, а также как цитотоксический фрагмент.

48. Конъюгат по п. 47, отличающийся тем, что детектируемый фрагмент содержит или состоит из парамагнитного изотопа.

49. Конъюгат по п. 48, отличающийся тем, что парамагнитный изотоп выбирают из группы, состоящей из ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr и ⁵⁶Fe.

50. Конъюгат по любому из пп. 42-49, отличающийся тем, что детектируемый фрагмент детектируется с помощью метода визуализации.

51. Конъюгат по любому из пп. 33-50, отличающийся тем, что цитотоксический фрагмент и/или детектируемый фрагмент присоединен к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту не напрямую, а через линкерный фрагмент.

52. Конъюгат по п. 51, отличающийся тем, что линкерный фрагмент представляет собой хелатор.

53. Конъюгат по п. 52, отличающийся тем, что хелатор выбирают из группы, состоящей из производных 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA), дефероксамина (DFO), производных диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), производных S-2-(4-изотиоцианатобензил)-1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусной кислоты (NOTA) и производных 1,4,8,11-тетраазациклододекан-1,4,8,11-тетрауксусной кислоты (TETA).

54. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, где IL1RAP является биомаркером, и заболеваний, поддающихся лечению ингибиторами сигнализации IL-1, указанная композиция содержит эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20 или его конъюгата по любому из пп. 21-53 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент.

55. Фармацевтическая композиция по п. 54, предназначенная для парентеральной доставки.

56. Фармацевтическая композиция по п. 55, предназначенная для внутривенной доставки.

57. Фармацевтическая композиция по п. 55, предназначенная для местной доставки.

58. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-20 для применения при лечении неопластического расстройства у субъекта, отличающиеся тем, что неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

59. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения при лечении неопластического расстройства по п. 58, представляющего собой неопластическое гематологическое расстройство.

60. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения при лечении неопластического расстройства по п. 59, отличающиеся тем, что неопластическое гематологическое расстройство выбирают из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза (CML), миелопролиферативного расстройства (MPD), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфобластного лейкоза (ALL) и острого миелоидного лейкоза (AML).

61. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения при лечении неопластического расстройства по п. 60, отличающиеся тем, что неопластическое гематологическое расстройство представляет собой CML.

62. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения при лечении неопластического расстройства по п. 60, отличающиеся тем, что неопластическое гематологическое расстройство представляет собой ALL.

63. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения при лечении неопластического расстройства по п. 58, отличающиеся тем, что неопластическое расстройство ассоциировано с образованием солидных опухолей в организме субъекта.

64. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения при лечении неопластического расстройства по п. 63, отличающиеся тем, что солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака простаты, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака головного мозга/ЦНС, рака шейки матки, эзофагеального рака, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичников, рака поджелудочной железы и сарком.

65. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения при лечении неопластического расстройства по п. 64, отличающиеся тем, что солидная опухоль представляет собой меланому.

66. Конъюгат по любому из пп 21-32 для применения при лечении неопластического расстройства у субъекта, отличающийся тем, что неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

67. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 66, представляющего собой неопластическое гематологическое расстройство.

68. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 67, отличающийся тем, что неопластическое гематологическое расстройство выбирают из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза (CML), миелопролиферативного расстройства (MPD), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфобластного лейкоза (ALL) и острого миелоидного лейкоза (AML).

69. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 68, отличающийся тем, что неопластическое гематологическое расстройство представляет собой CML.

70. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 68, отличающийся тем, что неопластическое гематологическое расстройство представляет собой ALL.

71. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 66, отличающийся тем, что неопластическое расстройство ассоциировано с образованием солидных опухолей в организме субъекта.

72. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 71, отличающийся тем, что солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака простаты, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака головного мозга/ЦНС, рака шейки матки, эзофагеального рака, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичников, рака поджелудочной железы и сарком.

73. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 72, отличающийся тем, что солидная опухоль представляет собой меланому.

