Способ сшивания полисахаридов при помощи фотоудаляемых защитных групп

Изобретение относится к пищевой промышленности. Предложен способ получения сшитых материалов на основе полисахаридов при помощи электромагнитного излучения в водном растворе, содержащем полисахарид со связанной карбаматной фотоудаляемой защитной группой (PPG с группой -NH-CO-O-) и полисахарид, содержащий альдегидную группу -СНО. Процесс сшивания проводят посредством реакции конденсации фотохимически высвобождаемой аминогруппы (-NH2) с альдегидной группой (-СНО), получая связь иминного типа (-N=CH-). Оба процесса происходят одновременно, и их можно проводить при физиологических условиях. Изобретение обеспечивает получение улучшенных материалов для тканевой инженерии, где плотность сшивания и, таким образом, механические свойства в структуре материала могут подгоняться. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 15 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к сшиванию полисахаридов при помощи фотоудаляемых защитных групп.

Уровень техники изобретения

Гидрогели представляют физически или химически сшитые полимерные структуры, которые способны поглощать большие количества воды без их растворения в водном растворе. Касательно подходящих реологических параметров, гидрогели с их свойствами похожи на живые ткани. Гидрогели используют в виде каркасов при трансплантации или регенерации тканей в случае повреждений ткани. Организацию клеток, пролиферацию клеток или определение морфогенеза можно регулировать при помощи гидрогелей. В то же время гидрогели представляют подходящий источник энергии для клеток. Эти нерастворимые трехмерные сети облегчают иммобилизацию биологически активных средств (аминокислот, пептидов, лекарственных средств, ферментов, факторов роста и пр.) и их последующее регулируемое высвобождение в желаемой концентрации, время и пространство. Из составных компонентов гидрогелей биополимеры предпочтительны относительно синтетических полимеров, особенно где конечное применение направлено на область тканевой инженерии или восстановительной медицины, и должна обеспечиваться высокая биосовместимость тестируемого материала (Slaughter V.В., Khurshid S.S., Fisher О.Z., Khademhosseini, Peppas, N.А. 2009. Adv Mater 21: 3307). Полисахариды являются подходящими полимерами благодаря их простой доступности, относительно низкой цене, превосходной биосовместимости, полезных механических свойств и многообразия структурных или функциональных вариаций. Наиболее часто используемые полисахариды для фармацевтических и биомедицинских применений представляют собой следующие.

Гиалуроновая кислота (НА) представляет собой природный гетерополисахарид гликозаминогликанового типа, образованный из D-глюкуронового и N-ацетил-D-глюкозаминового элемента, взаимосвязанных посредством β(1-3) и β(1-4) Оглюкозидной связи. НА обычно находится во многих соединительных тканях, синовиальной жидкости, водянистой влаге, коже и хрящах (Smeds K.A., Pfister-Serres A., Miki G., Dastqheib K., Inoue М., Hatchell D.L., Grinstaff M.W. 2001. J Biomed Mater Res 54: 115). Из-за ее биосовместимости НА используется в биомедицине, питании, косметике и фармацевтической промышленности.

Хондроитинсульфат (CS) представляет собой гликозаминогликан, состоящий из сульфатированного N-ацетилгалактозамина и D-глюкуроновой кислоты, который в наибольшем количестве находится во внеклеточном матриксе хряща. CS участвует в суставном метаболизме и используется в качестве терапевтических средств против дегенеративного артрита. В качестве пищевых добавок (например, Hyalgel) он играет важную роль в предотвращении остеоартроза (Bottegoni С., Muzzarelli R.A.A., Giovannini F., Busilacchi A., Gigante A. 2014: CarbPol 109: 126).

Хитозан (СН) представляет собой катионный гомополисахарид, получаемый деацетилированием хитина, и экстрагируется из экзоскелета морских ракообразных. Поскольку СН происходит из природного, возобновляемого нетоксичного и биоразлагаемого источника, он рассматривается как экологически приемлемый продукт. Его качество и свойства зависят от его чистоты и степени деацетилирования (обычно в диапазоне 70-95%), также от молекулярной массы и также от кристалличности. СН обычно используют в качестве гипохолестеринемического и бактериостатического препарата, среды для лекарственного средства или материала для образования клеточного каркаса (Pasqui D., De Cagna М., Barbucci, R. 2012. Polymers 4: 1517).

Карбоксиметилцеллюлоза натрия (CMCNa) представляет собой гидрофильное производное целлюлозы, получаемое алкилированием набухающей целлюлозы (гомополимера β-D-глюкопиранозы) при помощи хлоруксусной кислоты при основных условиях. CMCNa в комбинации с различными лекарственными средствами или необязательно совместными вспомогательными веществами в виде медицинских устройств (марли, бинта, раневых повязок) используется при терапии кожных заболеваний. Ее применяют при лечении диабетической стопы, накожных язв, послеоперационных хирургических ран, при токсическом эпидермальном некролизе, а также в качестве имплантов кожи (Pasqui D., De Cagna М., Barbucci, R. 2012. Polymers 4: 1517).

Полисахариды в своей нативной форме не образуют гидрогели. По этой причине требуется дополнительная модификация их физических свойств. Она главным образом состоит в снижении растворимости и повышении стабильности в водном растворе. Одним вариантом является химическая модификация, посредством которой снижается полярность полисахаридной цепи, например, путем блокирования карбоксильной группы, приводя к образованию сложного эфира (US 4851521, US 4965353), или путем гидрофобизации полярных гидроксильных групп (WO 1996/035720, WO 2010/105582, US 3720662).

