Способы лечения и профилактики развития цереброваскулярных заболеваний

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии и неврологии, и касается лечения и профилактики развития цереброваскулярных заболеваний. Для этого пациентам, имеющими или находящимся в группе риска развития церебральной кавернозной мальформации (ССМ), вводят терапевтически эффективное количество темпола, или холекальциферола, или их аналогов. Это обеспечивает эффективное лечение или профилактику возникновения ССМ за счет способности указанных соединений быстро и напрямую ингибировать внутриклеточные сигнальные пути, которые принимают участие в активации эндотелия и снижении дестабилизации, вызванной мутацией. 4 н. и 39 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивает приоритет на основании Патентной заявке США №. 14/728,800, поданной 2 июня 2015 года и озаглавленной как «СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ РАЗВИТИЯ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ», а также апоморфиПредварительной патентной заявке США №. 62/014,540, поданной 19 июня 2014 года, озаглавленной как «СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ РАЗВИТИЯ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ», каждая из которых включена в данную заявку во всей полноте посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное раскрытие относится к способам лечения и/или профилактики развития заболеваний. Более конкретно, раскрытие относится к способам лечения и/или профилактики развития цереброваскулярных заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Церебральные кавернозные мальформации (CCM) представляют собой заболевания с нарушением мозгового кровообращения, включающие ангиомы (т.е. сосудистые мальформации), развивающиеся из сосудов капиллярного русла в пределах центральной нервной системы (т.е. головного мозга, сетчатки глаза или позвоночника). CCM могут быть «подтекающими» и нестабильными с присутствующим хроническим или острым кровотечением, которое может привести к развитию воспаления или нарушению мозгового кровоснабжения, соответственно (см. Gault J с соавт., Neurosurgery 55, 1-16 (2004)). Пациенты, имеющие ССМ, также могут страдать эпилепсией и/или иметь очаговую неврологическую симптоматику (см. Al-Shahi Salman R с соавт., Stroke 39, 3222-3230 (2008); и Josephson CB с соавт., Neurology 76, 1548-1554 (2011)). Основным методом лечения ССМ является нейрохирургическая резекция, выполнение которой может представлять трудности, или которая может быть невозможной в случае наличия очагов поражений, локализующихся в области тонких или глубоких структур или поблизости от них, или в случае, если у пациентов наблюдается насколько очагов поражения (Batra S с соавт., Nat Rev Neurol 5, 659-670 (2009)). ССМ в целом развиваются в виде двух форм: спорадической и наследственной (или соматической или гаметической, соответственно), которые вместе могут поражать 1 человека из 200-600 человек в Соединенных Штатах (см. Otten PG с соавт., Neurochirurgie 35, 82-83 (1989); Vernooij MW с соавт., N Engl J Med 357, 1821-1828 (2007); и Al Shahi Salman R с соавт., Lancet Neurol 11, 217-224 (2012)).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Варианты осуществления, раскрытые в данной заявке, станут более очевидными на основе следующего описания и прилагаемой формулы изобретения, рассматриваемыми совместно с чертежами.

ФИГ. 1A отображает период времени лечения и анализа, описанных в Примере 1.

ФИГ. 1B представляет собой диаграмму, отображающую число очагов поражения при церебральных кавернозных мальформациях (ССМ), описанных в Примере 1.

ФИГ. 1C представляет собой диаграмму, отображающую число и размеры очагов поражений при ССМ, описанных в Примере 1.

ФИГ. 1D отображает реконструкции мышиного головного мозга и очаги поражения ССМ, описанные в Примере 1.

ФИГ. 2A отображает RHOA активацию, как описано в Примере 2.

ФИГ. 2B отображает pMLC активацию, как описано в Примере 2.

ФИГ. 2C отображает ARF6 активацию, как описано в Примере 2.

ФИГ. 3A отображает RAC1 активацию, как описано в Примере 2.

ФИГ. 3B отображает CDC-42 активацию, как описано в Примере 2.

ФИГ. 3C отображает R-RAS активацию, как описано в Примере 2.

ФИГ. 4A отображает «спасение» холекальциферолом CCM2-индуцированной активации ARF6, как описано в Примере 2.

ФИГ. 4B представляет собой диаграмму, отображающую количественный анализ результатов ФИГ. 4А.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее раскрытие предоставляет способы лечения цереброваскулярных заболеваний, включающих, не ограничиваясь заболеваниями с нарушением мозгового кровообращения, такими как церебральные кавернозные мальформации (ССМ). Данное раскрытие также предоставляет способы профилактики развития цереброваскулярных заболеваний, включающих, не ограничиваясь, ССМ.