74. Конъюгат по любому из пп. 33-53 для применения при лечении неопластического расстройства у субъекта, отличающийся тем, что неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

75. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 74, представляющего собой неопластическое гематологическое расстройство.

76. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 75, отличающийся тем, что неопластическое гематологическое расстройство выбирают из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза (CML), миелопролиферативного расстройства (MPD), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфобластного лейкоза (ALL) и острого миелоидного лейкоза (AML).

77. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 76, отличающийся тем, что неопластическое гематологическое расстройство представляет собой CML.

78. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 76, отличающийся тем, что неопластическое гематологическое расстройство представляет собой ALL.

79. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 74, отличающийся тем, что неопластическое расстройство ассоциировано с образованием солидных опухолей в организме субъекта.

80. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 79, отличающийся тем, что солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака простаты, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака головного мозга/ЦНС, рака шейки матки, эзофагеального рака, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичников, рака поджелудочной железы и сарком.

81. Конъюгат для применения при лечении неопластического расстройства по п. 80, отличающийся тем, что солидная опухоль представляет собой меланому.

82. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20 в изготовлении медикамента для лечения неопластического расстройства у субъекта, причем неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

83. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20 в изготовлении медикамента для диагностики неопластического расстройства у субъекта, причем неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

84. Применение по п. 82 или 83, отличающееся тем, что неопластическое расстройство представляет собой неопластическое гематологическое расстройство.

85. Применение по п. 84, отличающееся тем, что неопластическое гематологическое расстройство выбирают из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза (CML), миелопролиферативного расстройства (MPD), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфобластного лейкоза (ALL) и острого миелоидного лейкоза (AML).

86. Применение по п. 85, отличающееся тем, что неопластическое гематологическое расстройство представляет собой CML.

87. Применение по п. 85, отличающееся тем, что неопластическое гематологическое расстройство представляет собой ALL.

88. Применение по п. 82 или 83, отличающееся тем, что неопластическое расстройство ассоциировано с образованием солидных опухолей в организме субъекта.

89. Применение по п. 88, отличающееся тем, что солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака простаты, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака головного мозга/ЦНС, рака шейки матки, эзофагеального рака, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичников, рака поджелудочной железы и сарком.

90. Применение по п. 89, отличающееся тем, что солидная опухоль представляет собой меланому.

91. Применение конъюгата по любому из пп.21-32 в изготовлении медикамента для лечения неопластического расстройства у субъекта, причем неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

92. Применение конъюгата по любому из пп.21-32 в изготовлении медикамента для диагностики неопластического расстройства у субъекта, причем неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

93. Применение по п. 91 или 92, отличающееся тем, что неопластическое расстройство представляет собой неопластическое гематологическое расстройство.

94. Применение по п. 93, отличающееся тем, что неопластическое гематологическое расстройство выбирают из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза (CML), миелопролиферативного расстройства (MPD), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфобластного лейкоза (ALL) и острого миелоидного лейкоза (AML).

95. Применение по п. 94, отличающееся тем, что неопластическое гематологическое расстройство представляет собой CML.

96. Применение по п. 94, отличающееся тем, что неопластическое гематологическое расстройство представляет собой ALL.

97. Применение по п. 91 или 92, отличающееся тем, что неопластическое расстройство ассоциировано с образованием солидных опухолей в организме субъекта.

98. Применение по п. 97, отличающееся тем, что солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака простаты, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака головного мозга/ЦНС, рака шейки матки, эзофагеального рака, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичников, рака поджелудочной железы и сарком.

99. Применение по п. 98, отличающееся тем, что солидная опухоль представляет собой меланому.

100. Применение конъюгата по любому из пп.33-53 в изготовлении медикамента для лечения неопластического расстройства у субъекта, причем неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

101. Применение конъюгата по любому из пп.33-53 в изготовлении медикамента для диагностики неопластического расстройства у субъекта, причем неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

102. Применение по п. 100 или 101, отличающееся тем, что неопластическое расстройство представляет собой неопластическое гематологическое расстройство.

