Способ получения цитотоксических т-лимфоцитов, экспрессирующих химерные рецепторы



Способ получения цитотоксических т-лимфоцитов, экспрессирующих химерные рецепторы
Способ получения цитотоксических т-лимфоцитов, экспрессирующих химерные рецепторы
Способ получения цитотоксических т-лимфоцитов, экспрессирующих химерные рецепторы
Способ получения цитотоксических т-лимфоцитов, экспрессирующих химерные рецепторы
Способ получения цитотоксических т-лимфоцитов, экспрессирующих химерные рецепторы
C12N2800/95 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)
C12N15/8673 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2714380:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор. Согласно представленному способу для трансдукции Т-лимфоцитов используют рекомбинантные лентивирусные частицы, псевдотипированные поверхностными гликопротеинами вакцинного штамма вируса кори, а наработку лентивирусных частиц осуществляют с помощью CD46-дефицитной линии-упаковщика, полученной с помощью экспрессионной конструкции для экспрессии фермента CRISPR/Cas9 и направляющей РНК (sgРНК), комплементарной участку одного из экзонов гена CD46. Преимущество способа обусловлено эффективностью наработки лентивирусных частиц за счет сведения к минимуму негативных эффектов формирования синцития и реабсорбции вируса клетками упаковывающей линии. 7 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в иммунотерапевтических и исследовательских целях для эффективного получения генетически модифицированных цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих химерные рецепторы к заданному антигену.

Псевдотипирование лентивирусных векторов - широко используемая в генной инженерии практика, позволяющая повысить тропизм вирусных частиц к специфическим антигенам и увеличить эффективность трансдукции отдельных типов клеток. Особую актуальность данный метод приобретает при введении генетических конструкций в лимфоциты, в силу неспособности лентивирусов инфицировать так называемые «спящие» Т-лимфоциты покоя, не имеющие антигенной специфичности. Псевдотипирование лентивирусных векторов путем замены гликопротеина Env на гетерологичные гликопротеины вируса кори позволяет обойти это ограничение и добиться эффективной трансдукции Т-клеток, независимо от фазы клеточного цикла.

Проникновение в клетку вакцинного штамма вируса кори опосредовано двумя поверхностными гликопротеинами: гемаглютинином Н, специфично взаимодействующим с рецепторами заражаемой клетки (SLAM, CD46 и проч.) и белком слияния F, обеспечивающим связывание оболочки вируса с плазматической мембраной. Присутствие CD46 и SLAM рецепторов на поверхности Т-лимфоцитов обеспечивает эффективность трансдукции клеток этого типа Н- и F-псевдотипированными лентивирусными частицами.

В настоящее время разработаны различные алгоритмы доставки генетических конструкций при помощи лентивирусных векторов, псевдотипированных гликопротеинами вируса кори, наиболее близким к заявленному изобретению по технической сущности и результатам, достигаемым аналогами, являются технические решения, описанные в заявках: WO 2000055335 A1, WO 2011085247 A2 и ЕР 2615176 А1.

Применение существующих на сегодняшний день методик сопряжено с рядом ограничений, обусловленных, главным образом, спецификой наработки вируса. Основная проблема возникает в силу того, что, то время как спектр экспрессии SLAM (CD150/SLAM) ограничен незрелыми тимоцитами, Т- и В-лимфоцитами, макрофагами и дендритными клетками, рецептор CD46 присутствует на поверхности всех ядерных клеток в организме человека. На практике это приводит к тому, что заражению вирусом оказываются подвержены эукариотические упаковывающие клетки, используемые в ходе лабораторных методик наработки лентивирусных вирионов, псевдотипированных гликопротеинами Н и F. После трансдукции клеток-упаковщиков белок F вируса кори, экспрессирующийся на цитоплазматической мембране зараженной клетки, опосредует ее слияние с окружающими клетками, в результате приводя к формированию синцития - многоядерного клеточного образования, препятствующего дальнейшей пролиферации клеток и приводящее к их гибели. Заражение рекомбинантным вирусом CD46-позитивных клеток упаковывающей линии также приводит к значительному снижению титра вируса в силу его повторной реабсорбции из культуральной среды клетками упаковывающей линии.

Альтернативным решением проблемы заражения клеток линии-упаковщика нарабатываемым вирусом является техническое решение, приведенное в заявке ЕР 2615176 А1 являющейся одним из ближайших аналогов изобретения и описывающей использование лентивирусного вектора, псевдотипированного F и Н белками парамиксовирусов. Указанная проблема решается за счет таргетного изменения аминокислотной последовательности Н белка, делающего невозможным его взаимодействие с соответствующими лигандами (CD46, SLAM, nectin4). Вместе с тем, методика, реализуемая данным аналогом, ограничивает дальнейшее применение нарабатываемого вируса, не позволяя использовать ее для решения задач, решаемых заявленным изобретением, в частности, для трансдукции CD46-позитивных лимфоцитов, являющихся ключевым инструментом иммунотерапии.

