Не относящиеся к человеку животные, имеющие гуманизированный ген кластера дифференцировки 274

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированному грызуну для экспрессии гуманизированного полипептида CD274, геном которого содержит гуманизированный ген CD274 в эндогенном локусе CD274, к способу его получения, а также к его клетке, ткани и эмбриону. Также раскрыт способ скрининга в отношении лекарственного средства, способного лечить опухоль, включающий использование вышеуказанного грызуна. Изобретение позволяет эффективно осуществлять скрининг в отношении лекарственного средства, способного лечить опухоль. 8 н. и 16 з.п. ф-лы, 6 ил., 9 табл., 3 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СМЕЖНЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает преимущество по предварительной заявке США №62/089,549, поданной 9 декабря 2014 г., и предварительной заявке США №62/106,525, поданной 22 января 2015 г., которые полностью включены в настоящий документ путем ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПУТЕМ ССЫЛКИ

Перечень последовательностей в текстовом файле формата ASCII с именем 31971_10133WO01_PCTSequenceListing.txt размером 79 КБ, созданном 24 ноября 2015 г. и отправленном в Бюро по патентам и товарным знакам США через EFS-Web, включен в настоящий документ путем ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Несмотря на значительные достижения в лечении аутоиммунных, онкологических и инфекционных заболеваний, основные проблемы мировой системы здравоохранения остаются нерешенными. Эти основные проблемы обусловлены отчасти способностью клеток модулировать иммунный ответ посредством полипептидов клеточной поверхности. Посредством некоторых полипептидов клеточной поверхности клетки и микроорганизмы узурпируют сигнальные пути и ослабляют отслеживающие механизмы иммунной системы хозяина, ингибируя реакцию на них иммунной системы, что приводит к развитию характерных внешних проявлений заболеваний. Тем не менее, недостаточно разработаны системы in vivo для оптимального определения терапевтического потенциала новых нацеленных способов терапии аутоиммунных, онкологических и инфекционных заболеваний, которые были бы рассчитаны на модуляцию иммунных ответов на подобные патологии и на выяснение молекулярных аспектов того, как такие клетки манипулируют иммунными ответами. Такие системы in vivo создают основу для оценки терапевтической эффективности и разработки потенциальных агентов для лечения аутоиммунных, онкологических и инфекционных заболеваний в будущем.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение включает в себя признание того факта, что желательно создать не относящихся к человеку животных для получения улучшенных систем in vivo, предназначенных для идентификации и разработки новых лекарственных средств, а в некоторых вариантах осуществления - схем лечения, которые можно было бы использовать для лечения аутоиммунных, воспалительных и онкологических заболеваний. Настоящее изобретение также включает в себя признание того факта, что желательно создать не относящихся к человеку животных для получения улучшенных систем in vivo, предназначенных для идентификации и разработки новых лекарственных средств, а в некоторых вариантах осуществления - схем лечения, которые можно было бы использовать для лечения инфекционных заболеваний. Дополнительно настоящее изобретение также включает в себя признание того факта, что не относящиеся к человеку животные, имеющие гуманизированный ген CD274 и/или иным способом экспрессирующие, содержащие или продуцирующие человеческий или гуманизированный полипептид PD-L1, являются желательными, например, для использования в идентификации и разработке лекарственных средств, повышающих противоопухолевый и/или противомикробный иммунитет. В некоторых вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения образуют улучшенные системы in vivo для идентификации и разработки комбинированных видов лечения, включающих в себя нацеливание на PD-L1 или косвенное нацеливание на партнера PD-L1 по связыванию (например, PD-1, B7-1).

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается не относящееся к человеку животное, геном которого содержит ген CD274, содержащий генетический материал от двух разных биологических видов (например, человека и не человека). В некоторых вариантах осуществления ген CD274 не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе, кодирует полипептид PD-L1, содержащий человеческие и нечеловеческие участки, причем человеческие и нечеловеческие участки соединены друг с другом с образованием функционального полипептида PD-L1. В некоторых вариантах осуществления нечеловеческий участок содержит эндогенный участок. В некоторых вариантах осуществления ген CD274 не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе, кодирует полипептид PD-L1, содержащий полный или частичный внеклеточный домен человеческого полипептида PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается не относящееся к человеку животное, экспрессирующее полипептид PD-L1, содержащий человеческий участок и эндогенный участок. В некоторых вариантах осуществления полипептид PD-L1 настоящего изобретения транслируется в клетке не относящегося к человеку животного с нечеловеческим сигнальным пептидом; в некоторых конкретных вариантах осуществления - сигнальным пептидом грызуна.

В некоторых вариантах осуществления эндогенный участок содержит внутриклеточный участок эндогенного полипептида PD-L1. В некоторых вариантах осуществления эндогенный участок дополнительно содержит трансмембранный участок эндогенного полипептида PD-L1. В некоторых вариантах осуществления эндогенный участок имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична соответствующей аминокислотной последовательности мышиного полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6. В некоторых вариантах осуществления эндогенный участок имеет аминокислотную последовательность, которая по существу идентична соответствующей аминокислотной последовательности мышиного полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6. В некоторых вариантах осуществления эндогенный участок имеет аминокислотную последовательность, которая идентична соответствующей аминокислотной последовательности мышиного полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6.

В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит аминокислоты 19-238 человеческого полипептида PD-L1. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит аминокислоты 19-277 человеческого полипептида PD-L1. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит аминокислоты 19-131 человеческого полипептида PD-L1. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична соответствующей аминокислотной последовательности человеческого полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит аминокислотную последовательность, которая по существу идентична соответствующей аминокислотной последовательности человеческого полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит аминокислотную последовательность, которая идентична соответствующей аминокислотной последовательности человеческого полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6.

В некоторых вариантах осуществления полипептид PD-L1 настоящего изобретения кодируется геном CD274, содержащим эндогенную нечеловеческую последовательность CD274 и человеческую последовательность CD274. В некоторых конкретных вариантах осуществления ген CD274 содержит экзоны 1, 2, 6 и 7 эндогенного CD274. В некоторых конкретных вариантах осуществления ген CD274 дополнительно содержит, полностью или частично, экзон 5 эндогенного CD274. В некоторых вариантах осуществления ген CD274, содержащий эндогенную нечеловеческую последовательность CD274 и человеческую последовательность CD274, находится в эндогенном локусе CD274.

В некоторых вариантах осуществления ген CD274 настоящего изобретения содержит последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления ген CD274 настоящего изобретения содержит последовательность, по существу идентичную SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления ген CD274 настоящего изобретения содержит последовательность, идентичную SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 16.

В некоторых вариантах осуществления ген CD274 настоящего изобретения содержит SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления ген CD274 настоящего изобретения содержит SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления ген CD274 настоящего изобретения содержит SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления ген CD274 настоящего изобретения содержит SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления ген CD274 настоящего изобретения содержит SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается гуманизированный локус CD274. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный локус CD274 представляет собой эндогенный нечеловеческий локус CD274, генетически модифицированный для включения человеческой последовательности CD274. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается гуманизированный локус CD274, содержащий один или более экзонов нечеловеческого гена CD274, функционально связанных с одним или более полными или частичными экзонами человеческого гена CD274. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный локус CD274 дополнительно содержит 5' и 3' нетранслируемые области (UTR) нечеловеческого CD274, фланкирующие один или более экзонов человеческого гена CD274. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный локус CD274 находится под контролем промотора грызуна; в некоторых конкретных вариантах осуществления - эндогенного промотора грызуна.

В некоторых вариантах осуществления гуманизированный локус CD274 содержит экзоны 1, 2, 6 и 7 нечеловеческого CD274, функционально связанные с экзонами 3 и 4 человеческого CD274. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный локус CD274 содержит экзоны 1, 2, 6 и 7 нечеловеческого CD274, экзоны 3 и 4 человеческого CD274 и дополнительно содержит экзон 5 CD274, содержащий человеческий участок и нечеловеческий участок, и причем указанные нечеловеческие и человеческие экзоны функционально связаны. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок экзона 5 CD274 включает в себя нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки, входящие во внеклеточный домен человеческого полипептида PD-L1. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок экзона 5 CD274 включает в себя нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки 229-238 человеческого полипептида PD-L1. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок экзона 5 CD274 включает в себя около 32 п.н. экзона 5 человеческого CD274. В некоторых вариантах осуществления нечеловеческий участок экзона 5 CD274 включает в себя нуклеотиды, кодирующие трансмембранную последовательность. В некоторых вариантах осуществления нечеловеческий участок экзона 5 CD274 включает в себя около 69 п.н. экзона 5 CD274 грызуна. В некоторых конкретных вариантах осуществления гуманизированный локус CD274 содержит экзон 5 CD274 с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 12. В некоторых конкретных вариантах осуществления гуманизированный локус CD274 содержит экзон 5 CD274, кодирующий аминокислоты, соответствующие остаткам L229-R238 человеческого полипептида PD-L1, и аминокислоты, соответствующие остаткам T238-Q263 полипептида PD-L1 грызуна.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается не относящееся к человеку животное, имеющее ген CD274, который содержит эндогенный участок и человеческий участок, причем эндогенный и человеческий участки функционально связаны с нечеловеческим промотором CD274. В некоторых вариантах осуществления нечеловеческий промотор CD274 представляет собой промотор CD274 грызуна. В некоторых конкретных вариантах осуществления промотор CD274 грызуна представляет собой эндогенный промотор CD274 грызуна.

В некоторых вариантах осуществления эндогенный участок содержит экзоны 1, 2, 6 и 7 эндогенного CD274. В некоторых вариантах осуществления эндогенный участок дополнительно содержит, полностью или частично, экзон 5 эндогенного CD274. В некоторых вариантах осуществления экзоны 1, 2, 5 (полностью или частично), 6 и 7 эндогенного гена CD274 являются по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичными соответствующим экзонам 1, 2, 5 (полностью или частично), 6 и 7 мышиного гена Cd274, показанного на Фиг. 6. В некоторых вариантах осуществления экзоны 1, 2, 5 (полностью или частично), 6 и 7 эндогенного гена CD274 являются по существу идентичными соответствующим экзонам 1, 2, 5 (полностью или частично), 6 и 7 мышиного гена Cd274, показанного на Фиг. 6. В некоторых вариантах осуществления экзоны 1, 2, 5 (полностью или частично), 6 и 7 эндогенного гена CD274 являются идентичными соответствующим экзонам 1, 2, 5 (полностью или частично), 6 и 7 мышиного гена Cd274, показанного на Фиг. 6.

В некоторых вариантах осуществления человеческий участок кодирует аминокислоты 19-131, 19-227 или 19-238 человеческого полипептида PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит экзоны 3 и 4 человеческого гена CD274. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок дополнительно содержит, полностью или частично, экзон 5 человеческого CD274. В некоторых вариантах осуществления экзоны 3, 4 и 5 (полностью или частично) человеческого CD274 являются по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичными соответствующим экзонам 3, 4 и 5 (полностью или частично) человеческого гена CD274, показанного на Фиг. 6. В некоторых вариантах осуществления экзоны 3, 4 и 5 (полностью или частично) человеческого CD274 являются по существу идентичными соответствующим экзонам 3, 4 и 5 (полностью или частично) человеческого гена CD274, показанного на Фиг. 6. В некоторых вариантах осуществления экзоны 3, 4 и 5 (полностью или частично) человеческого CD274 являются идентичными соответствующим экзонам 3, 4 и 5 (полностью или частично) человеческого гена CD274, показанного на Фиг. 6. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит последовательность, оптимизированную по кодонам для экспрессии у не относящегося к человеку животного; в некоторых вариантах осуществления - для экспрессии у грызуна; в некоторых конкретных вариантах осуществления - для экспрессии у мыши или крысы.

В некоторых вариантах осуществления человеческий участок включает в себя последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит последовательность, по существу идентичную SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит последовательность, идентичную SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит последовательность, идентичную или по существу идентичную SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное настоящего изобретения имеет геном, содержащий ген CD274, содержащий SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается полипептид PD-L1, продуцированный, экспрессированный или полученный от не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе. В некоторых конкретных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный, экспрессированный или полученный от не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе, содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична гуманизированному полипептиду PD-L1, показанному на Фиг. 6. В некоторых конкретных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный, экспрессированный или полученный от не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе, содержит аминокислотную последовательность, которая по существу идентична гуманизированному полипептиду PD-L1, показанному на Фиг. 6. В некоторых конкретных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный, экспрессированный или полученный от не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе, содержит аминокислотную последовательность, которая идентична гуманизированному полипептиду PD-L1, показанному на Фиг. 6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается изолированная клетка или ткань от не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изолированная клетка или ткань содержит ген CD274, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетка относится к лимфоидной линии. В некоторых вариантах осуществления клетка относится к миелоидной линии. В некоторых вариантах осуществления клетка выбрана из В-клетки, дендритной клетки, макрофага, моноцита и Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления ткань выбрана из жировой ткани, мочевого пузыря, мозга, молочной железы, костного мозга, глаза, сердца, кишечника, почки, печени, легкого, лимфоузла, мышц, поджелудочной железы, плазмы, сыворотки, кожи, селезенки, желудка, тимуса, семенников, яичников и их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается нечеловеческая эмбриональная стволовая клетка, геном которой содержит ген CD274, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления нечеловеческая эмбриональная стволовая клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку грызуна. В некоторых конкретных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и взята из линии мышей 129, C57BL или их смеси. В некоторых конкретных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и относится к смеси линий 129 и C57BL.

В некоторых вариантах осуществления нечеловеческая эмбриональная стволовая клетка настоящего изобретения имеет геном, содержащий ген CD274, содержащий SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 или их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложено применение не относящейся к человеку эмбриональной стволовой клетки, как описано в настоящем документе, для создания не относящегося к человеку животного. В некоторых конкретных вариантах осуществления нечеловеческая эмбриональная стволовая клетка представляет собой мышиную эмбриональную стволовую клетку и используется для получения мыши, содержащей ген CD274, как описано в настоящем документе. В некоторых конкретных вариантах осуществления нечеловеческая эмбриональная стволовая клетка представляет собой крысиную эмбриональную стволовую клетку и используется для получения крысы, содержащей ген CD274, как описано в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается нечеловеческий эмбрион, содержащий, изготовленный из, полученный из или созданный из нечеловеческой эмбриональной стволовой клетки, содержащей ген CD274, как описано в настоящем документе. В некоторых конкретных вариантах осуществления нечеловеческий эмбрион представляет собой эмбрион грызуна; в некоторых вариантах осуществления - эмбрион мыши; в некоторых вариантах осуществления - эмбрион крысы.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложено использование нечеловеческого эмбриона, описанного в настоящем документе, для создания не относящегося к человеку животного. В некоторых конкретных вариантах осуществления нечеловеческий эмбрион представляет собой мышиный эмбрион и используется для получения мыши, содержащей ген CD274, как описано в настоящем документе. В некоторых конкретных вариантах осуществления нечеловеческий эмбрион представляет собой крысиный эмбрион и используется для получения крысы, содержащей ген CD274, как описано в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается нацеливающий вектор или нуклеотидная конструкция, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается нацеливающий вектор или нуклеотидная конструкция, который (-ая) содержит гуманизированный ген CD274, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается нацеливающий вектор (или нуклеотидная конструкция), содержащий (-ая) ген CD274, который кодирует полипептид PD-L1, содержащий, полностью или частично, человеческий внеклеточный домен; в некоторых конкретных вариантах осуществления - полипептид PD-L1, содержащий аминокислоты 19-131, 19-227 или 19-238 человеческого полипептида PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления нацеливающий вектор или нуклеотидная конструкция настоящего изобретения содержит, полностью или частично, один или более экзонов нечеловеческого гена CD274, функционально связанных с одним или более экзонами, полностью или частично, человеческого гена CD274. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий вектор или нуклеотидная конструкция дополнительно содержит 5' и 3' нетранслируемые области (UTR) нечеловеческого CD274, фланкирующие один или более экзонов человеческого гена CD274. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий вектор или нуклеотидная конструкция содержит один или более селективных маркеров. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий вектор или нуклеотидная конструкция содержит один или более участков сайт-специфической рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий вектор или нуклеотидная конструкция содержит экзоны 3 и 4 человеческого CD274. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий вектор или нуклеотидная конструкция содержит экзоны 3 и 4 человеческого CD274 и, полностью или частично, экзон 5 человеческого CD274.

В некоторых вариантах осуществления нацеливающий вектор или нуклеотидная конструкция содержит SEQ ID NO: 7. В некоторых конкретных вариантах осуществления нацеливающий вектор или нуклеотидная конструкция содержит последовательность, идентичную или по существу идентичную любой из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается использование нацеливающего вектора или нуклеотидной конструкции, как описано в настоящем документе, для получения модифицированной нечеловеческой эмбриональной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается использование нацеливающего вектора или нуклеотидной конструкции, как описано в настоящем документе, для получения модифицированной нечеловеческой клетки. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается использование нацеливающего вектора или нуклеотидной конструкции, как описано в настоящем документе, для получения модифицированного нечеловеческого эмбриона. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается использование нацеливающего вектора или нуклеотидной конструкции, как описано в настоящем документе, для получения не относящегося к человеку животного.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается способ получения не относящегося к человеку животного, экспрессирующего полипептид PD-L1 из эндогенного гена CD274, причем полипептид PD-L1 содержит человеческую последовательность, при этом способ включает в себя (а) вставку геномного фрагмента в эндогенный ген CD274 в нечеловеческой эмбриональной стволовой клетке, причем указанный геномный фрагмент содержит, полностью или частично, нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий полипептид PD-L1; (b) получение нечеловеческой эмбриональной стволовой клетки, созданной в (а); и (с) создание не относящегося к человеку животного с использованием эмбриональной стволовой клетки грызуна из (b).

В некоторых вариантах осуществления человеческая последовательность содержит аминокислоты 19-131, 19-227 или 19-238 человеческого полипептида PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность содержит экзоны 3 и 4 человеческого CD274. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность дополнительно содержит, полностью или частично, экзон 5 человеческого CD274. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность содержит один или более селективных маркеров. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность содержит один или более участков сайт-специфической рекомбинации.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается способ получения не относящегося к человеку животного, геном которого содержит ген CD274, кодирующий полипептид PD-L1, содержащий человеческий участок и эндогенный участок, которые функционально связаны с нечеловеческим промотором CD274, причем способ включает в себя модификацию генома не относящегося к человеку животного таким образом, чтобы он содержал ген CD274, кодирующий полипептид PD-L1, имеющий человеческий участок и эндогенный участок, которые функционально связаны с нечеловеческим промотором CD274, тем самым получая не относящееся к человеку животное. В некоторых вариантах осуществления нечеловеческий промотор CD274 представляет собой промотор CD274 грызуна. В некоторых конкретных вариантах осуществления промотор CD274 грызуна представляет собой эндогенный промотор CD274 грызуна.

В некоторых вариантах осуществления человеческий участок содержит аминокислоты 19-131, 19-227 или 19-238 человеческого полипептида PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления ген CD274 модифицирован для включения экзонов 3 и 4 человеческого CD274. В некоторых вариантах осуществления ген CD274 модифицирован для включения экзонов 3, 4 и, полностью или частично, 5 человеческого CD274.

В некоторых вариантах осуществления модифицирование генома не относящегося к человеку животного выполняют в нечеловеческой эмбриональной стволовой клетке, после чего создают не относящееся к человеку животное при помощи указанной нечеловеческой эмбриональной стволовой клетки. В некоторых конкретных вариантах осуществления нечеловеческая эмбриональная стволовая клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку грызуна; в некоторых вариантах осуществления - мышиную эмбриональную стволовую клетку; в некоторых вариантах осуществления - крысиную эмбриональную стволовую клетку.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается не относящееся к человеку животное, которое может быть получено, создано или продуцировано способом, описанным в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается способ снижения, предотвращения или устранения роста опухоли у не относящегося к человеку животного, включающий в себя этапы введения лекарственного средства, нацеленного на человеческий PD-L1, не относящемуся к человеку животному, геном которого содержит ген CD274, кодирующий полипептид PD-L1, имеющий человеческий участок и эндогенный участок, которые функционально связаны с промотором CD274 не относящегося к человеку животного; причем введение выполняют в условиях и в течение времени, достаточных для снижения, предотвращения или устранения роста опухоли у не относящегося к человеку животного.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается способ уничтожения опухолевых клеток у не относящегося к человеку животного, включающий в себя этапы введения лекарственного средства, нацеленного на человеческий PD-L1, не относящемуся к человеку животному, геном которого содержит ген CD274, кодирующий полипептид PD-L1, имеющий человеческий участок и эндогенный участок, которые функционально связаны с промотором CD274 не относящегося к человеку животного; причем введение выполняют в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы лекарственное средство обусловило уничтожение опухолевых клеток у не относящегося к человеку животного.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается способ оценки фармакокинетических свойств лекарственного средства, нацеленного на человеческий PL-L1, включающий в себя этапы введения лекарственного средства, нацеленного на человеческий PD-L1, не относящемуся к человеку животному, геном которого содержит ген CD274, кодирующий полипептид PD-L1, имеющий человеческий участок и эндогенный участок, которые функционально связаны с промотором CD274 не относящегося к человеку животного; и выполнения анализа для определения одного или более фармакокинетических свойств лекарственного средства, нацеленного на человеческий PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается способ оценки эффективности лекарственного средства, нацеленного на человеческий PL-L1, у не относящегося к человеку животного, включающий в себя этапы введения лекарственного средства, нацеленного на человеческий PD-L1, не относящемуся к человеку животному, геном которого содержит ген CD274, кодирующий полипептид PD-L1, имеющий человеческий участок и эндогенный участок, которые функционально связаны с промотором CD274 не относящегося к человеку животного; и выполнения анализа для определения эффективности лекарственного средства, нацеленного на человеческий PD-L1.