Нетрудно понять, что варианты осуществления, как описано в целом в данной заявке, являются иллюстративными. Следующее далее подробное описание различных вариантов осуществления не предназначено для ограничения объема настоящего раскрытия, но является всего лишь представительным для различных вариантов осуществления. Более того, порядок стадий или действий в способах, раскрытых в данной заявке, могут быть изменены специалистом в данной области техники в пределах объема настоящего раскрытия. Другими словами, в случаях, когда для нормального проведения процесса варианта осуществления не требуется соблюдение определенных стадий или действий, порядок стадий и действий может быть изменен.

Первый аспект раскрытия относится к способам снижения числа очагов поражения ССМ у пациентов, имеющих по меньшей мере один очаг поражения ССМ. Снижение скорости роста и/или числа очагов поражения ССМ у пациента может снизить частоту развития ассоциированных с ССМ признаков и симптомов, включая, но не ограничиваясь эпилепсией, кровотечением (например, внутримозговым кровоизлиянием) и очаговой неврологической симптоматикой.

В некоторых вариантах осуществления данное раскрытие предоставляет способы снижения числа очагов поражения ССМ у пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения ССМ, где способы включают введение терапевтически эффективного количество темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли. Терапевтически эффективное количество темпола (4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил) и/или его фармацевтически приемлемой соли также может включать фармацевтически приемлемый носитель.

Способы, раскрытые в данной заявке, могут дополнительно включать определение числа очагов поражения ССМ у пациента. Например, способы могут включать определение того, имеется ли у пациента один очаг поражения ССМ, два очага поражения ССМ или более чем два очага поражения ССМ. Терапевтически эффективное количество темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли может по меньшей мере частично зависеть от или определяться числом очагов поражения ССМ у пациента. Например, пациенту, имеющему только один очаг поражения ССМ, может потребоваться меньше доз или меньшая доза темпола, чем пациенту, имеющему два или более очага поражения ССМ. В некоторых вариантах осуществления для подсчета или определения числа очагов поражения ССМ можно применять магнитно-резонансную томографию (МРТ). Также можно применять другие подходящие способы подсчета или определения числа очагов поражения ССМ у пациента.

Наследственная форма ССМ наблюдается приблизительно в 20% случаев ССМ и в целом ассоциируется с мутациями с потерей функции в одном из трех генов: гена церебральной кавернозной мальформации 2 (ССМ2); гена KRIT1, содержащего анкириновый повтор (KRIT1); и/или гена запрограммированной смерти клеток 10 (PDCD10) (см. Riant F с соавт., FEBS J 277, 1070-1075 (2010). В целом, считается, что индивиды, имеющие множественные (т.е., два и более) очаги поражения ССМ и/или семейный анамнез ССМ, имеют наследственную форму ССМ, а также могут иметь более высокий риск более высокой частоты развития ассоциированных с ССМ признаков и симптомов, например, кровотечения (см. Al-Shahi Salman R с соавт., Lancet Neurol 11, 217-224 (2012) and Flemming KD с соавт., Neurology 78, 632-636 (2012)). Без ограничения теорией, можно сказать, что наследственная форма ССМ может развиваться в результате гетерозиготной гаметной мутации по меньшей мере в одном гене, выбираемом из ССМ2, KRIT1 и/или PDCD10. В целом, считается, что индивиды, имеющие один очаг поражения ССМ и/или не имеющие ССМ в семейном анамнезе, имеют спорадическую форму ССМ.

В некоторых вариантах осуществления раскрытые способы могут дополнительно включать определение пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения ССМ, где идентификация включает определение по меньшей мере одной мутации по меньшей мере в одном гене, ассоциированном с ССМ пациента. Например, по меньшей мере одну мутацию можно определить по меньшей мере в одном гене, выбираемом по меньшей мере из ССМ2, KRIT1 и/или PDCD10. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одну мутацию можно определить в CCM2 или KRIT1.

В других вариантах осуществления способы снижения числа очагов поражения у пациента могут дополнительно включать или включать в качестве альтернативы терапевтически эффективное количество холекальциферола (витамин D3), производное холекальциферола (включая, не ограничиваясь кальцидиолом и кальцитриолом) и/или фармацевтически приемлемую соль вышеперечисленных веществ. Например, способ снижения числа очагов поражения ССМ у пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения ССМ, может включать введение терапевтически эффективного количества: темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли; а также терапевтически эффективного количества холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ.

В некоторых вариантах осуществления пациент может представлять собой млекопитающее. В конкретных вариантах осуществления пациент может представлять собой человека. Любой пациент или участник, имеющий или находящийся в группе риска развития ССМ или по меньшей мере одного очага поражения ССМ, может быть потенциальным кандидатом для терапии темполом, его фармацевтически приемлемой солью, холекальциферолом и/или фармацевтически приемлемой солью вышеперечисленных веществ.

