Варианты fc-области с модифицированными свойствами связывания fcrn и белка а

Авторы патента:

C07K16/00 - Иммуноглобулины, например моноклональные или поликлональные антитела

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

Владельцы патента RU 2713131:

Ф. ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ (CH)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения гетеродимерного полипептида. Изобретение позволяет эффективно получать гетеродимерные полипептиды. 10 з.п. ф-лы, 9 табл., 1 пр.

Согласно данному изобретению предложены Fc-области IgG, которые модифицированы применительно к связыванию с Fc-рецептором, а также белком A.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Потребность в экономически выгодных способах производства влечет за собой необходимость оптимизации последующей очистки, включающей одну или более стадий аффинной хроматографии. Необходимость обработки больших объемов и более жесткие требования к протоколам “очистки на месте” (CIP) составляют некоторые из задач, которые требуют разрешения (Hober S., J. Chrom. B, 848 (2007) 40-47).

Очистка моноклональных антител с использованием селективных, обладающих аффинностью к Fc-области лигандов представляет собой наиболее многообещающую методологию для крупномасштабного производства терапевтических моноклональных антител. Действительно, для этой методики нет необходимости в использовании какого-либо взаимодействия с антиген-специфичной частью антитела, т.е. Fab доменом, который, тем самым, остается интактным и может сохранять свои свойства (см. Salvalaglio M., et al., J. Chrom. A, 1216 (2009) 8678-8686).

Благодаря ее селективности, стадию аффинной очистки используют на ранних этапах в цепочке процедур очистки, и поэтому число последовательных типовых операций может быть снижено (см. Hober, выше; MacLennan J., Biotechnol., 13 (1995) 1180; Harakas N.K., Bioprocess Technol., 18 (1994) 259).

Самыми общепризнанными лигандами для селективного связывания с IgG являются белок A и белок G стафилококков, которые способны к высокоселективным взаимодействиям с Fc-областью большинства IgG в участке, известном как “консенсусный сайт связывания” (CBS) (DeLano W.L., et al., Science, 287 (2000) 1279), который локализован в шарнирной области между CH2- и CH3-доменами (т.е. константными доменами тяжелой цепи) в Fc-области.

Стафилококковый белок A (SPA) представляет собой связанный с клеточной стенкой белковый домен, экспонированный на поверхности грамположительной бактерии Staphylococcus aureus. SPA обладает высокой аффинностью к IgG из различных видов, например IgG человека, кролика и морской свинки, но очень слабо взаимодействует с IgG быка и мыши (см. приведенную ниже таблицу) (см. Hober, выше; Duhamel R.C., et al., J. Immunol. Methods, 31 (1979) 211; L. and Kronvall G., Immunol. J., 133 (1984) 969; Richman D.D., et al., J. Immunol., 128 (1982) 2300; Amersham Pharmacia Biotech., Handbook, Antibody Purification (2000)).

Вид	Подкласс	Связывание с белком A
Человек	IgG1	++
	IgG2	++
	IgG3	--
	IgG4	++
	IgA	переменное
	IgD	-
IgM	переменное
Кролик	Различий нет	++
Морская свинка	IgG1	++
IgG2	++
Бык		+
Мышь	IgG1	+
	IgG2a	++
	IgG2b	+
	IgG3	+
IgM	переменное
Цыпленок	IgY	-

++: сильное связывание; +: умеренное связывание; -: слабое взаимодействие или его отсутствие.

Шарнирная область тяжелой цепи между CH2- и CH3-доменами IgG способна связываться с несколькими белками помимо белка A, такими как неонатальный Fc-рецептор (FcRn) (см. DeLano и Salvalaglio, выше).

Под CBS SPA понимают гидрофобный карман на поверхности антитела. Остатками, составляющими CBS IgG, являются Ile 253, Ser 254, Met 252, Met 423, Tyr 326, His 435, Asn 434, His 433, Arg 255 и Glu 380 (нумерация остатков тяжелой цепи IgG соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat). Заряженные аминокислоты (Arg 255, Glu 380) располагаются вокруг гидрофобного выступа, образованного остатками Ile 253 и Ser 254. Это приводит (может привести) к взаимодействиям полярных и гидрофильных групп (см. Salvalaglio, выше).

В общем случае, взаимодействие между белком A и IgG можно описать с использованием двух основных сайтов связывания: первый из них располагается в CH2-домене тяжелой цепи и характеризуется гидрофобными взаимодействиями между Phe 132, Leu 136, Ile 150 (белка A) и гидрофобным выступом IgG, составленным остатками Ile 253 и Ser 254, и одним электростатическим взаимодействием между Lys 154 (белка A) и Thr256 (IgG). Второй сайт локализован в CH3-домене тяжелой цепи, и здесь преобладают электростатические взаимодействия между Gln 129 и Tyr 133 (белок A) и His 433, Asn 434 и His 435 (IgG) (см. Salvalaglio, выше).

Lindhofer H. и др. (J. Immunol., 155 (1995) 219-225) сообщают о предпочтительном образовании пар, с ограничением по видам, с участием тяжелых/легких цепей в квадромах крыса/мышь.

Согласно сообщению Jedenberg L. и др. (J. Immunol. Meth., 201 (1997) 25-34), анализы по связыванию с SPA двух вариантов Fc-области (Fc13 и Fc31, каждый из которых содержит изотипическую замену на дипептид из соответствующего другого изотипа) показывали, что Fc1 и Fc31 взаимодействуют с SPA, в то время как в случае Fc3 и Fc13 детектируемое связывание с SPA отсутствует. Вывод относительно выявленного связывания с SPA варианта Fc31 Fc-области основывается на результатах внесения дипептидной замены R435H и F436Y.

В настоящее время внимание к терапевтическим моноклональным антителам сфокусировано на создании и применении биспецифичных или даже мультиспецифичных антител, специфически связывающихся с двумя или более мишенями (антигенами).

Основной проблемой при создании мультиспецифичных гетеродимерных антител класса IgG, состоящих из четырех цепей антитела (двух разных тяжелых цепей и двух разных легких цепей) в одной экспрессирующей клеточной линии считается так называемая проблема ассоциации цепей (см. Klein, C., et al., mAbs, 4 (2012) 653-663). Необходимость применения разных цепей в качестве левого и правого плеча мультиспецифичного антитела приводит к образованию, после экспрессии в одной клетке, смесей антител: две тяжелые цепи способны (теоретически) объединяться в четырех разных комбинациях (две из которых являются идентичными) и каждая из них может объединяться случайным образом с легкими цепями, в результате чего получаются 2⁴ (что в итоге составляет 16) теоретически возможных комбинаций цепей. Из этих 16 теоретически возможных комбинаций удалось обнаружить десять, среди которых только одна соответствует желаемому функциональному биспецифичному антителу (De Lau W.B., et al., J. Immunol., 146 (1991) 906-914). Трудности при выделении такого желаемого биспецифичного антитела из сложных смесей и присущий этому низкий выход, составляющий 12,5% от теоретически максимального, делают получение биспецифичного антитела в одной линии экспрессирующих клеток чрезвычайно сложной процедурой.

Чтобы преодолеть проблему ассоциации цепей и должным образом обеспечить корректную ассоциацию двух разных тяжелых цепей, Carter и др. из Genentech в конце 1990-х г.г. изобрели подход, названный “выступы-во-впадины” (KiH) (см. Carter P. J., Immunol. Meth., 248 (2001) 7-15; Merchant A.M., et al., Nat. Biotechnol., 16 (1998) 677-681; Zhu Z., et al., Prot. Sci., 6 (1997) 781-788; Ridgway J.B., et al., Prot. Eng., 9 (1996) 617-621; Atwell S., et al., J. Mol. Biol., 270(1997) 26-35; и US 7183076). По сути, данный подход основывается на модификациях поверхности контакта между двумя CH3-доменами двух тяжелых цепей антитела, где происходит больше всего взаимодействий. В CH3-домен одной тяжелой цепи антитела вводят большой по объему остаток, и он действует аналогично ключу (“выступу”). В другой тяжелой цепи формируют “впадину”, которая обладает способностью размещать в себе этот большой по объему остаток, имитируя замок. Полученную гетеродимерную Fc-область можно дополнительно стабилизировать путем искусственного введения/образования дисульфидных мостиков. Примечательно, что все мутации KiH погружены внутрь CH3-доменов и не “видимы” для иммунной системы. Кроме того, не затрагиваются такие свойства антител с мутациями KiH, как (термо)стабильность, связывание с Fc-рецептором-γ (FcγR) и эффекторные функции (например, антителозависимая клеточная цитотоксичность ADCC, связывание с FcRn) и фармакокинетические (ФК) свойства.

Корректной ассоциации тяжелых цепей с получением выходов по гетеродимеризации выше 97% можно достичь посредством внесения шести мутаций: S354C, T366W в “формирующую выступ” тяжелую цепь и Y349C, T366S, L368A, Y407V в “формирующую впадину” тяжелую цепь (см. Carter, выше; нумерация остатков соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat). В то время как гомодимеры по типу “впадина-впадина” могут существовать, присутствия гомодимеров по типу “выступ-выступ” обычно не наблюдается. Долю димеров по типу “впадина-впадина” можно снизить с использованием либо методик селективной очистки, либо изложенных ниже методик.

После рассмотрения вопроса о случайной ассоциации тяжелых цепей необходимо также обеспечить корректную ассоциацию легких цепей. Аналогично подходу KiH для CH3-домена, были предприняты усилия для изучения асимметричных взаимодействий между легкой цепью и тяжелой цепью, которые могут в конечном итоге привести к получению полноразмерных биспецифичных IgG.

Не так давно компания Roche разработала подход CrossMab как перспективный вариант для должного обеспечения корректного образования пар с участием легких цепей в биспецифичных гетеродимерных антителах класса IgG в случае объединения его с KiH-технологией (см. Klein, выше; Schaefer W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108 (2011) 11187-11192; Cain C., SciBX 4 (2011) 1-4). Этот подход позволяет создавать биспецифичные или даже мультиспецифичные антитела универсальным образом. В этом формате одно плечо предполагаемого биспецифичного антитела остается незатронутым. Во втором плече посредством междоменного кроссинговера между тяжелой и легкой цепью происходит замена всей Fab области, или VH-VL доменов (VH означает вариабельный домен тяжелой цепи; VL означает вариабельный домен легкой цепи), или CH1-CL доменов (CL означает константный домен легкой цепи). Вследствие этого, вновь сформированная “подвергнутая кроссинговеру” легкая цепь больше не образует ассоциатов с Fab областью (обычной, т.е. не подвергнутой кроссинговеру) тяжелой цепи другого плеча биспецифичного антитела. Таким образом, корректную ассоциацию “легких цепей” можно должным образом обеспечить посредством такого минимального изменения доменной организации (см. Schaefer, выше).

Zhu и др. вводили несколько стерически комплементарных мутаций, а также дисульфидных мостиков в две поверхности контакта VL/VH вариантов диател. В том случае, когда в поверхность контакта VL/VH антитела к p185HER2 (человеческий рецептор эпидермального фактора роста 2 типа с молекулярной массой 185 кДа) вносили мутации Y87A/F98M в VL и V37F/L45W в VH, гетеродимерное диатело извлекали с выходом более 90%, сохраняя общий выход и аффинность, сопоставимые с таковыми для родительского диатела (см. Zhu, выше).

Исследователи из Chugai конструировали биспецифичные диатела похожим образом, внося мутации в поверхности контакта VH-VL (главным образом превращая Q39 VH и Q38 VL в заряженные остатки), чтобы способствовать корректной ассоциации легких цепей (WO 2006/106905; Igawa T., et al., Prot. Eng. Des. Sel., 23 (2010) 667-677).

В WO 2011097603 описана обычная легкая цепь иммуноглобулина мыши.

В WO 2010151792 предложено биспецифичное антитело в формате, обеспечивающем простоту выделения, содержащее вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина, модифицированные по-разному, т.е. гетеродимерное по CH3-домену, при этом такие различные модификации являются неиммуногенными или по существу неиммуногенными применительно к модификациям в CH3-домене и по меньшей мере одна из модификаций приводит к получению биспецифичного антитела с другой аффинностью к такому аффинному реагенту, как белок A, и такое биспецифичное антитело можно выделить из разрушенной клетки, из среды или из смеси антител, основываясь на его аффинности к белку A.

Неонатальный Fc-рецептор (FcRn) важен для метаболического пути антител класса IgG in vivo. Функция FcRn заключается в спасении IgG от процесса лизосомальной деградации, что приводит к уменьшению клиренса и увеличению полупериода существования. Он представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из двух полипептидов: белка, подобного белку главного комплекса гистосовместимости класса I с молекулярной массой (ММ) 50 кДа (α-FcRn) и β2-микроглобулина (β2m) с ММ 15 кДа. FcRn связывается с высокой аффинностью с CH2-CH3-частью Fc-области антитела класса IgG. Взаимодействие между антителом класса IgG и FcRn зависит от pH и осуществляется в стехиометрическом соотношении 1:2, т.е. одна молекула антитела IgG может взаимодействовать с двумя молекулами FcRn посредством двух своих полипептидов Fc-области тяжелой цепи (см., например, Huber A.H., et al., J. Mol. Biol., 230 (1993) 1077-1083).

Таким образом, свойства/характеристики связывания молекул IgG с FcRn in vitro являются показателями его фармакокинетических свойств in vivo в кровотоке.

Во взаимодействии между FcRn и Fc-областью антитела класса IgG принимают участие разные аминокислотные остатки CH2- и CH3-домена тяжелой цепи.

Способы усиления связывания Fc-области (и также IgG) с FcRn были существлены путем внесения мутаций по различным аминокислотным остаткам в Fc-области: Thr 250, Met 252, Ser 254, Thr 256, Thr 307, Glu 380, Met 428, His 433 и Asn 434 (см. Kuo T.T., et al., J. Clin. Immunol., 30 (2010) 777-789; Ropeenian D.C., et al., Nat. Rev. Immunol., 7 (2007) 715-725).

В результате исследований белок-белковых взаимодействий с целью улучшения связывания с FcRn Dall'Acqua и др. была описана комбинация мутаций M252Y, S254T, T256E (Dall'Acqua W.F., et al. J. Biol. Chem., 281 (2006) 23514-23524). Исследования комплекса (Fc-область IgG человека)-(FcRn человека) показали, что остатки I253, S254, H435 и Y436 являются важнейшими остатками для данного взаимодействия (Firan M., et al., Int. Immunol., 13 (2001) 993-1002; Shields R.L., et al., J. Biol. Chem., 276 (2001) 6591-6604). В работе Yeung Y.A. и др. (J. Immunol., 182 (2009) 7667-7671) приведены различные мутанты по остаткам 248-259, и 301-317, и 376-382, и 424-437 и проведено их изучение.

В US 2012/0009182 описаны варианты иммуноглобулинов с измененной способностью к связыванию с белком A. Изменение посредством мутагенеза аффинности связывания с FcRn или продолжительности полупериодов существования антител в сыворотке крови описано в WO 2004/035752.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно данному изобретению предложены вариантные Fc-области, которые специфически связываются со стафилококковым белком A и которые связываются или не связываются с FcRn человека. Эти вариантные Fc-области содержат специфические аминокислотные мутации в CH2-домене, в то время как CH3-домен не изменен применительно к связыванию с белком A. Обнаружено, что эти мутации, в случае их использования в формирующей впадину цепи гетеродимерной Fc-области, способствуют очистке гетеродимерной Fc-области, т.е. отделению гетеродимерной Fc-области от являющейся побочным продуктом гомодимерной Fc-области (димера (цепь, формирующая впадину)-(цепь, формирующая впадину)).

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен гетеродимерный полипептид, содержащий

первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу по меньшей мере часть шарнирной области иммуноглобулина, которая содержит один или более остатков цистеина, CH2-домен иммуноглобулина и CH3-домен иммуноглобулина, и второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу по меньшей мере часть шарнирной области иммуноглобулина, которая содержит один или более остатков цистеина, CH2-домен иммуноглобулина и CH3-домен иммуноглобулина,

при этом первый полипептид содержит мутации Y349C, T366S, L368A и Y407V (цепь, формирующая впадину), а второй полипептид содержит мутации S354C и T366W (цепь, формирующая выступ),

при этом первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D,

при этом первый полипептид и второй полипептид соединены одним, двумя или более дисульфидными мостиками,

при этом CH3-домен первого полипептида и CH3-домен второго полипептида оба связывают или оба не связывают белок A

(нумерация соответствует EU-индексу по Kabat).

В одном из воплощений первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D, и

3) T250Q, и/или

4) T256E или T256A.

В одном из воплощений первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D, и

3) возможно a) T250Q, и/или b) T256E или T256A, и

4) a) L251A, или L251G, или L251D, и/или b) H310A или H310G.

В одном из воплощений первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутацию

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D, и

3) a) T250Q, и/или b) T256E или T256A, и

4) a) L251A, или L251G, или L251D, и/или b) H310A или H310G,

5) возможно a) T307A, или T307H, или T307Q, или T307P, и/или b) Q311H, и/или c) M252Y, и/или d) S254T.

В одном из воплощений второй полипептид (цепь, формирующая выступ) содержит мутацию

1) T250Q, и/или

2) M252Y, и/или

3) S254T, и/или

4) T256E или T256A, и/или

5) T307A, или T307H, или T307Q, или T307P, и/или

6) Q311H.

В одном из воплощений шарнирная область иммуноглобулина, CH2-домен иммуноглобулина и CH3-домен иммуноглобулина в случае первого и второго полипептида происходят из подкласса IgG1 человека. В одном из воплощений первый полипептид и второй полипептид каждый дополнительно содержит мутации L234A и L235A. В одном из воплощений первый полипептид и второй полипептид каждый дополнительно содержит мутацию P329G. В одном из воплощений первый полипептид и второй полипептид каждый дополнительно содержит мутации L234A, L235A и P329G.

В одном из воплощений шарнирная область иммуноглобулина, CH2-домен иммуноглобулина и CH3-домен иммуноглобулина в случае первого и второго полипептида происходят из подкласса IgG4 человека. В одном из воплощений первый полипептид и второй полипептид каждый дополнительно содержит мутации S228P и L235E. В одном из воплощений первый полипептид и второй полипептид каждый дополнительно содержит мутацию P329G. В одном из воплощений первый полипептид и второй полипептид каждый дополнительно содержит мутации S228P, L235E и P329G.

В одном из воплощений гетеродимерный полипептид представляет собой слитую конструкцию на основе полипептидов Fc-области.

В одном из воплощений гетеродимерный полипептид представляет собой полноразмерное антитело.

В одном из воплощений полноразмерное антитело содержит первый полипептид (цепь, формирующую впадину), содержащий, помимо обуславливающих впадину мутаций, мутации I253A и L314A, и второй полипептид (цепь, формирующую выступ) с обуславливающими выступ мутациями (нумерация согласно Kabat).

В одном из воплощений полноразмерное антитело содержит первый полипептид (цепь, формирующую впадину), содержащий, помимо обуславливающих впадину мутаций, мутации L251A и L314A, и второй полипептид (цепь, формирующую выступ) с обуславливающими выступ мутациями (нумерация согласно Kabat).

В одном из воплощений полноразмерное антитело содержит первый полипептид (цепь, формирующую впадину), содержащий, помимо обуславливающих впадину мутаций, мутацию L251A, и второй полипептид (цепь, формирующую выступ) с обуславливающими выступ мутациями (нумерация согласно Kabat).

В одном из воплощений полноразмерное антитело содержит первый полипептид (цепь, формирующую впадину), содержащий, помимо обуславливающих впадину мутаций, мутацию I253A, и второй полипептид (цепь, формирующую выступ) с обуславливающими выступ мутациями (нумерация согласно Kabat).

В одном из воплощений полноразмерное антитело содержит первый полипептид (цепь, формирующую впадину), содержащий, помимо обуславливающих впадину мутаций, мутацию L314A, и второй полипептид (цепь, формирующую выступ) с обуславливающими выступ мутациями (нумерация согласно Kabat).

В одном из воплощений полноразмерное антитело содержит первый полипептид (цепь, формирующую впадину), содержащий, помимо обуславливающих впадину мутаций, мутацию H310A, и второй полипептид (цепь, формирующую выступ) с обуславливающими выступ мутациями (нумерация согласно Kabat).

В одном из воплощений полноразмерное антитело содержит первый полипептид (цепь, формирующую впадину), содержащий, помимо обуславливающих впадину мутаций, мутации L251A, I253A и L314A, и второй полипептид (цепь, формирующую выступ) с обуславливающими выступ мутациями (нумерация согласно Kabat).

В одном из воплощений полноразмерное антитело содержит первый полипептид (цепь, формирующую впадину), содержащий, помимо обуславливающих впадину мутаций, мутации L251A, I253A и L314A, и второй полипептид (цепь, формирующую выступ), содержащий, помимо обуславливающих выступ мутаций, мутации M252Y, S254T и T256E (нумерация согласно Kabat).

В одном из воплощений полноразмерное антитело содержит первый полипептид (цепь, формирующую впадину), содержащий, помимо обуславливающих впадину мутаций, мутации I253A, L314A, M428L и N434H, и второй полипептид (цепь, формирующую выступ), содержащий, помимо обуславливающих выступ мутаций, мутации M252Y, S254T и T256E (нумерация согласно Kabat).

Кроме того, в одном из воплощений полноразмерное антитело дополнительно содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, содержащей S17A, R19A, T57A, T57K, R66A, S70A, Y79A, Q81A, N82aA и S82bA, в вариабельном домене тяжелой цепи (нумерация согласно Kabat). В одном из воплощений полноразмерное антитело содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из S17A, R19A, T57A, T57K, R66A, Q81A и N82aA, в вариабельном домене тяжелой цепи и демонстрирует более слабое связывание с белком A по сравнению с антителом, не имеющим этих мутаций, но в остальном имеющим идентичную аминокислотную последовательность (нумерация согласно Kabat). В одном из воплощений полноразмерное антитело содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из S70A, Y79A и S82bA, в вариабельном домене тяжелой цепи и демонстрирует более сильное связывание с белком A по сравнению с антителом, не имеющим этих мутаций, но в остальном имеющим идентичную аминокислотную последовательность (нумерация согласно Kabat).

В одном из воплощений полноразмерное антитело представляет собой моноспецифичное антитело. В одном из воплощений моноспецифичное антитело представляет собой одновалентное моноспецифичное антитело. В одном из воплощений моноспецифичное антитело представляет собой бивалентное моноспецифичное антитело.

В одном из воплощений полноразмерное антитело представляет собой биспецифичное антитело. В одном из воплощений биспецифичное антитело представляет собой бивалентное биспецифичное антитело. В одном из воплощений биспецифичное антитело представляет собой тетравалентное биспецифичное антитело.

В одном из воплощений полноразмерное антитело представляет собой триспецифичное антитело. В одном из воплощений триспецифичное антитело представляет собой трехвалентное триспецифичное антитело. В одном из воплощений триспецифичное антитело представляет собой тетравалентное триспецифичное антитело.

В одном из воплощений гетеродимерный полипептид представляет собой биспецифичное полноразмерное антитело, содержащее

первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи, CH1-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, шарнирную область иммуноглобулина подкласса IgG1, CH2-домен иммуноглобулина подкласса IgG1 и CH3-домен иммуноглобулина подкласса IgG1,

второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу второй вариабельный домен тяжелой цепи, CH1-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, шарнирную область иммуноглобулина подкласса IgG1, CH2-домен иммуноглобулина подкласса IgG1 и CH3-домен иммуноглобулина подкласса IgG1,

третий полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи,

четвертый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу второй вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи,

при этом второй вариабельный домен тяжелой цепи и второй вариабельный домен легкой цепи образуют второй сайт связывания, который специфически связывается со вторым антигеном,

при этом первый полипептид содержит мутации Y349C, T366S, L368A и Y407V, L234A, L235A и P329G, а второй полипептид содержит мутации S354C и T366W, L234A, L235A и P329G

при этом первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D,

при этом первый полипептид и второй полипептид соединены одним или более дисульфидными мостиками,

(нумерация соответствует EU-индексу по Kabat).

первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи, константный домен легкой цепи иммуноглобулина, шарнирную область иммуноглобулина подкласса IgG1, CH2-домен иммуноглобулина подкласса IgG1 и CH3-домен иммуноглобулина подкласса IgG1,

третий полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу первый вариабельный домен легкой цепи и CH1-домен иммуноглобулина подкласса IgG1,

при этом первый полипептид содержит мутации Y349C, T366S, L368A и Y407V, L234A, L235A и P329G, а второй полипептид содержит мутации S354C и T366W, L234A, L235A и P329G,

при этом первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D,

при этом первый полипептид и второй полипептид соединены одним или более дисульфидными мостиками,

(нумерация соответствует EU-индексу по Kabat).

первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи, CH1-домен иммуноглобулина подкласса IgG4, шарнирную область иммуноглобулина подкласса IgG4, CH2-домен иммуноглобулина подкласса IgG4 и CH3-домен иммуноглобулина подкласса IgG4,

второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу второй вариабельный домен тяжелой цепи, CH1-домен иммуноглобулина подкласса IgG4, шарнирную область иммуноглобулина подкласса IgG4, CH2-домен иммуноглобулина подкласса IgG4 и CH3-домен иммуноглобулина подкласса IgG4,

при этом первый полипептид содержит мутации Y349C, T366S, L368A и Y407V, S228P, L235E и P329G, а второй полипептид содержит мутации S354C и T366W, S228P, L235E и P329G,

при этом первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D,

при этом первый полипептид и второй полипептид соединены одним или более дисульфидными мостиками,

(нумерация соответствует EU-индексу по Kabat).

первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи, константный домен легкой цепи иммуноглобулина, шарнирную область иммуноглобулина подкласса IgG4, CH2-домен иммуноглобулина подкласса IgG4 и CH3-домен иммуноглобулина подкласса IgG4,

третий полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу первый вариабельный домен легкой цепи и CH1-домен иммуноглобулина подкласса IgG4,

при этом первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D,

при этом первый полипептид и второй полипептид соединены одним или более дисульфидными мостиками,

(нумерация соответствует EU-индексу по Kabat).

первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи, CH1-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, шарнирную область иммуноглобулина подкласса IgG1, CH2-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, CH3-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, пептидный линкер и первый одноцепочечный Fv фрагмент (scFv),

второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу второй вариабельный домен тяжелой цепи, CH1-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, шарнирную область иммуноглобулина подкласса IgG1, CH2-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, CH3-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, пептидный линкер и второй scFv,

при этом первый вариабельный домен тяжелой цепи и первый вариабельный домен легкой цепи образуют первый сайт связывания, который специфически связывается с первым антигеном, и второй вариабельный домен тяжелой цепи и второй вариабельный домен легкой цепи образуют второй сайт связывания, который специфически связывается с первым антигеном, а первый и второй scFv специфически связываются со вторым антигеном,

при этом первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D,

при этом первый полипептид и второй полипептид соединены одним или более дисульфидными мостиками,

(нумерация соответствует EU-индексу по Kabat).

первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи, константный домен легкой цепи иммуноглобулина, шарнирную область иммуноглобулина подкласса IgG1, CH2-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, CH3-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, пептидный линкер и первый scFv,

второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу второй вариабельный домен тяжелой цепи, CH1-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, шарнирную область иммуноглобулина подкласса IgG1, CH2-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, CH3-домен иммуноглобулина подкласса IgG1, пептидный линкер и второй scFv,

при этом первый полипептид и второй полипептид соединены одним или более дисульфидными мостиками.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен способ получения гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, включающий приведенные ниже стадии:

a) культивирования клетки млекопитающего, содержащей одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих гетеродимерный полипептид,

b) извлечения гетеродимерного полипептида из среды культивирования, и

c) очистки гетеродимерного полипептида аффинной хроматографией на колонке с иммобилизованным белком A и тем самым получения димерного полипептида.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложено применение комбинации мутаций

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D,

для отделения гетеродимерных полипептидов от гомодимерных полипептидов.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен способ лечения пациента, страдающего сосудистыми заболеваниями глаз, путем введения гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, для интравитреального введения.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, для применения в качестве лекарственного средства.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, для лечения сосудистых заболеваний глаз.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложена фармацевтическая композиция, содержащая гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, и возможно фармацевтически приемлемый носитель.

Чтобы избежать системных побочных эффектов в случае использования антитела, которое направленно воздействует на/связывает антигены, присутствующие не только в глазу, но также и в остальных частях организма, целесообразно иметь короткий системный полупериод существования после прохождения гематоофтальмического барьера из глаза в кровь.

Кроме того, антитело, которое специфически связывается с лигандами рецептора, эффективно только в лечении заболеваний глаз, если комплекс антитело-антиген удаляется из глаза, т.е. антитело действует в качестве “транспортного средства” для выведения лигандов рецептора из глаза и тем самым ингибирует передачу сигнала посредством рецептора.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложено применение гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, для транспортировки растворимого лиганда рецептора из глаза через гематоофтальмический барьер в кровоток.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложено применение гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, для удаления одного или нескольких растворимых лигандов рецептора из глаза.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложено применение гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, для лечения заболеваний глаз, в частности, сосудистых заболеваний глаз.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложено применение гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, для транспортировки одного или нескольких растворимых лигандов рецептора из интравитреального пространства в кровоток.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, для применения при лечении заболевания глаз.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, для применения при транспортировке кровоток.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, для применения при удалении одного или нескольких растворимых лигандов рецептора из глаза.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, для применения при лечении заболеваний глаз, в частности, сосудистых заболеваний глаз.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, для применения при транспортировке одного или нескольких растворимых лигандов рецептора из интравитреального пространства в кровоток.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен способ лечения индивидуума, имеющего сосудистое заболевание глаз, включающий введение данному индивидууму эффективного количества гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен способ транспортировки растворимого лиганда рецептора из глаза через гематоофтальмический барьер в кровоток индивидуума, включающий введение данному индивидууму эффективного количества гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, для транспортировки растворимого лиганда рецептора из глаза через гематоофтальмический барьер в кровоток.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен способ удаления одного или нескольких растворимых лигандов рецептора из глаза индивидуума, включающий введение данному индивидууму эффективного количества гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, с целью удаления одного или нескольких растворимых лигандов рецептора из глаза.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен способ транспортировки одного или нескольких растворимых лигандов рецептора из интравитреального пространства в кровоток индивидуума, включающий введение данному индивидууму эффективного количества гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, для транспортировки одного или нескольких растворимых лигандов рецептора из интравитреального пространства в кровоток

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен способ транспортировки растворимого лиганда рецептора из интравитреального пространства или глаза через гематоофтальмический барьер в кровоток индивидуума, включающий введение данному индивидууму эффективного количества гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, для транспортировки растворимого лиганда рецептора из глаза через гематоофтальмический барьер в кровоток.

В одном из воплощений гетеродимерный полипептид представляет собой биспецифичное антитело. В одном из воплощений биспецифичное антитело представляет собой бивалентное биспецифичное антитело. В одном из воплощений биспецифичное антитело представляет собой тетравалентное биспецифичное антитело.

В одном из воплощений гетеродимерный полипептид представляет собой триспецифичное антитело. В одном из воплощений триспецифичное антитело представляет собой трехвалентное триспецифичное антитело. В одном из воплощений триспецифичное антитело представляет собой тетравалентное триспецифичное антитело.

В одном из воплощений гетеродимерный полипептид представляет собой антитело, полученное с использованием технологии CrossMab.

В одном из воплощений первый полипептид дополнительно содержит мутации Y349C, T366S, L368A и Y407V, а второй полипептид дополнительно содержит мутации S354C и T366W.

В одном из воплощений антитело или слитая конструкция на основе полипептидов Fc-области происходят из подкласса IgG1. В одном из воплощений антитело или слитая конструкция на основе полипептидов Fc-области дополнительно содержат мутации L234A и L235A. В одном из воплощений антитело или слитая конструкция на основе полипептидов Fc-области дополнительно содержат мутацию P329G.

В одном из воплощений антитело или слитая конструкция на основе полипептидов Fc-области происходят из подкласса IgG4. В одном из воплощений антитело или слитая конструкция на основе полипептидов Fc-области дополнительно содержат мутации S228P и L235E. В одном из воплощений антитело или слитая конструкция на основе полипептидов Fc-области дополнительно содержат мутацию P329G.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВОПЛОЩЕНИЙ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин “примерно” означает диапазон, составляющий +/- 20% от следующего далее численного значения. В одном из воплощений термин “примерно” означает диапазон, составляющий +/- 10% от следующего далее численного значения. В одном из воплощений термин “примерно” означает диапазон, составляющий +/- 5% от следующего далее численного значения.

“Акцепторный каркас IgG человека” для целей данного изобретения представляет собой каркас, содержащий аминокислотную последовательность каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящего из каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса IgG человека, который определен ниже. Акцепторный каркас IgG человека, “происходящий из” каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса IgG человека, может содержать такую же, как у них, аминокислотную последовательность, или он может содержать изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях количество изменений аминокислот составляет 10 или меньше, 9 или меньше, 8 или меньше, 7 или меньше, 6 или меньше, 5 или меньше, 4 или меньше, 3 или меньше либо 2 или меньше. В некоторых воплощениях последовательность акцепторного каркаса VL иммуноглобулина человека идентична последовательности каркаса VL иммуноглобулина человека или последовательности консенсусного каркаса IgG человека.

Антитело с “созревшей аффинностью” относится к антителу с одним или более изменениями в одном или более чем одном гипервариабельном участке (HVR) по сравнению с родительским антителом, которое не претерпело таких изменений, приводящих к улучшению аффинности антитела к антигену.

Термин “изменение” означает мутацию (замену), вставку (добавление) или делецию одного или более аминокислотных остатков в родительском антителе или слитом полипептиде, например слитом полипептиде, содержащем по меньшей мере FcRn-связывающую часть Fc-области, приводящих к получению модифицированного антитела или слитого полипептида. Термин “мутация” означает, что определенный аминокислотный остаток замемен на другой аминокислотный остаток. Например, мутация L234A означает, что остаток аминокислоты лизина в положении 234 в (полипептиде) Fc-области антитела заменен на остаток аминокислоты аланина (замена лизина на аланин) (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat).

Термин “остатки природных аминокислот” означает аминокислотный остаток из группы, состоящей из аланина (трехбуквенный код: Ala, однобуквенный код: A), аргинина (Arg, R), аспарагина (Asn, N), аспарагиновой кислоты (Asp, D), цистеина (Cys, C), глутамина (Gln, Q), глутаминовой кислоты (Glu, E), глицина (Gly, G), гистидина (His, H), изолейцина (Ile, I), лейцина (Leu, L), лизина (Lys, K), метионина (Met, M), фенилаланина (Phe, F), пролина (Pro, P), серина (Ser, S), треонина (Thr, T), триптофана (Trp, W), тирозина (Tyr, Y) и валина (Val, V).

Термин “аминокислотная мутация” означает замену по меньшей мере одного имеющегося аминокислотного остатка на другой отличающийся от него аминокислотный остаток (т.е. заменяющий аминокислотный остаток). Заменяющий аминокислотный остаток может представлять собой “природный аминокислотный остаток” и быть выбран из группы, состоящей из аланина (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: A), аргинина (arg, R), аспарагина (asn, N), аспарагиновой кислоты (asp, D), цистеина (cys, C), глутамина (gln, Q), глутаминовой кислоты (glu, E), глицина (gly, G), гистидина (his, H), изолейцина (ile, I), лейцина (leu, L), лизина (lys, K), метионина (met, M), фенилаланина (phe, F), пролина (pro, P), серина (ser, S), треонина (thr, T), триптофана (trp, W), тирозина (tyr, Y) и валина (val, V). Заменяющим аминокислотным остатком может быть “неприродный аминокислотный остаток”. См., например, US 6586207, WO 98/48032, WO 03/073238, US 2004/0214988, WO 2005/35727, WO 2005/74524, Chin J.W., et al., J. Am. Chem. Soc., 124 (2002) 9026-9027; Chin J.W. and Schultz P.G., ChemBioChem., 11 (2002) 1135-1137; Chin J.W. et al., PICAS United States of America, 99 (2002) 11020-11024; и Wang L. and Schultz P.G., Chem. (2002) 1-10 (все они полностью включены в данное описание посредством ссылки).

Термин “аминокислотная делеция” означает удаление по меньшей мере одного аминокислотного остатка из предварительно заданного положения в аминокислотной последовательности.

Термин “антитело” используется в данном описании в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая, но не ограничиваясь этим, моноклональные антитела (mAb), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела, триспецифичные антитела) и фрагменты антител, при условии, что они демонстрируют желаемую антиген-, и/или белок A-, и/или FcRn-связывающую активность.

Термин “асимметричная Fc-область” означает пару полипептидов Fc-области, которые имеют разные аминокислотные остатки в соответствующих положениях согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat.

Термин “Fc-область, асимметричная применительно к связыванию с FcRn”, означает Fc-область, состоящую из двух полипептидных цепей, которые имеют разные аминокислотные остатки в соответствующих положениях, причем данные положения определены согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat, при этом присутствие разных аминокислот в этих положениях влияет на связывание Fc-области с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) человека. В рамках данного описания различия между двумя полипептидными цепями Fc-области в “Fc-области, асимметричной применительно к связыванию с FcRn”, не включают различий, которые внесены с целью облегчения образования гетеродимерных Fc-областей, например, для получения биспецифичных антител. Эти различия также могут быть асимметричными, т.е. когда две цепи отличаются аминокислотными остатками в не соответствующих друг другу положениях согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat. Присутствие таких различий облегчает осуществление гетеродимеризации и уменьшает вероятность гомодимеризации. Примерами таких различий являются так называемые замены по типу “выступы во впадины” (см., например, US 7695936 и US 2003/0078385). Обнаружено, что вероятность образования гетеродимеров повышают следующие замены по типу “выступы” и “впадины” в индивидуальных полипептидных цепях Fc-области антитела IgG подкласса IgG1: 1) в одной цепи Y407T, а в другой цепи T366Y; 2) в одной цепи Y407A, а в другой цепи T366W; 3) в одной цепи F405A, а в другой цепи T394W; 4) в одной цепи F405W, а в другой цепи T394S; 5) в одной цепи Y407T, а в другой цепи T366Y; 6) в одной цепи T366Y и F405A, а в другой цепи T394W и Y407T; 7) в одной цепи T366W и F405W, а в другой цепи T394S и Y407A; 8) в одной цепи F405W и Y407A, а в другой цепи T366W и T394S; и 9) в одной цепи T366W, а в другой цепи T366S, L368A и Y407V, при этом из перечисленного особенно подходит последний вариант. Кроме того, образованию гетеродимеров способствуют изменения, в результате которых создаются новые дисульфидные мостики между двумя полипептидными цепями Fc-области (см., например, US 2003/0078385). Обнаружено, что вероятность образования гетеродимеров повышают следующие замены, которые приводят к появлению соответствующим образом расположенных в пространстве остатков цистеина для образования новых внутрицепочечных дисульфидных связей в индивидуальных полипептидных цепях Fc-области антитела IgG подкласса IgG1: в одной цепи Y349C, а в другой S354C; в одной цепи Y349C, а в другой E356C; в одной цепи Y349C, а в другой E357C; в одной цепи L351C, а в другой S354C; в одной цепи T394C, а в другой E397C; или в одной цепи D399C, а в другой K392C. Следующими примерами изменений аминокислот, способствующих гетеродимеризации, являются так называемые “парные замены с изменением заряда” (см., например, WO 2009/089004). Обнаружено, что вероятность образования гетеродимеров повышают следующие парные замены с изменением заряда в индивидуальных полипептидных цепях Fc-области антитела IgG подкласса IgG1: 1) в одной цепи K409D или K409E, а в другой цепи D399K или D399R; 2) в одной цепи K392D или K392E, а в другой цепи D399K или D399R; 3) в одной цепи K439D или K439E, а в другой цепи E356K или E356R; 4) в одной цепи K370D или K370E, а в другой цепи E357K или E357R; 5) в одной цепи K409D и K360D, а в другой цепи D399K и E356K; 6) в одной цепи K409D и K370D, а в другой цепи D399K и E357K; 7) в одной цепи K409D и K392D, а в другой цепи D399K, E356K и E357K; 8) в одной цепи K409D и K392D, а в другой цепи D399K; 9) в одной цепи K409D и K392D, а в другой цепи D399K и E356K; 10) в одной цепи K409D и K392D, а в другой цепи D399K и D357K; 11) в одной цепи K409D и K370D, а в другой цепи D399K и D357K; 12) в одной цепи D399K, а в другой цепи K409D и K360D; и 13) в одной цепи K409D и K439D, а в другой D399K и E356K.

Термин “связывание (с антигеном)” означает связывание антитела со своим антигеном в анализе in vitro, в одном из воплощений в анализе связывания, в котором антитело связывают с поверхностью и связывание антигена с антителом измеряют с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR). “Связывание” означает, что аффинность связывания (K_D) составляет 10^-8 М или меньше, в некоторых воплощениях от 10^-13 до 10^-8 М, в некоторых воплощениях от 10^-13 до 10^-9 М.

Связывание можно изучать в анализе с использованием BIAcore (биосенсор AB от GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Аффинность связывания определяют в терминах k_a (константа скорости ассоциации для антитела при образовании комплекса антитело/антиген), k_d (константа диссоциации) и K_D (k_d/k_a).

Термин “химерное” антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из определенного источника или вида, в то время как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или вида.

Термин “CH2-домен” означает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается приблизительно от положения 231 согласно EU до положения 340 согласно EU (EU система нумерации по Kabat). В одном из воплощений CH2-домен имеет аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 01: APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQ E STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK.

Термин “CH3-домен” означает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается приблизительно от положения 341 согласно EU до положения 446 согласно EU. В одном из воплощений CH3-домен имеет аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 2: GQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG.

“Класс” антитела относится к типу константного домена или константной области его тяжелой цепи. Существуют пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно подразделить на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

Термин “сопоставимая длина” означает, что два полипептида содержат одинаковое число аминокислотных остатков или могут отличаться по длине на один или более и вплоть до, самое большее, 10 аминокислотных остатков. В одном из воплощений полипептиды Fc-области содержат одинаковое число аминокислотных остатков или отличаются числом аминокислотных остатков от 1 до 10. В одном из воплощений полипептиды Fc-области содержат одинаковое число аминокислотных остатков или отличаются числом аминокислотных остатков от 1 до 5. В одном из воплощений полипептиды Fc-области содержат одинаковое число аминокислотных остатков или отличаются числом аминокислотных остатков от 1 до 3.

“Эффекторные функции” относятся к тем биологическим активностям, присущим Fc-области антитела, которые варьируют в зависимости от класса антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание с C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); связывание с Fc-рецепторами; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; отрицательную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора); и активацию B-клеток.

“Эффективное количество” агента, например, фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному в необходимых дозировках и в течение необходимого периода времени для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата.

Термин “слитая конструкция на основе полипептидов Fc-области” означает слитую конструкцию связывающего домена (например, антигенсвязывающего домена, такого как одноцепочечное антитело или полипептид, как например, лиганд рецептора) с Fc-областью антитела, которая демонстрирует желаемую активность в отношении связывания с мишенью, и/или белком A, и/или FcRn.

Термин “Fc-область человеческого происхождения” означает C-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина человеческого происхождения, которая содержит по меньшей мере часть шарнирной области, CH2-домен и CH3-домен. В одном из воплощений Fc-область тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. В одном из воплощений Fc-область имеет аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 03. Тем не менее, C-концевой остаток лизина (Lys447) Fc-области может присутствовать или может не присутствовать.

Как использовано в данном описании, аминокислотные положения во всех константных областях и доменах тяжелой и легкой цепи нумеруют согласно системе нумерации по Kabat, описанной в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), и в данном описании в этом отношении используют фразу “нумерация согласно Kabat”. Как правило, систему нумерации по Kabat (см. стр. 647-660) в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) используют для константных доменов легкой цепи (CL) изотипа каппа и лямбда, а систему нумерации EU-индекс по Kabat (см. стр. 661-723) используют для константных доменов тяжелой цепи (CH1, шарнирной области, CH2 и CH3).

Термин “FcRn” означает неонатальный Fc-рецептор человека. Функция FcRn заключается в спасении IgG от процесса лизосомальной деградации, что приводит к уменьшению клиренса и увеличению полупериода существования. FcRn представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из двух полипептидов: белка, подобного белку главного комплекса гистосовместимости класса I с ММ 50 кДа (α-FcRn) и β2-микроглобулина (β2m) с ММ 15 кДа. FcRn связывается с высокой аффинностью с CH2-CH3-частью Fc-области IgG. Взаимодействие между IgG и FcRn строго зависит от pH и осуществляется в стехиометрическом соотношении 1:2, при этом одна молекула IgG связывается с двумя молекулами FcRn посредством двух своих тяжелых цепей (Huber A.H., et al., J. Mol. Biol., 230 (1993) 1077-1083). Связывание с FcRn происходит в эндосоме при кислотных значениях pH (pH меньше 6,5), а IgG высвобождается на клеточной поверхности при нейтральных значениях pH (pH примерно 7,4). Зависимость характера этого взаимодействия от pH способствует FcRn-опосредуемой защите молекул IgG, которые попадают в клетки посредством пиноцитоза, от внутриклеточной деградации, благодаря связыванию с рецептором в кислотных условиях внутри эндосом. Кроме того, FcRn способствует возвращению IgG на поверхность клеток и последующему высвобождению в кровоток после воздействия на комплекс FcRn-IgG среды с нейтральным значением pH вне клетки.

Термин “FcRn-связывающая часть Fc-области” означает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается, начиная приблизительно от положения 243 согласно EU до положения 261 согласно EU, и приблизительно от положения 275 согласно EU до положения 293 согласно EU, и приблизительно от положения 302 согласно EU до положения 319 согласно EU, и приблизительно от положения 336 согласно EU до положения 348 согласно EU, и приблизительно от положения 367 согласно EU до положения 393 согласно EU и положения 408 согласно EU, и приблизительно от положения 424 согласно EU до положения 440 согласно EU. В одном из воплощений изменен один или более чем один из следующих аминокислотных остатков, соответствующих EU нумерации по Kabat: F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 и S440 (нумерация согласно EU).

Термин “каркас” или “каркасные области (FR)” относится к остаткам вариабельного домена, не являющимся остатками гипервариабельных участков (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно располагаются в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термин “полноразмерное антитело” означает антитело, имеющее структуру, по существу аналогичную структуре нативного антитела, содержащего четыре полипептида, или имеющее тяжелые цепи, содержащие Fc-область, определенную в данном описании. Полноразмерное антитело может содержать дополнительные домены, такие как, например, одноцепочечный Fv (scFv) или scFab, конъюгированные с одной или более чем одной из цепей полноразмерного антитела. Эти конъюгаты также охватываются термином “полноразмерное антитело”.

Термин “димерный полипептид” означает комплекс, содержащий по меньшей мере два полипептида, которые соединены ковалентными связями. Этот комплекс может содержать дополнительные полипептиды, которые также соединены ковалентными или нековалентными связями с другими полипептидами. В одном из воплощений димерный полипептид содержит два или четыре полипептида.

Термины “гетеродимер” или “гетеродимерный” означают молекулу, которая содержит два полипептида (например, сопоставимой длины), причем эти два полипептида имеют аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере один аминокислотный остаток в соответствующем положении будет другим, при этом данное соответствующее положение определено согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat.

Термины “гомодимер” и “гомодимерный” означают молекулу, которая содержит два полипептида сопоставимой длины, причем эти два полипептида имеют аминокислотную последовательность, идентичную в соответствующих положениях, при этом данные соответствующие положения определены согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat.

Гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, является гетеродимерным с точки зрения определения в плане рассматриваемых мутаций или свойств. Например, что касается связывания с FcRn и/или белком A (т.е. при обращении внимания на эти свойства), то димерный полипептид является гомодимерным (т.е. оба полипептида в составе димерного полипептида содержат эти мутации) в плане наличия мутаций H310A, H433A и Y436A (эти мутации рассматриваются в отношении свойства димерного полипептида связываться с FcRn и/или белком A), но в то же самое время является гетеродимерным в плане наличия мутаций Y349C, T366S, L368A и Y407V (эти мутации не учитываются, поскольку эти мутации касаются гетеродимеризации димерного полипептида и не затрагивают свойств, относящихся к связыванию с FcRn/белком A), а также в плане наличия мутаций S354C и T366W, соответственно (первый набор содержится только в первом полипептиде, в то время как второй набор содержится только во втором полипептиде). Кроме того, например, димерный полипептид, описанный в данной заявке, может быть гетеродимерным в плане наличия мутаций I253A, H310A, H433A, H435A и Y436A (т.е. все эти мутации направлены на свойства димерного полипептида связываться с FcRn и/или белком A), т.е. один полипептид содержит мутации I253A, H310A и H435A, в то время как другой полипептид содержит мутации H310A, H433A и Y436A.

Термины “клетка-хозяин”, “линия клеток хозяина” и “культура клеток хозяина” используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки хозяина включают “трансформанты” и “трансфицированные клетки”, которые включают первичную трансфицированную клетку и ее потомство безотносительно числа пересевов. Потомство может быть не полностью идентичным родительской клетке по составу нуклеиновых кислот, а может содержать мутации. Мутантное потомство, которое обладает той же функцией или биологической активностью, по которой проводят скрининг или отбирают первоначально трансфицированную клетку, включено в данное изобретение.

“Человеческое антитело” представляет собой антитело, имеющее аминокислотную последовательность, которая соответствует последовательности антитела, вырабатываемого человеком или продуцируемого человеческой клеткой, или происходящее из источника, не являющегося человеком, в котором используются репертуары человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела. Такое определение человеческого антитела, в частности, исключает гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки, не относящиеся к человеческому антителу.

“Консенсусным каркасом IgG человека” является каркас, который представляет собой наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки при выборе каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. Обычно, выбор последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека осуществляют из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, эта подгруппа последовательностей представляет собой ту же подгруппу, что и в Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242, vol. 1-3. В одном из воплощений для VL данная подгруппа представляет собой подгруппу каппа I, как и у Kabat и др., выше. В одном из воплощений для VH данная подгруппа представляет собой подгруппу III, как и у Kabat и др., выше.

Термин “происходящий из” означает, что аминокислотную последовательность получают из родительской аминокислотной последовательности путем внесения изменений по меньшей мере в одно положение. Такая измененная аминокислотная последовательность отличается от соответствующей родительской аминокислотной последовательности по меньшей мере в одном соответствующем положении (нумерация для Fc-областей антител согласно EU-индексу по Kabat). В одном из воплощений аминокислотная последовательность, происходящая из родительской аминокислотной последовательности, отличается по одному-пятнадцати аминокислотным остаткам в соответствующих положениях. В одном из воплощений аминокислотная последовательность, происходящая из родительской аминокислотной последовательности, отличается по одному-десяти аминокислотным остаткам в соответствующих положениях. В одном из воплощений аминокислотная последовательность, происходящая из родительской аминокислотной последовательности, отличается по одному-шести аминокислотным остаткам в соответствующих положениях. Аналогичным образом, измененная аминокислотная последовательность имеет высокую идентичность аминокислотной последовательности со своей родительской аминокислотной последовательностью. В одном из воплощений аминокислотная последовательность, происходящая из родительской аминокислотной последовательности, имеет идентичность аминокислотной последовательности, составляющую 80% или более. В одном из воплощений аминокислотная последовательность, происходящая из родительской аминокислотной последовательности, имеет идентичность аминокислотной последовательности, составляющую 90% или более. В одном из воплощений аминокислотная последовательность, происходящая из родительской аминокислотной последовательности, имеет идентичность аминокислотной последовательности, составляющую 95% или более.