В различных вариантах осуществления не относящееся к человеку животное, как описано в настоящем документе, представляет собой грызуна, геном которого содержит ген CD274, кодирующий полипептид PD-L1, имеющий человеческий участок и эндогенный участок, которые функционально связаны с промотором CD274 грызуна. В различных вариантах осуществления промотор CD274 грызуна представляет собой эндогенный промотор CD274 грызуна. В различных вариантах осуществления человеческий участок содержит аминокислоты 19-131, 19-227 или 19-238 человеческого полипептида PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство, нацеленное на человеческий PD-L1, представляет собой антагонист PD-L1. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство, нацеленное на человеческий PD-L1, представляет собой агонист PD-L1. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство, нацеленное на человеческий PD-L1, представляет собой антитело к PD-L1. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство, нацеленное на человеческий PD-L1, вводят не относящемуся к человеку животному внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно или подкожно.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается способ идентификации или валидации лекарственного средства или вакцины, включающий в себя этапы введения лекарственного средства или вакцины не относящемуся к человеку животному, геном которого содержит ген CD274, как описано в настоящем документе, и отслеживания одного или более из иммунного ответа на лекарственное средство или вакцину, профиля безопасности лекарственного средства или вакцины или влияния на заболевание, нарушение или состояние. В некоторых вариантах осуществления отслеживание профиля безопасности включает в себя определение того, не проявляется ли у не относящегося к человеку животного побочный эффект или неблагоприятная реакция в результате введения лекарственного средства или вакцины. В некоторых вариантах осуществления побочный эффект или неблагоприятную реакцию выбирают из заболеваемости, смертности, изменения массы тела, изменения уровня одного или более ферментов (например, печени), изменения массы одного или более органов, утраты функции (например, сенсорной, двигательной, органной и т.п.), повышенной чувствительности к одному или более заболеваниям, изменений генома не относящегося к человеку животного, увеличения или уменьшения потребления пищи и осложнений одного или более заболеваний. В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние индуцируют у не относящегося к человеку животного. В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние, индуцированное у не относящегося к человеку животного, ассоциировано с заболеванием, нарушением или состоянием, от которого страдают один или более нуждающихся в лечении пациентов-людей. В некоторых конкретных вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой антитело.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается использование не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе, в разработке лекарственного средства или вакцины для применения в медицине, например в качестве лекарства.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается использование не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе, в производстве лекарства для лечения рака или опухоли.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается использование не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе, в производстве лекарства для лечения инфекционного заболевания.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается использование не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе, в производстве лекарства для лечения воспалительного заболевания, нарушения или состояния.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается использование не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе, в производстве лекарства для лечения аутоиммунного заболевания, нарушения или состояния.

В различных вариантах осуществления ген CD274 настоящего изобретения включает в себя ген CD274, как описано в настоящем документе. В различных вариантах осуществления ген CD274 настоящего изобретения кодирует полипептид PD-L1, имеющий человеческий участок и эндогенный участок, которые функционально связаны с промотором CD274 грызуна. В различных вариантах осуществления промотор грызуна представляет собой эндогенный промотор грызуна. В различных вариантах осуществления человеческий участок содержит экзоны 3 и 4 человеческого CD274. В различных вариантах осуществления человеческий участок содержит экзоны 3 и 4 человеческого CD274 и, полностью или частично, экзон 5 человеческого CD274.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1 настоящего изобретения включает в себя полипептид PD-L1, как описано в настоящем документе.

В различных вариантах осуществления не относящееся к человеку животное настоящего изобретения не имеет определимой экспрессии полноразмерного эндогенного нечеловеческого полипептида PD-L1. В различных вариантах осуществления не относящееся к человеку животное настоящего изобретения не экспрессирует с возможностью обнаружения внеклеточный участок эндогенного полипептида PD-L1. В различных вариантах осуществления не относящееся к человеку животное настоящего изобретения не экспрессирует с возможностью обнаружения домен иммуноглобулина V и домен иммуноглобулина С эндогенного полипептида PD-L1.

В различных вариантах осуществления не относящееся к человеку животное настоящего изобретения представляет собой грызуна; в некоторых вариантах осуществления - мышь; в некоторых вариантах осуществления - крысу.

В настоящей заявке термины «около» и «приблизительно» используются как синонимы. Все цифры, используемые в настоящей заявке с терминами «около/приблизительно» или без них, охватывают любые нормальные колебания, известные обычному специалисту в соответствующей области.

Другие характеристики, цели и преимущества настоящего изобретения станут понятны из следующего подробного описания конкретных вариантов осуществления. Однако следует понимать, что несмотря на указание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, подробное описание приведено только в качестве примера, но не ограничения. Специалисту в данной области из подробного описания станут очевидными разнообразные изменения и модификации в пределах объема изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Включенные в настоящий документ чертежи, состоящие из следующих фигур, предназначены только для иллюстрации и не носят ограничительного характера.

На Фиг. 1 представлена схема (без соблюдения масштаба) геномной организации нечеловеческих (например, мышиных) и человеческих генов кластера дифференцировки 274 (CD274). Экзоны пронумерованы под каждым экзоном. Нетранслируемые области (UTR) обозначены незакрашенными прямоугольниками.

На Фиг. 2 представлена иллюстрация (без соблюдения масштаба) примеров конструкций, используемых при гуманизации нечеловеческого гена кластера дифференцировки 274 (CD274). На схеме сверху показан гуманизированный нацеливающий вектор с неомициновой кассетой, а на нижней схеме показан гуманизированный нацеливающий вектор с удаленной неомициновой кассетой. Выбранные положения нуклеотидных стыков отмечены линией под каждым стыком с указанием соответствующих SEQ ID NO. Примеры гуманизирующих фрагментов описаны на Фиг. 6 и проиллюстрированы следующим образом: гуманизирующий фрагмент А: человеческие 4494 п.н.-неомиционовая кассета-человеческие 3950 п.н. (SEQ ID NO: 7); гуманизирующий фрагмент В: человеческие 4494 п.н.-lохР-человеческие 3950 п.н. (SEQ ID NO: 8); гуманизирующий фрагмент С: человеческий фрагмент из 4494 п.н. (SEQ ID NO: 9); гуманизирующий фрагмент D: человеческий фрагмент 3950 п.н. (SEQ ID NO: 10).

На Фиг. 3 представлена схема (без соблюдения масштаба) геномной организации нечеловеческих (например, мышиных) и человеческих генов кластера дифференцировки 274 (CD274) с указанием приблизительных местоположений зондов, применяемых при анализе, описанном в примере 1. Также показаны пример гуманизирующего фрагмента (гуманизирующий фрагмент Е; SEQ ID NO: 11) в человеческом гене CD274 и пример делеции участка мышиного гена Cd274.

На Фиг. 4 представлен пример кривых роста опухоли MC38.ova/hPD-L1 в течение 21 дня у мышей, гомозиготных по гуманизации эндогенного гена PD-L1, как описано в примере 1. Контрольное Ат: антитело, не специфичное к PD-L1; а-hPD-L1: антитело, специфичное к человеческому PD-L1. Стрелками показаны дни введения антител в ходе эксперимента. Для каждой экспериментальной группы показано количество мышей без опухолей на 21-й день.

На Фиг. 5 представлен анализ методом ПЦР реального времени экспрессии мРНК CD8b, CD3 и PD-L1 в спленоцитах мышей, гомозиготных по эндогенному гену CD274, описанному в примере 1, после лечения антителами к PD-L1 или контрольными антителами. А, среднее для шести мышей в группе. В, уровни экспрессии по отдельным мышам в каждой экспериментальной группе. Контрольное Ат: антитело, не специфическое к PD-L1; a-PD-L1: антитело к PD-L1.

На Фиг. 6 представлены примеры мышиных, человеческих и гуманизированных последовательностей CD274 и PD-L1, а также примеры человеческих нуклеотидных последовательностей для гуманизации нечеловеческого гена CD274. В последовательностях мРНК жирным шрифтом показана кодирующая последовательность, а последовательные экзоны при обозначении разделены перемежающимся подчеркнутым текстом; в гуманизированных последовательностях мРНК человеческие последовательности заключены в скобки. В белковых последовательностях сигнальные пептиды подчеркнуты, внеклеточные последовательности выделены жирным шрифтом, последовательности доменов иммуноглобулина V (IgV) заключены в скобки, а внутриклеточные последовательности выделены курсивом; в гуманизированных белковых последовательностях нечеловеческие последовательности обозначены обычным шрифтом, а человеческие последовательности выделены жирным шрифтом. Гуманизирующий фрагмент А: человеческие 4494 п.н.-неомициновая кассета-человеческие 3950 п.н. (SEQ ID NO: 7); гуманизирующий фрагмент В: человеческие 4494 п.н.-lохР-человеческие 3950 п.н. (SEQ ID NO: 8); гуманизирующий фрагмент С: человеческий фрагмент из 4494 п.н. (SEQ ID NO: 9); гуманизирующий фрагмент D: человеческий фрагмент 3950 п.н. (SEQ ID NO: 10).

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами и описанными в настоящем документе экспериментальными условиями, так как такие способы и условия могут изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, служит только для описания конкретных вариантов осуществления и не ограничивает объем настоящего изобретения, который определяется формулой изобретения.

При отсутствии иных указаний все термины и фразы, используемые в настоящем документе, включают значения, которые эти термины и фразы имеют в данной области, кроме случаев, когда иное значение четко указано или очевидно из контекста, в котором используется термин или фраза. В настоящем документе описаны конкретные способы и материалы, хотя для проверки или анализа настоящего изобретения могут быть использованы любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе. Все упомянутые в настоящем документе публикации включены в него путем ссылки.

Термин «приблизительно», примененный в настоящем документе к одной или более интересующим величинам, включает в себя величину, которая подобна указанной эталонной величине. В некоторых вариантах осуществления термин «приблизительно» или «около» обозначает диапазон величин, которые лежат в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше в любую сторону (большую и меньшую) от заданной эталонной величины, кроме случаев, когда указано иное значение или иное значение очевидно из контекста (за исключением ситуаций, в которых такое число превышает 100% от возможной величины).

Термин «биологически активный» в контексте настоящего документа включает в себя характеристику любого агента, который обладает активностью в биологической системе in vitro или in vivo (например, в организме). Например, биологически активным считается агент, который при нахождении в организме оказывает биологический эффект внутри этого организма. В конкретных вариантах осуществления, в которых белок или полипептид является биологически активным, участок этого белка или полипептида, который связан по меньшей мере с одним биологическим действием белка или полипептида, обычно называется «биологически активным» участком.

Фраза «белок кластера дифференцировки 274», «белок СD274», «белок В7-Н1» или «белок PD-L1» при использовании в настоящем документе относится к трансмембранному белку, принадлежащему к семейству В7 белковых лигандов клеточной поверхности, который имеет внеклеточные домены иммуноглобулина V (IgV) и константно-подобного иммуноглобулина (IgC), которые относятся к вариабельным и константным доменам иммуноглобулинов, а также трансмембранный и цитоплазматический (или внутриклеточный) домены. PD-L1 экспрессируется как в лимфоидных (например, В-клетки, Т-клетки, дендритные клетки, макрофаги, моноциты и т.п.), так и в нелимфоидных линиях (сердце, легкие, печень, поджелудочная железа и т.п.) и вовлечен во взаимодействие между поверхностными белками мембраны, например с белком Programmed cell death 1 (PD-1) при регуляции иммунных функций. Экспрессия PD-L1 регулируется цитокинами (например, интерфероном-γ), и было показано, что она повышена при многих типах рака у человека, что может позволять таким видам рака избегать надзора иммунной системы. Было показано, что PD-L1 вовлечен в несколько клеточных процессов, например во внутриклеточные инфекции, периферическую толерантность, сигнализацию Т-клеточного рецептора и пролиферацию Т-клеток. У мышей и людей выявлены изоформы CD274 с альтернативным сплайсингом. В качестве иллюстрации на Фиг. 6 приведены нуклеотидные и аминокислотные последовательности мышиных и человеческих генов CD274. После прочтения этого описания специалистам будет понятно, что один или более эндогенных генов CD274 в геноме (или все) могут быть замещены, модифицированы, изменены, удалены, разорваны и т.п. одним или более гетерологичными генами CD274 (например, полиморфными разновидностями, подтипами или мутантами, генами от других видов, гуманизированными формами и т.п.).

Термин «CD274-экспрессирующая клетка», «В7-Н1 -экспрессирующая клетка» или «PD-L1-экспрессирующая клетка» при использовании в настоящем документе относится к клетке, экспрессирующей трансмембранный полипептид PD-L1. В некоторых вариантах осуществления PD-L1 -экспрессирующая клетка экспрессирует трансмембранные полипептиды PD-L1 на своей поверхности. В некоторых вариантах осуществления полипептиды PD-L1 экспрессируются на поверхности клетки в количестве, достаточном для опосредования межклеточных взаимодействий (например, посредством взаимодействия с рецепторными полипептидами PD-1). К примерам PD-L1-экспрессирующих клеток относятся В-клетки, дендритные клетки, макрофаги, моноциты и Т-клетки. PD-L1-экспрессирующие клетки модулируют активацию или ингибирование лимфоидных клеток, усиливая или ослабляя иммунные ответы. В некоторых вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения проявляют регуляцию различных клеточных процессов (как описано в настоящем документе) посредством гуманизированных полипептидов PD-L1, экспрессированных на поверхности одной или более клеток не относящегося к человеку животного.

Термин «сравнимый» в контексте настоящего документа включает в себя два или более агентов, объектов, ситуаций, наборов условий и т.п., которые могут не быть идентичными друг другу, но являются в достаточной мере схожими, чтобы можно было их сравнить и сделать правильный вывод на основании наблюдаемых различий или сходств. Обычным специалистам в данной области будет понятно из контекста, какая степень идентичности требуется в любых конкретных обстоятельствах, чтобы два или более таких агентов, объектов, ситуаций, наборов условий и т.п. можно было считать сравнимыми.

Термин «консервативный», используемый в настоящем документе для описания консервативного аминокислотного замещения, включает в себя замещение аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим R-группу боковой цепи со схожими химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В большинстве случаев консервативное аминокислотное замещение по существу не изменит интересующие функциональные свойства белка, например способность рецептора к связыванию с лигандом. К примерам групп аминокислот, имеющих боковые цепи со сходными химическими свойствами, относятся алифатические боковые цепи, такие как глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; алифатические-гидроксильные боковые цепи, такие как серии и треонин; амид-содержащие боковые цепи, такие как аспарагин и глутамин; ароматические боковые цепи, такие как фенилаланин, тирозин и триптофан; основные боковые цепи, такие как лизин, аргинин и гистидин; кислотные боковые цепи, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и серосодержащие боковые цепи, такие как цистеин и метионин. Группы консервативного аминокислотного замещения включают в себя, например, валин/лейцин/изолейцин, фенилаланин/тирозин, лизин/аргинин, аланин/валин, глутамат/аспартат и аспарагин/глутамин. В некоторых вариантах осуществления консервативным аминокислотным замещением может быть замещение любого нативного остатка в белке аланином, как, например, при аланин-сканирующем мутагенезе. В некоторых вариантах осуществления выполняется консервативное замещение, которое имеет положительную величину в логарифмической матрице правдоподобия РАМ250, описанной в публикации Gonnet et al., 1992, Science 256:1443-1445, включенной в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления замещение является умеренно консервативным и имеет неотрицательную величину в логарифмической матрице правдоподобия РАМ250.

Термин «контроль» при использовании в настоящем документе включает в себя понятное специалистам значение термина «контроль» как стандарта, с которым сравниваются результаты. Как правило, контроли используют для повышения чистоты экспериментов путем изолирования переменных, чтобы сделать вывод об этих переменных. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой реакцию или анализ, выполняемый одновременно с исследуемой реакцией или анализом, чтобы получить образец для сравнения. При использовании в настоящем изобретении «контроль» может означать «контрольное животное». «Контрольное животное» может иметь модификацию, описанную в настоящем документе, модификацию, отличающуюся от описанной в настоящем документе, или может не иметь модификации (т.е. животное дикого типа). В одном эксперименте применяют «тест» (т.е. тестируемый переменный фактор). Во втором эксперименте, «контроле», тестируемый переменный фактор не применяют. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой исторический контроль (т.е. относящийся к исследованию или анализу, выполненному ранее, или являющийся уже известной величиной или результатом). В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой или включает в себя выведенную на печать или иным способом сохраненную запись. Контроль может представлять собой положительный контроль или отрицательный контроль.

Термин «разрыв» в контексте настоящего документа включает в себя результат события гомологичной рекомбинации с молекулой ДНК (например, с эндогенной гомологичной последовательностью, такой как ген или локус гена). В некоторых вариантах осуществления разрыв может приводить к вставке, делении, замещению, замене, миссенс-мутации или сдвигу рамки считывания последовательности (-ей) ДНК или их комбинации или представлять собой их. Вставки могут представлять собой вставку генов целиком или фрагментов генов, например экзонов, источником которых могут быть неэндогенные последовательности (например, гетерологичная последовательность). В некоторых вариантах осуществления разрыв может увеличивать экспрессию и/или активность гена или генного продукта (например, кодируемого геном белка). В некоторых вариантах осуществления разрыв может уменьшать экспрессию и/или активность гена или генного продукта. В некоторых вариантах осуществления разрыв может изменять последовательность гена или кодируемого генного продукта (например, кодируемого белка). В некоторых вариантах осуществления разрыв может укорачивать или фрагментировать ген или кодируемый генный продукт (например, кодируемый белок). В некоторых вариантах осуществления разрыв может удлинять ген или кодируемый генный продукт; в некоторых таких вариантах осуществления в результате разрыва может получаться слитый белок. В некоторых вариантах осуществления разрыв может изменять количество гена или генного продукта, но не влиять на их активность. В некоторых вариантах осуществления разрыв может изменять активность гена или генного продукта, но не влиять на их количество. В некоторых вариантах осуществления разрыв может не оказывать значимого влияния на количество гена или генного продукта. В некоторых вариантах осуществления разрыв может не оказывать значимого влияния на активность гена или генного продукта. В некоторых вариантах осуществления разрыв может не оказывать значимого влияния ни на количество, ни на активность гена или генного продукта.

Термины «определение», «измерение», «оценка», «выяснение», «испытание» и «анализ» используются в настоящем документе на взаимозаменяемой основе для обозначения любой формы измерения и включают в себя определение наличия или отсутствия элемента. Эти термины включают в себя количественные и/или качественные определения. Анализ может быть относительным или абсолютным. «Анализ на наличие» может определять количество чего-либо имеющегося и/или определять его наличие или отсутствие.

Фраза «эндогенный локус» или «эндогенный ген» в контексте настоящего документа включает в себя генетический локус, обнаруживаемый в исходном или эталонном организме перед внесением разрыва, делеции, замены, изменения или модификации, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус имеет последовательность, обнаруживаемую в природе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус представляет собой локус дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эталонный организм представляет собой организм дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эталонный организм представляет собой искусственно созданный организм. В некоторых вариантах осуществления эталонный организм представляет собой выведенный в лаборатории организм (искусственно созданный или дикого типа).

Фраза «эндогенный промотор» включает в себя промотор, который естественно связан, например, в организме дикого типа, с эндогенным геном.

Термин «гетерологичный» в контексте настоящего документа включает в себя агент или объект из другого источника. Например, при использовании применительно к полипептиду, гену или продукту гена, присутствующему в конкретной клетке или организме, этот термин поясняет, что соответствующий полипептид, ген или продукт гена: 1) был изготовлен человеком искусственно; 2) был внедрен в клетку или организм (или его предшественник) человеком (например, при помощи генной инженерии); и/или 3) в природе не продуцируется или не присутствует в соответствующей клетке или организме (например, в соответствующем типе клеток или типе организмов).

Термин «клетка-хозяин» в контексте настоящего документа включает в себя клетку, в которую была введена гетерологичная (например, экзогенная) нуклеиновая кислота или белок. После прочтения этого описания специалистам будет понятно, что эти термины обозначают не только конкретную указанную клетку, но также используются для обозначения потомства такой клетки. Так как в последующих поколениях могут возникнуть некоторые модификации вследствие либо мутации, либо воздействий среды, такое потомство может быть фактически не идентичным исходной клетке, но оно также может быть включено в объем используемого в настоящем документе термина «клетка-хозяин». В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой или содержит прокариотическую или эукариотическую клетку. Как правило, клетка-хозяин представляет собой любую клетку, пригодную для получения и/или продуцирования гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка, вне зависимости от царства, к которому принадлежит клетка. Примеры клеток включают прокариоты и эукариоты (одноклеточные или многоклеточные), бактериальные клетки (например, штаммы Е. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. и т.д.), клетки микобактерий, клетки грибов, дрожжевые клетки (например, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica и т.д.), клетки растений, клетки насекомых (например, SF-9, SF-21, инфицированные бакуловирусом клетки насекомых, Trichoplusia ni и т.д.), клетки не относящихся к человеку животных, клетки человека или слияния клеток, такие как, например, гибридомы или квадромы. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека, обезьяны, человекообразной обезьяны, хомяка, крысы или мыши. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой эукариотическую клетку, выбранную из следующих клеток: СНО (например, СНО K1, DXB-11 СНО, Veggie-CHO), COS (например, COS-7), клетки сетчатки, Vero, CV1, клетки почек (например, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, НаK, ВНK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, НВ 8065, HL-60, (например, ВНK21), Jurkat, Daudi, А431 (эпидермальной), CV-1, U937, 3Т3, L-клетки, клетки С127, SP2/0, NS-0, ММТ 060562, клетки Сертоли, клетки BRL 3А, клетки НТ1080, миеломной клетки, опухолевой клетки и клеточной линии, полученной из вышеупомянутых клеток. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит один или более вирусных генов, например клетку сетчатки, которая экспрессирует вирусный ген (например, клетку PER.C6®). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой или содержит изолированную клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой часть ткани. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой часть организма.

