Клеточная линия psca-car-yt, обладающая поверхностной экспрессией химерных антигенных рецепторов и проявляющая цитотоксическую активность по отношению к psca-позитивным раковым клеткам человека

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложена рекомбинантная клеточная линия PSCA-CAR-YT, обладающая поверхностной экспрессией химерных антигенных рецепторов и проявляющая цитотоксическую активность по отношению к PSCA-позитивным раковым клеткам человека. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии PSCA-ассоциированного рака. 5 ил., 5 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и генетической инженерии, в частности к получению клеточных линий, используемых в иммунотерапии аденокарциномы предстательной железы.

На сегодняшний день рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний среди мужчин. Согласно данным общемировой статистики рак простаты остается третьей по частоте причиной смерти от злокачественных опухолей мужчин старшего возраста. Благодаря использованию хирургических подходов в сочетании с гормональной, химио- и/или радиотерапией в лечении новообразований простаты, выживаемость пациентов на 1-II стадии данного заболевания составляет около 85%. В то же время, ввиду отсутствия ярко выраженных симптомов и надежной диагностики на ранних этапах болезни, примерно 90% случаев рака предстательной железы выявляются уже на поздних (III-IV) стадиях заболевания, что приводит к летальному исходу более половины больных и продолжает оставаться серьезной проблемой во всем мире [1].

Частота рака поджелудочной железы ниже, чем рака предстательной железы, однако первый тип рака значительно хуже поддается лечению. Пятилетняя выживаемость для пациентов, диагностированных с раком поджелудочной железы, не превышает 8% [2]. Характерной особенностью, объединяющей раки предстательной и поджелудочной желез, является частая экспрессия раковыми клетками на своей поверхности белка PSCA. Помимо раковых клеток, этот белок на невысоком уровне может экспрессироваться и нормальными клетками эпителия простаты, однако ткань предстательной железы не является критически важной для жизнедеятельности и по жизненным показаниям терапия, элиминирующая PSCA-позитивные клетки, может быть крайне эффективной для борьбы с метастазами при запущенных случаях рака поджелудочной железы и простаты.

Таким образом, развитие новых таргетных подходов для лечения онкологических заболеваний посредством элиминации PSCA-позитивных клеток является крайне востребованной задачей.

Адоптивная клеточная иммунотерапия с использованием Т-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (CAR) (далее CAR-T-клетки), позволяет перенаправить цитотоксическую активность Т-лимфоцитов против опухолевых клеток, несущих целевой поверхностный антиген. Данный подход основан на доставке кассет, кодирующих CAR, в собственные Т-лимфоциты пациента, культивируемые ex vivo, с последующим введением их обратно в организм больного. Размножаясь в организме, CAR-T-клетки способны находить и направленно уничтожать опухолевые клетки, экспонирующие распознаваемый CAR антиген [3].

CAR представляет собой искусственно сконструированную белковую молекулу. Основными функционально-структурными доменами CAR являются: 1) антигенраспознающий домен, в качестве которого часто используют вариабельные участки легкой и тяжелой цепей антител (scFv), объединенные в полипептидную цепь с помощью короткого линкера. Эта часть рецептора отвечает за распознавание рецептором целевого антигена и часто заимствуется от терапевтически одобренных антител; 2) шарнирный район CAR представляет собой наиболее подвижную часть рецептора, которая обеспечивает оптимальное взаимное позиционирование целевого антигена и антиген-распознающего домена в составе иммунологического синапса при встрече эффекторной клетки с клеткой-мишенью. Чаще всего для создания этой части рецептора используют последовательности CD8a, CD28 и IgG1/IgG4 (hinge-Fc часть) [3,4]; 3) трансмембранный домен необходим для закрепления рецептора на мембране; 4) сигнальный домен активирует клетку-носитель CAR. Наиболее часто в клинических испытаниях используются такие комбинации сигнальных доменов, как CD28-CD3ζ или 4-1BB-CD3 [3, 5, 6].

