Моющие композиции

Группа изобретений относится к биотехнологии. Моющая композиция содержит, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество, по меньшей мере, систему поверхностно-активных веществ, по меньшей мере, одно мыло или любые их смеси и вариант исходной липазы. При этом вариант обладает липазной активностью, его последовательность по меньшей мере на 90%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO: 2, и он содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и, по меньшей мере, одной или нескольким из D96E, и G38A в SEQ ID NO:2. Способ получения моющей композиции включает добавление варианта исходной липазы к композиции, содержащей, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество, по меньшей мере, систему поверхностно-активных веществ, по меньшей мере, одно мыло или любые их смеси. При этом вариант обладает липазной активностью, его последовательность по меньшей мере на 90%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO:2 и он содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и, по меньшей мере, одной или нескольким (из D96E и G38A в SEQ ID NO: 2). Способ очищения объекта включает приведение жирного пятна, присутствующего на объекте, подлежащем очищению, в контакт с указанной композицией. Применение указанной композиции в гидролизе сложного эфира карбоновой кислоты, синтезе или переэтерификации сложного эфира, а также для получения стабильного состава моющего средства. Группа изобретений обеспечивает повышенную стабильность липазы при хранении. 6 н. и 6 з.п. ф-лы, 65 табл., 13 пр.

 

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, который включен в данный документ посредством ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим варианты липаз, способам получения и применения указанных композиций, вариантов липаз, полинуклеотидов, кодирующих данные варианты, а также способам получения и применения указанных вариант.

Описание уровня техники

Липазы представляют собой важные биокатализаторы, которые, как было показано, являются пригодными для различных способов применения, и было найдено большое количество различных липаз, и многие из них нашли промышленное применение. Однако необходимы новые липазы, пригодные для применения в различных композициях, приспособленные к применяемым в настоящее время условиям.

Липазы использовали в композициях для удаления жирных пятен путем гидролизования триглицеридов с образованием жирных кислот. Современные моющие, очищающие композиции и/или композиции для ухода за тканью содержат множество активных ингредиентов, которые препятствуют способности липаз удалять жирные пятна, кроме того, такие композиции не применяют сразу после получения, и в результате стабильность липаз может быть нарушена во время хранения. Таким образом, существует потребность в липазах, которые являются активными и стабильными в жестких условиях моющих композиций.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к моющим композициям, содержащим вариант исходной липазы, при этом вариант обладает липазной активностью, его последовательность по меньшей мере на 60%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO: 2, и содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и по меньшей мере одной или нескольким (например, некоторому количеству) из D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T и G38A в SEQ ID NO: 2. Настоящее изобретение также относится к применению композиций, способам получения композиций и способам очищения.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к вариантам и полинуклеотидам, кодирующим данные варианты; конструкциям нуклеиновых кислот, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Липаза. Выражения "липаза", "фермент липаза", "липолитический фермент", "эстераза липидов", "липолитический полипептид" и "липолитический белок" относятся к ферменту класса EC3.1.1, как определено Номенклатурой Ферментов. Он может характеризоваться липазной активностью (триацилглицеринлипазы, EC3.1.1.3), активностью кутиназы (EC3.1.1.74), активностью стеринэстеразы (EC3.1.1.13) и/или активностью гидролазы воска-сложных эфиров (EC3.1.1.50). В контексте настоящего изобретения липазную активность определяют в соответствии с процедурой, описанной в примерах. В одном аспекте варианты по настоящему изобретению обладают по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% липазной активности полипептида SEQ ID NO: 2.

Аллельный вариант. Выражение "аллельный вариант" означает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельное разнообразие возникает в естественных условиях вследствие мутации и может приводить в результате к полиморфизму в пределах популяций. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.

кДНК. Выражение "кДНК" означает молекулу ДНК, которую можно получить посредством обратной транскрипции из зрелой сплайсированной молекулы мРНК, полученной из эукариотической или прокариотической клетки. В кДНК отсутствуют последовательности интронов, которые могут присутствовать в соответствующей геномной ДНК. Исходный, первичный РНК-транскрипт является предшественником мРНК, который подвергается процессингу в ходе ряда стадий, в том числе сплайсинга, до того, как станет зрелой сплайсированной мРНК.

Кодирующая последовательность. Выражение "кодирующая последовательность" означает полинуклеотид, который прямо определяет аминокислотную последовательность варианта. Границы кодирующей последовательности обычно определяются открытой рамкой считывания, которая начинается со стартового кодона, такого как ATG, GTG или TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как TAA, TAG или TGA. Кодирующая последовательность может представлять собой геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК или их сочетание.

Управляющие последовательности. Выражение "управляющие последовательности" означает последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему изобретению. Каждая управляющая последовательность может быть нативной (т.е. из того же гена) или чужеродной (т.е. из другого гена) относительно полинуклеотида, кодирующего вариант, или нативной или чужеродной относительно другой таковой. Такие управляющие последовательности включают, без ограничения, лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, последовательность пропептида, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Как минимум, управляющие последовательности включают в себя промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. В управляющих последовательностях могут быть предусмотрены линкеры с целью введения специфических сайтов рестрикции, способствующих лигированию управляющих последовательностей с кодирующим участком полинуклеотида, кодирующего вариант.

Экспрессия. Выражение "экспрессия" включает любой этап, задействованный в продуцировании варианта, в том числе без ограничения транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Вектор экспрессии. Выражение "вектор экспрессии" означает линейную или кольцевую молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотид, кодирующий вариант, и функционально связана с управляющими последовательностями, которые обеспечивают ее экспрессию.

Фрагмент. Выражение "фрагмент" означает полипептид, у которого отсутствуют одна или несколько (например, некоторое количество) аминокислот с амино и/или карбоксильного конца полипептида; причем фрагмент обладает липазной активностью. В одном аспекте фрагмент содержит по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%, но менее 100% из числа аминокислот 1-369 SEQ ID NO: 2.

Условия высокой жесткости. Выражение "условия высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 50% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 65°C.

Клетка-хозяин. Выражение "клетка-хозяин" означает любой тип клеток, который является восприимчивым к трансформации, трансфекции, трансдукции или подобным процедурам с помощью конструкции нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии, содержащих полинуклеотид по настоящему изобретению. Выражение "клетка-хозяин" охватывает любого потомка родительской клетки, который не является идентичным родительской клетке вследствие мутаций, происходящих в ходе репликации.

Улучшенное свойство. Выражение "улучшенное свойство" означает характеристику, связанную с вариантом, которая является улучшенной в сравнении с исходной липазой. Такие улучшенные свойства включают без ограничения стабильность моющего средства, стабильность в моющем средстве в присутствии протеазы, стабильностью к действию протеаз, химическую стабильность, стабильность к окислению, pH-стабильность, стабильность в условиях хранения и термостабильность.

Выделенный. Выражение "выделенный" означает вещество в форме или в окружении, которые не встречаются в естественных условиях. Неограничивающие примеры выделенных веществ включают в себя (1) любое не встречающееся в естественных условиях вещество, (2) любое вещество, в том числе без ограничения любой фермент, вариант, нуклеиновую кислоту, белок, пептид или кофактор, которые по меньшей мере частично отделены от одной, или нескольких, или всех встречающихся в естественных условиях составляющих, с которыми они связаны в естественных условиях; (3) любое вещество, модифицированное человеком, по сравнению с таким веществом, встречающимся в природе; или (4) любое вещество, модифицированное путем увеличения количества вещества по сравнению с другими компонентами, с которыми оно связано в естественных условиях (например, несколько копий гена, кодирующего вещество; применение более сильного промотора, чем промотор, связанный в естественных условиях с геном, кодирующим вещество). Выделенное вещество может присутствовать в образце ферментативного бульона.

Условия низкой жесткости. Выражение "условия низкой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 25% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 50°C.

Зрелый полипептид. Выражение "зрелый полипептид" означает полипептид в его конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как процессинг N-концевой части, усечение C-концевой части, гликозилирование, фосфорилирование и т. д. В одном аспекте зрелый полипептид образован аминокислотами 1-269 SEQ ID NO: 2. В данной области техники известно, что клетка-хозяин может продуцировать смесь двух или более различных зрелых полипептидов (т. е. с различными C-концевыми и/или N-концевыми аминокислотами), экспрессируемых одним и тем же полинуклеотидом.

Последовательность, кодирующая зрелый полипептид. Выражение "последовательность, кодирующая зрелый полипептид" означает полинуклеотид, который кодирует зрелый полипептид, обладающий липазной активностью. В одном аспекте последовательность, кодирующая зрелый полипептид, образована нуклеотидами 1-807 SEQ ID NO: 1.

Условия умеренной жесткости. Выражение "условия умеренной жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 55°C.

Условия умеренно высокой жесткости. Выражение "условия умеренно высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 60°C.

Мутант. Выражение "мутант" означает полинуклеотид, кодирующий вариант.

Конструкция нуклеиновой кислоты. Выражение "конструкция нуклеиновой кислоты" означает одно- или двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, выделенную из встречающегося в естественных условиях гена, или модифицированную с тем, чтобы она содержала сегменты нуклеиновых кислот в таком порядке, который в иных случаях не может существовать в естественных условиях, или являющуюся синтетической, которая содержит одну или несколько управляющих последовательностей.

Функционально связанный. Выражение "функционально связанный" означает конфигурацию, в которой управляющая последовательность размещена в соответствующем положении относительно кодирующей последовательности полинуклеотида так, что управляющая последовательность управляет экспрессией кодирующей последовательности.

Исходная форма или исходная липаза. Выражение "исходная форма" или "исходная липаза" означает липазу, которая может быть изменена для получения вариантов фермента по настоящему изобретению. Исходная липаза может представлять собой встречающийся в естественных условиях полипептид (дикого типа) или его вариант или фрагмент.

Идентичность последовательностей. Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром "идентичность последовательностей".

В контексте настоящего изобретения идентичность последовательностей у двух аминокислотных последовательностей определяют с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продолжение гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS). Выводимые данные в Needle, помеченные как "наиболее длинный идентичный участок" (полученные с применением опции – nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные остатки x 100)/(длина выравниваемого участка – общее число гэпов в выравниваемом участке).

В контексте настоящего изобретения идентичность последовательностей для двух последовательностей дезоксирибонуклеотидов определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), который реализован в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EDNAFULL (версия NCBI NUC4.4 для EMBOSS). Выводимые данные в Needle, помеченные как "наиболее длинный идентичный участок" (полученные с применением опции – nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные дезоксирибонуклеотиды x 100)/(длина выравниваемого участка – общее число гэпов в выравниваемом участке).

Стабильность. Стабильность липазы может быть выражена как остаточная активность или остаточная эффективность указанной липазы в течение или после воздействия различных условий испытания, как например, хранение в моющей композиции при различных температурах, при различных pH, в присутствии разных компонентов, таких как протеаза, химические вещества и/или окислительные вещества (измененные условия). Стабильность варианта липазы можно измерить относительно известной активности или эффективности исходной липазы или, в качестве альтернативы, относительно известной активности или эффективности варианта липазы, если его изначально добавляли в моющую композицию, необязательно хранящуюся охлажденной или замороженной, или относительно варианта липазы, хранящегося охлажденным или замороженным (неизмененные условия).

Подпоследовательность. Выражение "подпоследовательность" означает полинуклеотид, у которого отсутствуют один или несколько (например, некоторое количество) нуклеотидов с 5' и/или 3' конца кодирующей последовательности зрелого полипептида; причем подпоследовательность кодирует фрагмент, обладающий липазной активностью. В одном аспекте подпоследовательность содержит по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%, но менее 100% из числа нуклеотидов 1-807 SEQ ID NO: 1.

Вариант. Выражение "вариант" означает полипептид, обладающий липазной активностью, содержащий изменение, т. е. замену, вставку и/или делецию в одном или нескольких (например, некотором количестве) положениях. Замена означает замещение аминокислоты, занимающей определенное положение, другой аминокислотой; делеция означает удаление аминокислоты, занимающей определенное положение; а вставка означает добавление аминокислоты рядом с и непосредственно после аминокислоты, занимающей определенное положение. Варианты по настоящему изобретению обладают по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% липазной активности полипептида SEQ ID NO: 2.

Условия очень высокой жесткости. Выражение "условия очень высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 50% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 70°C.

Условия очень низкой жесткости. Выражение "условия очень низкой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 25% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 45°C.

Липаза дикого типа. Выражение липаза “дикого типа” означает липазу, экспрессируемую встречающимся в естественных условиях микроорганизмом, таким как бактерия, дрожжи или нитчатый гриб, обнаруживаемые в природе.

Условные обозначения для указания вариантов

В контексте настоящего изобретения полипептид, раскрытый в SEQ ID NO: 2, применяется для определения соответствующего аминокислотного остатка в другой липазе. Аминокислотную последовательность другой липазы выравнивают с SEQ ID NO: 2, и на основании выравнивания номер положения аминокислоты, соответствующий любому аминокислотному остатку в полипептиде, раскрытом в SEQ ID NO: 2, определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продолжение гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS).

Идентификацию соответствующего аминокислотного остатка в другой липазе можно определить путем выравнивания последовательностей нескольких полипептидов с использованием нескольких компьютерных программ, в том числе без ограничения MUSCLE (сравнение нескольких последовательностей по log-ожиданию; версия 3.5 или более поздняя; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (версия 6.857 или более поздняя; Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) и EMBOSS EMMA, в которой применяется ClustalW (1.83 или более поздняя; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), с применением их соответствующих параметров по умолчанию.

Если другой фермент отличается от полипептида SEQ ID NO: 2, так что с помощью традиционного сравнения на основании последовательностей невозможно обнаружить их родство (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), можно применять другие алгоритмы попарного сравнения последовательностей. Большей чувствительности поиска на основании последовательности можно достичь с применением программ поиска, которые применяют вероятностные представления семейств полипептидов (профилей) для поиска по базам данных. Например, программа PSI-BLAST создает профили посредством итеративного процесса поиска по базам данных и способна обнаруживать отдаленные гомологи (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Еще большей чувствительности можно достичь, если семейство или суперсемейство для данного полипептида имеет одного или несколько представителей в базах данных структуры белков. Программы, такие как GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881), используют информацию из ряда источников (PSI-BLAST, данные прогнозирования вторичной структуры, профили структурного выравнивания и потенциалы сольватации) в качестве данных, вводимых в нейронную сеть, с помощью которой предсказывают структурную укладку запрашиваемой последовательности. Аналогично, способ по Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, можно применять для выравнивания последовательности с неизвестной структурой с моделями суперсемейств, присутствующими в базе данных SCOP. Эти выравнивая можно, в свою очередь, применять для создания моделей гомологии для полипептида, и точность таких моделей можно оценивать с помощью ряда инструментов, разработанных для этой цели.

Для белков с известной структурой доступны несколько инструментов и ресурсы для отыскания и создания структурных выравниваний. Например, суперсемейства белков в SCOP были выравнены по структуре, и результаты этих выравниваний находятся в открытом доступе, а также доступны для загрузки. Структуры двух или более белков можно выравнять с применением ряда алгоритмов, таких как выравнивание на основе матрицы расстояний (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) или комбинаторного удлинения (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), и выполнение этих алгоритмов можно дополнительно применять для составления запросов по представляющей интерес структуре в базах данных структуры с целью нахождения возможных структурных гомологов (например, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

При описании вариантов по настоящему изобретению описанная ниже номенклатура адаптирована для простоты упоминания. Используется принятое IUPAC однобуквенное или трехбуквенное сокращение для аминокислот.

Замены. В отношении аминокислотной замены применяется следующая номенклатура: исходная аминокислота, положение, заменяющая аминокислота. Соответственно, замена треонина в положении 226 на аланин обозначается как "Thr226Ala" или "T226A". Несколько мутаций разделяют знаками сложения ("+"), например, "Gly205Arg + Ser411Phe" или "G205R + S411F" представляют замены в положениях 205 и 411 глицина (G) на аргинин (R) и серина (S) на фенилаланин (F), соответственно.

Делеции. В отношении делеции аминокислоты применяется следующая номенклатура: исходная аминокислота, положение, *. Соответственно, делеция глицина в положении 195 обозначается как "Gly195*" или "G195*". Несколько делеций разделяют знаками сложения ("+"), например, "Gly195* + Ser411*" или "G195* + S411*".

Вставки. В отношении вставки аминокислоты применяется следующая номенклатура: исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота. Соответственно, вставка лизина после глицина в положении 195 обозначается "Gly195GlyLys" или "G195GK". Вставку нескольких аминокислот обозначают [исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота № 1, вставленная аминокислота № 2 и т. д]. Например, вставка лизина и аланина после глицина в положении 195 обозначается как "Gly195GlyLysAla" или "G195GKA".

В таких случаях вставленный(ые) аминокислотный(ые) остаток(и) нумеруют путем добавления строчных букв к номеру положения аминокислотного остатка, предшествующего вставленному(ым) аминокислотному(ым) остатку(ам). Следовательно, в вышеуказанном примере последовательность будет иметь следующий вид.

Исходная форма:	Вариант:
195	195 195a 195b
G	G - K - A

Множественные изменения. Варианты, содержащие множественные изменения, разделяют знаками сложения ("+"), например, "Arg170Tyr+Gly195Glu" или "R170Y+G195E" представляют замену аргинина и глицина в положениях 170 и 195 на тирозин и глутаминовую кислоту, соответственно.

Разные изменения. Когда разные изменения могут вводиться в какое-либо положение, разные изменения разделяют запятой, например, "Arg170Tyr,Glu" представляет замену аргинина в положении 170 на тирозин или глутаминовую кислоту. Следовательно, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" обозначает следующие варианты:

"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" и "Tyr167Ala+Arg170Ala".

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим варианты липаз, причем вариант содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и по меньшей мере одной или нескольким (например, некоторому количеству) в полипептиде SEQ ID NO: 2, причем вариант обладает липазной активностью.

Варианты

Настоящее изобретение предусматривает варианты липаз, содержащие замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и по меньшей мере одной или нескольким (например, некоторому количеству) из D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T и G38A в SEQ ID NO: 2, причем вариант обладает липазной активностью. В некоторых аспектах варианты дополнительно содержат замены в положениях, соответствующих D27R и/или N33Q в SEQ ID NO: 2.

В одном аспекте последовательность варианта по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, но менее чем на 100% идентична аминокислотной последовательности исходной липазы. В другом аспекте вариант по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, например, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, но менее чем на 100% идентичен последовательности SEQ ID NO: 2.

В одном аспекте число замен в вариантах по настоящему изобретению составляет 1-40, например, 1-30, 1-20, 1-10 и 1-5, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 замен.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и по меньшей мере одной или нескольким (например, некоторому количеству) из D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T и G38A в SEQ ID NO: 2. В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R, и в двух положениях, соответствующих любому из положений D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R и N33Q в SEQ ID NO: 2. В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R, и в трех положениях, соответствующих любому из положений D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R и N33Q в SEQ ID NO: 2. В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R, и в четырех положениях, соответствующих любому из положений D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R и N33Q в SEQ ID NO: 2. В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R, и в пяти положениях, соответствующих любому из положений D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R и N33Q в SEQ ID NO: 2. В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R, и в шести положениях, соответствующих любому из положений D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R и N33Q в SEQ ID NO: 2. В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R, и в семи положениях, соответствующих любому из положений D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R и N33Q в SEQ ID NO: 2. В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R, и в восьми положениях, соответствующих любому из положений D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R и N33Q в SEQ ID NO: 2. В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R, и в девяти положениях, соответствующих любому из положений D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R и N33Q в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и положению 96. В другом аспекте аминокислота в положении, соответствующем положению 96, заменена на Glu, Gly, Ser или Val, предпочтительно на Glu. В другом аспекте вариант содержит или включает замену D96E в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и положению 111. В другом аспекте аминокислота в положении, соответствующем положению 111, заменена на Ala, Gly, Ile, Leu, Met или Val, предпочтительно Ala. В другом аспекте вариант содержит или включает замену D111A в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и положению 254. В другом аспекте аминокислота в положении, соответствующем положению 254, заменена на Ser или Thr, предпочтительно на Ser. В другом аспекте вариант содержит или включает замену D254S в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и положению 163. В другом аспекте аминокислота в положении, соответствующем положению 163, заменена на Asp, Glu, His или Lys. В другом аспекте вариант содержит или включает замену G163K в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и положению 256. В другом аспекте аминокислота в положении, соответствующем положению 256, заменена на Lys, Ser или Thr, предпочтительно на Thr. В другом аспекте вариант содержит или включает замену P256T в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и положению 91. В другом аспекте аминокислота в положении, соответствующем положению 91, заменена на Ala, Asn, Gln, Glu, Ile, Leu, Ser, Thr, Trp или Val, предпочтительно на Thr. В другом аспекте вариант содержит или включает замену G91T в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и положению 38. В другом аспекте аминокислота в положении, соответствующем положению 38, заменена на Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu, Met или Val, предпочтительно на Ala. В другом аспекте вариант содержит или включает замену G38A в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и положению 27. В другом аспекте аминокислота в положении, соответствующем положению 27, заменена на Arg, His или Lys, предпочтительно на Arg. В другом аспекте вариант содержит или включает замену D27R в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и положению 33. В другом аспекте аминокислота в положении, соответствующем положению 33, заменена на Gln, Lys, Ser или Thr, предпочтительно на Gln. В другом аспекте вариант содержит или включает замену N33Q в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из 27+33; 27+38; 27+91; 27+96; 27+111; 27+163; 27+254; 27+256; 33+38; 33+91; 33+96; 33+111; 33+163; 33+254; 33+256; 38+91; 38+96; 38+111; 38+163; 38+254; 38+256; 91+96; 91+111; 91+163; 91+254; 91+256; 96+111; 96+163; 96+254; 96+256; 111+163; 111+254; 111+256; 163+254; 163+256 или 254+256, таких как описанные выше.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из 27+33+38; 27+33+91; 27+33+96; 27+33+111; 27+33+163; 27+33+254; 27+33+256; 27+38+91; 27+38+96; 27+38+111; 27+38+163; 27+38+254; 27+38+256; 27+91+96; 27+91+111; 27+91+163; 27+91+254; 27+91+256; 27+96+111; 27+96+163; 27+96+254; 27+96+256; 27+111+163; 27+111+254; 27+111+256; 27+163+254; 27+163+256; 27+254+256; 33+38+91; 33+38+96; 33+38+111; 33+38+163; 33+38+254; 33+38+256; 33+91+96; 33+91+111; 33+91+163; 33+91+254; 33+91+256; 33+96+111; 33+96+163; 33+96+254; 33+96+256; 33+111+163; 33+111+254; 33+111+256; 33+163+254; 33+163+256; 33+254+256; 38+91+96; 38+91+111; 38+91+163; 38+91+254; 38+91+256; 38+96+111; 38+96+163; 38+96+254; 38+96+256; 38+111+163; 38+111+254; 38+111+256; 38+163+254; 38+163+256; 38+254+256; 91+96+111; 91+96+163; 91+96+254; 91+96+256; 91+111+163; 91+111+254; 91+111+256; 91+163+254; 91+163+256; 91+254+256; 96+111+163; 96+111+254; 96+111+256; 96+163+254; 96+163+256; 96+254+256; 111+163+254; 111+163+256; 111+254+256; или 163+254+256, таких как описанные выше.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из 27+33+38+91; 27+33+38+96; 27+33+38+111; 27+33+38+163; 27+33+38+254; 27+33+38+256; 27+33+91+96; 27+33+91+111; 27+33+91+163; 27+33+91+254; 27+33+91+256; 27+33+96+111; 27+33+96+163; 27+33+96+254; 27+33+96+256; 27+33+111+163; 27+33+111+254; 27+33+111+256; 27+33+163+254; 27+33+163+256; 27+33+254+256; 27+38+91+96; 27+38+91+111; 27+38+91+163; 27+38+91+254; 27+38+91+256; 27+38+96+111; 27+38+96+163; 27+38+96+254; 27+38+96+256; 27+38+111+163; 27+38+111+254; 27+38+111+256; 27+38+163+254; 27+38+163+256; 27+38+254+256; 27+91+96+111; 27+91+96+163; 27+91+96+254; 27+91+96+256; 27+91+111+163; 27+91+111+254; 27+91+111+256; 27+91+163+254; 27+91+163+256; 27+91+254+256; 27+96+111+163; 27+96+111+254; 27+96+111+256; 27+96+163+254; 27+96+163+256; 27+96+254+256; 27+111+163+254; 27+111+163+256; 27+111+254+256; 27+163+254+256; 33+38+91+96; 33+38+91+111; 33+38+91+163; 33+38+91+254; 33+38+91+256; 33+38+96+111; 33+38+96+163; 33+38+96+254; 33+38+96+256; 33+38+111+163; 33+38+111+254; 33+38+111+256; 33+38+163+254; 33+38+163+256; 33+38+254+256; 33+91+96+111; 33+91+96+163; 33+91+96+254; 33+91+96+256; 33+91+111+163; 33+91+111+254; 33+91+111+256; 33+91+163+254; 33+91+163+256; 33+91+254+256; 33+96+111+163; 33+96+111+254; 33+96+111+256; 33+96+163+254; 33+96+163+256; 33+96+254+256; 33+111+163+254; 33+111+163+256; 33+111+254+256; 33+163+254+256; 38+91+96+111; 38+91+96+163; 38+91+96+254; 38+91+96+256; 38+91+111+163; 38+91+111+254; 38+91+111+256; 38+91+163+254; 38+91+163+256; 38+91+254+256; 38+96+111+163; 38+96+111+254; 38+96+111+256; 38+96+163+254; 38+96+163+256; 38+96+254+256; 38+111+163+254; 38+111+163+256; 38+111+254+256; 38+163+254+256; 91+96+111+163; 91+96+111+254; 91+96+111+256; 91+96+163+254; 91+96+163+256; 91+96+254+256; 91+111+163+254; 91+111+163+256; 91+111+254+256; 91+163+254+256; 96+111+163+254; 96+111+163+256; 96+111+254+256; 96+163+254+256; или 111+163+254+256, таких как описанные выше.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из 27+33+38+91+96; 27+33+38+91+111; 27+33+38+91+163; 27+33+38+91+254; 27+33+38+91+256; 27+33+38+96+111; 27+33+38+96+163; 27+33+38+96+254; 27+33+38+96+256; 27+33+38+111+163; 27+33+38+111+254; 27+33+38+111+256; 27+33+38+163+254; 27+33+38+163+256; 27+33+38+254+256; 27+33+91+96+111; 27+33+91+96+163; 27+33+91+96+254; 27+33+91+96+256; 27+33+91+111+163; 27+33+91+111+254; 27+33+91+111+256; 27+33+91+163+254; 27+33+91+163+256; 27+33+91+254+256; 27+33+96+111+163; 27+33+96+111+254; 27+33+96+111+256; 27+33+96+163+254; 27+33+96+163+256; 27+33+96+254+256; 27+33+111+163+254; 27+33+111+163+256; 27+33+111+254+256; 27+33+163+254+256; 27+38+91+96+111; 27+38+91+96+163; 27+38+91+96+254; 27+38+91+96+256; 27+38+91+111+163; 27+38+91+111+254; 27+38+91+111+256; 27+38+91+163+254; 27+38+91+163+256; 27+38+91+254+256; 27+38+96+111+163; 27+38+96+111+254; 27+38+96+111+256; 27+38+96+163+254; 27+38+96+163+256; 27+38+96+254+256; 27+38+111+163+254; 27+38+111+163+256; 27+38+111+254+256; 27+38+163+254+256; 27+91+96+111+163; 27+91+96+111+254; 27+91+96+111+256; 27+91+96+163+254; 27+91+96+163+256; 27+91+96+254+256; 27+91+111+163+254; 27+91+111+163+256; 27+91+111+254+256; 27+91+163+254+256; 27+96+111+163+254; 27+96+111+163+256; 27+96+111+254+256; 27+96+163+254+256; 27+111+163+254+256; 33+38+91+96+111; 33+38+91+96+163; 33+38+91+96+254; 33+38+91+96+256; 33+38+91+111+163; 33+38+91+111+254; 33+38+91+111+256; 33+38+91+163+254; 33+38+91+163+256; 33+38+91+254+256; 33+38+96+111+163; 33+38+96+111+254; 33+38+96+111+256; 33+38+96+163+254; 33+38+96+163+256; 33+38+96+254+256; 33+38+111+163+254; 33+38+111+163+256; 33+38+111+254+256; 33+38+163+254+256; 33+91+96+111+163; 33+91+96+111+254; 33+91+96+111+256; 33+91+96+163+254; 33+91+96+163+256; 33+91+96+254+256; 33+91+111+163+254; 33+91+111+163+256; 33+91+111+254+256; 33+91+163+254+256; 33+96+111+163+254; 33+96+111+163+256; 33+96+111+254+256; 33+96+163+254+256; 33+111+163+254+256; 38+91+96+111+163; 38+91+96+111+254; 38+91+96+111+256; 38+91+96+163+254; 38+91+96+163+256; 38+91+96+254+256; 38+91+111+163+254; 38+91+111+163+256; 38+91+111+254+256; 38+91+163+254+256; 38+96+111+163+254; 38+96+111+163+256; 38+96+111+254+256; 38+96+163+254+256; 38+111+163+254+256; 91+96+111+163+254; 91+96+111+163+256; 91+96+111+254+256; 91+96+163+254+256; 91+111+163+254+256; или 96+111+163+254+256, таких как описанные выше.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из 27+33+38+91+96+111; 27+33+38+91+96+163; 27+33+38+91+96+254; 27+33+38+91+96+256; 27+33+38+91+111+163; 27+33+38+91+111+254; 27+33+38+91+111+256; 27+33+38+91+163+254; 27+33+38+91+163+256; 27+33+38+91+254+256; 27+33+38+96+111+163; 27+33+38+96+111+254; 27+33+38+96+111+256; 27+33+38+96+163+254; 27+33+38+96+163+256; 27+33+38+96+254+256; 27+33+38+111+163+254; 27+33+38+111+163+256; 27+33+38+111+254+256; 27+33+38+163+254+256; 27+33+91+96+111+163; 27+33+91+96+111+254; 27+33+91+96+111+256; 27+33+91+96+163+254; 27+33+91+96+163+256; 27+33+91+96+254+256; 27+33+91+111+163+254; 27+33+91+111+163+256; 27+33+91+111+254+256; 27+33+91+163+254+256; 27+33+96+111+163+254; 27+33+96+111+163+256; 27+33+96+111+254+256; 27+33+96+163+254+256; 27+33+111+163+254+256; 27+38+91+96+111+163; 27+38+91+96+111+254; 27+38+91+96+111+256; 27+38+91+96+163+254; 27+38+91+96+163+256; 27+38+91+96+254+256; 27+38+91+111+163+254; 27+38+91+111+163+256; 27+38+91+111+254+256; 27+38+91+163+254+256; 27+38+96+111+163+254; 27+38+96+111+163+256; 27+38+96+111+254+256; 27+38+96+163+254+256; 27+38+111+163+254+256; 27+91+96+111+163+254; 27+91+96+111+163+256; 27+91+96+111+254+256; 27+91+96+163+254+256; 27+91+111+163+254+256; 27+96+111+163+254+256; 33+38+91+96+111+163; 33+38+91+96+111+254; 33+38+91+96+111+256; 33+38+91+96+163+254; 33+38+91+96+163+256; 33+38+91+96+254+256; 33+38+91+111+163+254; 33+38+91+111+163+256; 33+38+91+111+254+256; 33+38+91+163+254+256; 33+38+96+111+163+254; 33+38+96+111+163+256; 33+38+96+111+254+256; 33+38+96+163+254+256; 33+38+111+163+254+256; 33+91+96+111+163+254; 33+91+96+111+163+256; 33+91+96+111+254+256; 33+91+96+163+254+256; 33+91+111+163+254+256; 33+96+111+163+254+256; 38+91+96+111+163+254; 38+91+96+111+163+256; 38+91+96+111+254+256; 38+91+96+163+254+256; 38+91+111+163+254+256; 38+96+111+163+254+256; или 91+96+111+163+254+256, таких как описанные выше.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из 27+33+38+91+96+111+163; 27+33+38+91+96+111+254; 27+33+38+91+96+111+256; 27+33+38+91+96+163+254; 27+33+38+91+96+163+256; 27+33+38+91+96+254+256; 27+33+38+91+111+163+254; 27+33+38+91+111+163+256; 27+33+38+91+111+254+256; 27+33+38+91+163+254+256; 27+33+38+96+111+163+254; 27+33+38+96+111+163+256; 27+33+38+96+111+254+256; 27+33+38+96+163+254+256; 27+33+38+111+163+254+256; 27+33+91+96+111+163+254; 27+33+91+96+111+163+256; 27+33+91+96+111+254+256; 27+33+91+96+163+254+256; 27+33+91+111+163+254+256; 27+33+96+111+163+254+256; 27+38+91+96+111+163+254; 27+38+91+96+111+163+256; 27+38+91+96+111+254+256; 27+38+91+96+163+254+256; 27+38+91+111+163+254+256; 27+38+96+111+163+254+256; 27+91+96+111+163+254+256; 33+38+91+96+111+163+254; 33+38+91+96+111+163+256; 33+38+91+96+111+254+256; 33+38+91+96+163+254+256; 33+38+91+111+163+254+256; 33+38+96+111+163+254+256; 33+91+96+111+163+254+256; или 38+91+96+111+163+254+256, таких как описанные выше.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из 27+33+38+91+96+111+163+254; 27+33+38+91+96+111+163+256; 27+33+38+91+96+111+254+256; 27+33+38+91+96+163+254+256; 27+33+38+91+111+163+254+256; 27+33+38+96+111+163+254+256; 27+33+91+96+111+163+254+256; 27+38+91+96+111+163+254+256; или 33+38+91+96+111+163+254+256, таких как описанные выше.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и 27+33+38+91+96+111+163+254+256, таких как описанные выше.

