Способ коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте
Владельцы патента RU 2711906:
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") (RU)
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и неврологии, и может быть использовано для лечения ишемии головного мозга. Способ включает воспроизведение четырехсосудистой модели ишемии головного мозга путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий. При этом крысам-самцам линии Wistar внутрибрюшинно вводят субстанцию рапиталама в дозе 10 мг/кг за 30 мин до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования ишемии головного мозга ежедневно в течение 14 суток. Способ обеспечивает выраженную коррекцию ишемии головного мозга путем направленного действия рапиталама на mGluR4 рецепторы, в результате чего происходит ингибирование продукции глутамата в черной субстанции, защита от глутамат-опосредованной эксайтотоксичности и угнетение воспалительных эффектов. 4 табл., 1 пр.
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и неврологии.
По известным литературным источникам - увеличение концентрации внутриклеточного Са2+ является результатом избыточного накопления глутамата во внеклеточном пространстве. Гибель нейронов происходит после последовательности биохимических реакций, которая получила название эксайтотоксичности. За этим следует дисбаланс между глутаматергическим возбуждением и ГАМК-эргическим торможением. В результате несвоевременной активации тормозных механизмов продолжается накопление внеклеточного глутамата, гибель нейронов, что приводит к более тяжелым проявлениям ишемии головного мозга [Domin H, Przykaza L, Jantas D, Kozniewska E, Boguszewski PM, Smialowska M (2016) Neuroprotective potential of the group III mGlu receptor agonist ACPT-I in animal models of ischemic stroke: In vitro and in vivo studies. Neuropharmacology 102: 276-294].
Наиболее вероятными механизмами нейропротекции являются ингибирование продукции глутамата в черной субстанции, что в свою очередь защищает от глутамат-опосредованной эксайтотоксичности и снижение воспалительных эффектов [Avdeeva NV, Sidorova SA, Gudyrev OS, Osipova OA, Golubev IV (2019) Mechanism of neuroprotective effect of mGluR4 agonists. Research Results in Pharmacology 5(2): 43-47].
Предполагается, что препараты, влияющие на mGluR4 рецепторы, имеют потенциал при лечении болезни Паркинсона, аутизма и мозжечковой атаксии [Power EM, Empson RM (2014) Functional contributions of glutamate transporters at the parallel fibre to Purkinje neuron synapse-relevance for the progression of cerebellar ataxia. Cerebellum and Ataxias 1: 3]. В галоперидоловой и резерпиновой моделях паркинсонизма введение агонистов mGluR4 приводило к уменьшению симптомов [Niswender CM, Conn PJ (2010) Metabotropic glutamate receptors: physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 50: 295-322].
Актуальным является поиск высокоэффективных препаратов для лечения ишемии головного мозга [Спасов A.A., Федорчук В.Ю., Гурова Н.A. и др. Методологический подход для изучения нейропротекторной активности в эксперименте. Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2014; 4: 39-45]. Перспективным представляется исследование субстанции рапиталама для коррекции ишемии головного мозга в эксперименте в лечебных целях, являющегося модулятором mGluR4 рецепторов. Рапиталам представляет собой N-[(4-chlorophenyl)methyl]-1,6-dihydro-4-methoxy-1-(2-methylphenyl)-6-oxo-3-pyridazinecarboxamide, С20Н18ClN3O3 [Авдеева, Н.В. Исследование некоторых аспектов мутагенного действия фармацевтической субстанции лекарственного средства - Рапиталам. Авдеева Н.В., Корокин М.В., Покровский М.В. Современные проблемы науки и образования. 2017. № 3. С. 136].
Известен способ коррекции тремора в эксперименте (патент на изобретение RU 2678977, публ. 05.02.2019), включающий однократное ежедневное внутрижелудочное введение крысам корригирующего агента в дозе 10 мг/кг в течение 10 дней, а в последний день эксперимента однократное внутрибрюшинное введение оксотреморина в дозе 1,5 мг/кг в объёме 0,5 мл/кг через 30 минут после введения корригирующего агента. При этом в качестве корригирующего агента используют субстанцию лекарственного средства Рапиталам, который является модулятором mGluR4 рецепторов. Изобретение приводит к выраженной коррекции оксотреморин-индуцированного тремора, подтверждаемой длительностью латентного периода и тремора, суммарной оценкой выраженности тремора в баллах и процентом животных с тремором в группе, с учетом его длительности.
В данном изобретении отсутствует информация о возможности коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте.
Известен способ профилактики церебральной ишемии (патент на изобретение RU 2696203, публ. 31.07.2019), включающий воспроизведение четырехсосудистой модели патологии и введение крысам-самцам линии Wistar 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина в дозе 50 мг/кг, который вводят однократно за 60 минут до эксперимента внутрижелудочно через зонд в качестве прекондиционирующего агента, а через 60 минут проводят моделирование церебральной ишемии путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий.