103. Применение по п. 102, отличающееся тем, что неопластическое гематологическое расстройство выбирают из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза (CML), миелопролиферативного расстройства (MPD), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфобластного лейкоза (ALL) и острого миелоидного лейкоза (AML).

104. Применение по п. 102, отличающееся тем, что неопластическое гематологическое расстройство представляет собой CML.

105. Применение по п. 102, отличающееся тем, что неопластическое гематологическое расстройство представляет собой ALL.

106. Применение по п. 100 или 101, отличающееся тем, что неопластическое расстройство ассоциировано с образованием солидных опухолей в организме субъекта.

107. Применение по п. 106, отличающееся тем, что солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака простаты, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака головного мозга/ЦНС, рака шейки матки, эзофагеального рака, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичников, рака поджелудочной железы и сарком.

108. Применение по п. 107, отличающееся тем, что солидная опухоль представляет собой меланому.

109. Способ лечения неопластического расстройства у субъекта, включающий стадию введения субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20 или его конъюгата по любому из пп. 21-53, причем неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

110. Способ по п. 109, в котором неопластическое расстройство представляет собой неопластическое гематологическое расстройство.

111. Способ по п. 110, в котором неопластическое гематологическое расстройство выбирают из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза (CML), миелопролиферативного расстройства (MPD), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфобластного лейкоза (ALL) и острого миелоидного лейкоза (AML).

112. Способ по п. 111, в котором неопластическое гематологическое расстройство представляет собой CML.

113. Способ по п. 111, в котором неопластическое гематологическое расстройство представляет собой ALL.

114. Способ по п. 109, в котором неопластическое расстройство ассоциировано с образованием солидных опухолей в организме субъекта.

115. Способ по п. 114, в котором солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака простаты, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака головного мозга/ЦНС, рака шейки матки, эзофагеального рака, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичников, рака поджелудочной железы и сарком.

116. Способ по п. 115, в котором солидная опухоль представляет собой меланому.

117. Способ диагностики неопластического расстройства у субъекта, включающий стадию введения субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20 или его конъюгата по любому из пп.21-53, причем неопластическое расстройство ассоциировано с клетками, экспрессирующими IL1RAP.

118. Способ по п. 117, в котором неопластическое расстройство представляет собой неопластическое гематологическое расстройство.

119. Способ по п. 118, в котором неопластическое гематологическое расстройство выбирают из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза (CML), миелопролиферативного расстройства (MPD), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфобластного лейкоза (ALL) и острого миелоидного лейкоза (AML).

120. Способ по п. 119, в котором неопластическое гематологическое расстройство представляет собой CML.

121. Способ по п. 119, в котором неопластическое гематологическое расстройство представляет собой ALL.

122. Способ по п. 117, в котором неопластическое расстройство ассоциировано с образованием солидных опухолей в организме субъекта.

123. Способ по п. 122, в котором солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака простаты, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака головного мозга/ЦНС, рака шейки матки, эзофагеального рака, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичников, рака поджелудочной железы и сарком.

124. Способ по п. 123, в котором солидная опухоль представляет собой меланому.

125. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-20 для применения при лечении болезни или состояния, восприимчивых к ингибированию сигнализации IL-1.

126. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 125, отличающиеся тем, что болезнь или состояние, восприимчивые к ингибированию сигнализации IL-1, выбирают из группы, состоящей из ревматоидного артрита, всех типов ювенильного артрита, включая системное начало ювенильного идиопатического артрита (SOJIA), остеоартрита, семейного холодового аутовоспалительного синдрома (FCAS), синдрома Макла-Уэльса, младенческого мультисистемного воспалительного заболевания (NOMID), семейной средиземноморской лихорадки (FMF), пиогенного артрита, гангренозной пиодермии и акне-синдрома (PAPA), болезни Стилла, развившейся у взрослых, синдрома гипериммуноглобулинемии D, сахарного диабета типа 2, синдрома активации макрофагов, периодического синдрома, ассоциированного с мутацией гена рецептора фактора некроза опухоли, болезни Блау, анкилозирующего спондилоартрита, острого лихорадочного нейтрофильного дерматоза, волчаночного артрита, болезни Альцгеймера, псориаза, астмы, атеросклероза, саркоидоза, атопического дерматита, системной красной волчанки, буллезного пемфигоида, сахарного диабета типа 1, хронической обструктивной болезни легких, гастрита, вызванного Helicobacter pylori, воспалительной болезни кишечника, гепатита C, ишемически-реперфузионного повреждения, рассеянного склероза, нейссериального или пневмококкового менингита, туберкулеза, синдрома Бехчета, септического шока, гомологичной болезни, астмы, диабета типа 1, болезни Альцгеймера, атеросклероза, Т-клеточного лейкоза взрослых, множественной миеломы, периодонтита, ожирения и ассоциированных с ожирением болезней, болезни межпозвоночных дисков, синдрома раздраженной толстой кишки, синдрома Шницлера, аллергии/атопического дерматита и подагры.

127. Конъюгат по любому из пп.21-33 для применения при лечении болезни или состояния, восприимчивых к ингибированию сигнализации IL-1.

128. Конъюгат по п. 127, отличающиеся тем, что болезнь или состояние, восприимчивые к ингибированию сигнализации IL-1, выбирают из группы, состоящей из ревматоидного артрита, всех типов ювенильного артрита, включая системное начало ювенильного идиопатического артрита (SOJIA), остеоартрита, семейного холодового аутовоспалительного синдрома (FCAS), синдрома Макла-Уэльса, младенческого мультисистемного воспалительного заболевания (NOMID), семейной средиземноморской лихорадки (FMF), пиогенного артрита, гангренозной пиодермии и акне-синдрома (PAPA), болезни Стилла, развившейся у взрослых, синдрома гипериммуноглобулинемии D, сахарного диабета типа 2, синдрома активации макрофагов, периодического синдрома, ассоциированного с мутацией гена рецептора фактора некроза опухоли, болезни Блау, анкилозирующего спондилоартрита, острого лихорадочного нейтрофильного дерматоза, волчаночного артрита, болезни Альцгеймера, псориаза, астмы, атеросклероза, саркоидоза, атопического дерматита, системной красной волчанки, буллезного пемфигоида, сахарного диабета типа 1, хронической обструктивной болезни легких, гастрита, вызванного Helicobacter pylori, воспалительной болезни кишечника, гепатита C, ишемически-реперфузионного повреждения, рассеянного склероза, нейссериального или пневмококкового менингита, туберкулеза, синдрома Бехчета, септического шока, гомологичной болезни, астмы, диабета типа 1, болезни Альцгеймера, атеросклероза, Т-клеточного лейкоза взрослых, множественной миеломы, периодонтита, ожирения и ассоциированных с ожирением болезней, болезни межпозвоночных дисков, синдрома раздраженной толстой кишки, синдрома Шницлера, аллергии/атопического дерматита и подагры.

129. Конъюгат по любому из пп.34-53 для применения при лечении болезни или состояния, восприимчивых к ингибированию сигнализации IL-1.