Вторым вариантом является химическая сшивка в структуре полисахарида. Наиболее используемые реакции, приводящие к химической сшивке, включают полимеризацию (Burdick J.A., Chung с., Jia X., Randolph М.A., Langer R. 2005. Biomacromolecules 6: 386), реакции конденсации (WO 2008014787, WO 2009/108100, WO 2011/069474), реакции димеризации (ЕР 0554898 В1, ЕР 0763754 А2, US 006025444), реакции циклоприсоединения (CZ 304072), необязательно ферментативные реакции (CZ 303879). Окислительные реакции полисахаридов согласно документам WO 2011/069474 и WO 2011/069475 можно использовать для синтеза предшественников полисахаридов, которые подходят для дополнительных химических модификаций, включая реакции сшивания. Реакция дегидратации этих предшественников, таким образом, использовалась для получения α,β-ненасыщенных аналогов (CZ 304512). Деацетилирование полисахаридов согласно документу US 7345117 используют для получения полиаминопроизводных, требуемых, например, для нуклеофильного присоединения.

Однако классическое химическое сшивание также имеет несколько важных и бесспорных недостатков, т.е. неконтролируемое развитие химической реакции, недостаточную хемоселективность, использование сшивающих средств и необходимость в дополнительной очистке готовых продуктов. Комбинация классического химического сшивания полисахаридов с использованием фотореактивных линкеров может успешно преодолевать вышеуказанные ограничения. Фотореактивные линкеры содержат фотоудаляемые защитные группы (PPG), встроенные в их структуру. Получение монофункциональных фотоудаляемых карбаматных линкеров можно проводить согласно (Figueiredo R.М., R., Christmann М. 2006 J OrgChem 71:4147) или (Werner Т., Barrett A.G. М. 2006 J OrgChem 71:4302 или Furuta, Т., Hirayma Y., Iwamura M. 2001. OrgLett 3: 1809) путем реакции избытка бифункционального аминолинкера со средством ацилирования, несущим PPG.

Одним примером применения PPG является субстрат, маскирующийся от обнаружения в биологической системе in vitro или in vivo, так называемого включения биологического ответа на присутствие конкретного средства. Эти замаскированные субстраты называются защищенными молекулами, а в случае использования PPG используют выражение защитные группы (CG). CG помогают главным образом в биотехнологии и клеточной биологии, поскольку их фоторасщепление происходит при умеренных условиях, быстро, точно и может превосходно регулироваться во времени и пространстве. Применения CG попадают в область фотолитографического создания сложных пептидов, олигонуклеотидов или в область высвобождения биологически активных соединений в клетках или тканях (US 2002/0016472).

Другим практическим примером PPG может быть химическая реакция двух вовлеченных функциональных групп, которая не продолжается, поскольку одна из них маскируется фотоудаляемой защитной группой (PPG). После удаления PPG исходная реакционноспособная группа восстанавливается, и она реагирует с другой участвующей группой в реакционной смеси. Преимущество двухстадийного процесса, введения и расщепления PPG, таким образом облегчает контроль за ходом химической реакции. Если субстрат в реакционной смеси замаскирован (защищен), химическая реакция не происходит. Если субстрат регенерирован (открыт) в реакционной смеси, происходит химическая реакция. Количество или концентрацию замаскированного и открытого субстрата можно определить при помощи источника электромагнитного излучения как во временном аспекте (переключатель «вкл.-выкл.», импульс света), так и в пространственном аспекте (направленный свет, лазер, использование фотомаски и пр.). Другим преимуществом фоторасщепления является то, что его можно надежно применять, где другие подходы введения защитных групп не справляются. Его применяют, например, для чувствительных к рН или теплочувствительных субстратов, биоматериалов и в in vitro или in vivo применениях. Подход, раскрытый здесь, таким образом, облегчает контроль качественных параметров (правильность и плотность сшивания), а также количественных параметров (общий объем относительно части образца) сшитого материала. По этой причине готовый сшитый продукт может переходить из вязких растворов через мягкие в эластичные гели.

Выражение фотохимически регулируемая химическая реакция может представлять не только реакцию сопряжения или реакцию, приводящую к иммобилизации или, напротив, к высвобождению субстрата из структуры-носителя. Этот подход также можно применять к образованию сшитых полимерных структур посредством реакции сшивания с замаскированным субстратом, который является объектом данного патентного документа.

В литературе существует большее количество практических примеров PPG, которые подвергаются фотолизу (Green Т.W. & Wuts P.G. М., 1999, John Wiley, 3rd edition). Фотолиз (химическое расщепление) химических связей в этих группах является результатом поглощения кванта света - фотона молекулой субстрата. Фотохимическое расщепление защитной группы можно проводить непосредственным возбуждением хромофора после поглощения одного протона с желаемой энергией или путем многофотонного поглощения с последующим переносом электрона в защитную группу (US 210/0207078). В случае аминов вводимые защитные группы представляют собой карбаматные функциональные группы. Большинство используемых PPG представляют собой алкокси- или, альтернативно, нитропроизводные ароматических спиртов ( Р., Т., Bochet Ch. G., Blanc A, Givens R., Rubina M., Popik V., Kostikov A., Wirz J. 2013: ChemRev 113: 119; US 2008/0009630), а также гетероароматические соединения кумаринового, хинолинового, ксантанового или тиоксантонового типа (US 2002/0016472).

Применение карбаматных PPG попадает главным образом в область комбинаторного пептидного синтеза или синтеза нуклеиновых кислот (Piggot А.М. & Karuzo Р. 2005. Tetr Lett 46: 8241). Существует еще несколько патентных документов (US 2013309706 A1, US 20008028630 A1, US 20060216324 A1), в которых используют фотолиз для модификации поверхности полимерных материалов, регулируемого высвобождения биологически активного соединения или, напротив, его ковалентной иммобилизации к полимерной структуре. Однако использование PPG для контролируемого сшивания полисахаридов еще не было опубликовано. Вероятно, причиной является комбинация множества факторов, включая, например, недостаточный мольный коэффициент поглощения выбранной PPG для желаемого диапазона длин волн, низкий квантовый выход фотолиза, медленное высвобождение субстрата, низкая стабильность и гидрофобный характер PPG, образование потенциально токсичных и поглощающих дезинтегративных продуктов фотолиза, их последующая конкурирующая реакция с высвобожденным субстратом или биологическим материалом.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает способ выполнения реакций сшивания в растворах полисахаридов, который основан на фотохимическом контроле процесса химического сшивания с использованием карбаматной PPG. Выражение фотохимический контроль представляет фотохимическое расщепление карбаматной связи (-NH-CO-O-), образуя соответствующую аминогруппу (-HN2), при помощи электромагнитного излучения. Выражение процесс химического сшивания представляет реакцию конденсации высвобожденной аминогруппы с альдегидной группой, образуя иминогруппу (-N=CH-). Оба одновременно протекающих процесса можно проводить при физиологически приемлемых условиях.