Термин “полипептид Fc-области IgG человека” относится к аминокислотной последовательности, которая идентична “нативному” полипептиду Fc-области IgG человека или полипептиду Fc-области человеческого IgG “дикого типа”. Термин “полипептид вариантной Fc-области (IgG человека)” относится к аминокислотной последовательности, получающейся из полипептида “нативной” Fc-области человеческого IgG или полипептида Fc-области человеческого IgG “дикого типа” в результате по меньшей мере “изменения одной аминокислоты”. “Fc-область IgG человека” состоит из двух полипептидов Fc-области IgG человека. “Вариантная Fc-область (IgG человека)” состоит из двух полипептидов Fc-области, при этом оба могут быть полипептидами вариантной Fc-области (IgG человека), или один представляет собой полипептид Fc-области IgG человека, а другой представляет собой полипептид вариантной Fc-области.

В одном из воплощений полипептид Fc-области IgG человека имеет аминокислотную последовательность полипептида Fc-области человеческого IgG1 с SEQ ID NO: 03, или полипептида Fc-области человеческого IgG2 с SEQ ID NO: 04, или полипептида Fc-области человеческого IgG4 с SEQ ID NO: 06 с мутациями, описанными в данной заявке. В одном из воплощений полипептид вариантной Fc-области IgG (человека) происходит из полипептида Fc-области с SEQ ID NO: 03, или 04, или 06 и имеет по меньшей мере одну аминокислотную мутацию по сравнению с полипептидом Fc-области человеческого IgG, имеющим SEQ ID NO: 03, или 04, или 06. В одном из воплощений полипептид вариантной Fc-области IgG (человека) содержит/имеет от примерно одной до примерно десяти аминокислотных мутаций, а в одном из воплощений от примерно одной до примерно пяти аминокислотных мутаций. В одном из воплощений полипептид вариантной Fc-области IgG (человека) имеет по меньшей мере примерно 80% гомологии с полипептидом Fc-области IgG человека с SEQ ID NO: 03, или 04, или 06. В одном из воплощений полипептид вариантной Fc-области IgG (человека) имеет по меньшей мере примерно 90% гомологии с полипептидом Fc-области IgG человека с SEQ ID NO: 03, или 04, или 06. В одном из воплощений полипептид вариантной Fc-области IgG (человека) имеет по меньшей мере примерно 95% гомологии с полипептидом Fc-области IgG человека с SEQ ID NO: 03, или 04, или 06.

Полипептид вариантной Fc-области IgG (человека), происходящий из полипептида Fc-области человеческого IgG с SEQ ID NO: 03, или 04, или 06, определяется теми аминокислотными изменениями, которые в нем содержатся. Так, например, термин P329G относится к происходящему из полипептида вариантной Fc-области IgG (человека) полипептиду Fc-области человеческого IgG с мутацией пролин → глицин в аминокислотном положении 329 по сравнению с полипептидом Fc-области человеческого IgG с SEQ ID NO: 03, или 04, или 06.

Полипептид Fc-области IgG1 человека имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 03).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями L234A, L235A имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 07).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями Y349C, T366S, L368A и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 08).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 09).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями L234A, L235A и мутациями Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 10).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями L234A, L235A и S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутацией P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 12).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями L234A, L235A и мутацией P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутацией P239G и мутациями Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутацией P329G и мутациями S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 15).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями L234A, L235A, P329G и Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 16).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями L234A, L235A, P329G и мутациями S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 17).

Полипептид Fc-области IgG4 человека имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 06).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S228P и L235E имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 18).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S228P, L235E и мутацией P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 19).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 20).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 21).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S228P, L235E и S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 22).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S228P, L235E и Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 23).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутацией P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 24).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутацией P239G и мутациями Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 25).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутацией P329G и мутациями S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 26).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S228P, L235E, P329G и Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 27).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S228P, L235E, P329G и S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 28).

“Гуманизированное” антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из HVR антител, не являющихся человеческими, и аминокислотные остатки из FR человеческих антител. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело будет содержать по существу все или по меньшей мере один и в типичном случае два вариабельных домена, в которых все или по существу все HVR (например, определяющие комплементарность участки (CDR)) соответствуют HVR антитела, не являющегося человеческим, а все или по существу все FR соответствуют FR человеческого антитела. Гуманизированное антитело возможно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из человеческого антитела. “Гуманизированный вариант” антитела, например, антитела, не являющегося человеческим, относится к антителу, которое подвергнуто гуманизации.

Термин “гипервариабельный участок” или “HVR”, использованный в данном описании, относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными по последовательности (“определяющими комплементарность участками” или “CDR”), и образуют петли определенной структуры (“гипервариабельные петли”), и/или содержат контактирующие с антигеном остатки (“места контакта с антигеном”). Как правило, антитела содержат шесть HVR: три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). HVR, указанные в данном описании, включают:

(a) гипервариабельные петли, образуемые аминокислотными остатками 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) (Chothia C. and Lesk A.M., J. Mol. Biol., 196 (1987) 901-917;

(b) CDR образуемые аминокислотными остатками 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) (Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);

(c) места контакта с антигеном, образуемые аминокислотными остатками 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) и 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996)); и

(d) комбинации (a), (b) и/или (c), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) и 94-102 (H3).

Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) нумеруются в данном описании согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat (Kabat и др., выше).

“Индивидуумом” или “субъектом” является млекопитающее. Млекопитающие включают, но не ограничиваются этим, одомашенных животных (например, крупный рогатый скот, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и приматов, не являющихся людьми, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых воплощениях индивидуумом или субъектом является человек.

“Выделенное” антитело представляет собой антитело, которое отделено от компонентов своего природного окружения. В некоторых воплощениях антитело очищено до чистоты более 95% или 99%, как определено, например, электрофоретически (например, по данным электрофореза в полиакриамидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), изоэлектрофокусирования (IEF), капиллярного электрофореза) или хроматографически (например, посредством гель-проникающей хроматографии или ионообменной либо обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC)). В качестве обзора методов оценки чистоты антител см., например, Flatman S. et al., J. Chromatogr. B, 848 (2007) 79-87.

“Выделенная” нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая отделена от компонентов своего природного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула данной нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в таком месте хромосомы, которое отличается от ее природного расположения в хромосоме.

Термин “моноклональное антитело”, использованный в данном описании, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих встречающиеся в природе мутации или появляющихся в процессе приготовления препарата на основе моноклональных антител, при этом такие варианты обычно присутствуют в незначительных количествах. В противоположность препаратам на основе поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате на основе моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, определение “моноклональное” указывает на характер антитела, полученного по существу из гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать в смысле требования получения антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены различными методами, включая, но не ограничиваясь этим, гибридомный метод, методы рекомбинантных ДНК, методы фагового дисплея и методы с использованием трансгенных животных, содержащих весь локус или часть локуса иммуноглобулина человека, при этом такие методы и другие типичные методы получения моноклональных антител изложены в данном описании.

“Нативные антитела” относятся к молекулам природных иммуноглобулинов различной структуры. Например, нативные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с ММ примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, соединенных дисульфидными связями. В направлении от N-конца к C-концу каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также называемую вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которым следуют три константных домена (CH1, CH2 и CH3). Аналогично, в направлении от N-конца к C-концу каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также называемую вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которым следует константный домен легкой цепи (CL). Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности ее константного домена.

Термин “инструкция по применению” используется для обозначения инструкций, обычно вкладываемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.

“Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности” применительно к референсной полипептидной последовательности определяют как процентную долю аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в референсной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, разрывов, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивания, необходимого для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей, можно достичь различными способами, известными специалисту в данной области техники, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как программное обеспечение BLAST (средство поиска основного локального выравнивания), BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако же, для целей данного изобретения значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают, используя компьютерную программу для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 разработана Genentech, Inc., и исходная программа с документацией для пользователя подана в бюро по охране авторских прав США (U.S. Copyright Office), Вашингтон, округ Колумбия (D.C.), 20559, где она зарегистрирована под № TXU510087 в бюро регистрации авторского права США. Программа ALIGN-2 общедоступна через Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, или ее можно компилировать с исходной программы. Программу ALIGN-2 следует компилировать для использования в операционной системе UNIX, включая Digital UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не изменяются.

В тех ситуациях, когда для сравнений аминокислотных последовательностей используют ALIGN-2, % идентичности аминокислотных последовательностей для заданной аминокислотной последовательности A относительно, по сравнению с или против заданной аминокислотной последовательности B (что можно альтернативно перефразировать как “заданная аминокислотная последовательность A, которая имеет или содержит определенный % аминокислотной последовательности, идентичной относительно, по сравнению с или против заданной аминокислотной последовательности B”) вычисляют так, как приведено ниже:

100 умножить на отношение X/Y,

где X представляет собой количество аминокислотных остатков, отмечаемых как идентичные совпадения программой для выравнивания последовательностей ALIGN-2 при выравнивании A и B этой программой, и где Y представляет собой общее количество аминокислотных остатков в B. Будет очевидно, что там, где длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, % идентичности аминокислотной последовательности A относительно B не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности B относительно A. Если конкретно не указано иное, то все используемые в данном описании значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают так, как описано в непосредственно предшествующем абзаце, с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

Термин “фармацевтическая композиция” относится к препарату, форма которого способствует эффективному проявлению биологической активности активного ингредиента, содержащегося в нем, и который не содержит никаких дополнительных компонентов, являющихся неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет введена данная композиция.

“Фармацевтически приемлемый носитель” относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличающемуся от активного ингредиента и являющемуся нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничивается этим, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

Термин “пептидный линкер”, использованный в данном описании, означает пептид с разными аминокислотными последовательностями, который в одном из воплощений имеет синтетическое происхождение. В одном из воплощений пептидный линкер представляет собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность длиной по меньшей мере 30 аминокислот, в одном из воплощений длиной 32-50 аминокислот. В одном из воплощений пептидный линкер представляет собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность длиной 32-40 аминокислот. В одном из воплощений пептидный линкер представляет собой (G_xS)_n, где G означает глицин, S означает серин (x равно 3, n равно 8, 9 или 10, либо x равно 4, и n равно 6, 7 или 8), в одном из воплощений x равно 4, n равно 6 или 7, в одном из воплощений x равно 4, n равно 7. В одном из воплощений пептидный линкер представляет собой (G₄S)₆G₂.

Термин “рекомбинантное антитело”, который использован в данном описании, означает все антитела (химерное, гуманизированное и человеческое), которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с использованием рекомбинантных методов. Термин включает в себя антитела, выделенные из клетки хозяина, такой как клетка NS0 или клетка яичников китайского хомячка (CHO), или из животного (например, мыши), генетически модифицированного генами иммуноглобулина человека, или антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, которым трансфицирована клетка хозяина. Такие рекомбинантные антитела имеют вариабельную и константную области в реаранжированной форме). Рекомбинантные антитела, описанные в данной заявке, могут быть подвергнуты in vivo соматической гипермутации. Таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи происходящими из последовательностей и родственными последовательностям VH и VL антител зародышевой линии человека, не могут естественным образом существовать в репертуаре антител зародышевой линии человека in vivo.

Использованный в данном описании термин “лечение” (и такие его грамматические варианты, как “лечить” или “подвергание лечению”) относится к клиническому воздействию в попытке изменить естественное течение болезни у подвергаемого лечению индивидуума, и оно может быть проведено либо с целью профилактики, либо в процессе курса лечения клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, но не ограничиваются этим, предупреждение возникновения или рецидива заболевания, облегчение симптомов, сведение к минимуму любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности симптомов или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию или улучшенный прогноз. В некоторых воплощениях, антитела или слитые конструкции на основе полипептидов Fc-области, описанные в данной заявке, используют для задержки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

Термин “валентный”, который используется в рамках настоящей заявки, относится к наличию конкретного количества сайтов связывания в молекуле (антитела). По существу, термины “бивалентный”, “тетравалентный” и “гексавалентный” относятся к наличию двух сайтов связывания, четырех сайтов связывания и шести сайтов связывания, соответственно, в молекуле (антитела). Биспецифичные антитела, описанные в данной заявке, в одном из предпочтительных воплощений являются “бивалентными”.

Термин “вариабельная область” или “вариабельный домен” относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который вовлечен в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) антитела обычно имеют аналогичные структуры, при этом каждый домен содержит четыре каркасные области (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt T.J. et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для придания антигенсвязывающей специфичности. Кроме того, для скрининга библиотеки комплементарных VL- или VH-доменов можно выделить антитела, связывающиеся с конкретным антигеном, используя VH- или VL-домен из антитела, которое связывается с данным антигеном, соответственно. См., например, Portolano S. et al., J. Immunol., 150 (1993) 880-887; Clarkson T. et al., Nature, 352 (1991) 624-628.

Термин “сосудистое заболевание глаз” включает, но не ограничивается этим, интраокулярные неоваскулярные синдромы, такие как диабетическая ретинопатия, диабетический макулярный отек, ретинопатия недоношенных, неоваскулярная глаукома, окклюзии вен сетчатки, окклюзии центральной вены сетчатки, макулярная дегенерация, возрастная макулярная дегенерация, пигментный ретинит, ретинальная ангиоматозная пролиферация, макулярная телеангиэктазия, ишемическая ретинопатия, неоваскуляризация радужной оболочки глаза, интраокулярная неоваскуляризация, роговичная неоваскуляризация, неоваскуляризация сетчатки, хориоидальная неоваскуляризация и дегенеративные изменения сетчатки (см., например, Garner A., “Vascular diseases” в: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner A. and Klintworth G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710).

Термин “вектор”, использованный в данном описании, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, обладающей способностью репродуцировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Термин включает в себя вектор как самореплицирующуюся нуклеиновокислотную структуру, а также вектор, встроенный в геном клетки хозяина, в которую он введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном описании “экспрессирующими векторами”.

Термин “с мутацией IHH-AAA”, использованный в данном описании, относится к комбинации мутаций I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) и H435A (His435Ala), термин “с мутацией HHY-AAA”, использованный в данном описании, относится к комбинации мутаций H310A (His310Ala), H433A (His433Ala) и Y436A (Tyr436Ala), а термин “с мутацией YTE”, использованный в данном описании, относится к комбинации мутаций M252Y (Met252Tyr), S254T (Ser254Thr) и T256E (Thr256Glu) в константной области тяжелой цепи подкласса IgG1 или IgG4, при этом нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat.

Термин “с мутациями P329G LALA”, использованный в данном описании, относится к комбинации мутаций L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala) и P329G (Pro329Gly) в константной области тяжелой цепи подкласса IgG1, при этом нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat. Термин “с мутацией SPLE”, использованный в данном описании, относится к комбинации мутаций S228P (Ser228Pro) и L235E (Leu235Glu) в константной области тяжелой цепи подкласса IgG4, при этом нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat. Термин “с мутацией SPLE и P239G”, использованный в данном описании, относится к комбинации мутаций S228P (Ser228Pro), L235E (Leu235Glu) и P329G (Pro329Gly) в константной области тяжелой цепи подкласса IgG4, при этом нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat.

II. КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ

Согласно одному из аспектов, в основе данного изобретения лежит, помимо всего прочего, обнаружение того, что вариантные Fc-области, которые специфически связываются со стафилококковым белком A и которые связываются или не связываются с FcRn человека, способствуют очистке гетеродимерной Fc-области в том случае, когда в этой гетеродимерной Fc-области используется формирующая впадину цепь. Такие вариантные Fc-области содержат специфические аминокислотные мутации в CH2-домене, в то время как CH3-домен не изменен применительно к связыванию с белком A. Обнаружено, что эти мутации, в случае их использования в формирующей впадину цепи гетеродимерной Fc-области, способствуют очистке гетеродимерной Fc-области, т.е. отделению гетеродимерной Fc-области от являющейся побочным продуктом гомодимерной Fc-области (димера (цепь, формирующая впадину)-(цепь, формирующая впадину)).

Обнаружено, что этого можно достичь путем использования комбинации мутаций в первом полипептиде (цепи, формирующей впадину):

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D.

Приведенная ниже таблица представляет собой типичный обзор аминокислотных остатков в Fc-области, которые вовлечены во взаимодействия или которые изменены с целью модификации взаимодействий.

Остаток	Взаимодействие с	KiH	Связывание с белком A	Влияние мутаций на связывание с FcRn
белком A	FcRn	выступ	впадина
Pro238					P238A - усиливает
Thr250					T250Q/M428L - усиливают
Leu251	контакт с основной цепью
Met252	гидрофобная упаковка				M252W - усиливает; M252Y - усиливает; M252Y/T256Q - усиливают; M252F/T256D - усиливают; M252Y/S254T/T256E - усиливают

Остаток	Взаимодействие с	KiH	Связывание с белком A	Влияние мутаций на связывание с FcRn
белком A	FcRn	выступ	впадина
Ile253	контакт с основной цепью; образование водородных связей; существенное ослабление связывания в случае мутации с заменой на Ala	взаимодействие			I253A - ослабляет
Ser254	взаимодействие полярных групп; образование водородных связей				S254A - ослабляет; M252Y/S254T/T256E - усиливают
Arg255	солевой мостик				R255A - ослабляет

Остаток	Взаимодействие с	KiH	Связывание с белком A	Влияние мутаций на связывание с FcRn
белком A	FcRn	выступ	впадина
Thr256					T256A - усиливает; T256Q - усиливает; T256P - усиливает; M252Y/T256Q - ослабляют; M252F/T256D - ослабляют; M252Y/S254T/T256E - усиливают
Pro257					P257I/Q311I - усиливают; P257I/N434H - усиливают
Glu272					E272A - усиливает
Asp280					D280K - усиливает
His285					ослабление
Lys288					K288A - ослабляет; K288A/N434A - усиливают
Val305					V305A - усиливает

Остаток	Взаимодействие с	KiH	Связывание с белком A	Влияние мутаций на связывание с FcRn
белком A	FcRn	выступ	впадина
Thr307					T307A - усиливает; T307A/E380A/N434A - усиливают; T307Q/N434A - усиливают; T307Q/N434S - усиливают; T307Q/E380A/N434A - усиливают
Val308					V308P/N434A - усиливают
Leu309					L309A - ослабляет
His310		взаимодействие			H310A - ослабляет; H310Q/H433N - ослабляют
Gln311	взаимодействие полярных или заряженных групп				Q311A - усиливает; P257I/Q311I - усиливают
Asp312					D312A - усиливает
Leu314	гидрофобное взаимодействие
Lys317					K317A - усиливает
Ala339					A339T - усиливает

Остаток	Взаимодействие с	KiH	Связывание с белком A	Влияние мутаций на связывание с FcRn
белком A	FcRn	выступ	впадина
Tyr349				Y349C
Ser354			S354C
Thr366			T366W	T366S
Leu368				L368A
Asp376					D376A - усиливает; D376V/N434H - усиливают
Ala378					A378Q - усиливает
Glu380	солевой мостик				E380A - усиливает E380A/N434A - усиливают; T307A/E380A/N434A - усиливают; T307Q/E380A/N434A - усиливают
Glu382					E382A - усиливает
Gly385					G385H - усиливает; G385A/Q386P/N389S - усиливают
Gln386					G385A/Q386P/N389S - усиливают

Остаток	Взаимодействие с	KiH	Связывание с белком A	Влияние мутаций на связывание с FcRn
белком A	FcRn	выступ	впадина
Asn389					G385A/Q386P/N389S - усиливают
Tyr407				Y407V
Ser415					S415A - ослабляет
Ser424					S424A - усиливает
Met428					M428L - усиливает; T250Q/M428L - усиливают
Leu432	взаимодействие полярных или заряженных групп
His433	взаимодействие полярных или заряженных групп; солевой мостик	взаимодействие			H433A - ослабляет; H310Q/H433N - ослабляют; H433K/N434F/Y436H- усиливают; H433R/N434Y/Y436H- усиливают; H433K/N434F - усиливают

Остаток	Взаимодействие с	KiH	Связывание с белком A	Влияние мутаций на связывание с FcRn
белком A	FcRn	выступ	впадина
Asn434	образование водородных связей; существенное ослабление связывания в случае замены на Ala	взаимодействие			N434W/Y/F/A/H - усиливают; K288A/N434A - усиливают; E380A/N434A - усиливают; T307A/E380A/N434A - усиливают; N434F/Y436H - усиливают; H433K/N434F/Y436H- усиливают; H433R/N434Y/Y436H- усиливают; H433K/N434F - усиливают; P257I/N434H - усиливают; D376V/N434H - усиливают; T307Q/N434A - усиливают; T307Q/N434S - усиливают; V308P/N434A - усиливают; T307Q/E380A/N434A - усиливают

Остаток	Взаимодействие с	KiH	Связывание с белком A	Влияние мутаций на связывание с FcRn
белком A	FcRn	выступ	впадина
His435	гидрофобная упаковка; существенное ослабление связывания в случае мутации с заменой на Ala	взаимодействие			H435R/Y436F устраняет связывание с белком A	H435A - ослабляет; H435R - ослабляет
Tyr436	гидрофобная упаковка; существенное ослабление связывания в случае замены на Ala	взаимодействие			H435R/Y436F устраняет связывание с белком A	Y436A - ослабляет; N434F/Y436H - усиливают; H433K/N434F/Y436H- усиливают; H433R/N434Y/Y436H - усиливают

Модификации, описанные в данной заявке, изменяют связывание со стафилококковым белком A. Все измененные в результате мутации остатки локализованы в CH2-домене. И хотя остатки в CH3-домене также взаимодействуют с белком A, для воздействия на связывание с белком A достаточно иметь мутации остатков в CH2-домене. Таким образом, в гетеродимерных молекулах и антителах, описанных в данной заявке, оба CH3-домена имеют одинаковые (идентичные) свойства/характеристики в отношении связывания с белком A. Таким образом, гетеродимерная молекула, описанная в данной заявке, является гетеродимерной применительно к связыванию с белком A в CH2-домене, но гомодимерной применительно к связыванию с белком A в CH3-домене.

В одном из воплощений комбинация мутаций, описанная в данной заявке, не изменяет или по существу не изменяет полупериода существования в сыворотке гетеродимерного полипептида по сравнению с соответствующим гетеродимерным полипептидом, у которого такая комбинация мутаций отсутствует.

В одном из воплощений комбинация мутаций далее не изменяет или по существу не изменяет полупериода существования в сыворотке гетеродимерного полипептида по сравнению с соответствующим гетеродимерным полипептидом, у которого такая комбинация мутаций отсутствует.

A. Неонатальный Fc-рецептор (FcRn)

Неонатальный Fc-рецептор (FcRn) важен для метаболического пути антител класса IgG in vivo. Функция FcRn заключается в спасении IgG дикого типа от процесса лизосомальной деградации, что приводит к уменьшению клиренса и увеличению полупериода существования. Он представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из двух полипептидов: белка, подобного белку главного комплекса гистосовместимости класса I с ММ 50 кДа (α-FcRn) и β2-микроглобулина (β2m) с ММ 15 кДа. FcRn связывается с высокой аффинностью с CH2-CH3-частью Fc-области антитела класса IgG. Взаимодействие между антителом класса IgG и FcRn зависит от pH и осуществляется в стехиометрическом соотношении 1:2, т.е. одна молекула IgG антитела может взаимодействовать с двумя молекулами FcRn посредством своих двух полипептидов Fc-области тяжелой цепи (см., например, Huber A.H., et al., J. Mol. Biol., 230 (1993) 1077-1083).

Во взаимодействии между FcRn и Fc-областью антитела класса IgG принимают участие разные аминокислотные остатки CH2- и CH3-домена тяжелой цепи. Аминокислотные остатки, участвующие во взаимодействии с FcRn, локализованы, начиная приблизительно от положения 243 согласно EU до положения 261 согласно EU, приблизительно от положения 275 согласно EU до положения 293 согласно EU, приблизительно от положения 302 согласно EU до положения 319 согласно EU, приблизительно от положения 336 согласно EU до положения 348 согласно EU, в положении 408 согласно EU, и приблизительно от положения 424 согласно EU до положения 440 согласно EU. Более конкретно, во взаимодействие между Fc-областью и FcRn вовлечены следующие аминокислотные остатки, соответствующие EU нумерации по Kabat: F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 и S440.

Исследованиями с использованием сайт-специфического мутагенеза доказано, что в Fc-области IgG критичными сайтами для связывания с FcRn, являются гистидин 310, гистидин 435 и изолейцин 253 и в меньшей степени гистидин 433 и тирозин 436 (см., например, Kim J.K., et al., Eur. J. Immunol., 29 (1999) 2819-2825; Raghavan M., et al., Biochem., 34 (1995) 14649-14657; Medesan C., et al., J. Immunol., 158 (1997) 2211-2217).

Способы усиления связывания IgG с FcRn были осуществлены путем внесения мутаций в различные аминокислотные остатки в IgG: треонин 250, метионин 252, серин 254, треонин 256, треонин 307, глутаминовую кислоту 380, метионин 428, гистидин 433 и аспарагин 434 (см. Kuo T.T., et al., J. Clin. Immunol., 30 (2010) 777-789).

В некоторых случаях желательны антитела с более низким полупериодом существования в кровотоке. Например, лекарственные средства для интравитреального введения должны иметь продолжительный полупериод существования в глазу и короткий полупериод существования в кровотоке пациента. Кроме того, преимущество таких антител заключается в их усиленном воздействии в месте заболевания, например в глазу.