В отличие от онкогематологических заболеваний В-клеточной природы, для которых CAR-T-клеточная терапия оказалась крайне эффективной, использование этой технологии применительно к солидным видам рака, в том числе и раку предстательной железы, сталкивается с рядом трудностей, связанных, в частности, с иммуносупрессивным опухолевым микроокружением, неэффективным «хомингом» и недостаточным временем жизни CAR-T-клеток в активном состоянии в организме пациента. Согласно литературным данным, одним из белков, сверхэкспрессирующихся опухолями предстательной [7] и поджелудочной железы [8], а также их метастазами [9] у части пациентов, является PSCA -GPI-заякоренный поверхностный белок длиной 123 аминокислотных остатка, обладающий крайне узким паттерном экспрессии в нормальных тканях [7,10]. PSCA был успешно использован в качестве мишени в контексте других иммунотерапевтических подходов [11-13].

Использование CAR-T-клеток, специфичных к PSCA-позитивным раковым клеткам, таким образом, является одним из перспективных направлений адоптивной иммунотерапии рака предстательной и поджелудочной железы, и согласуется с убедительными доклиническими данными эффективности такой терапии.

Помимо аутологичных CAR-T-клеток, производимых индивидуально для каждого пациента, в качестве носителей CAR рассматриваются и другие клеточные источники, например, геномно-редактированные "универсальные" CAR-T-клетки, NK-клетки периферической или пуповинной крови, iPS-NK клетки и иммортализованные NK-клеточные линии [14-19]. К преимуществам использования последних относят дешевизну производства, стандартизуемость, ограниченный пролиферативный потенциал, гомогенный состав, возможность комбинирования и использования нескольких CAR-NK клеточных продуктов последовательно или одновременно.

Описано несколько NK-клеточных линий человека, которые могут быть использованы в качестве аллогенных универсальных носителей CAR: NK-92, NKL, YT, YTS, KHYG-1 и т.д. Так, в клинических испытаниях IL-2 -зависимой линии NK-92 была показана безопасность их системного введения после летального облучения [20-22].

CAR-NK клеточные системы на основе клеточных линий NK-92, KHYG-1 и YTS были детально охарактеризованы доклинически и показана их активность в отношении целого ряда опухолей человека, ксенотранспланированных иммунодефицитным мышам [23]. В частности, было обнаружено, что PSCA-специфичный CAR, экспрессируемый клетками линии YTS, способен специфически узнавать PSCA-позитивные клетки-мишени и приводить к их элиминации в мышах [24].

Наиболее близким к заявляемой клеточной линии - прототипом, является линия клеток YT, обладающая поверхностной экспрессией химерных антигенных рецепторов (CAR), специфически распознающих раково-эмбриональный антиген (CEA). Известная линия была получена на основе линии NK-клеток человека - YT, в клетки которой методом электропорации была доставлена генетическая конструкция, кодирующая рецептор scBW431-hFc[zeta]. Данный химерный рецептор состоит из специфического одноцепочечного scFv-фрагмента (заимствованого из вариабельных областей гуманизированного СЕА-специфические антитела BW431), соединенного гибким пептидным линкером. Шарнирная и трансмембранная область рецептора представляют собой Fc-часть человеческого антитела IgG, в качестве сигнального домена используется последовательность CD3ζ человеческого Т-клеточного рецептора. Предлагаемая клеточная линия способна вызывать лизис клеток линий колоректального рака человека [25].Недостатком известной линии является недостаточно стабильная экспрессия CAR в полученных клетках, поскольку выбранный метод доставки последовательности рецептора scBW431-hFc[zeta] в геном клеток линии YT не обеспечивает стабильной встройки данной последовательности в геном клеток-носителей рецептора, соответственно со временем данная клеточная линия может утратить экспрессию CAR и потерять возможность оказывать цитоткосическое воздействие на раковые клетки. Кроме того, известная линия клеток YT не обладает цитотоксической активностью по отношению к PSCA-позитивным раковым клеткам человека, она проявляет цитотоксический эффект только в отношении клеток колоректального рака человека.

Задачей настоящего изобретения является получение новой стабильной клеточной линии PSCA-CAR-YT, обладающей поверхностной экспрессией химерных антигенных рецепторов и проявляющей цитотоксическую активность по отношению к PSCA-позитивным раковым клеткам человека.

Технический результат заявляемого изобретения: расширение коллекции рекомбинантных клеточных линий, которые могут быть использованы для иммунотерапии злокачественных новообразований, в частности аденокарциномы предстательной железы.