Преимущество предлагаемого решения по сравнению со способами сшивания полисахаридов, используемыми до настоящего времени, состоит во временном и пространственном контроле хода сшивания, что облегчает получение улучшенных материалов для тканевой инженерии, где можно влиять на плотность сшивок и, таким образом, также на механические свойства в структурах материалов. Фотохимический контроль очень предпочтителен в случаях, когда желательно регулировать рост клеток в заданной среде, что важно, например, для биоматериалов, разработанных для восстановления нервных тканей (Perale G. et. al 2011. ACS Chem. Neursci. 2: 336), или при получении инъецируемых гидрогелей в попытке минимизировать влияние классической инвазивной хирургии (Pasqui D., De Cagna М., Barbucci R. 2012. Polymers 4: 1517).

При помощи комбинации классического химического сшивания с фотореактивными производными полисахаридов можно достигать преимуществ временного контроля хода реакции сшивания таким образом, чтобы реакция проходила только когда соответствующий материал облучают электромагнитным излучением. При нормальных условиях реакция сшивания происходит до тех пор, пока не закончится исходный материал, что нежелательно в случаях, когда желательны конкретные свойства сшитого продукта, такие как клейкость материала, размер пор, проницаемость или биоразлагаемость. Также пространственный контроль хода реакции в виде подходящей фотомаски или направленного света обеспечивает местное протекание реакции сшивания в реакционной смеси. Типичный пример представляет собой фотолитографический подход к образованию гидрогеля, в котором используют свет для переноса геометрической формы фотомаски на светочувствительный субстрат (Khetan S., Burdick J.А. (2010). Biomaterials, 31: 8228).

Другим преимуществом введения PPG в структуру полисахарида является хемоспецифический ход фотолиза и, во-вторых, также реакции сшивания. Свет с желаемой энергией возбуждает только те PPG, которые фотолитически создают реакционноспособные сайты для последующей реакции сшивания на точно определенных сайтах в полимерной структуре полисахарида. Кроме того, фотолиз и реакции сшивания происходят при физиологических условиях без необходимости в дополнительном сшивающем средстве, органическом растворителе или выделении готовых сшитых продуктов, которые образуют гели в водной среде, имеют улучшенную гидролитическую стабильность, проявляют сорбционные свойства и обеспечивают удержание жидкостей и присутствующих средств. Применение этих сшитых полисахаридов относится к области тканевой инженерии, восстановительной медицины или биомедицинским применениям в виде каркасов, имплантов или носителей лекарственных средств.

Карбаматные производные полисахаридов согласно настоящему изобретению понимают как производные, которые имеют карбаматные PPG, встроенные в их структуру или непосредственно, или посредством соответствующего линкера, полученного из диамина, аминоспирта, дигидразида, аминокислоты, алкоксиамина, в конечном итоге посредством линкера с комбинацией следующих групп: -ОН, -NH2, -O-NH2, -СООН, -CONHNH2, -NH-NH2, -SH.

Также определено, что карбаматная PPG группа получена из ароматического или гетероароматического спирта, который проявляют поглощение электромагнитного излучения в диапазоне 320-400 нм, предпочтительно 330-370 нм.

Карбаматная PPG фотолизируется (фотохимически расщепляется) при облучении электромагнитным излучением в ароматический спирт, диоксид углерода и соединение с открытой аминной или гидразидной группой. Эта аминная или гидразидная группа взаимодействует с альдегидной группой другого (незамещенного) полисахарида, образуя иминную или гидразоновую группу. Как первый, так и второй полисахарид (полисахарид 1 и полисахарид 2) могут иметь одинаковую или различную структуру типа гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата или целлюлозы, в конце концов, их фармацевтически приемлемых производных и/или солей. Сшивание производных полисахаридов происходит посредством реакций конденсации. Фотолиз карбаматных PPG требует присутствия воды, и он происходит на основании облучения материала электромагнитным излучением и только после него. Фотолиз также происходит одновременно с реакцией сшивания и может проводиться при физиологических условиях или в присутствии других добавок (органических, неорганических солей или буферов).

Настоящее изобретение, таким образом, раскрывает способ осуществления реакции сшивания в водных растворах полисахаридов, который фотохимически регулируется. Из-за фотохимического контроля необходимо присутствие карбаматной фотоудаляемой группы (PPG), поскольку карбаматная группа защищает аминогруппу (-NH2) производного полисахарида от ранней или нежелательной реакции с альдегидной группой другого полисахарида, который присутствует в реакционной смеси. Если аминогруппа не защищена, происходит неконтролируемая реакция без какого-либо влияния на ее ход.

Если присутствует защитная PPG группа, реакция между аминогруппой и альдегидной группой происходит в водной реакционной смеси только тогда, когда реакционную смесь подвергают электромагнитному излучению, предпочтительно УФА в диапазоне длин волн от 320 до 400 нм. Это облегчает временной контроль реакции, например, при помощи переключателя источника облучения или затемнения реакционной смеси. Плотность сшивания увеличивается с повышением времени облучения, смотрите фиг. 1, примеры 8 и 9. Пространственный контроль реакции, например, при помощи фотомаски или луча света, происходит только в облучаемых местах, смотрите фиг. 2.