130. Конъюгат по п. 129, отличающиеся тем, что болезнь или состояние, восприимчивые к ингибированию сигнализации IL-1, выбирают из группы, состоящей из ревматоидного артрита, всех типов ювенильного артрита, включая системное начало ювенильного идиопатического артрита (SOJIA), остеоартрита, семейного холодового аутовоспалительного синдрома (FCAS), синдрома Макла-Уэльса, младенческого мультисистемного воспалительного заболевания (NOMID), семейной средиземноморской лихорадки (FMF), пиогенного артрита, гангренозной пиодермии и акне-синдрома (PAPA), болезни Стилла, развившейся у взрослых, синдрома гипериммуноглобулинемии D, сахарного диабета типа 2, синдрома активации макрофагов, периодического синдрома, ассоциированного с мутацией гена рецептора фактора некроза опухоли, болезни Блау, анкилозирующего спондилоартрита, острого лихорадочного нейтрофильного дерматоза, волчаночного артрита, болезни Альцгеймера, псориаза, астмы, атеросклероза, саркоидоза, атопического дерматита, системной красной волчанки, буллезного пемфигоида, сахарного диабета типа 1, хронической обструктивной болезни легких, гастрита, вызванного Helicobacter pylori, воспалительной болезни кишечника, гепатита C, ишемически-реперфузионного повреждения, рассеянного склероза, нейссериального или пневмококкового менингита, туберкулеза, синдрома Бехчета, септического шока, гомологичной болезни, астмы, диабета типа 1, болезни Альцгеймера, атеросклероза, Т-клеточного лейкоза взрослых, множественной миеломы, периодонтита, ожирения и ассоциированных с ожирением болезней, болезни межпозвоночных дисков, синдрома раздраженной толстой кишки, синдрома Шницлера, аллергии/атопического дерматита и подагры.

131. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20 в изготовлении медикамента для лечения болезни или состояния, восприимчивых к ингибированию сигнализации IL-1.

132. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п. 131, отличающееся тем, что болезнь или состояние, восприимчивые к ингибированию сигнализации IL-1, выбирают из группы, состоящей из ревматоидного артрита, всех типов ювенильного артрита, включая системное начало ювенильного идиопатического артрита (SOJIA), остеоартрита, семейного холодового аутовоспалительного синдрома (FCAS), синдрома Макла-Уэльса, младенческого мультисистемного воспалительного заболевания (NOMID), семейной средиземноморской лихорадки (FMF), пиогенного артрита, гангренозной пиодермии и акне-синдрома (PAPA), болезни Стилла, развившейся у взрослых, синдрома гипериммуноглобулинемии D, сахарного диабета типа 2, синдрома активации макрофагов, периодического синдрома, ассоциированного с мутацией гена рецептора фактора некроза опухоли, болезни Блау, анкилозирующего спондилоартрита, острого лихорадочного нейтрофильного дерматоза, волчаночного артрита, болезни Альцгеймера, псориаза, астмы, атеросклероза, саркоидоза, атопического дерматита, системной красной волчанки, буллезного пемфигоида, сахарного диабета типа 1, хронической обструктивной болезни легких, гастрита, вызванного Helicobacter pylori, воспалительной болезни кишечника, гепатита C, ишемически-реперфузионного повреждения, рассеянного склероза, нейссериального или пневмококкового менингита, туберкулеза, синдрома Бехчета, септического шока, гомологичной болезни, астмы, диабета типа 1, болезни Альцгеймера, атеросклероза, Т-клеточного лейкоза взрослых, множественной миеломы, периодонтита, ожирения и ассоциированных с ожирением болезней, болезни межпозвоночных дисков, синдрома раздраженной толстой кишки, синдрома Шницлера, аллергии/атопического дерматита и подагры.

133. Применение конъюгата по любому из пп.21-33 в изготовлении медикамента для лечения болезни или состояния, восприимчивых к ингибированию сигнализации IL-1.