Термин «гуманизированный» в контексте настоящего документа используется согласно принятому в данной области значению для обозначения нуклеиновых кислот или белков, структуры которых (например, нуклеотидные или аминокислотные последовательности) включают в себя участки, которые по существу соответствуют или являются идентичными структурам конкретного гена или белка, обнаруживаемого в природе у не относящегося к человеку животного, а также включают в себя участки, которые отличаются от обнаруживаемых в соответствующем конкретном нечеловеческом гене или белке, но более точно соответствуют сравнимым структурам, обнаруживаемым в соответствующем человеческом гене или белке. В некоторых вариантах осуществления «гуманизированный» ген кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по существу идентичную последовательности человеческого полипептида (например, человеческого белка или его участка (например, характерного участка)). В качестве одного из примеров в случае мембранного рецептора «гуманизированный» ген может кодировать полипептид, имеющий внеклеточный участок, аминокислотная последовательность которого аналогична человеческому внеклеточному участку, а оставшаяся последовательность аналогична нечеловеческому (например, мышиному) полипептиду. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген содержит по меньшей мере участок последовательности ДНК человеческого гена. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген содержит полную последовательность ДНК человеческого гена. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок содержит последовательность, имеющую участок, который присутствует в человеческом белке. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок содержит полную последовательность человеческого белка и экспрессируется из эндогенного локуса не относящегося к человеку животного, который соответствует гомологу или ортологу человеческого гена.

Термин «идентичность», используемый в настоящем документе для сравнения последовательностей, включает в себя идентичность, определенную по нескольким различным алгоритмам, известным в данной области, которые можно использовать для измерения идентичности нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления идентичность, описанная в настоящем документе, определяется с помощью программы выравнивания ClustalW v. 1.83 (медленное выравнивание) со штрафом за открытие гэпа 10,0 и штрафом за продолжение гэпа 0,1 и с помощью матрицы правдоподобности Гоннета (MACVECTOR™ 10.0.2, Mac Vector Inc., 2008).

Термины «улучшение», «увеличение», «устранение» или «уменьшение» или их грамматические эквиваленты при использовании в настоящем документе указывают на значения относительно исходного измерения, например измерения в том же индивидууме (или животном) до начала лечения, описанного в настоящем документе, или измерения в контрольном индивидууме (или животном) или в нескольких контрольных индивидуумах (или животных) в отсутствие лечения, описанного в настоящем документе.

Термин «изолированный» в контексте настоящего документа включает в себя вещество и/или объект, который был: (1) отделен по меньшей мере от некоторых компонентов, с которыми он был связан при изначальной продукции (в природе и/или в экспериментальных условиях); и/или (2) создан, продуцирован, получен и/или произведен человеком. Изолированные вещества и/или объекты могут быть отделены от около 10%, около 20%, около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или более чем около 99% других компонентов, с которыми они были изначально связаны. В некоторых вариантах осуществления изолированные агенты имеют степень чистоты, равную около 80%, около 85%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или более чем около 99%. В контексте настоящего документа вещество является «чистым», если оно по существу не содержит других компонентов. В некоторых вариантах осуществления, как будет понятно специалистам в данной области, вещество может по-прежнему рассматриваться как «изолированное» или даже «чистое» после объединения с некоторыми другими компонентами, такими как, например, один или более носителей или эксципиентов (например, буфером, растворителем, водой и т.д.); в таких вариантах осуществления процент изолирования или чистоты вещества рассчитывается без включения таких носителей или эксципиентов. В качестве всего лишь одного примера в некоторых вариантах осуществления биологический полимер, например полипептид или полинуклеотид, встречающийся в природе, считается «изолированным», когда: а) по природе своего происхождения или источника получения он не связан с какими-либо или со всеми компонентами, сопровождающими его интактное состояние в природе; b) он является по существу свободным от других полипептидов или нуклеиновых кислот того же биологического вида из числа видов, которые его производят в природе; или с) он экспрессируется или иным способом ассоциируется с компонентами клетки или иной экспрессионной системы, которая не относится к тем биологическим видам, которые его производят в природе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полипептид, полученный путем химического синтеза или синтеза в клеточной системе, отличной от продуцирующей его в природе, считается «изолированным» полипептидом. Альтернативно или дополнительно в некоторых вариантах осуществления полипептид, который был подвергнут очистке с использованием одного или более способов, может рассматриваться как «изолированный» полипептид в соответствии со степенью его отделения от других компонентов: а) с которыми он связан в природе; и/или b) с которыми он был связан при изначальной продукции.

Фраза «не относящееся к человеку животное» в контексте настоящего документа включает в себя любой позвоночный организм, кроме человека. В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой круглоротое, костную рыбу, хрящевую рыбу (например, акулу или ската), амфибию, рептилию, млекопитающее и птицу. В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой примата, козу, овцу, свинью, собаку, корову или грызуна. В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна, такого как крыса или мышь.

Фраза «нуклеиновая кислота» в контексте настоящего документа в широком смысле включает в себя любое соединение и/или вещество, которое находится в олигонуклеотидной цепи или может быть введено в нее. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой соединение и/или вещество, которое находится в олигонуклеотидной цепи или может быть введено в нее посредством фосфодиэфирной связи. Как будет очевидно из контекста, в некоторых вариантах осуществления термин «нуклеиновая кислота» включает в себя отдельные остатки нуклеиновой кислоты (например, нуклеотиды и/или нуклеозиды); в некоторых вариантах осуществления термин «нуклеиновая кислота» включает в себя олигонуклеотидную цепочку, содержащую индивидуальные остатки нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит РНК; в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит ДНК. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит один или более остатков природной нуклеиновой кислоты или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит один или более аналогов нуклеиновой кислоты или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления аналог нуклеиновой кислоты отличается от «нуклеиновой кислоты» тем, что в нем отсутствует фосфодиэфирный остов. Например, в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит одну или более «пептидных нуклеиновых кислот» или состоит из этих кислот, известных в данной области, в остове которых присутствуют пептидные связи вместо фосфодиэфирных связей, при этом они находятся в пределах объема настоящего изобретения. Альтернативно или дополнительно в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет одну или более тиофосфатных и/или 5'-N-фосфорамидитных связей вместо фосфодиэфирных связей. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит один или более природных нуклеозидов (например, аденозин, тимидин, гуанозин, цитидин, уридин, дезоксиаденозин, дезокситимидина, дезоксигуанозин и дезоксицитидин) или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит один или более нуклеозидных аналогов (например, 2-аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирролопиримидин, 3-метиладенозин, 5-метилцитидин, С5-пропинилцитидин, С5-пропинилуридин, 2-аминоаденозин, С5-бромуридин, С5-фторуридин, С5-йодуридин, С5-пропинилуридин, С5-пропинилцитидин, С5-метилцитидин, 2-аминоаденозин, 7-дезазааденозин, 7-дезазагуанозин, 8-оксоаденоизн, 8-оксогуанозин, O(6)-метилгуанин, 2-тиоцитидин, метилированные основания и их комбинации) или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» содержит один или более модифицированных сахаров (например, 2'-фторрибозу, рибозу, 2'-дезоксирибозу, арабинозу и гексозу) по сравнению с сахарами в природных нуклеиновых кислотах. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность «нуклеиновой кислоты» кодирует функциональный генный продукт, такой как РНК или белок. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» включает в себя один или более интронов. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» включает в себя один или более экзонов. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновую кислоту» получают посредством одного или более из изолирования из природного источника, ферментативного синтеза путем полимеризации на основании комплементарной матрицы (in vivo или in vitro), репродукции в рекомбинантной клетке или системе и химического синтеза. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» состоит по меньшей мере из 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» является одноцепочечной; в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» является двухцепочечной. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность «нуклеиновой кислоты» содержит по меньшей мере один элемент, который кодирует полипептид или комплементарен последовательности, которая кодирует полипептид. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» обладает ферментативной активностью.

Фраза «функционально связанный» в контексте настоящего документа включает в себя смежное положение, в котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать надлежащим образом. Управляющая последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности осуществляется в условиях, которые подходят для управляющих последовательностей. «Функционально связанные» последовательности включают в себя как последовательности управления экспрессией, которые примыкают к интересующему гену, так и последовательности управления экспрессией, которые управляют интересующим геном в трансположении или на расстоянии. Термин «последовательность управления экспрессией» в контексте настоящего документа включает в себя полинуклеотидные последовательности, необходимые для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. К «последовательностям управления экспрессией» относятся: подходящие последовательности для инициации и терминации транскрипции, промоторные и энхансерные последовательности; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, повышающие эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, повышающие стабильность белка; и при необходимости последовательности, усиливающие секрецию белка. Природа таких управляющих последовательностей отличается в зависимости от организма-хозяина. Например, у прокариот такие управляющие последовательности по существу включают в себя промотор, рибосомный сайт связывания и последовательность терминации транскрипции, тогда как у эукариот такие управляющие последовательности обычно включают в себя промоторы и последовательность терминации транскрипции. Термин «управляющие последовательности» включает в себя компоненты, наличие которых является обязательным для экспрессии и процессинга, а также может включать дополнительные компоненты, наличие которых является преимуществом, например лидерные последовательности и последовательности партнеров слияния.

Термин «полипептид» в контексте настоящего документа включает в себя любую полимерную цепь аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая встречается в природе. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая не встречается в природе. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, содержащую участки, встречающиеся в природе отдельно друг от друга (т.е. от двух или более разных организмов, например человеческие и нечеловеческие участки). В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая является искусственно созданной, т.е. была сконструирована и/или получена в результате деятельности человека.

Термин «предотвращать» или «предотвращение» при использовании в настоящем документе применительно к возникновению заболевания, нарушения и/или состояния включает в себя снижение риска развития заболевания, нарушения и/или состояния и/или отсрочку возникновения одной или более характеристик или симптомов заболевания, нарушения или состояния. Предотвращение можно считать выполненным, если начало заболевания, нарушения или состояния отсрочено на предварительно заданный период времени.

Термин «рекомбинантный» в контексте настоящего документа обозначает полипептиды (например, полипептиды PD-L1, описанные в настоящем документе), которые сконструированы, произведены, получены, экспрессированы, созданы или изолированы с помощью рекомбинантных средств, например полипептиды, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина, полипептиды, изолированные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки человеческих полипептидов (Hoogenboom Н.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Hoogenboom Н., and Chames P., 2000, Immunology Today 21:371-378; Azzazy H., and Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., and Larrick J.W., 2002, BioTechniques 29:128-145), антитела, изолированные из животного (например, мыши), трансгенного в отношении генов человеческого иммуноглобулина (см. например, Taylor, L. D., et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Little M. et al., 2000, Immunology Today 21:364-370; Kellermann S.A. and Green L.L., 2002, Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Murphy, A.J., et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-5158), или полипептидов, полученных, экспрессированных, созданных или изолированных любыми другими способами, включающими сплайсинг выбранных элементов последовательности друг с другом. В некоторых вариантах осуществления один или более таких выбранных элементов последовательности встречаются в природе. В некоторых вариантах осуществления один или более таких выбранных элементов последовательности сконструированы с помощью компьютерного моделирования. В некоторых вариантах осуществления один или более таких выбранных элементов последовательности получены в результате мутагенеза (например, in vivo или in vitro) известного элемента последовательности, например, из природного или искусственного источника. Например, в некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид содержит последовательности, встречающиеся в геноме исходного интересующего организма (например, человека, мыши и т.д.). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид содержит последовательности, встречающиеся в природе отдельно друг от друга (т.е. от двух или более разных организмов, например человеческие и нечеловеческие участки) в двух разных организмах (например, в человеческом и нечеловеческом организме). В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида получена посредством мутагенеза (например, in vivo или in vitro у не относящегося к человеку животного), в результате чего аминокислотные последовательности рекомбинантных полипептидов представляют собой последовательности, которые, хотя и происходят из полипептидных последовательностей и являются родственными им, могут не существовать в природе в геноме не относящегося к человеку животного in vivo.

Термин «замена» используется в настоящем документе для обозначения процесса, посредством которого «заменяемая» нуклеотидная последовательность (например, ген), находящаяся в локусе организма-хозяина (например, в геноме), удаляется из этого локуса, а на ее месте размещается другая «заменяющая» нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления заменяемая нуклеотидная последовательность и заменяющие нуклеотидные последовательности являются сравнимыми друг с другом в том смысле, что они, например, являются гомологичными друг другу и/или содержат соответствующие элементы (например, кодирующие белок элементы, регуляторные элементы и т.д.). В некоторых вариантах осуществления заменяемая нуклеотидная последовательность включает в себя один или более промоторов, энхансеров, донорных сайтов сплайсинга, принимающих сайтов сплайсинга, интронов, экзонов, нетранслируемых областей (UTR); в некоторых вариантах осуществления заменяющая нуклеотидная последовательность включает в себя одну или более кодирующих последовательностей. В некоторых вариантах осуществления заменяющая нуклеотидная последовательность представляет собой гомолог заменяемой нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления заменяющая нуклеотидная последовательность представляет собой ортолог заменяемой последовательности. В некоторых вариантах осуществления заменяющая нуклеотидная последовательность представляет собой или содержит человеческую нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления, включая таковые, в которых заменяющая нуклеотидная последовательность представляет собой или содержит человеческую нуклеотидную последовательность, заменяемая нуклеотидная последовательность представляет собой или содержит последовательность грызуна (например, мышиную или крысиную последовательность). Вставленная этим способом нуклеотидная последовательность может включать в себя одну или более регуляторных последовательностей, которые являются частью исходной нуклеотидной последовательности, используемой для получения вставленной этим способом последовательности (например, промоторов, энхансеров, нетранслируемых областей на 5'- или 3'-конце и т.д.). Например, в различных вариантах осуществления замена представляет собой замещение эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью, что приводит к продукции генного продукта из размещенной таким образом нуклеотидной последовательности (содержащей гетерологичную последовательность), а не к экспрессии эндогенной последовательности; замена эндогенной геномной последовательности нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, имеющий сходную функцию с белком, кодируемым эндогенной последовательностью (например, эндогенная геномная последовательность кодирует белок PD-L1, а фрагмент ДНК кодирует один или более человеческих белков PD-L1). В различных вариантах осуществления эндогенный ген или его фрагмент заменяется соответствующим человеческим геном или его фрагментом. Соответствующий человеческий ген или его фрагмент представляет собой человеческий ген или его фрагмент, который является ортологом или по существу схожим или аналогичным по структуре и/или функции заменяемому эндогенному гену или его фрагменту.

Термин «эталон» в настоящем документе используется для описания стандартного или контрольного агента, животного, когорты, индивидуума, популяции, образца, последовательности или значения, с которым сравнивают интересующий агент, животное, когорту, индивидуума, популяцию, образец, последовательность или значение. В некоторых вариантах осуществления эталонный агент, животное, когорту, индивидуума, популяцию, образец, последовательность или значение тестируют и/или определяют по существу одновременно с интересующим агентом, животным, когортой, индивидуумом, популяцией, образцом, последовательностью или значением. В некоторых вариантах осуществления эталонный агент, животное, когорта, индивидуум, популяция, образец, последовательность или значение представляет собой исторический эталон, не обязательно имеющий материальное воплощение. В некоторых вариантах осуществления эталон может относиться к контролю. В настоящем документе «эталон» может относиться к «эталонному животному». «Эталонное животное» может иметь модификацию, описанную в настоящем документе, модификацию, отличающуюся от описанной в настоящем документе, или может не иметь модификации (т.е. животное дикого типа). Специалистам в данной области будет очевидно, что, как правило, эталонный агент, животное, когорта, индивидуум, популяция, образец, последовательность или значение определяется или характеризуется в условиях, сравнимых с теми, которые применяют для определения или охарактеризования интересующего агента, животного (например, млекопитающего), когорты, индивидуума, популяции, образца, последовательности или значения.

Термин «по существу» в контексте настоящего документа включает качественное состояние проявления в полной или практически полной мере или степени интересующей характеристики или свойства. Обычному специалисту в области биологии будет понятно, что биологические и химические явления редко или почти никогда не стремятся к завершенности, и/или не протекают до завершения, или не достигают, или не отрицают абсолютного результата. Таким образом, термин «по существу» используется в настоящем документе для обозначения потенциального отсутствия завершенности, присущего многим биологическим и химическим явлениям.

Фраза «по существу гомологичный» в контексте настоящего документа включает в себя сравнение между аминокислотными или нуклеотидными последовательностями. Как будет понятно обычным специалистам в данной области, две последовательности в большинстве случаев рассматриваются как «по существу гомологичные», если они содержат гомологичные остатки в соответствующих положениях. Гомологичные остатки могут быть идентичными. В альтернативном варианте осуществления гомологичные остатки могут быть не идентичными, но будут иметь схожие соответствующие структурные и/или функциональные характеристики. Например, как хорошо известно обычным специалистам в данной области, некоторые аминокислоты обычно разделяют на «гидрофобные» или «гидрофильные» аминокислоты и/или на имеющие «полярные» или «неполярные» боковые цепи. Замещение аминокислоты другой аминокислотой аналогичного типа часто рассматривается как «гомологичное» замещение. В таблицах 1 и 2 приведены типичные классификации аминокислот.

Как хорошо известно в данной области, аминокислотные или нуклеотидные последовательности можно сравнивать с использованием различных алгоритмов, включая алгоритмы, реализованные в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, BLAST с использованием гэпов и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Примеры таких программ описаны в публикации Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S.F. et al., 1997, Methods in Enzymology; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., and B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; и Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Кроме выявления гомологичных последовательностей вышеупомянутые программы обычно обеспечивают определение степени гомологии. В некоторых вариантах осуществления две последовательности считаются по существу гомологичными, если по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более их соответствующих остатков являются гомологичными на протяжении достаточного отрезка из остатков. В некоторых вариантах осуществления достаточный отрезок равен полной последовательности. В некоторых вариантах осуществления достаточный отрезок составляет по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления достаточный отрезок включает в себя непрерывные остатки вдоль полной последовательности. В некоторых вариантах осуществления достаточный отрезок включает в себя остатки, не являющиеся непрерывными вдоль полной последовательности, например несмежные остатки, объединенные друг с другом путем свернутой конформации полипептида или его участка. В некоторых вариантах осуществления достаточный отрезок составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более остатков.

Фраза «по существу идентичные» в контексте настоящего документа включает в себя сравнение между аминокислотными или нуклеотидными последовательностями. Как будет понятно обычным специалистам в данной области, две последовательности в большинстве случаев рассматриваются как «по существу идентичные», если они содержат идентичные остатки в соответствующих положениях. Как хорошо известно в данной области, аминокислотные или нуклеотидные последовательности можно сравнивать с использованием различных алгоритмов, включая алгоритмы, реализованные в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, BLAST с использованием гэпов и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Примеры таких программ описаны в публикации Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S.F. et al., 1997, Methods in Enzymology; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., and B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; и Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Наряду с идентификацией идентичных последовательностей, вышеуказанные программы обычно указывают степень идентичности. В некоторых вариантах осуществления две последовательности считаются по существу идентичными, если по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более их соответствующих остатков являются идентичными на протяжении достаточного отрезка из остатков. В некоторых вариантах осуществления достаточный отрезок равен полной последовательности. В некоторых вариантах осуществления достаточный отрезок составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более остатков.

Фраза «нацеливающий вектор» или «нацеливающая конструкция» в контексте настоящего документа включает полинуклеотидную молекулу, которая содержит нацеливающую область. Нацеливающая область содержит последовательность, идентичную или по существу идентичную последовательности в целевой клетке, ткани или животном, и обеспечивает встраивание нацеливающей конструкции в положение внутри генома клетки, ткани или животного посредством гомологичной рекомбинации. Также включены нацеливающие области, которые осуществляют нацеливание с использованием сайтов распознавания сайт-специфичной рекомбиназы (например, сайтов loxP или Frt). В некоторых вариантах осуществления нацеливающая конструкция настоящего изобретения дополнительно содержит нуклеотидную последовательность или особо интересующий ген, селективный маркер, управляющие и/или регуляторные последовательности и другие нуклеотидные последовательности, позволяющие выполнять рекомбинацию, опосредованную экзогенным добавлением белков, которые способствуют или облегчают рекомбинацию с участием таких последовательностей. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая конструкция настоящего изобретения дополнительно содержит весь интересующий ген или его часть, причем интересующий ген представляет собой гетерологичный ген, кодирующий весь белок или его часть, который выполняет функцию, аналогичную функции белка, кодируемого эндогенной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая конструкция настоящего изобретения дополнительно содержит весь интересующий гуманизированный ген или его часть, причем интересующий гуманизированный ген представляет собой гетерологичный ген, кодирующий весь белок или его часть, который выполняет функцию, аналогичную функции белка, кодируемого эндогенной последовательностью.