Настоящее изобретение, в частности, относится к способу получения сшитых полисахаридных материалов согласно общей формуле (I)

где полисахарид 1 и полисахарид2 являются одинаковыми или различными полисахаридами, a R1 представляет собой C130алкильный остаток, C130алкиларильный остаток или C130алкилгетероарильный остаток, необязательно содержащий один или несколько одинаковых или различных гетероатомов, выбранных из группы, включающей N, О, S. Способ проводят следующим образом: водный раствор альдегида полисахарида2 общей формулы III

где степень замещения альдегида в полисахариде2 находится в диапазоне от 1 до 50%, добавляют в водный раствор полисахарида 1, замещенного аминной группой, модифицированной фотоудаляемой группой, общей формулы (И)

где R1 определен выше; R2 представляет собой ароматическую систему, и где степень замещения карбамата находится в диапазоне от 1 до 10%.

Реакционную смесь подвергают электромагнитному облучению, и в то же время происходит деоксигенирование смеси.

Реакцию можно выразить при помощи общей схемы 1:

Схема 1 фактически содержит две одновременно происходящие реакции, фотолиз PPG в полисахариде 1 и реакцию конденсации/сшивания амина полисахарида 1 с альдегидом полисахарида 2:

Азот или NH-группа в формулах (I) и (II) указаны в дополнение, хотя это часть группы R1. Также группа СН в формуле (I) или СН=O в формуле (III) указана в дополнение, хотя это часть полисахарида2. Специалисты в данной области техники поймут, что это сделано только для лучшего понимания и ясности реакции и реакционных субстратов.

Как представлено выше, степень замещения PPG в полисахариде 1 находится в диапазоне от 1 до 10%, предпочтительно от 3 до 10%, и его молекулярная масса составляет от 10 до 400 кДа, предпочтительно от 20 до 300 кДа, более предпочтительно от 20 до 100 кДа. Степень замещения полисахарида2 до альдегида находится в диапазоне от 1 до 50%, предпочтительно от 3 до 25%, и его молекулярная масса составляет от 10 до 800 кДа, предпочтительно от 50 до 250 кДа. Предпочтительные полисахариды включают, например, гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, целлюлозу и их фармацевтически приемлемые производные и/или соли.

R1 предпочтительно выбирают из группы, включающей дигидразидадипат и гексаметилендиамин, a R2 предпочтительно представляет собой конденсированную ароматическую систему, более предпочтительно выбранную из группы, включающей пирен, антрацен, фенантен, перилен, антрахинон, кумарин и их замещенные производные, которые могут содержать атомы С, Н, О, S, N в своей структуре и проявляют поглощение электромагнитного излучения, наиболее предпочтительно R2 представляет собой пирен.

Массовое отношение полисахарида 1 к полисахариду 2 предпочтительно находится в диапазоне от 1:2 до 2:1. Водные растворы полисахаридов 1 и 2 могут также содержать водорастворимые средства, выбранные из группы, включающей неорганические соли или буферы, предпочтительно фосфатный буфер, тогда как рН раствора находится в диапазоне от 6,5 до 7,5, предпочтительно 7,0.

Реакционную смесь, полученную способом, описанным в настоящем изобретении, подвергают электромагнитному излучению в течение 0,25-2 часов, предпочтительно 0,5-1 часа, при температуре от 10 до 50°С, предпочтительно от 20 до 35°С, тогда как используемое электромагнитное излучение имеет длину волны в диапазоне 320-400 нм, предпочтительно 330-370 нм. Как указано выше, преимущество настоящего изобретения состоит в том, что реакцию можно контролировать по времени при помощи переключения источника электромагнитного излучения, или импульсного источника электромагнитного излучения, или затемнения реакционной смеси. Настоящее изобретение дополнительно также обеспечивает пространственный контроль реакции при помощи фотомаски, направленного электромагнитного излучения или пучка электромагнитного излучения.

Материал, полученный согласно настоящему изобретению, можно использовать в области тканевой инженерии или восстановительной медицины в виде каркасов, наполнителей или в области биомедицины в виде носителей лекарственных средств на основе фоточувствительных материалов с регулируемым высвобождением биологически активного средства.

Подробное описание фигур

Фиг. 1 представляет использование перевернутого способа определения гелеобразования в реакционной смеси, (а) Раствор двухкомпонентной реакционной смеси (Pmoc-DHA-HA и НА-альдегид) перед фотолизом. (b) Гидрогель сшитого продукта (НА-DHA-HA) после фотолиза, (с) Гидрогель сшитого продукта (HA-DHA-HA) через 1 час в PBS (рН=7,4, с=0,9%, масс./об.).

Фиг. 2 показывает пространственный контроль реакции сшивания (Pmoc-DHA-HA и НА-альдегид) при помощи фотомаски в форме полукруга на 50% поверхности реакционной смеси, (а) Реакционная смесь после фотолиза, (b) реакционная смесь через 15 минут в PBS (рН=7,4, с=0,9% масс./об.) и декантирования раствора PBS, (с) реакционная смесь через 15 минут в PBS (рН=7,4, с=0,9% масс./об.) и добавления новой порции PBS.

Фиг. 3 показывает фотографии с микроскопа лиофилизированных образцов, (а): поверхность гидрогеля (100х), (b) сечение гидрогеля (100х), (с) сечение гидрогеля через 1 час в PBS (рН=7,4, с=0,9% мас./об.).

Примеры

Выражение эквивалент (экв.), используемое в настоящем документе, относится к дисахариду гиалуроновой кислоты, дисахариду хондроитинсульфата или моносахариду карбоксиметилцеллюлозы натрия, если не указано иное. Процент используется как массовый процент, если не указано иное.

Молекулярная масса исходной гиалуроновой кислоты (источник: Contipro Pharma a.s., Дольни-Доброуч, Чешская Республика) представляет собой среднюю молекулярную массу в диапазоне от 104 до 106 г⋅моль-1 и была определена при помощи SEC-MALLS.