Известны различные мутации, оказывающие влияние на связывание с FcRn и тем самым на полупериод существования в кровотоке. С использованием сайт-специфического мутагенеза идентифицированы аминокислотные остатки Fc-области, критичные для взаимодействия Fc-области IgG мыши и мышиного FcRn (см., например, Dall'Acqua W.F., et al., J. Immunol., 169 (2002) 5171-5180). В это взаимодействие вовлечены остатки I253, H310, H433, N434 и H435 (согласно EU нумерации по Kabat) (Medesan C., et al., Eur. J. Immunol., 26 (1996) 2533-2536; Firan M., et al., Int. Immunol., 13 (2001) 993-1002; Kim J.K., et al., Eur. J. Immunol., 24 (1994) 542-548). Обнаружено, что присутствие остатков I253, H310 и H435 критично для взаимодействия Fc-области IgG человека с мышиным FcRn (Kim J.K., et al., Eur. J. Immunol., 29 (1999) 2819-2825). В результате исследований белок-белковых взаимодействий с целью улучшения связывания с FcRn Dall'Acqua и др. были описаны мутации по остаткам M252Y, S254T, T256E (Dall'Acqua W.F., et al. J. Biol. Chem., 281 (2006) 23514-23524). Исследования комплекса Fc-область IgG человека-FcRn человека показали, что остатки I253, S254, H435 и Y436 являются важнейшими для данного взаимодействия остатками (Firan M., et al., Int. Immunol., 13 (2001) 993-1002; Shields R.L., et al., J. Biol. Chem., 276 (2001) 6591-6604). В работе Yeung Y.A. и др. (J. Immunol., 182 (2009) 7667-7671) описаны различные мутанты по остаткам 248-259, и 301-317, и 376-382, и 424-437 и проведено их изучение. Типичные мутации и их влияние на связывание с FcRn приведены в следующей таблице.

Таблица
Мутации	Влияние на связывание с FcRn	Полупериод существования в кровотоке	Ссылка
H285 H310Q/H433N (мышиный IgG1)	ослабляли связывание (с FcRn мыши)	уменьшали (у мыши)	Kim J.K., Scand. J. Immunol., 40 (1994) 457-465
I253A H310A H435A H436A (мышиный IgG1)	ослабляли связывание (с FcRn мыши)	уменьшали (у мыши)	Ghetie V. and Ward E.S., Immunol. Today, 18 (1997) 592-598
T252L/T254S/T256F T252A/T254S/T256A (мышиный IgG1)	усиливали связывание (с FcRn мыши)	увеличивали (у мыши)	Ghetie V. and Ward E.S., Immunol. Today, 18 (1997) 592-598
I253A H310A H435A H436A H433A/N434Q (мышиный IgG1)	ослабляли связывание (с FcRn мыши)	уменьшали (у мыши)	Medesan C., et al., J. Immunol., 158 (1997) 2211-2217

Мутации	Влияние на связывание с FcRn	Полупериод существования в кровотоке	Ссылка
I253A H310A H435A H435R (человеческий IgG1)	ослабляли; H310A: <0,1 отн. связывания с muFcRn (FcRn мыши)	уменьшали (у мыши)	Kim J.K., Eur. J. Immunol., 29 (1999) 2819-2825
H433A (человеческий IgG1)	1,1 отн. связывания с FcRn мыши; 0,4 отн. связывания с FcRn человека (мыши)		Kim J.K., Eur. J. Immunol., 29 (1999) 2819-2825
I253A S254A H435A Y436A (человеческий IgG1)	ослабляли; <0,1 относительно связывания с FcRn человека	уменьшали	Shields R.L., et al., J. Biol. Chem., 276 (2001) 6591-6604
R255A K288A L309A S415A H433A (человеческий IgG1)	ослабляли связывание (с FcRn человека)	уменьшали	Shields R.L., et al., J. Biol. Chem., 276 (2001) 6591-6604

Мутации	Влияние на связывание с FcRn	Полупериод существования в кровотоке	Ссылка
P238A T256A E272A V305A T307A Q311A D312A K317A D376A A378Q E380A E382A S424A N434A K288A/N434A E380A/N434A T307A/E380A/N434A (человеческий IgG1)	усиливали связывание (с FcRn человека)	увеличивали	Shields R.L., et al., J. Biol. Chem., 276 (2001) 6591-6604
H435A (гуманизированный IgG1)	ослабляли; <0,1 относительно связывания с FcRn человека	уменьшали	Firan M., et al., Int. Immunol., 13 (2001) 993-1002

Мутации	Влияние на связывание с FcRn	Полупериод существования в кровотоке	Ссылка
I253A (отсутствие связывания) M252W M252Y M252Y/T256Q M252F/T256D N434F/Y436H M252Y/S254T/T256E G385A/Q386P/N389S H433K/N434F/Y436H H433R/N434Y/Y436H G385R/Q386T/P387R/N389P M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F/Y436H M252Y/S254T/T256E/G385R /Q386T/P387R/N389P (человеческий IgG1)	усиливали связывание (с FcRn мыши и человека)	уменьшали (у мыши)	Dall'Acqua J. Immunol., 169 (2002) 5171-5180
M428L T250Q/M428L (человеческий IgG2)	усиливали связывание (с FcRn человека)	увеличивали (у макака)	Hinton P.R., et al., J. Biol. Chem., 279 (2004) 6213-6216
M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F (человеческий IgG)	усиливали связывание (с FcRn человека)	увеличивали (у мыши)	Vaccaro C., et al., Nat. Biotechnol., 23 (2005) 1283-1288

Мутации	Влияние на связывание с FcRn	Полупериод существования в кровотоке	Ссылка
T307A/E380A/N434A (химерный IgG1)	усиливали	увеличивали у трансгенной мыши	Pop L.M., et al., Int. Immunopharmacol., 5 (2005) 1279-1290
T250Q E380A M428L N434A K288A/N434A E380A/N434A T307A/E380A/N434A (человеческий IgG1)	усиливали связывание (с FcRn человека)	увеличивали у трансгенной мыши	Petkova S.B., et al., Int. Immunol., 18 (2006) 1759-1769
I253A (человеческий IgG1)	ослабляли связывание (с FcRn человека)	уменьшали у трансгенной мыши	Petkova S.B., et al., Int. Immunol., 18 (2006) 1759-1769
S239D/A330L/I332E M252Y/S254T/T256E (гуманизированный)	усиливали связывание (с FcRn человека и яванского макака)	увеличивали у яванского макака	Dall'Acqua W.F., et al., J. Biol. Chem., 281 (2006) 23514-23524
T250Q M428L T250Q/M428L (человеческий IgG1)	усиливали связывание (с FcRn человека)	увеличивали у макака-резус	Hinton P.R., et al., J. Immunol., 176 (2006) 346-356

Мутации	Влияние на связывание с FcRn	Полупериод существования в кровотоке	Ссылка
T250Q/M428L P257I/Q311I (гуманизированный IgG1)	усиливали связывание (с FcRn мыши и яванского макака)	никакого изменения у яванского макака; увеличивали у мыши	Datta-Mannan A., et al., J. Biol. Chem., 282 (2007) 1709-1717
P257I/Q311I P257I/N434H D376V/N434H (гуманизированный IgG1)	усиливали связывание при pH 6 (с FcRn человека, яванского макака, мыши)	уменьшали у мышей; P257I/N434H: уменьшали у яванского макака	Datta-Mannan A., et al., Drug Metab. Dispos., 35 (2007) 86-94

Мутации	Влияние на связывание с FcRn	Полупериод существования в кровотоке	Ссылка
аннулировали связывание с FcRn: I253, H310, H433, H435; ослабляли связывание с FcRn: Y436; усиливали связывание с FcRn: T250, N252, S254, T256, T307, M428, N434	усиливали и ослабляли	снижение способности IgG связываться с FcRn уменьшало время его существования в сыворотке крови; взаимодействие FcRn-IgG с более высокой аффинностью пролонгировало полупериоды существования IgG- и Fc-связанных лекарственных средств в сыворотке крови	Ropeenian D.C. and Akilesh S., Nat. Rev. Immunol., 7 (2007) 715-725

Мутации	Влияние на связывание с FcRn	Полупериод существования в кровотоке	Ссылка
N434A T307Q/N434A T307Q/N434S V308P/N434A T307Q/E380A/N434A (человеческий IgG1)	усиливали связывание (с FcRn яванского макака)	увеличивали у яванского макака	Yeung Y.A., et al., Cancer Res., 70 (2010) 3269-3277
256P 280K 339T 385H 428L 434W/Y/F/A/H (человеческий IgG)	усиливали при нейтральных pH		WO 2011/122011

Результаты симметричного конструирования Fc-области IgG1 с целью оказания влияния на связывание с FcRn показаны в следующей далее таблице (выравнивание мутаций и время удерживания на колонке для хроматографии на основе аффинности к FcRn).

Таблица
Мутации, влияющие на эффекторные функции	Мутация 1, влияющая на связывание с FcRn	Мутация 2, влияющая на связывание с FcRn	Мутация 3, влияющая на связывание с с FcRn	Время удержив. на колонке на основе аффинности к FcRn [мин]
L234A/L235A/P329G	---	---	---	45,3
L234A/L235A/P329G	I253A	H310A	H435A	2,3
L234A/L235A/P329G	I253A	---	---	2,7
L234A/L235A/P329G	---	H310A	---	2,4
L234A/L235A/P329G	---	---	H435A	2,7
L234A/L235A/P329G	I253A	H310A	---	2,3
L234A/L235A/P329G	I253A	---	H435A	2,3
L234A/L235A/P329G	---	H310A	H435A	2,4
L234A/L235A/P329G	---	H310A	Y436A	2,3
L234A/L235A/P329G	H310A	H433A	Y436A	2,4
L234A/L235A/P329G	---	---	Y436A	41,3

Времена удерживания меньше 3 минут соответствуют отсутствию связывания, поскольку вещество находится в проходящем потоке (“проскоке”) (в пике, выходящем со “свободным” объемом).

Одиночная мутация H310A является “самой сильной” молчащей симметричной мутацией с точки зрения ликвидации любого связывания с FcRn.

Симметричные одиночные мутации I253A и H435A приводят к относительному смещению времени удерживания на 0,3-0,4 мин. В общем случае, это можно рассматривать как недетектируемое связывание.

Внесение одиночной мутации Y436A приводит к детектированию сильного взаимодействия с колонкой при хроматографии на основе аффинности к FcRn. Не вдаваясь в теоретические рассуждения, отметим, что эта мутация может оказать влияние на FcRn-опосредуемый полупериод существования, в отличие от случая отсутствия взаимодействия, как например, при внесении комбинации мутаций I253A, H310A и H435A (мутация IHH-AAA).

Результаты, полученные с использованием симметрично модифицированного антитела к HER2, приведены в следующей далее таблице (в качестве ссылки см. WO 2006/031370).

Таблица
Мутация	Время удерживания [мин]
I253H	отсутствие связывания
M252D	отсутствие связывания
S254D	отсутствие связывания
R255D	41,4
M252H	43,6
K288E	45,2
L309H	45,5
E258H	45,6
T256H	46,0
K290H	46,2
D98E	46,2
дикий тип	46,3
K317H	46,3
Q311H	46,3
E430H	46,4
T307H	47,0
N434H	52,0

B. Сосудистые заболевания глаз

Сосудистые заболевания глаз представляют собой любое патологическое состояние, характеризующееся измененной или нерегулируемой пролиферацией и инвазией новых кровеносных сосудов в структуры тканей глаза, таких как сетчатка или роговица.

В одном из воплощений сосудистое заболевание глаз выбрано из группы, состоящей из влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной формы AMD), сухой формы возрастной макулярной дегенерации (сухой формы AMD), диабетического макулярного отека (DME), кистозного макулярного отека (CME), непролиферативной диабетической ретинопатии (NPDR), пролиферативной диабетической ретинопатии (PDR), кистозного макулярного отека, васкулита (например, окклюзии центральной вены сетчатки), отека диска зрительного нерва, ретинита, конъюнктивита, увеита, хориоидита, многоочагового хориоидита, глазного гистоплазмоза, блефарита, “сухого” глаза (болезни Шегрена) и других офтальмических болезней, при этом данное заболевание глаз или расстройство органов зрения ассоциировано с глазной неоваскуляризацией, сосудистой транссудацией и/или отеком сетчатки.

Антитело, содержащее гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, применимо в предупреждении и лечении влажной формы AMD, сухой формы AMD, CME, DME, NPDR, PDR, блефарита, “сухого” глаза и увеита, в одном из предпочтительных воплощений - влажной формы AMD, сухой формы AMD, блефарита и “сухого” глаза, также в одном из предпочтительных воплощений - CME, DME, NPDR и PDR, также в одном из предпочтительных воплощений - блефарита и “сухого” глаза, в особенности, влажной формы AMD и сухой формы AMD и также, в особенности, влажной формы AMD.

В некоторых воплощениях сосудистое заболевание глаз выбрано из группы, состоящей из влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной формы AMD), макулярного отека, окклюзий вен сетчатки, ретинопатии недоношенных и диабетической ретинопатии.

Другие заболевания, ассоциированные с роговичной неоваскуляризацией, включают, но не ограничиваются этим, эпидемический кератоконъюнктивит, дефицит витамина A, переутомление от ношения контактных линз, атопический кератит, верхний лимбический кератит, сочетание птеригиума и синдрома сухого глаза, болезнь Шегрена, розовые угри (акнэ), фликтенулез, сифилис, микобактериальные инфекции, дегенерацию липидного слоя (слезной пленки), химические ожоги, язвы, вызываемые бактериями, язвы, вызываемые грибками, инфекции, вызываемые вирусом простого герпеса, инфекции, вызываемые вирусом опоясывающего герпеса, протозойные инфекции, саркому Капоши, язву Мурена, краевую дегенерацию роговицы Терриена, краевой кератолиз, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, полиартериит, травму, саркоидоз Вегенера, склерит, синдром Стивенса-Джонсона, (рубцующийся) пемфигоид после радиальной кератомии и отторжение роговичного имплантата.

Заболевания, ассоциированные с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидеи включают, но не ограничиваются этим, диабетическую ретинопатию, макулярную дегенерацию, серповидноклеточную анемию, саркоид, сифилис, эластическую псевдоксантому, болезнь Педжета, окклюзию вен, окклюзию артерий, обструктивное заболевание сонной артерии, хронический увеит/витреит, микобактериальные инфекции, болезнь Лайма, системную красную волчанку, ретинопатию недоношенных, пигментный ретинит, отек сетчатки (включая макулярный отек), болезнь Илза, болезнь Бехчета, инфекции, вызывающие ретинит или хориоидит, предполагаемый гистоплазмоз глаз, болезнь Беста, миопию, врожденные ямки в диске зрительного нерва, болезнь Штаргардта, парспланит, хроническое отслоение сетчатки, синдромы повышенной вязкости крови, токсоплазмоз, травму и постлазерные осложнения.

Другие заболевания включают, но не ограничиваются этим, заболевания, ассоциируемые с рубеозом радужки (неоваскуляризацией угла передней камеры), и заболевания, вызываемые аномальной пролиферацией фиброваскулярной или фиброзной ткани, включая все формы пролиферативной витреоретинопатии.

Ретинопатия недоношенных (ROP) представляет собой заболевание глаз, поражающее недоношенных детей. Полагают, что оно вызывается дезорганизованным ростом кровеносных сосудов сетчатки, что может привести к образованию рубцов и отслоению сетчатки. ROP может быть умеренной и может проходить спонтанно, но в серьезных случаях может привести к слепоте. По сути, все недоношенные дети имеют риск ROP, и очень маленький вес при рождении является дополнительным фактором риска. Развитию ROP могут способствовать как токсичное действие кислорода, так и относительная гипоксия.

Макулярная дегенерация представляет собой заболевание, преимущественно встречающееся у пожилых людей, при котором центр внутренней оболочки глаза, известный как макулярная область сетчатки, претерпевает истончение, атрофию и в некоторых случаях кровотечение. Это может привести к потере центрального зрения, что влечет за собой неспособность видеть мелкие детали, читать или распознавать лица. По данным Американской академии офтальмологии сегодня это главная причина потери центрального зрения (слепоты) в Соединенных Штатах Америки для лиц старше пятидесяти лет. Хотя некоторые виды макулодистрофии, которые затрагивают более молодых людей, иногда называют макулярной дегенерацией, этот термин обычно относится к возрастной макулярной дегенерации (AMD или ARMD).

Возрастная макулярная дегенерация начинается с возникновения характерных желтых отложений в макуле (центральной зоне сетчатки, которая обеспечивает детализированное центральное зрение, называемое фовеальным), именуемых друзами, между пигментным эпителием сетчатки и лежащей под ним сосудистой оболочкой. Большинство людей с такими ранними изменениями (называемыми возрастной макулопатией) имеют хорошее зрение. У людей с друзами может развиваться прогрессирующая AMD. Риск значительно повышается, когда друзы становятся большими по размеру и многочисленными и ассоциированы с нарушением пигментного клеточного слоя под макулой. Большие и мягкие друзы связаны с повышением отложений холестерина и могут поддаваться лечению агентами, снижающими содержание холестерина, или с применением реологической процедуры (Rheo procedure).

Прогрессирующая AMD, ответственная за полную потерю зрения, имеет две формы: сухую и влажную. Центральная географическая атрофия, сухая форма прогрессирующей AMD, возникает в результате атрофии пигментного эпителиального слоя сетчатки, расположенного в нижней части сетчатки (если смотреть со стороны стекловидного тела), что приводит к потере зрения вследствие утраты фоторецепторов (палочек и колбочек) в центральной части глаза. Несмотря на отсутствие методов лечения этого состояния, в Национальном институте глаза (National Eye Institute) и других организациях продемонстрировано, что витаминные добавки совместно с применяемыми в высоких дозах антиоксидантами лютеином и зеаксантином замедляют прогрессирование сухой макулярной дегенерации, а у некоторых пациентов улучшают остроту зрения.

Пигментный ретинит (RP) представляет собой группу генетических заболеваний глаз. При прогрессировании симптомов RP трубчатому зрению, как правило, в течение нескольких лет или даже десятилетий предшествует куриная слепота. Многие люди с RP официально не признаются слепыми, пока не достигнут возраста более 40 или 50 лет, и они сохраняют некоторую способность видеть всю свою жизнь. Другие в результате RP полностью теряют зрение, в некоторых случаях уже в детском возрасте. Прогрессирование RP в каждом случае протекает по-разному. RP представляет собой тип врожденной дистрофии сетчатки, группу наследственных расстройств, при которых аномалии фоторецепторов (палочек и колбочек) или пигментного эпителия сетчатки (RPE) приводят к прогрессирующей потере зрения. Страдающие этим индивидуумы сначала испытывают нарушение адаптации к темноте или никталопию (куриную слепоту), сопровождающуюся сокращением периферического зрения (явление, известное как трубчатое зрение) и иногда потерей центрального зрения на поздних этапах течения заболевания.

Макулярный отек возникает, когда жидкость и белковые отложения собираются на макуле глаза, желтой центральной зоне сетчатки, или под ней, вызывая ее утолщение и набухание. Такое набухание может искажать центральное зрение субъекта, поскольку макула расположена вблизи центра сетчатки в задней части глазного яблока. В этой зоне находятся плотно упакованные колбочки, которые обеспечивают острое, четкое центральное зрение, позволяющее субъекту видеть форму, цвет и детали, находящиеся непосредственно на линии взгляда. Кистозный макулярный отек представляет собой тип макулярного отека, при котором происходит образование кист.

C. Настоящее изобретение

Обнаружено, что для существенного воздействия на связывание достаточно одной односторонней мутации в одном полипептиде Fc-области. Чем больше мутаций внесено в Fc-область, тем больше изменяется, т.е. ослабляется или усиливается, связывание со стафилококковым белком A и/или FcRn.

В данной заявке описан способ уменьшения количества побочного продукта с ненадлежащим образованием пар по типу “впадина-впадина”, возникающего при получении биспецифичных антител по типу “выступ-во-впадину” (KiH) при конструировании CH2-домена.

Аминокислоты в положениях L251, I253, H310, L314 в CH2-домене участвуют во взаимодействии с белком A и неонатальным Fc-рецептором человека (FcRn).

В результате осуществления замены аминокислот в одном или более чем одном из этих положений так называемой формирующей впадину цепи KiH-биспецифичного антитела на аминокислоты A, G или D свойство связываться с белком A и FcRn может быть подавлено.

В одном из предпочтительных воплощений CH2-домен содержит мутации 1) I253A или I253G и 2) L314A, или L314G, или L314D.

В результате такого конструирования побочный продукт с ненадлежащим образованием пар по типу “впадина-впадина” больше не может связываться с белком A и FcRn (нет возможности осуществления какого-либо взаимодействия с обеими тяжелыми цепями). Поэтому побочный продукт с ненадлежащим образованием пар по типу “впадина-впадина” не будет связываться на колонке для аффинной хроматографии с белком A и/или FcRn. Таким образом, побочный продукт с ненадлежащим образованием пар по типу “впадина-впадина” будет по меньшей мере элюироваться раньше, т.е. в виде отдельно обособленного пика, или вообще не будет связываться и может быть обнаружен в проходящем потоке (“проскоке”) при аффинной хроматографии на колонке с белком A или FcRn.

Чтобы компенсировать нарушенные свойства в отношении связывания с FcRn, расположенные рядом аминокислоты можно “улучшить” посредством внесения в область впадины мутации T250Q, и/или T256E, и/или T307H, либо в единственном числе, либо в виде одинарной, двойной или тройной комбинации.

Аминокислота и положение	Аминокислотная мутация в формирующей впадину цепи	Аминокислотная мутация в формирующей выступ цепи
Приводят к уменьшению связывания с FcRn для конечной биспецифичной молекулы
L251	A, G, D	L
I253	A, G	I
H310	A, G	H
L314	A, G, D	L
Приводят к уменьшению связывания с белком A при компенсации связывания с FcRn в области впадины для конечной биспецифичной молекулы; можно использовать в единственном числе или в комбинации
T250	Q	T
M252	Y	M
S254	T	S
T256	E, A	T
T307	A, H, Q, P	T
Q311	H	Q
Приводят к уменьшению связывания с белком A при компенсации связывания с FcRn в области выступа для конечной биспецифичной молекулы; можно использовать в единственном числе или в комбинации
T250	T	Q
M252	M	Y
S254	S	T

Аминокислота и положение	Аминокислотная мутация в формирующей впадину цепи	Аминокислотная мутация в формирующей выступ цепи
T256	T	E, A
T307	T	A, H, Q, P
Q311	Q	H

Описание условий конструирования связывания с FcRn приведено в следующей далее таблице.

Положение	Связывание с FcRn, усиленное в результате мутации с заменой на	Связывание с FcRn, ослабленное в результате мутации с заменой на	Связывание с белком A	Связывание с белком G
CH2
T250	Q
L251		D	есть	есть
M252	Y	L, D, (H)	есть	есть
I253		A	есть	есть
S254	T	A, D	есть	есть
R255		A, D
T256	E, A
E258		(H)
K288		E
T307	A, H, Q, P, H
L309		A, H
H310		A
Q311	H
L314		D	есть	нет
CH3
M428	L	(E)		есть
E430	H
L432		D	есть	есть
H433		A	нет	есть
N434	A, W, Y, H		есть	есть
H435		A	есть
Y436		A	нет	есть

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен гетеродимерный полипептид, содержащий

при этом первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D,

при этом первый полипептид и второй полипептид соединены одним или более дисульфидными мостиками,

(нумерация соответствует EU-индексу по Kabat).

В одном из воплощений первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D, и

3) T250Q, и/или

4) T256E или T256A.

В одном из воплощений первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D, и

3) возможно a) T250Q, и/или b) T256E или T256A, и

4) a) L251A, или L251G, или L251D, и/или b) H310A или H310G.

В одном из воплощений первый полипептид (цепь, формирующая впадину) содержит мутацию

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D, и

3) a) T250Q, и/или b) T256E или T256A, и

4) a) L251A, или L251G, или L251D, и/или b) H310A или H310G,

5) возможно a) T307A, или T307H, или T307Q, или T307P, и/или b) Q311H, и/или c) M252Y, и/или d) S254T.

В одном из воплощений второй полипептид (цепь, формирующая выступ) содержит мутацию

1) T250Q, и/или

2) M252Y, и/или

3) S254T, и/или

4) T256E или T256A, и/или

5) T307A, или T307H, или T307Q, или T307P, и/или

6) Q311H.

В одном из воплощений шарнирная область иммуноглобулина, CH2-домен иммуноглобулина и CH3-домен иммуноглобулина первого и второго полипептида происходят из подкласса IgG1 человека. В одном из воплощений первый полипептид и второй полипептид каждый дополнительно содержит мутации L234A и L235A. В одном из воплощений первый полипептид и второй полипептид каждый дополнительно содержит мутацию P329G. В одном из воплощений первый полипептид и второй полипептид каждый дополнительно содержит мутации L234A, L235A и P329G.

В одном из воплощений шарнирная область иммуноглобулина, CH2-домен иммуноглобулина и CH3-домен иммуноглобулина первого и второго полипептида происходят из подкласса IgG4 человека. В одном из воплощений первый полипептид и второй полипептид каждый дополнительно содержит мутации S228P и L235E. В одном из воплощений первый полипептид и второй полипептид каждый дополнительно содержит мутацию P329G. В одном из воплощений первый полипептид и второй полипептид каждый дополнительно содержит мутации S228P, L235E и P329G.

В одном из воплощений гетеродимерный полипептид представляет собой полноразмерное антитело.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложено антитело, содержащее гетеродимерный полипептид (вариантную Fc-область класса IgG человека), описанный в данной заявке.

Fc-область (гетеродимерный полипептид), описанная в данной заявке, в случае, если она содержится в полноразмерном антителе, придает молекуле описанные выше характеристики.

Антитела, например, полноразмерные антитела или моноклональные антитела, полученные с использованием технологии CrossMab, могут содержать вариантную Fc-область класса IgG (человека), описанную в данной заявке.