Указанный технический результат достигается путем трансдукции клеточной линии YT лентивирусными частицами, предварительно наработанными с использованием кальций-фосфатной трансфекции клеточной линии НЕК293Т рекомбинантной плазмидой aPSCA-myc-IgG1v2-CAR [26], в структуре которой закодирован химерный антигенный рецептор против белка PSCA, что обеспечит стабильную встройку последовательности CAR в геном клеток линии YT, тем самым обеспечив стабильную экспрессию CAR в полученных клетках.

Сущность заявляемого изобретения заключается в следующем.

Конструируют рекомбинантную плазмиду aPSCA-myc-IgG1v2-CAR, полученную на основе лентивирусного вектора pCDH (соответствующий номер GenBank KX757242.1), которая имеет следующие характеристики:

- имеет размер 9869 п. о.;

- кодирует основные функционально-структурные элементы CAR, специфичного к белку PSCA.

- состоит из следующих элементов:

1) фрагмента ДНК, кодирующего CAR, а именно последовательность антиген-распознающего модуля PSCA-специфичного CAR, которая была заимствована из гуманизированного мышиного антитела 2В3, используя кодирующую последовательность ДНК scFv (VL2B3 и VH2B3) [27]. Последовательность шарнирного района, заимствованная из молекулы человеческого IgG1 (hinge СН2-СН3), трансмембранный домен от молекулы CD28 (CD28TM) и сигнальный домен CD28-CD3z -цитоплазматическая последовательность сигнальной субъединицы Т-клеточного рецептора;

2) гибридного конститутивного промотора hEF1a-HTLV, обеспечивающего конститутивную и сильную экспрессию CAR и copGFP;

3) генетических маркеров:

AMPr - ген ампициллин-резистентности (bla), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli;

copGFP - репортерный ген зеленого флуоресцентного белка копеподы Pontellina plumata, определяющий свечение трансформированных или трансдуцированных клеток млекопитающих при их облучении в сине-зеленом УФ-диапазоне;

myc-эпитоп - находящийся между антиген-распознающей и шарнирной областью в структуре CAR и необходимого для детекции выхода CAR на поверхность клетки.

4) гибридного RSV-5'LTR промотора, состоящего из последовательностей вируса саркомы Рауса (RSV) и ВИЧ-1, обеспечивающего ТАТ-независимый синтез вирусных транскриптов в клетках-паковщицах лентивирусных частиц;

5) модифицированных генетических элементов ВИЧ-1 (сРРТ, gag, env, RRE), необходимых для корректного процессинга вирусной РНК и сборки лентивирусных частиц;

6) 5'LTR и 3'dLTR-последовательностей ВИЧ-1, обеспечивающих стабильную интеграцию заключенных между ними последовательностей в геном клеток млекопитающих без возможности их дальнейшей повторной мобилизации;

7) последовательности WPRE - регуляторного элемента вируса гепатита сурков, обеспечивающего увеличение стабильности и трансляции транскриптов;

8) фрагмента ДНК, содержащего последовательность Козак;

9) элемента IRES - внутреннего сайта посадки рибосомы кардиовируса А, обеспечивающего кэп-независимую инициацию трансляции сцепленного репортера copGFP.

Преимуществом использования такой конструкции является ее низкая иммуногенность, что особенно важно в дальнейшей работе на моделях in vivo и в клинике.

Карта генетической конструкции рекомбинатной плазмиды aPSCA-myc-IgG1v2-CAR представлена на Фиг. 1, а схема получаемого CAR - на Фиг. 2.

Клеточную линию PSCA-CAR-YT получают на основе клеточной линии YT путем ее трансдукции (заражения) лентивирусными частицами. Для получения лентивирусных частиц, ДНК рекомбинантной плазмиды aPSCA-myc-IgG1v2-CAR смешивают с ДНК вспомогательных плазмид pMD.2G и psPAX2, необходимых для упаковки лентивирусных частиц [28] в молярном соотношении 4:1:3 и трансформируют клетки эмбрионального почечного эпителия человека HEK293T методом кальций-фосфатной трансфекции, после чего выращивают 6 ч в среде IMDM с добавлением фетальной сыворотки коров до 10%, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина в атмосфере 5% СO₂ при 37°С. Через 6 часов после трансфекции среду в чашках заменяют на новую и инкубируют клетки 48 часов. После этого супернатанты кондиционированной среды фильтруют через 0.45 мкм PES-фильтры и используют для заражения клеточной линии YT методом спинокуляции в присутствии полибрена (8 мкг/ мл).