Термин «вариант» в контексте настоящего документа включает в себя объект, который демонстрирует выраженную структурную идентичность с эталонным объектом, но имеет структурные отличия от эталонного объекта в присутствии или при определенном уровне содержания одного или более химических фрагментов по сравнению с эталонным объектом. Во многих вариантах осуществления «вариант» также функционально отличается от эталонного объекта. В целом решение, является ли конкретный объект «вариантом» эталонного объекта, основывается на степени его структурной идентичности эталонному объекту. Как будет понятно специалистам в данной области, любой биологический или химический эталонный объект имеет конкретные характерные структурные элементы. «Вариант» по определению представляет собой отдельный химический объект, который включает в себя один или более таких характерных структурных элементов. Можно привести следующие примеры: небольшая молекула может иметь характерный основной структурный элемент (например, макроциклическое ядро) и/или один или более характерных боковых фрагментов так, что вариантом небольшой молекулы является молекула, включающая в себя основной структурный элемент и характерные боковые фрагменты, но имеющая отличающиеся другие боковые фрагменты и/или типы связей (одиночная или двойная, Е или Z и т.д.) внутри центральной части; полипептид может иметь характерный элемент последовательности, содержащий множество аминокислот, имеющих определенные положения по отношению друг к другу в линейном или трехмерном пространстве и/или выполняющих конкретную биологическую функцию; нуклеиновая кислота может иметь характерный элемент последовательности, содержащий множество нуклеотидных остатков, имеющих определенные положения по отношению друг к другу в линейном или трехмерном пространстве. Например, «вариант полипептида» может отличаться от эталонного полипептида вследствие одного или более отличий в аминокислотной последовательности и/или одного или более отличий в химических фрагментах (например, углеводах, липидах и т.д.), ковалентно связанных с полипептидным остовом. В некоторых вариантах осуществления общая идентичность последовательности «варианта полипептида» с эталонным полипептидом составляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 99%. Альтернативно или дополнительно в некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» не имеет по меньшей мере одной общей характерной последовательности с эталонным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления эталонный полипептид выполняет одно или более биологических действий. В некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» выполняет одно или более общих биологических действий с эталонным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» не выполняет одно или более биологических действий эталонного полипептида. В некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» демонстрирует сниженный уровень одного или более биологических действий по сравнению с эталонным полипептидом. Во многих вариантах осуществления интересующий полипептид считается «вариантом» исходного или эталонного полипептида, если аминокислотная последовательность интересующего полипептида идентична аминокислотной последовательности исходного полипептида, но имеет небольшое число изменений последовательности в определенных положениях. Обычно в варианте замещено менее 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% остатков по сравнению с исходным соединением. В некоторых вариантах осуществления «вариант» имеет 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замещенный остаток по сравнению с исходным соединением. Часто «вариант» имеет очень малое число (например, меньше 5, 4, 3, 2 или 1) замещенных функциональных остатков (т.е. остатков, которые участвуют в конкретном биологическом действии). Кроме того, «вариант» обычно имеет не более 5, 4, 3, 2 или 1 добавления или делении и часто не имеет добавлений или делений по сравнению с исходным соединением. Более того, количество любых добавлений или делений составляет обычно менее чем около 25, около 20, около 19, около 18, около 17, около 16, около 15, около 14, около 13, около 10, около 9, около 8, около 7, около 6 и чаще всего менее чем около 5, около 4, около 3 или около 2 остатков. В некоторых вариантах осуществления исходный или эталонный полипептид представляет собой встречающийся в природе полипептид. Как будет понятно обычным специалистам в данной области, множество разновидностей конкретного интересующего полипептида в большинстве случаев могут встречаться в природе, в особенности если интересующий полипептид представляет собой полипептид инфекционного агента.

Термин «вектор» в контексте настоящего документа включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В некоторых вариантах осуществления векторы способны выполнять экстрахромосомную репликацию и/или экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они связаны в клетке-хозяине, такой как эукариотическая и/или прокариотическая клетка. Векторы, способные направлять экспрессию функционально связанных генов, называются в настоящем документе «векторами экспрессии».

Термин «дикого типа» в контексте настоящего документа имеет значение, соответствующее принятому в данной области, и включает объект, имеющий такую структуру и/или вид действия, которые встречаются в природе в «нормальном» (в противоположность мутантному, болезненному, поврежденному и т.д.) состоянии или контексте. Обычным специалистам в данной области будет понятно, что гены и полипептиды дикого типа часто существуют во множестве различных форм (например, аллелей).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В настоящем изобретении предлагаются, помимо прочего, улучшенные и/или полученные генно-инженерными методами не относящиеся к человеку животные, имеющие гуманизированный генетический материал, кодирующий полипептид Programmed death-ligand 1 (PD-L1), для определения терапевтической эффективности модуляторов PD-L1 (например, антитела к PD-L1) при лечении рака, аутоиммунных заболеваний и инфекционных патологий, а также анализов ответов и функций иммунных клеток. Предполагается, что такие не относящиеся к человеку животные позволят лучше определять терапевтическую эффективность модуляторов PD-L1 и их потенциал в плане блокады PD-1:PD-L1 (или PD-L1:В7-1). Следовательно, настоящее изобретение особенно полезно для разработки средств против PD-L1 и в некоторых вариантах осуществления против PD-1 для лечения различных видов рака, аутоиммунных заболеваний, а также для усиления иммунных ответов для лечения и/или облегчения заболеваний инфекционной этиологии. В частности, настоящее изобретение охватывает гуманизацию гена CD274 грызуна для экспрессии гуманизированного полипептида PD-L1 на поверхности клеток не относящегося к человеку животного. Такие не относящиеся к человеку животные с гуманизированным PD-L1 имеют способность служить источником клеток, положительных по человеческому PD-L1 (human PD-L1⁺), для определения эффективности терапевтических анти-PD-L1 средств для стимуляции противоопухолевых иммунных ответов. Такие не относящиеся к человеку животные с гуманизированным PD-L1 также имеют способность служить источником клеток human PD-L1⁺ для определения эффективности терапевтических анти-PD-L1 средств для облегчения аутоиммунного заболевания, нарушения или состояния. Дополнительно такие не относящиеся к человеку животные с гуманизированным PD-L1 образуют систему in vivo для скрининга и разработки терапевтических анти-PD-L1 средств для лечения различных видов рака, аутоиммунных заболеваний и инфекционных заболеваний. В некоторых вариантах осуществления эффективность лечения может быть продемонстрирована на не относящихся к человеку животных настоящего изобретения в виде уменьшения или исчезновения признаков и/или симптомов заболевания, нарушения или состояния; в некоторых вариантах осуществления - уменьшения или исчезновения некоторых, но не всех признаков и симптомов заболевания, нарушения или состояния; в некоторых вариантах осуществления - уменьшения или исчезновения всех признаков и симптомов заболевания, нарушения или состояния, хотя заболевание, нарушение или состояние может все же присутствовать в организме не относящегося к человеку животного. В различных вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние связано с раком. В различных вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние связано с аутоиммунным заболеванием, нарушением или состоянием. В различных вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние связано с инфекционным патогеном (например, бактерией).

В некоторых вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения демонстрируют иммунные ответы, модулированные посредством блокады сигнализации PD-1:PD-L1 при помощи гуманизированного полипептида PD-L1, экспрессированного на поверхности клеток не относящегося к человеку животного. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные полипептиды PD-L1 имеют последовательность, соответствующую, полностью или частично, доменам иммуноглобулина V и С человеческого полипептида PD-L1. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные полипептиды PD-L1 имеют последовательность, соответствующую по существу всему внеклеточному домену человеческого полипептида PD-L1. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные полипептиды PD-L1 имеют последовательность, соответствующую цитоплазматическому домену полипептида PD-L1 грызуна; в некоторых вариантах осуществления - последовательность, соответствующую трансмембранному и цитоплазматическому доменам полипептида PD-L1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные полипептиды PD-L1 имеют последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 19-238 (или 19-227, или 19-131) человеческого полипептида PD-L1. В некоторых вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения имеют ген CD274, содержащий генетический материал от не относящегося к человеку животного и от гетерологичных видов (например, человека). В некоторых вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения имеют гуманизированный ген CD274, причем гуманизированный ген CD274 содержит экзон 3, экзон 4 и, полностью или частично, экзон 5 человеческого гена CD274. В некоторых конкретных вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения имеют гуманизированный ген CD274, причем гуманизированный ген CD274 содержит около 4494 п.н. человеческого гена CD274, соответствующих экзону 3, и около 4160 п.н. человеческой 3'-геномной последовательности от экзона 3. В некоторых конкретных вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения имеют гуманизированный ген CD274, причем гуманизированный ген CD274 содержит около 3950 п.н. человеческого гена CD274, соответствующих около 1253 п.н. человеческой 5'-геномной последовательности от экзона 4, экзон 4, интрон 4 и первые 32 п.н. экзона 5 человеческого гена CD274. В некоторых конкретных вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения имеют гуманизированный ген CD274, причем гуманизированный ген CD274 содержит около 4494 п.н. и около 3950 п.н. человеческого гена CD274, находящихся смежно с участком сайт-специфической рекомбинации (например, участком loxP), при этом 4494 п.н. и 3950 п.н. соответствуют экзону 3, экзону 4 и первым 32 п.н. экзона 5 человеческого гена CD274. В некоторых конкретных вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения имеют гуманизированный ген CD274, причем гуманизированный ген CD274 содержит 8444 п.н. человеческого гена CD274, соответствующие экзону 3, экзону 4 и первым 32 п.н. экзона 5 человеческого гена CD274. В некоторых вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные (например, грызуны, такие как мыши или крысы) настоящего изобретения имеют гуманизированный ген CD274, содержащий экзон 3, экзон 4 и участок экзона 5 человеческого гена CD274, функционально соединенные с экзонами 1, 2, участком экзона 5, экзонами 6 и 7 нечеловеческого гена Cd274 (например, эндогенного нечеловеческого гена Cd274); и в конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 кодирует гуманизированный полипептид PD-L1, содержащий весь или по существу весь внеклеточный домен человеческого полипептида PD-L1 и все или по существу все трансмембранный и цитоплазматический домены нечеловеческого полипептида PD-L1. В некоторых конкретных вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения содержат гуманизированный ген CD274, показанный на Фиг. 2.

В следующих разделах подробно описаны различные аспекты изобретения. Использование разделов не является ограничивающим изобретение. Каждый раздел можно применять к любому аспекту изобретения. В этой заявке применение союза «или» означает «и/или», если не указано иное.

Ген кластера дифференцировки 274 (CD274)

CD274, который кодирует полипептид, именуемый лигандом 1 запрограммированной гибели клетки (Programmed cell death ligand 1, PD-L1, также именуется B7-H1), был открыт в результате поиска по базе данных человеческих маркерных экспрессирующих последовательностей (EST) с использованием членов семейства В7 под названием В7-1 и В7-2 (Dong, Н. et al., 1999, Nature Med. 5(12):1365-1369; Freeman, G.J. et al., 2000, J. Exp. Med. 192(7):1027-1034). Ген CD274 состоит из семи экзонов, каждый из которых кодирует отдельные части полипептида PD-L1; экзон 1 - некодирующий и содержит 5'UTR; экзон 2 - сигнальная последовательность; экзон 3 - домен иммуноглобулина V (IgV); экзон 4 - домен иммуноглобулина С (IgC); экзон 5 - С-концевая часть внеклеточного домена и трансмембранный домен; экзон 6 - внутриклеточный домен; и экзон 7 - ~6 аминокислотных остатков внутриклеточного домена и 3'UTR. Полипептид PD-L1 имеет общую структурную организацию с другими членами семейства В7 (В7-1 и В7-2), несмотря на низкую процентную идентичность последовательностей (~20%). С другой стороны, полипептидные последовательности PD-L1 мыши и человека имеют идентичность последовательностей около 70% (Freeman, G.J. et al., выше). PD-L1 сильно экспрессируется в сердце, скелетных мышцах, плаценте и легких, слабо экспрессируется в тимусе, селезенке, почках и печени и не экспрессируется в мозге, толстом и тонком кишечнике (Dong, Н. et al., выше). Кроме этого, PD-L1 конститутивно экспрессируется на Т-клетках, В-клетках, миелоидных клетках (например, дендритных клетках, макрофагах, тучных клетках и т.п.) и кератиноцитах у мышей, тогда как у человека экспрессия в этих клетках отмечена после активации (например, обзор Keir, М.Е., et al., 2008, Annu. Rev. Immunol. 26:677-704). Действительно, было отмечено, что промотор CD274 как мышиных, так и человеческих генов содержит сайты связывания с регуляторным фактором интерферонов 1 (IRF-1), который по предположению отвечает за повышение уровня PD-L1 в раковых клетках человека (Lee, S.J. et al., 2006, FEBS Lett. 580(3):755-762). Были отмечены сплайсинговые варианты PD-L1 (см., например, ниже и Не, X.Н. et al., 2005, Acta Pharmacol Sin. 26(4):462-468), однако пока не было выявлено причинно-следственных связей с каким-либо заболеванием. PD-L1 связывается исключительно с PD-1 без всяких взаимодействий с другими белками, структурно сходными с PD-1 (CTLA4, CD28, ICOS; см. Dong. Dong, Н. et al. и Freeman, G.J. et al., выше). Связывание PD-L1 с PD-1 ведет к различным стимулирующим и ингибирующим функциям в иммунных клетках, к некоторым из которых относится пролиферация клеток, продукция цитокинов и сигнализация через Т-клеточный и В-клеточный рецептор. Также предполагается участие PD-L1 (а также PD-L2) в двусторонней сигнализации (например, см. Dong, Н. et al., 2003, J. Clin. Invest. 111:363-370; Kuipers, H. et al., 2006, Eur. J. Immunol. 36:2472-2782). Интересно, что для PD-L1 показано связывание с В7-1 (CD80), лигандом для CD28, хотя не было отмечено взаимодействий с самим CD28 (Butte, М. J. et al., 2007, Immunity 27:111-122). Это уникальное взаимодействие с В7-1 является особенно важным из-за его последствий для регуляции Т-клеточных ответов и толерантности. Действительно, учитывая множество функциональных результатов, обеспечиваемых костимуляторными и коингибиторными функциями, PD-L1 вызывает большой интерес в качестве потенциальной мишени для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний, а также для лечения рака. По существу терапия анти-PD-L1 в настоящее время тестируется в клинических испытаниях на людях (см. например, Pedoeem, A. et al., 2014, Clin. Immunol. 153:145-152; и Philips, G.K. and Atkins, M., 2014, Intern. Immunol. 8 стр.).

Необходимо более глубокое и детальное понимание опосредованных PD-L1 функций в разных типах клеток, в которых он экспрессируется (например, нелимфоидных клетках), и уникальных взаимодействий с другими членами семейства В7, чтобы выработать практические нацеленные способы лечения рака и аутоиммунных заболеваний в будущем.

Последовательности CD274 и PD-L1(В7-Н1)

Примеры мышиных, человеческих и гуманизированных последовательностей CD274 и PD-L1 представлены на Фиг. 6. Примеры человеческих нуклеотидных последовательностей для гуманизации нечеловеческого гена CD274 также представлены на Фиг. 6. В последовательностях мРНК жирным шрифтом показана кодирующая последовательность, а последовательные экзоны при обозначении разделены перемежающимся подчеркнутым текстом; в гуманизированных последовательностях мРНК человеческие последовательности заключены в скобки. В белковых последовательностях сигнальные пептиды подчеркнуты, внеклеточные последовательности выделены жирным шрифтом, последовательности доменов иммуноглобулина V (IgV) заключены в скобки, а внутриклеточные последовательности выделены курсивом; в гуманизированных белковых последовательностях нечеловеческие последовательности обозначены обычным шрифтом, а человеческие последовательности выделены жирным шрифтом.

Транскрипционные варианты CD274 известны специалистам. У одного транскрипционного варианта отсутствует рамочный экзон в 5'-кодирующей области по сравнению с канонической последовательностью (см. Фиг. 6), приводя к делеции остатков 17-130 (т.е. домена IgV плюс ~5 аминокислотных остатков). Последовательности мРНК и белка для данного варианта можно найти в Genbank по номерам доступа NM_001267706.1 и NP_001254635.1 соответственно, включенным в настоящий документ путем ссылки. Другой вариант кодирует растворимый белок, имеющий замену K178D и делецию остатков 179-290. Последовательности мРНК и белка для данного варианта можно найти в Genbank по номерам доступа ХМ_006716759.1 и ХР_006716822.1 соответственно, включенным в настоящий документ путем ссылки. Описан третий вариант (NR052005.1), у которого, если сравнивать с канонической последовательностью, отсутствует чередующийся внутренний сегмент, и, следовательно, он представляет собой некодирующий вариант, поскольку использование крайнего к 5'-концу поддерживаемого инициирующего трансляцию кодона делает транскрипт кандидатом на нонсенсопосредованную деградацию мРНК (NMD). Другие изоформы описаны в публикации WO 2014/197369, которая включена в настоящий документ путем ссылки.

Не относящиеся к человеку животные с гуманизированным CD274

Предлагаются не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие на поверхности клеток не относящихся к человеку животных гуманизированные полипептиды PD-L1, полученные в результате генетической модификации эндогенного локуса (например, локуса CD274) не относящегося к человеку животного, кодирующего полипептид PD-L1. Подходящие примеры, описанные в настоящем документе, включают в себя грызунов, в некоторых вариантах осуществления - мышей.

Гуманизированный ген CD274 в некоторых вариантах осуществления содержит генетический материал гетерологичного вида (например, людей), причем гуманизированный ген CD274 кодирует полипептид PD-L1, который содержит кодируемый участок генетического материала гетерологичного вида. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 настоящего изобретения содержит геномную ДНК гетерологичного вида, кодирующую внеклеточный участок полипептида PD-L1, который экспрессируется на плазматической мембране клетки. Также предложены не относящиеся к человеку животные, эмбрионы, клетки и нацеливающие конструкции для создания не относящихся к человеку животных, нечеловеческих эмбрионов и клеток, содержащих указанный гуманизированный ген CD274.

В некоторых вариантах осуществления эндогенный ген CD274 удален. В некоторых вариантах осуществления эндогенный ген CD274 изменен, причем участок эндогенного гена CD274 заменен гетерологичной последовательностью (например, полной последовательностью человеческого CD274 или ее частью). В некоторых вариантах осуществления весь или по существу весь эндогенный ген CD274 заменен гетерологичным геном (например, человеческим геном CD274). В некоторых вариантах осуществления участок гетерологичного гена CD274 вставлен в эндогенный нечеловеческий ген CD274 в эндогенный локус CD274. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный ген представляет собой человеческий ген. В некоторых вариантах осуществления модификацию или гуманизацию проводят только для одной из двух копий эндогенного гена CD274, что позволяет получить не относящееся к человеку животное, гетерозиготное по отношению к гуманизированному гену CD274. В других вариантах осуществления предлагается не относящееся к человеку животное, гомозиготное по отношению к гуманизированному гену CD274.