Гетеродимерные полипептиды обладают, вследствие наличия мутаций, свойствами не связываться со стафилококковым белком A с участием одной цепи (цепи, формирующей впадину) и связываться со стафилококковым белком A с участием другой цепи (цепи, формирующей выступ).

Таким образом, эти антитела можно очищать, т.е. отделять от нежелательных, содержащих формирующую впадину цепь, димерных побочных продуктов, используя традиционные аффинные носители с белком A, такие как MabSelectSure. Нет необходимости в использовании высокотехнологичных, но обладающих ограниченной специфичностью связывания аффинных носителей, таких как, например, CappaSelect, который пригоден только для антител, содержащих легкую цепь подкласса каппа. Кроме того, нет необходимости в адаптации метода очистки, если производится модификация/замена данного подкласса легкой цепи.

a) культивирования клетки млекопитающего, содержащей одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке,

b) извлечения гетеродимерного полипептида из среды культивирования, и

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложено применение комбинации мутаций 1) I253A или I253G и 2) L314A, или L314G, или L314D для отделения гетеродимерных полипептидов от гомодимерных полипептидов.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложено биспецифичное антитело, предоставляющее возможность использования простого метода выделения/очистки, содержащее Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина, модифицированные по-разному, при этом по меньшей мере одна из модификаций приводит к 1) получению биспецифичного антитела с другой аффинностью к белку A, и такое гетеродимерное биспецифичное антитело можно выделить из разрушенной клетки, из среды или из смеси антител, основываясь на его аффинности к белку A.

В одном из воплощений биспецифичное антитело элюируется при значении pH примерно 4,0.

В одном из воплощений биспецифичное антитело выделяют, используя аффинную хроматографию на белке А и элюирование с применением градиента pH или ступенчатого изменения pH, при этом в состав элюента при использовании градиента pH или ступенчатого изменения pH добавляют соль. В конкретном воплощении соль присутствует в концентрации от примерно 0,5 молярной до примерно 1 молярной. В одном из воплощений соль выбрана из группы, состоящей из солей - ацетат лития, натрия и калия; бикарбонаты натрия и калия; карбонаты лития, натрия и калия; хлориды лития, натрия, калия и магния; фториды натрия и калия; нитраты натрия, калия и кальция; фосфаты натрия и калия; и сульфаты кальция и магния. В одном из воплощений соль представляет собой соль галогенида щелочного металла или щелочноземельного металла. В одном из предпочтительных воплощений солью является хлорид натрия.

Согласно одному из аспектов димерный полипептид содержит первый полипептид, модифицированный так, как описано в данной заявке, и второй полипептид, который не модифицирован в отношении связывания с белком A или FcRn, для того, чтобы образовывался гетеродимерный полипептид, при этом данная характерная модификация приводит к элюированию димерного полипептида с аффинного носителя с белком A при значениях pH выше на 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,2; 1,3 или 1,4 единицы, чем для соответствующего димерного полипептида без этой характерной модификации. В одном из воплощений димерный полипептид с такими характерными модификациями элюируется при pH 4 или выше, в то время как немодифицированный димерный полипептид элюируется при pH 3,5 или ниже. В одном из воплощений димерный полипептид с такими характерными модификациями элюируется при pH примерно 4, в то время как немодифицированный димерный полипептид элюируется при pH примерно 2,8-3,5; 2,8-3,2 или 2,8-3. В этих воплощениях термин “немодифицированный” относится к отсутствию модификации 1) I253A и I253G и 2) L314A, и L314G, и L314D (система нумерации соответствует индексу EU по Kabat) в обоих полипептидах.

В случае хроматографических разделений добавление соли в концентрации от 0,5 молярной до 1 молярной (например, NaCl) может улучшить отделение гомодимерного полипептида от гетеродимерного полипептида, в особенности, если они происходят из подкласса IgG1 человека. Добавление соли в элюирующий раствор, повышающее значение pH, может расширить диапазон pH для элюирования, так что, например, успешного разделения этих двух полипептидов можно достичь с использованием ступенчатого градиента pH.

Соответственно, в одном из воплощений, способ выделения биспецифичного антитела, содержащего гетеродимерную Fc-область IgG, где одна цепь содержит мутации, описанные в данной заявке, включает стадию применения градиента pH в присутствии соли. В одном из воплощений соль присутствует в концентрации, достаточной для максимального увеличения разницы в значениях pH, соответствующих элюированию с хроматографического носителя с белком A гомодимера Fc-области IgG и гетеродимера Fc-области IgG. В одном из воплощений соль присутствует в концентрации от примерно 0,5 молярной до примерно 1 молярной. В одном из воплощений соль представляет собой соль щелочного металла или щелочноземельного металла и галогена. В одном из воплощений соль представляет собой хлорид щелочного металла или щелочноземельного металла, такую как, например, NaCl, KCl, LiCl, CaCl₂ или MgCl₂. В одном из воплощений для градиента pH используют диапазон от примерно pH 4 до примерно pH 5. В одном из воплощений градиент представляет собой линейный градиент. В одном из воплощений градиент pH представляет собой ступенчатый градиент. В одном из воплощений способ включает применение раствора с pH примерно 4 для уравновешивания аффинной колонки с белком A. В одном из воплощений биспецифичное антитело, содержащее гетеродимерную Fc-область IgG применительно к модификациям, описанным в данной заявке, элюируется с носителя для аффинной хроматографии с белком A в одной или нескольких фракциях, по существу не содержащей(их) негетеродимерного биспецифичного антитела.

Гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, получают с использованием рекомбинантных методов. Так, один из аспектов настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, а другой аспект относится к клетке, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке.

Способы получения рекомбинантными методами широко известны в документах данной области техники и включают экспрессию белка в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением гетеродимерного полипептида и обычно очистку до фармацевтически приемлемой чистоты. Чтобы осуществить экспрессию гетеродимерных полипептидов, которые упомянуты выше, в клетке хозяина, нуклеиновые кислоты, кодирующие соответствующие первый и второй полипептиды, встраивают в экспрессирующие векторы стандартными методами. Экспрессию проводят в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках хозяина типа клеток CHO, клеток NS0, клеток SP2/0, клеток HEK293, клеток COS, клеток PER.C6, клеток дрожжей или клеток E. coli, и гетеродимерный полипептид извлекают из клеток (из культурального супернатанта или клеток после разрушения).

Общие способы получения антител рекомбинантными методами хорошо известны в документах данной области техники и описаны, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. Purif., 17 (1999) 183-202; Geisse S., et al., Protein Expr. Purif., 8 (1996) 271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol., 16 (2000) 151-160; и Werner R.G., Drug Res., 48 (1998) 870-880.

Соответственно, один из аспектов, описанных в данной заявке, относится к способу получения гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, включающему стадии:

a) трансфекции клетки хозяина одним или более векторами, содержащими молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке,

b) культивирования клетки хозяина с целью экспрессии гетеродимерного полипептида, и

c) извлечения гетеродимерного полипептида из культивируемой смеси и тем самым получения гетеродимерного полипептида.

В одном из воплощений стадия извлечения по пункту (c) включает применение реагента специфичного захвата Fc-области иммуноглобулина. В одном из воплощений этот реагент специфичного захвата Fc-области используется в режиме связывания-элюирования. Примерами таких реагентов специфичного захвата Fc-области являются, например, носители для колоночной аффинной хроматографии с имммобилизованным на них стафилококковым белком A, изготовленные на базе особо прочной матрицы на основе агарозы, которая позволяет работать при высоких скоростях потока и низком противодавленим в случае получения крупномасштабных партий. Они содержат лиганд, который связывается с гетеродимерным полипептидом, т.е. его Fc-областью. Лиганды присоединены к матрице через длинную гидрофильную спейсерную ножку, что делает их легко доступными для связывания с целевой молекулой.

Гетеродимерные полипептиды, описанные в данной заявке, подходящим образом отделяют от культуральной среды, используя традиционные методики очистки иммуноглобулинов, такие как, например, хроматография на сефарозе с иммобилизованным на ней белком A, на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

ДНК и РНК, кодирующие моноклональные антитела, легко выделяют и секвенируют с использованием традиционных методик. После выделения ДНК может быть встроена в экспрессирующие векторы, которыми затем трансфицируют клетки хозяина, такие как клетки HEK 293, клетки CHO или миеломные клетки, которые в отсутствие этого не продуцируют гетеродимерные полипептиды, для синтеза рекомбинантных моноклональных гетеродимерных полипептидов в клетках хозяина.

Очистку антител осуществляют с целью устранения клеточных компонентов или других примесей, например, других нуклеиновых кислот или белков клетки, стандартными методами, включая обработку щелочью/SDS, разделение полос при центрифугировании в градиенте CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие хорошо известные в данной области методы (см., например, Ausubel F. et al., ed., Current Ptotocos in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)). Для очистки белков общепризнанными и широко используемыми считаются различные методы, такие как аффинная хроматография с использованием микробных белков (например, аффинная хроматография на носителях с иммобилизованным белком A или белком G), ионообменная хроматография (например, катионообменная (на карбоксиметил-содержащих носителях), анионообменная (на аминоэтил-содержащих носителях) и хроматография на смешанных ионообменниках), тиофильная адсорбционная хроматография (например, с использованием бета-меркаптоэтанола и других SH-содержащих лигандов), адсорбционная хроматография гидрофобных или ароматических взаимодействий (например, с использованием фенил-сефарозы, аза-аренофильных носителей или м-аминофенилбороновой кислоты), металл-хелатирующая аффинная хроматография (например, с использованием Ni(II)- и Cu(II)-аффинного носителя), гель-проникающая хроматография и электрофоретические методы (такие как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi M.A., Appl. Biochem. Biotech., 75 (1998) 93-102).

Один из аспектов, описанных в данной заявке, относится к фармацевтической композиции, содержащей гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке. Другой аспект изобретения относится к применению гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, для изготовления фармацевтической композиции. Следующий аспект изобретения относится к способу изготовления фармацевтической композиции, содержащей гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, при изготовлении которой вместе с ним использован фармацевтический носитель.

Композицию, описанную в данной заявке, можно вводить разнообразными способами, известными в данной области техники. Специалисту в данной области будет очевидно, что путь и/или способ введения будет варьировать в зависимости от желаемых результатов. Чтобы ввести соединение по изобретению с использованием определенных путей введения, может потребоваться нанесение на данное соединение покрытия из материала, предотвращающего его инактивацию, или совместное с этим материалом введение соединения. Например, соединение можно вводить субъекту в соответствующем носителе, например, в составе липосом, или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический раствор и водные буферные растворы. Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области техники.

Можно использовать много возможных способов доставки, включая, но не ограничиваясь этим, интраокулярное введение или местное нанесение. В одном из воплощений введение осуществляют интраокулярно, и оно включает, но не ограничивается этим, субконъюнктивальную инъекцию, интракамеральную инъекцию, инъекцию в переднюю камеру глаза через височную сторону лимба, интрастромальную инъекцию, внутрироговичную инъекцию, субретинальную инъекцию, инъекцию во внутриглазную жидкость, субтеноновую инъекцию или использование устройства непрерывной доставки, интравитреальную инъекцию (например, инъекцию в переднюю, среднюю или заднюю часть стекловидного тела). В одном из воплощений введение выполняют местно, и оно включает, но не ограничивается этим, нанесение глазных капель на роговицу.

В одном из воплощений гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, или фармацевтическую композицию, описанную в данной заявке, вводят, используя способ интравитреального введения, например, посредством интравитреальной инъекции. Это может быть осуществлено в соответствии со стандартными методиками, известными в данной области техники. См., например, Ritter et al., J. Clin. Invest., 116 (2006) 3266-3276, Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol., 25 (1999) 196-206 и Wray et al., Arch. Neurol., 33 (1976) 183-185.

В некоторых воплощениях терапевтические наборы по изобретению могут содержать одну или более доз гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, присутствующего в фармацевтической композиции, описанной в данной заявке, устройство, подходящее для интравитреальной инъекции фармацевтической композиции, и инструкцию с подробным описанием подходящих субъектов и протоколов для выполнения такой инъекции. Обычно в этих воплощениях композиции вводят субъекту, нуждающемуся в лечении, посредством интравитреальной инъекции. Это может быть осуществлено в соответствии со стандартными методиками, известными в данной области техники (см., например, Ritter et al., J. Clin. Invest., 116 (2006) 3266-3276, Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol., 25 (1999) 196-206 и Wray et al., Arch. Neurol., 33 (1976) 183-185).

Данная композиция также может содержать такие адъюванты, как консерванты, увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечить как посредством описанных выше процедур стерилизации, так и посредством включения различных антибактеральных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и тому подобного. Кроме этого, желательным может быть включение в композиции изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и тому подобное. Помимо этого, посредством включения агентов, замедляющих всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин, можно способствовать пролонгированному всасыванию инъекционной фармацевтической формы.

Независимо от выбранного пути введения, на основе соединений, описанных в данной заявке, которые могут быть использованы в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтических композиций, описанных в данной заявке, готовят фармацевтически приемлемые лекарственные формы традиционными способами, известными специалистам в данной области техники.

Фактические уровни дозировок активных ингредиентов в фармацевтической композиции, описанной в данной заявке, можно варьировать, чтобы получить количество активного ингредиента, которое будет эффективным с точки зрения достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента, с точки зрения композиции и способа введения, причем без оказания токсичного действия пациенту. Выбранный уровень дозировок будет зависеть от ряда фармакокинетических факторов, включая активность конкретных используемых композиций по настоящему изобретению, путь введения, время введения, скорость выделения конкретного используемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, применяемые в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраст, пол, массу, состояние, общее состояние здоровья и предшествующая история болезни подвергаемого лечению пациента, и подобных факторов, хорошо известных в области медицины.

Композиция должна быть стерильной и текучей до такой степени, чтобы ее можно было доставлять с помощью шприца. Помимо воды, носителем в одном из предпочтительных воплощений является изотонический забуференный физиологический раствор.

Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях, предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннит или сорбит, и хлорид натрия.

Композиция может представлять собой офтальмическую депо-композицию, содержащую активный агент для субконъюнктивального введения. Такая офтальмическая депо-композиция содержит микрочастицы по-существу чистого активного агента, например, гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке. Микрочастицы, содержащие гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, могут быть встроены в биосовместимый фармацевтически приемлемый полимер или липидный инкапсулирующий агент. Такие депо-композиции могут быть приспособлены для того, чтобы осуществлять высвобождения всего или по существу всего активного вещества в течение длительного периода времени. Полимерная или липидная матрица, если она присутствует, может быть приспособлена для того, чтобы в достаточной степени быть подвергнутой разрушению при транспортировке от места введения после высвобождения всего или по существу всего активного агента. Депо-композиция может представлять собой композицию в жидкой форме, содержащую фармацевтически приемлемый полимер и растворенный или диспергированный активный агент. После инъекции полимер образует депо в месте инъекции, например, посредством гелеобразования или осаждения.

Другой аспект, описанный в данной заявке, относится к гетеродимерному полипептиду, описанному в данной заявке, для применения в лечении сосудистых заболеваний глаз.

Одним из воплощений изобретения является гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, для применения в лечении сосудистых заболеваний глаз.

Другой аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, описанной в данной заявке, для применения в лечении сосудистых заболеваний глаз.

Другой аспект изобретения относится к применению гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, для изготовления лекарственного средства для лечения сосудистого заболевания глаз.

Другой аспект изобретения относится к способу лечения пациента, страдающего сосудистыми заболеваниями глаз, путем введения гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

В данном описании особо указано, что термин “содержащий”, использованный в данном описании, включает в себя термин “состоящий из”. Таким образом, все аспекты и воплощения, которые содержат термин “содержащий”, подобным же образом описываются термином “состоящий из”.

D. Модификации

В следующем аспекте гетеродимерный полипептид по любому из вышеупомянутых воплощений может включать любой из признаков, по отдельности или в комбинации, которые описаны в приведенных ниже разделах 1-6.

1. Аффинность антител

В одном из воплощений K_D измеряют в анализах с применением поверхностного плазмонного резонанса, используя BIACORE^®. Например, анализ с использованием BIACORE^®-2000 или BIACORE^®-3000 (GE Healthcare Inc., Piscataway, NJ) проводят при 25°C с CM5-чипами с иммобилизованным связывающим партнером, на уровне приблизительно 10 единиц ответного сигнала (RU). В одном из воплощений биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, GE Healthcare Inc.) активируют N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Связывающий партнер разбавляют 10 мМ ацетатом натрия, pH 4,8, до концентрации 5 мкг/мл (примерно 0,2 мкМ), после чего вводят со скоростью потока 5 мкл/минута до момента достижения приблизительно 10 единиц ответного сигнала (RU) для связанного связывающего партнера. После введения связывающего партнера вводят 1 М этаноламин, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений вводят димерный полипептид, содержащий слитый полипептид или антитело, в двукратных серийных разведениях (от 0,78 нМ до 500 нМ) в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) с 0,05% полисорбата 20 (TWEEN-20™) в качестве поверхностно-активного вещества (PBST - PBS/твин) при 25°C и скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Константы скорости ассоциации (k_on) и константы скорости диссоциации (k_off) рассчитывают, используя простую модель связывания Ленгмюра “один к одному” (аналитическое программное обеспечение BIACORE^®, версия 3.2), посредством совместной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (K_D) рассчитывают в виде соотношения k_off/k_on (см., например, Chen et al., J. Mol. Biol., 293 (1999), 865-881). Если константа скорости ассоциации превышает 10⁶ М^-1с^-1 по данным вышеупомянутого анализа с использованием поверхностного плазмонного резонанса, то ее можно определить, применяя метод гашения флуоресценции, в котором измеряют при 25°C увеличение или уменьшение интенсивности флуоресценции (возбуждение соответствует 295 нм; излучение соответствует 340 нм, полоса пропускания 16 нм) для 20 нМ антитела к антигену (в форме Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена по результатам измерений на спектрометре, таком как спектрофотометр, приспособленный для измерения методом остановленной струи, (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-AMINCO™ серии 8000 (ThermoSpectronic), снабженный кюветой с перемешиванием.

2. Химерные и гуманизированные антитела

В некоторых воплощениях гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, содержится в химерном антителе. Некоторые химерные антитела описаны, например, US 4816567 и в Morrison S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855. В одном из примеров химерное антитело содержит вариабельную область антитела, не являющегося человеческим, (например, вариабельную область, происходящую из антитела мыши, крысы, хомяка, кролика или примата, не являющегося человеком, такого как обезьяна) и константную область антитела человека. В другом примере химерное антитело представляет собой антитело с переключенным изотипом, в котором класс или подкласс был изменен по сравнению с родительским антителом. Химерные антитела включают свои антигенсвязывающие фрагменты.

В некоторых воплощениях химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Обычно антитело, не являющееся человеческим, подвергают гуманизации с целью снижения иммуногенности в отношении людей, с сохранением при этом специфичности и аффинности родительского антитела, не являющегося человеческим. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR, (или их части) происходят из антитела, не являющегося человеческим, а FR (или их части) происходят из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело возможно также будет содержать по меньшей мере часть константной области антитела человека. В некоторых воплощениях несколько остатков FR в гуманизированном антителе заменены на соответствующие остатки из антитела, не являющегося человеческим (например, антитела, из которого данные остатки HVR происходят), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

Обзор по гуманизированным антителам и способам их получения приведен, например, в Almagro J.C. and Fransson J., Front. Biosci., 13 (2008) 1619-1633, и они также описаны, например, в Riechmann I. et al., Nature, 332 (1988) 323-329; Queen C. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 86 (1989) 10029-10033; US 5821337, US 7527791, US 6982321 и US 7087409; Kashmiri S.V. et al., Methods, 36 (2005) 25-34 (где описывается привитие “определяющих специфичность участков” (SDR); Padlan E.A., Mol. Immunol., 28 (1991) 489-498 (где описывается “изменение поверхности”); Dall'Acqua W.F. et al., Methods, 36 (2005) 43-60 (где описывается “перетасовка FR”); Osbourn J. et al., Methods, 36 (2005) 61-68 и Klimka A. et al., Br. J. Cancer, 83 (2000) 252-260 (где описывается подход “направленной селекции” для перетасовки FR).

Каркасные области антител человека, которые могут быть использованы для гуманизации, включают, но не ограничиваются этим: каркасные области, отобранные с использованием метода “наилучшего соответствия” (см., например, Sims M.J. et al., J. Immunol., 151 (1993) 2296-2308); каркасные области, происходящие из консенсусной последовательности конкретной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепей человеческих антител (см., например, Carter P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 4285-4289 и Presta L.G. et al., J. Immunol., 151 (1993) 2623-2632); каркасные области зрелых человеческих антител (претерпевших соматические мутации) или каркасные области антител зародышевой линии человека (см., например, Almagro J.C. and Fransson J., Front. Biosci., 13 (2008) 1619-1633); и каркасные области, полученные в результате скрининга библиотек FR (см., например, Baca M. et al., J. Biol. Chem., 272 (1997) 10678-10684 и Rosok M.J. et al., J. Biol. Chem., 271 (1996) 22611-22618).

3. Человеческие антитела

В некоторых воплощениях димерный полипептид, описанный в данной заявке, происходит из человеческого антитела. Человеческие антитела могут быть получены с использованием различных методов, известных в данной области техники. Человеческие антитела в целом описаны в van Dijk M.A. and van de Winkel J.G., Curr. Opin. Pharmacol., 5 (2001) 368-374 и Lonberg N., Curr. Opin. Immunol., 20 (2008) 450-459.

Человеческие антитела могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано с целью получения интактных человеческих антител или интактных антител с вариабельными областями антител человека в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные обычно содержат все иммуноглобулиновые локусы человека или их часть, которые заменяют эндогенные иммуноглобулиновые локусы или которые присутствуют вне хромосомы либо случайным образом интегрированы в хромосомы животных. В таких трансгенных мышах эндогенные иммуноглобулиновые локусы, как правило, инактивированы. Обзор способов получения человеческих антител с использованием трансгенных животных см. в Lonberg N., Nat. Biotech., 23 (2005) 1117-1125. Также см., например, US 6075181 и US 6150584, где описывается технология XENOMOUSE™; US 5770429, где описывается технология HuMab®; US 7041870, где описывается технология K-M MOUSE®, и US 2007/0061900, где описывается технология VELOCIMOUSE®. Вариабельные области антител человека из интактных антител, производимых такими животными, могут быть дополнительно модифицированы, например, путем комбинирования с другой константной областью антитела человека.

Человеческие антитела также могут быть получены гибридомными методами. Описаны клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мышь-человек для получения человеческих моноклональных антител (см., например, Kozbor D., J. Immunol., 133 (1984) 3001-3005; Brodeur B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; и Boerner P. et al., J. Immunol., 147 (1991) 86-95). Человеческие антитела, созданные посредством гибридомной технологии с использованием B-клеток человека, также описаны в Li J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 (2006) 3557-3562. Дополнительные способы включают способы, описанные, например, в US 7189826 (где описывается получение моноклональных антител IgM человека из гибридомных клеточных линий) и в Ni J., Xiandai Mianyixue, 26 (2006) 265-268 (где описываются гибридомы человек-человек). Технология гибридом человека (триомная технология) также описана в Vollmers H.P. and Brandlein S., Histology and Histopathology, 20 (2005) 927-937 и Vollmers H.P. and Brandlein S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (2005) 185-191.

Человеческие антитела также могут быть созданы посредством выделения последовательностей вариабельных доменов Fv-клонов, отобранных из библиотек фагового дисплея, полученных на основе антител человека. Такие последовательности вариабельных доменов далее могут быть объединены с желаемым константным доменом антитела человека. Методы отбора человеческих антител из библиотек антител описываются ниже.

4. Антитела, полученные с использованием библиотек

В некоторых воплощениях гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, содержится в полученном с использованием библиотек антителе. Полученные с использованием библиотек антитела могут быть выделены посредством скрининга комбинаторных библиотек на антитела с желаемой(ыми) активностью или активностями. Например, в данной области техники известен ряд способов создания библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек на антитела, обладающие желаемыми характеристиками в отношении связывания. Обзор таких способов приведен, например, в Hoogenboom H.R. et al., Methods in Molecular Biology, 178 (2001) 1-37, и помимо этого они описаны, например, в McCafferty J. et al., Nature, 348 (1990) 552-554; Clackson T. et al., Nature, 352 (1991) 624-628; Marks J.D. et al., J. Mol. Biol., 222 (1992) 581-597; Marks J.D. and Bradbury A., Methods in Molecular Biology, 248 (2003) 161-175; Sidhu S.S. et al., J. Mol. Biol., 338 (2004) 299-310; Lee C.V. et al., J. Mol. Biol., 340 (2004) 1073-1093; Fellouse F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 (2004) 12467-12472; и Lee C.V. et al., J. Immunol. Methods, 284 (2004) 119-132.

В некоторых методах фагового дисплея репертуары генов VH и VL клонируют по отдельности, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР), и повторно объединяют случайным образом в фаговых библиотеках, которые затем могут быть подвергнуты скринингу в отношении антигенсвязывающего фага, как описано в Winter G. et al., Ann. Rev. Immunol., 12 (1994) 433-455. Обычно фаг проявляет фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов, либо в виде Fab фрагментов. Библиотеки на основе иммунизированных источников обеспечивают получение высокоаффинных в отношении иммуногена антител без необходимости конструирования гибридом. Альтернативно, можно клонировать репертуар интактных антител (например, человека) для обеспечения единого источника антител к разнообразному ассортименту как чужих, так и собственных антигенов, и без какой-либо иммунизации, как описано в Griffiths A.D. et al., EMBO J., 12 (1993) 725-734. И наконец, наивные библиотеки также могут быть созданы синтетическим путем посредством клонирования нереаранжированных сегментов V-генов из стволовых клеток и использования ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность для кодирования высоко вариабельных участков CDR3 и для завершения реаранжировки in vitro, как описано в Hoogenboom H.R. and Winter G., J. Mol. Biol., 227 (1992) 381-388. Патентные публикации, описывающие фаговые библиотеки человеческих антител, включают, например: US 5750373 и US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936 и US 2009/0002360.

Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек антител человека, считаются в данном описании человеческими антителами или фрагментами человеческих антител.

5. Мультиспецифичные антитела

В некоторых воплощениях гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, содержится в мультиспецифичном антителе, например биспецифичном антителе. Мультиспецифичные антитела представляют собой моноклональные антитела, обладающие специфичностями связывания по меньшей мере к двум разным сайтам. В некоторых воплощениях одна из специфичностей связывания направлена на первый антиген, а другая на какой-либо другой второй антиген. В некоторых воплощениях биспецифичные антитела могут связываться с двумя разными эпитопами одного и того же антигена. Биспецифичные антитела также могут быть использованы для локализации цитотоксических агентов в клетках, которые экспрессируют по меньшей мере один из антигенов. Биспецифичные антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

Методы получения мультиспецифичных антител включают, но не ограничиваются этим, рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, имеющих разные специфичности (см. Milstein C. and Cuello A.C., Nature, 305 (1983) 537-540, WO 93/08829 и Traunecker A. et al., EMBO J., 10 (1991) 3655-3659), и создание конструкций типа “выступ-во-впадину” (см., например, US 5731168). Мультиспецифичные антитела также могут быть получены путем конструирования электростатических направляющих взаимодействий для создания Fc-гетеродимерных молекул антител (WO 2009/089004); перекрестного сшивания двух или более антител или фрагментов (см., например, US 4676980 и Brennan M. et al., Science, 229 (1985) 81-83); использования лейциновых “застежек” для получения биспецифичных антител (см., например, Kostelny S.A. et al., J. Immunol., 148 (1992) 1547-1553); использования технологии “диател” для получения биспецифичных фрагментов антител (см., например, Hollinger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1993) 6444-6448); использования димеров одноцепочечных Fv (scFv) (см., например Gruber M. et al., J. Immunol., 152 (1994) 5368-5374) и получения триспецифичных антител, как описано, например, в Tutt A. et al., J. Immunol., 147 (1991) 60-69.

Сконструированные антитела с тремя или более функциональными антигенсвязывающими сайтами, включая “антитела-осьминоги (octopus antibodies)”, также включены в данное описание (см., например, US 2006/0025576).

Антитело или фрагмент, упомянутые в данном описании, также включают “Fab двойного действия” или “DAF” (см., например, US 2008/0069820).

Антитело или фрагмент, упомянутые в данном описании, также включают мультиспецифичные антитела, описанные в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2010/145793.

6. Варианты антител

В некоторых воплощениях гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, содержится в антителе. В другом воплощении предусмотрены варианты аминокислотных последовательностей антител, предложенных согласно данному изобретению. Например, может оказаться желательным улучшить аффинность связывания с антигеном и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела могут быть получены посредством внесения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или в результате пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции из, и/или вставки в, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения окончательной конструкции, при условии, что такая окончательная конструкция будет обладать желаемыми характеристиками, например, антигенсвязывающими свойствами, можно выполнить любую комбинацию делеции, вставки и замены.

a) Варианты с заменами, вставками и делециями

В некоторых воплощениях предложены варианты антител, имеющие одну или более аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес с точки зрения мутагенеза с введением замен, включают HVR и FR. Консервативные замены показаны в приведенной ниже таблице под заголовком “предпочтительные замены”. Более существенные изменения приведены в следующей далее таблице под заголовком “типичные замены” и, как дополнительно описано ниже, они имеют отношение к классам боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены могут быть внесены в антитело, представляющее интерес, и продукты могут быть подвергнуты скринингу в отношении желаемой активности, например, сохраненного/улучшенного связывания с антигеном, ослабленной иммуногенности или улучшенной ADCC или CDC.

ТАБЛИЦА
Исходный остаток	Типичные замены	Предпочтительные замены
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин	Leu
Leu (L)	Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile

Исходный остаток	Типичные замены	Предпочтительные замены
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин	Leu

Аминокислоты могут быть классифицированы в соответствии с общими свойствами боковой цепи на:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) содержащие остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены повлекут за собой замену представителя одного из этих классов на представителя другого класса.

Один из типов варианта с заменами включает замену одного или более остатков в гипервариабельных участках родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(ые) вариант(ы), отобранный(ые) для последующего изучения, будет(ут) иметь модификации (например, улучшения) некоторых биологических свойств (например, повышенную аффинность, сниженную иммуногенность) по сравнению с родительским антителом и/или будет(ут) иметь существенно сохраненные некоторые биологические свойства родительского антитела. Типичным вариантом с заменами является антитело с “созревшей аффинностью”, которое подходящим образом может быть создано, например, с использованием методов “созревания аффинности”, основанных на применении фагового дисплея, например, изложенных в данном описании. Кратко, вносят мутацию по одному или более остаткам HVR, проявляют вариантные антитела на поверхности фага и проводят скрининг в отношении конкретной биологической активности (например, аффинности связывания).

Изменения (например, замены) могут быть выполнены в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения могут быть выполнены в “горячих точках” HVR, т.е. в остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвержены мутации в процессе соматического созревания (см., например, Chowdhury P.S., Methods Mol. Biol., 207 (2008) 179-196), и/или в остатках, которые контактируют с антигеном, при этом полученный вариант VH или VL тестируют в отношении аффинности связывания. Метод созревания аффинности путем конструирования вторичных библиотек и повторного отбора из них описан, например, Hoogenboom H.R. и др. в Methods in Molecular Biology, 178 (2002) 1-37. В некоторых воплощениях метода созревания аффинности разнообразие в гены вариабельной области, выбранные для созревания, вносят любым из ряда способов (например, посредством допускающей ошибки ПЦР, перетасовки цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). Затем создают вторичную библиотеку. После этого проводят скрининг данной библиотеки с целью идентификации любых вариантов антитела с желаемой аффинностью. Другой способ внесения разнообразия включает HVR-направленные подходы, при которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков одновременно). При этом остатки HVR, вовлеченные в связывание антигена, можно специфически идентифицировать, например, используя аланин-сканирующий мутагенез или моделирование. Особенно часто мишенью становятся CDR-H3 и CDR-L3.

В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции могут осуществляться в пределах одного или более HVR при условии, что такие изменения по существу не снижают способности антитела связываться с антигеном. Например, в HVR могут быть выполнены консервативные изменения (например, консервативные замены, предложенные в данном изобретении), которые по существу не снижают аффинности связывания. Такие изменения могут быть, например, вне контактирующих с антигеном остатков в HVR. В некоторых воплощениях предложенных выше последовательностей вариантов VH и VL каждый HVR либо не изменен, либо содержит не более одной аминокислотной замены, двух или трех аминокислотных замен.

Полезный метод идентификации остатков или участков антитела, которые могут быть мишенью для мутагенеза, называется “аланин-сканирующим мутагенезом”, описанным в Cunningham B.C. and Wells J.A., Science, 244 (1989) 1081-1085. В этом методе идентифицируют остаток или группу целевых остатков (например, заряженных остатков, таких как остатки arg, asp, his, lys и glu) и заменяют на остатки нейтральной или отрицательно заряженной аминокислоты (например, аланина или полиаланина), чтобы определить, повлияет ли это на взаимодействие антитела с антигеном. В положениях аминокислот, демонстрирующих функциональную чувствительность к первоначальным заменам, могут быть выполнены дальнейшие замены. Альтернативно или помимо этого, для идентификации точек контакта между антителом и антигеном можно использовать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело. Такие контактирующие остатки и соседние с ними остатки могут быть выявлены или устранены как кандидаты на замену. Варианты можно подвергнуть скринингу, чтобы определить, имеют ли они желаемые свойства.

Вставки в аминокислотную последовательность включают присоединяемые к амино- и/или карбоксильному концу вставки длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутрь последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие варианты молекулы антитела со вставками включают слитую конструкцию, в которой N- или C-конец антитела соединен с ферментом (например, для антитело-опосредованной терапии с использованием ферментов и пролекарств (ADEPT)) или полипептидом, что увеличивает полупериод существования антитела в сыворотке крови.

b) Варианты гликозилирования

В некоторых воплощениях антитело, предложенное согласно данному изобретению, изменяют с целью увеличения или уменьшения степени гликозилирования антитела. Добавление или удаление сайтов гликозилирования антитела можно подходящим образом осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы создавался или удалялся один или более чем один сайт гликозилирования.

В тех случаях, когда антитело содержит Fc-область, присоединенный к ней углевод может быть изменен. Нативные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, обычно содержат разветвленный, биантенный олигосахарид, как правило, присоединенный посредством N-гликозидной связи к Asn297 CH2-домена Fc-области. См., например, Wright A. and Morrison S.L., TIBTECH, 15 (1997) 26-32. Олигосахарид может включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в “стволе” биантенной структуры олигосахарида. В некоторых воплощениях могут быть выполнены модификации олигосахарида в антителе по изобретению с целью создания вариантов антитела с определенными улучшенными свойствами.

В одном из воплощений предложены варианты антитела, содержащие углеводную структуру с недостаточным числом остатков фукозы, присоединенных (непосредственно или опосредованно) к Fc-области. Например, количество остатков фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество остатков фукозы определяют, подсчитывая среднее количество остатков фукозы в углеводной цепи при Asn297 относительно общего количества всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексных, гибридных и высокоманнозных структур) по результатам измерений с использованием время-пролетной масс-спектрометрии с ионизацией посредством лазерной десорбции ионов из матрицы (MALDI-TOF масс-спектрометрии), как описано, например в WO 2008/077546. Asn297 относится к остатку аспарагина, локализованному примерно в положении 297 в Fc-области (нумерация остатков Fc-области соответствует EU-индексу); однако, Asn297 также может быть локализован на расстоянии примерно ± 3 аминокислоты вверх по течению или вниз по течению относительно положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, вследствие незначительных вариаций последовательности антител. Такие фукозилированные варианты могут иметь улучшенную ADCC-функцию. См., например, US 2003/0157108, US 2004/0093621. Примеры публикаций, касающихся “дефукозилированных” или “дефицитных по фукозе” вариантов антител, включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki A. et al., J. Mol. Biol., 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki N. et al., Biotech. Bioeng., 87 (2004) 614-622. Примеры клеточных линий, способных продуцировать дефукозилированные антитела, включают клетки CHO линии Lec13, дефицитные по фукозилированию белка (Ripka J., et al., Arch. Biochem. Biophys., 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108 и WO 2004/056312, в частности, пример 11), и нокаутные клеточные линии, как например, клетки CHO, нокаутные по гену альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki N., et al., Biotech. Bioeng., 87 (2004) 614-622; Kanda Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94 (2006) 680-688 и WO 2003/085107).

Также предложены варианты антител с раздвоенными олигосахаридами, например, в которых биантенный олигосахарид, присоединенный к Fc-области антитела, имеет точки ветвления при GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь более низкую степень фукозилирования и/или улучшенную ADCC-функцию. Примеры таких вариантов антитела описаны, например, в WO 2003/011878, US 6602684 и US 2005/0123546. Также предложены варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc-области. Такие варианты антител могут иметь улучшенную CDC-функцию. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087, WO 1998/58964 и WO 1999/22764.

c) Варианты Fc-области

В некоторых воплощениях в гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, может быть введена одна или более чем одна аминокислотная модификация с получением тем самым варианта Fc-области. Вариант Fc-области может происходить из последовательности Fc-области антитела человека (например, Fc-области IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащей аминокислотную модификацию (например, замену/мутацию) в одном или более положениях аминокислот.

В некоторых воплощениях изобретения предусматривается гетеродимерный полипептид, обладающий некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, делающими его желаемым кандидатом для практических применений, при которых полупериод существования гетеродимерного полипептида in vivo является важным, в то время как некоторые эффекторные функции (такие как CDC и ADCC) не являются необходимыми или являются вредными. Для подтверждения снижения/истощения CDC- и/или ADCC-активностей можно провести анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo. Например, можно провести анализы связывания с Fc-рецепторами (FcR), чтобы убедиться, что у данного гетеродимерного полипептида антитела отсутствует способность связываться с FcγR (поэтому, вероятнее всего, у него отсутствует ADCC-активность), но сохраняется способность связываться с FcRn. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки (природные киллерные клетки), экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные по экспрессии FcR на гематопоэтических клетках суммированы в Таблице 3 на странице 464 в Ravetch J.V. and Kinet J.P., Annu. Rev. Immunol., 9 (1991) 457-492. Неограничивающие примеры анализов in vitro для оценки ADCC-активности молекулы, представляющей интерес, описаны в US 5500362 (см., например, Hellstrom I. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 83 (1986) 7059-7063, и Hellstrom I. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82 (1985) 1499-1502); US 5821337 (см. Bruggemann M. et al., J. Exp. Med., 166 (1987) 1351-1361). Альтернативно, можно применять нерадиоактивные методы анализа (см., например, анализ цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии без использования радиоактивности (CellTechnology, Inc., Mountain View, CA) и анализ цитотоксичности CytoTox 96^® без использования радиоактивности (Promega, Madison, WI)). Полезные для таких анализов эффекторные клетки включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и природные киллерные (NK) клетки. Альтернативно или помимо этого, ADCC-активность молекулы, представляющей интерес, можно оценить in vivo, например, в животной модели, такой как описанная в Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 95 (1998) 652-656. Также можно провести анализы связывания с C1q для подтверждения того, что димерный полипептид не обладает способностью связываться с C1q и, следовательно, не имеет CDC-активности. См., например, данные иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA) для связывания с C1q и C3c в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно провести анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro H. et al., J. Immunol. Methods, 202 (1996) 163-171; Cragg M.S. et al., Blood, 101 (2003) 1045-1052; и Cragg M.S. and M.J. Glennie, Blood, 103 (2004) 2738-2743). Определения связывания с FcRn и клиренса/полупериода существования in vivo также могут быть выполнены с использованием методов, известных в данной области техники (см., например, Petkova S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).

Гетеродимерные полипептиды с пониженной эффекторной функцией включают таковые с заменой одного или более остатков в Fc-области в положениях 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (US 6737056). Такие варианты Fc-области включают Fc-области с заменами аминокислот в двух или более положениях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант Fc-области “DANA” с заменой остатков 265 и 297 на аланин (US 7332581).

Описаны некоторые варианты антител с улучшенным или ослабленным связыванием с FcR (см., например, US 6737056, WO 2004/056312 и Shields R.L. et al., J. Biol. Chem., 276 (2001) 6591-6604).

В некоторых воплощениях вариант гетеродимерного полипептида содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, которые улучшают ADCC, например, заменами в положениях 298, 333 и/или 334 в Fc-области (нумерация остатков соответствует EU-индексу).

В некоторых воплощениях в Fc-области выполнены изменения, которые приводят к изменению (т.е. или к улучшению, или к ослаблению) связывания с C1q и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в US 6194551, WO 99/51642 и в Idusogie E.E. et al., J. Immunol., 164 (2000) 4178-4184.

Антитела с увеличенными полупериодами существования и улучшенным связыванием с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG к плоду (Guyer R.L. et al., J. Immunol., 117 (1976) 587-593; и Kim J.K. et al., J. Immunol., 24 (1994) 2429-2434), описаны в US 2005/0014934. Эти антитела содержат Fc-область с одной или более заменами в ней, которые улучшают связывание Fc-области с FcRn. Такие варианты Fc-области включают варианты с заменами одного или более остатков Fc-области в положениях: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, с заменой остатка 434 Fc-области (US 7371826).

Относительно других примеров вариантов Fc-области также см. Duncan A.R. and Winter G., Nature, 322 (1988) 738-740, US 5648260, US 5624821 и WO 94/29351.

d) Варианты антител, сконструированных с цистеином

В некоторых воплощениях может быть желательно создать сконструированные с цистеином гетеродимерные полипептиды, например, по аналогии с “тиоMAb”, в которых один или более остатков аминокислот в антителе заменены на остатки цистеина. В конкретных воплощениях заменяемые остатки находятся в доступных сайтах гетеродимерного полипептида. В результате замены этих остатков на цистеин реакционно-способные тиоловые группы будут тем самым располагаться в доступных сайтах гетеродимерного полипептида и могут быть использованы для конъюгирования гетеродимерного полипептида с другими группировками, такими как группировки лекарственного средства или группировки соединенного с линкером лекарственного средства, с целью создания иммуноконъюгата, как описано далее в данной заявке. В некоторых воплощениях могут быть заменены на цистеин какой-либо один или более из следующих остатков: V205 (нумерация по Kabat) в легкой цепи; A118 (нумерация согласно EU) в тяжелой цепи и S400 (нумерация согласно EU) в Fc-области тяжелой цепи. Сконструированные с цистеином димерные полипептиды могут быть созданы так, как описано, например, в US 7521541.

e) Производные

В некоторых воплощениях гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, может быть дополнительно модифицирован с тем, чтобы он содержал дополнительные небелковые группировки, которые известны в данной области техники и легко доступны. Группировки, подходящие для получения производных гетеродимерного полипептида, включают, но не ограничиваются этим, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но не ограничиваются этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (или гомополимеры, или статистические сополимеры), поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), и их смеси. Полиэтиленгликоль-пропиональдегид может иметь преимущества при получении ввиду его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к димерному полипептиду, может варьировать и, если присоединено более одного полимера, они могут представлять собой одинаковые или разные молекулы. В общем случае число и/или тип полимеров, используемых для получения производных, можно определить исходя из соображений, включающих, но не ограничивающихся этим, конкретные свойства или функции димерного полипептида, подлежащие улучшению, а также будет ли производное димерного полипептида использоваться в терапии определенных состояний и т.д.

В другом воплощении предложены конъюгаты гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, и небелковой группировки, которая может избирательно нагреваться под действием излучения. В одном из воплощений небелковая группировка представляет собой углеродную нанотрубку (Kam N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 (2005) 11600-11605). Излучение может иметь любую длину волны и включает, но не ограничивается этим, длины волн, которые не вредят обычным клеткам, но которые нагревают небелковую группировку до температуры, при которой клетки, расположенные в непосредственной близости от конъюгата димерного полипептида и небелковой группировки, погибают.

f) Гетеродимеризация

Имеется несколько подходов к CH3-модификациям для должного обеспечения гетеродимеризации, которые хорошо описаны, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Обычно во всех таких подходах первый CH3-домен и второй CH3-домен оба сконструированы по комплементарному типу с тем, чтобы каждый CH3-домен (или каждая содержащая его тяжелая цепь) больше не могли гомодимеризоваться сами с собой, а инициировали гетеродимеризацию с комплементарно сконструированным другим CH3-доменом (для того, чтобы первый и второй CH3-домен гетеродимеризовались, и никаких гомодимеров между двумя первыми или двумя вторыми CH3-доменами не образовывалось). Применение этих разных подходов с целью улучшения гетеродимеризации тяжелых цепей в мультиспецифичных антителах по изобретению предусматривается в виде разных альтернативных вариантов в комбинации с модификациями тяжелой-легкой цепи (обмен/замена в VH и VL в одном связывающемся плече и внесение в качестве замен заряженных аминокислот с противоположными зарядами в поверхность контакта CH1/CL), что снижает вероятность ненадлежащего образования пар легких цепей как побочных продуктов типа белка Бенс-Джонса.

В одном из предпочтительных воплощений изобретения (в случае, если мультиспецифичное антитело содержит CH3-домены в тяжелых цепях) CH3-домены указанного гетеродимерного полипептида по изобретению могут быть изменены с использованием технологии “выступ-во-впадину”, которая описана подробно на нескольких примерах, например, в WO 96/027011, Ridgway J.B., et al., Protein Eng., 9 (1996) 617-621; и Merchant A.M., et al., Nat. Biotechnol., 16 (1998) 677-681; WO 98/050431. В этом методе взаимодействующие поверхности двух CH3-доменов изменяют с целью усиления гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих эти два CH3-домена. Каждый из двух CH3-доменов (двух тяжелых цепей) может представлять собой “выступ”, в то время как другой представляет собой “впадину”. Кроме того, введение дисульфидного мостика стабилизирует гетеродимеры (Merchant A.M, et al., Nature Biotech., 16 (1998) 677-681, Atwell S., et al. J. Mol. Biol., 270 (1997) 26-35) и повышает выход.

Так, в одном из воплощений изобретения указанный гетеродимерный полипептид (содержит CH3-домен в каждой тяжелой цепи и) дополнительно характеризуется тем, что:

первый CH3-домен первой тяжелой цепи антитела по пункту (a) и второй CH3-домен второй тяжелой цепи антитела по пункту (b) оба встречаются на поверхности контакта, которая представляет собой исходную поверхность контакта между CH3-доменами антитела,

причем указанная поверхность контакта изменена, чтобы стимулировать образование мультиспецифичного антитела, при этом данное изменение характеризуется тем, что:

1) CH3-домен одной тяжелой цепи изменен

так, что в исходной поверхности контакта CH3-домена одной тяжелой цепи, которая встречается c исходной поверхностью контакта CH3-домена другой тяжелой цепи в мультиспецифичном антителе,

аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь большего объема, тем самым создавая выступающую часть в поверхности контакта CH3-домена одной тяжелой цепи, которая располагается в полости поверхности контакта CH3-домена другой тяжелой цепи,

2) CH3-домен другой тяжелой цепи изменен

так, что в исходной поверхности контакта второго CH3-домена, которая встречается c исходной поверхностью контакта первого CH3-домена в мультиспецифичном антителе,

аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь меньшего объема, тем самым создавая выступающую часть в поверхности контакта второго CH3-домена, которая располагается в полости поверхности контакта первого CH3-домена.

Предпочтительно, чтобы указанный аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь большего объема, был выбран из группы, состоящей из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y), триптофана (W).

Предпочтительно, чтобы указанный аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь меньшего объема, был выбран из группы, состоящей из аланина (A), серина (S), треонина (T), валина (V).

Согласно одному из аспектов изобретения оба CH3-домена дополнительно изменены посредством введения остатка аминокислоты цистеин (C) в соответствующие положения каждого CH3-домена для того, чтобы мог образовываться дисульфидный мостик между обоими CH3-доменами.

В одном из предпочтительных воплощений изобретения указанный гетеродимерный полипептид содержит аминокислотную мутацию T366W в первом CH3-домене “цепи, формирующей выступ” и аминокислотные мутации T366S, L368A, Y407V во втором CH3-домене “цепи, формирующей впадину”. Также можно использовать дополнительный межцепочечный дисульфидный мостик между CH3-доменами (Merchant A.M., et al., Nature Biotech., 16 (1998) 677-681), например, путем внесения аминокислотной мутации Y349C в CH3-домен “цепи, формирующей впадину” и аминокислотной мутации E356C или аминокислотной мутации S354C в CH3-домен “цепи, формирующей выступы”.

В одном из предпочтительных воплощений указанный гетеродимерный полипептид (который содержит CH3-домен в каждой тяжелой цепи) содержит аминокислотные мутации S354C, T366W в одном из двух CH3-доменов и аминокислотные мутации Y349C, T366S, L368A, Y407V в другом из двух CH3-доменов (дополнительную аминокислотную мутацию S354C в одном CH3-домене и дополнительную аминокислотную мутацию Y349C в другом CH3-домене, формирующие межцепочечный дисульфидный мостик) (нумерация согласно Kabat).

Другие способы CH3-модификаций для усиления гетеродимеризации включены в качестве альтернативных вариантов изобретения и описаны, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

В одном из воплощений, альтернативно, можно использовать связанный с гетеродимеризацией подход, описанный в EP 1870459 A1. Этот подход основан на внесении замен/мутаций заряженных аминокислот с противоположным зарядом в конкретные аминокислотные положения на поверхности контакта CH3/CH3-доменов между обеими тяжелыми цепями. Одно из предпочтительных воплощений для указанного гетеродимерного полипептида относится к аминокислотным мутациям R409D, K370E в первом CH3-домене мультиспецифичного антитела и аминокислотным мутациям D399K, E357K во втором CH3-домене мультиспецифичного антитела (нумерация согласно Kabat).

В другом воплощении указанный гетеродимерный полипептид содержит аминокислотную мутацию T366W в CH3-домене “цепи, формирующей выступы” и аминокислотные мутации T366S, L368A, Y407V в CH3-домене “цепи, формирующей впадину” и помимо этого аминокислотные мутации R409D, K370E в CH3-домене “цепи, формирующей выступы” и аминокислотные мутации D399K, E357K в CH3-домене “цепи, формирующей впадину”.

В другом воплощении указанный гетеродимерный полипептид содержит аминокислотные мутации S354C, T366W в одном из двух CH3-доменов и аминокислотные мутации Y349C, T366S, L368A, Y407V в другом из двух CH3-доменов или указанное мультиспецифичное антитело содержит аминокислотные мутации Y349C, T366W в одном из двух CH3-доменов и аминокислотные мутации S354C, T366S, L368A, Y407V в другом из двух CH3-доменов и помимо этого аминокислотные мутации R409D, K370E в CH3-домене “цепи, формирующей выступы” и аминокислотные мутации D399K, E357K в CH3-домене “цепи, формирующей впадину”.

В одном из воплощений, альтернативно, можно использовать подход с применением гетеродимеризации, описанный в WO 2013/157953. В одном из воплощений первый CH3-домен содержит аминокислотную мутацию T366K, а полипептид второго CH3-домена содержит аминокислотную мутацию L351D. В следующем воплощении первый CH3-домен содержит другую аминокислотную мутацию L351K. В следующем воплощении второй CH3-домен содержит другую аминокислотную мутацию, выбранную из Y349E, Y349D и L368E (предпочтительно L368E).