В другом аспекте вариант содержит или включает T231R+N233R и одну или несколько (например, некоторое количество) замен, выбранных из группы, состоящей из D27R, N33Q, G38A, G91T, D96E, D111A, G163K, D254S и P256T.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из D27R+N33Q; D27R+G38A; D27R+G91T; D27R+D96E; D27R+D111A; D27R+G163K; D27R+D254S; D27R+P256T; N33Q+G38A; N33Q+G91T; N33Q+D96E; N33Q+D111A; N33Q+G163K; N33Q+D254S; N33Q+P256T; G38A+G91T; G38A+D96E; G38A+D111A; G38A+G163K ; G38A+D254S; G38A+P256T; G91T+D96E; G91T+D111A; G91T+G163K ; G91T+D254S; G91T+P256T; D96E+D111A; D96E+G163K; D96E+D254S; D96E+P256T; D111A+G163K; D111A+D254S; D111A+P256T; G163K+D254S; G163K+P256T; или D254S+P256T в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из D27R+N33Q+G38A; D27R+N33Q+G91T; D27R+N33Q+D96E; D27R+N33Q+D111A; D27R+N33Q+G163K; D27R+N33Q+D254S; D27R+N33Q+P256T; D27R+G38A+G91T; D27R+G38A+D96E; D27R+G38A+D111A; D27R+G38A+G163K; D27R+G38A+D254S; D27R+G38A+P256T; D27R+G91T+D96E; D27R+G91T+D111A; D27R+G91T+G163K; D27R+G91T+D254S; D27R+G91T+P256T; D27R+D96E+D111A; D27R+D96E+G163K; D27R+D96E+D254S; D27R+D96E+P256T; D27R+D111A+G163K; D27R+D111A+D254S; D27R+D111A+P256T; D27R+G163K+D254S; D27R+G163K+P256T; D27R+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T; N33Q+G38A+D96E; N33Q+G38A+D111A; N33Q+G38A+G163K; N33Q+G38A+D254S; N33Q+G38A+P256T; N33Q+G91T+D96E; N33Q+G91T+D111A; N33Q+G91T+G163K; N33Q+G91T+D254S; N33Q+G91T+P256T; N33Q+D96E+D111A; N33Q+D96E+G163K; N33Q+D96E+D254S; N33Q+D96E+P256T; N33Q+D111A+G163K; N33Q+D111A+D254S; N33Q+D111A+P256T; N33Q+G163K+D254S; N33Q+G163K+P256T; N33Q+D254S+P256T; G38A+G91T+D96E; G38A+G91T+D111A; G38A+G91T+G163K; G38A+G91T+D254S; G38A+G91T+P256T; G38A+D96E+D111A; G38A+D96E+G163K; G38A+D96E+D254S; G38A+D96E+P256T; G38A+D111A+G163K; G38A+D111A+D254S; G38A+D111A+P256T; G38A+G163K+D254S; G38A+G163K+P256T; G38A+D254S+P256T; G91T+D96E+D111A; G91T+D96E+G163K; G91T+D96E+D254S; G91T+D96E+P256T; G91T+D111A+G163K; G91T+D111A+D254S; G91T+D111A+P256T; G91T+G163K+D254S; G91T+G163K+P256T; G91T+D254S+P256T; D96E+D111A+G163K; D96E+D111A+D254S; D96E+D111A+P256T; D96E+G163K+D254S; D96E+G163K+P256T; D96E+D254S+P256T; D111A+G163K+D254S; D111A+G163K+P256T; D111A+D254S+P256T; или G163K+D254S+P256T в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из D27R+N33Q+G38A+G91T; D27R+N33Q+G38A+D96E; D27R+N33Q+G38A+D111A; D27R+N33Q+G38A+G163K; D27R+N33Q+G38A+D254S; D27R+N33Q+G38A+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E; D27R+N33Q+G91T+D111A; D27R+N33Q+G91T+G163K; D27R+N33Q+G91T+D254S; D27R+N33Q+G91T+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A; D27R+N33Q+D96E+G163K; D27R+N33Q+D96E+D254S; D27R+N33Q+D96E+P256T; D27R+N33Q+D111A+G163K; D27R+N33Q+D111A+D254S; D27R+N33Q+D111A+P256T; D27R+N33Q+G163K+D254S; D27R+N33Q+G163K+P256T; D27R+N33Q+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E; D27R+G38A+G91T+D111A; D27R+G38A+G91T+G163K; D27R+G38A+G91T+D254S; D27R+G38A+G91T+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A; D27R+G38A+D96E+G163K; D27R+G38A+D96E+D254S; D27R+G38A+D96E+P256T; D27R+G38A+D111A+G163K; D27R+G38A+D111A+D254S; D27R+G38A+D111A+P256T; D27R+G38A+G163K+D254S; D27R+G38A+G163K+P256T; D27R+G38A+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+D111A; D27R+G91T+D96E+G163K; D27R+G91T+D96E+D254S; D27R+G91T+D96E+P256T; D27R+G91T+D111A+G163K; D27R+G91T+D111A+D254S; D27R+G91T+D111A+P256T; D27R+G91T+G163K+D254S; D27R+G91T+G163K+P256T; D27R+G91T+D254S+P256T; D27R+D96E+D111A+G163K; D27R+D96E+D111A+D254S; D27R+D96E+D111A+P256T; D27R+D96E+G163K+D254S; D27R+D96E+G163K+P256T; D27R+D96E+D254S+P256T; D27R+D111A+G163K+D254S; D27R+D111A+G163K+P256T; D27R+D111A+D254S+P256T; D27R+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E; N33Q+G38A+G91T+D111A; N33Q+G38A+G91T+G163K; N33Q+G38A+G91T+D254S; N33Q+G38A+G91T+P256T; N33Q+G38A+D96E+D111A; N33Q+G38A+D96E+G163K; N33Q+G38A+D96E+D254S; N33Q+G38A+D96E+P256T; N33Q+G38A+D111A+G163K; N33Q+G38A+D111A+D254S; N33Q+G38A+D111A+P256T; N33Q+G38A+G163K+D254S; N33Q+G38A+G163K+P256T; N33Q+G38A+D254S+P256T; N33Q+G91T+D96E+D111A; N33Q+G91T+D96E+G163K; N33Q+G91T+D96E+D254S; N33Q+G91T+D96E+P256T; N33Q+G91T+D111A+G163K; N33Q+G91T+D111A+D254S; N33Q+G91T+D111A+P256T; N33Q+G91T+G163K+D254S; N33Q+G91T+G163K+P256T; N33Q+G91T+D254S+P256T; N33Q+D96E+D111A+G163K; N33Q+D96E+D111A+D254S; N33Q+D96E+D111A+P256T; N33Q+D96E+G163K+D254S; N33Q+D96E+G163K+P256T; N33Q+D96E+D254S+P256T; N33Q+D111A+G163K+D254S; N33Q+D111A+G163K+P256T; N33Q+D111A+D254S+P256T; N33Q+G163K+D254S+P256T; G38A+G91T+D96E+D111A; G38A+G91T+D96E+G163K; G38A+G91T+D96E+D254S; G38A+G91T+D96E+P256T; G38A+G91T+D111A+G163K; G38A+G91T+D111A+D254S; G38A+G91T+D111A+P256T; G38A+G91T+G163K+D254S; G38A+G91T+G163K+P256T; G38A+G91T+D254S+P256T; G38A+D96E+D111A+G163K; G38A+D96E+D111A+D254S; G38A+D96E+D111A+P256T; G38A+D96E+G163K+D254S; G38A+D96E+G163K+P256T; G38A+D96E+D254S+P256T; G38A+D111A+G163K+D254S; G38A+D111A+G163K+P256T; G38A+D111A+D254S+P256T; G38A+G163K+D254S+P256T; G91T+D96E+D111A+G163K; G91T+D96E+D111A+D254S; G91T+D96E+D111A+P256T; G91T+D96E+G163K+D254S; G91T+D96E+G163K+P256T; G91T+D96E+D254S+P256T; G91T+D111A+G163K+D254S; G91T+D111A+G163K+P256T; G91T+D111A+D254S+P256T; G91T+G163K+D254S+P256T; D96E+D111A+G163K+D254S; D96E+D111A+G163K+P256T; D96E+D111A+D254S+P256T; D96E+G163K+D254S+P256T; или D111A+G163K+D254S+P256T в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замену в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A; D27R+N33Q+G38A+G91T+G163K; D27R+N33Q+G38A+G91T+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A; D27R+N33Q+G38A+D96E+G163K; D27R+N33Q+G38A+D96E+D254S; D27R+N33Q+G38A+D96E+P256T; D27R+N33Q+G38A+D111A+G163K; D27R+N33Q+G38A+D111A+D254S; D27R+N33Q+G38A+D111A+P256T; D27R+N33Q+G38A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A; D27R+N33Q+G91T+D96E+G163K; D27R+N33Q+G91T+D96E+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+P256T; D27R+N33Q+G91T+D111A+G163K; D27R+N33Q+G91T+D111A+D254S; D27R+N33Q+G91T+D111A+P256T; D27R+N33Q+G91T+G163K+D254S; D27R+N33Q+G91T+G163K+P256T; D27R+N33Q+G91T+D254S+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A+G163K; D27R+N33Q+D96E+D111A+D254S; D27R+N33Q+D96E+D111A+P256T; D27R+N33Q+D96E+G163K+D254S; D27R+N33Q+D96E+G163K+P256T; D27R+N33Q+D96E+D254S+P256T; D27R+N33Q+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A; D27R+G38A+G91T+D96E+G163K; D27R+G38A+G91T+D96E+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+P256T; D27R+G38A+G91T+D111A+G163K; D27R+G38A+G91T+D111A+D254S; D27R+G38A+G91T+D111A+P256T; D27R+G38A+G91T+G163K+D254S; D27R+G38A+G91T+G163K+P256T; D27R+G38A+G91T+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+G163K; D27R+G38A+D96E+D111A+D254S; D27R+G38A+D96E+D111A+P256T; D27R+G38A+D96E+G163K+D254S; D27R+G38A+D96E+G163K+P256T; D27R+G38A+D96E+D254S+P256T; D27R+G38A+D111A+G163K+D254S; D27R+G38A+D111A+G163K+P256T; D27R+G38A+D111A+D254S+P256T; D27R+G38A+G163K+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+D111A+G163K; D27R+G91T+D96E+D111A+D254S; D27R+G91T+D96E+D111A+P256T; D27R+G91T+D96E+G163K+D254S; D27R+G91T+D96E+G163K+P256T; D27R+G91T+D96E+D254S+P256T; D27R+G91T+D111A+G163K+D254S; D27R+G91T+D111A+G163K+P256T; D27R+G91T+D111A+D254S+P256T; D27R+G91T+G163K+D254S+P256T; D27R+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A; N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K; N33Q+G38A+G91T+D96E+D254S; N33Q+G38A+G91T+D96E+P256T; N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K; N33Q+G38A+G91T+D111A+D254S; N33Q+G38A+G91T+D111A+P256T; N33Q+G38A+G91T+G163K+D254S; N33Q+G38A+G91T+G163K+P256T; N33Q+G38A+G91T+D254S+P256T; N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K; N33Q+G38A+D96E+D111A+D254S; N33Q+G38A+D96E+D111A+P256T; N33Q+G38A+D96E+G163K+D254S; N33Q+G38A+D96E+G163K+P256T; N33Q+G38A+D96E+D254S+P256T; N33Q+G38A+D111A+G163K+D254S; N33Q+G38A+D111A+G163K+P256T; N33Q+G38A+D111A+D254S+P256T; N33Q+G38A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K; N33Q+G91T+D96E+D111A+D254S; N33Q+G91T+D96E+D111A+P256T; N33Q+G91T+D96E+G163K+D254S; N33Q+G91T+D96E+G163K+P256T; N33Q+G91T+D96E+D254S+P256T; N33Q+G91T+D111A+G163K+D254S; N33Q+G91T+D111A+G163K+P256T; N33Q+G91T+D111A+D254S+P256T; N33Q+G91T+G163K+D254S+P256T; N33Q+D96E+D111A+G163K+D254S; N33Q+D96E+D111A+G163K+P256T; N33Q+D96E+D111A+D254S+P256T; N33Q+D96E+G163K+D254S+P256T; N33Q+D111A+G163K+D254S+P256T; G38A+G91T+D96E+D111A+G163K; G38A+G91T+D96E+D111A+D254S; G38A+G91T+D96E+D111A+P256T; G38A+G91T+D96E+G163K+D254S; G38A+G91T+D96E+G163K+P256T; G38A+G91T+D96E+D254S+P256T; G38A+G91T+D111A+G163K+D254S; G38A+G91T+D111A+G163K+P256T; G38A+G91T+D111A+D254S+P256T; G38A+G91T+G163K+D254S+P256T; G38A+D96E+D111A+G163K+D254S; G38A+D96E+D111A+G163K+P256T; G38A+D96E+D111A+D254S+P256T; G38A+D96E+G163K+D254S+P256T; G38A+D111A+G163K+D254S+P256T; G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; или D96E+D111A+G163K+D254S+P256T в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+D254S; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+D96E+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+G163K+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+G163K+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G91T+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G91T+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+G163K+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S; D27R+G38A+G91T+D111A+G163K+P256T; D27R+G38A+G91T+D111A+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S; N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S; N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+P256T; N33Q+G38A+G91T+D111A+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S; N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+P256T; N33Q+G38A+D96E+D111A+D254S+P256T; N33Q+G38A+D96E+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; N33Q+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; N33Q+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; N33Q+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; G38A+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; G38A+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; G38A+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; G38A+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; или G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; или G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и одному из D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S;

D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; или

N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте вариант содержит или включает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте варианты содержат или включают замены в положениях, соответствующих следующим в SEQ ID NO: 2:

D96E T231R N233R;

N33Q D96E T231R N233R;

N33Q D111A T231R N233R;

N33Q T231R N233R P256T;

N33Q G38A G91T G163K T231R N233R D254S;

N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

D27R N33Q G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R P256T;

D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S;

D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

D96E T231R N233R D254S;

T231R N233R D254S P256T;

G163K T231R N233R D254S;

D27R N33Q G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T;

D27R G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

D96E G163K T231R N233R D254S;

D27R G163K T231R N233R D254S;

D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S;

D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T;

D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T:

D27R D96E G163K T231R N233R D254S;

D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T;

D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S;

D27R D96E G163K T231R N233R;

D27R D96E G163K T231R N233R D254S P256T;

D27R D96E D111A G163D T231R N233R D254S P256T;

D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S;

D27R D96E D111A G163K T231R N233R P256T;

D27R D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R P256T;

D27R G38A D96E D111A T231R N233R D254S P256T;

D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T;

D27R D96E G163K T231R N233R D254S P256T;

D27R N33Q G38A G91T D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

D27R G38A D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

D111A G163K T231R N233R D254S P256T

D111A T231R N233R

D111A T231R N233R D254S P256T

D27R D96E D111A G163K T231R N233R

D27R D96E D111A T231R N233R

D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T

D27R N33Q G38A D96E D111A T231R N233R D254S P256T

D27R G38A D96E D111A G163K E210Q T231R N233R D254S P256T

D27R T231R N233R D254S P256T

D96E D111A G163K T231R N233R

D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T

D96E D111A G163K T231R N233R P256T

D96E D111A T231R N233R

D96E D111A T231R N233R D254S

D96E D111A T231R N233R P256T

D96E G163K T231R N233R D254S P256T

D96E T231R N233R D254S P256T

D96E T231R N233R P256T

G38A D96E D111A T231R N233R

G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T

G91T D96E D111A T231R N233R

G91T D96E T231R N233R

G91T T231R N233R D254S P256T

N33Q D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T

T231R N233R D254S P256T

T231R N233R P256T

Варианты могут дополнительно содержать одну или несколько дополнительных замен в одном или нескольких (например, некотором количестве) других положений.

Изменения аминокислот могут быть незначительными, то есть являться консервативными аминокислотными заменами или вставками, которые не оказывают значительного влияния на укладку и/или активность белка; небольшими делециями, как правило, размером 1-30 аминокислот; небольшими удлинениями на амино- или карбокси-конце, такими как метиониновый остаток на амино-конце; небольшим линкерным пептидом размером до 20-25 остатков; или небольшим удлинением, которое облегчает очистку путем изменения суммарного заряда, или другой функциональной группой, такой как полигистидиновый участок, антигенный эпитоп или связывающий домен.

Примерами консервативных замен являются замены в пределах групп основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и малых аминокислот (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Аминокислотные замены, которые в целом не изменяют специфическую активность, известны из уровня техники и описаны, например, H. Neurath and R.L. Hill, 1979, в The Proteins, Academic Press, New York. Обычные замены представляют собой Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.

В качестве альтернативы, изменения аминокислот имеют такую природу, что физико-химические свойства полипептидов изменяются. Например, изменения аминокислот могут улучшать термостабильность полипептида, изменять субстратную специфичность, изменять оптимальное значение pH и т.п.

Существенные аминокислоты в полипептиде можно идентифицировать в соответствии с процедурами, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последней методике отдельные мутации, заключающиеся в замене на аланин, вводят по каждому остатку в молекуле, и полученные в результате мутантные молекулы исследуют в отношении липазной активности для идентификации аминокислотных остатков, которые являются определяющими для активности молекулы. См. также Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Активный центр при ферментативном или другом биологическом взаимодействии можно также определить с помощью физического анализа структуры, которую определяют с помощью таких методик, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого контактирующего центра. См., например, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Об идентичности существенных аминокислот можно также сделать заключение на основании выравнивания с родственным полипептидом.

Варианты могут состоять из или содержать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% от количества аминокислот из SEQ ID NO: 2.

В одном варианте осуществления вариант характеризуется улучшенной стабильностью в моющем средстве в присутствии протеазы по сравнению с исходной липазой.

В одном варианте осуществления вариант характеризуется улучшенной стабильностью в моющем средстве по сравнению с исходной липазой.

В одном варианте осуществления вариант характеризуется улучшенной стабильностью к действию протеаз по сравнению с исходной липазой.

В одном варианте осуществления вариант характеризуется улучшенной химической стабильностью по сравнению с исходной липазой.

В одном варианте осуществления вариант характеризуется улучшенной стабильностью к окислению по сравнению с исходной липазой.

В одном варианте осуществления вариант характеризуется улучшенной pH-стабильностью по сравнению с исходной липазой.

В одном варианте осуществления вариант характеризуется улучшенной стабильностью в условиях хранения по сравнению с исходной липазой.

В одном варианте осуществления вариант характеризуется улучшенной термостабильностью по сравнению с исходной липазой.

Исходные липазы

Исходная липаза может представлять собой (a) полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична полипептиду SEQ ID NO: 2; (b) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях низкой жесткости с (i) кодирующей полипептид последовательностью SEQ ID NO: 1, (ii) последовательностью полной длины, комплементарной (i); или (c) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична кодирующей полипептид последовательности SEQ ID NO: 1.

В одном аспекте последовательность исходной формы идентична обладающему липазной активностью полипептиду SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100%. В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается на вплоть до 40 аминокислот, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 от полипептида SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте исходная форма представляет собой фрагмент полипептида SEQ ID NO: 2, содержащий по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% от количества аминокислот из SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления исходная форма представляет собой аллельный вариант полипептида SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте исходная форма кодируется полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях очень низкой жесткости, условиях низкой жесткости, условиях умеренной жесткости, условиях умеренно высокой жесткости, условиях высокой жесткости или условиях очень высокой жесткости с (i) кодирующей полипептид последовательностью SEQ ID NO: 1, (ii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).

Полинуклеотид SEQ ID NO: 1 или его подпоследовательность, а также полипептид SEQ ID NO: 2 или его фрагмент можно использовать для конструирования зондов на основе нуклеиновой кислоты для идентификации и клонирования ДНК, кодирующей исходную форму у штаммов разных родов или видов, в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. В частности, такие зонды можно применять для гибридизации с геномной ДНК или кДНК представляющей интерес клетки после стандартных процедур Саузерн-блоттинга с целью идентификации и выделения их соответствующего гена. Такие зонды могут быть значительно короче полной последовательности, но должны иметь длину по меньшей мере 15, например, по меньшей мере 25, по меньшей мере 35 или по меньшей мере 70 нуклеотидов. Зонд на основе нуклеиновой кислоты предпочтительно имеет длину по меньшей мере 100 нуклеотидов, например, имеет длину по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 500 нуклеотидов, по меньшей мере 600 нуклеотидов, по меньшей мере 700 нуклеотидов, по меньшей мере 800 нуклеотидов или по меньшей мере 900 нуклеотидов. Можно применять как ДНК-, так и РНК-зонды. Зонды, как правило, метят для выявления соответствующего гена (например, ³²P, ³H, ³⁵S, биотином или авидином). Такие зонды охватываются настоящим изобретением.

Библиотеку геномной ДНК или кДНК, полученную из таких прочих штаммов, можно подвергнуть скринингу в отношении ДНК, которая гибридизируется с зондами, описанными выше, и кодирует исходную форму. Геномную или другую ДНК из таких прочих штаммов можно разделить посредством электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле или других методик разделения. ДНК из библиотек или разделенную ДНК можно перенести на нитроцеллюлозу или другой подходящий материал-носитель и иммобилизовать на них. С целью идентификации клона или ДНК, которые гибридизируются c SEQ ID NO: 1 или ее подпоследовательностью, материал-носитель применяется в Саузерн-блоттинге.

В контексте настоящего изобретения гибридизация означает, что полинуклеотид гибридизируется с меченым зондом на основе нуклеиновой кислоты, соответствующим (i) SEQ ID NO: 1; (ii) кодирующей полипептид последовательности SEQ ID NO: 1; (iii) последовательности полной длины, комплементарной ей; или (iv) ее подпоследовательности; в условиях от очень низкой до очень высокой жесткости. Молекулы, с которыми зонд на основе нуклеиновой кислоты гибридизируется в этих условиях, можно выявить с помощью, например, пленки для рентгенографии или любых других средств для выявления, известных в данной области.

В одном аспекте зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой кодирующую полипептид последовательность SEQ ID NO: 1. В другом аспекте зонд на основе нуклеиновой кислоты составляют по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% от количества нуклеотидов из SEQ ID NO: 1. В другом аспекте зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотид, который кодирует полипептид SEQ ID NO: 2, его полипептид или его фрагмент. В другом аспекте зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO: 1.

В другом варианте осуществления исходная форма кодируется полинуклеотидом, последовательность которого идентична кодирующей полипептид последовательности SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100%.

Полипептид может представлять собой гибридный полипептид, в котором участок одного полипептида слит с N-концом или C-концом участка другого полипептида.

Исходная форма может представлять собой слитый полипептид или расщепляемый слитый полипептид, в котором другой полипептид слит с N-концом или C-концом полипептида согласно настоящему изобретению. Слитый полипептид получают путем слияния полинуклеотида, кодирующего другой полипептид, с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению. Методики получения слитых полипептидов известны из уровня техники и включают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды с тем, чтобы они находились в рамке и чтобы экспрессия слитого полипептида находилась под контролем одного и того же промотора(ов) и терминатора. Слитые полипептиды можно также конструировать с применением интеиновой технологии, в которой слитые полипептиды создаются постртрансляционно (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

Слитый полипептид может дополнительно содержать сайт расщепления между двумя полипептидами. После секреции слитого белка сайт расщепляется с высвобождением двух полипептидов. Примеры сайтов расщепления включают без ограничения сайты, раскрытые в Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; и Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; и Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Исходную форму можно получить из микроорганизмов любого рода. В контексте настоящего изобретения выражение "полученный из", которое применяется в данном документе применительно к определенному источнику, будет означать, что исходная форма, кодируемая полинуклеотидом, продуцируется источником или штаммом, в который был введен полинуклеотид из источника. В одном аспекте исходная форма секретируется за пределы клетки.

Исходная форма может представлять собой бактериальную липазу. Например, исходная форма может представлять собой полипептид грамположительных бактерий, такой как липаза Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces или липаза Thermobifida, или полипептид грамотрицательных бактерий, такой как липаза Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella или Ureaplasma.

В одном аспекте исходная форма представляет собой липазу Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis.

В другом аспекте исходная форма представляет собой липазу Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis или Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

В другом аспекте исходная форма представляет собой липазу Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus или Streptomyces lividans.

В другом аспекте исходная форма представляет собой липазу Thermobifida alba или Thermobifida fusca (ранее известных как Thermomonaspora fusca).

Исходная форма может представлять собой липазу гриба. Например, исходная форма может представлять собой липазу дрожжей, такую как липаза Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia; или липазу нитчатого гриба, такую как липаза Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella или Xylaria.

В другом аспекте исходная форма представляет собой липазу Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis или Saccharomyces oviformis.

В другом аспекте исходная форма представляет собой липазу Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.

В другом аспекте исходная форма представляет собой липазу Thermomyces lanuginosus, например, липазу SEQ ID NO: 2.

Будет понятно, что в отношении вышеупомянутых видов настоящее изобретение охватывает как совершенную, так и несовершенную стадии, а также другие таксономические эквиваленты, например, анаморфы, вне зависимости от названия вида, под которым они известны. Специалисты в данной области легко поймут идентичность соответствующих эквивалентов.

Штаммы этих видов являются легкодоступными неограниченному кругу лиц в ряде коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection) (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) и Коллекция патентованных культур Службы сельскохозяйственных исследований (Agricultural Research Service Patent Culture Collection), Северный региональный исследовательский центр (Northern Regional Research Center) (NRRL).

Исходную форму можно идентифицировать и получить из других источников, в том числе микроорганизмов, выделенных из природной среды (например, почвы, компостов, воды и т.д.), или образцов ДНК, полученных непосредственно из природных материалов (например, почвы, компостов, воды и т. д.), с использованием вышеупомянутых зондов. Методики выделения микроорганизмов и ДНК непосредственно из естественных мест обитания хорошо известны в данной области техники. Полинуклеотид, кодирующий исходную форму, можно затем получить подобным образом путем скрининга библиотеки геномной ДНК или кДНК другого микроорганизма или образца смешанной ДНК. После того как полинуклеотид, кодирующий исходную форму, был выявлен зондом(ами), полинуклеотид можно выделить или клонировать с использованием методик, которые хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, Sambrook et al., 1989, выше).

Получение вариантов

Настоящее изобретение также относится к способам получения вариантов липаз, включающим: (a) введение замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и по меньшей мере одной или нескольким (например, некоторому количеству) из D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R и N33Q в SEQ ID NO: 2; (b) выбор варианта, который обладает липазной активностью и характеризуется улучшенной стабильностью по сравнению с исходной липазой; и (c) извлечение варианта.

Варианты можно получить с использованием любой процедуры мутагенеза, известной из уровня техники, такой как сайт-направленный мутагенез, конструирование синтетических генов, конструирование полусинтетических генов, случайный мутагенез, шаффлинг и т.д.

Сайт-направленный мутагенез представляет собой методику, в которой одну или несколько (например, некоторое количество) мутаций вводят в один или несколько определенных сайтов в полинуклеотиде, кодирующем исходную липазу.

Сайт-направленный мутагенез можно проводить in vitro с помощью ПЦР, включающей использование олигонуклеотидных праймеров, содержащих необходимую мутацию. Сайт-направленный мутагенез можно также осуществлять in vitro путем кассетного мутагенеза, включающего расщепление рестрикционным ферментом по сайту в плазмиде, содержащей полинуклеотид, кодирующий исходную липазу, и последующего лигирования олигонуклеотида, содержащего мутацию, в полинуклеотид. Обычно рестрикционный фермент, который расщепляет плазмиду и олигонуклеотид, является одним и тем же, обеспечивающим возможность лигирования друг с другом липких концов плазмиды и вставки. См., например, Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; и Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

Сайт-направленный мутагенез можно также проводить in vivo с помощью способов, известных из уровня техники. См., например, US2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; и Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

Любую процедуру сайт-направленного мутагенеза можно использовать в настоящем изобретении. Доступны многие коммерческие наборы, которые можно использовать для получения вариантов.

Конструирование синтетического гена включает в себя in vitro синтез молекулы полинуклеотида, предназначенной для кодирования представляющего интерес полипептида. Синтез гена можно осуществить с использованием ряда методик, таких как мультиплексная микрочиповая технология, описанная Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054), и подобных технологий, где олигонуклеотиды синтезируют и собирают на фотопрограммируемых микропотоковых чипах.

Одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или вставок можно осуществить и исследовать при помощи известных способов мутагенеза, рекомбинации и/или шаффлинга с последующей соответствующей процедурой скрининга, как, например, таковых, раскрытых в Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO95/17413 или WO95/22625. Другие способы, которые можно применять, включают ПЦР с использованием неточной полимеразы, фаговый дисплей (например, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; патент США № 5223409; WO 92/06204) и направленный на участок мутагенез (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Способы мутагенеза/шаффлинга можно объединить с автоматизированными способами скрининга с высокой пропускной способностью для выявления активности клонированных подвергнутых мутагенезу полипептидов, экспрессируемых клетками-хозяевами (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Подвергнутые мутагенезу молекулы ДНК, которые кодируют активные полипептиды, можно извлечь из клеток-хозяев и быстро секвенировать с применением стандартных способов, известных в данной области техники. Эти способы обеспечивают возможность быстрого определения важности отдельных аминокислотных остатков в полипептиде.

Конструирование полусинтетического гена проводят путем объединения аспектов конструирования синтетических генов, и/или сайт-направленного мутагенеза, и/или случайного мутаганеза, и/или шаффлинга. Полусинтетическая конструкция характеризуется способом, в котором используются фрагменты полинуклеотида, которые синтезируются, в сочетании с методиками ПЦР. Определенные участки генов можно, таким образом, синтезировать de novo, в то время как другие участки можно амплифицировать с использованием сайт-специфических мутагенных праймеров, тогда как остальные участки можно подвергнуть ПЦР с использованием неточной полимеразы или ПЦР амплификации без использования неточной полимеразы. Подпоследовательности полинуклеотидов можно затем подвергнуть шаффлингу.

Полинуклеотиды

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим вариант согласно настоящему изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид по настоящему изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему полинуклеотид по настоящему изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид по настоящему изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу получения варианта липазы, включающему: (a) культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, подходящих для экспрессии варианта; и (b) извлечение варианта.

Конструкции нуклеиновой кислоты

Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, функционально связанный с одной или несколькими управляющими последовательностями, которые управляют экспрессией кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине в условиях, подходящих для управляющих последовательностей.

С полинуклеотидом можно производить манипуляции рядом способов для обеспечения экспрессии варианта. Манипуляция с полинуклеотидом до его вставки в вектор может быть желательной или необходимой в зависимости от вектора экспрессии. Методики модификации полинуклеотидов, в которых применяют способы рекомбинантных ДНК, хорошо известны в данной области техники.

Управляющая последовательность может представлять собой промотор, полинуклеотид, который узнается клеткой-хозяином для экспрессии полинуклеотида. Промотор содержит последовательности, регулирующие транскрипцию, которые опосредуют экспрессию варианта. Промотор может представлять собой любой полинуклеотид, который проявляет транскрипционную активность в клетке-хозяине, в том числе мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, гомологичные либо гетерологичные по отношению к клетке-хозяину.

Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкций нуклеиновых кислот по настоящему изобретению в бактериальной клетке-хозяине являются промоторы, полученные из гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (penP), гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus (amyM), гена левансахаразы Bacillus subtilis (sacB), генов xylA и xylB Bacillus subtilis, гена cryIIIA Bacillus thuringiensis (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), lac-оперона E. coli, trc-промотора E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), гена агаразы Streptomyces coelicolor (dagA) и гена прокариотической бета-лактамазы (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), а также tac-промотор (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Дополнительные промоторы описаны в "Useful proteins from recombinant bacteria" в Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; и в Sambrook et al., 1989, выше. Примеры тандемных промоторов раскрыты в WO 99/43835.

Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкций нуклеиновых кислот по настоящему изобретению в клетке-хозяине, являющейся клеткой нитчатого гриба, являются промоторы, полученные из генов ацетамидазы Aspergillus nidulans, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger, кислотостабильной альфа-амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger или Aspergillus awamori (glaA), такаамилазы Aspergillus oryzae, щелочной протеазы Aspergillus oryzae, триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae, трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum (WO 96/00787), амилоглюкозидазы Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn Fusarium venenatum (WO 00/56900), липазы Rhizomucor miehei, аспартатпротеиназы Rhizomucor miehei, бета-глюкозидазы Trichoderma reesei, целлобиогидролазы I Trichoderma reesei, целлобиогидролазы II Trichoderma reesei, эндоглюканазы I Trichoderma reesei, эндоглюканазы II Trichoderma reesei, эндоглюканазы III Trichoderma reesei, эндоглюканазы IV Trichoderma reesei, эндоглюканазы V Trichoderma reesei, ксиланазы I Trichoderma reesei, ксиланазы II Trichoderma reesei, бета-ксилозидазы Trichoderma reesei, а также промотор NA2-tpi (модифицированный промотор из гена нейтральной альфа-амилазы Aspergillus, в котором нетранслируемая лидерная последовательность была заменена на нетранслируемую лидерную последовательность из гена триозофосфатизомеразы Aspergillus; неограничивающие примеры включают в себя модифицированные промоторы из гена нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger, в которых нетранслируемая лидерная последовательность была заменена на нетранслируемую лидерную последовательность из гена триозофосфатизомеразы Aspergillus nidulans или Aspergillus oryzae); а также мутантные, усеченные и гибридные промоторы, полученные из них.