В различных аспектах не относящееся к человеку животное содержит человеческий ген CD274, полностью или частично, в эндогенном нечеловеческом локусе CD274. В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное содержит человеческий ген CD274 в положении за пределом эндогенного нечеловеческого локуса CD274. Таким образом, такое не относящееся к человеку животное можно описать как имеющее гетерологичный ген CD274. Замененный, вставленный, модифицированный или видоизмененный ген CD274 в эндогенном локусе CD274 (или вне эндогенного локуса CD274) или полипептид, экспрессированный с такого гена (или экспрессированный с любого другого места генома не относящегося к человеку животного), можно обнаруживать с использованием различных способов, включая, например, ПЦР, Вестрен-блот, Саузерн-блот, полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) или анализ приобретения или потери аллеля. В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное является гетерозиготным по отношению к гуманизированному гену CD274.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который имеет третий экзон с последовательностью, которая по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична третьему экзону, присутствующему в человеческой последовательности мРНК CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, имеющий третий экзон с последовательностью, по существу идентичной третьему экзону, присутствующему в последовательности человеческой мPHK CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, имеющий третий экзон с последовательностью, идентичной третьему экзону, присутствующему в последовательности человеческой мPHK CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который имеет четвертый экзон с последовательностью, которая по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична четвертому экзону, присутствующему в человеческой последовательности мРНК CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, имеющий четвертый экзон с последовательностью, по существу идентичной четвертому экзону, присутствующему в последовательности человеческой мРНК CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, имеющий четвертый экзон с последовательностью, идентичной четвертому экзону, присутствующему в последовательности человеческой мРНК CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который имеет пятый экзон с последовательностью, которая по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична пятому экзону, присутствующему в гуманизированной последовательности мРНК CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, имеющий пятый экзон с последовательностью, по существу идентичной пятому экзону, присутствующему в последовательности гуманизированной мРНК CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, имеющий пятый экзон с последовательностью, идентичной пятому экзону, присутствующему в последовательности гуманизированной мРНК CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который имеет третий, четвертый и пятый экзон, в каждом их которых последовательность по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична третьему, четвертому и пятому экзону, присутствующим в гуманизированной последовательности мРНК CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, имеющий третий, четвертый и пятый экзоны, в каждом из которых последовательность по существу идентична третьему, четвертому и пятому экзону, присутствующим в последовательности гуманизированной мРНК CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, имеющий третий, четвертый и пятый экзоны, в каждом их которых последовательность идентична третьему, четвертому и пятому экзону, присутствующим в последовательности гуманизированной мРНК CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который имеет первый, второй, шестой и седьмой экзон, в каждом из которых последовательность по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична первому, второму, шестому и седьмому экзону, присутствующим в мышиной последовательности мРНК Cd274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, имеющий первый, второй, шестой и седьмой экзоны, в каждом из которых последовательность по существу идентична первому, второму, шестому и седьмому экзонам, присутствующим в последовательности мышиной мРНК Cd274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, имеющий первый, второй, шестой и седьмой экзоны, в каждом их которых последовательность идентична первому, второму, шестому и седьмому экзонам, присутствующим в последовательности мышиной мРНК Cd274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит последовательность, по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную SEQ ID NO: 12.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит последовательность, по существу идентичную SEQ ID NO: 12.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит последовательность, идентичную SEQ ID NO: 12.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит последовательность, по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 16.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит последовательность, по существу идентичную SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 16.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит последовательность, идентичную SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 16.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит первую последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную SEQ ID NO: 13, и вторую последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную SEQ ID NO: 16.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит первую последовательность, по существу идентичную SEQ ID NO: 13, и вторую последовательность, по существу идентичную SEQ ID NO: 16.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит первую последовательность, идентичную SEQ ID NO: 13, и вторую последовательность, идентичную SEQ ID NO: 16.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением содержит SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 и сайт распознавания сайт-специфической рекомбиназы, причем указанный сайт распознавания сайт-специфической рекомбиназы расположен внутри интрона указанного гуманизированного гена CD274.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением содержит SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 и сайт loxP, причем указанный сайт loxP рсположен внутри интрона указанного гуманизированного гена CD274.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит интрон между экзоном 3 CD274 и экзоном 4 CD274, причем указанный интрон содержит последовательность, по существу идентичную SEQ ID NO: 17.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит интрон между экзоном 3 CD274 и экзоном 4 CD274, причем указанный интрон содержит последовательность, идентичную SEQ ID NO: 17.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который содержит SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, который имеет кодирующую нуклеотидную последовательность (например, последовательность кДНК), по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную кодирующей нуклеотидной последовательности, присутствующей в гуманизированной кодирующей нуклеотидной последовательности, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, имеющий кодирующую нуклеотидную последовательность (например, последовательность кДНК), по существу идентичную кодирующей нуклеотидной последовательности, появляющейся в кодирующей нуклеотидной последовательности гуманизированного CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген CD274, имеющий кодирующую нуклеотидную последовательность (например, последовательность кДНК), идентичную кодирующей нуклеотидной последовательности, появляющейся в кодирующей нуклеотидной последовательности гуманизированного CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления последовательность мРНК гуманизированного CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную последовательности мРНК гуманизированного CD274, показанного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления последовательность мРНК гуманизированного CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой последовательность, по существу идентичную последовательности мРНК гуманизированного CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления последовательность мРНК гуманизированного CD274 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой последовательность, идентичную последовательности мРНК гуманизированного CD274, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением кодирует полипептид PD-L1, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную последовательности полипептида PD-L1, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением кодирует полипептид PD-L1 с аминокислотной последовательностью, по существу идентичной последовательности полипептида PD-L1, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления гуманизированный ген CD274 в соответствии с настоящим изобретением кодирует полипептид PD-L1 с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности полипептида PD-L1, показанной на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет внеклеточный участок, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична внеклеточному участку человеческого полипептида PD-L1, представленного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет внеклеточный участок с аминокислотной последовательностью, которая по существу идентична внеклеточному участку человеческого полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет внеклеточный участок с аминокислотной последовательностью, которая идентична внеклеточному участку человеческого полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична аминокислотным остаткам 19-131, присутствующим в человеческом или гуманизированном полипептиде PD-L1, представленном нам Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, которая по существу идентична аминокислотным остаткам 19-131, имеющимся в человеческом или гуманизированном полипептиде PD-L1, показанном на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотным остаткам 19-131, имеющимся в человеческом или гуманизированном полипептиде PD-L1, показанном на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична аминокислотным остаткам 19-227, присутствующим в человеческом или гуманизированном полипептиде PD-L1, представленном нам Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, которая по существу идентична аминокислотным остаткам 19-227, имеющимся в человеческом или гуманизированном полипептиде PD-L1, показанном на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотным остаткам 19-227, имеющимся в человеческом или гуманизированном полипептиде PD-L1, показанном на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 91%, 98%, 99% или более) идентична аминокислотным остаткам 19-238, присутствующим в человеческом или гуманизированном полипептиде PD-L1, представленном нам Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, которая по существу идентична аминокислотным остаткам 19-238, имеющимся в человеческом или гуманизированном полипептиде PD-L1, показанном на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотным остаткам 19-238, имеющимся в человеческом или гуманизированном полипептиде PD-L1, показанном на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет домен иммуноглобулина V (IgV), имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична домену IgV человеческого полипептида PD-L1, представленного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет домен иммуноглобулина V (IgV), имеющий аминокислотную последовательность, которая по существу идентична домену IgV человеческого полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет домен иммуноглобулина V (IgV), имеющий аминокислотную последовательность, которая идентична домену IgV человеческого полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет домен иммуноглобулина (IgV) и домен иммуноглобулина С (IgC), каждый из которых имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична домену IgV и домену IgC человеческого полипептида PD-L1, представленного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет домен иммуноглобулина V (IgV) и домен иммуноглобулина С (IgC), каждый из которых имеет аминокислотную последовательность, которая по существу идентична домену IgV и домену IgC человеческого полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет домен иммуноглобулина V (IgV) и домен иммуноглобулина С (IgC), каждый из которых имеет аминокислотную последовательность, которая идентична домену IgV и домену IgC человеческого полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет трансмембранный домен и внутриклеточный домен, каждый из которых имеет последовательность, которая по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична трансмембранному домену и внутриклеточному домену мышиного полипептида PD-L1, представленного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет трансмембранный домен и внутриклеточный домен, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность, которая по существу идентична трансмембранному домену и внутриклеточному домену мышиного полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет трансмембранный домен и внутриклеточный домен, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность, которая идентична трансмембранному домену и внутриклеточному домену мышиного полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% (например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична аминокислотной последовательности гуманизированного полипептида PD-L1, представленного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет аминокислотную последовательность, которая по существу идентична аминокислотной последовательности гуманизированного полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6.

В различных вариантах осуществления полипептид PD-L1, продуцированный не относящимся к человеку животным настоящего изобретения, имеет аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности гуманизированного полипептида PD-L1, показанного на Фиг. 6.

Предложены композиции и способы создания не относящихся к человеку животных, которые экспрессируют гуманизированный полипептид PD-L1, включая специфические полиморфные формы, аллельные варианты (например, одиночные различия в аминокислотах) или изоформы с альтернативным сплайсингом, включая композиции и способы создания не относящихся к человеку животных, которые экспрессируют такие полипептиды с человеческого промотора и человеческой регуляторной последовательности (-ей). В некоторых вариантах осуществления также предложены композиции и способы создания не относящихся к человеку животных, которые экспрессируют такие полипептиды с эндогенного промотора и эндогенной (-ых) регуляторной (-ых) последовательности (-ей); в некоторых вариантах осуществления - с эндогенного промотора грызуна и эндогенной (-ых) регуляторной (-ых) последовательности (-ей) грызуна. Способы включают вставку генетического материала, кодирующего человеческий полипептид PD-L1 (например, последовательность ДНК CD274), полностью или частично, в точное местоположение в геноме не относящегося к человеку животного, которое соответствует эндогенному гену CD274, что приводит к созданию гуманизированного гена CD274, который экспрессирует полипептид PD-L1, являющийся полностью или частично человеческим. В альтернативном варианте осуществления вставка генетического материала, кодирующего человеческий полипептид PD-L1, полностью или частично, может осуществляться в случайное место генома не относящегося к человеку животного, т.е. за пределами эндогенного гена CD274. В некоторых вариантах осуществления способы включают вставку геномной ДНК, соответствующей экзонам 3-5 (или экзонам 3, 4 и участку экзона 5) человеческого гена CD274 в эндогенный ген CD274 не относящегося к человеку животного, тем самым создавая гуманизированный ген, кодирующий полипептид PD-L1, который содержит человеческий участок, включающий в себя аминокислоты, кодируемые вставленными экзонами. В некоторых вариантах осуществления способы включают в себя случайную вставку геномной ДНК, соответствующей полноразмерному гену (или кДНК) человеческого CD274, в геном не относящегося к человеку животного, тем самым создавая человеческий трансген CD274, кодирующий полноразмерный человеческий полипептид PD-L1.

При необходимости кодирующий участок генетического материала или полинуклеотидную (-ые) последовательность (-сти), кодирующую (-ие), полностью или частично, человеческий полипептид PD-L1, можно модифицировать, включив в нее (них) кодоны, которые оптимизированы для экспрессии в не относящемся к человеку животном (например, см. патенты США №5,670,356 и 5,874,304). Оптимизированные по кодонам последовательности представляют собой синтетические последовательности и предпочтительно кодируют полипептид (или биологически активный фрагмент полноразмерного полипептида, обладающий по существу той же активностью, что и полноразмерный полипептид), идентичный кодируемому исходным не оптимизированным по кодонам полинуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления кодирующий участок генетического материала, кодирующего человеческий полипептид PD-L1, полностью или частично, может содержать измененную последовательность для оптимизации использования кодонов в конкретном типе клеток (например, клетке грызуна). Например, кодоны геномной ДНК, соответствующие экзонам 3-5 (или экзонам 3, 4 и участку экзона 5) человеческого гена CD274, вставляемым в эндогенный ген CD274 не относящегося к человеку животного (например, грызуна), могут быть оптимизированы для экспрессии в клетке не относящегося к человеку животного. Такая последовательность может быть названа оптимизированной по кодонам последовательностью.

Техника создания гуманизированного гена CD274 включает в себя относительно минимальную модификацию эндогенного гена и приводит к природной CD274-опосредованной (т.е. PD-L1-опосредованной) сигнальной трансдукции у не относящегося к человеку животного, поскольку, например, геномная последовательность гена CD274 модифицируется в одном фрагменте и, следовательно, сохраняет нормальную функциональность вследствие включения необходимых регуляторных последовательностей и в некоторых вариантах осуществления интронных последовательностей. Таким образом, в этих вариантах осуществления модификация гена CD274 не влияет на другие окружающие гены или другие эндогенные гены, взаимодействующие с CD274 (например, Pdcd1 и т.п.). Кроме того, в различных вариантах осуществления модификация не влияет на сборку функционального трансмембранного полипептида PD-L1 на плазматической мембране и сохраняет нормальные эффекторные функции посредством связывания и последующей передачи сигнала через цитоплазматический участок полипептида, который в результате модификации не изменяется.

Схематическое изображение (без соблюдения масштаба) геномной организации гена Cd274 грызуна (например, мыши) и человеческого гена CD274 показано на Фиг. 1. Примеры конструкций для гуманизации эндогенного гена Cd274 грызуна (например, мыши) с использованием геномного фрагмента, содержащего экзоны 3, 4 и участок экзона 5 человеческого гена CD274, представлены на Фиг. 2. Как показано, геномную ДНК, содержащую экзоны 3, 4 и участок экзона 5 человеческого гена CD274, вставляют в локус эндогенного гена Cd274 грызуна (например, мыши) посредством нацеливающей конструкции. Эта геномная ДНК включает в себя участок гена, кодирующий внеклеточный участок (например, аминокислотные остатки 19-238) человеческого полипептида PD-L1. Если это желательно, геномную ДНК, содержащую экзоны 3 и 4 человеческого гена CD274, можно вставить в локус эндогенного гена Cd274 грызуна (например, мыши) при помощи нацеливающей конструкции, так чтобы внедрить участок гена, кодирующий домены иммуноглобулина V и С (например, аминокислотные остатки 19-227) человеческого полипептида PD-L1. В альтернативном варианте осуществления геномную ДНК, содержащую только экзон 3 человеческого гена CD274, можно вставить в локус эндогенного гена Cd274 грызуна (например, мыши) при помощи нацеливающей конструкции, так чтобы внедрить только участок гена, кодирующий домен иммуноглобулина V (например, аминокислотные остатки 19-131) человеческого полипептида PD-L1. Специалистам в данной области по прочтении настоящего описания будет очевидно, что в геном не относящегося к человеку животного можно вставлять различные количества генетического материала человеческого гена CD274, используя методологию, описанную в настоящем документе, в зависимости от того, какой закодированный полипептид PD-L1 желательно получить.

Не относящееся к человеку животное (например, мышь), имеющее гуманизированный ген CD274 в эндогенном локусе CD274, может быть создано с помощью любого способа, известного в данной области. Например, может быть создан нацеливающий вектор, который встраивает весь человеческий ген CD274 или его часть вместе с селективным маркерным геном. На Фиг. 2 показан эндогенный локус Cd274 генома мыши, содержащий вставку из экзонов 3, 4 и участка экзона 5 (около 32 п. н.) человеческого гена CD274. Как показано, нацеливающая конструкция содержит гомологичное плечо на 5'-конце, содержащее последовательность перед экзоном 3 эндогенного мышиного гена Cd274 (~ 92,9 т. п. н), затем фрагмент геномной ДНК, содержащий экзон 3 человеческого гена CD274 (~ 4494 п. н.), кассету селекции лекарственными средствами (например, ген устойчивости к неомицину, фланкированный с обеих сторон последовательностями loxP); ~ 5 т. п. н.) в направлении, противоположном направлению транскрипции, относительно эндогенного мышиного гена Cd274, фрагмент геномной ДНК, содержащий экзон 4 и участок экзона 5 человеческого гена CD274 (~ 3950 п. н.), и гомологичное плечо на 3'-конце, содержащее участок экзона 5 эндогенного мышиного гена Cd274 и последующую геномную последовательность, включая экзоны 6 и 7 (~ 67,6 т. п. н.). Нацеливающая конструкция содержит самоудаляющуюся кассету селекции лекарственными средствами (например, ген резистентности к неомицину, фланкированный последовательностями loxP; см. патенты США №8,697,851, 8,518,392 и 8,354,389, которые все включены в настоящий документ путем ссылки). При гомологичной рекомбинации экзоны 3, 4 и участок экзона 5 эндогенного мышиного гена Cd274 замещаются на последовательность, содержащуюся в нацеливающем векторе (т е. экзоны 3, 4 и участок экзона 5 человеческого гена CD274), что приводит к делеции приблизительно 8964 п. н. Создается гуманизированный ген CD274, что приводит к получению клетки или не относящегося к человеку животного, которое экспрессирует гуманизированный полипептид PD-L1, содержащий аминокислоты, кодируемые вставленной геномной РНК человеческого гена CD274. Кассета селекции лекарственными средствами удаляется зависимым от развития образом, т.е. потомство, полученное от мыши, клетки зародышевой линии которой содержат вышеописанный гуманизированный ген CD274, будут терять селективный маркер в дифференцированных клетках в процессе развития.

Хотя в настоящем документе широко обсуждаются варианты осуществления, где гуманизированный ген CD274 используется у мышей (т.е. мышь с геном CD274, кодирующим полипептид PD-L1, содержащий человеческий участок и мышиный участок), также предусмотрены другие не относящиеся к человеку животные, имеющие гуманизированный ген CD274. В некоторых вариантах осуществления такие не относящиеся к человеку животные содержат гуманизированный ген CD274, функционально связанный с эндогенным промотором CD274. В некоторых конкретных вариантах осуществления эндогенный промотор CD274 представляет собой эндогенный промотор грызуна. В некоторых вариантах осуществления такие не относящиеся к человеку животные экспрессируют гуманизированный полипептид PD-L1 с эндогенного локуса, причем гуманизированный полипептид PD-L1 содержит аминокислотные остатки 19-238 (или 19-227, или 19-131) человеческого полипептида PD-L1. К таким не относящимся к человеку животным относятся любые, которые могут быть подвергнуты генетической модификации для экспрессии полипептида PD-L1, описанного в настоящем документе, включая, например, млекопитающих, таких как мышь, крыса, кролик, свинья, корова (например, корова, бык, буйвол), олень, овца, коза, курица, кошка, собака, хорек, примат (например, мартышка, макак-резус) и т.п. К примерам последовательностей нечеловеческих ортологов CD274 относятся, например, PD-L1 курицы (ХМ_424811.3 и ХР_424811.3), шимпанзе (ХМ_001140705.2 и ХР 001140705.1), PD-L1 коровы (NM_001163412.1 и NP_001 156884.1), PD-L1 собаки (ХМ .541302.3 и ХР_541302.3), обезьяны (NM_001083889.1 и NP 001077358.1) и крысы (NM_001191954.1 и NP_001178883.1), которые включены в настоящий документ путем ссылки. Например, в случае не относящихся к человеку животных, для которых отсутствуют легкодоступные приемлемые генетически модифицируемые ЭС-клетки, применяют другие способы создания не относящегося к человеку животного, содержащего генетические модификации. Такие способы включают, например, модификацию генома другой клетки, отличной от эмбриональной стволовой (например, фибробласта или индуцированной плюрипотентной клетки), и использование ядерного переноса в соматических клетках (SCNT) для переноса генетически модифицированного генома в приемлемую клетку, например безъядерный ооцит, и постепенное созревание модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) в не относящемся к человеку животном в приемлемых условиях для формирования эмбриона (см., например, Wilmut, I. et al., 1997, Nature 385: 810-813; опубликованные заявки на международный патент № WO 97/07668 и WO 97/07669).

Способы модификации генома не относящегося к человеку животного (например, генома свиньи, коровы, грызуна, курицы и т.п.) включают в себя, например, применение нуклеазы с «цинковыми пальцами» (ZFN) или эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), для модификации генома с целью включения в него гуманизированного гена CD274.

Не относящееся к человеку животное, несущее гуманизированный ген CD274, как описано в настоящем документе, также можно создать путем внедрения нуклеотидной последовательности CD274 в случайное место генома не относящегося к человеку животного в качестве трансгена. В зависимости от контекста можно использовать кДНК или геномные человеческие последовательности CD274. Например, интронные последовательности и сигналы полиаденилирования можно включить в трансген для повышения эффективности и уровня экспрессии трансгена. Тканеспецифическую (-ие) регуляторную (-ые) последовательность (-и) можно функционально связывать с трансгеном CD274, чтобы направить экспрессию полипептида PD-L1 в конкретные типы клеток. Конститутивный промотор можно функционально связывать с нуклеотидной последовательностью CD274, чтобы закодированный полипептид PD-L1 имел повышенную экспрессию (т.е. экспрессировался на более высоком уровне и/или в тканях, где экспрессия не наблюдается у не относящегося к человеку животного дикого типа).

Не относящееся к человеку животное-основателя трансгенной линии можно идентифицировать по присутствию трансгена CD274 в его геноме и/или по экспрессии мРНК PD-L1 в клетках или тканях не относящегося к человеку животного. Не относящегося к человеку животного-основателя трансгенной линии можно использовать для выведения дополнительных не относящихся к человеку животных, несущих трансген CD274. Более того, трансгенных не относящихся к человеку животных, несущих трансген, кодирующий человеческий полипептид PD-L1, полностью или частично, можно дополнительно скрещивать с другими трансгенными не относящимися к человеку животными, несущими другие трансгены (например, трансген Pdcd1 или CD80).

Также могут быть получены трансгенные не относящиеся к человеку животные, содержащие выбранные системы, позволяющие осуществлять регулируемую или управляемую экспрессию трансгена. К примерам таких систем относятся рекомбиназная система Cre/loxP бактериофага Р1 (см., например, Lakso, М. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236) и рекомбиназная система FLP/Frt из S. cerevisiae (O'Gorman, S. et al., 1991, Science 251:1351-1355). Таких животных можно получать путем конструирования «двойных» трансгенных животных, например путем скрещивания двух трансгенных животных, одно из которых имеет трансген, кодирующий выбранный полипептид (например, трансген CD274), а другое имеет трансген, кодирующий рекомбиназу (например, рекомбиназу Cre).

Не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения могут быть получены, как описано выше, или с использованием способов, известных специалистам, так чтобы они имели дополнительные человеческие или гуманизированные гены, часто в зависимости от предполагаемого использования не относящегося к человеку животного. Генетический материал таких дополнительных человеческих или гуманизированных генов можно внедрить путем дополнительного изменения генома клеток (например, эмбриональных стволовых клеток), имеющих вышеописанные генетические модификации, или с использованием известных специалистам методик скрещивания с другими генетически модифицированными линиями при необходимости. В некоторых вариантах осуществления получают не относящихся к человеку животных настоящего изобретения, дополнительно содержащих один или более человеческих или гуманизированных генов, выбранных из семейства лигандов В7 и/или семейства рецепторов CD28 (например, Pdcd1 (PD-1) и т.п.). В некоторых вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения могут быть получены путем внедрения нацеливающего вектора, как описано в настоящем документе, в клетку модифицированной линии. В некоторых вариантах осуществления получают не относящихся к человеку животных настоящего изобретения, дополнительно имеющих человеческий или гуманизированный ген Programmed cell death 1 (Pdcd1). В некоторых вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения имеют гуманизированный ген CD274, как описано в настоящем документе, и генетический материал из гетерологичных видов (например, человека), причем генетический материал кодирует, полностью или частично, один или более гетерологичных полипептидов, выбранных из семейства лигандов В-7 или из семейства рецепторов CD28. В некоторых конкретных вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения имеют гуманизированный ген CD274, как описано в настоящем документе, и генетический материал из гетерологичных видов (например, человека), причем генетический материал кодирует, полностью или частично, гетерологичный (например, человеческий) полипептид PD-1. В некоторых конкретных вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения дополнительно содержат ген Pdcd1, содержащий эндогенный участок и человеческий участок, причем человеческий участок кодирует внеклеточный домен человеческого полипептида PD-1, а эндогенный участок кодирует внутриклеточный домен эндогенного полипептида PD-1; в некоторых вариантах осуществления человеческий и эндогенный участки функционально связаны с эндогенным промотором Pdcd1; в некоторых вариантах осуществления - с эндогенным промотором Pdcd1 грызуна.