В одном из воплощений, альтернативно, можно использовать подход с применением гетеродимеризации, описанный в WO 2012/058768. В одном из воплощений первый CH3-домен содержит аминокислотные мутации L351Y, Y407A, а второй CH3-домен содержит аминокислотные мутации T366A, K409F. В следующем воплощении второй CH3-домен содержит другую аминокислотную мутацию в положении T411, D399, S400, F405, N390 или K392, например, выбранную из a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E или T411W, b) D399R, D399W, D399Y или D399K, c) S400E, S400D, S400R или S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V или F405W, e) N390R, N390K или N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F или K392E. В следующем воплощении первый CH3-домен содержит аминокислотные мутации L351Y, Y407A, а второй CH3-домен содержит аминокислотные мутации T366V, K409F. В следующем воплощении первый CH3-домен содержит аминокислотную мутацию Y407A, а второй CH3-домен содержит аминокислотные мутации T366A, K409F. В следующем воплощении второй CH3-домен содержит другие аминокислотные мутации K392E, T411E, D399R и S400R.

В одном из воплощений, альтернативно, можно использовать подход с применением гетеродимеризации, описанный в WO 2011/143545, например, проводя модификацию аминокислот в положении, выбранном из группы, состоящей из положений 368 и 409.

В одном из воплощений, альтернативно, можно использовать подход с применением гетеродимеризации, описанный в WO 2011/090762, где также используется изложенная выше технология “выступы-во-впадины”. В одном из воплощений первый CH3-домен содержит аминокислотную мутацию T366W, а второй CH3-домен содержит аминокислотную мутацию Y407A. В одном из воплощений первый CH3-домен содержит аминокислотную мутацию T366Y, а второй CH3-домен содержит аминокислотную мутацию Y407T.

В одном из воплощений мультиспецифичное антитело происходит из изотипа IgG2, и, альтернативно, можно использовать подход с применением гетеродимеризации, описанный в WO 2010/129304.

В одном из воплощений, альтернативно, можно использовать подход с применением гетеродимеризации, описанный в WO 2009/089004. В одном из воплощений первый CH3-домен содержит замену аминокислоты K392 или N392 на отрицательно заряженную аминокислоту (например, на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D), предпочтительно замену K392D или N392D), а второй CH3-домен содержит замену аминокислоты D399, E356, D356 или E357 на положительно заряженную аминокислоту (например, на лизин (K) или аргинин (R), предпочтительно замену D399K, E356K, D356K или E357K и более предпочтительно D399K и E356K. В следующем воплощении первый CH3-домен дополнительно содержит замену аминокислоты K409 или R409 на отрицательно заряженную аминокислоту (например, на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D), предпочтительно замену K409D или R409D). В следующем воплощении первый CH3-домен дополнительно или альтернативно содержит замену аминокислоты K439 и/или K370 на отрицательно заряженную аминокислоту (например, на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D)).

В одном из воплощений, альтернативно, можно использовать подход с применением гетеродимеризации, описанный в WO 2007/147901. В одном из воплощений первый CH3-домен содержит аминокислотные мутации K253E, D282K и K322D, а второй CH3-домен содержит аминокислотные мутации D239K, E240K и K292D.

В одном из воплощений, альтернативно, можно использовать подход с применением гетеродимеризации, описанный в WO 2007/110205.

E. Рекомбинантные методы и технологии изготовления препаратов

Антитела могут быть получены с использованием рекомбинантных методов и технологий изготовления препаратов, например, как описано в US 4816567. В одном из воплощений предложена(ы) выделенная(ые) нуклеиновая(ые) кислота(ы), кодирующая(ие) гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую последовательность первого полипептида, и/или аминокислотную последовательность, содержащую последовательность второго полипептида гетеродимерного полипептида. В следующем воплощении предложены один или более векторов (например, экспрессирующих векторов), содержащих такую нуклеиновую кислоту. В следующем воплощении предложена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном из таких воплощений клетка-хозяин содержит (например, трансфицирована нижеперечисленным): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую первый полипептид гетеродимерного полипептида, и аминокислотную последовательность, содержащую второй полипептид гетеродимерного полипептида, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую первый полипептид гетеродимерного полипептида, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую второй полипептид гетеродимерного полипептида. В одном из воплощений клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например клетку яичников китайского хомячка (CHO) или лимфоидную клетку (например, клетку Y0, NS0, Sp20). В одном из воплощений предложен способ получения гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, включающий культивирование клетки хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую гетеродимерный полипептид, предложенный выше, в условиях, подходящих для экспрессии данного гетеродимерного полипептида, и возможно извлечение антитела из клетки хозяина (или среды культивирования клетки хозяина).

Чтобы получить рекомбинантными методами гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, нуклеиновую кислоту, кодирующую гетеродимерный полипептид, например, который описан выше, выделяют и встраивают в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке хозяина. Такую нуклеиновую кислоту можно легко выделить и секвенировать, используя традиционные методики (например, используя олигонуклеотидные зонды, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими полипептид(ы) вариантной Fc-области или тяжелую и легкую цепи антитела).

Клетки хозяина, подходящие для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих гетеродимерные полипептиды, включают прокариотические или эукариотические клетки, описанные в данной заявке. Например, гетеродимерные полипептиды могут продуцироваться бактериями, в частности, когда нет необходимости в гликозилировании и Fc-эффекторной функции. Для экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях см., например, US 5648237, US 5789199 и US 5840523 (см. также Charlton K.A. в Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, где описывается экспрессия фрагментов антител в E. coli). После экспрессии гетеродимерный полипептид можно выделять из бактериальной клеточной массы в растворимой фракции и можно очищать далее.

Помимо прокариотов подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих гетеродимерные полипептиды, являются эукариотические микроорганизмы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования в которых “гуманизированы”, что приводит к получению гетеродимерного полипептида, частично или полностью воспроизводящего картину гликозилирования у человека. См. Gerngross T.U., Nat. Biotech., 22 (2004), 1409-1414 и Li H. et al., Nat. Biotech., 24 (2006), 210-215.

Кроме того, подходящие клетки хозяина для экспрессии гликозилированного гетеродимерного полипептида происходят из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, которые могут быть использованы вместе с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

В качестве хозяев также можно использовать культуры растительных клеток. См., например, US 5959177, US 6040498, US 6420548, US 7125978 и US 6417429 (описывающие технологию PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях).

В качестве хозяев также можно использовать клетки позвоночных. Например, могут быть полезны линии клеток млекопитающих, адаптированные к росту в суспензии. Другими примерами полезных в качестве хозяев линий клеток млекопитающих являются линия клеток CV1 почки обезьяны, трансфицированная SV40 (обезьяний вирус 40) (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (клетки HEK293 или 293, которые описаны, например, в Graham F.L. et al., J. Gen. Virol., 36 (1977) 59-74); клетки почки новорожденного хомячка (BHK); клетки Сертоли у мышей (клетки TM4, которые описаны, например, в Mather J.P., Biol. Reprod., 23 (1980) 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени крысы линии Buffalo (BRL 3A); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мышей (MMT 060562); клетки TRI, которые описаны, например, в Mather J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383 (1982) 44-68; клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие полезные линии клеток млекопитающих в качестве клеток хозяина включают клетки яичников китайского хомячка (CHO), в том числе DHFR^- (дефицитные по дигидрофолатредуктазе) клетки CHO (Urlaub G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (1980) 4216-4220), и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток млекопитающих в качестве клеток хозяина, подходящих для получения антител, см., например, в Yazaki P. and Wu A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.

F. Комбинированное лечение

В некоторых воплощениях гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, или фармацевтическую композицию, описанную в данной заявке, вводят как таковые (без дополнительного терапевтического агента) для лечения одного или нескольких сосудистых заболеваний глаз, изложенных в данном описании.

В других воплощениях гетеродимерный полипептид антитела или фармацевтическую композицию, описанную в данной заявке, применяют в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами или способами лечения одного или нескольких сосудистых заболеваний глаз, изложенных в данном описании.

В других воплощениях на основе гетеродимерного полипептида или фармацевтической композиции, описанной в данной заявке, изготавливают комбинацию с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами и вводят для лечения одного или нескольких сосудистых заболеваний глаз, изложенных в данном описании.

В некоторых воплощениях способы комбинированного лечения, предложенные в данном изобретении, заключаются в том, что гетеродимерный полипептид или фармацевтическую композицию, описанную в данной заявке, вводят последовательно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами для лечения одного или нескольких сосудистых заболеваний глаз, изложенных в данном описании.

Дополнительные терапевтические агенты включают, но не ограничиваются этим, триптофанил-тРНК-синтетазу (TrpRS), Eye001 (ПЭГилированный аптамер против сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF)), скваламин, RETAANE(™) (анекортава ацетат для депо-препарата в виде суспензии; Alcon, Inc.), пролекарственную форму комбретастатина A4 (CA4P), MACUGEN(™), MIFEPREX(™) (мифепристон-ru486), субтенона триамцинолона ацетонид, кристаллический триамцинолона ацетонид для интравитреального введения, приномастат (AG3340 - синтетический ингибитор матриксных металлопротеиназ, Pfizer), флуоцинолона ацетонид (в том числе интраокулярный имплантат на основе флуоцинолона, Bausch & Lomb/Control Delivery Systems), ингибиторы рецептора VEGF (VEGFR) (Sugen), VEGF-Trap (Regeneron/Aventis), ингибиторы рецепторной тирозинкиназы VEGF, такие как 4-(4-бром-2-фторанилино)-6-метокси-7-(1-метилпиперидин-4-илметокси)хиназолин (ZD6474), 4-(4-фтор-2-метилиндол-5-илокси)-6-метокси-7-(3-пирролидин-1-илпропокси)хиназолин (AZD2171), ваталаниб (PTK787) и SU1 1248 (сунитиниб), линомид и ингибиторы функции интегрина v.бета.3 и ангиостатин.

Другие фармацевтические терапии, которые можно использовать в комбинации с гетеродимерным полипептидом или фармацевтической композицией, описанной в данной заявке, включают, но не ограничиваются этим, VISUDYNE(™) совместно с применением атермического лазера, PKC 412, эндовион (endovion) (NeuroSearch A/S), нейротрофические факторы, в том числе в качестве примера глиальный нейротрофический фактор и цилиарный нейротрофический фактор, диатазем (diatazem), дорзоламид, фототроп (phototrop), 9-цис-ретиналь, лекарственную терапию глаз (в том числе Echo-терапию), включая фосфолина иодид или эхотиофат либо ингибиторы карбоангидразы, AE-941 (AEterna Laboratories, Inc.), Sirna-027 (Sirna Therapeutics, Inc.), пегаптаниб (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), нейротрофины (включая, только в качестве примера, NT-4/5, Genentech), Cand5 (Acuity Pharmaceuticals), INS-37217 (Inspire Pharmaceuticals), антагонисты интегринов (включая таковые от Jerini AG и Abbott Laboratories), EG-3306 (Ark Therapeutics Ltd.), BDM-E (BioDiem Ltd.), талидомид (который используется, например, в EntreMed, Inc.), кардиотрофин-1 (Genentech), 2-метоксиэстрадиол (Allergan/Oculex), DL-8234 (Toray Industries), NTC-200 (Neurotech), тетратиомолибдат (University of Michigan), LYN-002 (Lynkeus Biotech), соединение из микроводорослей (Aquasearch/Albany, MerPharmaceuticals), D-9120 (Celltech Group plc.), ATX-S10 (Hamamatsu Photonics), трансформирующий ростовой фактор(TGF)-бета 2 (Genzyme/Celtrix), ингибиторы тирозинкиназ (Allergan, SUGEN, Pfizer), NX-278-L (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), Opt-24 (OPTIS France SA), нейропротекторы ганглиозных клеток сетчатки (Cogent Neurosciences), производные N-нитропиразола (Texas A&M University System), KP-102 (Krenitsky Pharmaceuticals), циклоспорин A, своевременную пересадку сетчатки, фотодинамическую терапию (PDT) (в том числе, только в качестве примера, рецептор-направленную PDT, Bristol-Myers Squibb, Co.; порфимер натрия для инъекций с PDT; вертепорфин, QLT Inc.; ростапорфин с PDT, Miravent Medical Technologies; талапорфин натрия с PDT, Nippon Petroleum; мотексафин лютеция, Pharmacyclics, Inc.), антисмысловые олигонуклеотиды (в том числе, только в качестве примера, продукты, протестированные Novagali Pharma SA и ISIS-13650, Isis Pharmaceuticals), лазерную фотокоагуляцию, лазерное лечение друз, хирургическую операцию по поводу макулярных разрывов сетчатки, хирургическую операцию по поводу транслокации макулы, применение миниатюрных вживляемых телескопов, Phi-Motion ангиографию (также известную как микролазерная терапия и лечение питающих сосудов), протонную терапию, микростимулирующую терапию, витреоретинальную хирургию отслойки сетчатки, операцию пломбирования склеры, субмакулярную хирургию, транспупиллярную термотерапию, терапию с использованием фотосистемы I, применение РНК-интерференции (РНКи), экстракорпоральный реоферез (также известный как мембранная дифференциальная фильтрация и реотерапия), имплантацию микрочипов, терапию с использованием стволовых клеток, генно-заместительную терапию, генную терапию с использованием рибозимов (включая генную терапию для восприимчивого к гипоксии элемента, Oxford Biomedica; применение системы Lentipak, Genetix; генную терапию с использованием PDEF (ETS-фактор предстательной железы), GenVec), трансплантацию фоторецепторных клеток/клеток сетчатки (включая трансплантируемые эпителиальные клетки сетчатки, Diacrin, Inc.; трансплантат клеток сетчатки, Cell Genesys, Inc.) и иглоукалывание.

В комбинации с гетеродимерным полипептидом или фармацевтической композицией, описанной в данной заявке, можно использовать любой антиангиогенный агент, включая, но не ограничиваясь этим, агенты, приведенные в Carmeliet and Jain, Nature, 407 (2000) 249-257. В некоторых воплощениях антиангиогенный агент представляет собой другой антагонист VEGF или антагонист рецептора VEGF, такой как варианты VEGF, растворимые фрагменты рецептора VEGF, аптамеры, способные блокировать VEGF или VEGFR, нейтрализующие антитела к VEGFR, низкомолекулярные ингибиторы VEGFR-тирозинкиназ и любые их комбинации, и они включают аптамеры к VEGF (например, пегаптаниб), растворимые рекомбинантные рецепторы-ловушки (например, VEGF Trap). В некоторых воплощениях антиангиогенный агент включает кортикостероиды, ангиостатические стероиды, анекортава ацетат, ангиостатин, эндостатин, малые интерферирующие РНК, ослабляющие экспрессию VEGFR или лиганда VEGF, ингибиторы тирозинкиназ для пост-VEGFR блокирования, ингибиторы матриксных металлопротеаз (MMP), белок 3, связывающий инсулиноподобный фактор роста (IGFBP3), блокаторы фактора-1 стромальных клеток (SDF-1), фактор пигментного эпителия (PEDF), гамма-секретазу, дельта-подобный лиганд 4, антагонисты интегринов, блокаторы гипоксия-индуцибельного фактора 1-альфа (HIF-1), блокаторы протеинкиназы CK2 (казеинкиназы II) и ингибиторы хоуминга стволовых клеток (т.е. эндотелиальных клеток-предшественников) в сайт неоваскуляризации с использованием антител к кадгерину (CD-144) сосудистого эндотелия и фактору стромальных клеток (SDF)-I. Также можно использовать низкомолекулярные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ (RTK), нацеленные на рецепторы VEGF, включая PTK787. Также можно использовать агенты, обладающие активностью в отношении подавления неоваскуляризации, которые не обязательно являются соединениями, направленными против VEGF, и они включают противовоспалительные лекарственные средства, ингибиторы мишени рапамицина у млекопитающих (m-Tor), рапамицин, эверолимус, темсиролимус, циклоспорин, агенты, направленные против фактора некроза опухоли (TNF), агенты, направленные против системы комплемента, и нестероидные противовоспалительные агенты. Также можно использовать агенты, которые оказывают нейропротекторное действие и потенциально способны ослаблять прогрессирование сухой макулярной дегенерации, такие как агенты класса лекарственных средств, называемых “нейростероидами”. Они включают такие лекарственные средства, как дегидроэпиандростерон (DHEA) (торговые марки: Prastera^(R) и Fidelin^(R)), дегидроэпиандростерона сульфат и прегненолона сульфат. В комбинации с димерным полипептидом или фармацевтической композицией, описанными в данной заявке, можно использовать любой терапевтический агент против AMD (возрастной макулярной дегенерации), включая, но не ограничиваясь этим, вертепорфин в комбинации с PDT, пегаптаниб натрия, цинк или антиоксидант(ы), по отдельности или в любой комбинации.

G. Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции на основе гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, готовят путем смешивания такого гетеродимерного полипептида, имеющего желаемую степень чистоты, с одним или более чем одним возможным фармацевтически приемлемым носителем (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают, но не ограничиваются этим: буферы, например, на основе фосфата, цитрата и других органических кислот; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензилхлорид аммония; гексаметонийхлорид; бензалконийхлорид; бензетонийхлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поли(винилпирролидон); аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как ион натрия; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Типичные фармацевтически приемлемые носители, упомянутые в данном описании, также включают агенты диспергирования лекарственных средств в интерстициальном пространстве (interstitial drug dispersion agents), такие как активные растворимые в нейтральных условиях гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы PH-20 человека, такие как рекомбинантная гиалуронидаза человека PH-20 (rHuPH20) (HYLENEX^®, Baxter International, Inc.). Некоторые типичные sHASEGP и способы их применения, включая rHuPH20, описаны в US 2005/0260186 и US 2006/0104968. Согласно одному из аспектов sHASEGP комбинируют с одной или более чем одной дополнительной гликозаминогликаназой, такой как хондроитиназа.

Типичные лиофилизированные композиции на основе антител описаны в US 6267958. Водные композиции на основе антител включают композиции, описанные в US 6171586 и WO 2006/044908, причем последние композиции включают в себя гистидин-ацетатный буфер.

Композиция, описанная в данной заявке, также может содержать более одного из активных ингредиентов, которые необходимы для конкретного подвергаемого лечению показания, предпочтительно, ингредиентов с дополняющими активностями, которые не оказывают неблагоприятного действия друг на друга. Такие активные ингредиенты соответственно представлены в комбинации в количествах, которые эффективны для предполаемой цели.

Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, приготовленные, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, например, в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и микрокапсулы из поли(метилметакрилата), соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980).

Можно изготовить препараты с длительным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с длительным высвобождением включают полупроницаемые формы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, которые представлены в форме штампованных изделий, например, пленок или микрокапсул.

Композиции, предназначенные для введения in vivo, как правило, должны быть стерильными. Стерильности легко добиться, например, с помощью фильтрования через стерилизующие фильтрационные мембраны.

H. Способы терапии и композиции

Любой гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, можно использовать в способах терапии.

Согласно одному из аспектов предложен гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, для применения в качестве лекарственного средства. Согласно другим аспектам предложен гетеродимерный полипептид для применения в лечении сосудистых заболеваний глаз. В некоторых воплощениях предложен гетеродимерный полипептид для применения в способе лечения индивидуума, имеющего сосудистое заболевание глаз, включающем введение данному индивидууму эффективного количества гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке. В одном из таких воплощений способ дополнительно включает введение данному индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, описанного выше в разделе D. В других воплощениях изобретения предложен гетеродимерный полипептид для применения в ингибировании ангиогенеза в глазу. В некоторых воплощениях изобретения предложен гетеродимерный полипептид для применения в способе ингибирования ангиогенеза у индивидуума, включающем введение данному индивидууму эффективного количества гетеродимерного полипептида для ингибирования ангиогенеза. “Индивидуумом”, соответствующим любому из упомянутых выше воплощений, в одном из предпочтительных воплощений является человек.

Согласно следующему аспекту изобретения предложено применение гетеродимерного полипептида для изготовления или получения лекарственного средства. В одном из воплощений лекарственное средство предназначено для лечения сосудистого заболевания глаз. В следующем воплощении лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения сосудистого заболевания глаз, включающем введение индивидууму, имеющему сосудистое заболевание глаз, эффективного количества лекарственного средства. В одном из таких воплощений способ дополнительно включает введение данному индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, которое описано выше. В следующем воплощении лекарственное средство предназначено для ингибирования ангиогенеза. В следующем воплощении лекарственное средство предназначено для применения в способе ингибирования ангиогенеза у индивидуума, включающем введение данному индивидууму эффективного количества лекарственного средства для ингибирования ангиогенеза. “Индивидуумом”, соответствующим любому из упомянутых выше воплощений, может быть человек.

Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ лечения сосудистого заболевания глаз. В одном из воплощений способ включает введение индивидууму, имеющему сосудистое заболевание глаз, эффективного количества гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке. В одном из таких воплощений способ дополнительно включает введение данному индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, как описано ниже. “Индивидуумом”, соответствующим любому из вышеупомянутых воплощений, может быть человек.

Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ ингибирования ангиогенеза в глазу у индивидуума. В одном из воплощений способ включает введение данному индивидууму эффективного количества гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке, для ингибирования ангиогенеза. В одном из воплощений “индивидуумом” является человек.

Согласно следующему аспекту изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие любой из гетеродимерных полипептидов, описанных в данной заявке, например, для применения в любом из указанных выше способов терапии. В одном из воплощений фармацевтическая композиция содержит любой из гетеродимерных полипептидов, описанных в данной заявке, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом воплощении фармацевтическая композиция содержит любой из гетеродимерных полипептидов, описанных в данной заявке, и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, описанный ниже.

Гетеродимерные полипептиды, описанные в данной заявке, можно использовать либо по отдельности, либо в комбинации с другими агентами в терапии. Например, гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, может быть введен по меньшей мере вместе с одним дополнительным терапевтическим агентом.

Гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке, (и какой-либо дополнительный терапевтический агент) можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное введение, и, при необходимости местного лечения, введение в область поражения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, интраартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Введение может быть осуществлено любым подходящим путем, например посредством инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, зависимым в некоторой степени от того, является ли это введение кратковременным или продолжительным. Данным изобретением охвачены различные режимы введения, включая, но не ограничиваясь этим, однократные или многократные введения в разные моменты времени, струйное введение и прерывистую инфузию.

На основе гетеродимерных полипептидов, описанных в данной заявке, будут изготовлены лекарственные формы, которые могут быть разделены на дозы и введены способом, соответствующим надлежащей медицинской практике. Факторы, рассматриваемые в этом контексте, включают конкретное подвергаемое лечению расстройство, конкретное подвергаемое лечению млекопитающее, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные врачам. Необходимости в этом нет, но на основе такого гетеродимерного полипептида можно изготовить лекарственную форму, содержащую один или более агентов, используемых в настоящее время для предупреждения или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества гетеродимерного полипептида, присутствующего в композиции, типа расстройства или лечения и других факторов, рассмотренных выше. Они, как правило, используются в тех же дозировках и вводятся теми же путями, какие изложены в данном описании, или в количестве, составляющем примерно от 1 до 99% от дозировок, изложенных в данном описании, или в любой дозировке и любым путем, которые эмпирически/клинически определены как соответствующие.

Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая дозировка описанного в данной заявке гетеродимерного полипептида (при использовании по отдельности или в комбинации с одним или более чем одним другим дополнительным терапевтическим агентом) будет зависеть от типа подлежащего лечению заболевания, типа гетеродимерного полипептида, тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли гетеродимерный полипептид в профилактических или терапевтических целях, от предыдущей терапии, от клинической истории пациента и восприимчивости к гетеродимерному полипептиду и от усмотрения лечащего врача. Соответственно, гетеродимерный полипептид вводят пациенту за один раз или в ходе курса лечений. В зависимости от типа и тяжести заболевания первоначальной возможной дозировкой для введения пациенту может быть дозировка антитела, составляющая от примерно 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,5 мг/кг - 10 мг/кг), будь то выполнено, например, в виде одного или более отдельных введений, или в виде непрерывной инфузии. Одна из типичных суточных дозировок может находиться в диапазоне от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. При повторных введениях в течение нескольких суток или больше, в зависимости от состояния, лечение, как правило, будет продолжено до тех пор, пока не наступит желаемое подавление симптомов заболевания. Одна из типичных дозировок гетеродимерного полипептида может находиться в диапазоне от примерно 0,05 мг/кг до примерно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту можно вводить одну дозу или большее число доз, составляющих примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Такие дозы можно вводить периодически, например каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати доз или, например, приблизительно шесть доз гетеродимерного полипептида). Сначала можно вводить более высокую ударную дозу, затем одну или несколько более низких доз. Ход такого лечения легко отслеживать посредством традиционных методов и анализов.

III. Изделия производства

Согласно другому аспекту изобретения предложено изделие производства, содержащее материалы, полезные для лечения, предупреждения и/или диагностики описанных выше расстройств. Изделие производства содержит контейнер и этикетку или инструкцию по применению на контейнере или в соединении с ним. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, пакеты для внутривенных (в./в.) растворов и т.д. Контейнеры могут быть выполнены из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит в себе композицию, которая отдельно или в комбинации с другой композицией эффективна для лечения, предупреждения и/или диагностики данного состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон, снабженный пробкой, поддающейся прокалыванию иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке. Этикетка или инструкция по применению указывает на то, что композицию применяют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие производства может содержать (a) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, при этом композиция содержит гетеродимерный полипептид, описанный в данной заявке; и (b) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, при этом композиция содержит дополнительный цитотоксический или иной терапевтический агент. Изделие производства по этому воплощению изобретения может дополнительно содержать инструкцию по применению, указывающую, что данные композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. Альтернативно или помимо этого, изделие производства может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, включающий в себя фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может содержать другие необходимые с коммерческой и потребительской точки зрения материалы, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Очевидно, что любое из упомянутых выше изделий производства может включать в себя иммуноконъюгат по изобретению вместо или помимо гетеродимерного полипептида, описанного в данной заявке.