134. Применение конъюгата по п. 133, отличающееся тем, что болезнь или состояние, восприимчивые к ингибированию сигнализации IL-1, выбирают из группы, состоящей из ревматоидного артрита, всех типов ювенильного артрита, включая системное начало ювенильного идиопатического артрита (SOJIA), остеоартрита, семейного холодового аутовоспалительного синдрома (FCAS), синдрома Макла-Уэльса, младенческого мультисистемного воспалительного заболевания (NOMID), семейной средиземноморской лихорадки (FMF), пиогенного артрита, гангренозной пиодермии и акне-синдрома (PAPA), болезни Стилла, развившейся у взрослых, синдрома гипериммуноглобулинемии D, сахарного диабета типа 2, синдрома активации макрофагов, периодического синдрома, ассоциированного с мутацией гена рецептора фактора некроза опухоли, болезни Блау, анкилозирующего спондилоартрита, острого лихорадочного нейтрофильного дерматоза, волчаночного артрита, болезни Альцгеймера, псориаза, астмы, атеросклероза, саркоидоза, атопического дерматита, системной красной волчанки, буллезного пемфигоида, сахарного диабета типа 1, хронической обструктивной болезни легких, гастрита, вызванного Helicobacter pylori, воспалительной болезни кишечника, гепатита C, ишемически-реперфузионного повреждения, рассеянного склероза, нейссериального или пневмококкового менингита, туберкулеза, синдрома Бехчета, септического шока, гомологичной болезни, астмы, диабета типа 1, болезни Альцгеймера, атеросклероза, Т-клеточного лейкоза взрослых, множественной миеломы, периодонтита, ожирения и ассоциированных с ожирением болезней, болезни межпозвоночных дисков, синдрома раздраженной толстой кишки, синдрома Шницлера, аллергии/атопического дерматита и подагры.

135. Применение конъюгата по любому из пп.34-53 в изготовлении медикамента для лечения болезни или состояния, восприимчивых к ингибированию сигнализации IL-1.

136. Применение конъюгата по п. 135, отличающееся тем, что болезнь или состояние, восприимчивые к ингибированию сигнализации IL-1, выбирают из группы, состоящей из ревматоидного артрита, всех типов ювенильного артрита, включая системное начало ювенильного идиопатического артрита (SOJIA), остеоартрита, семейного холодового аутовоспалительного синдрома (FCAS), синдрома Макла-Уэльса, младенческого мультисистемного воспалительного заболевания (NOMID), семейной средиземноморской лихорадки (FMF), пиогенного артрита, гангренозной пиодермии и акне-синдрома (PAPA), болезни Стилла, развившейся у взрослых, синдрома гипериммуноглобулинемии D, сахарного диабета типа 2, синдрома активации макрофагов, периодического синдрома, ассоциированного с мутацией гена рецептора фактора некроза опухоли, болезни Блау, анкилозирующего спондилоартрита, острого лихорадочного нейтрофильного дерматоза, волчаночного артрита, болезни Альцгеймера, псориаза, астмы, атеросклероза, саркоидоза, атопического дерматита, системной красной волчанки, буллезного пемфигоида, сахарного диабета типа 1, хронической обструктивной болезни легких, гастрита, вызванного Helicobacter pylori, воспалительной болезни кишечника, гепатита C, ишемически-реперфузионного повреждения, рассеянного склероза, нейссериального или пневмококкового менингита, туберкулеза, синдрома Бехчета, септического шока, гомологичной болезни, астмы, диабета типа 1, болезни Альцгеймера, атеросклероза, Т-клеточного лейкоза взрослых, множественной миеломы, периодонтита, ожирения и ассоциированных с ожирением болезней, болезни межпозвоночных дисков, синдрома раздраженной толстой кишки, синдрома Шницлера, аллергии/атопического дерматита и подагры.

137. Способ лечения болезни или состояния, восприимчивых к ингибированию сигнализации IL-1 у субъекта, включающий стадию введения субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20 или его конъюгата по любому из пп.21-53.