Полученные таким способом клетки экспрессируют на своей поверхности CAR, специфичные к белку PSCA (Фиг. 3), и обладают цитотоксической активностью в отношении PSCA-позитивных раковых клеток, в частности, клеток аденокарциномы простаты человека (Фиг. 4, Фиг. 5).

Клеточная линия PSCA-CAR-YT характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клеточная линия состоит из округлых клеток, равной величины, растущих одиночно или образующих скопления. Клеточная линия суспензионная.

Культуральные признаки. Клеточная линия PSCA-CAR-YT культивируется на питательной среде IMDM, содержащей 4 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. В культуральные чашки диаметром 6 см в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Время субкультивирования составляет 2-3 суток, кратность рассева 1:5-1:6.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Криоконсервирование. Для длительного хранения культуру клеток криоконсервируют путем замораживания в жидком азоте. Размораживание клеток проводят при температуре 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживания оценивают по включению трипанового синего и составляет не менее 90%.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

Фиг. 1. Карта генетической конструкции рекомбинантной плазмиды aPSCA-myc-IgG1v2-CAR, где: VL2B3, VH2B3, IgG1, CD28 ТМ, CD28 cyto, CD3 cyto - последовательности ДНК, кодирующие основные функционально-структурные элементы CAR, hEF1a-HTLV -конститутивный промотор фактора элонгации трансляции человека -альфа, IRES - внутренний сайт посадки рибосомы кардиовируса A, copGFP -зеленый флуоресцентный белок копеподы Pontellina plumata, Kozak -консенсусная последовательность Козак RSV promoter- гибридный промотор, 5'LTR - длинный концевой повтор ВИЧ-1, gag - укороченная последовательность гена gag ВИЧ-1, RRE - REV-связывающий элемент ВИЧ-1, WPRE - регуляторный элемент вируса гепатита сурков, 3'dLTR -усеченный длинный концевой повтор ВИЧ-1, AmpR - ген устойчивости к ампициллину. Общий размер плазмиды 9869 п. о.

Фиг. 2. Основные структурные составляющие CAR: hEF1a-HTLV -конститутивный промотор фактора элонгации трансляции человека -альфа, SP - лидерная последовательность, scFv(aPSCA) - последовательности специфических scFv к белку PSCA, myc - эпитоп для детекции, IgG1 -шарнирная область, CD28-CD3z - цитоплазматическая последовательность сигнальной субъединицы Т-клеточного рецептора, IRES - внутренний сайт посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита, copGFP - репортерный ген (зеленый флуоресцентный белок GFP).

Фиг. 3. А - Цитометрический анализ поверхностной экспрессии CAR (против белка PSCA) трансдуцированной линии YT после окраски антителами на с-myc эпитоп. Отрицательный контроль - интактная линия YT;

Фиг. 3. Б - Цитометрический анализ поверхностной экспрессии CAR (против белка PSCA) трансдуцированной линии YT после окраски Protein L. Отрицательный контроль - интактная линия YT;

Фиг. 4. Уровень цитотоксичности проявляемый клеточной линией PSCA-CAR-YT при инкубации с клетками-мишенями в различных соотношениях (1:1, 2:1, 3:1), проанализированный с помощью FACS. Клетки, экспрессирующие CAR, специфичный к другому целевому белку -PSMA (PSMA-CAR-YT), а также интактные клетки YT использованы в качестве отрицательного контроля и не оказывают цитотоксического воздействия на клетки-мишени (клеточная линия PC3-PSCA). Все показатели представлены в виде «среднее±стандартное отклонение».

Фиг. 5. Секреция ИФН-гамма клеточной линией PSCA-CAR-YT при ее коинкубации с клетками аденокарциномы простаты человека, эктопически экспрессирующих PSCA (PC3-PSCA) (синий цвет), в сравнении с клеточной линией РС3 (красный цвет). В качестве отрицательного контроля использованы интактные клетки YT, не экспрессирующие CAR. Все показатели представлены в виде «среднее±стандартное отклонение».

Для лучшего понимания сущности предлагаемой группы изобретений ниже следуют конкретные примеры их осуществления.