Основным недостатком способа является то, что в нем описана только профилактика церебральной ишемии путем прекондиционирования 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицином на крысах линии Wistar и нет данных по коррекции 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицином ишемических повреждений головного мозга после моделирования патологии (посткондиционирование), что гораздо чаще встречается в практике. Помимо этого, не приведены данные по применению 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина для лечения церебральной ишемии.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте, обладающего направленным действием на mGluR4 рецепторы, основанным на ингибировании продукции глутамата в черной субстанции, которая в свою очередь защищает от глутамат-опосредованной эксайтотоксичности и снижении воспалительных эффектов [Avdeeva NV, Sidorova SA, Gudyrev OS, Osipova OA, Golubev IV (2019) Mechanism of neuroprotective effect of mGluR4 agonists. Research Results in Pharmacology 5(2): 43-47].
Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного способа коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте, являющегося модулятором mGluR4 рецепторов.
Поставленная задача достигается тем, что предложен способ коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте, включающий воспроизведение четырехсосудистой модели ишемии головного мозга путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий и введение крысам-самцам линии Wistar фармакологического агента, причем в качестве фармакологического агента используют субстанцию рапиталама в дозе 10 мг/кг, вводимую внутрибрюшинно за 30 мин. до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования ишемии головного мозга ежедневно внутрибрюшинно в течение 14 суток суммарно.
Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что:
- в качестве церебропротектора с лечебной целью вводят субстанцию рапиталама, являющегося модулятором mGluR4 рецепторов.
- эффективность субстанции оценивается всесторонне: исследуются неврологический дефицит животного, поведенческие реакции, уровень двух специфических маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE.
- с помощью электроэнцефалографии (ЭЭГ) производится контроль правильно выполненной модели патологии.
- способ приводит к выраженной коррекции ишемических повреждений головного мозга в эксперименте на крысах-самцах линии Wistar при выбранном режиме введения субстанции рапиталама.
Способ обеспечивает выраженную коррекцию ишемии головного мозга путем направленного действия рапиталама на mGluR4 рецепторы, в результате чего происходит ингибирование продукции глутамата в черной субстанции, защита от глутамат-опосредованной эксайтотоксичности и угнетение воспалительных эффектов.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ
Эксперимент выполнен на 40 половозрелых самцах крыс линии Wistar 5-6-месячного возраста массой 180-210 г. Содержание животных соответствовало всем правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований на территории РФ. Животные содержались в стандартных условиях, соответствующих санитарным правилам (№ 1045-73), утвержденным МЗ СССР 06.04.73 г. по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) и ГОСТ Р 53434-2009. Вивисекцию проводили по этическим принципам обращения с лабораторными животными «European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No.123».
В эксперимент вошло 4 группы крыс: 1) интактные (n=10), 2) ложнооперированные (n=10), 3) с тотальной церебральной ишемией (n=10), 4) с тотальной церебральной ишемией и введением рапиталама в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно за 30 мин. до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования церебральной ишемии ежедневно в течение 14 суток (n=10).
Наркотизацию животных выполняли внутрибрюшинным введением золетила 60 мг/кг и хлоралгидрата 150 мг/кг.
Все эксперименты были выполнены в соответствии с методическими рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств при нарушениях мозгового кровообращения. В работе была использована модель патологии, при которой осуществляли временную окклюзию двух общих сонных артерий на 4 минуты, с предварительной коагуляцией двух вертебральных артерий. Оценка адекватности выполнения окклюзии артерий, кровоснабжающих мозг, осуществлялась с помощью регистрации электрической активности головного мозга животного на приборе Biopac Systems Inc. MP150 EEG100C [Tadalafil as an agent of pharmacological preconditioning in ischemic - reperfusion brain injury / Martynova O.V. // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. - 2017. - Vol.3, №3. - Р. 20-36].
Метод осуществляли при помощи программы AcqKnowledge 4.2. Критерием правильно выполненной методики являлось уменьшение амплитуды ЭЭГ.
Протокол исследования включал следующие этапы: моделирование ишемии головного мозга; оценку ЭЭГ животного; оценку поведенческих реакций (до моделирования патологии и на 2, 7 и 14 сут. после моделирования патологии); неврологического дефицита на 1, 3, 7 и 14 сут после моделирования патологии; определение уровня S100b и NSE на 3 сутки после моделирования патологии.
О выраженности церебропротекторного эффекта судили по тяжести неврологического дефицита, поведенческого статуса, уровню специфических маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE.