Для дрожжей-хозяев пригодные промоторы получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), галактокиназы Saccharomyces cerevisiae (GAL1), алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), триозофосфатизомеразы Saccharomyces cerevisiae (TPI), металлотионеина Saccharomyces cerevisiae (CUP1) и 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae. Другие пригодные промоторы для дрожжевых клеток-хозяев описаны в Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

Управляющая последовательность может также представлять собой терминатор транскрипции, который распознается клеткой-хозяином с терминацией транскрипции. Терминаторная последовательность функционально связана с 3’-концом полинуклеотида, кодирующего вариант. Можно использовать любой терминатор, функционирующий в клетке-хозяине.

Предпочтительные терминаторы для бактериальных клеток-хозяев получают из генов щелочной протеазы Bacillus clausii (aprH), альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL) и рибосомной РНК Escherichia coli (rrnB).

Предпочтительные терминаторы для клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, получают из генов антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, глюкоамилазы Aspergillus niger, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger, такаамилазы Aspergillus oryzae и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum.

Предпочтительные терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae, цитохрома C Saccharomyces cerevisiae (CYC1) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae. Другие пригодные терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев описаны в Romanos et al., 1992, выше.

Управляющая последовательность может также представлять собой участок, стабилизирующий мРНК, расположенный ниже промотора и выше кодирующей последовательности гена, который повышает экспрессию гена.

Примеры подходящих участков, стабилизирующих мРНК, получают из гена cryIIIA Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) и гена SP82 Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

Управляющая последовательность может также представлять собой лидерную последовательность, нетранслируемый участок мРНК, важный для трансляции в клетке-хозяине. Лидерная последовательность функционально связана с 5’-концом полинуклеотида, кодирующего вариант. Можно применять любую лидерную последовательность, функционирующую в клетке-хозяине.

Предпочтительные лидерные последовательности для клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, получают из генов такаамилазы Aspergillus oryzae и триозофосфатизомеразы Aspergillus nidulans.

Подходящие лидерные последовательности для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae, альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

Управляющая последовательность может также представлять собой последовательность полиаденилирования, последовательность, функционально связанную с 3’-концом последовательности, кодирующей вариант, и при транскрипции распознается клеткой-хозяином как сигнал к присоединению полиаденозиновых остатков к транскрибируемой мРНК. Можно применять любую последовательность полиаденилирования, функционирующую в клетке-хозяине.

Предпочтительные последовательности полиаденилирования для клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, получают из генов антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, глюкоамилазы Aspergillus niger, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger, такаамилазы Aspergillus oryzae и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum.

Пригодные последовательности полиаденилирования для дрожжевых клеток-хозяев описаны в Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

Управляющая последовательность может также представлять собой сигнальный пептид, кодирующий участок, который кодирует сигнальный пептид, связанный с N-концом варианта, и направляет вариант по клеточному секреторному пути. 5’-конец кодирующей последовательности полинуклеотида может по своей природе содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, связанную в естественных условиях в трансляционной рамке считывания с сегментом кодирующей последовательности, которая кодирует вариант. В качестве альтернативы, 5’-конец кодирующей последовательности может содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая является чужеродной относительно кодирующей последовательности. Чужеродная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, может быть необходимой в тех случаях, когда кодирующая последовательность в естественных условиях не содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид. В качестве альтернативы, чужеродной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, можно просто заменить последовательность, кодирующую сигнальный пептид в естественных условиях, с целью повышения секреции варианта. Однако можно использовать любую последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая направляет экспрессируемый вариант по секреторному пути в клетке-хозяине.

Эффективные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, для бактериальных клеток-хозяев представляют собой последовательности, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов мальтогенной амилазы Bacillus NCIB 11837, субтилизина Bacillus licheniformis, бета-лактамазы Bacillus licheniformis, альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus, нейтральных протеаз Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) и prsA Bacillus subtilis. Дополнительные сигнальные пептиды описаны в Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Эффективные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, для клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, представляют собой последовательности, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов нейтральной амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger, такаамилазы Aspergillus oryzae, целлюлазы Humicola insolens, эндоглюканазы V Humicola insolens, липазы Humicola lanuginosa и аспартатпротеиназы Rhizomucor miehei.

Пригодные сигнальные пептиды для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и инвертазы Saccharomyces cerevisiae. Другие пригодные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, описаны в Romanos et al., 1992, выше.

Управляющая последовательность может также представлять собой кодирующую последовательность пропептида, которая кодирует пропептид, расположенный на N-конце варианта. Получаемый в результате полипептид известен как профермент или прополипептид (или, в некоторых случаях, зимоген). Прополипептид обычно неактивен и может быть превращен в активный полипептид путем каталитического или автокаталитического отщепления пропептида от прополипептида. Последовательность, кодирующую пропептид, можно получить из генов щелочной протеазы Bacillus subtilis (aprE), нейтральной протеазы Bacillus subtilis (nprT), лакказы Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), аспартатпротеиназы Rhizomucor miehei и альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae.

В случае, если присутствуют последовательности как сигнального пептида, так и пропептида, последовательность пропептида расположена возле N-конца варианта, а последовательность сигнального пептида расположена возле N-конца последовательности пропептида.

Также может быть желательным добавление регуляторных последовательностей, которые регулируют экспрессию варианта относительно роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных систем являются таковые, которые вызывают включение или выключение экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, в том числе на наличие регуляторного соединения. Регуляторные системы в прокариотических системах включают в себя системы операторов lac, tac и trp. У дрожжей можно применять систему ADH2 или систему GAL1. У нитчатых грибов можно применять промотор гена глюкоамилазы Aspergillus niger, промотор гена така-альфа-амилазы Aspergillus oryzae и промотор гена глюкоамилазы Aspergillus oryzae. Другими примерами регуляторных последовательностей являются таковые, которые обеспечивают возможность амплификации гена. В эукариотических системах эти регуляторные последовательности включают в себя ген дигидрофолатредуктазы, амплифицируемый в присутствии метотрексата, и гены металлотионеинов, амплифицируемые в присутствии тяжелых металлов. В этих случаях полинуклеотид, кодирующий вариант, будет функционально связан с регулирующей последовательностью.

Векторы экспрессии

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам экспрессии, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. Различные нуклеотидные и управляющие последовательности можно объединить вместе с получением рекомбинантного вектора экспрессии, который может включать в себя один или несколько соответствующих сайтов рестрикции для обеспечения возможности вставки или замещения полинуклеотида, кодирующего вариант, по таким сайтам. В качестве альтернативы, полинуклеотид можно экспрессировать посредством вставки полинуклеотида или конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, в подходящий вектор для экспрессии. При создании вектора экспрессии кодирующую последовательность располагают в векторе таким образом, чтобы кодирующая последовательность была функционально связана с подходящими управляющими последовательностями для экспрессии.

Рекомбинантный вектор экспрессии может представлять собой любой вектор (например, плазмиду или вирус), который можно удобным образом подвергнуть технологиям рекомбинантной ДНК и который может способствовать экспрессии полинуклеотида. Выбор вектора, как правило, будет зависеть от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую должен быть введен вектор. Вектор может представлять собой линейную или замкнутую кольцевую плазмиду.

Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует в виде внехромосомного объекта, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например, плазмиду, внехромосомный элемент, минихромосому или искусственную хромосому. Вектор может содержать любые средства для обеспечения саморепликации. В качестве альтернативы, вектор может быть таким, который при введении в клетку-хозяина интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую(ые) он интегрировался. Более того, можно применять один вектор или плазмиду или два или более векторов или плазмид, которые в совокупности содержат общую ДНК, которую необходимо ввести в геном клетки-хозяина, или транспозон.

Вектор предпочтительно содержит один или несколько селектируемых маркеров, которые позволяют легко проводить отбор трансформированных, трансфицированных, трансдуцированных или подобных клеток. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофность для ауксотрофов и т. п.

Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются dal-гены Bacillus licheniformis или Bacillus subtilis или маркеры, которые придают устойчивость к антибиотикам, как например, устойчивость к ампициллину, хлорамфениколу, канамицину, неомицину, спектиномицину или тетрациклину. Подходящие маркеры для дрожжевых клеток-хозяев включают в себя без ограничения ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 и URA3. Селектируемые маркеры для применения в клетке-хозяине, являющейся клеткой нитчатого гриба, включают в себя, без ограничения, amdS (ацетамидазу), argB (орнитинкарбамоилтрансферазу), bar (фосфинотрицинацетилтрансферазу), hph (гигромицинфосфотрансферазу), niaD (нитратредуктазу), pyrG (оротидин-5’-фосфатдекарбоксилазу), sC (сульфатаденилтрансферазу) и trpC (антранилатсинтазу), а также их эквиваленты. Для применения в клетке Aspergillus предпочтительными являются гены amdS и pyrG Aspergillus nidulans или Aspergillus oryzae и ген bar Streptomyces hygroscopicus.

Вектор предпочтительно содержит элемент(ы), который(ые) обеспечивает(ют) интеграцию вектора в геном клетки-хозяина или автономную репликацию вектора в клетке независимо от генома.

Интеграция вектора в геном клетки-хозяина может зависеть от последовательности полинуклеотида, кодирующей вариант, или любого другого элемента вектора для интеграции в геном путем гомологичной или негомологичной рекомбинации. В качестве альтернативы, вектор может содержать дополнительные полинуклеотиды для управления интеграцией в геном клетки-хозяина в точном(ых) местоположении(ях) в хромосоме(ах) путем гомологичной рекомбинации. Для повышения возможности интеграции в точном местоположении интегрируемые элементы должны содержать достаточное количество нуклеиновых кислот, как например, от 100 до 10000 пар оснований, от 400 до 10000 пар оснований и от 800 до 10000 пар оснований, последовательность которых в высокой степени идентична соответствующей последовательности-мишени для увеличения вероятности гомологичной рекомбинации. Интегрируемые элементы могут представлять собой любую последовательность, гомологичную последовательности-мишени в геноме клетки-хозяина. Кроме того, интегрируемые элементы могут представлять собой некодирующие или кодирующие полинуклеотиды. С другой стороны, вектор можно интегрировать в геном клетки-хозяина путем негомологичной рекомбинации.

Для автономной репликации вектор может дополнительно содержать точку начала репликации, что обеспечивает возможность автономной репликации вектора в рассматриваемой клетке-хозяине. Точка начала репликации может представлять собой любой репликатор плазмиды, опосредующий автономную репликацию, который функционирует в клетке. Выражение "точка начала репликации" или "репликатор плазмиды" означает полинуклеотид, который обеспечивает возможность репликации плазмиды или вектора in vivo.

Примерами бактериальных точек начала репликации являются точки начала репликации плазмид pBR322, pUC19, pACYC177 и pACYC184, обеспечивающие возможность репликации в E. coli, и pUB110, pE194, pTA1060 и pAMß1, обеспечивающие возможность репликации в Bacillus.

Примерами точек начала репликации для применения в дрожжевой клетке-хозяине являются точки начала репликации 2-микронной плазмиды ARS1, ARS4, комбинация ARS1 и CEN3 и комбинация ARS4 и CEN6.

Примерами точек начала репликации, пригодных в клетке нитчатого гриба, являются AMA1 и ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). Выделение гена AMA1 и конструирование плазмид или векторов, содержащих ген, можно проводить в соответствии со способами, раскрытыми в WO 00/24883.

В клетку-хозяина для повышения продуцирования варианта можно ввести более чем одну копию полинуклеотида по настоящему изобретению. Увеличения числа копий полинуклеотида можно достичь путем интеграции по меньшей мере одной дополнительной копии последовательности в геном клетки-хозяина или путем внедрения амплифицируемого селектируемого маркерного гена с полинуклеотидом, причем клетки, содержащие амплифицированные копии селектируемого маркерного гена и, следовательно, дополнительные копии полинуклеотида, можно отбирать путем культивирования клеток в присутствии подходящего средства для отбора.

Процедуры, применяемые для лигирования описанных выше элементов для конструирования рекомбинантных векторов экспрессии по настоящему изобретению, хорошо известны специалисту в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, выше).

Клетки-хозяева

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, функционально связанный с одной или несколькими управляющими последовательностями, которые управляют продуцированием варианта по настоящему изобретению. Конструкцию или вектор, содержащие полинуклеотид, вводят в клетку-хозяина так, чтобы конструкция или вектор сохранялись в виде интегрированного в хромосому элемента или в виде самореплицирующегося внехромосомного вектора, как описано ранее. Выражение "клетка-хозяин" охватывает любого потомка родительской клетки, который не является идентичным родительской клетке вследствие мутаций, происходящих в ходе репликации. Выбор клетки-хозяина будет в значительной степени зависеть от гена, кодирующего вариант, и его источника.

Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку, пригодную при рекомбинантном получении варианта, например, прокариота или эукариота.

Прокариотическая клетка-хозяин может представлять собой клетку любой грамположительной или грамотрицательной бактерии. Грамположительные бактерии включают без ограничения Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus и Streptomyces. Грамотрицательные бактерии включают без ограничения Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella и Ureaplasma.

Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой любую клетку Bacillus, в том числе без ограничения клетки Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis.

Бактериальная клетка-хозяин может также представлять собой любую клетку Streptococcus, в том числе без ограничения клетки Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis и Streptococcus equi subsp. zooepidemicus.

Бактериальная клетка-хозяин может также представлять собой любую клетку Streptomyces, в том числе без ограничения клетки Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus и Streptomyces lividans.

Введение ДНК в клетку Bacillus можно осуществлять путем трансформации протопластов (см., например, Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), трансформации компетентных клеток (см., например, Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, или Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), электропорации (см., например, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) или конъюгации (см., например, Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). Введение ДНК в клетку E. coli можно осуществлять путем трансформации протопластов (см., например, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) или электропорации (см., например, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). Введение ДНК в клетку Streptomyces можно осуществлять путем трансформации протопластов, электропорации (см., например, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), конъюгации (см., например, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) или трансдукции (см., например, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). Введение ДНК в клетку Pseudomonas можно осуществлять путем электропорации (см., например, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) или конъюгации (см., например, Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). Введение ДНК в клетку Streptococcus можно осуществлять благодаря естественной компетентности (см., например, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), путем трансформации протопластов (см., например, Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), электропорации (см., например, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) или конъюгации (см., например, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Тем не менее можно применять любой известный в данной области техники способ введения ДНК в клетку-хозяина.

Клетка-хозяин может также быть эукариотической клеткой, такой как клетка млекопитающего, насекомого, растительная или грибная клетка.

Клетка-хозяин может представлять собой грибную клетку. "Грибы", как применяется в данном документе, включают отделы Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota и Zygomycota, а также Oomycota и все митоспоровые грибы (как определено Hawksworth и соавт. в Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK).

Грибная клетка-хозяин может представлять собой дрожжевую клетку. “Дрожжи” в контексте данного документа включают аскоспорогенные дрожжи (Endomycetales), базидиоспорогенные дрожжи и дрожжи, принадлежащие к несовершенным грибам (бластомицетам). Поскольку классификация дрожжей в будущем может измениться, в контексте настоящего изобретения дрожжи следует определять согласно описанному в Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

Дрожжевая клетка-хозяин может представлять собой клетку Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia, такую как клетка Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis или Yarrowia lipolytica.

Грибная клетка-хозяин может представлять собой клетку нитчатого гриба. "Нитчатые грибы" включают все нитчатые формы подотделов Eumycota и Oomycota (как определено Hawksworth et al., 1995, выше). Нитчатые грибы, как правило, характеризуются клеточной стенкой мицелия, состоящей из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Вегетативный рост происходит путем удлинения гиф, а катаболизм углерода является облигатно-аэробным. Напротив, вегетативный рост дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae, происходит путем почкования одноклеточного таллома, а катаболизм углерода может быть ферментативным.

Клетка-хозяин, являющаяся клеткой нитчатого гриба, может представлять собой клетку Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes или Trichoderma.

Например, клетка-хозяин, являющаяся клеткой нитчатого гриба, может представлять собой клетку Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.

Грибные клетки можно трансформировать с помощью способа, включающего образование протопластов, трансформацию протопластов и регенерацию клеточной стенки способом, известным per se. Подходящие процедуры для трансформации клеток-хозяев, являющихся клетками Aspergillus и Trichoderma, описаны в EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, и Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Подходящие способы трансформации видов Fusarium описаны в Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, и WO96/00787. Дрожжи можно трансформировать с применением процедур, описанных Becker и Guarente в Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; и Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Способы получения

Настоящее изобретение также относится к способам получения варианта, включающим: (a) культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, подходящих для экспрессии варианта; и (b) извлечение варианта.

Клетки-хозяева культивируют в питательной среде, подходящей для продукции варианта с использованием способов, известных из уровня техники. Например, клетку можно культивировать путем культивирования во встряхиваемой колбе или при мелкомасштабной или крупномасштабной ферментации (в том числе непрерывной, периодической, подпитываемой или твердофазной ферментации) в лабораторных или промышленных ферментерах, осуществляемой в подходящей среде и в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии и/или выделения варианта. Культивирование осуществляют в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, с применением процедур, известных в данной области техники. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или могут быть получены в соответствии с опубликованными составами (например, в каталогах Американской коллекции типовых культур). Если вариант секретируется в питательную среду, вариант можно извлечь непосредственно из среды. Если вариант не секретируется, его можно извлечь из клеточных лизатов.

Вариант можно выявить с использованием способов, известных из уровня техники, которые являются специфическими для вариантов. Эти способы выявления включают без ограничения применение специфичных антител, образование продукта ферментативной реакции или исчезновение субстрата фермента. Например, для определения активности варианта также можно использовать ферментный анализ, такой как анализ, описанный в примерах.

Вариант можно извлечь с использованием способов, известных из уровня техники. Например, вариант можно извлечь из питательной среды с помощью общепринятых процедур, в том числе без ограничения сбора, центрифугирования, фильтрования, экстракции, распылительной сушки, испарения или осаждения.

Вариант можно очистить с помощью ряда процедур, известных из уровня техники, в том числе без ограничения хроматографии (например, ионообменной, аффинной, гидрофобной хроматографии, хроматофокусирования и гель-хроматографии), электрофоретических процедур (например, препаративного изоэлектрического фокусирования), дифференциальной растворимости (например, осаждение сульфатом аммония), SDS-PAGE или экстракции (см., например, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) с получением, по сути, чистых вариантов.

В альтернативном аспекте вариант не извлекают, а вместо этого используют в качестве источника варианта клетку-хозяина по настоящему изобретению, экспрессирующую вариант.

Композиции

Предусмотрены композиции, содержащие полипептид по настоящему изобретению.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к моющей композиции, содержащей вариант исходной липазы, при этом вариант обладает липазной активностью, его последовательность по меньшей мере на 60%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO: 2, и он содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и по меньшей мере одной или нескольким (например, некоторому количеству) из D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T и G38A в SEQ ID NO: 2. В некоторых аспектах композиция дополнительно содержит замены в положениях, соответствующих D27R и/или N33Q в SEQ ID NO: 2.

В некоторых аспектах указанный вариант характеризуется повышенной стабильностью по сравнению с исходной липазой. В некоторых аспектах стабильность представляет собой стабильность в условиях хранения, стабильность в присутствии поверхностно-активных веществ; стабильность в присутствии протеазы, стабильность в присутствии протеазы и поверхностно-активных веществ; стабильность в присутствии компонентов моющего средства; химическую стабильность, стабильность к окислению, pH-стабильность и/или термостабильность. Повышенная стабильность может быть выражена как показатель улучшения периода полужизни (HIF) выше 1, как описано в примере 1. В некоторых аспектах варианты характеризуются HIF выше 1,0; выше 1,5; выше 2,0; выше 2,5; выше 3,0; выше 3,5; выше 4,0; выше 4,5; выше 5,0; выше 5,5 или выше 6,0.

Неограничивающий перечень компонентов композиции, проиллюстрированный далее в данном документе, является пригодным для применения в композициях и способах согласно данному документу, может быть желательно включен в некоторые варианты осуществления настоящего изобретения, например, для того, чтобы способствовать эффективности очищения или повысить таковую для обработки основы, подлежащей очищению, или для модификации эстетических характеристик композиции, как в случае с отдушками, красящими веществами, красителями или подобным. Количества любых таких компонентов, включенных в любые композиции, являются дополнением для любых материалов, упомянутых ранее для включения. Точная природа данных дополнительных компонентов и количества, в которых их включают, будут зависеть от физической формы композиции и природы очищающего процесса, для которого ее применяют. Хотя компоненты, упомянутые ниже, разделены на категории согласно общему названию в соответствии с конкретной функциональной возможностью, это не должно быть истолковано как ограничение, так как компонент может включать дополнительные функциональные возможности, что будет понятно специалисту в данной области.

Если не указано иное, количества в процентах приведены по весу композиции (вес. %). Подходящие материалы компонентов включают без ограничения поверхностно-активные вещества, моющие компоненты, хелатирующие средства, средства, ингибирующие перенос красителя, диспергирующие средства, ферменты и стабилизаторы ферментов, каталитические материалы, активаторы отбеливания, пероксид водорода, источники пероксида водорода, предварительно образованные перкислоты, полимерные диспергирующие средства, средства для удаления глинистых загрязнений/средства против переосаждения, осветлители, подавители образования мыльной пены, красители, оттеночные красители, отдушки, системы доставки отдушки, средства, обеспечивающие эластичность структуры, мягчители тканей, носители, гидротропы, технологические добавки, растворители и/или пигменты. В дополнение к раскрытым выше, подходящие примеры других таких компонентов и уровни применения можно найти в US5576282, US6306812 и US6326348, включенных в данный документ посредством ссылки.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение не содержит один или несколько из следующих вспомогательных материалов: поверхностно-активные вещества, мыла, моющие компоненты, хелатирующие средства, средства, ингибирующие перенос красителя, диспергирующие средства, дополнительные ферменты, стабилизаторы ферментов, каталитические материалы, активаторы отбеливания, пероксид водорода, источники пероксида водорода, предварительно образованные перкислоты, полимерные диспергирующие средства, средства для удаления глинистых загрязнений/средства против переосаждения, осветлители, подавители образования мыльной пены, красители, отдушки, системы доставки отдушки, средства, обеспечивающие эластичность структуры, мягчители тканей, носители, гидротропы, технологические добавки, растворители и/или пигменты. Однако если присутствует один или несколько компонентов, такие один или несколько компонентов могут присутствовать, как подробно описано ниже.

Поверхностно-активные вещества. Композиции по настоящему изобретению могут содержать поверхностно-активное вещество или систему поверхностно-активных веществ, где поверхностно-активное вещество может быть выбрано из неионогенных поверхностно-активных веществ, анионных поверхностно-активных веществ, катионных поверхностно-активных веществ, амфолитических поверхностно-активных веществ, цвиттер-ионных поверхностно-активных веществ, семиполярных неионогенных поверхностно-активных веществ и их смесей. Если поверхностно-активное вещество присутствует, оно, как правило, присутствует в количестве от 0,1 до 60 вес. %, от 0,2 до 40 вес. %, от 0,5 до 30 вес. %, от 1 до 50 вес. %, от 1 до 40 вес. %, от 1 до 30 вес. %, от 1 до 20 вес. %, от 3 до 10 вес. %, от 3 до 5 вес. %, от 5 до 40 вес. %, от 5 до 30 вес. %, от 5 до 15 вес. %, от 3 до 20 вес. %, от 3 до 10 вес. %, от 8 до 12 вес. %, от 10 до 12 вес. %, от 20 до 25 вес. % или от 25-60%.

Подходящие анионные моющие поверхностно-активные вещества включают сульфатные и сульфонатные моющие поверхностно-активные вещества.

Подходящие сульфонатные моющие поверхностно-активные вещества включают аклилбензолсульфонат, в одном аспекте C_10-13алкилбензолсульфонат. Подходящий алкилбензолсульфонат (LAS) можно получить путем сульфирования коммерчески доступного линейного алкилбензола (LAB); подходящий LAB включает низший 2-фенил LAB, например Isochem® или Petrelab®, другие подходящие LAB включают высший 2-фенил LAB, например Hyblene®. Подходящее анионное моющее поверхностно-активное вещество представляет собой алкилбензолсульфонат, полученный путем катализированного процесса DETAL, хотя другие способы синтеза, такие как HF, также могут быть пригодными. В одном аспекте применяют магниевую соль LAS.

Подходящие сульфатные моющие поверхностно-активные вещества включают алкилсульфат, в одном аспекте C_8-18алкилсульфат, или преимущественно C₁₂алкилсульфат.

Другое подходящее сульфатное моющее поверхностно-активное вещество представляет собой алкилалкоксилированный сульфат, в одном аспекте алкилэтоксилированный сульфат, в одном аспекте C_8-18алкилалкоксилированный сульфат, в другом аспекте, C_8-18алкилэтоксилированный сульфат, как правило, алкилалкоксилированный сульфат характеризуется средней степенью алкоксилирования от 0,5 до 20 или от 0,5 до 10, как правило, алкилалкоксилированный сульфат представляет собой C_8-18алкилэтоксилированный сульфат, характеризующийся средней степенью этоксилирования от 0,5 до 10, от 0,5 до 7, от 0,5 до 5 или от 0,5 до 3.

Алкилсульфат, алкилалкоксилированный сульфат и алкилбензолсульфонаты могут быть линейными или разветвленными, замещенными или незамещенными.

Моющее поверхностно-активное вещество может быть разветвленным в середине цепи моющим поверхностно-активным веществом, в одном аспекте разветвленным в середине цепи анионным моющим поверхностно-активным веществом, в одном аспекте разветвленным в середине цепи алкилсульфатом и/или разветвленным в середине цепи алкилбензолсульфонатом, например, разветвленным в середине цепи алкилсульфатом. В одном аспекте разветвления в середине цепи представляют собой C_1-4алкильные группы, как правило, метильные и/или этильные группы.

Неограничивающие примеры анионных поверхностно-активных веществ включают сульфаты и сульфонаты, в частности, линейные алкилбензолсульфонаты (LAS), изомеры LAS, разветвленные алкилбензолсульфонаты (BABS), фенилалкансульфонаты, альфа-олефинсульфонаты (AOS), олефинсульфонаты, алкенсульфонаты, алкан-2,3-диилбис(сульфаты), гидроксиалкансульфонаты и дисульфонаты, алкилсульфаты (AS), такие как додецилсульфат натрия (SDS), сульфаты жирных спиртов (FAS), сульфаты первичных спиртов (PAS), эфирсульфаты спиртов (AES, или AEOS, или FES, также известные как этоксисульфаты спиртов или эфирсульфаты жирных спиртов); вторичные алкансульфонаты (SAS), сульфонаты парафина (PS), сульфонаты сложных эфиров, сложные эфиры глицерина и сульфонированных жирных кислот, метиловые сложные эфиры жирных альфа-сульфокислот (альфа-SFMe или SES), включая сульфонат сложного метилового эфира (MES), алкил- или алкенилянтарную кислоту, додеценил/тетрадеценил янтарную кислоту (DTSA), жирнокислотные производные аминокислот, сложные диэфиры и моноэфиры сульфоянтарной кислоты или мыло и их комбинации.

Подходящие неионные моющие поверхностно-активные вещества выбраны из группы, состоящей из C₈-C₁₈алкилэтоксилатов, таких как NEODOL®; C₆-C₁₂алкилфенолалкоксилатов, где алкоксилатные звенья могут представлять собой этиленокси-звенья, пропиленокси-звенья или их смесь; продуктов реакции конденсации C₁₂-C₁₈спирта и C₆-C₁₂алкилфенола с блок-полимерами этиленоксид/пропиленоксид, такими как Pluronic®; разветвленных в середине цепи C₁₄-C₂₂спиртов; разветвленных в середине цепи C₁₄-C₂₂алкилалкоксилатов, как правило, характеризующихся средней степенью алкоксилирования от 1 до 30; алкилполисахаридов, в одном аспекте алкилполигликозидов; амидов жирных полигидроксикислот; поверхностно-активных веществ на основе блокированного эфиром поли(оксиалкилированного) спирта и их смесей.

Подходящие неионные моющие поверхностно-активные вещества включают алкилполиглюкозид и/или алкилалкоксилированный спирт.

В одном аспекте неионные моющие поверхностно-активные вещества включают алкилалкоксилированные спирты, в одном аспекте C_8-18алкилалкоксилированный спирт, например, C_8-18алкилэтоксилированный спирт, алкилалкоксилированный спирт может характеризоваться средней степенью алкоксилирования от 1 до 50, от 1 до 30, от 1 до 20 или от 1 до 10. В одном аспекте алкилалкоксилированный спирт может представлять собой C_8-18алкилэтоксилированный спирт, характеризующийся средней степенью этоксилирования от 1 до 10, от 1 до 7, более от 1 до 5 или от 3 до 7. Алкилалкоксилированный спирт может быть линейным или разветвленным и замещенным или незамещенным. Подходящие неионогенные поверхностно-активные вещества включают Lutensol®.

Неограничивающие примеры неионогенных поверхностно-активных веществ включают этоксилаты спирта (AE или AEO), пропоксилаты спирта, пропоксилированные жирные спирты (PFA), алкоксилированные алкиловые сложные эфиры жирной кислоты, например этоксилированные и/или пропоксилированные алкиловые сложные эфиры жирной кислоты, алкилфенолэтоксилаты (APE), нонилфенолэтоксилаты (NPE), алкилполигликозиды (APG), алкоксилированные амины, моноэтаноламиды жирной кислоты (FAM), диэтаноламиды жирной кислоты (FADA), этоксилированные моноэтаноламиды жирной кислоты (EFAM), пропоксилированные моноэтаноламиды жирной кислоты (PFAM), амиды жирной полигидроксиалкилкислоты или N-ацил-N-алкил-производные глюкозамина (глюкамиды, GA или глюкамиды жирной кислоты, FAGA), а также продукты, доступные под торговыми названиями SPAN и TWEEN, и их комбинации.

Подходящие катионные моющие поверхностно-активные вещества включают соединения алкилпиридиния, алкильные соединения четвертичного аммония, алкильные соединения четвертичного фосфония, алкильные соединения третичного сульфония и их смеси.

Подходящие катионные моющие поверхностно-активные вещества представляют собой соединения четвертичного аммония, имеющие общую формулу (R)(R₁)(R₂)(R₃)N⁺ X^-, где R представляет собой линейный или разветвленный, замещенный или незамещенный C_6-18алкильный или алкенильный фрагмент, R₁ и R₂ независимо выбраны из метильного или этильного фрагментов, R₃ представляет собой гидроксильный, гидроксиметильный или гидроксиэтильный фрагмент, X представляет собой анион, который обеспечивает нейтральный заряд, подходящие анионы включают галиды, например хлорид; сульфат и сульфонат. Подходящие катионные моющие поверхностно-активные вещества представляют собой хлориды моно-C_6-18алкил-моно-гидроксиэтил-ди-метил-четвертичного аммония. Наиболее подходящие катионные моющие поверхностно-активные вещества представляют собой хлорид моно-C_8-10алкил-моно-гидроксиэтил-ди-метил-четвертичного аммония, хлорид моно-C_10-12алкил-моно-гидроксиэтил-ди-метил-четвертичного аммония и хлорид моно-C₁₀алкил-моно-гидроксиэтил-ди-метилчетвертичного аммония.

Неограничивающие примеры катионных поверхностно-активных веществ включают четвертичный алкилдиметилэтаноламин (ADMEAQ), цетилтриметиламмония бромид (CTAB), диметилдистеариламмония хлорид (DSDMAC) и алкилбензилдиметиламмоний, алкильные соединения четвертичного аммония, соединения алкоксилированного четвертичного аммония (AQA), сложный эфир четвертичных аммониевых соединений и их комбинации.

Подходящие амфотерные/цвиттер-ионные поверхностно-активные вещества включают аминоксиды и бетаины, такие как алкилдиметилбетаины, сульфобетаины или их комбинации. Нейтрализованные амином анионные поверхностно-активные вещества - анионные поверхностно-активные вещества по настоящему изобретению и вспомогательные анионные вторичные поверхностно-активные вещества, могут существовать в кислой форме, и указанную кислую форму можно нейтрализовать с образованием соли поверхностно-активного вещества, которая является необходимой для применения в моющих композициях по настоящему изобретению. Типичные средства для нейтрализации включают основание на основе противоиона металла, например гидроксиды, такие как NaOH или KOH. Дополнительные предпочтительные средства для нейтрализации анионных поверхностно-активных веществ по настоящему изобретению и вспомогательные анионные поверхностно-активные вещества или вторичные поверхностно-активные вещества в их кислых формах включают аммиак, амины или алканоламины. Алканоламины являются предпочтительными. Подходящие неограничивающие примеры включают моноэтаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин и другие линейные или разветвленные алканоламины, известные из уровня техники; например, наиболее предпочтительные алканоламины включают 2-амино-1-пропанол, 1-аминопропанол, моноизопропаноламин или 1-амино-3-пропанол. Нейтрализацию амином можно осуществлять в полной мере или частично, например, часть смеси анионных поверхностно-активных веществ можно нейтрализовать натрием или калием, а часть смеси анионных поверхностно-активных веществ можно нейтрализовать аминами или алканоламинами.

Неограничивающие примеры семиполярных поверхностно-активных веществ включают аминоксиды (AO), такие как алкилдиметиламиноксид.