Молекулярная масса исходного хондроитинсульфата (источник: Sigma-Aldrich s.r.o., Прага, Чешская Республика) представляет собой среднюю молекулярную массу в диапазоне от 4×104 до 5×104 Да или г⋅моль-1 и была определена при помощи способа SEC-MALLS. Соотношение хондроитин-4-сульфата (C4S) и хондроитин-6-сульфата (C6S) составляло 2:3. Материал выделяли из животного материала.

Молекулярная масса исходной карбоксиметилцеллюлозы натрия (источник: Sigma-Aldrich s.r.o., Прага, Чешская Республика) представляет собой среднюю молекулярную массу в диапазоне от 22×104 до 25×104 г⋅моль-1 и была определена при помощи SEC-MALLS. Степень алкилирования карбоксиметильной группой составляла 70%.

Степень замещения или модификации структуры гликозаминогликанов определяли посредством следующего расчета:

DS = степень замещения = 100% * (мольное количество заместителя связи или модифицированного дисахарида) / (мольное количество всех дисахаридов)

Степень модификации структуры карбоксиметилцеллюлозы натрия определяли посредством следующего расчета:

DS = степень замещения = 100% * (мольное количество заместителя связи или модифицированного моносахарида) / (мольное количество всех моносахаридов)

PPG = фотоудаляемая защитная группа

DHA = дигидразидадипат

HMD = 1,6-гексаметилендиамин

Pmoc = пирен-1-илметоксикарбонил

УФА = ближнее ультрафиолетовое излучение в диапазоне длин волн 320-400 нм, излучаемое ртутной точеной лампы - источника длинноволнового ультрафиолетового излучения «черного света», модель В-100А (UVP) с заявленной λмакс.=365 нм.

Морфологию поверхности высушенных сублимацией гелей анализировали при помощи сканирующего электронного микроскопа Zeiss Ultra Plus.

Деацетилированную гиалуроновую кислоту получали при помощи деацетилирования гидразином согласно Buffa R. и соавт. в документе CZ 304512.

Окисление полисахаридов проводили согласно Buffa R и соавт.: документы WO 2011069474 и WO 2011069475.

Пример 1. Получение Pmoc-дигидразидадипата гиалуроновой кислоты (Pmoc-DHA-НА)

НА-альдегид (100 мг, 0,265 ммоль, DS=43%, Mw=1,35×105 г/моль) растворяли в 5 мл дистиллированной воды (раствор I). Pmoc-DHA (54 мг, 0,126 ммоль) растворяли в 5 мл DMSO (раствор II). Оба раствора смешивали и приводили в реакцию в течение 24 часов при комнатной температуре. На второй стадии добавляли PicBH3 (81 мг, 0,754 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 48 часов при комнатной температуре. Продукт осаждали при помощи IPА.

DS=10%, Mw=0,34×105 г/моль, практический выход 85%

Пример 2. Получение Pmoc-гексаметилендиамина гиалуроновой кислоты (Pmoc-HMD-HA)

НА-альдегид (100 мг, 0,265 ммоль, DS=10%, Mw=1,92×105 г/моль) растворяли в 5 мл дистиллированной воды (раствор I). Pmoc-HMD (19 мг, 0,05 ммоль) растворяли в 5 мл DMSO (раствор II). Оба раствора смешивали и приводили в реакцию в течение 24 часов при комнатной температуре. На второй стадии добавляли PicBH3 (81 мг, 0,754 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 48 часов при комнатной температуре. Продукт получали осаждением при помощи IPA.

DS=7%, Mw=1,92×105 г/моль, практический выход 71%.

Пример 3. Получение Pmoc-дигидразидадипата хондроитинсульфата (Pmoc-DHA-CS)

CS-альдегид (50 мг, 0,10 ммоль, DS=14%, Mw=3,0-4,0×105 г/моль) растворяли в 2,5 мл дистиллированной воды (раствор I). Pmoc-DHA (8,7 мг, 0,02 ммоль, 0,2 экв.) растворяли в 2,5 мл DMSO (раствор II). Оба раствора смешивали и приводили в реакцию в течение 24 часов при комнатной температуре. На второй стадии добавляли PicBH3 (32 мг, 0,3 ммоль, 3 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 48 часов при комнатной температуре. Продукт получали осаждением при помощи IPA.

DS=5-6%, Mw=3,0-4,0×105 г/моль, практический выход 84%

Пример 4. Получение Pmoc-дигидразидадипата карбоксиметилцеллюлозы натрия (Pmoc-DHA-CMCNa)

CMCNa-альдегид (100 мг, 0,45 ммоль, DS=4-5%, Mw=8,2×105 г/моль) растворяли в 5 мл дистиллированной воды (раствор I). Pmoc-DHA (19,4 мг, 0,045 ммоль, 0,1 экв.) растворяли в 5 мл DMSO (раствор II). Оба раствора смешивали и приводили в реакцию в течение 24 часов при комнатной температуре. На второй стадии добавляли PicBH3 (144 мг, 1,345 ммоль, 3 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 48 часов при комнатной температуре. Продукт получали осаждением при помощи IPA.

DS=2%, Mw=0,80×105 г/моль, практический выход 88%

Пример 5. Получение Pmoc-HMD-HA

Pmoc-1-H-имидазолкарбоксилат (326 мг, 1 ммоль), растворенный в 20 мл THF, добавляли в 20 мл водного раствора HMD-HA (200 мг, 0,5 ммоль, DS=36%) и реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре. Продукт (DS=8%, Y=40%) получали осаждением при помощи IPA.

Структурный анализ продукта показан в примере 2.