Для всех данных была применена описательная статистика. Полученные данные проверены на нормальность распределения. С помощью критерия Шапиро-Уилка определяли тип распределения. В случае нормального распределения были подсчитаны среднее значение (M) и стандартная ошибка среднего (m). В случаях ненормального распределения были рассчитаны медиана (Me) и квартильный размах (QR). Межгрупповые различия анализировались параметрическими (t-критерий Стьюдента) или непараметрическими (критерий Манна-Уитни) методами, в зависимости от типа распределения. Различия были определены при 0,05 уровне значимости. Статистический анализ выполнен с помощью программного обеспечения Statistica 10.0.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Для оценки неврологического статуса крыс использовали несколько методов:
1. Балльную шкалу оценки инсульта McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной, результаты которой представлены в таблице 1. Внутри группы крыс с признаками неврологического дефицита подразделяли на животных с легкой, средней и тяжелой симптоматикой неврологического дефицита. Если у животного присутствовало несколько признаков неврологического дефицита, то баллы суммировали. За контроль принимали данные, полученные от животных с тотальной ишемией головного мозга. При оценке выраженности неврологического дефицита по McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной на первые сутки после моделирования патологии в контрольной группе наблюдался неврологический дефицит средней степени тяжести (2,73 ± 0,14 балла). У животных регистрировались вялость и замедленность движений, тремор, наличие полуптозов и птозов глаз, слабость конечностей, манежные движения, паралич задней левой лапы. В группе с введением субстанции рапиталама на первые сутки после моделирования ишемии выявлено достоверно более низкое значение неврологического дефицита, чем в контрольной группе (p<0,05). В группе с введением субстанции рапиталама на 3 сутки значение достоверно отличалось от контрольной группы (p<0,05). В контрольной группе на 7 и 14 сутки сохранялся паралич задней левой конечности и полуптоз, птоз правого глаза. В группе с введением рапиталама на 7 и 14 сутки сохранялся лишь полуптоз правого глаза. Активность животных нарастала более стремительно в группе с рапиталамом.
Таблица 1
Влияние субстанции рапиталама на динамику тяжести неврологических нарушений по McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной при коррекции ишемии головного мозга в эксперименте, баллы (М±m; n=10)
| Период | Группы | |||
| Интактные | Ложнооперированные | Контроль |
Коррекция рапиталамом,
10 мг/кг |
|
| 1 сут | 0 | 0 | 2,73±0,14 | 1,53±0,26* |
| 3 сут | 0 | 0 | 1,28±0,19 | 0,88±0,35* |
| 7 сут | 0 | 0 | 0,85±0,30 | 0,68±0,26 |
| 14 сут | 0 | 0 | 0,51±0,24 | 0,36±0,22 |
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.
При анализе поведенческих реакций крыс с введением рапиталама в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) выявлено, что животные ведут себя активнее, чем крысы контрольной группы. Уже на 2 сутки эксперимента в группе с введением рапиталама наблюдается статистически значимые изменения следующих параметров: снижение времени пребывания в тёмном рукаве ПКЛ, увеличение времени пребывания животных в светлом рукаве ПКЛ, увеличение количества стоек. Количество свешиваний в ПКЛ достоверно увеличивалось на 2 сутки эксперимента в группах с введением рапиталама в дозе 10 мг/кг по сравнению со значениями контрольной группы (р<0,05). На 7-е и 14-е сутки наблюдается статистически значимое улучшение всех изучаемых параметров в группе с рапиталамом по сравнению с контрольной группой (р<0,05) (таблица 2).
Таблица 2
Влияние субстанции рапиталама на поведенческую активность животных в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» при коррекции ишемии головного мозга в эксперименте (М±m; n=10)
| Критерий | Период | Группы | |||
| Интактные | Ложнооперированные | Контроль |
Коррекция рапиталамом,
10 мг/кг |
||
| Темный рукав, t | 2 сут. | 153,2±2,0 | 154,1±2,2 | 169,4±1,5 | 158,6±1,7* |
| 7 сут. | 153,2±1,8 | 153,6±1,7 | 165,6±2,4 | 155,8±2,4* | |
| 14 сут. | 154,5±1,8 | 155,5±2,0 | 164,8±2,6 | 158,6±1,7* | |
| Светлый рукав, t | 2 сут. | 23,8±1,7 | 24,1±1,5 | 11,6±1,7 | 18,2±0,8* |
| 7 сут. | 23,8±1,5 | 23,4±1,3 | 12,7±1,0 | 20,5±1,2* | |
| 14 сут. | 22,8±1,6 | 22,2±1,4 | 13,7±1,3 | 21,5±1,0* | |
| Стойки, шт. | 2 сут. | 10,0±0,5 | 10,4±0,8 | 4,6±0,33 | 7,1±0,3* |
| 7 сут. | 9,9±0,6 | 9,2±0,6 | 5,3±0,2 | 8,0±0,4* | |
| 14 сут. | 9,8±0,7 | 9,4±0,8 | 5,6±0,3 | 8,7±0,4* | |
| Свешивания, шт. | 2 сут. | 4,8±0,4 | 4,8±0,5 | 1,5±0,3 | 2,0±0,2* |
| 7 сут. | 4,9±0,2 | 4,6±0,3 | 1,7±0,2 | 2,9±0,3* | |
| 14 сут. | 5,0±0,5 | 5,2±0,4 | 1,8±0,2 | 3,9±0,5* |
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.