Системы поверхностно-активных веществ, содержащие смеси одного или нескольких анионных и в дополнение к ним одного или нескольких неионогенных поверхностно-активных веществ необязательно с дополнительным поверхностно-активным веществом, таким как катионное поверхностно-активное вещество, могут быть предпочтительными. Предпочтительные весовые соотношения анионного поверхностно-активного вещества и неионогенного поверхностно-активного вещества составляют по меньшей мере 2:1 или по меньшей мере от 1:1 до 1:10.

В одном аспекте система поверхностно-активных веществ может содержать смесь изопреноидных поверхностно-активных веществ, представленных формулой A и формулой B:

где Y представляет собой CH2 или отсутствует, и Z может быть выбран таким образом, что полученное в результате поверхностно-активное вещество выбрано из следующих поверхностно-активных веществ: алкилкарбоксилатного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе полиалкокси-соединения, алкильного анионного полиалкоксисульфатного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сульфоната сложного эфира глицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе диметиламинооксида, алкильного поверхностно-активного вещества на основе полигидрокси-соединения, алкильного поверхностно-активного вещества на основе фосфатного сложного эфира, алкилглицеринсульфонатного поверхностно-активного вещества, алкильного полиглюконатного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе полифосфатного сложного эфира, алкилфосфонатного поверхностно-активного вещества, алкильного полигликозидного поверхностно-активного вещества, алкильного моногликозидного поверхностно-активного вещества, алкильного дикликозидного поверхностно-активного вещества, алкильного сульфосукцинатного поверхностно-активного вещества, алкильного дисульфатного поверхностно-активного вещества, алкильного дисульфонатного поверхностно-активного вещества, алкильного сульфосукцинаматного поверхностно-активного вещества, алкильного глюкамидного поверхностно-активного вещества, алкильного тауринатного поверхностно-активного вещества, алкильного саркозинатного поверхностно-активного вещества, алкильного глицинатного поверхностно-активного вещества, алкильного изотионатного поверхностно-активного вещества, алкильного диалканоламидного поверхностно-активного вещества, алкильного моноалканоламидного поверхностно-активного вещества, алкильного моноалканоламидсульфатного поверхностно-активного вещества, алкильного дигликоль-амидного поверхностно-активного вещества, алкильного дигликоль-амидсульфатного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сложного эфира глицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сульфата сложного эфира глицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе эфира глицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сульфата эфира глицерина, поверхностно-активного вещества на основе сульфоната алкилметильного сложного эфира, алкильного поверхностно-активного вещества на основе эфира полиглицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сульфата эфира полиглицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сложного эфира сорбитана, алкильного поверхностно-активного вещества на основе аммониоалкансульфоната, алкильного поверхностно-активного вещества на основе амидопропилбетаина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе аллилированного четвертичного аммониевого соединения, алкильного поверхностно-активного вещества на основе моногидроксиалкил-диалкилированного четвертичного аммониевого соединения, алкильного поверхностно-активного вещества на основе дигидроксиалкилмоноалкильного четвертичного аммониевого соединения, поверхностно-активного вещества на основе алкилированного четвертичного соединения аммония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе триметиламмониевого четвертичного соединения аммония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе полигидроксалкилоксипропильного четвертичного соединения аммония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе четвертичного соединения аммония сложного эфира глицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе четвертичного соединения аммония гликольамина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе монометилдигидроксиэтил-четвертичного аммония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе диметилмоногидроксиэтил-четвертичного аммония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе триметиламмония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе имидазолина, алкен-2-ил-сукцинатного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе a-сульфонированной карбоновой кислоты, алкильного поверхностно-активного вещества на основе алкильного сложного эфира a-сульфонированной карбоновой кислоты, альфа-олефинсульфонатного поверхностно-активного вещества, алкилфенолэтоксилатного поверхностно-активного вещества, алкилбензолсульфонатного поверхностно-активного вещества, поверхностно-активного вещества на основе алкилсульфобетаина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе гидроксисульфобетаина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе аммониокарбоксилатбетаина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сложного эфира сахарозы, алкильного алканоламидного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе ди(полиоксиэтилен)моноалкиламмония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе моно(полиоксиэтилен)диалкиламмония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе бензилдиметиламмония, алкиламинопропионатного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе амидопропилдиметиламина или их смеси; и если Z представляет собой заряженный фрагмент, то заряд Z уравновешен зарядом подходящего металла или органического противоиона. Подходящие противоионы включают противоионы металлов, амин или алканоламин, например, C1-C6алканоламмоний. Более конкретно, подходящие противоионы включают Na+, Ca+, Li+, K+, Mg+, например, моноэтаноламин (MEA), диэтаноламин (DEA), триэтаноламин (TEA), 2-амино-l-пропанол, 1-аминопропанол, метилдиэтаноламин, диметилэтаноламин, моноизопропаноламин, триизопропаноламин, l-амино-3-пропанол или их смеси. В одном варианте осуществления композиции содержат от 5% до 97% одного или нескольких неизопреноидных поверхностно-активных веществ и одной или нескольких вспомогательных очищающих добавок; причем весовое соотношение поверхностно-активного вещества формулы A и поверхностно-активного вещества формулы B составляет от 50:50 до 95:5.

Мыло. Композиции согласно данному документу могут содержать мыло. Не вдаваясь в теорию, может быть необходимо включить мыло, поскольку оно действует отчасти как поверхностно-активное вещество, а отчасти как моющий компонент и может быть пригодным для гашения пены и, кроме того, может благоприятно взаимодействовать с различными катионными соединениями композиции для повышения мягкости текстильного изделия, обработанного композициями по настоящему изобретению. Может быть применено любое мыло, известное из уровня техники для применения в стиральных порошках. В одном варианте осуществления композиции содержат от 0 вес. % до 20 вес. %, от 0,5 вес. % до 20 вес. %, от 4 вес. % до 10 вес. % или от 4 вес. % до 7 вес. % мыла.

Примеры мыла, пригодные согласно данному документу, включают мыла олеиновой кислоты, мыла пальмитиновой кислоты, мыла на основе жирных кислот пальмового ядра и их смеси. Типичные мыла представлены в форме смесей мыл жирной кислоты, характеризующихся разными длинами цепей и степенями замещения. Одна такая смесь представляет собой лишенную легких фракций жирную кислоту пальмового ядра.

В одном варианте осуществления мыло выбрано из свободной жирной кислоты. Подходящие жирные кислоты являются насыщенными и/или ненасыщенными и могут быть получены из природных источников, например сложных эфиров растительного или животного происхождения (например, масла пальмового ядра, пальмового масла, кокосового масло, масла бабассу, сафлорового масла, таллового масла, касторового масла, животного и рыбьего жира, топленого животного жира и их смесей), или получены синтетически (например, посредством окисления нефти или путем гидрирования монооксида углерода с помощью способа Фишера-Тропша).

Примеры подходящих насыщенных жирных кислот для применения в композициях по настоящему изобретению включают каприновую, лауриновую, миристиновую, пальмитиновую, стеариновую, арахиновую и бегеновую кислоту. Подходящие виды ненасыщенных жирных кислот включают пальмитолеиновую, олеиновую, линолевую, линоленовую и рицинолевую кислоту. Примерами предпочтительных жирных кислот являются насыщенная Cn-жирная кислота, насыщенные Ci₂-Ci₄-жирные кислоты и насыщенные или ненасыщенные Cn-Ci₈-жирные кислоты и их смеси.

Весовое соотношение смягчающего ткань катионного вторичного поверхностно-активного вещества и жирной кислоты, если они присутствуют, составляет предпочтительно от приблизительно 1:3 до приблизительно 3: 1, более предпочтительно от приблизительно 1:1,5 до приблизительно 1.5:1, наиболее предпочтительно приблизительно 1:1.

Количества мыла и немыльных анионных поверхностно-активных веществ согласно данному документу представляют собой проценты по весу моющей композиции, определенные на основе кислой формы. Однако, как обычно понимают в данной области, анионные поверхностно-активные вещества и мыла на практике нейтрализуют с использованием оснований натрия, калия или алканоламмония, например гидроксида натрия или моноэтаноламина.

Гидротропы. Композиции по настоящему изобретению могут содержать один или несколько гидротропов. Гидротроп представляет собой соединение, которое солюбилизирует гидрофобные соединения в водных растворах (или, в противоположном случае, полярные соединения в неполярном окружении). Как правило, гидротропы имеют как гидрофобный, так и гидрофильный характер (так называемые амфифильные свойства, которые известны у поверхностно-активных веществ); тем не менее, молекулярная структура гидротропов обычно не способствует спонтанной аутоагрегации, см., например, обзор в Hodgdon and Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. У гидротропов не проявляется критическая концентрация, выше которой происходит аутоагрегация, что обнаруживается у поверхностно-активных веществ и липидов, образующих мицеллярные, ламеллярные или другие хорошо определенные мезофазы. Между тем у многих гидротропов наблюдается процесс агрегации непрерывного типа, при этом размеры агрегатов растут по мере увеличения концентрации. Тем не менее, многие гидротропы изменяют фазовое поведение, стабильность и коллоидные свойства систем, содержащих вещества полярного и неполярного характера, в том числе смеси воды, масла, поверхностно-активных веществ и полимеров. Гидротропы обычно применяют в отраслях, начиная от фармацевтики, личной гигиены, пищевой промышленности и заканчивая применениями в технике. Применение гидротропов в моющих композициях дает, например, более концентрированные составы поверхностно-активных веществ (например, в процессе уплотнения жидких моющих средств путем удаления воды), не вызывая нежелательные явления, такие как разделение фаз или высокая вязкость.

Моющее средство может содержать от 0 до 10 вес. %, например от 0 до 5 вес. %, от 0,5 до 5 вес. % или от 3% до 5 вес. % гидротропа. Для применения в моющих средствах можно применять любой гидротроп, известный в данной области техники. Неограничивающие примеры гидротропов включают бензолсульфонат натрия, п-толуолсульфонат натрия (STS), ксилолсульфонат натрия (SXS), кумолсульфонат натрия (SCS), цимолсульфонат натрия, аминоксиды, спирты и полигликолевые эфиры, гидроксинафтоат натрия, гидроксинафталинсульфонат натрия, этилгексилсульфат натрия и их комбинации.

Моющие компоненты. Композиции по настоящему изобретению могут содержать один или несколько моющих компонентов, вспомогательных моющих компонентов, системы моющих компонентов или их смесь. Если применяют моющий компонент, очищающая композиция, как правило, будет содержать от 0 до 65 вес. %, по меньшей мере 1 вес. %, от 2 до 60 вес. % или от 5 до 10 вес. % моющего компонента. В очищающей композиции для мытья посуды количество моющего компонента, как правило, составляет от 40 до 65 вес. % или от 50 до 65 вес. %. Композиция может, по сути, не содержать моющий компонент; "по сути не содержит" означает "намеренно не добавлен" цеолит и/или фосфат. Типичные цеолитные моющие компоненты включают цеолит A, цеолит P и цеолит MAP. Типичный фосфатный моющий компонент представляет собой триполифосфат натрия.

Моющий компонент и/или вспомогательный моющий компонент могут представлять собой, в частности, хелатирующее средство, которое образует растворимые в воде комплексы с Ca и Mg. Можно применять любой моющий компонент и/или вспомогательный моющий компонент, известные из уровня техники для применения в моющих средствах. Неограничивающие примеры моющих компонентов включают цеолиты, дифосфаты (пирофосфаты), трифосфаты, такие как трифосфат натрия (STP или STPP), карбонаты, такие как карбонат натрия, растворимые силикаты, такие как метасиликат натрия, слоистые силикаты (например, SKS-6 от Hoechst), этаноламины, такие как 2-аминоэтан-1-ол (MEA), иминодиэтанол (DEA) и 2,2',2"-нитрилотриэтанол (TEA), и карбоксиметилинулин (CMI) и их комбинации.

Очищающая композиция может включать вспомогательный моющий компонент отдельно или в комбинации с моющим компонентом, например, цеолитным моющим компонентом. Неограничивающие примеры моющих компонентов включают гомополимеры полиакрилатов или их сополимеры, такие как поли(акриловая кислота) (PAA) или сополимер акриловой кислоты/малеиновой кислоты (PAA/PMA). Дополнительные неограничивающие примеры включают цитрат, хелатирующие средства, такие как аминокарбоксилаты, аминополикарбоксилаты, а также фосфонаты и алкил- или алкенилянтарную кислоту. Дополнительные конкретные примеры включают 2,2',2"-нитрилотриуксусную кислоту (NTA), этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), иминодиянтарую кислоту (IDS), этилендиамин-N,N'-диянтарную кислоту (EDDS), метилглициндиуксусную кислоту (MGDA), глутамовую кислоту-N,N-диуксусную кислоту (GLDA), 1-гидроксиэтан-1,1-диилбис(фосфоновую кислоту) (HEDP), этилендиаминтетракис(метилен)тетракис(фосфоновую кислоту) (EDTMPA), диэтилентриаминпентакис(метилен)пентакис(фосфоновую кислоту) (DTPMPA), N-(2-гидроксиэтил)иминодиуксусную кислоту (EDG), аспарагиновую кислоту-N-моноуксусную кислоту (ASMA), аспарагиновую кислоту-N,N-диуксусную кислоту (ASDA), аспарагиновую кислоту-N-монопропионовую кислоту (ASMP), иминодиянтарную кислоту (IDA), N-(2-сульфометил)-аспарагиновую кислоту (SMAS), N-(2-сульфоэтил)аспарагиновую кислоту (SEAS), N-(2-сульфометил)-глутаминовую кислоту (SMGL), N-(2-сульфоэтил) глутаминовую кислоту (SEGL), N-метилиминодиуксусную кислоту (MIDA), α-аланин-N,N-диуксусную кислоту (α-ALDA), серин-N,N-диуксусную кислоту (SEDA), изосерин-N,N-диуксусную кислоту (ISDA), фенилаланин-N,N-диуксусную кислоту (PHDA), антраниловую кислоту-N,N-диуксусную кислоту (ANDA), сульфаниловую кислоту-N,N-диуксусную кислоту (SLDA), таурин-N, N-диуксусную кислоту (TUDA) и сульфометил-N,N-диуксусную кислоту (SMDA), N-(гидроксиэтил)-этилидендиаминтриацетат (HEDTA), диэтанолглицин (DEG), диэтилентриамин-пента-(метиленфосфоновую кислоту) (DTPMP), аминотрис(метиленфосфоновую кислоту) (ATMP) и их комбинации и соли. Дополнительные иллюстративные моющие компоненты и/или вспомогательные моющие компоненты описаны, например, в WO09/102854, US5977053.

Хелатирующие средства и ингибиторы роста кристаллов. Композиции согласно данному документу могут содержать хелатирующее средство и/или ингибитор роста кристаллов. Подходящие молекулы включают хелатирующие средства на основе меди, железа и/или марганца и их смеси. Подходящие молекулы включают DTPA (диэтилентриаминпентауксусную кислоту), HEDP (гидроксиэтандифосфоновую кислоту), DTPMP (диэтилентриаминпента(метиленфосфоновую кислоту)), гидрат динатриевой соли 1,2-дигидроксибензол-3,5-дисульфоновой кислоты, этилендиамин, диэтилентриамин, этилендиаминдиянтарную кислоту (EDDS), N-гидроксиэтилэтилендиаминтриуксусную кислоту (HEDTA), триэтилентетраамингексауксусную кислоту (TTHA), N-гидроксиэтилиминодиуксусную кислоту (HEIDA), дигидроксиэтилглицин (DHEG), этилендиаминтетрапропионовую кислоту (EDTP), карбоксиметилинулин и 2-фосфонобутан-1,2,4-трикарбоновую кислоту (Bayhibit® AM) и их производные. Как правило, композиция может содержать от 0,005 до 15 вес. % или от 3,0 до 10 вес. % хелатирующего средства или ингибитора роста кристаллов.

Отбеливающий компонент. Отбеливающий компонент, подходящий для включения в способы и композиции по настоящему изобретению, включает один или смесь более чем одного отбеливающего компонента. Подходящие отбеливающие компоненты включают катализаторы отбеливания, фотоотбеливатели, активаторы отбеливания, пероксид водорода, источники пероксида водорода, предварительно образованные перкислоты и их смеси. В общем, если применяют отбеливающий компонент, композиции по настоящему изобретению могут содержать от 0 до 30 вес. %, от 0,00001 до 90 вес. %, от 0,0001 до 50 вес. %, от 0,001 до 25 вес. % или от 1 до 20 вес. %. Примеры подходящих отбеливающих компонентов включают

(1) предварительно образованные перкислоты: подходящие предварительно образованные перкислоты включают без ограничения соединения, выбранные из группы, состоящей из предварительно образованных пероксикислот или их солей, как правило, либо пероксикарбоновую кислоту или ее соль, либо пероксисульфоновую кислоту или ее соль.

Предварительно образованная пероксикислота или ее соль предпочтительно представляют собой пероксикарбоновую кислоту или ее соль, как правило, имеющую химическую структуру, соответствующую следующей химической формуле:

где R¹⁴ выбран из алкила, аралкила, циклоалкила, арила или гетероциклических групп; группа R¹⁴ может быть линейной или разветвленной, замещенной или незамещенной; и Y представляет собой любой подходящий противоион, который обеспечивает нейтральный электрический заряд, предпочтительно Y выбран из водорода, натрия или калия. Предпочтительно R¹⁴ представляет собой линейный или разветвленный, замещенный или незамещенный C_6-9алкил. Предпочтительно пероксикислота или ее соль выбрана из пероксигексановой кислоты, пероксигептановой кислоты, пероксиокстановой кислоты, пероксинонановой кислоты, пероксидекановой кислоты, любой их соли или любой их комбинации. Особенно предпочтительными пероксикислотами являются фталимидо-перокси-алкановые кислоты, в частности, ε-фталимидо-перокси-гексановая кислота (PAP). Предпочтительно пероксикислота или ее соль характеризуется точкой плавления в диапазоне от 30^oC до 60^oC.

Предварительно образованная пероксикислота или ее соль также могут представлять собой пероксисульфоновую кислоту или ее соль, как правило, имеющую химическую структуру, соответствующую следующей химической формуле:

где R¹⁵ выбран из алкила, аралкила, циклоалкила, арила или гетероциклических групп; группа R¹⁵ может быть линейной или разветвленной, замещенной или незамещенной; и Z представляет собой любой подходящий противоион, который обеспечивает нейтральный электрический заряд, предпочтительно Z выбран из водорода, натрия или калия. Предпочтительно R¹⁵ представляет собой линейный или разветвленный, замещенный или незамещенный C_6-9алкил. Предпочтительно такие отбеливающие компоненты могут присутствовать в композициях по настоящему изобретению в количестве от 0,01 до 50 вес. % или от 0,1 до 20 вес. %.

(2) Источники пероксида водорода включают, например, неорганические пергидратные соли, в том числе соли щелочных металлов, например натриевые соли пербората (обычно моно- или тетра-гидраты), перкарбонатные, персульфатные, перфосфатные, персиликатные соли и их смеси. В одном аспекте настоящего изобретения неорганические пергидратные соли, например соли, выбранные из группы, состоящей из натриевых солей пербората, перкарбоната и их смесей. При использовании неорганические пергидратные соли, как правило, присутствуют в количестве от 0,05 до 40 вес. % или от 1 до 30 вес. % от общей композиции и их, как правило, вводят в такие композиции в виде кристаллического твердого вещества, на которое может быть нанесено покрытие. Подходящие покрытия включают неорганические соли, такие как силикат щелочного металла, карбонатные или боратные соли или их смеси, или органические материалы, такие как растворимые в воде или диспергируемые полимеры, воски, масла или жирные мыла. Предпочтительно такие отбеливающие компоненты могут присутствовать в композициях по настоящему изобретению в количестве от 0,01 до 50 вес. % или от 0,1 до 20 вес. %.

(3) Под выражением "активатор отбеливания" в данном документе понимают соединение, которое реагирует с пероксидом водорода с образованием перкислоты посредством пергидролиза. Перкислота, полученная таким образом, представляет собой активированный отбеливатель. Подходящие активаторы отбеливания для применения согласно данному документу включают активаторы, принадлежащие к классу сложных эфиров, амидов, имидов или ангидридов. Подходящими активаторами отбеливания являются активаторы, содержащие R-(C=O)-L, где R представляет собой алкильную группу, необязательно разветвленную, имеющую, если активатор отбеливания является гидрофобным, от 6 до 14 атомов углерода или от 8 до 12 атомов углерода и, если активатор отбеливания является гидрофильным, менее 6 атомов углерода или менее 4 атомов углерода; а L представляет собой уходящую группу. Примерами подходящих уходящих групп являются бензойная кислота и ее производные, в частности, бензолсульфонат. Подходящие активаторы отбеливания включают додеканоилоксибензолсульфонат, деканоилоксибензолсульфонат, деканоилоксибензойную кислоту или ее соли, 3,5,5-триметилгексаноилоксибензолсульфонат, тетраaцетилэтилендиамин (TAED), 4-[(3,5,5-триметилгексаноил)окси]бензол-1-сульфонат натрия (ISONOBS), 4-(додеканоилокси)бензол-1-сульфонат (LOBS), 4-(деканоилокси)бензол-1-сульфонат, 4-(деканоилокси)бензоат (DOBS или DOBA), 4-(нонаноилокси)бензол-1-сульфонат (NOBS) и/или активаторы, раскрытые в WO98/17767. Семейство активаторов отбеливания раскрыто в EP624154, и наиболее предпочтительным в данном семействе является aцетилтриэтилцитрат (ATC). Преимущество ATC или короткоцепочечного триглицерида, такого как триацетин, заключается в том, что он является экологически безопасным. Кроме того, aцетилтриэтилцитрат и триацетин имеют хорошую гидролитическую стабильность в продукте при хранении и являются эффективными активаторами отбеливания. Наконец, ATC является многофункциональным, поскольку цитрат, высвобождаемый в ходе реакции пергидролиза, может действовать в качестве моющего компонента. Альтернативно, отбеливающая система может содержать пероксикислоты, например, амидного, имидного или сульфонового типа. Отбеливающая система может дополнительно содержать перкислоты, такие как 6-(фталимидо)пероксигексановая кислота (PAP). Подходящие активаторы отбеливания также раскрыты в WO98/17767. Поскольку можно использовать любой активатор отбеливания, в одном аспекте настоящего изобретения очищающая композиция по настоящему изобретению может содержать NOBS, TAED или их смеси. Перкислота и/или активатор отбеливания, если они присутствуют, как правило, присутствуют в композиции в количестве от 0,1 до 60 вес. %, от 0,5 до 40 вес. % или от 0,6 до 10 вес. % по весу ткани и композиции для ухода за домом. Одну или несколько гидрофобных перкислот или их предшественников можно применять в комбинации с одним или несколькими гидрофильными перкислотами или их предшественниками. Предпочтительно такие отбеливающие компоненты могут присутствовать в композициях по настоящему изобретению в количестве от 0,01 до 50 вес. % или от 0,1 до 20 вес. %.

Количества источника пероксида водорода и перкислоты или активатора отбеливания могут быть выбраны таким образом, что молярное отношение доступного кислорода (из источника пероксида) к перкислоте составляет от 1:1 до 35:1 или даже от 2:1 до 10:1.

(4) Диацилпероксиды. Предпочтительные диацилпероксидные виды отбеливающих средств включают диацилпероксиды, выбранные из диацилпероксидов общей формулы R¹-C(O)-OO-(O)C-R², в которой R¹ представляет собой C₆-C₁₈алкильную, предпочтительно C₆-C₁₂алкильную группу, содержащую линейную цепь по меньшей мере из 5 атомов углерода и необязательно содержащую один или несколько заместителей (например, –N⁺ (CH₃)₃, -COOH или -CN) и/или один или несколько прерывающих фрагментов (например, -CONH- или -CH=CH-), вставленных между соседними атомами углерода алкильного радикала, а R² представляет собой алифатическую группу, совместимую с пероксидным фрагментом, таким образом, что R¹ и R² вместе содержат в общем от 8 до 30 атомов углерода. В одном предпочтительном аспекте R¹ и R² представляют собой линейные незамещенные C₆-C₁₂алкильные цепи. Наиболее предпочтительно R¹ и R² являются идентичными. Диацилпероксиды, в которых и R¹, и R² представляют собой C₆-C₁₂алкильные группы, являются особенно предпочтительными. Предпочтительно по меньшей мере одна из, наиболее предпочтительно только одна из R-групп (R₁ или R₂) не содержит разветвлений или боковых колец в альфа-положении, или предпочтительно ни в альфа-положении, ни в бета-положении, или наиболее предпочтительно ни в одном из альфа-, или бета-, или гамма-положений. В одном следующем предпочтительном варианте осуществления DAP может быть асимметричным, так что предпочтительно гидролиз R1-ацильной группы является быстрым с образованием перкислот, но гидролиз R2-ацильной группы является медленным.

Тетраацилпероксидные виды отбеливающих средств предпочтительно выбраны из тетраацилпероксидов общей формулы R³-C(O)-OO-C(O)-(CH2)n-C(O)-OO-C(O)-R³, в которой R³ представляет собой C₁-C₉алкил или C₃-C₇группу, а n представляет собой целое число от 2 до 12 или от 4 до 10 включительно.

Предпочтительно диацилпероксидный и/или тетраацилпероксидный вид отбеливающих средств присутствует в количестве, достаточном для обеспечения по меньшей мере 0,5 ppm, по меньшей мере 10 ppm или по меньшей мере 50 ppm по весу моющего раствора. В предпочтительном варианте осуществления вид отбеливающего средства присутствует в количестве, достаточном для обеспечения от 0,5 до 300 ppm, от 30 до 150 ppm по весу моющего раствора.

Предпочтительно отбеливающий компонент содержит катализатор отбеливания (5 и 6).

(5) Предпочтительными являются органические (неметаллические) катализаторы отбеливания, включающие катализатор отбеливания, способный принимать атом кислорода от пероксикислоты и/или ее соли и переносить атом кислорода к окисляемому субстрату. Подходящие катализаторы отбеливания включают без ограничения иминиевые катионы и полиионы; иминиевые цвиттерионы; модифицированные амины; модифицированные аминоксиды; N-сульфонилимины; N-фосфонилимины; N-ацилимины; тиадиазолдиоксиды; перфторимины; циклические кетосахара и их смеси.

Подходящие иминиевые катионы и полиионы включают без ограничения тетрафторборат N-метил-3,4-дигидроизохинолиния, полученный как описано в Tetrahedron (1992), 49(2), 423-38 (например, соединение 4, стр. 433); п-толуолсульфонат N-метил-3,4-дигидроизохинолиния, полученный как описано в US5360569 (например, колонка 11, пример 1); и п-толуолсульфонат N-октил-3,4-дигидроизохинолиния, полученный как описано в US5360568 (например, колонка 10, прим. 3).

Подходящие иминиевые цвиттерионы включают без ограничения N-(3-сульфопропил)-3,4-дигидроизохинолиний, внутреннюю соль, полученную как описано в US5576282 (например, колонка 31, прим. II); N-[2-(сульфоокси)додецил]-3,4-дигидроизохинолиний, внутреннюю соль, полученную как описано в US5817614 (например, колонка 32, прим. V); 2-[3-[(2-этилгексил)окси]-2-(сульфоокси)пропил]-3,4-дигидроизохинолиний, внутреннюю соль, полученную как описано в WO05/047264 (например, стр. 18, прим. 8) и 2-[3-[(2-бутилоктил)окси]-2-(сульфоокси)пропил]-3,4-дигидроизохинолиний, внутреннюю соль.

Подходящие модифицированные аминные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения 1,2,3,4-тетрагидро-2-метил-1-изохинолинол, который может быть получен в соответствием с процедурами, описанными в Tetrahedron Letters (1987), 28(48), 6061-6064. Подходящие модифицированные аминоксидные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения натрия 1-гидрокси-N-окси-N-[2-(сульфоокси)децил]-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин.

Подходящие N-сульфонилиминные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения 3-метил-1,2-бензизотиазол-1,1-диоксид, полученный в соответствии с процедурой, описанной в Journal of Organic Chemistry (1990), 55(4), 1254-61.

Подходящие N-фосфонилиминные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения [R-(E)]-N-[(2-хлор-5-нитрофенил)метилен]-P-фенил-P-(2,4,6-триметилфенил)-фосфиновый амид, который можно получить в соответствии с процедурами, описанными в Journal of the Chemical Society, Chemical Communications (1994), (22), 2569-70.

Подходящие N-ацилиминные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения [N(E)]-N-(фенилметилен)ацетамид, который можно получить в соответствии с процедурами, описанными в Polish Journal of Chemistry (2003), 77(5), 577-590.

Подходящие тиадиазолдиоксидные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения 3-метил-4-фенил-1,2,5-тиадиазол-1,1-диоксид, который можно получить в соответствии с процедурами, описанными в US5753599 (колонка 9, прим. 2).

Подходящие перфториминные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения (Z)-2,2,3,3,4,4,4-гептафтор-N-(нонафторбутил)бутанимидоилфторид, который можно получить в соответствии с процедурами, описанными в Tetrahedron Letters (1994), 35(34), 6329-30.

Подходящие циклические катализаторы переноса кислорода на основе кетосахаров включают без ограничения 1,2:4,5-ди-O-изопропилиден-D-эритро-2,3-гексодиуро-2,6-пиранозу, полученную как описано в US6649085 (колонка 12, прим. 1).

Предпочтительно катализатор отбеливания содержит иминиевую и/или карбонильную функциональную группу и, как правило, способен к образованию оксазиридиниевой и/или диоксирановой функциональной группы при принятии атома кислорода, в частности, при принятии атома кислорода из пероксикислоты и/или ее соли. Предпочтительно катализатор отбеливания содержит оксазиридиниевую функциональную группу и/или способен к образованию оказиридиниевой функциональной группы при принятии атома кислорода, в частности, при принятии атома кислорода из пероксикислоты и/или ее соли. Предпочтительно катализатор отбеливания содержит циклическую иминиевую функциональную группу, причем предпочтительно циклический фрагмент имеет размер кольца от пяти до восьми атомов (включая атом азота), предпочтительно шесть атомов. Предпочтительно катализатор отбеливания содержит арилиминиевую функциональную группу, предпочтительно би-циклическую арилиминиевую функциональную группу, предпочтительно 3,4-дигидроизохинолиниевую функциональную группу. Как правило, иминная функциональная группа представляет собой четвертичную иминную функциональную группу и, как правило, способна к образованию четвертичной оксазиридиниевой функциональной группы при принятии атома кислорода, в частности, при принятии атома кислорода из пероксикислоты и/или ее соли. В другом аспекте моющая композиция содержит отбеливающий компонент, имеющий logP_o/w не более 0, не более -0,5, не более -1,0, не более -1,5, не более -2,0, не более -2,5, не более -3,0 или не более -3,5. Способ определения logP_o/w более подробно описан ниже.

Как правило, отбеливающий ингредиент способен к образованию видов отбеливающих средств, имеющих X_SO от 0,01 до 0,30, от 0,05 до 0,25 или от 0,10 до 0,20. Способ определения X_SO более подробно описан ниже. Например, отбеливающие ингредиенты, имеющие структуру изохинолиния, способны к образованию видов отбеливающих средств, которые имеют структуру оксазиридиния. В данном примере X_SO соответствует оксазиридиниевым видам отбеливающих средств.

Предпочтительно катализатор отбеливания имеет химическую структуру, соответствующую следующей химической формуле:

где n и m независимо равны от 0 до 4, предпочтительно n и m оба равны 0; каждый R¹ независимо выбран из замещенного или незамещенного радикала, выбранного из группы, состоящей из водорода, алкила, циклоалкила, арила, конденсированного арила, гетероциклического кольца, конденсированного гетероциклического кольца, нитро, галогено, циано, сульфонато, алкокси, кето, карбонового и карбоалкокси радикалов; и любые два заместителя R¹, присоединенные к соседним атомам, могут объединяться с образованием конденсированного арила, конденсированного карбоциклического или конденсированного гетероциклического кольца; каждый R² независимо выбран из замещенного или незамещенного радикала, независимо выбранного из группы, состоящей из водорода, гидрокси, алкила, циклоалкила, алкарила, арила, аралкила, алкиленов, гетероциклического кольца, алкоксигрупп, арилкарбонильных групп, карбоксиалкильных групп и амидных групп; любой R² может быть соединен вместе с любым другим R² с образованием части общего кольца; любые R², присоединенные к одному и тому же атому, могут объединяться с образованием карбонила; и любые два R² могут объединяться с образованием замещенного или незамещенного конденсированного ненасыщенного фрагмента; R³ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₀алкил; R⁴ представляет собой водород или фрагмент Q_t-A, где Q представляет собой разветвленный или неразветвленный алкилен, t = 0 или 1, и A представляет собой анионную группу, выбранную из группы, состоящей из OSO₃^-, SO₃^-, CO₂^-, OCO₂^-, OPO₃^2-, OPO₃H^- и OPO₂^-; R⁵ представляет собой водород или фрагмент -CR¹¹R¹²-Y-G_b-Y_c-[(CR⁹R¹⁰)_y-O]_k-R⁸, где каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из O, S, N-H или N-R⁸; и каждый R⁸ независимо выбран из группы, состоящей из алкила, арила и гетероарила, причем указанные фрагменты являются замещенными или незамещенными и, будучи замещенными или незамещенными, указанные фрагменты имеют менее 21 атома углерода; каждый G независимо выбран из группы, состоящей из CO, SO₂, SO, PO и PO₂; R⁹ и R¹⁰ независимо выбраны из группы, состоящей из H и C₁-C₄алкила; R¹¹ и R¹² независимо выбраны из группы, состоящей из H и алкила, или, взятые вместе, могут соединяться с образованием карбонила; b = 0 или 1; c может быть = 0 или 1, но c должен быть = 0, если b = 0; y представляет собой целое число от 1 до 6; k представляет собой целое число от 0 до 20; R⁶ представляет собой H или алкильный, арильный или гетероарильный фрагмент; причем указанные фрагменты являются замещенными или незамещенными; и X, если присутствует, представляет собой подходящий противоион, уравновешивающий заряд, предпочтительно X присутствует, если R⁴ представляет собой водород, подходящий X включает без ограничения хлорид, бромид, сульфат, метосульфат, сульфонат, п-толуолсульфонат, боронтетрафторид и фосфат.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения катализатор отбеливания имеет структуру, соответствующую приведенной ниже общей формуле

где R¹³ представляет собой разветвленную алкильную группу, содержащую от трех до 24 атомов углерода (включая ответвляющиеся атомы углерода), или линейную алкильную группу, содержащую от одного до 24 атомов углерода; предпочтительно R¹³ представляет собой разветвленную алкильную группу, содержащую от восьми до 18 атомов углерода, или линейную алкильную группу, содержащую от восьми до восемнадцати атомов углерода; предпочтительно R¹³ выбран из группы, состоящей из 2-пропилгептила, 2-бутилоктила, 2-пентилнонила, 2-гексилдецила, н-додецила, н-тетрадецила, н-гексадецила, н-окстадецила, изононила, изодецила, изотридецила и изопентадецила; предпочтительно R¹³ выбран из группы, состоящей из 2-бутилоктила, 2-пентилнонила, 2-гексилдецила, изотридецила и изопентадецила.