Пример 1. Трансдукция клеточной линии YT кодирующими CAR лентивирусными частицами

Доставка ДНК-кассет, кодирующих CAR, в клетки линии YT осуществляется с помощью лентивирусных частиц, псевдотипированных поверхностным белком G вируса везикулярного стоматита (VSV), для наработки которых используются клетки линии HEK 293Т. Клетки линии HEK293Т в чашке диаметром 5 см с конфлюэнтностью 60-70% трансфицируют препаратами плазмид при помощи кальций-фосфатной трансфекции. Для этого ДНК рекомбинантной плазмиды aPSCA-myc-IgG1v2-CAR смешивают с ДНК вспомогательных плазмид psPAX2 (упаковочная плазмида, кодирующая GAG, POL и REV под контролем сильного конститутивного промотора СAG) и pMD2.G (упаковочная плазмида, кодирующая белок оболочки G вируса везикулярного стоматита) в молярном соотношении 4:3:1 (5 мкг плазмиды aPSCA-myc-IgG1v2-CAR: 3,7 мкг psPAX2: 1,3 мкг pMD2.G). Полученную смесь смешивают с 31.2 мкл СаСl₂ и добавляют воду до 250 мкл. После этого смесь постепенно добавляют к 250 мкл стерильного HBS (150 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, рН 7,0), интенсивно перемешивая его на вортексе. Полученную таким образом суспензию комплексов фосфата кальция и ДНК плазмиды осторожно раскапывают по поверхности чашки с трансфицируемыми клетками HEK293Т. Через 6 часов после трансфекции среду в чашках заменяют на новую и инкубируют клетки 48 часов. После этого супернатанты кондиционированных сред, полученные центрифугированием при 20.000 g в течение 3-х часов, фильтруют через 0.45 мкм PES-фильтры, чтобы избавиться от фрагментов клеток и агрегатов, и используют для трансдукции клеток линии YT методом спинокуляции. Для этого в лунки 96-луночного планшета вносят клетки линии YT в количестве 10.000 клеток на лунку, после чего к ним добавляют препарат лентивируса в различном объеме: 25 и 75 мкл (с MOI равном 1), также в каждую лунку вносят полибрен (Sigma Aldrich) до финальной концентрации 8 мкг/мл. После этого клетки центрифугируют при 500g в течение 40 минут, при 32°С, далее инкубируют при температуре 37°С и 5% атмосфере СО₂. Через 24 часа после трансдукции среду в лунках планшета заменяют на новую.

Пример 2. Анализ поверхностной экспрессии CAR в клетках линий PSCA-CAR-YT.

Детекцию поверхностной экспрессии CAR клеточной линии PSCA-CAR-YT осуществляют с помощью окраски клеток антителами против эпитопа с-myc, содержащегося в структуре CAR или с помощью коинкубации полученных клеток с биотинилированным Protein L, способным связывать каппа-цепи иммуноглобулинов. Для этого клетки в количестве ~ 100.000 клеток переносят в цитометрическую пробирку, и осаждают центрифугированием при 500g в течение 4 минут, после чего клетки отмывают от остатков культуральной среды в 2 мл PBS (рН 7,4: 1,7 мМ КН₂РO₄, 5,2 мМ Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl), содержащего 1,5% FCS и 0,06% NaN_3; с последующим центрифугированием. Затем клетки инкубируют с мышиными моноклональными антителами против c-myc (Abeam, клон 9Е10) или с Protein L-bio (GenScript, М00097) в концентрации 1 мкг/ мкл в течение 30 минут при 4°С. По окончании инкубации клетки дважды отмывают от первичных антител раствором PBS с 1,5% FCS и 0,06% NaN₃ и инкубируют с флуоресцентно-мечеными конъюгатами вторичных антител. В качестве конъюгатов к антителам против c-myc используют ослиные антитела против IgG мыши, меченые РЕ (BioLegend), а в качестве конъюгатов к Protein L, стрептавидин-РЕ (Thermo Fisher Scientific). Используемые конъюгаты разводят в соотношении 1:800 в PBS с 1,5% FCS и 0,06% NaN₃. Инкубацию проводят в течение 30 минут при 4°С, после чего дважды промывают образцы и для исключения из анализа мертвых клеток добавляют 1 мкг/ мкл 7AAD (Biolegend). Образцы анализируют с помощью проточного цитометра BD FACSCanto II (Becton Dickinson and Company). Анализ полученных данных проводят с помощью программного обеспечения BD FACSDiva Software. Результаты эксперимента представлены на Фиг. 3 и свидетельствуют о том, что в сравнении с интактными клетками линии YT, полученная клеточная линия PSCA-CAR-YT обладает высоким уровнем поверхностной экспрессии CAR.