Результаты теста актиметрии представлены в таблице 3.
Таблица 3
Влияние субстанции рапиталама на поведенческую активность животных в тесте актиметрии при коррекции ишемии головного мозга в эксперименте (М±m; n=10)
| Критерий | Период | Группы | |||
| Интактные | Ложнооперированные | Контроль |
Коррекция рапиталамом,
10 мг/кг |
||
| Общая активность, у.е. | 2 сут. | 940,07 ±25,94 |
932,11 ±22,03 |
410,41 ±27,9 |
453,20 ±18,86 |
| 7 сут. | 945,83 ±18,77 |
941,15 ±17,01 |
414,56 ±25,87 |
459,69 ±23,76 |
|
| 14 сут. | 943,80 ±19,6 |
932,46 ±13,5 |
419,9 ±13,0 |
490,4 ±14,2* |
|
| Стериотипы движения, у.е. | 2 сут. | 77,02 ±2,82 |
75,05 ±2,99 |
29,47 ±2,75 |
35,65 ±3,35* |
| 7 сут. | 77,26 ±1,45 |
78,56 ±3,09 |
30,41 ±2,28 |
41,13 ±3,04* |
|
| 14 сут. | 78,0 ±2,8 |
78,9 ±2,5 |
30,9 ±1,8 |
45,3 ±2,1* |
|
| Макси-мальная скорость, у.е. | 2 сут. | 43,18 ±2,18 |
44,67 ±3,02 |
22,25 ±2,45 |
26,71 ±3,34 |
| 7 сут. | 43,62 ±2,53 |
41,32 ±2,88 |
22,78 ±2,39 |
30,94 ±2,36* |
|
| 14 сут. | 43,74 ±1,61 |
44,05 ±2,63 |
22,81 ±2,04 |
35,19 ±2,71* |
|
| Общая дистанция, у.е. | 2 сут. | 2220,4 ±101,1 |
2206,8 ±98,2 |
772,17 ±31,01 |
805,97 ±23,75 |
| 7 сут. | 2289,8 ±120,9 |
2198,1 ±114,1 |
774,0 ±25,5 |
846,6 ±29,7* |
|
| 14 сут. | 2329,9 ±182,5 |
2300,3 ±167,5 |
780,4 ±18,4 |
1671,0 ±180,7* |
|
| Время отдыха, у.е. | 2 сут. | 89,81 ±5,39 |
91,09 ±6,90 |
196,39 ±6,08 |
157,08 ±4,73* |
| 7 сут. | 89,8 ±3,5 |
90,8 ±3,7 |
190,3 ±4,7 |
149,6 ±5,6* |
|
| 14 сут. | 89,8 ±4,0 |
89,8 ±4,2 |
185,0 ±6,4 |
120,9 ±7,2* |
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.
В связи с тем, что оптимальная концентрация S100b и NSE наблюдается во временном промежутке с 24 часов до 72 часов, кровь брали на 3-и сутки после моделирования патологии. Результаты исследования на биохимические маркёры повреждения головного мозга представлены в таблице 4.
Таблица 4
Влияние субстанции рапиталама на концентрацию биохимических маркёров повреждения головного мозга в крови крыс при коррекции ишемии головного мозга в эксперименте (M±m; n=10)
| Показатели | Группы | |||
| Интактные | Ложнооперированные | Контроль |
Коррекция рапиталамом,
10 мг/кг |
|
| S100b мкг/л | 0,725±0,17 | 0,698±0,14 | 1,981±0,21 | 0,660±0,07* |
| NSE нг/мл | 0,364±0,10 | 0,301±0,08 | 0,541±0,11 | 0,252±0,04* |
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.
Таким образом, в предлагаемом способе введение субстанции рапиталама в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно за 30 мин. до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования ишемии головного мозга ежедневно в течение 14 суток в лечебных целях приводит к выраженной коррекции ишемии головного мозга.
Способ коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте, включающий воспроизведение четырехсосудистой модели ишемии головного мозга путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий и введение крысам-самцам линии Wistar фармакологического агента, отличающийся тем, что в качестве фармакологического агента используют субстанцию рапиталама в дозе 10 мг/кг, вводимую внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования ишемии головного мозга ежедневно внутрибрюшинно в течение 14 суток суммарно.