Предпочтительно отбеливающий компонент содержит источник перкислоты в дополнение к катализатору отбеливания, в частности, органическому катализатору отбеливания. Источник перкислоты может быть выбран из (a) предварительно образованной перкислоты; (b) перкарбонатной, перборатной или персульфатной соли (источника пероксида водорода) предпочтительно в комбинации с активатором отбеливания и (c) фермента пергидролазы и сложного эфира для образования перкислоты in situ в присутствии воды на стадии обработки текстиля или твердых поверхностей.

Перкислота и/или активатор отбеливания, если они присутствуют, как правило, присутствуют в композиции в количестве от 0,1 до 60 вес. %, от 0,5 до 40 вес. % или от 0,6 до 10 вес. % по весу композиции. Одну или несколько гидрофобных перкислот или их предшественников можно применять в комбинации с одной или несколькими гидрофильными перкислотами или их предшественниками.

Количества источника пероксида водорода и перкислоты или активатора отбеливания может быть выбрано таким образом, что молярное отношение доступного кислорода (из источника пероксида) к перкислоте составляет от 1:1 до 35:1 или от 2:1 до 10:1.

(6) Содержащие металл катализаторы отбеливания. В отбеливающем компоненте может быть обеспечен каталитический комплекс металла. Один тип содержащего металл катализатора отбеливания представляет собой систему катализаторов, включающую катион переходного металла с определенной каталитической активностью отбеливания, например катионы меди, железа, титана, рутения, вольфрама, молибдена или марганца, дополнительный катион металла, характеризующийся низкой каталитической активностью отбеливания или ее отсутствием, например катионы цинка или алюминия, и секвестрант, характеризующийся определенными константами стабильности для каталитических и вспомогательных катионов металлов, в частности, этилендиаминтетрауксусную кислоту, этилендиаминтетра(метиленфосфоновую кислоту) и их растворимые в воде соли. Такие катализаторы раскрыты в US4430243. Предпочтительные катализаторы раскрыты в WO09/839406, US6218351 и WO00/012667. Особенно предпочтительными являются катализатор на основе переходного металла или его лиганды, которые представляют собой соединенные мостиками полидентатные N-донорные лиганды.

При необходимости композиции согласно данному документу могут катализироваться с помощью соединения марганца. Такие соединения и уровни применения хорошо известны из уровня техники и включают, например, катализаторы на основе марганца, раскрытые в US5576282.

Катализаторы отбеливания на основе кобальта, применимые согласно данному документу, известны и раскрыты, например, в US5597936; US5595967. Такие катализаторы на основе кобальта могут быть легко получены с помощью известных процедур, таких как изложенные, например, в US5597936 и US5595967.

Композиции согласно данному документу в подходящем случае также могут включать комплекс переходного металла с лигандами, такими как биспидоны (US7501389) и/или макрополициклические жесткие лиганды, сокращенно обозначенные как "MRL". На практике, но не в качестве ограничения, композиции и способы согласно данному документу можно корректировать для обеспечения порядка по меньшей мере одной части на сто миллионов активных единиц MRL в водной моющей среде, и данная корректировка, как правило, будет обеспечивать от 0,005 до 25 ppm, от 0,05 до 10 ppm или от 0,1 до 5 ppm MRL в моющем растворе.

Подходящие переходные металлы в катализаторе отбеливания на основе переходных металлов по настоящему изобретению включают, например, марганец, железо и хром. Подходящие MRL включают 5,12-диэтил-1,5,8,12-тетраазабицикло[6.6.2]гексадекан. Подходящие MRL на основе переходных металлов могут быть легко получены с помощью известных процедур, таких как изложенные, например, в US6225464 и WO00/32601.

(7) Фотоотбеливатели. Подходящие фотоотбеливатели включают, например, сульфонированный фталоцианид цинка, сульфонированные фталоцианиды алюминия, ксантеновые красители и их смеси. Предпочтительные отбеливающие компоненты для применения в композициях по настоящему изобретению включают источник пероксида водорода, активатор отбеливания и/или органическую пероксикислоту, необязательно полученную in situ в результате реакции источника пероксида водорода и активатора отбеливания, в комбинации с катализатором отбеливания. Предпочтительные отбеливающие компоненты включают катализаторы отбеливания, предпочтительно органические катализаторы отбеливания, как описано выше.

Особенно предпочтительными отбеливающими компонентами являются катализаторы отбеливания, в частности органические катализаторы отбеливания.

Иллюстративные отбеливающие системы также раскрыты, например, в WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259 и WO2007/087242.

Окрашивающие средства для тканей. Композиция может содержать окрашивающее средство для тканей. Подходящие окрашивающие средства для тканей включают красители, конъюгаты краситель-глина и пигменты. Подходящие красители включают низкомолекулярные красители и полимерные красители. Подходящие низкомолекулярные красители включают низкомолекулярные красители, выбранные из группы, состоящей из красителей, относящиеся к следующим классификационным группам по цветовому индексу (C.I.): Direct Blue, Direct Red, Direct Violet, Acid Blue, Acid Red, Acid Violet, Basic Blue, Basic Violet и Basic Red, или их смеси.

В другом аспекте подходящие низкомолекулярные красители включают низкомолекулярные красители, выбранные из группы, состоящей из следующих номеров согласно цветовому индексу (Общество красильщиков и колористов, Бадфорд, Великобритания): Direct Violet 9, Direct Violet 35, Direct Violet 48, Direct Violet 51, Direct Violet 66, Direct Violet 99, Direct Blue 1, Direct Blue 71, Direct Blue 80, Direct Blue 279, Acid Red 17, Acid Red 73, Acid Red 88, Acid Red 150, Acid Violet 15, Acid Violet 17, Acid Violet 24, Acid Violet 43, Acid Red 52, Acid Violet 49, Acid Violet 50, Acid Blue 15, Acid Blue 17, Acid Blue 25, Acid Blue 29, Acid Blue 40, Acid Blue 45, Acid Blue 75, Acid Blue 80, Acid Blue 83, Acid Blue 90 и Acid Blue 113, Acid Black 1, Basic Violet 1, Basic Violet 3, Basic Violet 4, Basic Violet 10, Basic Violet 35, Basic Blue 3, Basic Blue 16, Basic Blue 22, Basic Blue 47, Basic Blue 66, Basic Blue 75, Basic Blue 159, и их смеси. В другом аспекте подходящие низкомолекулярные красители включают низкомолекулярные красители, выбранные из группы, состоящие из следующих номеров согласно цветовому индексу (Общество красильщиков и колористов, Брадфорд, Великобритания): Acid Violet 17, Acid Violet 43, Acid Red 52, Acid Red 73, Acid Red 88, Acid Red 150, Acid Blue 25, Acid Blue 29, Acid Blue 45, Acid Blue 113, Acid Black 1, Direct Blue 1, Direct Blue 71, Direct Violet 51, и их смеси. В другом аспекте подходящие низкомолекулярные красители включают низкомолекулярные красители, выбранные из группы, состоящие из следующих номеров согласно цветовому индексу (Общество красильщиков и колористов, Брадфорд, Великобритания): Acid Violet 17, Direct Blue 71, Direct Violet 51, Direct Blue 1, Acid Red 88, Acid Red 150, Acid Blue 29, Acid Blue 113, или их смеси.

Подходящие полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из полимеров, содержащих сопряженные хромогены (конъюгаты краситель-полимер) и полимеры с хромогенами, совместно полимеризованными в основную цепь полимера, и их смеси.

В другом аспекте подходящие полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из субстантивных красящих веществ для ткани, продаваемых под названием Liquitint® (Milliken), конъюгатов краситель-полимер, образованных по меньшей мере из одного реактивного красителя и полимера, выбранного из группы, состоящей из полимеров, содержащих фрагмент, выбранные из группы, состоящей из гидроксильного фрагмента, фрагмента первичного амина, фрагмента вторичного амина, тиольного фрагмента и их смеси. В еще одном аспекте подходящие полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из Liquitint® Violet CT, карбоксиметилцеллюлозы (CMC), сопряженной с реактивным синим, реактивным фиолетовым или реактивным красным красителем, например CMC, сопряженной с C.I. Reactive Blue 19, продаваемой Megazyme, Уиклоу, Ирландия, под названием продукта AZO-CM-CELLULOSE, кодом продукта S-ACMC, полимерных красящих веществ на основе алкоксилированного трифенил-метана, полимерных красящих веществ на основе алкоксилированного тиофена и их смесей.

Предпочтительные оттеночные красители включают белящие вещества, представленные в WO08/87497. Данные белящие вещества могут характеризоваться следующей структурой (I):

(I),

где R₁ и R₂ могут быть независимо выбраны из

a) [(CH₂CR'HO)_x(CH₂CR"HO)_yH],

где R' выбран из группы, состоящей из H, CH₃, CH₂O(CH₂CH₂O)_zH и их смесей; где R" выбран из группы, состоящей из H, CH₂O(CH₂CH₂O)_zH и их смесей; где x + y ≤ 5; где y ≥ 1; и где z = 0-5;

b) R₁ = алкил, арил или арилалкил, а R₂ = [(CH₂CR'HO)_x(CH₂CR"HO)_yH],

где R' выбран из группы, состоящей из H, CH₃, CH₂O(CH₂CH₂O)_zH и их смесей; где R" выбран из группы, состоящей из H, CH₂O(CH₂CH₂O)_zH и их смесей; где x + y ≤ 10; где y ≥ 1; и где z = 0-5;

c) R₁ = [CH₂CH₂(OR₃)CH₂OR₄], а R₂ = [CH₂CH₂(O R₃)CH₂O R₄],

где R₃ выбран из группы, состоящей из H, (CH₂CH₂O)_zH и их смесей; и где z = 0-10;

где R₄ выбран из группы, состоящей из (C₁-C₁₆)алкила, арильных групп и их смесей; и

d) где R1 и R2 могут быть независимо выбраны из продукта присоединения амино к оксиду стирола, глицидилметиловому эфиру, изобутилглицидиловому эфиру, изопропилглицидиловому эфиру, трет-бутилглицидиловому эфиру, 2-этилгексилглицидиловому эфиру и глицидилгексадециловому эфиру с последующем добавлением от 1 до 10 алкиленоксидных фрагментов.

Предпочтительное белящее вещество по настоящему изобретению может характеризоваться следующей структурой (II):

(II),

где R' выбран из группы, состоящей из H, CH₃, CH₂O(CH₂CH₂O)_zH и их смесей; где R" выбран из группы, состоящей из H, CH₂O(CH₂CH₂O)_zH и их смесей; где x + y ≤ 5; где y ≥ 1; и где z = 0-5.

Следующее предпочтительное белящее вещество по настоящему изобретению может характеризоваться следующей структурой (III):

(III),

причем, как правило, оно содержит смесь, содержащую в общем 5 EO-групп. Подходящими предпочтительными молекулами являются молекулы структуры I, имеющие следующие боковые группы из "части a", указанной выше.

ТАБЛИЦА 1

	R1				R2
	R'	R"	X	y	R'	R"	x	y
A	H	H	3	1	H	H	0	1
B	H	H	2	1	H	H	1	1
c = b	H	H	1	1	H	H	2	1
d = a	H	H	0	1	H	H	3	1

Следующие пригодные белящие вещества включают белящие вещества, описанные в US2008/34511 (Unilever). Предпочтительным средством является "Violet 13".

Подходящие конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из по меньшей мере одного катионного/основного красителя и смектитовой глины, и их смеси. В другом аспекте подходящие конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из одного катионного/основного красителя, выбранного из группы, состоящей из C.I. Basic Yellow 1-108, C.I. Basic Orange 1-69, C.I. Basic Red 1-118, C.I. Basic Violet 1-51, C.I. Basic Blue 1-164, C.I. Basic Green 1-14, C.I. Basic Brown 1-23, CI Basic Black 1-11, и глины, выбранной из группы, состоящей из монтмориллонитовой глины, гекторитной глины, сапонитной глины и их смесей. В еще одном аспекте подходящие конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из конъюгата монтмориллонита с Basic Blue B7 C.I. 42595, конъюгата монтмориллонита с Basic Blue B9 C.I. 52015, конъюгата монтмориллонита с Basic Violet V3 C.I. 42555, конъюгата монтмориллонита с Basic Green G1 C.I. 42040, конъюгата монтмориллонита с Basic Red R1 C.I. 45160, конъюгата монтмориллонита с C.I. Basic Black 2, конъюгата гекторита с Basic Blue B7 C.I. 42595, конъюгата гекторита с Basic Blue B9 C.I. 52015, конъюгата гекторита с Basic Violet V3 C.I. 42555, конъюгата гекторита с Basic Green G1 C.I. 42040, конъюгата гекторита с Basic Red R1 C.I. 45160, конъюгата гекторита с C.I. Basic Black 2, конъюгата сапонита с Basic Blue B7 C.I. 42595, конъюгата сапонита с Basic Blue B9 C.I. 52015, конъюгата сапонита с Basic Violet V3 C.I. 42555, конъюгата сапонита с Basic Green G1 C.I. 42040, конъюгата сапонита с Basic Red R1 C.I. 45160, конъюгата сапонита с C.I. Basic Black 2 и их смесей.

Подходящие пигменты включают пигменты, выбранные из группы, состоящей из флавантрона, индантрона, хлорированного индантрона, содержащего от 1 до 4 атомов хлора, пирантрона, дихлорпирантрона, монобромдихлорпирантрона, дибромдихлорпирантрона, тетрабромпирантрона, диимида перилен-3,4,9,10-тетракарбоновой кислоты, где имидные группы могут быть незамещенными или замещенными C1-C3алкилом, или фенилом, или гетероциклическим радикалом, и где фенил и гетероциклические радикалы могут дополнительно содержать заместители, которые не придают растворимость в воде, амидов антрапиримидинкарбоновой кислоты, виолантрона, изовиолантрона, диоксазиновых пигментов, фталоцианина меди, который может содержать до 2 атомов хлора на молекулу, полихлормедь фталоцианина или полибромхлормедь фталоцианина, содержащего до 14 атомов брома на молекулу, и их смесей.

В другом аспекте подходящие пигменты включают пигменты, выбранные из группы, состоящей из ультрамаринового синего (C.I. Pigment Blue 29), ультрамаринового фиолетового (C.I. Pigment Violet 15) и их смесей.

Вышеупомянутые окрашивающие средства для тканей можно применять в комбинации (можно применять любую смесь окрашивающих средств для ткани). Подходящие окрашивающие средства для ткани более подробно раскрыты в US7208459. Предпочтительные количества красителя в композициях по настоящему изобретению составляют от 0,00001 до 0,5 вес. % или от 0,0001 до 0,25 вес. %. Предпочтительная концентрация красителей в воде для стадии обработки и/или очищения составляет от 1 ppb до 5 ppm, от 10 ppb до 5 ppm или от 20 ppb до 5 ppm. В предпочтительных композициях концентрация поверхностно-активного вещества будет составлять от 0,2 до 3 г/л.

Инкапсуляты. Композиция может содержать инкапсулят. В одном аспекте инкапсулят содержит ядро, оболочку, имеющую внутреннюю и внешнюю поверхность, причем указанная оболочка инкапсулирует указанное ядро.

В одном аспекте указанного инкапсулята указанное ядро может содержать материал, выбранный из группы, состоящей из отдушек; осветлителей; красителей; средств, отпугивающих насекомых; кремнийорганических соединений; восков; вкусоароматических добавок; витаминов; смягчающих ткань средств; в одном аспекте средств по уходу за кожей, парафинов; ферментов; антибактериальных средств; отбеливающих средств; компонентов, придающих определенные сенсорные ощущения; и их смесей; и указанная оболочка может содержать материал, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленов; полиамидов; поливиниловых спиртов, необязательно содержащих другие coмономеры; полистиролов; полиизопренов; поликарбонатов; сложных полиэфиров; полиакрилатов; аминопластов, в одном аспекте указанный аминопласт может включать полимочевины, полиуретан и/или полимочевиноуретан, и в одном аспекте указанная полимочевина может включать полиоксиметиленмочевину и/или меламин-формальдегид; полиолефинов; полисахаридов, в одном аспекте указанный полисахарид может включать альгинат и/или хитозан; желатина; шеллака; эпоксидных смол; виниловых полимеров; нерастворимых в воде неорганических веществ; кремнийорганического соединения и их смесей.

В одном аспекте указанного инкапсулята указанное ядро может содержать отдушку.

В одном аспекте указанного инкапсулята указанная оболочка может содержать меламин-формальдегид и/или сшитый меламин-формальдегид.

В одном аспекте подходящие инкапсуляты могут содержать материал ядра и оболочку, причем указанная оболочка, по меньшей мере частично окружающая указанный материал ядра, раскрыта. По меньшей мере 75%, 85% или 90% указанных инкапсулятов могут характеризоваться пределом прочности, составляющим от 0,2 до 10 МПа, от 0,4 до 5 МПа, от 0,6 до 3,5 МПа или от 0,7 до 3 МПа, и утечкой полезного средства, составляющей от 0 до 30%, от 0 до 20% или от 0 до 5%.

В одном аспекте, по меньшей мере 75%, 85% или 90% указанных инкапсулятов могут иметь размер частиц от 1 до 80 микрон, от 5 до 60 микрон, от 10 до 50 микрон или от 15 до 40 микрон.

В одном аспекте по меньшей мере 75%, 85% или 90% указанных инкапсулятов могут иметь толщину стенки частицы от 30 до 250 нм, от 80 до 180 нм или от 100 до 160 нм.

В одном аспекте, материал ядра указанных инкапсулятов может включать материал, выбранный из группы, состоящей из исходного материала отдушки, и/или необязательно материал, выбранный из группы, состоящей из растительного масла, в том числе чистых и/или смешанных растительных масел, включая касторовое масло, кокосовое масло, хлопковое масло, масло виноградных косточек, рапсовое, соевое масло, кукурузное масло, пальмовое масло, льняное масло, сафлоровое масло, оливковое масло, арахисовое масло, кокосовое масло, пальмоядровое масло, касторовое масло, лимонное масло и их смеси; сложных эфиров растительных масел, сложных эфиров, включая дибутиладипат, дибутилфталат, бутилбензиладипат, бензилоктиладипат, трикрезилфосфат, триоктилфосфат и их смеси; углеводородов с прямой или разветвленной цепью, включая такие углеводороды с прямой или разветвленной цепью, которые имеют точку кипения более приблизительно 80°C; частично гидрогенизированных терфенилов, диалкилфталатов, алкилбифенилов, включая моноизопропилбифенил, алкилированного нафталина, включая дипропилнафталин, петролейных эфиров, включая керосин, минерального масла и его смесей; ароматических растворителей, включая бензол, толуол и их смеси; силиконовых масел и их смесей.

В одном аспекте материал стенок указанных инкапсулятов может содержать подходящую смолу, в том числе продукт реакции альдегида и амина, подходящие альдегиды включают формальдегид. Подходящие амины включают меламин, мочевину, бензогуанамин, гликолурил и их смеси. Подходящие меламины включают метилoлмеламин, метилированный метилoлмеламин, иминомеламин и их смеси. Подходящие мочевины включают диметилoлмочевину, метилированную диметилoлмочевину, мочевина-резорцин и их смеси.

В одном аспекте подходящие поглотители формальдегида можно применять с инкапсулятами, например в суспензии капсулы, и/или их можно добавлять в композицию до, во время или после добавления инкапсулятов в такую композицию. Подходящие капсулы могут быть получены с помощью следующих основных положений US2008/0305982 и/или US2009/0247449.

В предпочтительном аспекте композиция также может содержать вспомогательное вещество для осаждения, предпочтительно состоящее из группы, состоящей из катионных или неионогенных полимеров. Подходящие полимеры включают катионные крахмалы, катионную гидроксиэтилцеллюлозу, поливинилформальдегид, смолу плодов рожкового дерева, маннаны, ксилоглюканы, смолу индийского финика, полиэтилентерефталат и полимеры, содержащие диметиламиноэтилметакрилат, необязательно с одним из мономеров, выбранных из группы, состоящей из акриловой кислоты и акриламида.

Отдушки. В одном аспекте композиция содержит отдушку, которая содержит один или несколько исходных материалов отдушки, выбранных из группы, состоящей из 1,1'-оксибис-2-пропанола; диэтилового сложного эфира 1,4-циклогександикарбоновой кислоты; (этоксиметокси)циклододекана; 1,3-нонандиола, моноацетата; 2-пропенилового сложного эфира (3-метилбутокси)уксусной кислоты; бета-метилциклододеканэтанола; 2-метил-3-[(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)окси]-1-пропанола; оксациклогексадекан-2-она; альфа-метил-бензолметанолацетата; транс-3-этокси-1,1,5-триметилциклогексана; 4-(1,1-диметилэтил)циклогексанолацетата; додекагидро-3a,6,6,9a-тетраметилнафто[2,1-b]фурана; бета-метилбензолпропаналя; бета-метил-3-(1-метилэтил)бензолпропаналя; 4-фенил-2-бутанона; этилового сложного эфира 2-метилбутановой кислоты; бензальдегида; 1-метилэтилового сложного эфира 2-метилбутановой кислоты; дигидро-5-пентил-2(3H)фуранона; (2E)-1-(2,6,6-триметил-2-циклогексен-1-ил)-2-бутен-1-она; додеканаля; ундеканаля; 2-этил-альфа,альфа-диметилбензолпропаналя; деканaля; альфа,альфа-диметилбензолэтанолацетата; 2-(фенилметилен)октаналя; метилового сложного эфира 2-[[3-[4-(1,1-диметилэтил)фенил]-2-метилпропилиден]амино]бензойной кислоты; 1-(2,6,6-триметил-3-циклогексен-1-ил)-2-бутен-1-она; 2-пентилциклопентанона; метилового сложного эфира 3-оксо-2-пентилциклопентануксусной кислоты; 4-гидрокси-3-метоксибензальдегида; 3-этокси-4-гидроксибензальдегида; 2-гептилциклопентанона; 1-(4-метилфенил)этанона; (3E)-4-(2,6,6-триметил-1-циклогексен-1-ил)-3-бутен-2-она; (3E)-4-(2,6,6-триметил-2-циклогексен-1-ил)-3-бутен-2-она; бензолэтанола; 2H-1-бензoпиран-2-она; 4-метоксибензальдегида; 10-ундеканаля; фенилметилового сложного эфира пропановой кислоты; бета-метилбензолпентанола; 1,1-диэтокси-3,7-диметил-2,6-октадиена; альфа,альфа-диметилбензолэтанола; (2E)-1-(2,6,6-триметил-1-циклогексен-1-ил)-2-бутен-1-она; фенилметилового сложного эфира уксусной кислоты; 2-пропенилового сложного эфира циклогексанпропановой кислоты; 2-пропенилового сложного эфира гексановой кислоты; 1,2-диметокси-4-(2-пропенил)бензола; оксима 1,5-диметил-бицикло[3.2.1]октан-8-она; 4-(4-гидрокси-4-метилпентил)-3-циклогексен-1-карбоксальдегида; 3-бутен-2-ола; метилового сложного эфира 2-[[[2,4(или 3,5)-диметил-3-циклогексен-1-ил]метилен]амино]бензойной кислоты; 8-циклогексадецен-1-она; метилиoнона; 2,6-диметил-7-октен-2-ола; 2-метокси-4-(2-пропенил)фенола; (2E)-3,7-диметил-2,6-октадиен-1-ола; (3Z)-3-гексенилового сложного эфира 2-гидрокси-бензойной кислоты; 2-тридеценнитрила; 4-(2,2-диметил-6-метиленциклогексил)-3-метил-3-бутен-2-она; тетрагидро-4-метил-2-(2-метил-1-пропенил)-2H-пирана; 2-пропенилового сложного эфира (2-метилбутокси)уксусной кислоты; 3-метилбутилового сложного эфира 2-гидроксибензойной кислоты; (Z)-1-(2,6,6-триметил-1-циклогексен-1-ил)-2-бутен-1-она; метилового сложного эфира 2-гексил-3-оксоциклопентанкарбоновой кислоты; 4-этил.-альфа.,альфа.-диметил-бензолпропаналя; 3-(4-гидрокси-4-метилпентил)-3-циклогексен-1-карбоксальдегида; [3R-(3.альфа.,3a.бета.,7.бета.,8a.альфа.)]-1-(2,3,4,7,8,8a-гексагидро-3,6,8,8-тетраметил-1H-3a,7-метанoазулен-5-ил)-этанона; 6-бутилтетрагидро-2-метил-2H-пиран-2-она ундеканаля; 4-(1,1-диметилэтил)-.альфа.-метил-бензолпропаналя; 5-гептилдигидро-2(3H)-фуранона; метилового 2-[(7-гидрокси-3,7-диметилоктилиден)амино]-бензойной кислоты; фенилметилового сложного эфира 2-гидроксибензойной кислоты; 2-метоксинафталина; 2-гексил-2-циклопентен-1-она; 5-гексилдигидро-2(3H)-фуранона; этилового сложного эфира 3-метил-3-фенилоксиранкарбоновой кислоты; 1,3,3-триметил-2-оксабицикло[2.2.2]октана; .гамма.-метил-бензолпентанола; 3,7-диметил-3-октанола; 3,7-диметил-2,6-октадиеннитрила; 3,7-диметил-6-октен-1-ола; терпинеолацетата; дигидро-производного 2-метил-6-метилен-7-октен-2-ола; 3a,4,5,6,7,7a-гексагидро-4,7-метано-1H-инден-6-олпропаноата; 3-метил-2-бутен-1-олацетата; (Z)-3-гексен-1-олацетата; 2-этил-4-(2,2,3-триметил-3-циклопентен-1-ил)-2-бутен-1-ола; 4-(октагидро-4,7-метанo-5H-инден-5-илиден)-бутаналя; 3-2,4-диметил-циклогексен-1-карбоксальдегида; 1-(1,2,3,4,5,6,7,8-октагидро-2,3,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-этанона; метилового сложного эфира 2-гидрокси-бензойной кислоты; гексилового сложного эфира 2-гидрокси-бензойной кислоты; 2-фенокси-этанола; пентилового сложного эфира 2-гидрокси-бензойной кислоты; 2,3-гептaндиона; 2-гексен-1-ола; 2,6-диметил-6-октен-2-ола; дамаскона (альфа, бета, гамма или дельта или их смесей), ацетата 3a,4,5,6,7,7a-гексагидро-4,7-метано-1H-инден-6-ола; 9-ундеценаля; 8-ундеценаля; изоциклоцитраля; 1-(1,2,3,5,6,7,8,8a-октагидро-2,3,8,8-тетраметил-2-нафталенил)этанона; 3,5-диметил-3-циклогексен-1-карбоксальдегида; 2,4-диметил-3-циклогексен-1-карбоксальдегида; 3,7-диметил-1,6-октадиен-3-ола; ацетата 3,7-диметил-1,6-октадиен-3-ола; лилиаля (п-т-буциналя) и циклопентанона, 2-[2-(4-метил-3-циклогексен-1-ил)пропил]- и 1-метил-4-(1-метилэтенил)циклогексена и их смесей.

В одном аспекте композиция может содержать инкапсулированную частицу отдушки, содержащую либо растворимое в воде гидроксильное соединение, либо меламин-формальдегид, либо модифицированный поливиниловый спирт. В одном аспекте инкапсулят содержит (a) по меньшей мере частично растворимую в воде твердую матрицу, содержащую одно или несколько растворимых в воде гидроксильных соединений, предпочтительно крахмал; и (b) парфюмерное масло, инкапсулированное с помощью твердой матрицы.

В следующем аспекте отдушка может быть предварительно составлена в комплекс с полиамином, предпочтительно полиэтиленимином с целью образования основания шиффа.

Полимеры. Композиция может содержать один или несколько полимеров. Примерами являются карбоксиметилцеллюлоза, поли(винил-пирролидон), поли(этиленгликоль), поли(виниловый спирт), поли(винилпиридин-N-оксид), поли(винилимидазол), поликарбоксилаты, например, полиакрилаты, coполимеры малеиновой и акриловой кислоты и coполимеры лаурилметакрилата и акриловой кислоты.

Композиция может содержать один или несколько амфифильных очищающих полимеров, например, соединение, имеющее следующую общую структуру: бис((C₂H₅O)(C₂H₄O)n)(CH₃)-N⁺-C_xH_2x-N⁺-(CH₃)-бис((C₂H₅O)(C₂H₄O)n), где n = от 20 до 30, и x = от 3 до 8, или его сульфатированные или сульфонированные варианты.

Композиция может содержать амфифильные алкоксилированные полимеры, очищающие топленый животный жир, которые уравновесили гидрофильные и гидрофобные свойства таким образом, что они удаляют частицы топленого животного жира с тканей и поверхностей. Конкретные варианты осуществления амфифильных алкоксилированных полимеров, очищающих топленый животный жир, по настоящему изобретению включают структуру ядра и множество алкоксилатных групп, прикрепленных к данной структуре ядра. Они могут содержать алкоксилированные полиалкиленимины, предпочтительно имеющие внутренний полиэтиленоксидный блок и внешний полипропиленоксидный блок.

Алкоксилированные поликарбоксилаты, такие как полученные из полиакрилатов, пригодны согласно данному документу для обеспечения дополнительной эффективности удаления жиров и масел. Такие материалы раскрыты в WO91/08281 и PCT90/01815. С химической точки зрения данные материалы содержат полиакрилаты, имеющие одну этокси-боковую цепь на каждые 7-8 акрилатных звеньев. Боковые цепи имеют формулу -(CH₂CH₂O)_m(CH₂)_nCH₃, где m равен 2-3, и n равен 6-12. Боковые цепи связаны сложноэфирной связью с "основной цепью" полиакрилата с обеспечением "гребнеобразного" типа полимерной структуры. Молекулярный вес может варьировать, но, как правило, находится в диапазоне от 2000 до 50000. Такие алкоксилированные поликарбоксилаты могут составлять от 0,05 вес. % до 10 вес. % композиций согласно данному документу.

Полученные из изопреноидов поверхностно-активные вещества по настоящему изобретению и их смеси с другими вторичными поверхностно-активными веществами и другими вспомогательными ингредиентами являются особенно пригодными для применения с амфилическим привитым coполимером, предпочтительно амфилический привитый coполимер содержит (i) основную цепь полиэтиленгликоля и (ii) по меньшей мере один боковой фрагмент, выбранный из поливинилацетата, поливинилового спирта и их смесей. Предпочтительным амфилическим привитым coполимером является Sokalan HP22, поставляемый BASF. Подходящие полимеры включают произвольные привитые coполимеры, предпочтительно coполимер полиэтиленоксида с привитым поливинилацетатом, имеющий основную цепь полиэтиленоксида и множественные поливинилацетатные боковые цепи. Молекулярный вес основной цепи полиэтиленоксида предпочтительно составляет 6000, а весовое соотношение полиэтиленоксида и поливинилацетата составляет от 40 до 60, и присутствует не более 1 точки прикрепления на 50 этиленоксидных звеньев.

Карбоксилатный полимер. Композиция по настоящему изобретению также может включать один или несколько карбоксилатных полимеров, например, малеатный/акрилатный произвольный coполимер или полиакрилатный гомополимер. В одном аспекте карбоксилатный полимер представляет собой полиакрилатный гомополимер, имеющий молекулярный вес от 4000 до 9000 Да или от 6000 до 9000 Да.