Другой аспект раскрытия относится к способам снижения числа очагов поражения ССМ или ингибирования развития одного или более очагов поражения ССМ у пациента, находящегося в группе риска развития по меньшей мере одного очага поражения.

В некоторых вариантах осуществления раскрытие предоставляет способы снижения числа очагов поражения ССМ или ингибирования развития одного или более очагов поражения ССМ у пациента, находящегося в группе риска развития по меньшей мере одного очага поражения ССМ, где способы могут включать введение терапевтически эффективного количества темпола. В некоторых других вариантах осуществления способы снижения числа очагов поражения ССМ или ингибирования развития одного или более очагов поражения ССМ у пациента, находящегося в группе риска развития по меньшей мере одного очага поражения ССМ могут включать введение терапевтически эффективного количества темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли. Терапевтически эффективное количество темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли может также включать фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления способы могут дополнительно включать определение пациента, находящегося в группе риска развития по меньшей мере одного очага поражения, где определение включает определение лежащей в основе по меньшей мере одной мутации по меньшей мере в одном гене, ассоциированном с развитием ССМ у пациента. Например, по меньшей мере одну мутацию можно определить в одном гене, выбираемом по меньшей мере из ССМ2, KRIT1 и/или PDCD10. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одну мутацию можно определить в CCM2 или KRIT1. В некоторых вариантах осуществления способы определения пациента, находящегося в группе риска развития по меньшей мере одного очага поражения ССМ, могут включать определение гетерозиготной гаметной мутации по меньшей мере в одном гене, выбираемом из ССМ2, KRIT1 и/или PDCD10. В еще одном варианте осуществления способы определения пациента, находящегося в группе риска развития по меньшей мере одного очага поражения ССМ, могут включать определения гетерозиготной гаметной мутации в гене CCM2.

В других вариантах осуществления способы снижения числа очагов поражений ССМ или профилактики развития одного или более очагов поражений ССМ у пациента могут дополнительно включать или включать в качестве альтернативы введение терапевтически эффективного количества холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемых солей вышеперечисленных веществ. Например, способы снижения числа очагов поражений ССМ или профилактики развития одного или более очагов поражений ССМ у пациента могут включать введение терапевтически эффективного количества: темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли; а также терапевтически приемлемого количества холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемой соли вышеуказанных веществ. В некоторых вариантах осуществления пациент может представлять собой млекопитающее. В конкретных вариантах осуществления пациент может представлять собой человека.

Другой аспект раскрытие относится к способам замедления или профилактики развития кровоизлияния у пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения ССМ. Кровоизлияние или внутримозговое кровоизлияние может являться результатом (признаком) или симптомом ССМ. Вплоть до 17% пациентов с ССМ умирают в результате внутримозговых кровоизлияний. В дополнение, внутримозговые кровоизлияния могут привести к значительному ухудшению качества жизни индивида. Индивиды, имеющие наибольший риск развития кровоизлияния, в целом, представляют собой индивидов, имеющих множественные очаги поражения ССМ и/или индивидов, у которых недавно имело место кровоизлияние. Например, частота развития рецидивов кровоизлияний среди пациентов с ССМ, имеющих клиническую симптоматику кровоизлияния, составляет 20% в течение первого года (см. Flemming KD с соавт., Neurology 78, 632-636 (2012)). Дополнительно, лечение пациентов, имеющих наследственную форму ССМ и/или имеющие множественные очаги поражения ССМ, при помощи хирургической резекции, может быть затруднено. Таким образом, стабилизация числа очагов поражения ССМ может предотвратить или снизить риск развития кровоизлияния у пациентов с ССМ.

В некоторых вариантах осуществления способы замедления или профилактики развития кровоизлияния у пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения ССМ, могут включать введение терапевтически эффективного количества темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли. Терапевтически эффективное количество темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли может также включать фармацевтически приемлемый носитель.

В других вариантах осуществления способы замедления или профилактики развития кровоизлияния у пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения ССМ, могут дополнительно включать определение пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения ССМ, у которого в анамнезе имелось кровоизлияние в пределах предопределенного периода времени до начала введения темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления предопределенный период времени может представлять собой один год. В других конкретных вариантах осуществления предопределенный период времени может представлять собой два года. Также можно использовать другие предопределенные периоды времени.

В некоторых вариантах осуществления кровоизлияние может быть ассоциировано, может вызываться и/или представлять собой симптом ССМ. Кровоизлияние также развивается в сосудистой системе головного мозга пациента.