Пример 3. Культивирование клеточной линии PSCA-CAR-YT

Клеточную линию PSCA-CAR-YT культивируют в питательной среде IMDM (Sigma), содержащей 4 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в атмосфере 5% СO₂ при 37°С. Клетки пересевают один раз в два дня или за сутки перед проведением трансдукции.

Для длительного хранения клетки криоконсервируют путем замораживания в жидком азоте. Для этого клетки ресуспендируют в среде для заморозки - питательная среда IMDM с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки 10% и 10% ДМСО. Снижение температуры обеспечивается со скоростью 1°С в минуту до минус 70°С, затем проводится быстрое замораживание клеток в жидком азоте.

Размораживание клеток быстрое, при температуре 37°С, после чего клетки разводят в 5 мл культуральной среды и осаждают центрифугированием при 500 g. После чего клеточный осадок поднимают в 5 мл свежей культуральной среды и переносят в культуральную чашку диаметром 6 см. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет не менее 90%.

Пример 4. Оценка цитотоксической активности клеточной линии PSCA-CAR-YT по отношению к клеткам аденокарциномы простаты человека.

Для анализа цитотоксической активности клетки линий PSCA-CAR-YT коинкубируют с клеточной линией аденокарциномы простаты человека, обладающей эктопической экспрессией PSCA - PC3-PSCA, в различных соотношениях эффектор:мишень, с последующим анализом количества погибших клеток-мишеней с помощью FACS. Чем выше процент гибели клеток-мишеней, тем выше цитотоксическая активность PSCA-специфичных клеток-эффекторов. Для этого клетки-мишени линии РС3-PSCA предварительно окрашивают, добавляя в культуральную среду 4 мкг/мкл флуоресцентного красителя DID (ThermoFisher Scientific) и инкубируют в течение 7 минут. Затем меченые клетки-мишени, как и клетки-эффекторы PSCA-CAR-YT, отмывают от старой культуральной среды. После чего в 96-луночный планшет вносят по 20.000 меченых клеток-мишеней на лунку планшета, далее к ним добавляют клетки-эффекторы в соотношениях эффектор: мишень: 1:1, 2:1, 3:1. В одной лунке оставляют клетки-мишени без эффекторов в качестве контроля, также в качестве отрицательного контроля к клеткам-мишеням добавляют клетки YT-CAR, обладающие другой специфичностью (CAR специфичный к белку PSMA). Эксперимент проводят в двух биологических повторах для каждого соотношения эффектор: мишень. Клетки инкубируют 4 часа в атмосфере 5% СO₂ при 37°С. Затем добавляют витальный краситель PI (пропидий йодид). Процент погибших клеток-мишеней измеряют на цитофлуориметре BD FACSCantoII. Анализ полученных данных проводят с помощью программного обеспечения BD FACSDiva Software. Представленные на Фиг. 4 результаты свидетельствуют о том, что полученная линия PSCA-CAR-YT оказывает цитотоксическое действие на PSCA-позитивные клетки-мишени и вызывает гибель раковых клеток простаты человека.

Пример 5. Измерение уровня секреции ИФН-гамма клеточной линией PSCA-CAR-YT при коинкубации с клеткам рака простаты человека.

PSCA-CAR-YT клетки коинкубировали с клетками PC3-PSCA в 24-луночном планшете в течение 4 часов в соотношении 1:1. Для инкубации использовали среду IMDM (ThermoFisher Scientific) с 10% фетальной сыворотки коровы (HyClone), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, не содержащую цитокинов человека, в т.ч. ИЛ-2 и ИФН-гамма. После инкубации супернатанты кондиционированных сред фильтровали через фильтр с диаметром пор 0.45 микрон, чтобы избавиться от фрагментов клеток и агрегатов. Профильтрованный супернатант использовали для проведения ИФА анализа при помощи набора гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ (АО "Вектор-БЕСТ", Россия). Для точного определения концентрации использовали стандарты концентрации ИФН-гамма, входящие в набор. Полученные данные, представленные на Фиг. 5, демонстрируют высокий уровень секреции ИФН-гамма в клетках линии PSCA-CAR-YT, по сравнению с клетками исходной линии YT, не трансдуцированной лентивирусными частицами, кодирующими CAR.