Грязеотталкивающий полимер. Композиция по настоящему изобретению также может включать один или несколько грязеотталкивающих полимеров, имеющих структуру, которая определена одной из следующих структур (I), (II) или (III):

(I) -[(OCHR¹-CHR²)_a-O-OC-Ar-CO-]_d,,

(II) -[(OCHR³-CHR⁴)_b-O-OC-sAr-CO-]_e,

(III) -[(OCHR⁵-CHR⁶)_c-OR⁷]_f,

где

a, b и c равны от 1 до 200;

d, e и f равны от 1 до 50;

Ar представляет собой 1,4-замещенный фенилен;

sAr представляет собой 1,3-замещенный фенилен, замещенный SO₃Me в положении 5;

Me представляет собой Li, K, Mg/2, Ca/2, Al/3, аммоний, моно-, ди-, три- или тетраалкиламмоний, где алкильные группы представляют собой C₁-C₁₈алкил или C₂-C₁₀гидроксиалкил или их смеси;

R¹, R², R³, R⁴, R⁵ и R⁶ независимо выбраны из H или C₁-C₁₈n- или изоалкила; и

R⁷ представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₁₈алкил, или линейный или разветвленный C₂-C₃₀алкенил, или циклоалкильную группу с 5-9 атомами углерода, или C₈-C₃₀арильную группу, или C₆-C₃₀арилалкильную группу.

Подходящими грязеотталкивающими полимерами являются грязеотталкивающие полимеры, являющиеся сложными полиэфирами, например полимеры Repel-o-tex, в том числе Repel-o-tex, SF-2 и SRP6, поставляемые Rhodia. Другие подходящие грязеотталкивающие полимеры включают полимеры Texcare, в том числе Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 и SRN325, поставляемые Clariant. Другими подходящими грязеотталкивающими полимерами являются полимеры Marloquest, например, Marloquest SL, поставляемые Sasol.

Целлюлозный полимер. Композиция по настоящему изобретению также может включать один или несколько целлюлозных полимеров, в том числе выбранных из алкилцеллюлозы, алкилалкоксиалкилцеллюлозы, карбоксиалкилцеллюлозы, алкилкарбоксиалкилцеллюлозы. В одном аспекте целлюлозные полимеры выбраны из группы, состоящей из карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, метилгидроксиэтилцеллюлозы, метилкарбоксиметилцеллюлозы и их смесей. В одном аспекте карбоксиметилцеллюлоза характеризуется степенью замещения по карбоксиметильным группам от 0,5 до 0,9 и молекулярным весом от 100000 до 300000 Да.

Ферменты. Композиция может содержать один или несколько ферментов, которые обеспечивают эффективность очищения и/или положительные эффекты при уходе за тканью. Примеры подходящих ферментов включают без ограничения гемицеллюлазы, пероксидазы, протеазы, целлюлазы, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, эстеразы, кутиназы, пектиназы, маннаназы, пектатлиазы, кератиназы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, липоксигеназы, лигниназы, пуллуланазы, танназы, пентозаназы, маланазы, ß-глюканазы, арабинозидазы, гиалуронидазу, хондроитиназу, лакказу, хлорофиллазы, амилазы или их смеси. Типичная комбинация представляет собой смесь ферментов, которая может содержать, например, протеазу и липазу вместе с амилазой. Вышеупомянутые дополнительные ферменты, если они присутствуют в композиции, могут присутствовать в количествах от 0,00001 до 2 вес. %, от 0,0001 до 1 вес. % или от 0,001 до 0,5 вес. % белка-фермента по весу композиции.

В целом, свойства выбранного(ых) фермента(ов) должны быть совместимыми с выбранным моющим средством (т. е. оптимум pH, совместимость с другими ферментативными и неферментативными ингредиентами и т. д.), при этом фермент(ы) должен(ны) присутствовать в эффективных количествах.

В одном аспекте предпочтительные ферменты будут включать целлюлазу. Пригодные целлюлазы включают таковые бактериального или грибкового происхождения. Включены химически модифицированные или мутанты белковой инженерии. Подходящие целлюлазы включают целлюлазы из родов Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, например, целлюлазы грибов, полученные из Humicola insolens, Myceliophthora thermophila и Fusarium oxysporum, раскрытые в US4435307, US5648263, US5691178, US5776757 и WO89/09259.

Особенно подходящими целлюлазами являются щелочные или нейтральные целлюлазы, обладающие положительными эффектами сохранения цвета. Примерами таких целлюлаз являются целлюлазы, описанные в EP0495257, EP0531372, WO96/11262, WO96/29397, WO98/08940. Другими примерами являются варианты целлюлаз, например, описанные в WO94/07998, EP0531315, US5457046, US5686593, US5763254, WO95/24471, WO98/12307 и PCT/DK98/00299.

Коммерчески доступные целлюлазы включают Celluzyme™, и Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, и Puradax HA™ (Genencor International Inc.), и KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

В одном аспекте предпочтительные ферменты будут включать протеазу. Подходящие протеазы включают протеазы бактериального, грибкового, растительного, вирусного или животного происхождения, например, растительного или микробного происхождения. Микробное происхождение является предпочтительным. Включены химически модифицированные или мутанты белковой инженерии. Это может быть щелочная протеаза, например, серин-протеаза или металлопротеаза. Серин-протеаза может быть, например, представителем семейства S1, таким как трипсин, или семейства S8, таким как субтилизин. Протеазы, относящиеся к металлопротеазам, могут, например, представлять собой термолизин, например из семейства M4, или другую металлопротеазу, например из семейств M5, M7 или M8.

Выражение "субтилазы" относится к подгруппе серин-протеазы в соответствии с Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 и Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Серин-протеазы представляют собой подгруппу протеаз, которая характеризуется наличием серина в активном центре, который образует ковалентный аддукт с субстратом. Субтилазы могут быть разделены на 6 подразделов, т. е. семейство субтилизина, семейство термитазы, семейство протеиназы K, семейство пептидазы-лантибиотика, семейство кексина и семейство пиролизина.

Примерами субтилаз являются субтилазы, полученные из Bacillus, например Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus и Bacillus gibsonii, описанные в US7262042 и WO09/021867, и субтилизин lentus, субтилизин Novo, субтилизин Carlsberg, Bacillus licheniformis, субтилизин BPN', субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168, описанные в WO89/06279, и протеаза PD138, описанная в (WO93/18140). Другими пригодными протеазами могут быть протеазы, описанные в WO92/175177, WO01/016285, WO02/026024 и WO02/016547. Примерами трипсин-подобных протеаз являются трипсин (например, свиного или бычьего происхождения) и протеаза Fusarium, описанная в WO89/06270, WO94/25583 и WO05/040372, и протеазы хемотрипсины, полученные из Cellumonas, описанные в WO05/052161 и WO05/052146.

Следующей предпочтительной протеазой является щелочная протеаза из Bacillus lentus DSM 5483, описанная, например, в WO95/23221, и ее варианты, которые описаны в WO92/21760, WO95/23221, EP1921147 и EP1921148.

Примерами металлопротеаз являются нейтральная металлопротеаза, описанная в WO07/044993 (Genencor Int.), например, металлопротеазы, полученные из Bacillus amyloliquefaciens.

Примерами пригодных протеаз являются варианты, описанные в WO92/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WO01/44452, WO03/006602, WO04/03186, WO04/041979, WO07/006305, WO11/036263, WO11/036264, в частности, варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 и 274, при использовании BPN'-нумерации. Более предпочтительно варианты субтилазы могут содержать следующие мутации: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (при использовании BPN'-нумерации).

Подходящие коммерчески доступные ферменты-протеазы включают продаваемые под торговыми названиями Alcalase®, Blaze®; Duralase^Tm, Durazym^Tm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® и Esperase®, все могут продаваться как Ultra® или Evity® (Novozymes A/S), продаваемые под торговым названием Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, Preferenz^Tm, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, Effectenz^Tm, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Opticlean® и Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem^TM (Gist-Brocases N.V.), BLAP (последовательность, представленная на фигуре 29 в US5352604) и их варианты (Henkel AG) и KAP (субтилизин Bacillus alkalophilus) от Kao.

В одном аспекте предпочтительные ферменты будут включать амилазу. Подходящие амилазы могут представлять собой альфа-амилазу или глюкоамилазу и могут быть бактериального или грибкового происхождения. Включены химически модифицированные или мутанты белковой инженерии. Амилазы включают, например, альфа-амилазы, полученные из Bacillus, например, особого штамма Bacillus licheniformis, более подробно описанного в GB1296839.

Подходящие амилазы включают амилазы, имеющие SEQ ID NO: 3 в WO95/10603, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 3. Предпочтительные варианты раскрыты в WO94/02597, WO94/18314, WO97/43424 и SEQ ID NO: 4 в WO99/019467, например, варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408 и 444.

Различные подходящие амилазы включают амилазы, имеющие SEQ ID NO: 6 в WO02/010355, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие делецию в положениях 181 и 182 и замену в положении 193.

Другие амилазы, которые являются подходящими, представляют собой гибридную альфа-амилазу, содержащую остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из B. amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO: 6 в WO2006/066594, и остатки 36-483 альфа-амилазы B. licheniformis, приведенной в SEQ ID NO: 4 в WO2006/066594, или варианты, последовательность которых на 90% идентична ей. Предпочтительными вариантами данной гибридной альфа-амилазы являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 и Q264. Наиболее предпочтительными вариантами гибридной альфа-амилазы, содержащими остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из B. amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO: 6 в WO2006/066594, и остатки 36-483 SEQ ID NO: 4, являются варианты, имеющие следующие замены:

M197T;

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S или

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.

Следующие амилазы, которые являются подходящими, представляют собой амилазы, имеющие SEQ ID NO: 6 в WO99/019467, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 и K269. Особенно предпочтительными амилазами являются амилазы, имеющие делецию в положениях R181 и G182 или положениях H183 и G184.

Дополнительными амилазами, которые можно применять, являются амилазы, имеющие SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 в WO96/023873, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 и 476. Более предпочтительными вариантами являются варианты, имеющие делецию в положениях 181 и 182 или положениях 183 и 184. Наиболее предпочтительными вариантами амилазы SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 являются варианты, имеющие делецию в положениях 183 и 184 и замену в одном или нескольких из положений 140, 195, 206, 243, 260, 304 и 476.

Другие амилазы, которые можно применять, представляют собой амилазы, имеющие SEQ ID NO: 2 в WO08/153815, SEQ ID NO: 10 в WO01/66712, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 2 в WO08/153815 или последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 10 в WO01/66712. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 10 в WO01/66712 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 и 264.

Следующими подходящими амилазами являются амилазы, имеющие SEQ ID NO: 2 в WO09/061380, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 2. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие усечение C-конца и/или замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 и G475. Более предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие замену в одном или нескольких из следующих положений: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E и G475K, и/или делецию в положении R180, и/или S181 или T182, и/или G183. Наиболее предпочтительными вариантами амилазы SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие следующие замены:

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K или

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K, где варианты усечены по C-концу и необязательно дополнительно содержат замену в положении 243 и/или делецию в положении 180 и/или положении 181.

Другие подходящие амилазы представляют собой альфа-амилазу, имеющую SEQ ID NO: 12 в WO01/66712, или вариант, последовательность которого по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 12. Предпочтительными вариантами амилазы являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений SEQ ID NO: 12 в WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Особенно предпочтительные амилазы включают варианты, имеющие делецию в D183 и G184 и имеющие замены в R118K, N195F, R320K и R458K, и вариант, дополнительно имеющий замены в одном или нескольких положениях, выбранных из группы следующих: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 и A339, наиболее предпочтительным является вариант, который дополнительно имеет замены во всех данных положениях.

Другими примерами являются варианты амилазы, например, варианты, описанные в WO2011/098531, WO2013/001078 и WO2013/001087.

Коммерчески доступные амилазы представляют собой Duramyl^TM, Termamyl^TM, Termamyl Ultra^TM, Fungamyl^TM, Ban^TM, Stainzyme^TM, Stainzyme Plus^TM, Amplify®, Supramyl^TM, Natalase^TM, Liquozyme X и BAN^TM (от Novozymes A/S), KEMZYM® AT 9000 Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A-1200, Вена, Австрия, и Rapidase^TM, Purastar^TM/Effectenz^TM, Powerase, Preferenz S100, Preferenx S110, ENZYSIZE®, OPTISIZE HT PLUS®, и PURASTAR OXAM® (Danisco/DuPont), и KAM® (Kao).

Пригодные липазы и кутиназы включают таковые бактериального или грибкового происхождения. Включены химически модифицированные мутантные ферменты или мутантные ферменты, полученные с применением белковой инженерии. Примеры включают липазу из Thermomyces, например, из T. lanuginosus (ранее называемых Humicola lanuginosa), которая описана в EP258068 и EP305216, кутиназу из Humicola, например, H. insolens (WO96/13580), липазу из штаммов Pseudomonas (некоторые из них в настоящее время переименованы в Burkholderia), например, P. alcaligenes или P. pseudoalcaligenes (EP218272), P. cepacia (EP331376), P. sp. штамма SD705 (WO95/06720 и WO96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012), липазы GDSL-типа Streptomyces (WO10/065455), кутиназу из Magnaporthe grisea (WO10/107560), кутиназу из Pseudomonas mendocina (US5389536), липазу из Thermobifida fusca (WO11/084412), липазу Geobacillus stearothermophilus (WO11/084417), липазу из Bacillus subtilis (WO11/084599) и липазу из Streptomyces griseus (WO11/150157) и S. pristinaespiralis (WO12/137147).

Другими примерами являются варианты липаз, такие как описанные в EP 407225, WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 95/22615, WO 96/00292, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/34450, WO 00/60063, WO 01/92502, WO 07/87508 и WO 09/109500.

Предпочтительные коммерческие продукты на основе липаз включают Lipolase^TM, Lipex™; Lipolex^TM и Lipoclean^TM (Novozymes A/S), Lumafast (первоначально от Genencor) и Lipomax (первоначально от Gist-Brocades).

Другими примерами являются липазы, иногда называемые ацилтрансферазами или пергидролазами, например, ацилтрансферазы с гомологией с липазой А Cuida antarctica (WO10/111143), ацилтрансферазы из Mycobacterium smegmatis (WO05/56782), пергидролазы из семейства CE 7 (WO09/67279) и варианты пергидролазы M. smegmatis, в частности, вариант S54V, используемый в коммерческом продукте Gentle Power Bleach от Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO 10/100028).

В одном аспекте другие предпочтительные ферменты включают эдоглюканазы микробного происхождения, проявляющие эндо-бета-1,4-глюканазную активность (EC3.2.1.4), в том числе бактериальный полипептид, эндогенный по отношению к члену рода Bacillus, который имеет последовательность, по меньшей мере на 90%, 94%, 97% или 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 в US7141403, и их смеси. Подходящие эндоглюканазы продают под торговыми названиями Celluclean® и Whitezyme® (Novozymes).

Другие предпочтительные ферменты включают пектат-лиазы, продаваемые под торговыми названиями Pectawash®, Pectaway®, Xpect®, и маннаназы, продаваемые под торговыми названиями Mannaway® (Novozymes) и Purabrite® (Danisco/DuPont).

Фермент(ы) в моющем средстве может(могут) быть включен(ы) в моющую композицию путем добавления отдельных добавок, содержащих один или несколько ферментов, или путем добавления комбинированной добавки, содержащей все из этих ферментов. Моющую добавку согласно настоящему изобретению, т.е. отдельную добавку или комбинированную добавку, можно составить, например, в виде гранулята, жидкости, взвеси и т. д. Предпочтительные составы моющих добавок представляют собой грануляты, в частности непылящие грануляты, жидкости, в частности стабилизированные жидкости, или взвеси.

Непылящие грануляты могут быть получены, например, как раскрыто в US4106991 и US4661452, и необязательно могут быть покрыты с помощью способов, известных из уровня техники. Примерами восковидных покрывающих материалов являются поли(этиленоксидные) продукты (полиэтиленгликоль, PEG) со средним молярным весом 1000-20000; этоксилированные нонилфенолы, содержащие 16-50 этиленоксидных звеньев; этоксилированные жирные спирты, в которых спирт содержит от 12 до 20 атомов углерода и в которых присутствует от 15 до 80 этиленоксидных звеньев; жирные спирты; жирные кислоты; а также моно-, и ди-, и триглицериды жирных кислот. Примеры пленкообразующих покрывающих материалов, подходящих для нанесения с помощью методик с применением псевдоожиженного слоя, приведены в GB1483591. Жидкие ферментные препараты можно, например, стабилизировать путем добавления полиола, такого как пропиленгликоль, сахара или сахароспирта, молочной кислоты или борной кислоты в соответствии с общепризнанными способами. Защищенные ферменты можно получать в соответствии со способом, раскрытым в EP238216.

Средства, ингибирующие перенос красителя. Композиции по настоящему изобретению также могут включать одно или несколько средств, ингибирующих перенос красителя. Подходящие полимерные средства, ингибирующие перенос красителя, включают без ограничения полимеры поливинилпирролидона, полимеры полиамин-N-оксида, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и поливинилимидазолы или их смеси. Средства, ингибирующие перенос красителя, если они присутствуют в композиции, могут присутствовать в количествах от 0,0001 до 10 вес. %, от 0,01 до 5 вес. % или от 0,1 до 3 вес. %.

Осветлители. Композиции по настоящему изобретению также могут содержать дополнительные компоненты, которые могут изменять насыщенность цвета изделия, которое очищают, например флюоресцентные осветлители.

Композиция может содержать флюоресцентный осветлитель с C.I. 260 в альфа-кристаллической форме, имеющий следующую структуру:

В одном аспекте осветлитель представляет собой растворимый в холодной воде осветлитель, например флюоресцентный осветлитель с C.I. 260 в альфа-кристаллической форме. В одном аспекте осветлитель преимущественно находится в альфа-кристаллической форме, что означает, что, как правило, по меньшей мере 50 вес. %, по меньшей мере 75 вес. %, по меньшей мере 90 вес. %, по меньшей мере 99 вес. % или даже, по сути, весь флюоресцентный осветлитель с C.I. 260 находится в альфа-кристалличесткой форме.

Осветлитель, как правило, находится в форме тонкоизмельченных частиц, имеющих средневесовой размер первичной частицы от 3 до 30 микрометров, от 3 микрометров до 20 микрометров или от 3 до 10 микрометров.

Композиция может содержать флюоресцентный осветлитель с C.I. 260 в бета-кристаллической форме, и весовое соотношение (i) флюоресцентного осветлителя с C.I. 260 в альфа-кристаллической форме и (ii) флюоресцентного осветлителя с C.I. 260 в бета-кристаллической форме может составлять по меньшей мере 0,1 или по меньшей мере 0,6. Патентный документ BE680847 относится к способу получения флюоресцентного осветлителя с C.I 260 в альфа-кристаллической форме.

Коммерческие оптические осветлители, которые могут быть пригодными в настоящем изобретении, могут быть разделены на подгруппы, которые включают, но необязательно ограничиваются этим, производные стильбена, пиразолина, кумарина, карбоновой кислоты, метинцианинов, дибензотиофен-5,5-диоксида, азолов, гетероциклов с 5- и 6-членным кольцом и других различных веществ. Примеры таких осветлителей раскрыты в "The Production and Application of Fluorescent Brightening Agents", M. Zahradnik, опубликованном John Wiley & Sons, New York (1982). Конкретные неограничивающие примеры оптических осветлителей, которые являются пригодными в настоящих композициях, представляют собой средства, указанные в US4790856 и US3646015.

Следующий подходящий осветлитель имеет приведенную ниже структуру:

Количества подходящего флюоресцентного осветлителя включают нижние значения количества от 0,01 вес. %, от 0,05 вес. %, от 0,1 вес. % или от 0,2 вес. % до верхних значений количества 0,5 вес. % или 0,75 вес. %.

В одном аспекте осветлитель может быть загружен в глину с образованием частицы. Силикатные соли. Композиции по настоящему изобретению также могут содержать силикатные соли, например, силикат натрия или калия. Композиция может содержать от 0 вес. % до менее 10 вес. % силикатной соли, до 9 вес. %, или до 8 вес. %, или до 7 вес. %, или до 6 вес. %, или до 5 вес. %, или до 4 вес. %, или до 3 вес. %, или даже до 2 вес. % и от более 0 вес. %, или от 0,5 вес. %, или от 1 вес. % силикатной соли. Подходящей силикатной солью является силикат натрия.

Диспергирующие средства. Композиции по настоящему изобретению также могут содержать диспергирующие средства. Подходящие растворимые в воде органические материалы включают гомо- или сополимерные кислоты или их соли, в которых поликарбоновая кислота содержит по меньшей мере два карбоксильных радикала, отделенных друг от друга не более чем двумя атомами углерода.

Стабилизаторы ферментов. Ферменты для применения в композициях могут быть стабилизированы с помощью различных методик. Ферменты, применяемые согласно настоящему документу, могут быть стабилизированы при присутствии растворимых в воде источников ионов кальция и/или магния. Примерами общепринятых стабилизирующих средств являются, например, полиол, такой как пропиленгликоль или глицерин, сахар или сахароспирт, пептидный альдегид, молочная кислота, борная кислота или производное борной кислоты, например ароматический сложный эфир борной кислоты, или производное фенилбороновой кислоты, например 4-формилфенилбороновая кислота, и композицию можно составить, как описано, например, в WO92/19709 и WO92/19708. В случае водных композиций, содержащих протеазу, для улучшения стабильности можно дополнительно добавлять обратимый ингибитор протеазы, такой как соединение бора, в том числе борат, 4-формилфенилбороновую кислоту, фенилбороновую кислоту и ее производные, или соединения, такие как формиат кальция, формиат натрия и 1,2-пропандиол. Пептидный альдегид может иметь формулу B₂-B₁-B₀-R, где R представляет собой водород, CH₃, CX₃, CHX₂ или CH₂X, где X представляет собой атом галогена; B₀ представляет собой остаток фенилаланина с заместителем OH в пара-положении и/или в мета-положении; B₁ представляет собой один остаток аминокислоты; и B₂ состоит из одного или нескольких аминокислотных остатков, необязательно содержащих N-концевую защитную группу. Предпочтительные пептидные альдегиды включают без ограничения Z-RAY-H, Ac-GAY-H, Z-GAY-H, Z-GAL-H, Z-GAF-H, Z-GAV-H, Z-RVY-H, Z-LVY-H, Ac-LGAY-H, Ac-FGAY-H, Ac-YGAY-H, Ac-FGVY-H или Ac-WLVY-H, где Z представляет собой бензилоксикарбонил, а Ac представляет собой aцетил.

Растворители. Подходящие растворители включают воду и другие растворители, например, липофильные жидкости. Примеры подходящих липофильных жидкостей включают силоксаны, другие кремнийорганические соединения, углеводороды, простые эфиры гликолей, производные глицерина, такие как эфиры глицерина, перфторированные амины, перфторированные и гидрофторэфирные растворители, низколетучие нефторированные органические растворители, диольные растворители, другие экологически безопасные растворители и их смеси.

Структурообразующее средство/загустители. Структурированные жидкости могут быть или внутренне структурированными, при этом структура образована первичными ингредиентами (например, материалом поверхностно-активного вещества), и/или наружно структурированными путем обеспечения структуры трехмерной матрицы с использованием вторичных ингредиентов (например, полимеров, глины и/или силикатного материала). Композиция может содержать структурообразующее средство в количестве от 0,01 до 5 вес. % или от 0,1 до 2,0 вес. %. Структурообразующее средство, как правило, выбрано из группы, состоящей из диглицеридов и триглицеридов, дистеарата этиленгликоля, микрокристаллической целлюлозы, материалов на основе целлюлозы, микроволокнистой целлюлозы, гидрофобно модифицированных набухающих в щелочных условиях эмульсий, таких как Polygel W30 (3VSigma), биополимеров, ксантановой камеди, геллановой камеди и их смесей. Подходящее структурообразующее средство включает гидрогенизированное касторовое масло и его неэтоксилированные производные. Подходящее структурообразующее средство раскрыто в US6855680. Такие структурообразующие средства имеют нитеобразную структурообразующую систему с диапазоном соотношений размеров. Другие подходящие структурообразующие средства и способы их получения описаны в WO10/034736.

Модификаторы. Композиция по настоящему изобретению может включать жирное соединение с высокой точкой плавления. Жирное соединение с высокой точкой плавления, пригодное согласно данному документу, имеет точку плавления 25°C или выше и выбрано из группы, состоящей из жирных спиртов, жирных кислот, производных жирных спиртов, производных жирных кислот и их смесей. Такие соединения с низкой точкой плавления не предназначены для включения в данный раздел. Неограничивающие примеры соединений с высокой точкой плавления можно найти в International Cosmetic Ingredient Dictionary, Fifth Edition, 1993, и CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition, 1992.

Жирное соединение с высокой точкой плавления включено в композицию в количестве от 0,1 до 40 вес. %, от 1 до 30 вес. %, от 1,5 до 16 вес. %, от 1,5 до 8 вес. % с целью обеспечения таких положительных эффектов улучшенной модификации, как ощущение гладкости при нанесении на влажные волосы, ощущение мягкости и увлажненности на сухих волосах.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать катионный полимер. Концентрации катионного полимера в композиции, как правило, находятся в диапазоне от 0,05 до 3 вес. %, от 0,075 до 2,0 вес. % или от 0,1 до 1,0 вес. %. Подходящие катионные полимеры будут характеризоваться значениями плотности катионного заряда, составляющими по меньшей мере 0,5 мэкв/г, по меньшей мере 0,9 мэкв/г, по меньшей мере 1,2 мэкв/г, по меньшей мере 1,5 мэкв/г или менее 7 мэкв/г и менее 5 мэкв/г, при предполагаемом pH применения композиция, причем это значение pH, как правило, будет находиться в диапазоне от pH 3 до pH 9 или от pH 4 до pH 8. В данном документе "плотность катионного заряда" полимера относится к соотношению числа положительных зарядов полимера и молекулярного веса полимера. Средний молекулярный вес таких подходящих катионных полимеров обычно будет составлять от 10000 до 10 миллионов, от 50000 до 5 миллионов или от 100000 до 3 миллионов.

Подходящие катионные полимеры для применения в композициях по настоящему изобретению содержат катионные азотсодержащие фрагменты, например, четвертичный аммоний или катионные протонированные амино-фрагменты. Можно применять любые анионные противоионы совместно с катионными полимерами, поскольку полимеры остаются растворимыми в воде, в композиции или в фазе коацервата композиции, и поскольку противоионы физически и химически совместимы с основными компонентами композиции или не ухудшают каким-либо другим нежелательным образом эффективность, стабильность или эстетические характеристики композиции. Неограничивающие примеры таких противоионов включают галиды (например, хлорид, фторид, бромид, йодид), сульфат и метилсульфат.

Неограничивающие примеры таких полимеров описаны в 3-м издании CTFA Cosmetic Ingredient Dictionary под редакцией Estrin, Crosley и Haynes (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D.C. (1982)).

Другие подходящие катионные полимеры для применения в композиции включают полисахаридные полимеры, катионные производные гуаровой камеди, содержащие четвертичный азот эфиры целлюлозы, синтетические полимеры, coполимеры этерифицированной целлюлозы, гуаровой камеди и крахмала. В случае применения катионные полимеры согласно данному документу являются либо растворимыми в композиции, либо растворимыми в фазе коацервата с координационными связями в композиции, образованной катионным полимером и анионным, амфотерным и/или цвиттер-ионным компонентом, представляющим собой поверхностно-активное вещество, описанным в данном документе ранее. Коацерваты с координационными связями катионного полимера также могут быть образованы другими заряженными материалами в композиции. Подходящие катионные полимеры описаны в US3962418; US3958581 и US2007/0207109.

Композиция по настоящему изобретению может включать неионогенный полимер в качестве модификатора. Согласно данному документу пригодными являются полиалкиленгликоли, имеющие молекулярный вес более 1000. Пригодными являются таковые, имеющие следующую общую формулу:

где R⁹⁵ выбран из группы, состоящей из H, метила и их смесей. Модификаторы, и в частности кремнийорганические соединения, могут быть включены в композицию. Модификаторы, пригодные в композициях по настоящему изобретению, как правило, содержат нерастворимую в воде, диспергируемую в воде нелетучую жидкость, которая образует эмульгированные жидкие частицы. Подходящими модификаторами для применения в композиции являются те модификаторы, которые обычно характеризуются как кремнийорганические соединения (например, силиконовые масла, катионные силиконы, ненаполненные силиконовые каучуки, силиконы с высоким показателем преломления и силиконовые смолы), органические модифицирующие масла (например, углеводородные масла, полиолефины и жирные сложные эфиры) или их комбинации, или те модификаторы, которые каким-либо другим образом образуют жидкие диспергированные частицы в водной матрице поверхностно-активного вещества согласно данному документу. Такие модификаторы должны быть физически и химически совместимыми с основными компонентами композиции и не должны каким-либо другим нежелательным образом ухудшать стабильность, эстетические характеристики или эффективность композиции.

Концентрация модификатора в композиции должна быть достаточной для обеспечения необходимых положительных эффектов модификации. Такая концентрация может варьировать в зависимости от модификатора, необходимой эффективности модификации, среднего размера частиц модификатора, типа и концентрации других компонентов и других подобных факторов.

Концентрация силиконового модификатора, как правило, находится в диапазоне от 0,01 до 10 вес. %. Неограничивающие примеры подходящих кремнийорганических модификаторов и необязательных суспендирующих средств для кремнийорганического соединения описаны в переизданном патенте США № 34584; US5104646; US5106609; US4152416; US2826551; US3964500; US4364837; US6607717; US6482969; US5807956; US5981681; US6207782; US7465439; US7041767; US7217777; US2007/0286837A1; US2005/0048549A1; US2007/0041929A1; GB849433; DE10036533, все из которых включены в данный документ посредством ссылки; Chemistry and Technology of Silicones, New York: Academic Press (1968); General Electric Silicone Rubber Product Data Sheets SE 30, SE 33, SE 54 и SE 76; Silicon Compounds, Petrarch Systems, Inc. (1984); и в Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, vol. 15, 2d ed., pp 204-308, John Wiley & Sons, Inc. (1989).

Композиции по настоящему изобретению также могут содержать от 0,05 до 3 вес. % по меньшей мере одного органического модифицирующего масла в качестве модификатора, либо отдельно, либо в комбинации с другими модификаторами, например, кремнийорганическими соединениями (описанными в данном документе). Подходящие модифицирующие масла включают углеводородные масла, полиолефины и жирные сложные эфиры. Также подходящими для применения в композициях согласно данному документу являются модификаторы, описанные в US5674478 и US5750122 или в US4529586; US4507280; US4663158; US4197865; US4217914; US4381919 и US4422853.

Гигиена и неприятный запах. Композиции по настоящему изобретению также могут содержать одно или несколько из рицинолеата цинка, тимола, четвертичных аммониевых солей, например, Bardac®, полиэтилениминов (например, Lupasol® от BASF) и их комплексов с цинком, серебра и соединений серебра, в частности, соединений, предназначенных для медленного высвобождения Ag⁺, или дисперсий нано-серебра.

Пробиотики. Композиции могут содержать пробиотики, например, описанные в WO09/043709.

Пенообразователи. Если необходимо сильное пенообразование, в композиции могут быть введены пенообразователи, такие как C₁₀-C₁₆алканоламиды или C₁₀-C₁₄алкилсульфаты, как правило, в количествах от 1 до 10 вес. %. C₁₀-C₁₄моноэтанол- и диэтаноламиды представляют типичный класс таких пенообразователей. Применение таких пенообразователей со вспомогательными поверхностно-активными веществами, характеризующимися сильным пенообразованием, такими как аминоксиды, бетаины и сультаины, приведенные выше, также является преимущественным. При необходимости можно добавлять растворимые в воде соли магния и/или кальция, например, MgCl₂, MgSO₄, CaCl₂, CaSO₄ и т. п., как правило, в количествах от 0,1 до 2 вес. % с обеспечением дополнительного количества мыльной пены и с повышением эффективности удаления жиров и масел.

Подавители образования мыльной пены. В композиции по настоящему изобретению можно вводить соединения для снижения или подавления образования мыльной пены. Подавление образования мыльной пены может иметь особое значение в так называемом "процессе очищения с высокой концентрацией", как описано в US4489455 и US4489574, и в стиральных машинах с конструкцией фронтальной загрузки. В качестве подавителей образования мыльной пены можно применять широкий круг материалов, и подавители образования мыльной пены хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Third Edition, Volume 7, p.430-447 (John Wiley & Sons, Inc., 1979). Примеры подавителей образования мыльной пены включают монокарбоновую жирную кислоту и ее растворимые соли, высокомолекулярные углеводороды, такие как парафин, сложные эфиры жирных кислот (например, триглицериды жирных кислот), сложные эфиры жирных кислот и одновалентных спиртов, алифатические C₁₈-C₄₀кетоны (например, стеарон), N-алкилированные аминотриазины, воскообразные углеводороды, предпочтительно имеющие точку плавления ниже приблизительно 100°C, силиконовые подавители образования мыльной пены и вторичные спирты. Подавители образования мыльной пены описаны в US2954347; US4265779; US4265779; US3455839; US3933672; US4652392; US4978471; US4983316; US5288431; US4639489; US4749740; US4798679; US4075118; EP89307851.9; EP150872 и DOS 2124526.

Для любых моющих композиций, применяемых в автоматических стиральных машинах, мыльная пена не должна образовываться в той степени, когда она выходит за пределы стиральной машины. Подавители образования мыльной пены, если их используют, предпочтительно присутствуют в "подавляющем образование мыльной пены количестве". Под "подавляющим образование мыльной пены количеством" понимают, что специалист, занимающийся составлением композиции, может выбрать количество данного средства для контроля пенообразования, которое будет в достаточной степени контролировать образование мыльной пены, что дает в результате моющее средство для стирки белья с низким пенообразованием для применения в автоматических стиральных машинах.