В других вариантах осуществления способы замедления или профилактики развития кровоизлияния у пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения ССМ, могут дополнительно включать или включать в качестве альтернативы введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбираемого из холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ. Например, способы замедления или профилактики развития кровоизлияния у пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения ССМ, могут включать введение терапевтически эффективного количества темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли; терапевтически эффективного количества холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ. В некоторых вариантах осуществления пациент может представлять собой млекопитающее. В конкретных вариантах осуществления пациент может представлять собой человека.

Другой аспект раскрытия относится к способам снижения проницаемости сосудистой системы головного мозга у пациента, имеющего риск или находящегося в групп риска развития ССМ.

В некоторых вариантах осуществления данное раскрытие предоставляет способы снижения проницаемости сосудистой системы головного мозга у пациента, имеющего ССМ, где способы включают введение фармацевтически-приемлемого количества темпола. В некоторых вариантах осуществления способы снижения проницаемости сосудистой системы головного мозга у пациента, имеющего ССМ, могут включать введение терапевтически эффективного количества темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли. Терапевтически эффективное количество темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли может также включать фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления способы снижения проницаемости сосудистой системы головного мозга могут дополнительно включать определение пациента, имеющего ССМ, где определение включает определение по меньшей мере одной мутации по меньшей мере в одном гене, выбираемом по меньшей мере из CCM2, KRIT1 и/или PDCD10. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере одну мутацию может определить в CCM2 или KRIT1.

В других вариантах осуществления способы снижения проницаемости сосудистой системы головного мозга у пациента, имеющего ССМ, могут дополнительно включать введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбираемого из холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ. Например, способ снижения проницаемости сосудистой системы головного мозга у пациента, имеющего ССМ, может включать введение терапевтически эффективного количества: темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли; а также терапевтически эффективного количества холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ.

В некоторых других вариантах осуществления раскрытие предоставляет способы снижения проницаемости сосудистой системы головного мозга у пациента, находящегося в группе риска развития ССМ, где способы могут включать введение терапевтически эффективного количества темпола. В некоторых других вариантах осуществления способы снижения проницаемости сосудистой сети головного мозга пациента, находящегося в группе риска развития ССМ, могут включать введение терапевтически эффективного количества темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли. Терапевтически эффективное количество темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли также может включать фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления способы снижения проницаемости сосудистой системы головного мозга могут дополнительно включать определение пациента, находящегося в группе риска развития ССМ, где определение включает определение по меньшей мере одной мутации по меньшей мере в одном гене, выбираемом по меньшей мере из CCM2, KRIT1 и/или PDCD10. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере одну мутацию может определить в CCM2 или KRIT1. В некоторых других вариантах осуществления способы определения пациента, находящегося в группе риска развития ССМ, могут включать определение гетерозиготной гаметной мутации по меньшей мере в одном гене, выбираемом из ССМ2, KRIT1 и/или PDCD10. В еще одном варианте осуществления способы определения пациента, находящегося в группе риска развития ССМ, могут включать определения гетерозиготной гаметной мутации в гене CCM2.

В другом варианте осуществления способы снижения проницаемости сосудистой системы головного мозга у пациента, находящегося в группе риска развития ССМ, могут дополнительно включать или включать в качестве альтернативы введение терапевтически эффективного количества соединения, выбираемого по меньшей мере из холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемой соли вышеуказанных веществ. Например, способы снижения проницаемости сосудистой системы головного мозга у пациента, находящегося в группе риска развития ССМ, могут включать введение терапевтически эффективного количества холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемой соли вышеуказанных веществ. В некоторых вариантах осуществления пациент может представлять собой млекопитающего. В конкретных вариантах осуществления пациент может представлять собой человека.

Другой аспект раскрытия относится к способам улучшения цереброваскулярного состояния пациента, имеющего ССМ.

В некоторых вариантах осуществления раскрытие предоставляет способы улучшения цереброваскулярного состояния пациента, имеющего ССМ, где способы включают введение терапевтически эффективного количества темпола. В некоторых других вариантах осуществления способы улучшения цереброваскулярного состояния пациента, имеющего ССМ, могут включать могут включать введение терапевтически эффективного количества темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли. Терапевтически эффективное количество темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли может также включать фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления раскрытые способы могут дополнительно включать определение пациента, имеющего ССМ, как описано выше.

В других вариантах осуществления способы улучшения цереброваскулярного состояния пациента, имеющего ССМ, могут дополнительно включать или включать в качестве альтернативы введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбираемого из холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ. Например, способ улучшения цереброваскулярного состояния пациента, имеющего ССМ, может включать введение терапевтически приемлемого количества темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли; а также терапевтически эффективного количества холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемой соли вышеуказанных веществ

Другой аспект раскрытия относится к способам снижения цереброваскулярного воспаления у пациента, имеющего ССМ.