Таким образом, полученная клеточная линия PSCA-CAR-YT обладает поверхностной экспрессией CAR и проявляет цитотоксическую активность в отношении PSCA-позитивных раковых клеток. Данная клеточная линия может быть использована в разработке клеточной терапии пациентов с PSCA-положительной опухолью предстательной железы.

Источники информации

1. Miller KD, Siegel RL, Lin CC, Mariotto AB, Kramer JL, Rowland JH, et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J. Clin. 2016;66:271-89.

2. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 2016;66:7-30.

3. Gianpietro Dotti, Stephen Gottschalk, Barbara Savoldo and MKB. Design and Development of Therapies using Chimeric Antigen. Immunol. Rev.; 257(1). 2014;580:6269-74.

4. Кулемзин CB, Кузнецова BB, Мамонкин M, Таранин AB, Горчаков AA. Основы дизайна химерных антигенных рецепторов. Acta Naturae. 2017;1:6-15.

5. Savoldo В, Ramos CA, Liu E, Mims MP, Keating MJ, Carrum G, et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 2011;121:1822-6.

6. Beatty GL, O'Hara M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: Defining the challenges and next steps. Pharmacol. Ther. 2016;166:30-9.

7. Reiter RE, Gu Z, Watabe T, Thomas G, Szigeti K, Davis E, et al. Prostate stem cell antigen: a cell surface marker overexpressed in prostate cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998;95:1735-40.

8. Argani P, Rosty C, Reiter RE, Wilentz RE, Murugesan SR, Leach SD, et al. Advances in Brief Discovery of New Markers of Cancer through Serial Analysis of Gene Expression: Prostate Stem Cell Antigen Is Overexpressed in Pancreatic Adenocarcinoma. Cancer Res. 2001;61:4320-4.

9. Lam JS, Shintaku IP, Vessella RL, Jenkins RB, Horvath S, Said JW, et al. Prostate Stem Cell Antigen Is Overexpressed in Prostate Cancer Metastases. Clinical Cancer Res. 2005;11:2591-6.

10. Morgenroth A, Cartellieri M, Schmitz M, Gunes S, Weigle B, Bachmann M, et al. Targeting of tumor cells expressing the prostate stem cell antigen (PSCA) using genetically engineered T-cells. The Prostate. 2007;67:1121-31.

11. Ross S, Spencer SD, Holcomb I, Tan C, Hongo J, Devaux B, et al. Prostate Stem Cell Antigen as Therapy Target: Prostate Stem Cell Antigen as Therapy Target: Tissue Expression and in Vivo Efficacy of an Immunoconjugate. Cancer Res. 2002;62:2546-53.

12. Saffran DC, Raitano a B, Hubert RS, Witte ON, Reiter RE, Jakobovits A. Anti-PSCA mAbs inhibit tumor growth and metastasis formation and prolong the survival of mice bearing human prostate cancer xenografts. Proc Natl Acad Sci. 2001;98:2658-63.

13. Waeckerle-Men Y, Uetz-Von Allmen E, Fopp M, Von Moos R, Bohme C, Schmid HP, et al. Dendritic cell-based multi-epitope immunotherapy of hormone-refractory prostate carcinoma. Cancer Immunol Immunother. 2006;55:1524-33.

14. Oelsner S, Friede ME, Zhang C, Wagner J, Badura S, Bader P, et al. Continuously expanding CAR NK-92 cells display selective cytotoxicity against B-cell leukemia and lymphoma. Cytotherapy. 2017;19:235-49.

15. Chen X, Han J, Chu J, Zhang L, Zhang J, Chen C, et al. A combinational therapy of EGFR-CAR NK cells and oncolytic herpes simplex virus 1 for breast cancer brain metastases. Oncotarget. 2016;7:27764-77.

16. Zhang C, Burger MC, Jennewein L, Zeiner P, et al. ErbB2/HER2-Specific NK Cells for Targeted Therapy of Glioblastoma. J. Natl Cancer Inst. 2016;108:1-12.

17. Wang Z, Guo L, Song Y, Zhang Y, Lin D, Ни B, et al. Augmented anti-tumor activity of NK-92 cells expressing chimeric receptors of TGF-βR II and NKG2D. Cancer Immunol Immunother. 2017;66:537-48.