Пример 6. Получение Pmoc-DHA-HA

Pmoc-1-H-имидазолкарбоксилат (326 мг, 1 ммоль), растворенный в 20 мл THF, добавляли в 20 мл водного раствора DHA-HA (200 мг, 0,5 ммоль, DS=25%) и реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре. Продукт (DS=6%, Y=45%) получали осаждением при помощи IPA.

Структурный анализ продукта показан в примере 1.

Пример 7. Получение Pmoc-деацетилированной гиалуроновой кислоты (Pmoc-DEA-НА)

Pmoc-1-H-имидазолкарбоксилат (326 мг, 1 ммоль), растворенный в 20 мл THF, добавляли в 20 мл водного раствора DEA-HA (200 мг, 0,5 ммоль, DS=32%, Mw=0,37×105 г/моль) и реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при 40°С. Продукт получали осаждением при помощи IPA.

DS=7%, практический выход 35%

Пример 8. Фотолиз Pmoc-DHA-HA в присутствии НА-альдегида и сшивание

Способ 1: Pmoc-DHA-HA (10 мг, 0,025 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 2 мл D2O в кварцевой колбе. Добавляли НА-альдегид (10 мг, 0,025 ммоль, DS=11%, Mw=0,66×105 г/моль). Образец дезоксигенировали потоком азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2 при 25°С, рН=7, при перемешивании, в то же время образцы отбирали с 15-минутными интервалами для анализа 1Н-ЯМР. Повышение плотности сшивания (δ=7,49 части на миллион, HA-CH=N-HA) контролировали с конкретными временными интервалами (15/30/45/60 мин) на уровне (18/31/66/85%), соответственно.

Пример 9. Фотолиз Pmoc-DHA-HA в присутствии α,β-ненасыщенного НА-альдегида и сшивание

Способ 1: Pmoc-DHA-HA (10 мг, 0,025 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 2 мл D2O в кварцевой колбе. Добавляли α,β-ненасыщенный НА-альдегид (10 мг, 0,025 ммоль, DS=5%, Mw=0,68×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке N2 и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2 при 25°С, рН=7, при перемешивании, в то же время образцы для анализа 1H-ЯМР отбирали с 15-минутными интервалами. Повышение плотности сшивания (δ=7,58 части на миллион (Н6) и 5,60 части на миллион (Н4), HA-CH=N-HA) контролировали с конкретными временными интервалами (15/30/45/60 мин) на уровне (20/32/48/75%), соответственно.

Пример 10. Фотолиз Pmoc-DHA-HA в присутствии насыщенного НА-альдегида и сшивание

Способ 1: Pmoc-DHA-HA (10 мг, 0,025 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 2 мл D2O в кварцевой колбе. Добавляли НА-альдегид (10 мг, 0,025 ммоль, DS=11%, Mw=0,66×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке N2 и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2 при 25°С, рН=7, при перемешивании, тогда как аликвоты для анализа 1Н-ЯМР отбирали с 15-минутными интервалами. После 60 минут воздействия УФ образовывалось 85% гидразона (δ=7,49 части на миллион, HA-CH=N-НА).

Способ 2: Pmoc-DHA-HA (10 мг, 0,025 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 2 мл D2O в кварцевой колбе. Добавляли НА-альдегид (10 мг, 0,025 ммоль, DS=45%, Mw=0,35×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2 при 25°С, рН=7, при перемешивании, причем образцы для анализа 1Н-ЯМР отбирали с 15-минутными интервалами. После 60 минут воздействия УФ образовывалось 95% гидразона (δ=7,49 части на миллион, HA-CH=N-НА).

Способ 3: Pmoc-DHA-HA (10 мг, 0,025 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 2 мл PBS (с=0,9%, рН=7,4) в кварцевой колбе. Добавляли НА-альдегид (10 мг, 0,025 ммоль, DS=11%, Mw=5,10×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2 при 37°С, рН=7, при перемешивании. После 1 часа облучения УФА вязкость раствора повышалась.

Способ 4: Pmoc-DHA-HA (10 мг, 0,025 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 2 мл PBS (с=0,9%, рН=7,4) в кварцевой колбе. Добавляли НА-альдегид (10 мг, 0,025 ммоль, DS=11%, Mw=5,1×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2 при 50°С, при 25°С, рН=7, при перемешивании. После 1 часа облучения УФА вязкость раствора повышалась.

Способ 5: Pmoc-DHA-HA (10 мг, 0,025 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 3 мл PBS (с=0,9%, рН=7,4) в кварцевой колбе. Добавляли НА-альдегид (20 мг, 0,050 ммоль, DS=11%, Mw=5,10×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2, при 25°С, рН=7, при перемешивании. После 1 часа облучения УФА образовывался гель.

Способ 6: Pmoc-DHA-HA (10 мг, 0,025 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 3 мл PBS (с=0,9%, рН=7,4) в кварцевой колбе. Добавляли НА-альдегид (20 мг, 0,050 ммоль, DS=11%, Mw=5,10×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 0,25 часа в УФА в атмосфере N2, при 25°С, рН=6,5, при перемешивании. После 1 часа облучения УФА вязкость раствора повышалась.

Способ 7: Pmoc-DHA-HA (10 мг, 0,025 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 3 мл PBS (с=0,9%, рН=7,4) в кварцевой колбе. Добавляли НА-альдегид (20 мг, 0,050 ммоль, DS=11%, Mw=5,10×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 2 часов в УФА в атмосфере N2 при 25°С, рН=7,5, при перемешивании. После 2 часов облучения УФА образовывался гель.

DS=3%, гидразоновая группа

Пример 11. Фотолиз Pmoc-DHA-HA в присутствии α,β-ненасыщенного НА-альдегида и сшивание

Способ 1: Pmoc-DHA-HA (10 мг, 0,025 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 2 мл D2O в кварцевой колбе. Добавляли α,β-ненасыщенный НА-альдегид (10 мг, 0,025 ммоль, DS=5%, Mw=0,68×10s г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2, при 25°С, рН=7, при перемешивании, причем образцы для анализа 1H-ЯМР отбирали с 15-минутными интервалами. После 60 минут воздействия УФА образовывались 75% гидразона (δ=7,58 части на миллион (Н6) и 5,60 части на миллион (Н4), HA-CH=N-HA).