IV. ПРИМЕРЫ

Далее приведены примеры способов и композиций по изобретению. Очевидно, что с учетом приведенного выше общего описания на практике могут быть осуществлены различные другие воплощения.

Несмотря на то, что для ясности понимания вышеизложенное изобретение описано довольно подробно посредством иллюстрации и примеров, эти описания и примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем, описанный в данной заявке. Описания всей патентной и научной литературы, приведенные в данном документе, явным образом включены во всей своей полноте посредством ссылки.

Методы

Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ESI-MS)

Аликвоты белков (50 мкг) подвергают дегликозилированию путем добавления 0,5 мкл N-гликаназы плюс (Roche) и буферного раствора на основе фосфата натрия (0,1 М; pH 7,1) с получением конечного объема образца 115 мкл. Смесь инкубируют при 37°C в течение 18 ч. После этого добавляют для восстановления и денатурации по 60 мкл 0,5 М раствора TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфин; Pierce) в 4 М растворе гуанидина⋅HCl (Pierce) и по 50 мкл 8 М раствора гуанидина⋅HCl. Смесь инкубируют при 37°C в течение 30 мин. Образцы обессоливают посредством гель-проникающей хроматографии (Сефароза G-25, изократический режим, 40%-ый ацетонитрил с 2% муравьиной кислоты). ESI-масс-спектры (+ve) регистрируют на квадрупольном времяпролетном (Q-TOF) приборе (maXis, Bruker), оборудованном источником нано-ESI (TriVersa NanoMate, Advion). Используют приведенные ниже параметры настройки для MS: параметры переноса ионов: радиочастота (RF) ионной воронки, 400 Vpp; энергия индуцированной столкновениями диссоциации в источнике (ISCID), 0 эВ; RF мультиполя, 400 Vpp; квадруполь: энергия ионов, 4,0 эВ; нижний предел для массы, 600 m/z; источник: сухой газ, 8 л/мин; температура сухого газа, 160°C; столкновительная ячейка: энергия столкновений, 10 эВ; RF столкновений: 2000 Vpp; система охлаждения ионов: RF системы охлаждения ионов, 300 Vpp; время переноса: 120 мкс; накопление предимпульсов, 10 мкс; диапазон сканирования m/z 600-2000. Для оценки данных используют программное обеспечение собственной разработки (MassAnalyzer).

Анализ связывания с FcRn с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Анализ свойств антитела дикого типа и мутантов в отношении связывания с FcRn проводят, применяя технологию поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием прибора BIAcore T100 (BIAcore AB, Uppsala, Sweden). Эта система является общепризнанной системой для исследования молекулярных взаимодействий. Она позволяет проводить непрерывный мониторинг связывания лиганд/аналит в режиме реального времени и, таким образом, определение кинетических параметров в различных условиях анализа. SPR-технология основана на измерении показателя преломления вблизи поверхности покрытого золотом биосенсорного чипа. Изменения показателя преломления указывают на изменения массы на поверхности, вызванные взаимодействием иммобилизованного лиганда с введенным в раствор аналитом. Если молекулы связаны с иммобилизованным на поверхности лигандом, то масса увеличивается, в случае же диссоциации масса уменьшается. В применяемом в настоящем изобретении анализе рецептор FcRn иммобилизуют на поверхности CM5-биосенсорного чипа BIAcore (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden) посредством аминного сочетания на уровне 400 единиц ответного сигнала (RU). Анализ проводят при комнатной температуре, используя PBS, содержащий 0,05% Tween-20™, pH 6,0 (GE Healthcare Bioscience), в качестве рабочего буфера и буфера для разведения. 200 нМ растворы образцов антитела вводят при скорости потока 50 мкл/мин при комнатной температуре. Время ассоциации составляет 180 с, фаза диссоциации занимает 360 с. Регенерацию поверхности чипа осуществляют посредством непродолжительной инъекции HBS-P, pH 8,0. Оценку SPR-данных выполняют путем сравнения высоты сигнала биологического ответа через 180 с после инъекции и через 300 с после инъекции. Соответствующими параметрами являются максимальный уровень RU (через 180 с после инъекции) и стабильность на более поздний момент времени (через 300 с после окончания инъекции).

Анализ связывания с белком A с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Данный анализ основан на спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса. Белок A иммобилизуют на поверхности биосенсора для SPR. После введения образца в проточные ячейки SPR-спектрометра происходит образование его комплекса с иммобилизованным белком A, что приводит к увеличению массы на поверхности сенсорного чипа и, следовательно, к возрастанию ответного сигнала (поскольку 1 RU определяется как 1 пг/мм²). После этого сенсорный чип регенерируют путем растворения комплекса образец-белок A. Затем полученные ответные сигналы оценивают по высоте сигнала в единицах ответа (RU) и по показателям диссоциации.

Проводят реакцию сочетания белка A (20 мкг/мл) на уровне приблизительно 3500 единиц ответного сигнала (RU) на поверхности CM5-чипа (GE Healthcare) при pH 4,0, используя набор для аминного сочетания от GE Healthcare.

В качестве буфера для образцов и системы используют буфер HBS-P+ (состава: 0,01 М 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES), 0,15 М NaCl, 0,005% поверхностно-активного вещества P20; стерилизованный фильтрованием, pH 7,4). Температуру проточной ячейки устанавливаюти на 25°C, а температуру в отделении для образца на 12°C. Систему заполняют рабочим буфером. Затем в течение 120 секунд со скоростью потока 30 мкл/мин вводят 5 нМ растворы конструкций образца, после чего проводят фазу диссоциации продолжительностью 300 секунд. Затем поверхность сенсорного чипа регенерируют, выполняя две 30-секундные инъекции раствора глицина-HCl, pH 1,5, при скорости потока 30 мкл/мин. Каждый образец измеряют в трех повторах.

Термин “с мутацией IHH-AAA”, использованный в данном описании, относится к комбинациям мутаций I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) и H435A (His435Ala) в константной области тяжелой цепи подкласса IgG1 или IgG4 (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat), термин “с мутацией HHY-AAA”, использованный в данном описании, относится к комбинациям мутаций H310A (His310Ala), H433A (His433Ala) и Y436A (Tyr436Ala) в константной области тяжелой цепи подкласса IgG1 или IgG4 (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat), термин “с мутацией P329G LALA”, использованный в данном описании, относится к комбинациям мутаций L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala) и P329G (Pro329Gly) в константной области тяжелой цепи подкласса IgG1 (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat abat), а термин “с мутацией SPLE”, использованный в данном описании, относится к комбинациям мутаций S228P (Ser228Pro) и L235E (Leu235Glu) в константной области тяжелой цепи подкласса IgG4 (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat).

Общая информация

Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина человека, приведена в: Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Аминокислотные остатки цепей антитела нумеруют и обозначают согласно EU нумерации (Edelman G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63 (1969) 78-85; Kabat E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

Методы рекомбинантной ДНК

Для работы с ДНК используют стандартные методы, описанные в Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Реагенты для молекулярной биологии используют в соответствии с инструкциями производителя.

Синтез генов

Желаемые сегменты генов нумеруют согласно заданным спецификациям в Geneart (Regensburg, Germany).

Определение последовательности ДНК

Последовательности ДНК определяют посредством секвенирования двухцепочечных молекул, выполненного в MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany) или SequiServe GmbH (Vaterstetten, Germany).

Анализ ДНК и белковых последовательностей и обработка полученных для последовательностей данных

Для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрирования последовательностей используют пакет программ от GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), версию 10.2, и пакет программ Vector NT1 Advance, версию 8.0, от Infomax.

Экспрессирующие векторы

Для экспрессии описанных антител применяют экспрессирующие плазмиды для временной экспрессии (например, в клетках HEK293-F) либо на основе организации кДНК с промотором CMV и следующим за ним интроном A или без него, либо на основе геномной организации с цитомегаловирусным (CMV) промотором.

Помимо экспрессирующей антитело кассеты такие векторы содержат:

- ориджин репликации, обеспечивающий осуществление репликации этого вектора в E. coli,

- ген β-лактамазы, придающий E. coli устойчивость к ампициллину, и

- ген дигидрофолатредуктазы из Mus. musculus в качестве селектируемого маркера в эукариотических клетках.

В состав транскрипционной единицы гена, кодирующего антитело, входят следующие элементы:

- уникальный(ые) сайт(ы) рестрикции на 5'-конце,

- энхансер и промотор непосредственно ранних генов цитомегаловируса человека,

- последовательность интрона A, в случае организации на основе кДНК,

- 5'-нетранслируемый участок гена, кодирующего иммуноглобулин человека,

- нуклеиновая кислота, кодирующая сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,

- нуклеиновая кислота, кодирующая цепь человеческого антитела (дикого типа или с заменой в домене) либо в виде кДНК, либо в виде геномной организации с экзон-интронным построением для иммуноглобулина,

- 3'-нетранслируемый участок с последовательностью сигнала полиаденилирования и

- уникальный(ые) сайт(ы) рестрикции на 3'-конце.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие цепи антител, создают посредством ПЦР и/или синтеза генов и сборку осуществляют с применением известных рекомбинантных методов и технологий, соединяя сообразные сегменты нуклеиновых кислот, например, с использованием уникальных сайтов рестрикции в соответствующих векторах. Последовательности субклонированных нуклеиновых кислот подтверждают посредством секвенирования ДНК. Для осуществления процедур временной трансфекции готовят большие количества векторов, используя для их получения трансформированные культуры E. coli (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Методы культивирования клеток

Используют стандартные методы культивирования клеток, описанные в Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.

Экспрессию биспецифичных антител осуществляют посредством временной котрансфекции клеток HEK293-F, выращиваемых в суспензии, соответствующими экспрессирующими векторами, как описано ниже.

Пример 1

Экспрессия и очистка

Процедуры временной трансфекции в системе HEK293-F

Моноспецифичные и биспецифичные антитела создают посредством временной трансфекции соответствующими векторами (например, кодирующими тяжелую и модифицированную тяжелую цепь, а также соответствующую легкую и модифицированную легкую цепь) с использованием системы HEK293-F (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. Кратко, клетки HEK293-F (Invitrogen), выращиваемые в суспензии либо во встряхиваемой колбе, либо в ферментере с перемешиванием в бессывороточной среде FreeStyle™ для экспрессии в клетках 293 (Invitrogen), трансфицируют смесью, состоящей из соответствующих экспрессирующих векторов и 293Fectin™ или Fectin™ (Invitrogen). В случае использования встряхиваемой колбы емкостью 2 л (Corning) клетки HEK293-F рассевают при плотности 10⁶ клеток/мл в объеме 600 мл и инкубируют в условиях 120 об./мин, 8% CO₂. На следующий день клетки трансфицируют при плотности клеток приблизительно 1,5⋅10⁶ клеток/мл, используя приблизительно 42 мл смеси, состоящей из A) 20 мл среды Opti-MEM (Invitrogen) с содержанием 600 мкг суммарной векторной ДНК (1 мкг/мл), кодирующей тяжелую или модифицированную тяжелую цепь, соответственно, и соответствующую легкую цепь, в эквимолярном соотношении, и B) 20 мл Opti-MEM с 1,2 мл 293Fectin™ или Fectin™ (2 мкл/мл). По мере расходования глюкозы в ходе процесса ферментации добавляют раствор глюкозы. Супернатант, содержащий секретированное антитело, собирают через 5-10 суток, и антитела либо незамедлительно очищают из супернатанта, либо супернатант замораживают и оставляют на хранение.

Очистка

Биспецифичные антитела очищают из супернатантов клеточных культур аффинной хроматографией с использованием MabSelectSureSepharose™, гидрофобной хроматографией с использованием butyl-Sepharose (GE Healthcare, Sweden) и гель-проникающей (GE Healthcare, Sweden) хроматографией на Superdex 200.

Кратко, стерильные отфильтрованные супернатанты клеточных культур сорбируют на носителе MabSelectSure, уравновешенном буфером на основе PBS (10 мМ Na₂HPO₄, 1 мМ KH₂PO₄, 137 мМ NaCl и 2,7 мМ KCl, pH 7,4), промывают уравновешивающим буфером и элюируют 25 мМ раствором цитрата натрия при pH 3,0. Фракции антител после элюирования объединяют и нейтрализуют, используя 2 М Трис, pH 9,0. Проводят подготовку пулов антител для гидрофобной хроматографии, добавляя 1,6 М раствор сульфата аммония до конечной концентрации 0,8 М по сульфату аммония и подводя pH до значения 5,0 с использованием уксусной кислоты. После уравновешивания на носителе butyl-Sepharose с использованием 35 мМ раствора ацетата натрия, 0,8 М раствора сульфата аммония, pH 5,0, на носитель наносят антитела, промывают уравновешивающим буфером и элюируют линейным градиентом до 35 мМ раствора ацетата натрия, pH 5,0. Фракции, содержащие (моноспецифичные или биспецифичные) антитела, объединяют и далее очищают гель-проникающей хроматографией, используя колонку Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Sweden), уравновешенную 20 мМ раствором гистидина с 140 мМ NaCl, pH 6,0. Фракции, содержащие (моноспецифичные или биспецифичные) антитела, объединяют, концентрируют до необходимой концентрации, используя устройства для ультрафильтрации Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech S.A., France) и хранят при -80°C.

Анализ чистоты и целостности антител может быть проведен после каждой стадии очистки посредством капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (CE-SDS) с применением микрожидкостной технологии Labchip (Caliper Life Science, USA). Для CE-SDS-анализа белка готовят пять мкл раствора, используя набор реагентов для высокопроизводительного экспресс-анализа белков (HT Protein Express) в соответствии с инструкциями производителя, и анализ на системе LabChip GXII проводят, используя чип HT Protein Express. Анализ данных проводят, используя программное обеспечение LabChip GX.

Анализ содержания агрегатов в образцах антител может быть проведен посредством высокоэффективной гель-проникающей хроматографии (SEC) с использованием аналитической колонки для гель-проникающей хроматографии, заполненной Superdex 200 (GE Healthcare, Sweden), в рабочем буфере 2xPBS (20 мМ Na₂HPO₄, 2 мМ KH₂PO₄, 274 мМ NaCl и 5,4 мМ KCl, pH 7,4) при 25°C. Раствор, содержащий 25 мкг белка, вводят в колонку со скоростью потока 0,75 мл/мин и элюируют в изократическом режиме в течение 50 минут.

Пример 2

Хроматография с использованием иммобилизованного FcRn

Связывание со стрептавидин-сефарозой

Один грамм стрептавидин-сефарозы (GE Healthcare) добавляют к раствору биотинилированного и диализованного рецептора и инкубируют в течение двух часов со встряхиванием. Сефарозой с иммобилизованным на ней рецептором заполняют XK колонку емкостью 1 мл (GE Healthcare).

Колоночная хроматография на основе аффинности к FcRn

Условия:
размеры колонки:	50 мм × 5 мм;
высота слоя:	5 см;
загрузка:	50 мкг образца;
уравновешивающий буфер:	20 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (MES) с 150 мМ NaCl, значение pH подведено до 5,5;
элюирующий буфер:	20 мМ Трис/HCl с 150 мМ NaCl, значение pH подведено до 8,8;
элюирование:	уравновешивающий буфер в объеме 7,5 объемов колонки (CV); 30 CV элюирующего буфера до 100% элюирования; 10 CV элюирующего буфера.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

<120> ВАРИАНТЫ FC-ОБЛАСТИ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ С FCRN И БЕЛКОМ A

<130> P32409

<150> EP14192054.6

<151> 2014-11-06

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

50 55 60

Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

65 70 75 80

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

85 90 95

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105

<210> 2

<211> 106

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

100 105

<210> 3

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 3

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 4

<211> 223

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 4

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 5

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 5

Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 6

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 6

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 7

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG1, с мутациями L234A, L235A

<400> 7

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 8

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG1, с мутациями Y349C, T366S, L368A и Y407V

<400> 8

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 9

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG1, с мутациями S354C, T366W

<400> 9

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 10

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG1, с мутациями L234A, L235A и мутациями Y349C, T366S, L368A, Y407V

<400> 10

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 11

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG1, с мутациями L234A, L235A и S354C, T366W

<400> 11

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 12

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG1, с мутацией P329G

<400> 12

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 13

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG1, с мутациями L234A, L235A и мутацией P329G

<400> 13

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 14

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG1, с мутацией P239G и мутациями Y349C, T366S, L368A, Y407V

<400> 14

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 15

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG1, с мутацией P329G и мутациями S354C, T366W

<400> 15

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 16

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG1, с мутациями L234A, L235A, P329G и Y349C, T366S, L368A, Y407V

<400> 16

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 17

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG1, с мутациями L234A, L235A, P329G и мутациями S354C, T366W

<400> 17

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 18

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG4, с мутациями S228P и L235E

<400> 18

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 19

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG4, с мутациями S228P, L235E и мутацией P329G

<400> 19

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 20

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG4, с мутациями S354C, T366W

<400> 20

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 21

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG4, с мутациями Y349C, T366S, L368A, Y407V

<400> 21

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 22

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG4, с мутациями S228P, L235E и S354C, T366W

<400> 22

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 23

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG4, с мутациями S228P, L235E и Y349C, T366S, L368A, Y407V

<400> 23

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 24

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG4, с мутацией P329G

<400> 24

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 25

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG4, с мутациями P239G и Y349C, T366S, L368A, Y407V

<400> 25

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 26

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG4, с мутациями P329G и S354C, T366W

<400> 26

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 27

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG4, с мутациями S228P, L235E, P329G и Y349C, T366S, L368A, Y407V

<400> 27

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 28

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого

IgG4, с мутациями S228P, L235E, P329G и S354C, T366W

<400> 28

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 29

<211> 105

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 29

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 30

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 30

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<---

1. Способ получения гетеродимерного полипептида, содержащего первый полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу по меньшей мере часть шарнирной области иммуноглобулина, которая содержит один или более остатков цистеина, CH2-домен иммуноглобулина и CH3-домен иммуноглобулина, и второй полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу по меньшей мере часть шарнирной области иммуноглобулина, которая содержит один или более остатков цистеина, CH2-домен иммуноглобулина и CH3-домен иммуноглобулина, причем указанный иммуноглобулин представляет собой IgG, первый полипептид содержит мутации Y349C, T366S, L368A и Y407V, а второй полипептид содержит мутации S354C и T366W, CH3-домен первого полипептида и CH3-домен второго полипептида оба связывают белок A, первый полипептид и второй полипептид соединены одним или более дисульфидными мостиками, при котором в первый полипептид вносят мутации 1) I253A или I253G и 2) L314A, или L314G, или L314D, где нумерация соответствует EU-индексу по Kabat.

2. Способ по п. 1, где вносят мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D, и

3) T250Q, и/или

4) T256E или T256A.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, где вносят мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D, и

3) возможно a) T250Q и/или b) T256E или T256A, и

4) a) L251A, или L251G, или L251D и/или b) H310A или H310G.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где вносят мутации

1) I253A или I253G, и

2) L314A, или L314G, или L314D, и

3) a) T250Q и/или b) T256E или T256A, и

4) a) L251A, или L251G, или L251D и/или b) H310A или H310G,

5) возможно a) T307A, или T307H, или T307Q, или T307P, и/или b) Q311H, и/или c) M252Y, и/или d) S254T.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где вносят мутации

1) T250Q, и/или

2) M252Y, и/или

3) S254T, и/или

4) T256E или T256A, и/или

5) T307A, или T307H, или T307Q, или T307P, и/или

6) Q311H.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где шарнирная область иммуноглобулина, CH2-домен иммуноглобулина и CH3-домен иммуноглобулина происходят из подкласса IgG1 человека.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где первый полипептид и второй полипептид дополнительно содержат мутации L234A и L235A.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где первый полипептид и второй полипептид дополнительно содержат мутацию P329G.

9. Способ по любому из пп. 1-5, где шарнирная область иммуноглобулина, CH2-домен иммуноглобулина и CH3-домен иммуноглобулина происходят из подкласса IgG4 человека.

10. Способ по любому из пп. 1-5 и 9, где первый полипептид и второй полипептид дополнительно содержат мутации S228P и L235E.

11. Способ по любому из пп. 1-5 и 9, 10, где первый полипептид и второй полипептид дополнительно содержат мутацию P329G.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено активируемое антитело, которое в активированном состоянии связывает рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), включающее антитело, маскирующий фрагмент, который в нерасщепленном состоянии ингибирует связывание антитела с EGFR, и расщепляемый фрагмент, который функционирует в качестве субстрата для протеазы.

Мутантные иммуноглобулин-связывающие полипептиды // 2712882

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к Fc-связывающему полипептиду с улучшенной щелочной стабильностью, содержащему мутант Fc-связывающего домена белка А Staphylococcus (SpA), где мутант имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9-17.

Новые эукариотические клетки и способы их получения для рекомбинантной экспрессии представляющего интерес продукта // 2712507

Изобретение относится к новым эукариотическим клеткам, подходящим для рекомбинантного продуцирования представляющего интерес продукта, где геном клетки-хозяина модифицируют для ингибирования функция белка FAM60A в указанной клетке, например, посредством снижения или блокирования функциональной экспрессии гена FAM60A, что приводит к повышению ее стабильности.

Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства trbv9 tkp человека, и способы их применения // 2712251

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, способные к специфическому связыванию с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-клеточного рецептора человека.

Лечение рака с помощью гуманизированного анти-cd19 химерного антигенного рецептора // 2711975

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая анти-CD19 химерный антигенный рецептор, выделенная молекула анти-CD19 химерный антигенный рецептор, а также гуманизированный анти-CD19-связывающий домен.

Сайт-специфическая конъюгация антитело-лекарственное средство посредством гликоинженерии // 2711935

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая конъюгат антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и цитотоксина для доставки цитотоксина субъекту (варианты), композицию для терапевтического применения, содержащую вышеуказанный конъюгат, способ лечения нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества композиции, выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело для получения вышеуказанного конъюгата, вектор экспрессии, клетку-хозяина для продуцирования вышеуказанного конъюгата, способ получения конъюгата, конъюгат антитело-лекарственное средство для доставки группы лекарственного средства субъекту.

Нейтрализующие антитела к вирусу гриппа b и пути их применения // 2711932

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое способно к связыванию с гемагглютинином (HA) вируса гриппа B и нейтрализации вируса гриппа B в двух филогенетически разных линиях, выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, вектор, для получения антитела, клетку-хозяин, для экспрессии антитела, способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий культивирование клетки-хозяина, композицию для лечения вируса гриппа B, применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в получении лекарственного препарата для профилактики или лечения инфекции, вызванной вирусом гриппа В, применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в получении лекарственного препарата для профилактики или лечения инфекции, вызванной вирусом гриппа А и вирусом гриппа В, способ профилактики или лечения инфекции, вызванной вирусом гриппа B, способ профилактики или лечения инфекции, вызванной вирусом гриппа А и вирусом гриппа B, применение антитела или его фрагмента для in vitro диагностики инфекции, вызванной вирусом гриппа В.

Способ получения конъюгатов агента, связывающегося с клетками, и цитотоксического агента // 2711930

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения конъюгата агента, связывающегося с клетками, и цитотоксического агента. Цитотоксический агент приводят в контакт с бифункциональным сшивающим реагентом, представленным структурной формулойили его солью, в буферном растворе, содержащем буферный агент, причем буферный раствор имеет высокую буферную емкость и молярное отношение буферного агента к бифункциональному сшивающему реагенту составляет от 2:1 до 8:1.

Моноклональные антитела, которые специфически связываются с участком бета цепи семейства trbv-9 т-клеточного рецептора человека, и способы их применения // 2711871

Шаттл для гематоэнцефалического барьера // 2711552

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к шаттлу для гематоэнцефалического барьера. Шаттл содержит полноразмерное антитело IgG-типа, линкер и один scFab, мишенью которого является рецептор трансферрина, соединенный с помощью линкера с C-концом Fc-фрагмента одной из тяжелых цепей полноразмерного IgG.

Фармацевтическая композиция для предотвращения и лечения заболеваний глаз, содержащая в качестве активного ингредиента белок слияния, в котором слиты проникающий в ткань пептид и препарат против фактора роста эндотелия сосудов // 2712623

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложена фармацевтическая композиция для предотвращения и лечения вызванного неоваскуляризацией заболевания глаз, содержащая белок слияния, в котором проникающий в ткань пептид слит с анти-VEGF.

Медикаменты, применения и способы // 2712283

Группа изобретений относится к лечению рецидивного и рефрактерного рака. Заявлено применение композиции, содержащей молекулу антитела, которая специфически связывается с антигеном на поверхности В-клетки и имеет домен Fc, способный связывать FcγRIIb у субъекта, который имеет В-клетки, экспрессирующие FcγRIIb, в комбинации с агентом, который предотвращает или снижает связывание FcγRIIb, представленного на поверхности В-клетки, с Fc-доменом этой молекулы антитела, и который предотвращает или снижает интернализацию этой молекулы антитела в В-клетку, для лечения рецидивного В-клеточного рака и/или рефрактерного В-клеточного рака, устойчивого к указанному антителу у субъекта, который имеет В-клетки, экспрессирующие FcγRIIb.

Лечение остеоартрита // 2712273

Группа изобретений относится к медицине, а именно к способу лечения остеоартрита (OA). Для этого применяют антагонист гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) для уменьшения или предупреждения патологических признаков остеоартрита, включающих повреждение хряща, образование остеофитов и деформацию суставов, где антагонист представляет собой антитело, специфичное в отношении GM-CSF.

Лечение боли // 2712166

Изобретение относится к медицине, а именно к способу лечения боли. Для этого применяют антагонист гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) в качестве средства анальгетического действия для лечения боли, где указанный антагонист представляет собой антитело, специфичное в отношении GM-CSF.

Сайт-специфическая конъюгация антитело-лекарственное средство посредством гликоинженерии // 2711935