В некоторых вариантах осуществления данное раскрытие предоставляет способы снижения цереброваскулярного воспаления у пациента, имеющего ССМ, где способы включают введение терапевтически эффективного количества темпола. В некоторых вариантах осуществления способы снижения цереброваскулярного воспаления у пациента, имеющего ССМ, могут включать введение терапевтически эффективного количества темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли. Терапевтически эффективное количество темпола и/или его фармацевтической соли также может включать фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления раскрытые способы могут дополнительно включать определение пациента, имеющего ССМ, как описано выше.

В других вариантах осуществления способы снижения цереброваскулярного воспаления у пациента, имеющего ССМ, могут дополнительно включать или включать в качестве альтернативы введение терапевтически эффективного количества одного соединения, выбираемого по меньшей мере из холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ. Например, способ улучшения цереброваскулярного состояния пациента, имеющего ССМ, может включать введение терапевтически эффективного количества: темпола и/или его фармацевтически приемлемых соли; а также терапевтически эффективного количества холекальциферола, производного холекальциферола и/или фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ.

В некоторых вариантах осуществления данное раскрытие предоставляет способы лечения или профилактики развития наследственной геморрагической телеангиэктазии (НГТ, HHT), где способы могут включать введение терапевтически эффективного количества темпола и/или его фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых вариантах осуществления способы в соответствии с любыми вышеупомянутыми вариантами осуществления могут дополнительно включать или включать в качестве альтернативы введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбираемого из: темпо (2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-ил)-оксил), 4-амино-темпо (4-амино-(2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-ил)-оксил), CuSO₄, MnCl₂, Тирона (4,5-дигидрокси-1,3-бензолдисульфокислота), PEG-SOD (полиэтиленгликоль супероксиддисмутаза), алоина ((10S)-10-глюкопиранозил-1,8-дигидрокси-3-(гидроксиметил)-9(10Н)-антраценон), гидрохлорида апоморфина, димеркапрола, гедунина и пиндолола; производного вышеперечисленных веществ и/или фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ.

ПРИМЕРЫ

Для дополнительного иллюстрирования данных вариантов осуществления предоставлены следующие примеры. Данные примеры не предназначены для ограничения объема заявленного изобретения, который должен быть определен исключительно на основании прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1 - Длительное лечение темполом и холекальциферолов Ccm2 ecKO мышей

Исследования влияния длительного лечения темполом и холекальциферолом на индуцируемых нокаутных по эндотелий-специфическому Ccm2 мышей (Ccm2^f/-; +/Tg(Pdgfb-iCreER^T2), также называемых в данной заявке Ccm2 ecKO мышами или эндотелий-нокаутными мышами, проводились, помимо прочего, для оценки возможности введения темпола и/или холекальциферола для лечения ССМ (см. Chan AC с соавт., J Clin Invest 121, 1871-1881 (2011) в отношении Ccm2 ecKO мышей). Через 5 дней после рождения (Р5) помет Ccm2 ecKO мышей был отнесен в группу получения стандартной пищи (HARLAN 2018, 1,5 МЕ/г D3), стандартной пищи плюс темпола в питьевой воде (1 ммоль) или обогащенной холекальциферолом пищи (HARLAN 2018+25 МЕ/г D3). Пища предоставлялась матери каждого помета до того, как мыши были отлучены на Р21. Мыши из каждого помета продолжали получать соответствующую пищу до достижения возраста 5 месяцев, точки, в которой у 100% мышей, нокаутных по эндотелий-специфическому Ccm2, наблюдались цереброваскулярные очаги поражения, определяемые на МРТ. ФИГ. 1А демонстрирует период времени лечения и анализа при применении темпола или холекальциферола у Ccm2 ecKO мышей, как описано в данной заявке.

В возрасте 5 месяцев мышей умерщвляют путем обескровливания (кровь была собрана для дальнейшего анализа) и дальнейшей перфузией при помощи раствора хлорида натрия и далее 4% формальдегида. Головной мозг мышей удаляют из черепа и производят посмертное МРТ. Градиент-восстановленную эхо последовательность применяют для получения коронарных срезов, охватывающих весь головной мозг. Параметры последовательности заданы следующим образом: время повторения импульса - 328 мс; время задержки эхо-импульса - 5,4 мс; угол наклона вектора - 40°, 12 средних значений, разрешение в плоскости - 125 мкм×125 мкм; а также толщина среза - 0,5 мм. Для типичной выборки головного мозга (для применения в качестве 3D реконструкций) было получено 3D градиентное эхо с высокой разрешающей способностью с применением следующих параметров: размер изотропных вокселей - 78 мкм×78мкм×78мкм в течение 9 часов. Другие параметры последовательности заданы следующим образом: время повторения импульса -250 мс; время задержки эхо-импульса, 7,5 мс; угол наклона вектора - 30° и 2 средних значения. Область поражения и число очагов поражения подсчитываются двумя экспертами в слепом режиме при помощи программного обеспечения IMAGEJ и OSIRIX. Конкретно каждому эксперту предоставляют все доступные МРТ, которые помечают в случайном порядке. Каждый эксперт далее использует программное обеспечение для охвата всех «очагов поражения» любого размера в каждом среде каждого МРТ для всех мышей. Смежные очаги поражения рассматривают как один большой очаг поражения.