18. Guarracino F, Cabrini L, Baldassarri R, Petronio S, De Carlo M, Covello RD, et al. Noninvasive Ventilation for Awake Percutaneous Aortic Valve Implantation in High-Risk Respiratory Patients: A Case Series. Journal of cardiothoracic and vascular anesthesia. 2010; 294:3124-30.

19. Hsieh Y Те, Aggarwal P, Cirelli D, Gu L, Surowy T, Mozier NM. Characterization of FcγRIIIA effector cells used in in vitro ADCC bioassay: Comparison of primary NK cells with engineered NK-92 and Jurkat T cells. J. Immunol Methods. 2017;441:56-66.

20. Tonn T, Schwabe D, Klingemann HG, Becker S, Esser R, Koehl U, et al. Treatment of patients with advanced cancer with the natural killer cell line NK-92. Cytotherapy. 2013;15:1563-70.

21. Arai S, Meagher R, Swearingen M, Myint H, Rich E, Martinson J, et al. Infusion of the allogeneic cell line NK-92 in patients with advanced renal cell cancer or melanoma: a phase I trial. Cytotherapy. 2008;10:625-32.

22. Boyiadzis M, Agha M, Redner RL, Sehgal A, Im A, Hou JZ, et al. Phase 1 clinical trial of adoptive immunotherapy using "off-the-shelf activated natural killer cells in patients with refractory and relapsed acute myeloid leukemia. Cytotherapy. 2017;19:1225-32.

23. Waeckerle-Men Y, Uetz-Von Allmen E, Fopp M, Von Moos R, C, Schmid HP, et al. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Cytotherapy. 2017;7:1524-33.

24. Topfer K, Cartellieri M, Michen S, Wiedemuth R, N, Lindemann D, et al. DAP12-Based Activating Chimeric Antigen Receptor for NK Cell Tumor Immunotherapy. J. Immunol. 2015;194:3201-12.

25. Патент EP 1383872 B1, опубл. 23.11.2005.

26. Кулемзин СВ. Модульная система лентивирусных векторов для работы с химерными антигенными рецепторами, 2017, Биоорганическая химия, Т.43,2, с. 124-132.

27. Matvienko DA, Kulemzin S V., Smagina AS, Belovezhets TN, Chikaev AN, Volkova OY, et al. Analysis of in vitro activity of PSCA-specific CARs in the context of human NK cell line YT. Cell Ther. Transplant. 2018;7:70-7.

28. Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, Naldini L, Trono D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat. Biotechnol. 1997; 15:871-5.

Рекомбинантная клеточная линия PSCA-CAR-YT, обладающая поверхностной экспрессией химерных антигенных рецепторов и проявляющая цитотоксическую активность по отношению к PSCA-позитивным раковым клеткам человека, полученная путем трансдукции клеточной линии YT лентивирусными частицами на основе рекомбинантной плазмиды aPSCA-myc-IgG1v2-CAR, характеризующейся в соответствии с физической картой, представленной на фиг. 1, следующими признаками: имеет размер 9869 п.о., кодирует основные функционально-структурные элементы CAR, специфичного к белку PSCA, состоит из следующих элементов:

1) фрагмента ДНК, кодирующего CAR;

2) гибридного конститутивного промотора hEF1a-HTLV, обеспечивающего конститутивную и сильную экспрессию CAR и copGFP;

3) генетических маркеров: AMPr - ген ампициллин-резистентности (bla), copGFP - репортерный ген зеленого флуоресцентного белка копеподы Pontellina plumata;

4) myc-эпитопа - служебный модуль, расположенный между антиген-распознающей и шарнирной областью в структуре CAR.

5) гибридного RSV-5'LTR промотора, состоящего из последовательностей вируса саркомы Рауса (RSV) и ВИЧ-1, обеспечивающего ТАТ-независимый синтез вирусных транскриптов в клетках-паковщицах лентивирусных частиц;

6) модифицированных генетических элементов ВИЧ-1 (сРРТ, gag, env, RRE);

7) 5'LTR и 3'dLTR-последовательностей ВИЧ-1;

8) последовательности WPRE - регуляторный элемент вируса гепатита сурков;

9) фрагмента ДНК, содержащего последовательность Козак;

10) элемента IRES - внутренний сайт посадки рибосомы кардиовируса А.