Композиции согласно данному документу обычно будут содержать от 0 до 10 вес. % подавителя образования мыльной пены. При использовании в качестве подавителей мыльной пены монокарбоновые жирные кислоты и их соли, как правило, будут присутствовать в количествах до 5 вес. %. Предпочтительно используют от 0,5 до 3 вес. % жирного монокарбоксилатного подавителя образования мыльной пены. Силиконовые подавители образования мыльной пены, как правило, используют в количествах до 2,0 вес. %, хотя можно применять и большие количества. Моностеарилфосфатные подавители образования мыльной пены, как правило, используют в количествах в диапазоне от 0,1 до 2 вес. %. Углеводородные подавители мыльной пены, как правило, используют в количествах в диапазоне от 0,01 до 5,0 вес. %, хотя можно применять и большие количества. Спиртовые подавители образования мыльной пены, как правило, применяют в количестве от 0,2 до 3 вес. %.

Композиции согласно данному документу могут обладать очищающей активностью в широком диапазоне pH. В некоторых вариантах осуществления композиции обладают очищающей активностью в диапазоне от pH 4 до pH 11,5. В других вариантах осуществления композиции являются активными в диапазоне от pH 6 до pH 11, от pH 7 до pH 11, от pH 8 до pH 11, от pH 9 до pH 11 или от pH 10 до pH 11,5.

Композиции согласно данному документу могут обладать очищающей активностью в широком диапазоне температур, например, от 10^oC или ниже до 90^oC. Предпочтительно температура будет ниже 50^oC, или 40^oC, или даже 30^oC. В некоторых вариантах осуществления оптимальный диапазон температур для композиций составляет от 10^oC до 20^oC, от 15^oC до 25^oC, от 15^oC до 30^oC, от 20^oC до 30^oC, от 25^oC до 35^oC, от 30^oC до 40^oC, от 35^oC до 45^oC или от 40^oC до 50^oC.

Форма композиции

Композиции, описанные в данном документе, преимущественно используют, например, в способах применения для стирки белья, очищения твердых поверхностей, способах применения для мытья посуды, а также в косметических способах применения, например, для зубных протезов, зубов, волос и кожи. Композиции по настоящему изобретению, в частности, представляют собой твердые или жидкие композиции для очищения и/или обработки. В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, где форма композиции выбрана из группы, состоящей из обычной, плотной или концентрированной жидкости; геля; пасты; бруска мыла; обычного или уплотненного порошка; гранулированного твердого вещества; гомогенной или многослойной таблетки с двумя или большим числом слоев (в одинаковой или разных фазах); пакета, имеющего одну или несколько камер; формы с разовой дозой, состоящей из одной или нескольких камер; или любой их комбинации.

Форма композиции может физически отделять один компонент от другого в камерах, таких как водорастворимые пакеты, или в разных слоях таблетки. Таким образом можно избежать отрицательного взаимодействия между компонентами при хранении. Различные профили растворимости каждой из камер также могут обеспечивать задержку растворения выбранных компонентов в моющем растворе.

Пакеты могут быть сформированы с одной или множеством камер. Они могут иметь любую форму, вид и материал, который является подходящим для удерживания композиции, например, без возможности высвобождения композиции из пакета до контакта с водой. Пакет сделан из водорастворимой пленки, которая охватывает внутренний объем. Указанный внутренний объем может быть разделен на камеры пакета. Предпочитаемыми пленками являются полимерные материалы, предпочтительно полимеры, которые имеют форму пленки или слоя. Предпочтительные полимеры, сополимеры или их производные выбраны из полиакрилатов и водорастворимых coполимеров акрилата, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, декстрина натрия, этилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, мальтодекстрина, полиметакрилатов, наиболее предпочтительно coполимеров поливинилового спирта и гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC). Предпочтительно, количество полимера в пленке, например PVA, составляет по меньшей мере приблизительно 60%. Предпочтительный средний молекулярный вес обычно составляет от приблизительно 20000 до приблизительно 150000. Пленки также могут состоять из смешанных композиций, содержащих гидролитически разлагаемые и водорастворимые смеси полимеров, например полилактида и поливинилового спирта (известных под торговым названием M8630, продаваемых MonoSol LLC, Индиана, США), с пластификаторами, такими как глицерин, этиленглицерин, пропиленгликоль, сорбит и их смеси. Пакеты могут содержать твердую очищающую композицию для стирки или часть компонентов и/или жидкую очищающую композицию или часть компонентов, разделенные водорастворимой пленкой. Камера для жидких компонентов может отличаться по составу от камер, содержащих твердые вещества (US2009/0011970 A1).

Растворимая в воде пленка. Композиции по настоящему изобретению также могут быть инкапсулированы внутри растворимой в воде пленки. Предпочтительными материалами пленок предпочтительно являются полимерные материалы. Материал пленки можно получить, например, путем отливки, формовки выдуванием, экструзии или экструзии с раздувом полимерного материала, как известно из уровня техники. Предпочтительные полимеры, coполимеры или их производные, подходящие для применения в качестве материала пакета, выбраны из поливиниловых спиртов, поливинилпирролидона, полиалкиленоксидов, акриламида, акриловой кислоты, целлюлозы, эфиров целлюлозы, сложных эфиров целлюлозы, амидов целлюлозы, поливинилацетатов, поликарбоновых кислот и солей, полиаминокислот или пептидов, полиамидов, полиакриламида, coполимеров малеиновой и акриловой кислот, полисахаридов, в том числе крахмала и желатина, натуральных камедей, таких как ксантановая и каррагинановая. Более предпочтительные полимеры выбраны из полиакрилатов и растворимых в воде coполимеров акрилатов, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы натрия, декстрина, этилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, мальтодекстрина, полиметакрилатов и наиболее предпочтительно выбраны из поливиниловых спиртов, coполимеров поливиниловых спиртов и гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC) и их комбинаций. Предпочтительно количество полимера в материале пакета, например полимера PVA, составляет по меньшей мере 60 вес. %. Полимер может иметь любой средневесовой молекулярный вес, предпочтительно от приблизительно 1000 до 1000000, от приблизительно 10000 до 300000, от приблизительно 20000 до 150000. Смеси полимеров также можно применять в качестве материала пакета.

Естественно, можно использовать различный материал пленки и/или пленки различной толщины при изготовлении камер по настоящему изобретению. Преимуществом при выборе разных пленок является то, что полученные в результате камеры могут проявлять разные характеристики растворимости или высвобождения.

Предпочтительными материалами пленки являются пленки PVA, известные под торговыми названиями MonoSol M8630, M8900, H8779, и описанные в US6166117 и US6787512, и пленки PVA с соответствующими характеристиками растворимости и способности к деформации.

Материал пленки согласно данному документу также может содержать один или несколько дополнительных ингредиентов. Например, преимущественным может быть добавление пластификаторов, например, глицерина, этиленгликоля, диэтиленгликоля, пропиленгликоля, сорбита и их смесей. Другие добавки включают функциональные моющие добавки для доставки в воду для стирки, например, органические полимерные диспергирующие средства и т.д.

Способы получения композиций

Композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в любой подходящей форме и получены с помощью любого способа, выбранного специалистом, занимающимся составлением композиции, неограничивающие примеры которых описаны в примерах настоящей заявки и в US4990280; US20030087791A1; US20030087790A1; US20050003983A1; US20040048764A1; US4762636; US6291412; US20050227891A1; EP1070115A2; US5879584; US5691297; US5574005; US5569645; US5565422; US5516448; US5489392; US5486303, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Композиции по настоящему изобретению или полученные в соответствии с настоящим изобретением включают композицию для очищения и/или обработки, в том числе, но без ограничения, композиции для обработки тканей, твердых поверхностей и любых других поверхностей в области ухода за тканью и домом, в том числе области улучшения качества воздуха, включая освежители воздуха и системы ароматизации, средства ухода за машиной, средства для мытья посуды, средства для кондиционирования ткани (в том числе мягчения и/или освежения), моющее средство для стирки, добавку и/или средство ухода для стирки и полоскания, средство для очищения и/или обработки твердых поверхностей, в том числе средства для очищения пола и унитаза, средства для мытья в форме гранул или порошка для широкого применения или "для тяжелой работы", в особенности очищающие моющие средства; средства для мытья в форме жидкости, геля или пасты для широкого применения, в особенности типы жидкостей для так называемой тяжелой работы; жидкие моющие средства для тонких тканей; средства для ручного мытья посуды или средства для мытья посуды, предназначенные для легкой работы, в особенности средства сильнопенящегося типа; средства для машинного мытья посуды, в том числе различные таблетированные, гранулированные, жидкие и ополаскивающие типы для бытового и промышленного применения: шампуни для машин или ковров, средства для очищения ванной комнаты, в том числе средства для очищения унитаза; а также вспомогательные очищающие средства, такие как отбеливающие добавки и "средства для удаления пятен в форме стика", или типы для предварительной обработки, нанесенные на основу композиции, такие как салфетки для добавления в сушильную установку. Предпочтительными являются композиции и способы для очищения и/или обработки текстильных изделий и/или твердых поверхностей, наиболее предпочтительно текстильных изделий. Композиции предпочтительно представляют собой композиции, применяемые на стадии предварительной обработки или основной стадии стирки способа стирки, наиболее предпочтительно для применения на стадии стирки текстильного изделия.

Применяемое в данном документе выражение "композиция для очищения и/или обработки ткани и/или твердых поверхностей" представляет собой подмножество композиций для очищения и обработки, которое включает, если не указано иное, средства для мытья в форме гранул или порошка для широкого применения или "для тяжелой работы", в особенности очищающие моющие средства; средства для мытья в форме жидкости, геля или пасты для широкого применения, в особенности типы жидкостей для так называемой тяжелой работы; жидкие моющие средства для тонких тканей; средства для ручного мытья посуды или средства для мытья посуды, предназначенные для легкой работы, в особенности средства сильнопенящегося типа; средства для машинного мытья посуды, в том числе различные таблетированные, гранулированные, жидкие и ополаскивающие типы для бытового и промышленного применения; жидкие средства для очищения и дезинфекции, шампуни для машин или ковров, средства для очищения ванной комнаты, в том числе средства для чистки унитазов; композиции для кондиционирования тканей, в том числе мягчения и/или освежения, которые могут быть в форме жидкости, твердого вещества и/или салфетки с пропиткой мягчителем-антистатиком; а также вспомогательные очищающие средства, такие как добавки для осветления и "средства для удаления пятен в форме стика", или типы для предварительной обработки, нанесенные на основу композиции, такие как салфетки для добавления в сушильную установку. Все такие композиции, которые являются применимыми, могут находиться в стандартной, концентрированной или даже высококонцентрированной форме даже до такой степени, что такие композиции в определенном аспекте могут быть безводными.

Способ применения

Настоящее изобретение включает способ очищения какой-либо поверхности, в том числе обработки текстильного изделия или твердой поверхности или других поверхностей в области тканей и/или ухода за домом. Предполагается, что описанное очищение может происходить как в малом масштабе, как например, в частном домашнем хозяйстве, так и в крупном масштабе, как например, в промышленных и специализированных условиях. В одном аспекте настоящего изобретения способ включает стадию приведения в контакт поверхности, подлежащей обработке, на стадии предварительной обработки или основной стадии стирки способа стирки, наиболее предпочтительно для применения на стадии стирки текстильного изделия или альтертативно для применения в мытье посуды, включая как ручное, так и автоматизированное/механическое мытье посуды. В одном варианте осуществления настоящего изобретения вариант липазы и другие компоненты добавляют последовательно при осуществлении способа для очищения и/или обработки поверхности. В качестве альтернативы вариант липазы и другие компоненты добавляют одновременно.

Как применяется в данном документе, стирка включает без ограничения чистку и механическое перемешивание. Стирку можно проводить с пенной композицией, как описано в WO08/101958, и/или путем периодического применения давления (давление/вакуум) в качестве дополнения или в качестве альтернативы для чистки и механического перемешивания. Высушивание таких поверхностей или тканей можно проводить с помощью каких-либо обычных средств, применяемых либо в бытовых, либо промышленных условиях. Очищающие композиции по настоящему изобретению идеально подходят для применения в способах применения для стирки белья, а также мытья посуды. Соответственно, настоящее изобретение включает способ очищения объекта, в том числе без ограничения ткани, столовых приборов, ножевых изделий и кухонной посуды. Способ включает стадии приведения объекта, подлежащего очищению, в контакт с указанной очищающей композицией, содержащей по меньшей мере один вариант осуществления очищающей композиции по настоящей заявке, очищающую добавку или их смесь. Ткань может включать большинство любых тканей, поддающихся стирке, в нормальных условиях применения потребителем или в промышленности. Раствор может иметь pH от 8 до 10,5. Композиции можно использовать с концентрациями в растворе от 500 до 15000 ppm. Температуры воды, как правило, находятся в диапазоне от 5ºC до 90ºC. Соотношение воды и ткани, как правило, составляет от 1:1 до 30:1.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу применения полипептида, по меньшей мере на 60% идентичного SEQ ID NO: 2, для получения композиции. В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции для очищения объекта.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции, включающему добавление полипептида, по меньшей мере на 60% идентичного SEQ ID NO: 2, и поверхностно-активного вещества. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу очищения поверхности, включающему приведение жирного пятна, присутствующего на поверхности, подлежащей очищению, в контакт с очищающей композицией. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу гидролиза жира, присутствующего в загрязнении и/или пятне на поверхности, включающему приведение загрязнения и/или пятна в контакт с очищающей композицией. В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции в гидролизе сложного эфира карбоновой кислоты. В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции в гидролизе, синтезе или переэтерификации сложного эфира. В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции для получения стабильного состава.

Растения

Настоящее изобретение также относится к растениям, например, трансгенному растению, части растения или клетке растения, содержащим полинуклеотид по настоящему изобретению с тем, чтобы вырабатывать и продуцировать вариант в извлекаемых количествах. Вариант можно извлечь из растения или части растения. В качестве альтернативы растение или часть растения, содержащие вариант, можно применять как таковые для улучшения качества пищи или корма, например, для улучшения пищевой ценности, вкусовой привлекательности и реологических свойств или для разрушения антипитательного фактора.

Трансгенное растение может иметь две семядоли (двудольное) или одну семядолю (однодольное). Примерами однодольных растений являются злаковые растения, такие как мятлик (мятлик луговой, Poa), кормовая трава, такая как Festuca, Lolium, трава умеренной климатической зоны, такая как Agrostis, и зерновые растения, например, пшеница, разновидности овса, рожь, ячмень, рис, сорго и маис (кукуруза).

Примерами двудольных растений являются табак, бобовые, такие как разновидности люпина, картофель, сахарная свекла, горох, фасоль и соя, и крестоцветные растения (семейство Brassicaceae), такие как цветная капуста, рапс и близкородственный модельный организм Arabidopsis thaliana.

Примерами частей растения являются стебель, каллюс, листья, корень, плоды, семена и клубни, а также отдельные ткани, составляющие эти части, например, эпидермис, мезофилл, паренхима, сосудистые ткани, меристемы. Конкретные компартменты растительной клетки, такие как хлоропласты, апопласты, митохондрии, вакуоли, пероксисомы и цитоплазма, также рассматриваются как части растения. Более того, любая растительная клетка вне зависимости от тканевого происхождения рассматривается как часть растения. Подобным образом, части растения, такие как конкретные ткани и клетки, выделенные для облегчения осуществления настоящего изобретения, также считают частями растения, например, зародыши, эндоспермы, алейрон и семенные оболочки.

В объем настоящего изобретения также включено потомство таких растений, частей растений и растительных клеток.

Трансгенное растение или клетка растения, экспрессирующие вариант, могут быть сконструированы в соответствии со способами, известными из уровня техники. Вкратце, растение или клетку растения конструируют путем включения одной или нескольких конструкций экспрессии, кодирующих вариант, в геном растения-хозяина или геном хлоропласта и размножения полученного в результате модифицированного растения или клетки растения с получением трансгенного растения или клетки растения.

Конструкция экспрессии представляет собой подходящую конструкцию нуклеиновой кислоты, которая содержит полинуклеотид, кодирующий вариант, функционально связанный с соответствующими регуляторными последовательностями, необходимыми для экспрессии полинуклеотида в выбранном растении или выбранной части растения. Более того, конструкция экспрессии может содержать селектируемый маркер, пригодный для идентификации клеток растений, в которые была интегрирована конструкция экспрессии и последовательности ДНК, необходимые для введения конструкции в указанное растение (последнее зависит от применяемого способа введения ДНК).

Выбор регуляторных последовательностей, таких как промоторные и терминаторные последовательности и необязательно последовательности сигнального или транзитного пептидов, определяется, например, на основании того, когда, где и как желательна экспрессия варианта. Например, экспрессия гена, кодирующего вариант, может быть конститутивной, или индуцибельной, или может быть связанной с развитием, специфической к стадии или ткани, и продукт гена может быть нацелен на конкретную ткань или часть растения, как например, семена или листья. Регуляторные последовательности описаны, например, в Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Для конститутивной экспрессии можно применять промотор 35S-CaMV, убиквитина 1 маиса или актина 1 риса (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Орган-специфические промоторы могут представлять собой, например, промотор из запасающих поглощающих тканей, таких как семена, клубни картофеля и плоды (Edwards and Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), или из метаболических поглощающих тканей, таких как меристемы (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), семяспецифический промотор, такой как промотор гена глутелина, проламина, глобулина или альбумина из риса (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), промотор Vicia faba из гена легумина B4 и гена неизвестного белка семени из Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), промотор из белка масляных телец семени (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), промотор гена запасного белка napA из Brassica napus или любой другой семяспецифический промотор, известный из уровня техники, например, как описано в WO 91/14772. Более того, промотор может представлять собой специфический к листьям промотор, такой как промотор rbcs из риса или томата (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), промотор гена аденинметилтрансферазы вируса хлореллы (Mitra and Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), промотор гена aldP из риса (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674) или промотор, индуцируемый повреждением, такой как промотор pin2 картофеля (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Подобным образом, промотор может индуцироваться абиотическими воздействиями, такими как температура, засуха или изменения солености, или индуцироваться экзогенно вносимыми веществами, которые активируют промотор, например, этанолом, эстрогенами, гормонами растений, такими как этилен, абсцизовая кислота и гиббереллиновая кислота, и тяжелыми металлами.

Промоторный энхансерный элемент также можно применять для достижения более высоких уровней экспрессии варианта в растении. Например, промоторный энхансерный элемент может представлять собой интрон, который расположен между промотором и полинуклеотидом, кодирующим вариант. Например, Xu et al., 1993, выше, раскрывают применение первого интрона гена актина 1 риса для усиления экспрессии.

Селектируемый маркерный ген и любые другие части конструкции экспрессии могут быть выбраны из таковых, доступных в данной области.

Конструкцию нуклеиновой кислоты включают в геном растения в соответствии с общепринятыми методиками, известными из уровня техники, в том числе опосредованной Agrobacterium трансформацией, опосредованной вирусом трансформацией, микроинъекцией, бомбардировкой частицами, биолистической трансформацией и электропорацией (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Опосредованный Agrobacterium tumefaciens перенос генов представляет собой способ создания трансгенных двудольных растений (для обзора см. Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) и для трансформации однодольных растений, хотя другие способы трансформации можно применять для этих растений. Способ создания трансгенных однодольных растений представляет собой бомбардировку частицами (микроскопическими частицами золота или вольфрама, покрытыми трансформирующей ДНК) эмбриональных каллюсов или развивающихся эмбрионов (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Альтернативный способ трансформации однодольных растений основан на трансформации протопластов, как описано Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Дополнительные способы трансформации включают описанные в патентах США №№ 6395966 и 7151204 (оба из которых включены в данный документ с помощью ссылки во всей своей полноте).

После трансформации трансформанты со встроенной конструкцией экспрессии отбирают и регенерируют с получением целых растений в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Часто процедуру трансформации разрабатывают для селективного удаления генов, по которым ведется отбор, либо во время регенерации, либо в следующих поколениях путем применения, например, контрансформации двумя отдельными конструкциями T-ДНК или сайт-специфического вырезания гена, по которому ведется отбор, специфической рекомбиназой.

Помимо непосредственной трансформации генотипа конкретного растения конструкцией по настоящему изобретению, трансгенные растения можно получить путем скрещивания растения, содержащего конструкцию, со вторым растением, у которого конструкция отсутствует. Например, конструкцию, кодирующую вариант, можно ввести в конкретный сорт растений путем скрещивания без необходимости когда-либо непосредственно трансформировать растение указанного сорта. Таким образом, настоящее изобретение охватывает не только растение, непосредственно регенерированное из клеток, которые были трансформированы в соответствии с настоящим изобретением, но также потомство таких растений. Как применяется в данном документе, потомство может относиться к потомкам любого поколения от родительского растения, полученного в соответствии с настоящим изобретением. Такое потомство может включать конструкцию ДНК, полученную в соответствии с настоящим изобретением. Скрещивание приводит в результате к введению трансгена в линию растений путем перекрестного опыления исходной линии с донорной линией растений. Неограничивающие примеры таких стадий описаны в US7151204.

Растения можно получать посредством способа превращения путем возвратного скрещивания. Например, растения включают растения, называемые превращенным путем возвратного скрещивания генотипом, линией, инбредным растением или гибридом.

Генетические маркеры могут применяться для того, чтобы способствовать интрогрессии одного или нескольких трансгенов по настоящему изобретению из одного генетического окружения в другое. Отбор с помощью маркеров предоставляет преимущества по сравнению с традиционной селекцией в том, что его можно применять для того, чтобы избежать ошибок, вызванных фенотипической изменчивостью. Кроме того, генетические маркеры могут обеспечить данные, относящиеся к относительной степени содержания элитной зародышевой плазмы в отдельном потомке конкретного скрещивания. Например, если растение с желаемым признаком, которое в остальном не имеет агрономически желаемого генетического окружения, скрещивают с элитным родителем, генетические маркеры можно применять для отбора потомства, которое не только обладает представляющим интерес признаком, но также имеет сравнительно высокую долю желаемой зародышевой плазмы. Таким образом, количество поколений, необходимое для интрогрессии одного или нескольких признаков в конкретное генетическое окружение, сведено к минимуму.

Настоящее изобретение также относится к способам получения варианта по настоящему изобретению, включающим: (a) культивирование трансгенного растения или клетки растения, содержащих полинуклеотид, кодирующий вариант в условиях, благоприятных для получения варианта; и (b) извлечение варианта.

Настоящее изобретение дополнительно описывается следующими примерами, которые не следует толковать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Анализ стабильности при хранении в реальном времени

Протокол A: моющее средство

После титрирования активного центра очищенные варианты липаз разводили буфером (10 мМ янтарной кислоты + 2 мМ CaCl₂ + 0,02% Brij 35, доводили до pH 6,5) до определенной концентрации. 10 мкл 100 ppm раствора липазы добавляли к 90 мкл моющей композиции, перемешивали в течение 5 минут и запечатывали. Образцы хранили при 4°C в моющем средстве D002 (неизмененные условия) и моющем средстве D001 или D002 при 47°C (измененные условия). Время хранения составляло 335,5 часа.

После хранения возможную конденсационную жидкость собирали путем центрифугирования. К 100 мкл содержавшегося в измененных или неизмененных условиях образца добавляли 235 мкл буфера (0,1 M Tris-HCl, 9 мМ CaCl₂, 0,0225% Brij-30, pH 8,0 + 0,85% 4-FBPA (31,5 г/л)) в соответствии с 3,35-кратным разведением. Через 10 минут перемешивания 5 мкл аликвот образца дополнительно 60-кратно разводили тем же буфером. Затем одну часть данных разведенных липаз смешивали с четырьмя частями 0,5 мМ pNP-пальмитата, 1 мМ хлорида кальция, 100 мМ Tris (pH 8,0), 6,5 мМ дезоксихолата, 1,4 г/л AOS и в течение 30 минут спектрофотометрически измеряли высвобождение pNP хромофора. Это применяли для определения активности через исходный тангенс угла наклона кривой реакции.

Остаточную активность рассчитывали как отношение измеренных скоростей образца, содержавшегося в измененных условиях, к таковым образца, содержавшегося в неизмененных условиях. Среднее значение остаточной активности рассчитывали на основании четырех повторностей и нормализовали по отношению к данным эталонного пропускания варианта липазы с каждым набором условий проведения эксперимента.

Период полужизни (T_1/2) рассчитывали на основании следующей формулы:

период полужизни = время при измененных условиях * ln(0,5)/ln(остаточная активность).

Коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для определенных мутаций рассчитывали путем деления значения периода полужизни варианта липазы на значение периода полужизни исходной липазы.

Период полужизни Lipex определяли при времени инкубации 23,25 ч при тех же условиях. Остаточная активность составляла 6% в D001 и 20% в D002, в результате периоды полужизни составляли 6 и 10 часов, соответственно.

Протокол B: моющее средство с протеазой

После титрирования активного центра очищенные варианты липаз разводили буфером (10 мМ янтарной кислоты + 2 мМ CaCl₂ + 0,02% Brij 35, доводили до pH 6,5) до определенной концентрации. 10 мкл 100 ppm раствора липазы добавляли к 70 мкл моющей композиции, перемешивали в течение 5 минут и запечатывали. Образцы хранили при 4°C в моющем средстве D001 без протеазы (неизмененные условия) и моющем средстве D001 с 1,35% Savinase 16L при 30°C (измененные условия). Время хранения составляло 160 часов.

После хранения возможную конденсационную жидкость собирали путем центрифугирования. К 100 мкл содержавшегося в измененных или неизмененных условиях образца добавляли 230 мкл буфера (0,1 M Tris-HCl, 9 мМ CaCl₂, 0,0225% Brij-30, pH 8,0 + 0,85% 4-FBPA (31,5 г/л)) в соответствии с 3,3-кратным разведением. Через 5 минут перемешивания 5 мкл аликвот образца дополнительно 60-кратно разводили тем же буфером. Затем одну часть данных разведенных липаз смешивали с четырьмя частями 0,5 мМ pNP-пальмитата, 1 мМ хлорида кальция, 100 мМ Tris (pH 8,0), 6,5 мМ дезоксихолата, 1,4 г/л AOS и в течение 30 минут спектрофотометрически измеряли высвобождение pNP хромофора. Это применяли для определения активности через исходный тангенс угла наклона кривой реакции.

Остаточную активность рассчитывали как отношение измеренных скоростей образца, содержавшегося в измененных условиях, к таковым образца, содержавшегося в неизмененных условиях. Среднее значение остаточной активности рассчитывали на основании четырех повторностей и нормализовали по отношению к данным эталонного пропускания варианта липазы с каждым набором условий проведения эксперимента.

Период полужизни (T_1/2) рассчитывали на основании следующей формулы:

период полужизни = время при измененных условиях * ln(0,5)/ln(остаточная активность).

Коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для определенных мутаций рассчитывали путем деления значения периода полужизни варианта липазы на значение периода полужизни исходной липазы.

Период полужизни Lipex определяли при времени инкубации 23,25 ч. при тех же условиях. Остаточная активность составляла 15% в D001 с 1,35% Savinase, в результате период полужизни составлял 8,5 часа.

Протокол C: моющее средство с протеазой

Протокол осуществляли, по сути, как описано для протокола B, за исключением того, что инкубацию при измененных условиях осуществляли при 25°C в течение 164 часов. Lipex в данных условиях характеризовался остаточной активностью 4% и периодом полужизни 35 часов.

Протокол D: моющее средство

После титрирования активного центра очищенные варианты липаз разводили буфером (10 мМ янтарной кислоты + 2 мМ CaCl₂ + 0,02% Brij 35, доводили до pH 6,5) до определенной концентрации. 10 мкл 100 ppm раствора липазы добавляли к 90 мкл моющей композиции, перемешивали в течение 5 минут и запечатывали. Образцы хранили при 4°C в моющем средстве D002 (неизмененные условия) и моющем средстве D001 или D002 при 47°C (измененные условия). Время хранения составляло 13,33 часа.

После хранения возможную конденсационную жидкость собирали путем центрифугирования. К 100 мкл содержавшегося в измененных или неизмененных условиях образца добавляли 235 мкл буфера (0,1 M Tris-HCl, 9 мМ CaCl₂, 0,0225% Brij-30, pH 8,0 + 0,85% 4-FBPA (31,5 г/л)) в соответствии с 3,35-кратным разведением. Через 10 минут перемешивания 5 мкл аликвот образца дополнительно 60-кратно разводили тем же буфером. Затем одну часть данных разведенных липаз смешивали с четырьмя частями 0,5 мМ pNP-пальмитата, 1 мМ хлорида кальция, 100 мМ Tris (pH 8,0), 6,5 мМ дезоксихолата, 1,4 г/л AOS и в течение 30 минут спектрофотометрически измеряли высвобождение pNP хромофора. Это применяли для определения активности через исходный тангенс угла наклона кривой реакции.

Остаточную активность рассчитывали как отношение измеренных скоростей образца, содержавшегося в измененных условиях, к таковым образца, содержавшегося в неизмененных условиях. Среднее значение остаточной активности рассчитывали на основании четырех повторностей и нормализовали по отношению к данным эталонного пропускания варианта липазы с каждым набором условий проведения эксперимента.

Период полужизни (T_1/2) рассчитывали на основании следующей формулы:

период полужизни = время при измененных условиях * ln(0,5)/ln(остаточная активность).

Коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для определенных мутаций рассчитывали путем деления значения периода полужизни варианта липазы на значение периода полужизни исходной липазы.

Протокол E: моющее средство с протеазой

После титрирования активного центра очищенные варианты липаз разводили буфером (10 мМ янтарной кислоты + 2 мМ CaCl₂ + 0,02% Brij 35, доводили до pH 6,5) до определенной концентрации. 10 мкл 100 ppm раствора липазы добавляли к 90 мкл моющей композиции, перемешивали в течение 5 минут и запечатывали. Образцы хранили при 4°C в моющем средстве D001 без протеазы (неизмененные условия) и моющем средстве D001 с 1,35% Savinase 16L при 30°C (измененные условия). Время хранения составляло 13,33 часа.

После хранения возможную конденсационную жидкость собирали путем центрифугирования. К 100 мкл содержавшегося в измененных или неизмененных условиях образца добавляли 235 мкл буфера (0,1 M Tris-HCl, 9 мМ CaCl₂, 0,0225% Brij-30, pH 8,0 + 0,85% 4-FBPA (31,5 г/л)) в соответствии с 3,35-кратным разведением. Через 5 минут перемешивания 5 мкл аликвот образца дополнительно 60-кратно разводили тем же буфером. Затем одну часть данных разведенных липаз смешивали с четырьмя частями 0,5 мМ pNP-пальмитата, 1 мМ хлорида кальция, 100 мМ Tris (pH 8,0), 6,5 мМ дезоксихолата, 1,4 г/л AOS и в течение 30 минут спектрофотометрически измеряли высвобождение pNP хромофора. Это применяли для определения активности через исходный тангенс угла наклона кривой реакции.

Остаточную активность рассчитывали как отношение измеренных скоростей образца, содержавшегося в измененных условиях, к таковым образца, содержавшегося в неизмененных условиях. Среднее значение остаточной активности рассчитывали на основании четырех повторностей и нормализовали по отношению к данным эталонного пропускания варианта липазы с каждым набором условий проведения эксперимента.

Период полужизни (T_1/2) рассчитывали на основании следующей формулы:

период полужизни = время при измененных условиях * ln(0,5)/ln(остаточная активность).

Коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для определенных мутаций рассчитывали путем деления значения периода полужизни варианта липазы на значение периода полужизни исходной липазы.

Протокол F: культуральный бульон с продуцируемым вариантом фермента, инкубированный в моющем средстве

Штаммы Aspergillus oryzae, продуцирующие вариант липазы, выращивали в течение 5 дней при 37^oC в среде 2xSC с 2% мальтозы без встряхивания. Среда 2xSC представляет собой 15 г основы азотного агара для дрожжей без аминокислот (Difco 291920), 22,6 г янтарной кислоты (Merck 822260), 13,6 г гидроксида натрия (Merck 106498), 11,2 г казаминокислот (витаминный анализ, Difco 228830) и 0,2 г L-триптофана (Merck 108374), растворенные в 1 л деионизированной воды.

10 мкл культурального бульона добавляли к 90 мкл моющей композиции, перемешивали в течение 5 минут и запечатывали. Образцы хранили при -20°C в моющем средстве D001 (неизмененные условия) и моющем средстве D001 при 47°C (измененные условия). Время хранения указано в таблицах данных.

После хранения возможную конденсационную жидкость собирали путем центрифугирования. К 100 мкл содержавшегося в измененных или неизмененных условиях образца добавляли 230 мкл буфера (0,1 M Tris-HCl, 9 мМ CaCl₂, 0,0225% Brij-30, pH 8,0 + 0,85% 4-FBPA (31,5 г/л)) в соответствии с 3,3-кратным разведением. Через 10 минут перемешивания 5 мкл аликвот образца дополнительно 60-кратно разводили тем же буфером. Затем одну часть данных разведенных липаз смешивали с четырьмя частями 0,5 мМ pNP-пальмитата, 1 мМ хлорида кальция, 100 мМ Tris (pH 8,0), 6,5 мМ дезоксихолата, 1,4 г/л AOS и в течение 30 минут спектрофотометрически измеряли высвобождение pNP хромофора. Это применяли для определения активности через исходный тангенс угла наклона кривой реакции.

Остаточную активность рассчитывали как отношение измеренных скоростей образца, содержавшегося в измененных условиях, к таковым образца, содержавшегося в неизмененных условиях. Период полужизни (T_1/2) рассчитывали на основании следующей формулы:

период полужизни = время при измененных условиях * ln(0,5)/ln(остаточная активность).