Результаты, полученные от обоих экспертов, предоставляют в форме таблиц. 3D-реконструкции были составлены при помощи программного обеспечения OSIRIX экспертом в слепом режиме. У мышей, получающих пищу, обогащенную темполом или холекальциферолом, наблюдалось приблизительно вдвое меньше очагов поражения по сравнению с теми, которую получали стандартную пищу. ФИГ. 1В отображает нормализованное число очагов поражения ССМ, обнаруженных при помощи МРТ у Ccm2 ecKO мышей. Термин «VD3-обогащенный», как применяют в данной заявке и более конкретно в ФИГ. 1В и 1С, относится к пище, обогащенной витамином D3 или холекальциферолом. При сравнении числа очагов поражения на основании поперечных сечений, как подсчитано при помощи МРТ, оказалось, что обе схемы лечения значительно уменьшают очаги поражения среди очагов поражения всех размеров, и имеется выраженная тенденция к уменьшению всех размеров очагов поражения. ФИГ. 1С представляет собой диаграмму, отображающую число очагов поражений различных размеров, обнаруженных при помощи МРТ у Ccm2 ecKO мышей. Влияние нутритивной поддержки в виде темпола и холекальциферола стало очевидным в точки зрения качества при сравнении трехмерных реконструкций головного мозга мышей на основе МРТ. ФИГ. 1D иллюстрирует трехмерные реконструкции головного мозга (серый /кремовый цвет) и очаги поражения (красный цвет) для типичного головного мозга каждой из описанных выше групп лечения, где продемонстрирован головной мозг мыши со средним числом очагов поражения для каждой из групп лечения (самый верхний головной мозг - для контрольной группы; центральный головной мозг - для группы применения холекальциферола; и нижний головной мозг - для группы применения темпола). Диаграмма в ФИГ. 1В и 1С отображает ± стандартную ошибку среднего значения (SEM). * указывает на P<0,05, ** указывает на P<0,01, *** указывает на P<0,001 и **** указывает на P<0,0001.

Пример 2 - Анализ сроков влияния холекальциферола на эндотелий

Сроки влияния холекальциферола на эндотелий оценивают при помощи оценки влияния нокдауна гена ССМ2 и последующего лечения холекальциферолом, на панели сигнальных путей, ассоциированных с нестабильностью эндотелия. Оцененные сигнальные пути включают: фактор-6-АДФ-рибозилирования (ARF6), контрольный белок клеточного цикла-гомолог 42 (CDC42), трансформирующий белок RhoA (RHOA), фосфорилирование легкой цепи миозина (pMLC), Ras-подобный субстрат 1 ботулотоксина С3 (RAC1) и Ras-подобный белок R-Ras (RRAS) (см. MT с соавт., Circ Res 98, 73-80 (2006); Broman MT с соавт., Trends Cardiovasc Med 17, 151-156 (2007); Eliceiri BP с соавт., Mol Cell 4, 915-924 (1999); Sawada J с соавт., Cancer Cell 22, 235-249 (2012); Weis S с соавт., J Cell Biol 167, 223-229 (2004); Wojciak-Stothard B с соавт., Vascul Pharmacol 39, 187-199 (2002); и Zhu W с соавт., Nature 492, 252-255 (2012)).

HMVEC-D (клетки микрососудистого эндотелия человека) дикого типа, обработанные siCTRL или siCCM2, инкубируют либо с 100 нмоль, либо с 10 мкмоль холекальциферола (TOCRIS BIOSCIENCE), 7-DHD (7-дегидрохолестерина) (SIGMA-ALDRICH) или контрольным раствором (0,5% диметилфульфоксид, DMSO) в течение 60 минут (pMLC, ARF6, RAC, CDC42, RRAS) или 24 часов (RHOA), если не указано иное. После обработки клетки промывают при помощи ледяного фосфатно-солевого буферного раствора и лизируют в 50 ммоль Трис с рН 7,4, 150 ммоль NaCl, 10 ммоль MgCl₂, 10% глицерине, 1% NP-40, 1Х ингибиторами протеазы и 1Х ингибиторами фосфатазы.