Способ 2: Pmoc-DHA-HA (10 мг, 0,025 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 2 мл PBS (0,9%, рН=7,4) в кварцевой колбе. Добавляли α,β-ненасыщенный НА-альдегид (10 мг, 0,025 ммоль, DS=4%, Mw=2,05×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2, при 25°С, рН=7, при перемешивании. После 1 часа облучения вязкость раствора повышалась.

Способ 3: Pmoc-DHA-HA (10 мг, 0,025 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 3 мл PBS (0,9%, рН=7,4) в кварцевой колбе. Добавляли α,β-ненасыщенный НА-альдегид (20 мг, 0,05 ммоль, DS=4%, Mw=2,05×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение в УФА в атмосфере N2, при 25°С, рН=7, при перемешивании. После 1 часа облучения УФА вязкость раствора повышалась.

Способ 4: Pmoc-DHA-HA (20 мг, 0,05 ммоль, DS=10%, Mw=2,64×105 г/моль) растворяли в 3 мл PBS (0,9%, рН=7,4) в кварцевой колбе. Добавляли α,β-ненасыщенный НА-альдегид (10 мг, 0,025 ммоль, DS=4%, Mw=2,05×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2, при 25°С, рН=7, при перемешивании. После 1 часа облучения УФА вязкость раствора повышалась.

DS=3%, гидразоновая группа

Пример 12. Фотолиз Pmoc-DHA-CS в присутствии насыщенного НА-альдегида и сшивание

Способ 1: Pmoc-DHA-CS (10 мг, 0,020 ммоль, DS=5%, Mw=2-4×104 г/моль) растворяли в 1 мл D2O в кварцевой колбе. Добавляли НА-альдегид (8 мг, 0,020 ммоль, DS=33%, Mw=0,40×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2, при 25°С, рН=7, при перемешивании. После 60 минут воздействия УФА образовывались 100% гидразона (δ=7,60 части на миллион, НА-CH=N-DHA-CS).

Способ 2: Pmoc-DHA-CS (10 мг, 0,020 ммоль, DS=5%, Mw=2-4×104 г/моль) растворяли в 1 мл PBS (с=0,9%, рН=7,4) в кварцевой колбе. Добавляли НА-альдегид (8 мг, 0,025 ммоль, DS=33%, Mw=0,40×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2, при 25°С, рН=7, при перемешивании. После 1 часа облучения УФА образовывалось 70% гидразона.

DS=5%, гидразоновая группа

Пример 13. Фотолиз Pmoc-DHA-CMCNa в присутствии насыщенного НА-альдегида и сшивание

Способ 1: Pmoc-DHA-CMCNa(10 мг, 0,038 ммоль, DS=3-4%, Mw=6-8×104 г/моль) растворяли в 1 мл D2O в кварцевой колбе. Добавляли НА-альдегид (15 мг, 0,038 ммоль, DS=33%, Mw=0,40×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2, при 25°С, рН=7. После 60 минут воздействия УФА образовывались 100% гидразона (δ=7,55 и 7,60 части на миллион, HA-CH=N-DHA-CMC).

Способ 2: Pmoc-DHA-CMCNa (10 мг, 0,038 ммоль, DS=3-4%, Mw - 6-8×104 г/моль) растворяли в 1 мл PBS (с=0,9%, рН=7,4) в кварцевой колбе. Добавляли НА-альдегид (15 мг, 0,038 ммоль, DS=33%, Mw=0,40×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2, при 25°С, рН=7, при перемешивании. После 1 часа облучения УФА образовывалось 90% гидразона.

DS=4%, гидразоновая группа

Пример 14 Фотолиз Pmoc-DHA-CS в присутствии насыщенного CS-альдегида и сшивание

Pmoc-DHA-CS (10 мг, 0,020 ммоль, DS=5%, Mw=2-4×104 г/моль) растворяли в 1 мл PBS (с=0,9%, рН=7,4) в кварцевой колбе. Добавляли CS (10 мг, 0,02 ммоль, DS=5%). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2, при 25°С, рН=7, при перемешивании. После 60 минут облучения УФА вязкость раствора повышалась.

1Н-ЯМР (D2O)δ5 7,55-7,60 (bs, 1Н, -N=CH-) части на миллион

Пример 15. Фотолиз Pmoc-DHA-CMCNa в присутствии CMCNa-альдегида и сшивание

Pmoc-DHA-CMCNa (10 мг, 0,038 ммоль, DS=3-4%, Mw=0,60-0,80×105 г/моль) растворяли в 1 мл PBS (с=0,9%, рН=7,4) в кварцевой колбе. Добавляли CMCNa-альдегид (9 мг, 0,038 ммоль, DS=3-4%, Mw=0,6×105 г/моль). Образец дезоксигенировали в потоке азота и облучали в течение 1 часа в УФА в атмосфере N2, при 25°С, рН=7, при перемешивании. После 60 минут облучения УФА вязкость раствора повышалась.

1Н-ЯМР (D2O) δ 7,55-7,60 (bs, 1H, -N=CH-) части на миллион

1. Способ получения сшитых полисахаридных материалов согласно общей формуле (I)

где полисахарид1 и полисахарид2 являются одинаковыми или различными полисахаридами, выбранными из группы, включающей гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, карбоксиметилцеллюлозу и их фармацевтически приемлемые производные и/или соли, и R1 представляет собой C130алкильный остаток, C130алкиларильный остаток или C130алкилгетероарильный остаток, необязательно содержащий один или несколько одинаковых или различных гетероатомов, выбранных из группы, включающей N, О, S, отличающийся тем, что

водный раствор альдегида полисахарида 2 общей формулы III

где степень замещения альдегида в полисахариде2 находится в диапазоне от 1 до 50%, добавляют в водный раствор полисахарида 1, замещенного на аминогруппе фотоудаляемой группой, согласно общей формуле II

где R1 определен выше; R2 представляет собой ароматическую систему, и где степень замещения карбамата в полисахариде 1 находится в диапазоне от 1 до 10%,

и полученную смесь одновременно подвергают электромагнитному облучению и деоксигенированию.

2. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что степень замещения карбамата в полисахариде 1 находится в диапазоне от 3 до 10%, а его молекулярная масса составляет от 10 до 400 кДа, предпочтительно от 20 до 300 кДа, более предпочтительно от 20 до 100 кДа.

3. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что степень замещения альдегида в полисахариде2 находится в диапазоне от 3 до 25%, а его молекулярная масса составляет от 10 до 800 кДа, предпочтительно от 50 до 250 кДа.

4. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что R1 выбирают из группы, включающей дигидразид адипиновой кислоты и гексаметилендиамин.

5. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что R2 выбирают из группы, включающей пирен, антрацен, фенантрен, перилен, антрахинон, кумарин и их замещенные производные, которые могут содержать атомы С, Н, О, S, N в своей структуре и которые проявляют поглощение электромагнитного излучения.

6. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что массовое отношение полисахарида 1 к полисахариду 2 находится в диапазоне от 1:2 до 2:1.

7. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что смесь подвергают электромагнитному облучению в течение 0,25-2 часов, предпочтительно 0,5-1 часа, при температуре от 10 до 50°С, предпочтительно от 25 до 35°С.

8. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что водные растворы полисахаридов 1 и 2 также содержат водорастворимые средства, выбранные из группы, включающей неорганические соли или буферы, предпочтительно фосфатный буфер, причем рН раствора находится в диапазоне от 6,5 до 7,5, предпочтительно 7,0.

9. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что используют электромагнитное излучение с длиной волны 320-400 нм, предпочтительно 330-370 нм.

10. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что реакцию контролируют в отношении времени посредством переключения источника электромагнитного излучения, или посредством импульсного источника электромагнитного излучения, или посредством затемнения реакции.

11. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что реакцию контролируют в отношении пространства посредством фотомаски, направленного электромагнитного излучения или пучка электромагнитного излучения.

12. Применение материала, полученного способом по п. 1, в области тканевой инженерии, восстановительной медицины в виде каркасов, наполнителей.

13. Применение материала, полученного способом по п. 1, для доставки лекарственного средства.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области химии полимеров и может быть использовано для получения полимерных наночастиц из аспарагината хитозана. Способ получения производных хитозана предусматривает смешивание хитозана с кислотой и получение целевого продукта.

Настоящее изобретение относится к самоподдерживающейся пленке на основе сложного эфира гиалуроновой кислоты и к способу ее получения. Указанная пленка содержит C10-С22-ацилированное производное гиалуроновой кислоты в соответствии с общей формулой (I), , в которой R представляет собой Н+ или Na+ и в которой R1 представляет собой Н или -С(=O)CxHy, при этом x представляет собой целое число в диапазоне от 9 до 21, а у представляет собой целое число в диапазоне от 11 до 43, и CxHy представляет собой линейную или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную цепь С9-С21, в которой по меньшей мере в одном повторяющемся звене один или несколько R1 представляют собой -С(=O)СхНу и в которой n находится в диапазоне от 12 до 4000.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена установка и способ повышения концентрации содержащей растворимые углеводы фракции, а также полученные указанным способом содержащая растворимые углеводы фракция и твердая фракция.

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, в частности к способу получения иммуногенного конъюгата, содержащего полисахарид Streptococcus pneumoniae серотипов 10А, 22F или 33F, ковалентно связанный с белком-носителем.

Изобретение относится к составам гидрогелевых систем - комплексов (ассоциатов) гиалуроновой кислоты с щелочноземельными и переходными металлами, выбранных из группы: Ca, Mg, Zn, и способу их получения.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической или косметической промышленности. Способ получения бутирата гиалуроновой кислоты или его соли с щелочным металлом, приемлемой для фармацевтического и косметического использования или использования в медицинском устройстве, включающий взаимодействие гиалуроновой кислоты, возможно в виде соли с натрием или другим щелочным металлом, в водном растворе с бутирил-имидазолидом в присутствии карбоната натрия.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения α,β-ненасыщенных альдегидов в структуре сульфатированных полисахаридов.

Изобретение относится к новым водорастворимым нанокомпозитам, представляющим собой наночастицы металлокомплексных соединений биофлавоноидов, содержащихся в арабиногалактане-сырце, и Gd(III), инкапсулированные в макромолекулы арабиногалактана.

Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ получения пищевой добавки - пектина из растительного сырья включает промывку исходного сырья водой, кислотный гидролиз, отделение раствора, осаждение и сушку целевого продукта.
Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к получению пектиновых экстрактов. Способ получения пектинового экстракта из корзинок-соцветий подсолнечника предусматривает измельчение, очистку сырья, гидролиз-экстрагирование подготовленного сырья с добавлением кислоты, отделение жидкой фазы.

Изобретение относится к пищевой промышленности. Предложен способ получения сшитых материалов на основе полисахаридов при помощи электромагнитного излучения в водном растворе, содержащем полисахарид со связанной карбаматной фотоудаляемой защитной группой и полисахарид, содержащий альдегидную группу -СНО. Процесс сшивания проводят посредством реакции конденсации фотохимически высвобождаемой аминогруппы с альдегидной группой, получая связь иминного типа. Оба процесса происходят одновременно, и их можно проводить при физиологических условиях. Изобретение обеспечивает получение улучшенных материалов для тканевой инженерии, где плотность сшивания и, таким образом, механические свойства в структуре материала могут подгоняться. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 15 пр.

Наверх