138. Способ по п. 137, в котором болезнь или состояние, восприимчивые к ингибированию сигнализации IL-1, выбирают из группы, состоящей из ревматоидного артрита, всех типов ювенильного артрита, включая системное начало ювенильного идиопатического артрита (SOJIA), остеоартрита, семейного холодового аутовоспалительного синдрома (FCAS), синдрома Макла-Уэльса, младенческого мультисистемного воспалительного заболевания (NOMID), семейной средиземноморской лихорадки (FMF), пиогенного артрита, гангренозной пиодермии и акне-синдрома (PAPA), болезни Стилла, развившейся у взрослых, синдрома гипериммуноглобулинемии D, сахарного диабета типа 2, синдрома активации макрофагов, периодического синдрома, ассоциированного с мутацией гена рецептора фактора некроза опухоли, болезни Блау, анкилозирующего спондилоартрита, острого лихорадочного нейтрофильного дерматоза, волчаночного артрита, болезни Альцгеймера, псориаза, астмы, атеросклероза, саркоидоза, атопического дерматита, системной красной волчанки, буллезного пемфигоида, сахарного диабета типа 1, хронической обструктивной болезни легких, гастрита, вызванного Helicobacter pylori, воспалительной болезни кишечника, гепатита C, ишемически-реперфузионного повреждения, рассеянного склероза, нейссериального или пневмококкового менингита, туберкулеза, синдрома Бехчета, септического шока, гомологичной болезни, астмы, диабета типа 1, болезни Альцгеймера, атеросклероза, Т-клеточного лейкоза взрослых, множественной миеломы, периодонтита, ожирения и ассоциированных с ожирением болезней, болезни межпозвоночных дисков, синдрома раздраженной толстой кишки, синдрома Шницлера, аллергии/атопического дерматита и подагры.

139. In vitro способ детектирования раковых клеток, экспрессирующих IL1RAP, у субъекта, включающий:

(a) обеспечение образца клеток от тестируемого субъекта;

(b) необязательно, экстракцию и/или очистку клеток, присутствующих в образце;

(c) введение в контакт антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20 или конъюгата по любому из пп.21-53 с клетками, присутствующими в образце;

(d) определение того, связывается ли антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с клетками,

причем связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с клетками указывает на присутствие раковых клеток в ткани субъекта.

140. In vitro способ идентификации пациента с раком, ассоциированным с клетками, экспрессирующими IL1RAP, который получит пользу от лечения антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-20 или конъюгатом по любому из пп. 21-53, включающий:

(a) обеспечение образца раковых клеток от пациента, подлежащего тестированию;

(b) необязательно, экстракцию и/или очистку клеток, присутствующих в образце;

(c) введение в контакт антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20 или конъюгата по любому из пп.21-53 с клетками, присутствующими в образце;

(d) определение того, связывается ли антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с клетками,

причем связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с раковыми клетками указывает, что пациент получит пользу от лечения антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-20 или конъюгатом по любому из пп.21-53.

141. Способ лечения пациента с раком, ассоциированным с клетками, экспрессирующими IL1RAP, включающий введение субъекту, у которого был идентифицирован рак с применением способа по п. 139 или 140, терапевтического агента, эффективного при лечении указанного рака.

142. Способ лечения пациента с раком по п. 141, в котором терапевтический агент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-20 или конъюгат по любому из пп.21-53.

143. Способ лечения пациента с раком, ассоциированным с клетками, экспрессирующими IL1RAP, включающий:

(a) подготовку образца клеток от субъекта, подлежащего тестированию на присутствие раковых клеток, экспрессирующих IL1RAP выше пороговых критериев с применением способа по п. 139 или 140;

(b) выбор субъектов для лечения, образцы клеток которых, протестированные на стадии (a), содержат раковые клетки с экспрессией IL1RAP выше пороговых критериев; и

(c) введение субъекту, выбранному на стадии (b), терапевтического агента, эффективного для лечения указанного рака.

144. Способ лечения пациента с раком по п. 143, включающий:

(a) получение образца клеток от субъекта;

(b) тестирование указанных клеток на присутствие раковых клеток, экспрессирующих IL1RAP выше пороговых критериев с применением способа по п. 139 или 140;

(c) выбор субъектов для лечения, образцы клеток которых, протестированные на стадии (b), содержат раковые клетки с экспрессией IL1RAP выше пороговых критериев; и

(d) введение субъекту, выбранному на стадии (c), терапевтического агента, эффективного для лечения указанного рака.