Например, как описано в настоящем документе, не относящиеся к человеку животные, имеющие гуманизированный ген CD274, могут дополнительно иметь (например, в результате скрещивания или стратегии нацеливания на несколько генов) одну или более модификаций, как описано в заявке на патент США №14/744,592, поданной 19 июня 2015 г., которая включена в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления грызуна, имеющего гуманизированный ген CD274 (т.е. экзоны 3, 4 и 5'-участок экзона 5 человеческого гена CD274, функционально связанные с экзонами 1, 2, 3'-участком экзона 5, экзонами 6 и 7 эндогенного гена Cd274 грызуна, так что гуманизированный ген CD274 кодирует полипептид PD-L1, содержащий внеклеточный участок человеческого полипептида PD-L1 и внутриклеточный участок полипептида PD-L1 грызуна), скрещивают с грызуном, содержащим гуманизированный ген Pdcd1 (например, экзон 2 и 5'-участок экзона 3 человеческого гена PDCD1, функционально связанные с экзоном 1, 3'-участком экзона 3 и экзонами 4 и 5 эндогенного гена Pdcd1 грызуна, так что гуманизированный ген Pdcd1 кодирует полипептид PD-1, имеющий внеклеточный участок человеческого полипептида PD-1 и внутриклеточный участок полипептида PD-1 грызуна; см., например, заявку на патент США №14/744,592, поданную 19 июня 2015 г., включенную в настоящий документ путем ссылки). В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 содержит экзоны 1, 4 и 5 нечеловеческого (например, принадлежащего грызуну) Pdcd1, экзон 2 человеческого Pdcd1 и экзон 3 Pdcd1, причем экзон 3 Pdcd1 содержит человеческий участок и нечеловеческий участок, и при этом указанные нечеловеческие и человеческие экзоны функционально связаны. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок экзона 3 Pdcd1 содержит нуклеотиды, кодирующие последовательность ножки PD-1. В некоторых вариантах осуществления человеческий участок экзона 3 Pdcd1 содержит около 71 п. н. экзона 3 человеческого Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления нечеловеческий участок экзона 3 Pdcd1 включает в себя нуклеотиды, кодирующие трансмембранную последовательность. В некоторых вариантах осуществления нечеловеческий участок экзона 3 Pdcd1 содержит около 91 п. н. экзона 3 Pdcd1 грызуна. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 кодирует гуманизированный полипептид PD-1, включающий в себя внеклеточный участок (например, по существу весь внеклеточный домен) человеческого полипептида PD-1, трансмембранный участок (например, по существу весь трансмембранный домен) и внутриклеточный участок (например, по существу весь внутриклеточный домен) полипептида PD-1 грызуна.

В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное настоящего изобретения представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное настоящего изобретения представляет собой мелкое млекопитающее, например из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное настоящего изобретения представляет собой грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызуна настоящего изобретения выбирают из мыши, крысы и хомяка. В некоторых вариантах осуществления грызуна настоящего изобретения выбирают из надсемейства Muroidea. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное настоящего изобретения выбирают из семейства Calomyscidae (например, мышевидные хомячки), Cricetidae (например, хомяк, мыши и крысы Нового света, полевка), Muridae (мыши и крысы, песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки), Nesomyidae (рипидомисы, скальные крысы, малагасийские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки) и Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированного грызуна настоящего изобретения выбирают из мыши или крысы (семейство Muridae), песчанки, иглистой мыши и косматого хомяка. В некоторых конкретных вариантах осуществления генетически модифицированная мышь настоящего изобретения является представителем семейства Muridae. В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное настоящего изобретения представляет собой грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызуна настоящего изобретения выбирают из мыши и крысы. В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное настоящего изобретения представляет собой мышь.

В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное настоящего изобретения представляет собой грызуна, который является мышью линии C57BL, выбранной из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В некоторых конкретных вариантах осуществления мышь настоящего изобретения представляет собой мышь линии 129, выбранную из группы, состоящей из линий 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (см., например, Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10: 836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). В некоторых конкретных вариантах осуществления генетически модифицированная мышь настоящего изобретения представляет собой смесь вышеупомянутой линии 129 и вышеупомянутой линии C57BL/6. В некоторых конкретных вариантах осуществления мышь настоящего изобретения представляет собой смесь вышеупомянутых линий 129 или смесь вышеупомянутых линий BL/6. В некоторых конкретных вариантах осуществления линия 129 смеси, описанной в настоящем документе, представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В некоторых вариантах осуществления мышь настоящего изобретения представляет собой мышь линии BALB, например линии BALB/c. В некоторых вариантах осуществления мышь настоящего изобретения представляет собой смесь линии BALB и другой вышеупомянутой линии.

В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное настоящего изобретения представляет собой крысу. В некоторых конкретных вариантах осуществления крыса настоящего изобретения выбрана из крысы линии Вистар, линии LEA, линии Спрег-Доули, линии Фишер, F344, F6 и линии темные Агути. В некоторых конкретных вариантах осуществления линия крыс, описанная в настоящем документе, представляет собой смесь двух или более линий, выбранных из группы, состоящей из линий Вистар, LEA, Спрег-Доули, Фишер, F344, F6 и темные Агути.

Способы использования не относящихся к человеку животных, имеющих гуманизированные гены CD274

Описаны мутантные и трансгенные по CD274 не относящиеся к человеку животные (например, мыши) (Iwai, Y. et al., 2002, Proc. Nat. Acad. Sci. 99(19): 12293-12297; Latchman, Y. E. et al., 2004, Proc. Nat. Acad. Sci. 101(29): 10691-10696; Subudhi, S. K. et al., 2004, J. Clin. Invest. 113(5): 694-700; Guleria, I. et al., 2005, J. Exp. Med. 202(2): 231-237; Keir, M.E. et al., 2006, J. Exp. Med. 203(4): 883-895; Tanaka, K. et al., 2007, J. Immunol. 179: 5204-5210; Wang, C. et al., 2008, Diabetes 57: 1861-1869; Wen, X. et al., 2008, Transplant. 86(11): 1596-1602; Plege, A. et al., 2009, Transpl. 87(7): 975-982; Cao, Y. et al., 2010, Cancer Res. 71(4): 1235-1243; Plege, A. et al., 2010, Eur. Soc. Organ Transplant. 23:1293-1300; Ritprajak, P. et al., 2010, J. Immunol. 184: 4918-4925; Yantha, J. et al., 2010, Diabetes 59: 2588-2596; Ding, Q. et al., 2011, J. Leukocyte Biol. 90: 77-86; Tang, L. et al., 2011, Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi 27(4): 357-359; Ghazizadeh, S. et al., 2012, 20(1): 196-203). Такие мутантные и трансгенные животные применялись для определения молекулярных аспектов экспрессии и функционирования PD-L1, а также роли пути PD-1:PD-L1 в регуляции иммунных ответов, в частности Т-клеточных ответов. Однако они имеют ограничения, которые отчасти связаны с продемонстрированной вариабельностью полученных результатов. У многих трансгенных по PD-L1 животных использованы трансгены, предназначенные для сверхэкспрессии эндогенного PD-L1 (см., например, Ghazizadeh et al. выше), тогда как в других случаях акцент сделан на связывании экспрессии трансгенного PD-L1 с тканеспецифическими промоторами (см., например, Ritprajak et al. выше). У некоторых таких животных проявился характер экспрессии трансгенного PD-L1, не коррелирующий с профилями транскрипции дикого типа (см., например, Wang et al. and Yantha et al. выше). Более того, из-за использования генетического материала из того же источника (например, мышиного трансгена PD-L1 у мыши) сверхэкспрессия PD-L1 может соответствовать эндогенному PD-L1, а не трансгенному PD-L1 из-за возможных эффектов положения трансгена. В некоторых случаях такие животные продемонстрировали ускоренное развитие заболевания и, следовательно, подняли проблему того, что трансген мог создать или модифицировать один или более фенотипов, тем самым усложняя анализ функции PD-L1. Эти результаты можно обоснованно связать со строением конструкции. Применительно к человеческому PD-L1 клетки кишечного эпителия свиньи, модифицированные для устойчивой экспрессии человеческого PD-L1 под контролем CMV, были применены в модели трансплантации кожи на карликовых свиньях и дали важную информацию об эктопической экспрессии человеческого PD-L1 на модели аллотрансплантата (Ding et al. выше). Существующие трансгенные по PD-L1 не относящиеся к человеку животные доказали свою полезность в выяснении некоторых биологических функций PD-L1 и пути PD-1:PD-L1, однако, как продемонстрировано выше, имеющиеся системы in vivo, в которых используется опосредованная PD-L1 биология, являются неполными. Молекулярные аспекты пути PD-1:PD-L1 и его роль в регуляции иммунных ответов в контексте рака и аутоиммунных заболеваний не были в полной мере использованы в трансгенных животных (например, мышах).

Не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения обеспечивают улучшенную систему in vivo и источник биологических материалов (например, клеток), экспрессирующих человеческий (или гуманизированный) PD-L1, который используется для различных анализов. В различных вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения применяются для разработки лекарственных средств, которые нацелены на PD-L1, и/или модулируют сигнализацию PD-1:PD-L1 (например, мешая взаимодействию с PD-1), и/или модулируют взаимодействия PD-L1 с другими партнерами по связыванию (например, В7-1). Такие животные являются особенно полезными, поскольку они являются полностью иммунокомпетентными, в отличие от многих других животных моделей, использованных для исследований in vivo; следовательно, анализ влияния лекарственных средств не осложняется нарушенным состоянием иммунитета. В различных вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для идентификации, скрининга и/или разработки потенциальных лекарственных средств (например, антител), связывающихся с человеческим PD-L1. В различных вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для скрининга и разработки потенциальных лекарственных средств (например, антител), блокирующих взаимодействие человеческого PD-L1 с человеческим PD-1 и/или человеческим В7-1. В различных вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для определения профиля связывания антагонистов и/или агонистов гуманизированного полипептида PD-L1 на поверхности клетки не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе; в некоторых вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для определения эпитопа или эпитопов одного или более потенциальных лекарственных антител, связывающихся с человеческим PD-L1.

В различных вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для определения фармакокинетических профилей антител к PD-L1. В различных вариантах осуществления одно или более не относящихся к человеку животных настоящего изобретения и одно или более контрольных или эталонных не относящихся к человеку животных подвергают действию одного или более потенциальных лекарственных антител к PD-L1 в различных дозах (например, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг, или 50 мг/кг, или более). Потенциальные лекарственные антитела могут вводиться любым подходящим способом, включая парентеральный и непарентеральный пути введения. К парентеральным путям относятся, например, внутривенный, внутриартериальный, внутрипортальный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, внутрипозвоночный, внутриоболочечный, интрацеребровентрикулярный, внутричерепной, интраплевральный или другие способы введения. К непарентеральным путям относятся, например, пероральный, назальный, чрескожный, легочный, ректальный, буккальный, вагинальный, глазной. Введение может также осуществляться путем непрерывной инфузии, местного введения, замедленного высвобождения из имплантатов (гелей, мембран и т.п.) и/или внутривенной инъекции. Кровь у не относящихся к человеку животных (гуманизированных и контрольных) забирают на различных сроках (например, 0 ч, 6 ч, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней или до 30 или более дней). Можно применять различные виды анализа для определения фармакокинетических профилей введенных потенциальных лекарственных антител с использованием образцов, полученных от не относящихся к человеку животных, как описано в настоящем документе, включая, без ограничений, общий IgG, антительный ответ на введенный препарат, агглютинацию и т.п.

В различных вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для измерения терапевтического эффекта блокирования или модуляции сигнализации PD-L1 (или сигнализации PD-1:PD-L1, или взаимодействий, опосредованных PD-L1:B7-1) и влияния на экспрессию генов, являющуюся результатом изменений в клетке. В различных вариантах осуществления не относящееся к человеку животное настоящего изобретения или выделенные из него клетки подвергают действию потенциального лекарственного средства, связывающегося с гуманизированным полипептидом PD-L1 (или человеческим участком полипептида PD-L1) на поверхности клетки не относящегося к человеку животного и по истечении некоторого периода времени анализируют на предмет влияний на зависящие от PD-L1 процессы (или взаимодействия), например адгезию, апоптоз, продукцию цитокинов, воспаление, пролиферацию, аутотолерантность и вирусную инфекцию (или ответы).

Не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения экспрессируют гуманизированный полипептид PD-L1 и, следовательно, могут быть получены клетки, клеточные линии и клеточные культуры, служащие источником гуманизированного PD-L1, для использования в анализах связывания и функциональных анализах, например для анализа связывания или функции антагониста или агониста PD-L1, в частности когда антагонист или агонист специфичен к человеческой последовательности или эпитопу PD-L1 или, как вариант, специфичен к человеческой последовательности или эпитопу PD-L1, ассоциированному с PD-1 и/или В7-1. В различных вариантах осуществления эпитопы PD-L1, связанные с потенциальными лекарственными антителами, можно определять с использованием клеток из не относящихся к человеку животных настоящего изобретения.

В различных вариантах осуществления гуманизированный полипептид PD-L1, экспрессируемый не относящимся к человеку животным, как описано в настоящем документе, может содержать вариант аминокислотной последовательности. К примерам вариантов человеческого полипептида PD-L1 относятся перечисленные на веб-странице SNP Gene View от NCBI и сведенные в таблицу 3. В различных вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения экспрессируют вариант гуманизированного полипептида PD-L1. В различных вариантах осуществления вариант является полиморфным в положении аминокислоты, ассоциированном со связыванием лиганда. В различных вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения используются для определения эффекта связывания лиганда посредством взаимодействия с полиморфным полипептидным вариантом человеческого PD-L1. В некоторых конкретных вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения экспрессируют вариант гуманизированного полипептида PD-L1, показанный в таблице 3.

Клетки не относящихся к человеку животных настоящего изобретения могут быть изолированы и использованы для данного конкретного случая или могут быть сохранены в культуре в течение многих поколений. В различных вариантах осуществления клетки не относящегося к человеку животного настоящего изобретения являются иммортализованными (например, посредством применения вируса) и поддерживаются в культуре неопределенно долго (например, в последовательных культурах).

В различных вариантах осуществления клетки и/или не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения используются в различных схемах иммунизации для определения опосредованных PD-L1 функций в иммунном ответе на антиген (например, Т-клеточном ответе). В некоторых вариантах осуществления потенциальные лекарственные средства, которые связываются с или блокируют одну или более функций человеческого (или гуманизированного) PD-L1, охарактеризовывают на не относящемся к человеку животном настоящего изобретения. К подходящим измерениям относятся различные клеточные анализы, анализы пролиферации, анализ сывороточных иммуноглобулинов (например, титр антител), анализы цитотоксичности, описание лиганд-рецепторных взаимодействий (например, иммунопреципитационные анализы) и описания лиганд-лигандных взаимодействий. В некоторых вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для описания опосредованных PD-L1 функций, регулирующих иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с аутоиммунным заболеванием, нарушением или состоянием. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с воспалительным заболеванием, нарушением или состоянием. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с опухолью. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с инфекционным агентом (например, бактерией). В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой тестовый антиген (например, овальбумин или OVA). В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой мишень, ассоциированную с заболеванием или состоянием, от которого страдают один или более нуждающихся в лечении пациентов-людей.

В различных вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения применяют в анализах сыворотки для определения титров продукции аутоантител для тестирования фармакотоксикологических аспектов потенциальных лекарственных средств, нацеленных на человеческий PD-L1. В некоторых вариантах осуществления продукция аутоантител у не относящихся к человеку животных настоящего изобретения является следствием одного или более аутоиммунных заболеваний, нарушений или состояний, индуцированных в не относящемся к человеку животном.

В различных вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для стимулирования их одним или более антигенами с целью определения терапевтического потенциала соединений или биологических агентов в плане модуляции PD-L1-зависимой регуляции иммунного ответа, включая, без ограничений, специфические ответы на данный антиген, зависимые от Т-клеток и зависимые от В-клеток.

В различных вариантах осуществления клетки и/или не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения используются в анализе выживания и/или пролиферации (например, с использованием В- или Т-клеток) в целях поиска и разработки потенциальных лекарственных средств, модулирующих сигнализацию человеческого PD-L1. Активация или ингибирование PD-L1 играет важную роль в регуляции Т-клеточных ответов, и регуляция аутотолерантности посредством PD-L1 может являться следствием активации определенных эпитопов внеклеточного домена PD-L1, и, следовательно, потенциальные модуляторы PD-L1 (например, антагонисты или агонисты) можно идентифицировать, охарактеризовать и разработать с использованием клеток не относящихся к человеку животных настоящего изобретения и/или не относящихся к человеку животных, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетки и/или не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения используются в анализе (-ах) выживания или гибели при определении влияния на пролиферацию или апоптоз конкретной (-ых) клетки (-ок) (например, раковых клеток) в присутствии или в отсутствии PD-L1.

В различных вариантах осуществления клетки и/или не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения используются при ксенотрансплантации гетерологичных (например, человеческих) клеток или тканей для определения опосредованных PD-L1 функций в физиологическом (например, иммунном) ответе на трансплантированные человеческие клетки или ткань. В некоторых вариантах осуществления потенциальные лекарственные средства, которые связываются с или блокируют одну или более функций человеческого PD-L1, охарактеризовывают на не относящемся к человеку животном настоящего изобретения. К подходящим измерениям относятся различные клеточные анализы, анализы пролиферации, анализ сывороточных иммуноглобулинов (например, титр антител), анализы цитотоксичности и описание лиганд-рецепторных взаимодействий (иммунопреципитационные анализы). В некоторых вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для описания опосредованных PD-L1 функций, регулирующих иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с опухолью. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с аутоиммунным заболеванием, нарушением или состоянием. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с воспалительным заболеванием, нарушением или состоянием. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой мишень, ассоциированную с заболеванием или состоянием, от которого страдают один или более нуждающихся в лечении пациентов-людей.

В различных вариантах осуществления не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения используются в экспериментах по трансплантации или адоптивному переносу для определения терапевтического потенциала соединений или биологических агентов в плане модуляции PD-L1 - зависимой регуляции ксеногенных лимфоцитов и их иммунной функции. В различных вариантах осуществления не относящимся к человеку животным настоящего изобретения трансплантируют человеческие Т-клетки; в некоторых вариантах осуществления - интактные Т-клетки; в некоторых вариантах осуществления - активированные Т-клетки.

В различных вариантах осуществления клетки не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют в Т-клеточных анализах для определения терапевтического потенциала соединений или биологических агентов в плане модуляции PD-L1-зависимой регуляции Т-зависимых ответов и функций. К примерам Т-клеточных анализов относятся, без ограничений, ELISpot, внутриклеточное окрашивание на цитокины, рестрикция по антигенам главного комплекса гистосовместимости (МНС), анализы вирусной супрессии, анализы цитотоксичности, анализы пролиферации и анализы супрессии регуляторными Т-клетками.

В различных вариантах осуществления клетки относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют в анализах трансмиграции клеток в целях поиска и разработки потенциальных лекарственных средств, модулирующих человеческий PD-L1. Трансмиграция клеток включает в себя миграцию клеток через эндотелий, и анализ трансмиграции позволяет измерить взаимодействие с эндотелием или трансмиграцию лейкоцитов или опухолевых клеток.

В различных вариантах осуществления клетки не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют в анализах роста (или пролиферации) опухолевых клеток для определения терапевтического потенциала соединений или биологических агентов и модуляции PD-L1-зависимой регуляции и/или апоптоза опухолевых клеток.

В различных вариантах осуществления клетки не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют в анализах продукции цитокинов для определения терапевтического потенциала соединений или биологических агентов и модуляции PD-L1-зависимой регуляции высвобождения цитокинов Т-клетками (например, интерферона-γ, интерлейкина-10). В некоторых вариантах осуществления клетки не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для обнаружения (и/или измерения) внутриклеточного высвобождения цитокинов, обусловленного взаимодействием гуманизированного PD-L1 с лекарственным препаратом, нацеленным на человеческий PD-L1, или партнером PD-L1 по связыванию (например, PD-1, В7-1 или его растворимым вариантом).

В различных вариантах осуществления аутоиммунное заболевание, нарушение или состояние индуцируют у одного или более не относящихся к человеку животных настоящего изобретения для получения системы in vivo для определения терапевтического потенциала соединений или биологических агентов по модуляции PD-L1-зависимой регуляции одной или более функций (или аспектов) аутоиммунного заболевания, нарушения или состояния. К примерам аутоиммунных заболеваний, нарушений или состояний, которые можно индуцировать у одного или более не относящихся к человеку животных настоящего изобретения, относятся диабет, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (например, как модель рассеянного склероза), ревматоидный артрит и системная красная волчанка.

Не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения образуют систему in vivo для анализа и испытания лекарственного средства или вакцины. В различных вариантах осуществления потенциальное лекарственное средство или вакцину можно ввести одному или более не относящимся к человеку животным настоящего изобретения с последующим мониторингом не относящихся к человеку животных для определения одного или более из иммунного ответа на лекарственное средство или вакцину, профиля безопасности лекарственного средства или вакцины или эффекта в отношении заболевания или состояния и/или одного или более симптомов заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления вакцина нацелена на вирус, такой как, например, вирус иммунодефицита человека или вирус гепатита (например, вирус гепатита С). К примерам способов, использованных для определения профиля безопасности, относятся измерения токсичности, оптимальной для дозирования концентрации, эффективности лекарства или вакцины и возможных факторов риска. Такие лекарственные средства или вакцины можно совершенствовать и/или разрабатывать в не относящихся к человеку животных.