Для реакции связывания RhoA, ARF6, Rac1/cdc42 и R-Ras получают неочищенный лизат цельных клеток, и GTP-RhoA, ARF6, Rac1/cdc42 и R-Ras преципитируют с Rhotekin-RBD (EMD MILLIPORE), GGA3-PBD (CELL BIOLABS), PAK-1-PBD (EMD MILLIPORE) и Raf-1 RBD, соответственно. После последующих трех смывов при помощи лизирующего буфера связанные белки элюируют при помощи 2Х буфера для образца. RhoA, ARF6, Rac1/cdc42 и R-Ras определяют при помощи вестерн-блоттинга с антителами (RhoA, Rac1 и R-Ras антитела получены от CELL SIGNALING TECHNOLOGY; ARF6 и cad42 получены от EMD MILLIPORE).

Обработка монослоев при помощи холекальциферола ингибирует индуцированную ССМ2 нокдауном ССМ2 активацию ARF6, RHOA и pMLC (см. ФИГ. 2A-2C). Оказалось, что нокдаун ССМ2 не оказывает влияние на активацию CDC42, RAC1 или RRAS; также обработка вплоть до 10 мкмоль холекальциферола не ингибирует базово активацию данных маркеров (см. ФИГ. 3А-3С). Благодаря важной роли ARF6 в качестве основного модулятора проницаемости эндотелия, сроки влияния холекальциферола на активацию ARF6 исследуют дополнительно, и обнаружили, что ингибирование активации ARF6 развивается в течение 5 минут (см. ФИГ. 4А и 4В). ФИГ. 2А-2С, 4А и 4В отображают средней значение ± SEM для трех или более независимых экспериментов. *указывает на P<0,05, ** указывает на P<0,01, *** указывает на P<0,001. На основании ФИГ. 3A-3С все столбцы представляют среднее значение ± SEM.

Будучи рассмотренными вместе, данные, как описано выше, предполагают, что холекальциферол, при применении даже в физиологических дозах, может быстро и напрямую ингибировать множественные ключи внутриклеточных сигнальных путей, которые принимают участие в активации эндотелия и обеспечении стабильности в контексте дестабилизации, вызванной мутацией.

Специалистам в данной области техники будет очевидно, что многие изменения можно внести в детали описанных выше вариантов осуществления, не отходя от лежащих в их основе принципов изобретения.

1. Способ снижения числа, скорости роста или обоих показателей очагов поражения церебральной кавернозной мальформации (ССМ) у пациентов, имеющих или находящихся в группе риска развития по меньшей мере одного очага поражения ССМ, где способ включает введение терапевтически эффективного количества темпола, холекальциферола, кальцидиола или кальцитриола или темпо или 4-аминотемпо, фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ или комбинаций вышеперечисленных веществ.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий определение числа, размера или обоих показателей очагов поражения ССМ.

3. Способ по п. 2, дополнительно включающий определение числа и размера для очагов поражения ССМ до введения препаратов.

4. Способ по п. 2 или 3, дополнительно включающий определение числа и размера очагов поражения для ССМ после введения препаратов.

5. Способ по любому из пп. 2-4, где магнитно-резонансную томографию (МРТ) применяют для определения числа, размера или обоих показателей для очагов поражения ССМ.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где у пациента имеется один очаг поражения ССМ.

7. Способ по любому из пп. 1-5, где у пациента имеется два или более очагов поражения ССМ.

8. Способ по любому из пп. 1-5 или 6-7, дополнительно включающий определение пациента, имеющего или находящегося в группе риска развития по меньшей мере одного очага поражения ССМ.

9. Способ по п. 8, где определение пациента, имеющего или находящегося в группе риска развития по меньшей мере одного очага поражения ССМ, включает определение мутации по меньшей мере в одном гене, ассоциированном с ССМ у пациента.

10. Способ по п. 9, где по меньшей мере один ген, ассоциированный с ССМ, выбирают из по меньшей мере CCM2, KRIT1 или PDCD10.

11. Способ по п. 9, где мутация включает гетерозиготную гаметную мутацию в гене ССМ2 у пациента.

12. Способ по любому из пп. 1-5 или 6-11, дополнительно включающий введение терапевтически эффективного количества алоина, хлористоводородного апоморфина, димеркапрола, гедунина и пиндолола; или фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ.

13. Способ по любому из пп. 1-5 или 6-12, где пациент представляет собой человека.

14. Способ профилактики или лечения признаков или симптомов церебральной кавернозной мальформации (ССМ) у пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения, где способ включает введение терапевтически эффективного количества темпола, холекальциферола, кальцидиола или кальцитриола или темпо или 4-аминотемпо, фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ или комбинаций вышеперечисленных веществ.

15. Способ по п. 14, где признак или симптом ССМ выбирают по меньшей мере из внутримозгового кровоизлияния, повышенной проницаемости сосудистой системы головного мозга, эпилепсии или очаговой неврологической симптоматики.