Среднее значение остаточной активности и периоды полужизни рассчитывали на основании четырех повторностей.

Коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для определенных мутаций рассчитывали путем деления значения периода полужизни варианта липазы на значение периода полужизни исходной липазы.

Протокол G: культуральный бульон с продуцируемым вариантом фермента, инкубированный в моющем средстве с протеазой

10 мкл культурального бульона из протокола F добавляли к 90 мкл моющей композиции, перемешивали в течение 5 минут и запечатывали. Образцы хранили при -20°C в моющем средстве D001 без протеазы (неизмененные условия) и моющем средстве D001 с 1,35% Savinase 16L при 30°C (измененные условия). Время хранения указано в таблицах данных.

После хранения возможную конденсационную жидкость собирали путем центрифугирования. К 100 мкл содержавшегося в измененных или неизмененных условиях образца добавляли 230 мкл буфера (0,1 M Tris-HCl, 9 мМ CaCl₂, 0,0225% Brij-30, pH 8,0 + 0,85% 4-FBPA (31,5 г/л)) в соответствии с 3,3-кратным разведением. Через 10 минут перемешивания 5 мкл аликвот образца дополнительно 60-кратно разводили тем же буфером. Затем одну часть данных разведенных липаз смешивали с четырьмя частями 0,5 мМ pNP-пальмитата, 1 мМ хлорида кальция, 100 мМ Tris (pH 8,0), 6,5 мМ дезоксихолата, 1,4 г/л AOS и в течение 30 минут спектрофотометрически измеряли высвобождение pNP хромофора. Это применяли для определения активности через исходный тангенс угла наклона кривой реакции.

Остаточную активность рассчитывали как отношение измеренных скоростей образца, содержавшегося в измененных условиях, к таковым образца, содержавшегося в неизмененных условиях. Период полужизни (T_1/2) рассчитывали на основании следующей формулы:

период полужизни = время при измененных условиях * ln(0,5)/ln(остаточная активность).

Среднее значение остаточной активности и периоды полужизни рассчитывали на основании четырех повторностей.

Коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для определенных мутаций рассчитывали путем деления значения периода полужизни варианта липазы на значение периода полужизни исходной липазы.

ТАБЛИЦА 1A: состав D001

Компоненты (*количества на основании фактического содержания сухого вещества)	вес. %
Мягкая вода	49,0
NaOH, пеллеты	3,0
Линейная алкилсульфоновая (LAS) кислота	12,0
Соевая жирная кислота (Edenor SJ)	6,0
Кокосовая жирная кислота (Radiacid 0631)	5,0
Алкилэтоксилат C13AE8EO; (90%*)	10,0
Триэтаноламин (99/90%*)	2,0
Цитрат Na, дегидратированный	1,0
DTPMPA; диэтилентриаминпентакис(метиленфосфоновая) кислота (Dequest 2066 C2)	3,0
Пропиленгликоль	5,0
EtOH (99,9%*)	5,0
Краситель	добавлено
Средство, придающее непрозрачность (Syntran 5909,35 вес. %*)	0,1
pH	8,4

ТАБЛИЦА 1B: состав D002

Компоненты (Содержание активного компонента в ингредиенте)	вес. %
Мягкая вода	34,14
NaOH, пеллеты (>99%)	1,75
Линейная алкилбензолсульфоновая кислота (LAS) (97%)	12,00
Лаурилсульфат натрия (SLES) (28%)	17,63
Соевая жирная кислота (>90%)	2,75
Кокосовая жирная кислота (>90%)	2,75
AEO; этоксилат спирта с 8 моль EO;Lutensol TO 8 (~100%)	11,00
Триэтаноламин (100%)	3,33
Цитрат Na, дегидратированный (100%)	2,00
DTMPA; диэтилентриаминпентакис(метилен)пентакис(фосфоновая кислота), гептанатриевая соль (Dequest 2066 C) (~42% в виде Na7 соли)	0,48
MPG (>98%)	6,00
EtOH, пропан-2-ол (90/10%)	3,00
Глицерин (>99,5)	1,71
Формиат натрия (>95%)	1,00
PCA (40% в виде натриевой соли)	0,46

Пример 2. Стабилизирующий эффект D27R

Показаны значения периода полужизни в часах (T_1/2) варианта и его эталонной липазы и полученный в результате коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для эффекта D27R.

ТАБЛИЦА 2A: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом A

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	370	1,7	123	1,6
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	617	192

ТАБЛИЦА 2B: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом B

Мутации	T1/2 (ч)	HIF
N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	64	1,7
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	110

ТАБЛИЦА 2D: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом D

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
T231R N233R	3,3	1,1	13,3	1,4
D27R T231R N233R	3,6	18,3

ТАБЛИЦА 2E: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом E

Мутации	T1/2 (ч)	HIF
N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	17,5	1,5
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	26,2

ТАБЛИЦА 2F-1: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
D96E D111A G163K T231R N233R	7	2,0
D27R D96E D111A G163K T231R N233R	13

ТАБЛИЦА 2F-2: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при времени хранения 331 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R D254S P256T	189	1,7
D27R T231R N233R D254S P256T	318

ТАБЛИЦА 2G: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом G при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
D96E D111A T231R N233R	30	1,7
D27R D96E D111A T231R N233R	53*
D96E D111A G163K T231R N233R	32	11,1
D27R D96E D111A G163K T231R N233R	352

* определено на основании одной повторности

Пример 3. Стабилизирующий эффект N33Q

Показаны значения периода полужизни в часах (T_1/2) варианта и его эталонной липазы и полученный в результате коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для эффекта N33Q.

ТАБЛИЦА 3A: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом A

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	503	1,2	178	1,1
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	617	192

ТАБЛИЦА 3B: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом B

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	94	1,3
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	126

ТАБЛИЦА 3C: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом C

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	202	3,6
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	731

ТАБЛИЦА 3E: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом E

Мутации	T1/2 (ч)	HIF
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	24,0	1,4
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	33,3

Пример 4. Стабилизирующий эффект G38A

Показаны значения периода полужизни в часах (T_1/2) варианта и его эталонной липазы и полученный в результате коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для эффекта G38A.

ТАБЛИЦА 4A: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом A

Мутация	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R N33Q G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	29	21,4	43	4,5
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	617	192

ТАБЛИЦА 4B: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом B

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R N33Q G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	30	3,6
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	110

ТАБЛИЦА 4D: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом D

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R N33Q G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	4,7	>8,7	19,4	>2,1
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>41

ТАБЛИЦА 4E: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом E

Мутации	T1/2 (ч)	HIF
D27R N33Q G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	8,5	3,1
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	26,2

Пример 5. Стабилизирующий эффект G91T

Показаны значения периода полужизни в часах (T_1/2) варианта и его эталонной липазы и полученный в результате коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для эффекта G91T.

ТАБЛИЦА 5A: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом A

Мутация	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R N33Q G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	428	1,4	142	1,3
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	617	192
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	362	1,4	144	1,2
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	503	178
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	410	1,5	152	1,3
D27R G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	597	196
D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T	387	1,4	131	1,3
D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	530	172
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S	239	1,8	81	1,4
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	421	110

ТАБЛИЦА 5D: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом D

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
N33Q T231R N233R	3,8	1,3	14,3	1,3
N33Q G91T T231R N233R	5,1	18,8

Кроме того, стабилизирующий эффект замен G91I, G91N и G91V, определенный как HIF > 1, наблюдали в экспериментах с моющим средством, которые проводили, по сути, в соответствии с протоколом A, а также в экспериментах с моющим средством с протеазой, которые проводили, по сути, в соответствии с протоколом B.

ТАБЛИЦА 5F-1: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
D96E D111A T231R N233R	21	1,1
G91T D96E D111A T231R N233R	24

ТАБЛИЦА 5F-2: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при времени хранения 331 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R D254S P256T	189	3,1
G91T T231R N233R D254S P256T	584

ТАБЛИЦА 5G-1: стабильность при хранении определяли в соответствии с протоколом G при времени хранения 18 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R D254S P256T	10	1,3
G91T T231R N233R D254S P256T	13

ТАБЛИЦА 5G-2: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом G при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
D96E D111A T231R N233R	30	1,4
G91T D96E D111A T231R N233R	44

Пример 6. Стабилизирующий эффект D96E

Показаны значения периода полужизни в часах (T_1/2) варианта липазы и его эталонной липазы и полученный в результате коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для эффекта D96E.

ТАБЛИЦА 6B: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом B

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R N33Q G38A G91T D111A G163K T231R N233R D254S P256T	<21	>5,2
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	110
D27R G38A D111A G163K T231R N233R D254S P256T	34	3,6
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	125
D27R D111A G163K T231R N233R D254S P256T	47	2,6
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	124

ТАБЛИЦА 6C: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом C

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R G163K T231R N233R D254S	40	2,4
D27R D96E G163K T231R N233R D254S	96
G163K T231R N233R D254S	35	2,1
D96E G163K T231R N233R D254S	75
T231R N233R	39	1,6
D96E T231R N233R	64
T231R N233R D254S	30	2,4
D96E T231R N233R D254S	70

ТАБЛИЦА 6D: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом D

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R G38A D111A G163K T231R N233R D254S P256T	-	-	22,4	>1,8
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	-	>41
D27R D111A G163K T231R N233R D254S P256T	4,4	>9,3	24,6	>1,7
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>41
N33Q T231R N233R	3,8	1,1	14,3	1,7
N33Q D96E T231R N233R	4,1	24,9

ТАБЛИЦА 6E: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом E

Мутации	T1/2 (ч)	HIF
D27R N33Q G38A G91T D111A G163K T231R N233R D254S P256T	8,8	3,0
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	26,2
D27R G38A D111A G163K T231R N233R D254S P256T	10,8	>3,8
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41
D27R D111A G163K T231R N233R D254S P256T	10,7	3,5
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	37,2
N33Q T231R N233R	5,5	1,8
N33Q D96E T231R N233R	9,7

ТАБЛИЦА 6F-1: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R	7	6,6
D96E T231R N233R	49
D111A T231R N233R	13	1,7
D96E D111A T231R N233R	21

ТАБЛИЦА 6F-2: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при времени хранения 331 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R D254S P256T	189	1,5
D96E T231R N233R D254S P256T	285

ТАБЛИЦА 6G-1: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом G при времени хранения 18 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R D254S P256T	10	3,5
D96E T231R N233R D254S P256T	34

ТАБЛИЦА 6G-2: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом G при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R	12	2,0
D96E T231R N233R	24
D111A T231R N233R	15	2,0
D96E D111A T231R N233R	30
D111A G163K T231R N233R D254S P256T	14	5,4
D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	74

Пример 7. Стабилизирующий эффект D111A

Показаны значения периода полужизни в часах (T_1/2) варианта и его эталонной липазы и полученный в результате коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для эффекта D111A.

ТАБЛИЦА 7A: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом A

Мутация	D001T1/2 (ч)	D001 HIF	D002T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R N33Q G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	513	1,2	163	1,2
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	617	192

ТАБЛИЦА 7B: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом B

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R N33Q G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	65	1,7
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	110
D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	63	1,8
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	116
D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T	62	2,0
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	125
D27R D96E G163K T231R N233R D254S P256T	87	1,4
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	124

ТАБЛИЦА 7C: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом C

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T	111	4,1
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	452
D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	133	1,3
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	168

ТАБЛИЦА 7E: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом E

Мутации	T1/2 (ч)	HIF
D27R N33Q G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	20,7	1,3
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	26,2
D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	27,9	>1,5
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41
D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T	24,8	>1,7
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41
D27R D96E G163K T231R N233R D254S P256T	21,2	1,8
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	37,2
N33Q T231R N233R	5,5	1,3
N33Q D111A T231R N233R	7,2

ТАБЛИЦА 7F-1: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R	7	1,7
D111A T231R N233R	13

ТАБЛИЦА 7F-2: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при времени хранения 331 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R D254S P256T	189	2,0
D111A T231R N233R D254S P256T	379
D96E G163K T231R N233R D254S P256T	206*	1,3
D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	264

* определено на основании двух повторностей.

ТАБЛИЦА 7G-1: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом G при времени хранения 18 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R D254S P256T	10	1,8
D111A T231R N233R D254S P256T	17

ТАБЛИЦА 7G-2: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом G при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R	12	1,3
D111A T231R N233R	15
D96E T231R N233R	24	1,3
D96E D111A T231R N233R	30
D96E G163K T231R N233R D254S P256T	25*	3,0
D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	74

* определено на основании двух повторностей.

Пример 8. Стабилизирующий эффект G163K

ТАБЛИЦА 8A: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом A

Мутация	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A T231R N233R D254S P256T	114	5,4	78	2,5
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	617	192

ТАБЛИЦА 8B: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом B

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A T231R N233R D254S P256T	54	2,0
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	110

ТАБЛИЦА 8D: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом D

Мутация	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A T231R N233R D254S P256T	6,9	>6,0	21,8	>1,9
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>41

ТАБЛИЦА 8E: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом E

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A T231R N233R D254S P256T	10,4	2,5
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	26,2
D27R G38A D96E D111A T231R N233R D254S P256T	32,6	1,3
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41

Пример 9. Стабилизирующий эффект D254S

Показаны значения периода полужизни в часах (T_1/2) варианта и его эталонной липазы и полученный в результате коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для эффекта D254S.

ТАБЛИЦА 9A: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом A

Мутация	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R P256T	143	4,3	91	2,1
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	617	192
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R P256T	62	5,8	<41	>3,5
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	362	144
D27R D96E D111A G163K T231R N233R P256T	87	4,7	53	2,8
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	410	152
T231R N233R	3,3	32,7	13,3	3,8
T231R N233R D254S	108	50

ТАБЛИЦА 9B: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом B

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R P256T	79	1,4
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	110
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R P256T	66	1,9
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	125
D27R D96E D111A G163K T231R N233R P256T	107	1,2
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	124

ТАБЛИЦА 9D: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом D

Мутация	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R P256T	14,3	>2,9
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R P256T	6,5	>6,3
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41
D27R D96E D111A G163K T231R N233R P256T	7,6	>5,4
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41
T231R N233R	3,3	3,6
T231R N233R D254S	11,8

ТАБЛИЦА 9E: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом E

Мутации	T1/2 (ч)	HIF
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R P256T	27,1	>1,5
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41
D27R D96E D111A G163K T231R N233R P256T	24,0	1,6
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	37,2

ТАБЛИЦА 9F: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
D96E D111A T231R N233R	21	1,5
D96E D111A T231R N233R D254S	32
T231R N233R	7	4,8
T231R N233R D254S	35
T231R N233R P256T	32	6,0
T231R N233R D254S P256T	189*
D96E D111A G163K T231R N233R P256T	17	15,9
D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	264*

* время хранения 331 час

ТАБЛИЦА 9G-1: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом G при времени хранения 18 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R	10	1,8
T231R N233R D254S	17

ТАБЛИЦА 9G-2: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом G при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
D96E D111A T231R N233R	30	3,5
D96E D111A T231R N233R D254S	105
D96E D111A G163K T231R N233R P256T	30	2,4
D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	74

Пример 10. Стабилизирующий эффект P256T

Показаны значения периода полужизни в часах (T_1/2) варианта липазы и его эталонной липазы и полученный в результате коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для эффекта P256T.

ТАБЛИЦА 10A: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом A

Мутация	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	421	1,2	110	1,6
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	503	178
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S	239	1,5	81	1,8
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	362	144
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	315	2,0	89	2,2
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	617	192
T231R N233R D254S	108	3,1	50	2,4
T231R N233R D254S P256T	339	120

ТАБЛИЦА 10B: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом B

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	94	1,2
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	116
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S	97	1,3
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	125
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S	116	1,1
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	124

ТАБЛИЦА 10D: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом D

Мутация	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S	30,2	>1,4	-	-
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	-
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	27,8	>1,5	-	-
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	-
T231R N233R D254S	11,8	3,0	14,0	1,2
T231R N233R D254S P256T	34,9	16,6

ТАБЛИЦА 10E: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом E

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	24,0	>1,8
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41
T231R N233R D254S	5,7	1,3
T231R N233R D254S P256T	7,3

ТАБЛИЦА 10F: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R	7	4,3
T231R N233R P256T	32
T231R N233R D254S	35	2,4
T231R N233R D254S P256T	86
D96E D111A G163K T231R N233R	7	2,4
D96E D111A G163K T231R N233R P256T	17

ТАБЛИЦА 10G-1: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом G при времени хранения 18 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
T231R N233R	10	4,2
T231R N233R P256T	41

ТАБЛИЦА 10G-2: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом G при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
D96E D111A T231R N233R	30	2,6
D96E D111A T231R N233R P256T	81

Пример 11. Стабилизирующий эффект D254S и P256T

Показаны значения периода полужизни в часах (T_1/2) варианта и его эталонной липазы и полученный в результате коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для эффекта D254S и P256T.

ТАБЛИЦА 11A: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом A

Мутация	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R D96E G163K T231R N233R	<29	>14,6	<37	>3,8
D27R D96E G163K T231R N233R D254S P256T	417	141
T231R N233R	3,3	102,7	13,3	9,0
T231R N233R D254S P256T	339	120

ТАБЛИЦА 11D: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом D

Мутация	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF
D27R D96E G163K T231R N233R	3,3	>12,5
D27R D96E G163K T231R N233R D254S P256T	>41

ТАБЛИЦА 11F: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при указанном времени хранения

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	Время при измененных условиях (ч)
D96E D111A G163K T231R N233R	7	38,8	63
D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	264	331
T231R N233R	7	28,0	63
T231R N233R D254S P256T	206	331
D96E T231R N233R	49	5,9	63
D96E T231R N233R D254S P256T	285	331
D111A T231R N233R	13	30,3	63
D111A T231R N233R D254S P256T	379	331

Пример 12. Улучшенная стабильность по сравнению с вариантом с T231R N233R

Показаны значения периода полужизни в часах (T_1/2) варианта липазы и полученный в результате коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) относительно варианта липазы с мутациями T231R N233R.

ТАБЛИЦА 12A: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом A

Мутация	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	597	181	196	14,7
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	617	187	192	14,4
D27R N33Q G38A G91T D111A G163K T231R N233R D254S P256T	580	176	184	13,8
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	503	152	178	13,4
D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	530	161	172	12,9
D27R N33Q G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	513	155	163	12,3
D27R D96E D111A G163D T231R N233R D254S P256T	465	141	157	11,8
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S	437	132	157	11,8
D27R D111A G163K T231R N233R D254S P256T	474	144	150	11,3
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	410	124	152	11,4
D27R G38A D111A G163K T231R N233R D254S P256T	439	133	150	11,3
D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	409	124	148	11,1
D27R N33Q G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	428	130	142	10,7
D27R D96E G163K T231R N233R D254S P256T	417	126	141	10,6
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	362	110	144	10,8
D27R G38A D96E D111A T231R N233R D254S P256T	380	115	139	10,5
T231R N233R D254S P256T	339	103	120	9,0
D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T	387	117	131	9,8
N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	370	112	123	9,2
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	421	128	110	8,3
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	315	95	89	6,7
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S	239	72	81	6,1
G163K T231R N233R D254S	122	37	54	4,1
N33Q G38A G91T G163K T231R N233R D254S	107	32	55	4,1
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R P256T	143	43	91	6,8
T231R N233R D254S	108	33	50	3,8
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A T231R N233R D254S P256T	114	35	78	5,9
T231R N233R	3,3	1	13,3	1

ТАБЛИЦА 12B: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом B

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R G38A D96E D111A T231R N233R D254S P256T	137	24,5
D27R D96E D111A G163D T231R N233R D254S P256T	128	22,9
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	126	22,5
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	125	22,3
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	124	22,1
D27R N33Q G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	119	21,3
D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	118	21,1
D27R G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	116	20,7
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	116	20,7
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S	116	20,7
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	110	19,6
D27R D96E D111A G163K T231R N233R P256T	107	19,1
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S	97	17,3
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	94	16,8
D27R D96E G163K T231R N233R D254S P256T	87	15,5
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R P256T	79	14,1
D27R D96E G163K T231R N233R	74	13,2
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R P256T	66	11,8
D27R N33Q G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	65	11,6
N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	64	11,4
D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	63	11,3
D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T	62	11,1
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A T231R N233R D254S P256T	54	9,6
D27R D111A G163K T231R N233R D254S P256T	47	8,4
N33Q D96E T231R N233R	44	7,9
D27R G38A D111A G163K T231R N233R D254S P256T	34	6,1
T231R N233R D254S P256T	33	5,9
T231R N233R	5,6	1,0

ТАБЛИЦА 12D: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом D

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	D002 T1/2 (ч)	D002 HIF
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	>41	>3,1
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	>41	>3,1
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	>41	>3,1
D27R D96E D111A G163D T231R N233R D254S P256T	37,2	11,3	>41	>3,1
D27R G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	>41	>3,1
D27R N33Q G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	>41	>3,1
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S	30,2	9,2	>41	>3,1
D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	>41	>3,1
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	27,8	8,4	>41	>3,1
D27R G38A D96E D111A T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	>41	>3,1
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S	>41	>12,4	>41	>3,1
D27R D96E D111A G163K T231R N233R P256T	7,6	2,3	>41	>3,1
D27R D96E G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	>41	>3,1
D27R N33Q G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	>41	>3,1
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R P256T	6,5	2,0	>41	>3,1
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	38,4	11,6	>41	>3,1
D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T	40,6	12,3	>41	>3,1
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R P256T	14,3	4,3	>41	>3,1
D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	>41	>3,1
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	>41	>3,1
D27R D96E G163K T231R N233R	3,3	1,0	>41	>3,1
N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	>41	>3,1
N33Q D96E T231R N233R	4,1	1,2	24,9	1,9
D27R D111A G163K T231R N233R D254S P256T	4,4	1,3	24,6	1,9
D27R N33Q G38A G91T D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	23,9	1,8
D27R G38A D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>12,4	22,4	1,7
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A T231R N233R D254S P256T	6,9	2,1	21,8	1,6
D27R N33Q G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	4,7	1,4	19,4	1,5
N33Q G91T T231R N233R	5,1	1,5	18,8	1,4
D27R T231R N233R	3,6	1,1	18,3	1,4
N33Q D111A T231R N233R	4,0	1,2	17,2	1,3
N33Q G38A G91T G163K T231R N233R D254S	8,1	2,4	17,0	1,3
T231R N233R D254S P256T	34,9	10,6	16,6	1,2
G163K T231R N233R D254S	12,4	3,8	15,4	1,2
N33Q T231R N233R P256T	4,3	1,3	14,4	1,1
N33Q T231R N233R	3,8	1,2	14,3	1,1
T231R N233R D254S	11,8	3,6	14,0	1,1
T231R N233R	3,3	1,0	13,3	1,0

ТАБЛИЦА 12E: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом E

Мутация	T1/2 (ч)	HIF
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S	>41	>7,3
D27R N33Q G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>7,3
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>7,3
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	>41	>7,3
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S	40,0	7,2
D27R G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	37,3	6,7
D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	37,2	6,6
D27R D96E D111A G163D T231R N233R D254S P256T	33,9	6,0
D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	33,6	6,0
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	33,3	6,0
D27R G38A D96E D111A T231R N233R D254S P256T	32,6	5,8
D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	27,9	5,0
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R P256T	27,1	4,8
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R P256T	26,3	4,7
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	26,2	4,7
D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T	24,8	4,4
D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S	24,0	4,3
D27R D96E D111A G163K T231R N233R P256T	24,0	4,3
D27R D96E G163K T231R N233R D254S P256T	21,2	3,8
D27R N33Q G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T	20,7	3,7
D27R D96E G163K T231R N233R	19,3	3,5
D27R D96E G163K T231R N233R D254S P256T	17,9	3,2
N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	17,5	3,1
D27R G38A D111A G163K T231R N233R D254S P256T	10,8	1,9
D27R D111A G163K T231R N233R D254S P256T	10,7	1,9
D27R N33Q G38A G91T D96E D111A T231R N233R D254S P256T	10,4	1,9
N33Q D96E T231R N233R	9,7	1,7
D27R N33Q G38A G91T D111A G163K T231R N233R D254S P256T	8,8	1,6
D27R N33Q G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	8,5	1,5
T231R N233R D254S P256T	7,3	1,3
N33Q D111A T231R N233R	7,2	1,3
D27R T231R N233R	6,6	1,2
N33Q T231R N233R P256T	6,5	1,2
T231R N233R D254S	5,7	1,0
T231R N233R	5,6	1,0

ТАБЛИЦА 12F: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при указанном времени хранения

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	Время при измененных условиях (ч)
G91T T231R N233R D254S P256T	584	79,3	331
D111A G163K T231R N233R D254S P256T	381	51,7	331
D111A T231R N233R D254S P256T	379	51,4	331
D27R N33Q G38A D96E D111A T231R N233R D254S P256T	372	50,5	331
D27R T231R N233R D254S P256T	318	43,1	331
D96E T231R N233R D254S P256T	285	38,6	331
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	284	38,5	331
D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	264	35,8	331
G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	262	35,6	331
N33Q D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	248	33,7	331
D96E G163K T231R N233R D254S P256T	206	27,9	331
T231R N233R D254S P256T	189	25,7	331
G163K T231R N233R D254S	88	12,0	331
D96E T231R N233R	49	6,6	63
T231R N233R D254S	35	4,8	63
D96E D111A T231R N233R D254S	32	4,4	63
T231R N233R P256T	32	4,3	63
G91T D96E D111A T231R N233R	24	3,2	63
D96E D111A T231R N233R	21	2,9	63
D96E D111A G163K T231R N233R P256T	17	2,2	63
D27R D96E D111A G163K T231R N233R	13	1,8	63
D111A T231R N233R	13	1,7	63
T231R N233R	7	1,0	63

ТАБЛИЦА 12G: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом F при указанном времени хранения. Выбирали период полужизни варианта липазы с мутациями T231R N233R, определенный при времени хранения 63 ч.

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	Время при измененных условиях (ч)
D27R N33Q G38A D96E D111A T231R N233R D254S P256T	384	33,0	162
D27R D96E D111A G163K T231R N233R	352	30,2	63
D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	324	27,8	63
D96E D111A T231R N233R D254S	105	9,0	63
D96E D111A T231R N233R P256T	81	6,9	63
D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	74	6,3	63
D27R D96E D111A T231R N233R	53*	4,6	63
G91T D96E D111A T231R N233R	44	3,7	63
T231R N233R P256T	41	3,5	18
G91T D96E T231R N233R	38	3,3	63
N33Q D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	35	3,0	63
D96E T231R N233R D254S P256T	34	2,9	18
G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T	33	2,9	63
D96E D111A G163K T231R N233R	32	2,7	63
D96E D111A T231R N233R	30	2,6	63
D96E D111A G163K T231R N233R P256T	30	2,6	63
D96E T231R N233R P256T	27	2,3	63
D96E G163K T231R N233R D254S P256T	25**	2,1	63
G38A D96E D111A T231R N233R	24	2,1	63
D96E T231R N233R	24	2,0	63
T231R N233R D254S	17	1,5	18
D111A T231R N233R D254S P256T	17	1,5	18
D111A T231R N233R	15	1,3	63
D111A G163K T231R N233R D254S P256T	14	1,2	63
G91T T231R N233R D254S P256T	13	1,1	18
T231R N233R	12	1,0	63
T231R N233R	10	0,8	18

* определено на основании одной повторности, ** определено на основании двух повторностей.

Пример 13. Стабилизирующий эффект D96E и D111A

Показаны значения периода полужизни в часах (T_1/2) варианта и его эталонной липазы и полученный в результате коэффициент улучшения периода полужизни (HIF) для эффекта D96E и D111A.

ТАБЛИЦА 13G: стабильность при хранении, которую определяли в соответствии с протоколом G при указанном времени хранения

Мутации	D001 T1/2 (ч)	D001 HIF	Время при измененных условиях (ч)
T231R N233R	12	2,6	63
D96E D111A T231R N233R	30	63
T231R N233R D254S	17	6,1	18
D96E D111A T231R N233R D254S	105	63
T231R N233R P256T	41	2,0	18
D96E D111A T231R N233R P256T	81	63

Объем описанного и заявленного в данном документе изобретения не должен ограничиваться конкретными аспектами, раскрытыми в данном документе, поскольку эти аспекты предполагаются как иллюстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Предполагается, что любые эквивалентные аспекты находятся в пределах объема настоящего изобретения. Действительно, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к продемонстрированным и описанным в данном документе станут очевидны специалистам в данной области из вышеприведенного описания. Предполагается, что такие модификации также входят в объем прилагаемой формулы изобретения. В случае противоречия настоящее раскрытие, в том числе определения, будет иметь преобладающую силу.

Настоящее изобретение далее описывается в следующих пунктах.

1. Моющая композиция, содержащая по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, по меньшей мере систему поверхностно-активных веществ, по меньшей мере одно мыло или любые их смеси и вариант исходной липазы, при этом вариант обладает липазной активностью, его последовательность по меньшей мере на 90%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO: 2, и он содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и по меньшей мере одной или нескольким из D96E, и G38A в SEQ ID NO: 2.

2. Композиция по п.1, где вариант дополнительно содержит замены в положениях, соответствующих D27R и/или N33Q в SEQ ID NO: 2.

3. Композиция по пп.1-2 где вариант липазы содержит замену, выбранную из группы:

a) D96E T231R N233R;

b) N33Q D96E T231R N233R;

c) N33Q G38A G91T G163K T231R N233R D254S;

d) N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

e) D27R N33Q G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

f) D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R P256T;

g) D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S;

h) D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

i) D96E T231R N233R D254S;

j) D27R N33Q G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T;

k) D27R G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

l) D96E G163K T231R N233R D254S;

m) D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S;

n) D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T;

o) D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T:

p) D27R D96E G163K T231R N233R D254S;

q) D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

r) D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T

s) D27R D96E D111A G163K T231R N233R;

t) D27R D96E D111A T231R N233R;

u) D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

v) D27R N33Q G38A D96E D111A T231R N233R D254S P256T;

w) D27R G38A D96E D111A G163K E210Q T231R N233R D254S P256T;

x) D96E D111A G163K T231R N233R;

y) D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

z) D96E D111A G163K T231R N233R P256T;

aa) D96E D111A T231R N233R;

bb) D96E D111A T231R N233R D254S;

cc) D96E D111A T231R N233R D254S P256T

dd) D96E D111A T231R N233R P256T;

ee) D96E G163K T231R N233R D254S P256T;

ff) D96E T231R N233R D254S P256T;

gg) D96E T231R N233R P256T;

hh) G38A D96E D111A T231R N233R;

ii) G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

jj) G91T D96E D111A T231R N233R;

kk) G91T D96E T231R N233R;

ll) N33Q D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T;

mm) D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T.

4. Композиция по любому из пп.1-3, дополнительно содержащая один или несколько ферментов, выбранных из гемицеллюлаз, пероксидаз, протеаз, целлюлаз, ксиланаз, липаз, фосфолипаз, эстераз, кутиназ, пектиназ, маннаназ, пектатлиаз, кератиназ, редуктаз, оксидаз, фенолоксидаз, липоксигеназ, лигниназ, пуллуланаз, танназ, пентозаназ, маланаз, β-глюканаз, арабинозидаз, гиалуронидазы, хондроитиназы, лакказы, хлорофиллаз, амилаз или их смесей.

5. Композиция по п.1, где вариант выбран из группы, состоящей из

a) полипептида, последовательность которого по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO: 2;

b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях низкой жесткости, условиях средней жесткости, условиях умеренно высокой жесткости, условиях высокой жесткости или условиях очень высокой жесткости с (i) кодирующей полипептид последовательностью SEQ ID NO: 1 или (ii) последовательностью полной длины, комплементарной (i);

c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, последовательность которого по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO: 1; и

d) фрагмента полипептида SEQ ID NO: 2.

6. Композиция по п.1, где композиция представляет собой очищающую композицию для стирки белья, очищающую композицию для мытья посуды, очищающую композицию для твердых поверхностей и/или очищающую композицию для личной гигиены.

7. Композиция по п.1, где композиция составлена в виде обычной, плотной или концентрированной жидкости; геля; пасты; бруска мыла; обычного или уплотненного порошка; гранулированного твердого вещества; гомогенной или многослойной таблетки с двумя или большим числом слоев (в одинаковой или разных фазах); пакета, имеющего одну или несколько камер; формы с разовой дозой, состоящей из одной или нескольких камер; или любой их комбинации.

8. Способ получения композиции по любому из пп. 1-7, включающий добавление варианта исходной липазы к композиции, содержащей по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, по меньшей мере систему поверхностно-активных веществ, по меньшей мере одно мыло или любые их смеси, при этом вариант обладает липазной активностью, его последовательность по меньшей мере на 90%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO: 2, и он содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R и по меньшей мере одной или нескольким (из D96E и G38A в SEQ ID NO: 2).

9. Способ очищения объекта, включающий приведение жирного пятна, присутствующего на объекте, подлежащем очищению, в контакт с композицией по любому из пп. 1-7.

10. Применение композиции по любому из пп. 1-7 в гидролизе сложного эфира карбоновой кислоты.

11. Применение композиции по любому из пп. 1-7 в гидролизе, синтезе или переэтерификации сложного эфира.

12. Применение композиции по любому из пп. 1-7 для получения стабильного состава моющего средства.