Не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения обеспечивают улучшенную систему in vivo для выявления механизмов межклеточного взаимодействия у человека при использовании адоптивного переноса. В различных вариантах осуществления не относящимся к человеку животным настоящего изобретения можно имплантировать опухолевый ксенотрансплантат, а затем провести вторую имплантацию инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, которые можно имплантировать не относящимся к человеку животным методом адоптивного переноса с целью определения эффективности уничтожения солидных опухолей или других злокачественных новообразований. Такие эксперименты можно проводить с человеческими клетками, благодаря исключительному присутствию человеческого PD-L1, без конкуренции с эндогенным PD-L1 не относящегося к человеку животного. Дополнительно в таких не относящихся к человеку животных можно совершенствовать и/или разрабатывать терапевтические и фармацевтические средства для использования при ксенотрансплантации.

Не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения образуют систему in vivo для оценки фармакокинетических свойств лекарственного средства, нацеленного на человеческий PD-L1. В различных вариантах осуществления лекарственное средство, нацеленное на человеческий PD-L1, можно доставлять или вводить одному или более не относящимся к человеку животным настоящего изобретения с последующим мониторингом или выполнением одного или более анализов на не относящихся к человеку животных (или выделенных из них клетках) для определения эффекта лекарственного средства на не относящееся к человеку животное. К фармакокинетическим свойствам относятся, без ограничений, способ процессинга лекарственного средства животным в различные метаболиты (или определение присутствия или отсутствия одного или более метаболитов лекарственного средства, включая, без ограничений, токсические метаболиты), период полувыведения лекарства, уровни лекарства в циркуляции после введения (например, концентрация лекарственного средства в сыворотке), реакция на лекарственное средство (например, антитела к лекарственному средству), всасывание и распределение лекарственного средства, путь введения, пути выведения и/или клиренс лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления фармакокинетические и фармакодинамические свойства лекарственных средств (например, модуляторов PD-L1) отслеживают у или посредством не относящихся к человеку животных настоящего изобретения.

Не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения образуют систему in vivo для оценки прямой токсичности лекарственного средства, нацеленного на человеческий PD-L1. В различных вариантах осуществления лекарственное средство, нацеленное на человеческий PD-L1, можно доставлять или вводить одному или более не относящимся к человеку животным настоящего изобретения с последующим мониторингом или выполнением одного или более анализов на не относящихся к человеку животных (или выделенных из них клетках) для определения прямого токсического эффекта лекарственного средства на не относящееся к человеку животное. Как правило, лекарственные средства предназначены для модуляции одной или нескольких функций своих мишеней. В качестве всего одного примера модулятор PD-L1 предназначен для модуляции опосредованных PD-L1 функций (например, сигнализации PD-L1 и/или взаимодействий PD-L1) путем взаимодействия каким-либо образом с молекулой PD-L1 на поверхности одной или более клеток и в некоторых вариантах осуществления блокирования взаимодействий с одним или более партнерами PD-L1 по связыванию. В некоторых вариантах осуществления такой модулятор может оказывать неблагоприятный эффект, представляющий собой чрезмерное усиление желаемого (-ых) фармакологического (-их) действия (-ий) модулятора. Такие эффекты называются прямыми эффектами. К примерам прямых эффектов относятся передозировка, хроническая активация/инактивация и корректное действие в некорректной ткани. В некоторых вариантах осуществления прямые эффекты лекарственного средства, нацеленного на PD-L1, выявленные у или посредством не относящихся к человеку животных настоящего изобретения, используют для определения ранее неизвестной (-ых) функции (-ий) PD-L1.

Не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения образуют систему in vivo для оценки побочной токсичности лекарственного средства, нацеленного на человеческий PD-L1. В различных вариантах осуществления лекарственное средство, нацеленное на человеческий PD-L1, можно доставлять или вводить одному или более не относящимся к человеку животным настоящего изобретения с последующим мониторингом или выполнением одного или более анализов на не относящихся к человеку животных (или выделенных из них клетках) для определения побочного токсического эффекта лекарственного средства на не относящееся к человеку животное. Побочные эффекты могут возникать, когда лекарственное средство взаимодействует с непредусмотренной мишенью (например, перекрестная активность с общим эпитопом). Такие взаимодействия могут происходить в предусмотренной или в непредусмотренной ткани. В качестве всего одного примера зеркальные изомеры (энантиомеры) лекарственного средства могут вызывать побочные токсические эффекты. Кроме этого, лекарство может ненадлежащим образом взаимодействовать с разными подтипами рецепторов и непреднамеренно активировать их. К примерам побочных эффектов относятся неправильная активация/ингибирование некорректной мишени, независимо от ткани, в которой находится некорректная мишень. В некоторых вариантах осуществления побочные эффекты лекарственного средства, нацеленного на человеческий PD-L1, определяют путем сравнения эффектов введения лекарственного средства не относящимся к человеку животным настоящего изобретения с одним или более эталонными не относящимися к человеку животными.

В некоторых вариантах осуществления выполнение анализа включает в себя определение эффекта на фенотип и/или генотип не относящегося к человеку животного, которому вводят лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления выполнение анализа включает в себя определение вариабельности между разными партиями модулятора PD-L1 (например, антагониста или агониста) или лекарственного средства, нацеленного на PD-L1. В некоторых вариантах осуществления выполнение анализа включает в себя определение различий между эффектами лекарственного средства, нацеленного на PD-L1, введенного не относящемуся к человеку животному настоящего изобретения и эталонному не относящемуся к человеку животному. В различных вариантах осуществления эталонные не относящиеся к человеку животные могут иметь модификацию, описанную в настоящем документе, могут иметь модификацию, отличающуюся от описанной в настоящем документе (например, модификацию, включающую измененный, разорванный, удаленный, вставленный, модифицированный и т.п. или иным образом нефункциональный ген CD274), или могут не иметь модификации (т.е. не относящееся к человеку животное дикого типа).

К примерам параметров, которые могут быть измерены у не относящихся к человеку животных (или в и/или с помощью выделенных из них клеток) для оценки фармакокинетических свойств, прямой токсичности и/или побочной токсичности лекарственного средства, нацеленного на человеческий PD-L1, относятся, без ограничений, агглютинация, аутофагия, деление клеток, гибель клеток, опосредованный комплементом гемолиз, целостность ДНК, титр специфичных к лекарству антител, метаболизм лекарства, анализы экспрессии генов, метаболическая активность, митохондриальная активность, окислительный стресс, фагоцитоз, биосинтез белка, деградация белка, секреция белка, стрессовый ответ, концентрация лекарства в ткани-мишени, концентрация лекарства в ткани, не являющейся мишенью, транскрипционная активность и т.п. В различных вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для определения фармацевтически эффективной дозы модулятора PD-L1 (например, лекарственного средства, нацеленного на PD-L1).

Не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения обеспечивают улучшенную систему in vivo для разработки и описания потенциальных терапевтических средств, предназначенных для применения при раке. В различных вариантах осуществления не относящимся к человеку животным настоящего изобретения можно имплантировать опухоль (или опухолевые клетки), а затем ввести одно или несколько потенциальных терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления потенциальные терапевтические средства могут включать в себя мультиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело) или коктейль антител; в некоторых вариантах осуществления потенциальные терапевтические средства включают в себя комбинированную терапию, такую как, например, введение двух или более моноспецифических антител последовательно или одновременно. Опухоли можно дать достаточно времени для формирования в одном или более месте в организме не относящегося к человеку животного, прежде чем вводить одно или более потенциальных терапевтических средств. Пролиферацию, рост, выживание и т.д. опухолевых клеток можно измерять как до, так и после введения потенциального (-ых) терапевтического (-их) средства (средств). Также при желании можно измерить цитотоксичность потенциальных терапевтических средств на не относящемся к человеку животном.

Не относящиеся к человеку животные настоящего изобретения обеспечивают улучшенную систему in vivo для разработки и описания потенциальных терапевтических средств, предназначенных для применения при инфекционных заболеваниях. В различных вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения можно инфицировать инъекцией вируса (например, MHV, HIV, HCV и т.п.) или патогена (например, бактерий), а затем ввести одно или более потенциальных терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления потенциальные терапевтические средства могут включать в себя мультиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело) или коктейль антител; в некоторых вариантах осуществления потенциальные терапевтические средства включают в себя комбинированную терапию, такую как, например, введение двух или более моноспецифических антител последовательно или одновременно; в некоторых вариантах осуществления потенциальные терапевтические средства могут включать в себя вакцину. Вирусу или патогену можно дать достаточно времени для формирования в одном или более местах или клетках в организме не относящегося к человеку животного, так чтобы в не относящемся к человеку животном развились один или более симптомов, ассоциированных с инфицированием вирусом или патогеном. Пролиферацию и рост Т-клеток можно измерять как до, так и после введения потенциального (-ых) терапевтического (-их) средства (средств). Дополнительно можно провести измерение выживания, выполнить анализ цитокинов в сыворотке и/или внутри клеток, измерить гистопатологию в печени и/или селезенке у не относящихся к человеку животных, инфицированных вирусом или патогеном. В некоторых вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для определения степени повреждения органов, ассоциированной с вирусной инфекцией. В некоторых вариантах осуществления не относящихся к человеку животных настоящего изобретения используют для определения профиля экспрессии цитокинов и/или профиля экспрессии генов в различных органах не относящихся к человеку животных, инфицированных конкретным вирусом.

Не относящихся к человеку животных настоящего изобретения можно использовать для оценки эффективности терапевтического средства, нацеленного на человеческие клетки. В различных вариантах осуществления одному или более не относящимся к человеку животным настоящего изобретения трансплантируют человеческие клетки и такому не относящемуся к человеку животному вводят потенциальное лекарственное средство, нацеленное на эти человеческие клетки. Далее определяют терапевтическую эффективность лекарственного средства, осуществляя мониторинг человеческих клеток в не относящемся к человеку животном после введения лекарственного средства. К лекарственным средствам, которые можно протестировать на не относящихся к человеку животных, относятся как низкомолекулярные соединения, т.е. соединения с молекулярным весом менее 1500 кДа, 1200 кДа, 1000 кДа или 800 дальтон, так и высокомолекулярные соединения (такие как белки, например антитела), обладающие запланированными терапевтическими эффектами для лечения человеческих заболеваний и состояний путем нацеливания (например, связывания и/или воздействия) на человеческие клетки.

В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой противораковое средство, а человеческие клетки представляют собой раковые клетки, которые могут быть клетками первичного рака или клетками клеточных линий, сформировавшихся из первичного рака. В некоторых вариантах осуществления не относящемуся к человеку животному настоящего изобретения трансплантируют человеческие раковые клетки и не относящемуся к человеку животному вводят противораковое лекарственное средство. Эффективность лекарственного средства можно определить путем оценки того, ингибируется ли рост и метастазирование человеческих раковых клеток в организме не относящегося к человеку животного в результате введения лекарственного средства.

В конкретных вариантах осуществления противораковое лекарственное средство представляет собой молекулу антитела, которая связывается с антигеном на человеческих раковых клетках. В конкретных вариантах осуществления противораковое средство представляет собой биспецифическое антитело, которое связывается с антигеном на человеческих раковых клетках и с антигеном на других человеческих клетках, например клетках человеческой иммунной системы (или «человеческих иммунных клетках»), таких как В-клетки и Т-клетки.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры приведены для того, чтобы описать обычным специалистам в данной области, как создать и использовать способы и композиции изобретения. Эти примеры не предназначены для ограничения объема того, что авторы рассматривают в качестве их изобретения. При отсутствии иных указаний температура приведена в градусах по Цельсию, а давление равно или приблизительно равно атмосферному.

Пример 1. Гуманизация эндогенного гена кластера дифференцировки 274 (CD274)

В данном примере представлены примеры способов гуманизации эндогенного гена CD274, кодирующего лиганд 1 программируемой гибели клеток (Programmed cell death-ligand 1, PD-L1) у не относящегося к человеку животного, такого как грызун (например, мышь). Способы, описанные в данном примере, можно применять для гуманизации эндогенного гена CD274 не относящегося к человеку животного с использованием любой желаемой человеческой последовательности или комбинации последовательностей (или фрагментов последовательностей). В этом примере фрагмент человеческой ДНК на ~ 8444 п. н., содержащий экзоны 3, 4 и 5 (частично) человеческого гена CD274, присутствующий в Genbank под номером доступа NM_014143.3 (SEQ ID NO: 11), используют для гуманизации эндогенного гена Cd274 мыши. Нацеливающий вектор для гуманизации генетического материала, кодирующего внеклеточный домен, содержащий N-концевой домен IgV и домен типа IgC2 эндогенного гена Cd274, конструировали с использованием технологии VELOCIGENE® (см., например, патент США №6,586,251 и публикацию Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6): 652-659; включенные в настоящий документ путем ссылки).

Если коротко, мышиный клон искусственной бактериальной хромосомы (ВАС) RP23-467A9 (Invitrogen) модифицировали, удаляя кодирующие последовательности экзонов 3, 4 и 5 (частично) эндогенного мышиного гена Cd274 (~ 8942 п. н.) и вставляя экзоны 3, 4 и 5 (частично) человеческого гена CD274, используя фрагмент человеческой ДНК на ~ 8444 п. н., кодирующий аминокислоты 19-238 человеческого полипептида PD-L1. Эндогенную ДНК, содержащую экзон 1, экзон 2, экзон 6 и экзон 7, а также нетранслируемые области (UTR), оставляли нетронутой. Анализ последовательности фрагмента человеческой ДНК на ~ 8444 п. н. подтвердил наличие всех человеческих экзонов CD274 (т.е. экзонов 3, 4 и частично 5) и сигналов сплайсинга. Анализ последовательности показал, что последовательность совпала с человеческим транскриптом CD274 NM014143.3. Прежде всего, фрагмент человеческой ДНК на ~ 8444 п. н. амплифицировали двумя участками (Фиг. 2, вверху). 5'-участок (~ 4494 п. н.), содержащий экзон 2 человеческого CD274 и часть интрона 3, амплифицировали методом ПЦР с использованием 3'-праймера, содержащего сайт рестрикции NheI, и 5'-праймера, содержащего мышиный гомологичный фрагмент для облегчения бактериальной гомологичной рекомбинации. 3'-участок (~ 3950 п. н.), содержащий часть интрона 3, экзон 4, интрон 4 и часть экзона 5 (~ 32 п. н.), амплифицировали методом ПЦР, используя 5'-праймер, содержащий сайт рестрикции XhoI, и 3'-праймер, содержащий мышиный гомологичный фрагмент для облегчения бактериальной гомологичной рекомбинации. Продукты ПЦР очищали на геле и по отдельности расщепляли соответствующими рестрикционными эндонуклеазами. Сайты рестрикции NheI-XhoI использовали для пришивания фрагментов ДНК ~ 4494 п. н. и ~ 3950 п. н. к 5' и 3'-концам самоудаляющейся неомициновой кассеты на ~ 4996 п. н. (loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-loxP; см. патенты США №8,697,851, 8,518,392 и 8,354,389, которые все включены в настоящий документ путем ссылки) в обратной ориентации относительно фрагментов ДНК, содержащих человеческую кодирующую последовательность CD274. В последующей селекции использовали неомицин. Согласно схеме соединение между участком экзона 5 человеческого CD274 (т.е. первыми 32 п. н.) и экзоном 5 эндогенного Cd274 сохраняло открытую рамку считывания в экзоне 5 (Фиг. 2) и создавало уникальный экзон 5 CD274 Полученный нацеливающий вектор содержал, в направлении от 5' к 3', 5'-гомологичное плечо, содержащее ~ 92,9 т.п.н. мышиной геномной ДНК из клона ВАС RP23-467A9, фрагмент человеческой ДНК на ~ 4494 п. н., содержащий экзон 3 и часть интрона 3 человеческого гена CD274, самоудаляющуюся неомициновую кассету, фланкированную сайтами loxP, фрагмент человеческой ДНК на ~ 3950 п. н., содержащий часть интрона 3, экзон 4, интрон 4 и первые 32 п. н. экзона 5 человеческого гена CD274, и ~ 67,6 т. п. н. мышиной геномной ДНК из клона ВАС RP23-467A9.

Вышеописанный модифицированный клон RP23-467A9 был использован при электропорации мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток для создания модифицированных ЭС-клеток, содержащих эндогенный ген CD274, гуманизированный от экзона 3 до участка экзона 5 (т.е. делецией ~ 8964 эндогенного гена Cd274 и вставкой ~ 8444 п. н. человеческой последовательности CD274). Позитивно нацеленные ЭС-клетки, содержащие гуманизированный ген CD274, идентифицировали путем анализа (Valenzuela et al. выше), которым определялось присутствие человеческих последовательностей CD274 (например, экзонов 3, 4 и участка экзона 5) и подтверждалась делеция и/или сохранение мышиных последовательностей Cd274 (например, экзонов 3, 4 и участка экзона 5 и/или экзонов 1, 2, 6 и 7). В таблице 4 представлены примеры последовательностей праймеров и зондов, которые использовались для подтверждения гуманизации эндогенного мышиного гена Cd274, как описано выше (показано на Фиг. 3).

Нуклеотидные последовательности в различных стыках представлены на схемах на Фиг. 2. Нуклеотидная последовательность ближней к 5'-концу точки вставки включала в себя нижеследующую, и это показывает, что эндогенная мышиная последовательность Cd274 (ниже заключена в скобки) примыкает к человеческой последовательности CD274 ближе к 3'-концу от точки вставки:

Нуклеотидная последовательность 5'-конца самоудаляющейся неомициновой кассеты включала в себя нижеследующую, и это указывает, что человеческая последовательность CD274 примыкает к последовательности кассеты (ниже заключена в скобки, сайт рестрикции NheI выделен курсивом, а последовательность loxP выделена жирным шрифтом) ближе к 3'-концу от точки вставки:

Нуклеотидная последовательность 3'-конца самоудаляющейся неомициновой кассеты включала в себя нижеследующую, и это указывает, что последовательность кассеты (ниже заключена в скобки, последовательность loxP выделена жирным шрифтом, а сайт рестрикции XhoI выделен курсивом) примыкает к человеческой последовательности CD274 ближе к 3'-концу от точки вставки:

Нуклеотидная последовательность 3'-конца человеческой последовательности CD274 включала в себя нижеследующую, и это указывает, что человеческая последовательность CD274 примыкает к мышиной последовательности Cd274 (ниже заключена в скобки):

Нуклеотидная последовательность точки вставки после делеции неомициновой кассеты включала в себя нижеследующую, и это указывает, что человеческая геномная последовательность примыкает к оставшейся кассетной последовательности loxP (ниже заключена в скобки, сайты рестрикции NheI и XhoI выделены курсивом, последовательность loxP выделена жирным шрифтом):

Положительные ЭС-клеточные клоны далее использовали для имплантации самкам мышей методом VELOCIMOUSE® (см., например, патент США №7,294,754 и публикацию Poueymirou et al., 2007, Nature Biotech. 25(1): 91-99) с получением потомства детенышей, содержащих вставку экзонов 3, 4 человеческого CD274 и части экзона 5 человеческого CD274 в эндогенный мышиный ген Cd274. Мыши с гуманизацией экзона 3, 4 и части экзона 5 (т.е. фрагментом человеческой ДНК на ~ 8444 п. н.) эндогенного гена Cd274 проходили дополнительное подтверждение и идентификацию путем генотипирования ДНК, выделенной из отрезка хвоста, с применением анализа (Valenzuela et al., выше), обнаруживающего присутствие человеческих генных последовательностей CD274. Детенышей генотипировали и для охарактеризовывания отбирали когорты животных, гетерозиготных по гуманизированной генной конструкции Pdcd1. Также мышей скрещивали для получения гомозигот.

Пример 2. Экспрессия гуманизированного PD-L1 на активированных Т-клетках

Данный пример демонстрирует, что не относящиеся к человеку животные (например, грызуны), модифицированные так, чтобы иметь гуманизированный ген CD274 согласно примеру 1, экспрессируют гуманизированный полипептид PD-L1 на поверхности активированных лимфоцитов. В этом примере активированные Т-клетки из мышей дикого типа и мышей, геном которых содержал гуманизированный ген CD274, описанный в примере 1, окрашивали коммерческими антителами к PD-L1 для определения экспрессии PD-L1 в стимулированных и нестимулированных Т-клетках.

Если коротко, отбирали селезенки мышей дикого типа и мышей, гомозиготных по эндогенному гену CD274, описанному в примере 1, и преобразовывали их в суспензию одиночных клеток путем механической диссоциации. Клетки отмывали средой (RPMI с добавлением 10% FBS), ресуспендировали 1×10⁶/мл и сеяли по 200 мкл (200000 клеток) в 96-луночные планшеты. Клетки в избранных лунках стимулировали антителами к CD3 и антителами к CD28 (в обоих случаях 1 мкг/мл) в течение 72 часов. Клетки окрашивали для сортинга клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) согласно описанию производителя антителами, распознающими CD3, CD4, CD8 и человеческий (клон MIH1, BD Biosciences) или мышиный (клон 10F.9G2, eBioscience) PD-L1. Окрашенные клетки исследовали проточным цитометром LSRII и данные анализировали с помощью программного обеспечения FLOWJO™. Селектировали клетки CD8⁺ Т (CD3⁺CD8⁺) и CD4⁺ Т (CD3⁺CD4⁺) и анализировали на экспрессию человеческого и мышиного PD-L1. Примеры средних значений интенсивности флуоресценции представлены в таблице 5.