16. Способ по п. 14 или 15, дополнительно включающий определение пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения ССМ, у которого имелось внутримозговое кровоизлияние в пределах предопределенного периода времени по меньшей мере приблизительно один год или по меньшей мере приблизительно два года до начала введения препарата.

17. Способ по любому из пп. 14-16, дополнительно включающий определение числа, размера или обоих параметров очагов поражения ССМ.

18. Способ по п. 17, дополнительно включающий определение числа и размера очагов поражения ССМ перед введением препарата.

19. Способ по п. 17 или 18, дополнительно включающий определение числа и размера очагов поражения ССМ после введения препарата.

20. Способ по любому из пп. 17-19, где магнитно-резонансную томографию (МРТ) применяют для определения числа, размера или обоих параметров для очагов поражения ССМ.

21. Способ по любому из пп. 14-20, где у пациента имеется один очаг поражения ССМ.

22. Способ по любому из пп. 14-20, где у пациента имеются два или более очагов поражения ССМ.

23. Способ по любому из пп. 14-22, дополнительно включающий определение пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения ССМ.

24. Способ по п. 23, где определение пациента, имеющего по меньшей мере один очаг поражения ССМ, включает определение мутации по меньшей мере в одном гене, ассоциированном с ССМ у пациента.

25. Способ по п. 24, где по меньшей мере один ген, ассоциированный с ССМ, выбирают по меньшей мере из CCM2, KRIT1 или PDCD10.

26. Способ по п. 24, где мутация включает гетерозиготную гаметную мутацию в гене ССМ2 у пациента.

27. Способ по любому из пп. 14-26, дополнительно включающий введение терапевтически эффективного количества алоина, гидрохлорида апоморфина, димеркапрола, гедунина или пиндолола; или фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ.

28. Способ по любому из пп. 14-27, где пациент представляет собой человека.

29. Способ снижения цереброваскулярного воспаления, снижения цереброваскулярной проницаемости или и того и другого у пациента, имеющего или находящегося в группе риска развития очагов поражения церебральной кавернозной мальформации (ССМ), где способ включает введение терапевтически эффективного количества темпола, холекальциферола, кальцидиола или кальцитриола, темпо или 4-аминотемпо, фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ или комбинаций вышеперечисленных веществ.

30. Способ по п. 29, дополнительно включающий определение числа, размера или обоих параметров очагов поражения ССМ.

31. Способ по п. 30, дополнительно включающий определение числа и размера очагов поражения ССМ до введения препарата.

32. Способ по п. 30 или 31, дополнительно включающий определение числа и размера очагов поражения ССМ после введения препарата.

33. Способ по любому из пп. 31-32, где магнитно-резонансную томографию (МРТ) применяют для определения числа, размера или обоих параметров очагов поражения ССМ.

34. Способ по любому из пп. 29-33, где пациента имеет один очаг поражения ССМ.

35. Способ по любому из пп. 29-33, где пациента имеет два или более очагов поражения ССМ.

36. Способ по любому из пп. 29-34, дополнительно включающий определение пациента, имеющего или находящегося в группе риска развития по меньшей мере одного очага поражения ССМ.

37. Способ по п. 36, где определение пациента, имеющего или находящегося в группе риска развития по меньшей мере одного очага поражения ССМ, включает определение мутации по меньшей мере в одном гене, ассоциированном с ССМ у пациента.

38. Способ по п. 37, где по меньшей мере один ген, ассоциированный с ССМ, выбирают по меньшей мере из CCM2, KRIT1 или PDCD10.

39. Способ по п. 37, где мутация включает гетерозиготную гаметную мутацию в ССМ2 гене у пациента.

40. Способ по любому из пп. 29-39, дополнительно включающий введение терапевтически эффективного количества алоина, гидрохлорида апоморфина, димеркапрола, гедунина или пиндолола; производного вышеперечисленных веществ или фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ.

41. Способ по любому из пп. 29-40, где пациент представляет собой человека.

42. Способ улучшения цереброваскулярного состояния у пациента, имеющего или находящегося в группе риска развития очага поражения церебральной кавернозной мальформации (ССМ), где способ включает введение терапевтически эффективного количества темпола, холекальциферола, кальцидиола или кальцитриола или 4-аминотемпо, фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ или комбинаций вышеперечисленных веществ.

43. Способ лечения наследственной геморрагической телеангиэктазии у пациента при необходимости в таковом, где способ включает введение терапевтически эффективного количества темпола, холекальциферола, кальцидиола или кальцитриола или 4-аминотемпо, фармацевтически приемлемой соли вышеперечисленных веществ или комбинаций вышеперечисленных веществ.