Как показано в таблице 5, мыши, имеющие гуманизированный ген CD274, описанный в примере 1, экспрессируют на активированных Т-клетках полипептид PD-L1, содержащий человеческий участок и эндогенный участок. Человеческий участок экспрессируется с возможностью распознавания антителом, реагирующим с полностью человеческим полипептидом PD-L1, но не распознающим мышиный полипептид PD-L1 мышей дикого типа. Напротив, антитело к мышиному PD-L1, клон 10F.9G2, продемонстрировало высокий уровень окрашивания мышиного PD-L1 у мышей дикого типа после стимуляции антителами к CD3/антителами к CD28 и минимальный уровень окрашивания у мышей с гуманизированным PD-L1. Это, вероятнее всего, обусловлено частичной перекрестной реактивностью с человеческим PD-L1.

α-hPD-L1: антитело к человеческому PD-L1

α-mPD-L1: антитело к мышиному PD-L1

Пример 3. Эффективность модуляторов PD-L1 in vivo

Этот пример демонстрирует, что не относящихся к человеку животных (например, грызунов), модифицированных так, чтобы иметь гуманизированный ген CD274, соответствующий примеру 1, можно использовать в анализе in vivo для отбора модуляторов PD-L1 (например, антител к PD-L1) и определения различных характеристик, таких как, например, уменьшение роста опухоли и/или уничтожение опухолевых клеток. В данном примере выполняется скрининг нескольких антител к PD-L1 на мышах, гомозиготных по гуманизированному эндогенному гену CD274 (как описано в примере 1), которым подкожно вводили опухолевые клетки MC38.ova для определения оптимальной дозы антитела, способствующей регрессии опухоли, и определения уровня гибели опухолевых клеток, опосредованной антителами к PD-L1.

Если коротко, мышей разделяли равномерно по весу тела на пять экспериментальных и контрольных групп для исследования 1 (n=5-8 мышей в группе) или рандомизировали на семь экспериментальных групп для исследования 2 (n=5-6 мышей). Животных исследования 1 подвергали анестезии путем ингаляции изофурана, а затем подкожно вводили в правый бок 1×10⁶ клеток MC38.ova в суспензии со 100 мкл DMEM (день 0). Клетки MC38.Ova (мышиная аденокарцинома толстой кишки) модифицировали для экспрессии куриного овальбумина, чтобы повысить иммуногенность опухоли и обеспечить возможность мониторинга Т-клеточных иммунных ответов на известные антигенные овальбуминовые пептиды. Клетки MC38.ova также трансдуцировали лентивирусным вектором, экспрессирующим полноразмерный человеческий PD-L1 под контролем промотора вируса SFFV, и сортировали по положительной экспрессии человеческого PD-L1 (MC38.ova/hPD-L1) методом проточной цитометрии с использованием антитела, специфичного к человеческому PD-L1 (клон MIH1, BD Biosciences). Клетки MC38.ova также экспрессируют низкий уровень эндогенного мышиного PD-L1. Животным экспериментальных групп исследования 1 внутрибрюшинно вводили по 500 мкг одного из трех антител к PD-L1 или одного из двух изотипических контрольных антител, не специфичных к PD-L1, на 3-й, 7-й, 10-й, 14-й и 17-й дни. Одной группе животных ничего не вводили. Животным исследования 2 также подкожно имплантировали по 1×10⁶ клеток MC38.Ova/hPD-Ll (день 0), однако экспериментальным группам исследования 2 внутрибрюшинно вводили антитело к PD-L1 (антитело А, антитело В или антитело С) или контрольные антитела (т.е. не специфические к PD-L1) в дозах 10 мг/кг или 5 мг/кг. Экспериментальным группам вводили антитела на 3-й, 7-й, 10-й, 14-й и 17-й дни. Экспериментальные дозы и протокол введения в каждом из исследований представлены в таблице 6.

В каждом исследовании объемы опухолей отслеживали измерениями циркулем дважды в неделю на всем протяжении эксперимента (17 дней в случае исследования 1 и 21 день в исследовании 2) и в конце каждого исследования регистрировали процентную долю выживания. Также в конце каждого исследования регистрировали количество мышей, не имеющих опухолей. Примеры результатов, выраженные в виде среднего объема опухоли (мм³ ± СО), процентной доли выживших и количества мышей, не имеющих опухолей, представлены в таблицах 7 и 8. Примеры кривых роста опухолей представлены на Фиг. 4.

В исследовании 1 все три антитела к PD-L1 эффективно обеспечивали регрессию опухоли в дозе 500 мкг/мышь, и все мыши, получавшие антитела В и С, не имели опухоли к 17-му дню (таблица 7). В группе антитела А четыре из пяти мышей (80%) не имели опухоли к 17-му дню, тогда как все мыши в контрольных группах имели опухоль. Однофакторный дисперсионный анализ с пост-тестом Дуннета со множественным сравнением показал достоверное различие объемов опухолей между группой, получавшей лечение антителами к PD-L1, и группой, получавшей контрольные антитела, со значением р<0,05. Контроль 2 представляет собой несвязанное контрольное антитело совпадающего изотипа, тогда как контроль 1 представляет собой несвязанное контрольное антитело несовпадающего изотипа.

В исследовании 2 введение выбранных антител к PD-L1 приводило к ингибированию роста опухоли и, следовательно, способствовало регрессии опухоли (таблица 8). Все протестированные антитела к PD-L1 были эффективны в дозе 10 мг/кг и 5 мг/кг и способствовали регрессии опухоли у получавших лечение мышей дозозависимым образом в течение всего срока эксперимента. Ни одно животное, получавшее контрольные антитела, не избавилось от опухоли (таблица 8). Однофакторный дисперсионный анализ с пост-тестом Тьюки со множественным сравнением показал достоверное различие объемов опухолей между группой, получавшей лечение антителами к PD-L1, и группой, получавшей контрольные антитела, со значением р<0,05 или ниже. Контроль 1 представляет собой несвязанный контроль совпадающего изотипа.

Как показано на Фиг. 4 и в таблицах 7 и 8, антитела к PD-L1 достоверно ингибировали рост опухоли в профилактической модели роста опухоли MC38.ova/hPD-L1 на мышах, имеющих гуманизированный ген CD274, описанный в примере 1. Терапия антителами к PD-L1 в дозах 10 мг/кг и 5 мг/кг обеспечивала регрессию опухоли у всех мышей в течение всего срока эксперимента, вследствие чего к 21-му дню опухолей не имели три из шести мышей в группе, получавшей 10 мг/кг, и две из пяти мышей в группе, получавшей 5 мг/кг, тогда как в контрольной группе ни одна из мышей не избавилась от опухоли (0/6) (Фиг. 4). Однофакторный дисперсионный анализ с пост-тестом Дуннета со множественным сравнением показал достоверное различие объемов опухолей на 21-й день между группой, получавшей лечение антителами к PD-L1, и группой, получавшей контрольные антитела, со значением р<0,01 (группа, получавшая 5 мг/кг) и значением р<0,0001 (группа, получавшая 10 мг/кг).

В сходном эксперименте исследовали интактную функциональную сигнализацию PD-L1 у мышей, имеющих гуманизированный ген CD274, описанный в примере 1, путем измерения ответов Т-клеток CD8⁺ и CD3⁺ в спленоцитах мышей-опухоленосителей, получавших антитело к PD-L1.

Если коротко, в конце эксперимента, на 21-й день (как описано выше), выделяли спленоциты из мышей, имеющих гуманизированный ген CD274, описанный в примере 1, получавших антитело к PD-L1 или контрольное антитело. Выделяли всю РНК и выполняли ПЦР в реальном времени на обратно транскрибированной кДНК с использованием олигонуклеотидов и смеси зондов TAQMAN™, специфичной к мышиному CD8b, мышиному CD3ξ (Mm00446171_m1, Applied Biosystems), человеческому PD-L1 и мышиному PD-L1 (таблица 9). Образцы нормализовали к экспрессии мышиного циклофиллина В. Примеры результатов представлены на Фиг. 5.

Как показано на Фиг. 5, введение антитела к hPD-L1 приводило к увеличению количества Т-клеток CD8⁺ и CD3⁺ в спленоцитах мышей, имеющих гуманизированный ген CD274 (описанный в примере 1) и несущих опухоли MC38.ova/hPD-L1. Это подтверждает, что мыши, имеющие гуманизированный ген CD274 (описанный в примере 1), проявляют надлежащую экспрессию и сигнализацию через гуманизированный PD-L1 на поверхности клеток в том смысле, что экспрессия PD-L1 клетками MC38.ova не могла подавить пролиферацию противоопухолевых Т-клеток CD8⁺. В целом, продемонстрированное увеличение количества Т-клеток по сравнению с контрольными мышами наблюдали в обеих экспериментальных группах, однако статистически значимое различие по уровням CD8b (значение р<0,01) и CD3 (р<0,001), по данным однофакторного дисперсионного анализа с пост-тестом Дуннета с множественным сравнением, было достигнуто только между группой, получавшей 10 мг/кг антитела к PD-L1, и контрольными группами.

Экспрессию мРНК человеческого PD-L1 измерили при помощи специфичных к человеку зондов, разработанных для внеклеточного участка человеческого полипептида PD-L1 (таблица 9), и подтвердили надлежащую экспрессию гуманизированного белка PD-L1 на поверхности клеток (Фиг. 5). Кроме этого, при измерении экспрессии мРНК мышиного PD-L1 при помощи праймеров, предназначенных для обнаружения внеклеточного участка мышиного PD-L1 (таблица 9), получить продукт не удалось. Эти данные подтверждают результаты проточной цитометрии, представленные в таблице 5, т.е. мыши с гуманизированным PD-L1 действительно экспрессируют гуманизированный PD-L1, который является интактным и функциональным на поверхности клеток.

В совокупности данный пример демонстрирует, что не относящихся к человеку животных настоящего изобретения можно использовать для оценки in vivo эффективности лекарственных средств (например, антител), нацеленных на PD-L1, и таких животных можно применять для выделения терапевтического эффекта антител к PD-L1. Более того, не относящихся к человеку животных, описанных в настоящем документе, можно применять для оценки той степени, в которой лекарственные средства, нацеленные на PD-L1, могут способствовать регрессии опухолей и/или опосредовать уничтожение опухолевых клеток. Не относящиеся к человеку животные (например, мыши) настоящего изобретения демонстрируют экспрессию функционального гуманизированного полипептида PD-L1 на поверхности клеток, а также надлежащую регуляцию полипептидом PD-L1 иммунных ответов через ингибирование PD-L1-зависимой супрессии Т-клеток CD8⁺ на модели опухоли.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

Таким образом, после описания нескольких аспектов по меньшей мере одного варианта осуществления настоящего изобретения специалистам в данной области должно быть понятно, что можно легко выполнить различные изменения, модификации и улучшения. Предполагается, что такие изменения, модификации и улучшения будут частью настоящего описания и будут находиться в рамках сущности и объема изобретения. Соответственно, вышеизложенное описание и чертежи приведены только в качестве примера, а изобретение подробно описано в приведенной ниже формуле изобретения.

Использование обозначающих порядок терминов, таких как «первый», «второй», «третий» и т.д., в формуле изобретения для определения заявляемого элемента формулы изобретения само по себе не подразумевает какой-либо приоритет, предшествование или расположение в определенном порядке одного элемента формулы изобретения по сравнению с другим или временной порядок, в котором выполняются этапы способа, но используется исключительно в качестве отметки с целью отличить один элемент формулы изобретения, имеющий определенное название, от другого элемента с таким же названием (кроме использования обозначающего порядок термина) для различения элементов формулы изобретения.

При использовании в настоящем описании и в формуле настоящего изобретения форм единственного числа, при отсутствии ясных иных указаний, они обозначают включение множества объектов. Пункты формулы изобретения или описания, которые включают союз «или» между одним или более элементов группы, являются выполненными, если один, более одного или все элементы группы присутствуют, используются или иным образом связаны с данным продуктом или процессом, если не указано противоположное или из контекста не очевидно иное. Изобретение включает варианты осуществления, в которых ровно один элемент группы присутствует, используется или иным образом связан с данным продуктом или процессом. Изобретение также включает варианты осуществления, в которых более одного или все элементы группы присутствуют, используются или иным образом связаны с данным продуктом или процессом. Кроме того, следует понимать, что настоящее изобретение охватывает все варианты, комбинации и перестановки, в которых одно или более ограничений, элементов, условий, описательных терминов и т.п. из одного или более перечисленных пунктов формулы изобретения включены в другой пункт формулы изобретения, зависимый от того же исходного пункта (или, если применимо, любого другого пункта), если не указано иное или если специалисту в данной области не будет очевидно, что возникнет противоречие или несоответствие. Если элементы представлены в виде перечней (например, в группе Маркуша или схожем формате), следует понимать, что также описана каждая подгруппа элементов, и любой (-ые) элемент (-ы) можно удалить из группы. Следует понимать, что в целом, если изобретение или аспекты изобретения содержат конкретные элементы, признаки и т.д., конкретные варианты осуществления изобретения или аспекты изобретения состоят или по существу состоят из таких элементов, признаков и т.д. С целью упрощения эти варианты осуществления в настоящем документе специально не были описаны в каждом случае именно таким образом. Также следует понимать, что любой вариант осуществления или аспект изобретения может быть в прямой форме исключен из формулы изобретения вне зависимости от того, присутствует ли в описании такое особое исключение.

Специалистам в данной области будут понятны типичные стандартные отклонения или погрешности, относящиеся к величинам, полученным в анализах или других процессах, описанных в настоящем документе. Публикации, веб-сайты и другие справочные материалы, упоминаемые в настоящем документе для описания предпосылок создания изобретения и для предоставления дополнительной информации относительно его практического применения, включены в настоящий документ путем ссылки.

1. Генетически модифицированный грызун для экспрессии гуманизированного полипептида CD274, геном которого содержит гуманизированный ген CD274 в эндогенном локусе CD274,

причем указанный гуманизированный ген CD274 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточную последовательность человеческого полипептида CD274, функционально связанную с

(i) нуклеотидной последовательностью, кодирующей внутриклеточную последовательность и трансмембранную последовательность эндогенного полипептида CD274 грызуна, и

(ii) промотором CD274 грызуна;

причем указанный грызун экспрессирует гуманизированный полипептид CD274 и причем указанный грызун представляет собой мышь или крысу.

2. Генетически модифицированный грызун по п. 1, у которого нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточную последовательность и трансмембранную последовательность эндогенного полипептида CD274 грызуна, содержит экзон 6, экзон 7 и часть экзона 5 эндогенного гена CD274 грызуна.

3. Генетически модифицированный грызун по п. 1 или 2, у которого гуманизированный ген CD274 содержит экзон 1 и экзон 2 эндогенного гена CD274 грызуна.

4. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 1-3, у которого нуклеотидная последовательность, кодирующая внеклеточную последовательность человеческого полипептида CD274, содержит экзон 3, экзон 4 и часть экзона 5 человеческого гена CD274.

5. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 1-3, у которого нуклеотидная последовательность, кодирующая внеклеточную последовательность человеческого полипептида CD274, кодирует аминокислоты 19-238 человеческого полипептида CD274.

6. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 1-5, у которого промотор CD274 грызуна представляет собой эндогенный промотор CD274 грызуна.

7. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 1-6, у которого гуманизированный ген CD274 является результатом замены геномного фрагмента эндогенного гена CD274 грызуна геномным фрагментом человеческого гена CD274, причем геномный фрагмент человеческого гена CD274 содержит экзон 3, экзон 4 и часть экзона 5 человеческого гена CD274.

8. Генетически модифицированный грызун по п. 7, у которого гуманизированный ген CD274 содержит экзон 1 и экзон 2 эндогенного гена CD274 грызуна, экзон 3, экзон 4 и часть экзона 5 человеческого гена CD274 и экзон 6, экзон 7 и часть экзона 5 эндогенного гена CD274 грызуна.

9. Изолированная клетка грызуна для экспрессии гуманизированного полипептида CD274, геном которой содержит гуманизированный ген CD274 в эндогенном локусе CD274,

причем указанный гуманизированный ген CD274 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточную последовательность человеческого полипептида CD274, функционально связанную с

(i) нуклеотидной последовательностью, кодирующей внутриклеточную последовательность и трансмембранную последовательность эндогенного полипептида CD274 грызуна, и

(ii) промотором CD274 грызуна; и

причем изолированная клетка грызуна экспрессирует гуманизированный полипептид CD274 и представляет собой мышиную клетку или крысиную клетку.

10. Изолированная ткань грызуна для экспрессии гуманизированного полипептида CD274, геном которой содержит гуманизированный ген CD274 в эндогенном локусе CD274,

причем указанный гуманизированный ген CD274 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточную последовательность человеческого полипептида CD274, функционально связанную с

(i) нуклеотидной последовательностью, кодирующей внутриклеточную последовательность и трансмембранную последовательность эндогенного полипептида CD274 грызуна, и

(ii) промотором CD274 грызуна; и

причем изолированная ткань грызуна экспрессирует гуманизированный полипептид CD274 и представляет собой мышиную ткань или крысиную ткань.

11. Изолированная эмбриональная стволовая (ES) клетка грызуна для получения грызуна, экспрессирующего гуманизированный полипептид CD274, геном которой содержит гуманизированный ген CD274 в эндогенном локусе CD274,

причем указанный гуманизированный ген CD274 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточную последовательность человеческого полипептида CD274, функционально связанную с

(i) нуклеотидной последовательностью, кодирующей внутриклеточную последовательность и трансмембранную последовательность эндогенного полипептида CD274 грызуна, и

(ii) промотором CD274 грызуна;

причем гуманизированный ген CD274 кодирует гуманизированный полипептид CD274 и

причем ES-клетка грызуна представляет собой мышиную ES-клетку или крысиную ES-клетку.

12. Эмбрион грызуна для получения животного-грызуна, которое экспрессирует гуманизированный полипептид CD274, причем эмбрион грызуна содержит эмбриональную стволовую клетку по п. 11 и представляет собой мышиный эмбрион или крысиный эмбрион.

13. Способ получения генетически модифицированного грызуна, который экспрессирует гуманизированный полипептид CD274, причем способ включает в себя

(а) вставку нуклеотидной последовательности, которая кодирует внеклеточную последовательность человеческого полипептида CD274, в эндогенный ген CD274 грызуна изолированной ES-клетки грызуна с получением гуманизированного гена CD274,

причем указанный гуманизированный ген CD274 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточную последовательность человеческого полипептида CD274, функционально связанную с

(i) нуклеотидной последовательностью, кодирующей внутриклеточную последовательность и трансмембранную последовательность эндогенного полипептида CD274 грызуна, и

(ii) промотором CD274 грызуна; и

(b) получение грызуна с использованием ES-клетки грызуна, содержащей гуманизированный ген CD274, полученный в (а), причем геном грызуна содержит гуманизированный ген CD274 в эндогенном локусе CD274 грызуна и причем грызун экспрессирует гуманизированный полипептид CD274 и представляет собой мышь или крысу.

14. Способ получения генетически модифицированного грызуна, который экспрессирует гуманизированный полипептид CD274, при этом геном грызуна содержит гуманизированный ген CD274, причем способ включает в себя

модификацию генома грызуна для содержания в модифицированном геноме гуманизированного гена CD274 в эндогенном локусе CD274, причем указанный гуманизированный ген CD274 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточную последовательность человеческого полипептида CD274, функционально связанную с

(i) нуклеотидной последовательностью, кодирующей внутриклеточную последовательность и трансмембранную последовательность эндогенного полипептида CD274 грызуна, и

(ii) промотором CD274 грызуна; и

получение грызуна, содержащего модифицированный геном грызуна, причем грызун экспрессирует гуманизированный полипептид CD274 и представляет собой мышь или крысу.

15. Способ по п. 13 или 14, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая внеклеточную последовательность человеческого полипептида CD274, содержит экзон 3, экзон 4 и часть экзона 5 человеческого гена CD274.

16. Способ по п. 13 или 14, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая внеклеточную последовательность человеческого полипептида CD274, кодирует аминокислоты 19-238 человеческого полипептида CD274.

17. Способ по любому из пп. 13-16, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточную последовательность и трансмембранную последовательность эндогенного полипептида CD274 грызуна, содержит экзон 6, экзон 7 и часть экзона 5 эндогенного гена CD274 грызуна.

18. Способ по любому из пп. 13-17, в котором гуманизированный ген CD274 содержит экзон 1 и экзон 2 эндогенного гена CD274 грызуна.

19. Способ по любому из пп. 13-18, в котором промотор CD274 грызуна представляет собой эндогенный промотор CD274 грызуна.

20. Способ по любому из пп. 13-19, в котором гуманизированный ген CD274 является результатом замены геномного фрагмента эндогенного гена CD274 грызуна геномным фрагментом человеческого гена CD274, причем геномный фрагмент человеческого гена CD274 содержит экзон 3, экзон 4 и часть экзона 5 человеческого гена CD274.

21. Способ по п. 20, в котором гуманизированный ген CD274 содержит экзон 1 и экзон 2 эндогенного гена CD274 грызуна, экзон 3, экзон 4 и часть экзона 5 человеческого гена CD274 и экзон 6, экзон 7 и часть экзона 5 эндогенного гена CD274 грызуна.

22. Способ скрининга в отношении лекарственного средства, способного лечить опухоль, причем способ включает в себя этапы

(a) введения опухолевых клеток грызуну по любому из пп. 1-8 с тем, чтобы у грызуна образовалась опухоль,

(b) введения лекарственного средства грызуну с этапа (а); и

(c) определения того, снижается ли рост опухоли у грызуна с этапа (b), при этом лекарственное средство, которое снижает рост опухоли, способно лечить опухоль.

23. Способ по п. 22, в котором лекарственное средство представляет собой антитело к человеческому CD274.

24. Способ по п. 22 или 23, в котором лекарственное средство вводят грызуну внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно или подкожно.