Известно техническое решение WO 2000055335 A1, раскрывающее способ получения псевдотипированных лентивирусных векторов, которые могут быть использованы для доставки целевых генов (в частности, генетических последовательностей, кодирующих структуру CAR) в клетки широкого спектра клеточных культур, предусматривают использование в качестве линии-упаковщика для наработки лентивирусных частиц, псевдотипированных гликопротеинами вируса кори, линий HEK293 (primary human embryonic kidney cells) и PMK (primary monkey kidney cells), не предполагая их генетической модификации с целью подавления экспрессии CD46.

Задачей, на решение которой было направлено заявленное изобретение, является создание эффективного метода наработки рекомбинантных лентивирусных частиц, псевдотипированных поверхностными гликопротеинами вакцинного штамма вируса кори, в ходе которого не происходило бы заражения рекомбинантным вирусом клеток упаковывающей линии.

Решением данной задачи является разработка методики получения цитотоксических Т-лимфоцитов, включающей этап создания клеточной линии упаковщика с нарушенной экспрессией рецептора CD46. Трансгенные CD46-дефицитные клетки не будут подвержены заражению лентивирусными частицами, псевдотипированными гетерологичными гликопротеинами вируса кори, что позволит добиться высокой эффективности получения рекомбинантного вируса, используемого для получения цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор.

Технической задачей изобретения является оптимизация процесса получения цитотоксических Т-лимфоцитов, имеющих потенциал использования в терапевтических и исследовательских целях, с помощью повышения эффективности наработки рекомбинантных лентивирусных частиц, за счет сведения к минимуму негативных эффектов формирования синцития и реабсорбции вируса клетками упаковывающей линии. Заявленное техническое решение характеризуется научной новизной, не имеет полных аналогов и обладает конкурентными преимуществами для получения цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерные рецепторы.

Разработанная методика получения цитотоксических Т-лимфоцитов, включающая этап создания клеточной линии упаковщика с нарушенной экспрессией клеточного рецептора CD46

1. Получение CD46-дефицитной линии HEK293T.

a. Подбор in silico и последующий синтез (приобретение) короткой последовательности направляющей РНК (sgPHK), обладающей уникальным сродством к 5' экзонам CD46.

b. Клонирование подобранной короткой последовательности направляющей РНК в генетический вектор, кодирующий последовательность эндонуклеазы Cas9 и репортерный ген (tag GFP).

c. Оценка эффективности клонирования в ходе секвенирования по Сэнгеру.

d. Трансфекция клеток линии HEK293T полученной генетической конструкцией.

e. Анализ флуоресценции, отбор и экспансия RFP-позитивных клонов.

f. Оценка эффективности нокаута CD46 в ходе иммуноферментного анализа.

2. Получение лентивируса, псевдотипированного поверхностными гликопротеинами вакцинного штамма вируса кори.

g. Трансфекция CD46-дефицитной линии HEK293T генетическими конструкциями, кодирующими структуру Т-клеточного химерного рецептора и двумя упаковочными плазмидами, несущими гены гликопротеинов F и Н.

h. Наработка и выделение вируса

i. Определение титра вируса

3. Трансдукция Т-клеток наработанным рекомбинантным лентивирусом, псевдотипированным поверхностными гликопротеинами вакцинного штамма вируса кори.

Осуществление изобретения

I. Получение CD46-дефицитной линии HEK293T

Первым этапом достижения технического результата стало создание экспрессионной конструкции для экспрессии фермента CRISPR/Cas9 и направляющей РНК (sgРНК), комплементарной участку экзона-1 гена CD46 для эффективного подавления экспрессии рецептора CD46 (Фиг. 1, 2).

Подобранная последовательность направляющей РНК была клонирована в вектор pCas-Guide-PVR1-P2A-tagRFP под контроль промотора U6 (Фиг. 3).

Анализ нуклеотидной последовательности полученной генетической конструкции анализировали методом секвенирования по Сэнгеру, доказавшим успешность проведенного клонирования.

Полученной генетической конструкцией были трансфицированы клетки линии HEK293T. Изоляция и экспансия успешно трансфицированных клонов была проведена на основе уровня флуоресценции репортерного гена tagRFP, входящего в состав вектора pCas-Guide-PVR1-P2A-tagRFP.

II. Получение лентивирусных частиц, псевдотипированных поверхностными гликопротеинами вакцинного штамма вируса кори

Клетки CD46-дефицитной линии HEK293T были котрансфецированы тремя плазмидами: генетической конструкцией, кодирующей структуру Т-клеточного химерного рецептора (Фиг. 4) и двумя упаковочными плазмидами, несущими гены гликопротеинов F и Н (Фиг. 5 и 6, соответственно).

Ростовую среду с трансфицированных клеток, содержащую рекомбинантные вирионы, собирали через 36 часов, фильтровали через 0.44 мкм стерильные фильтры (Millipore) и использовали для трансдукции Т-лимфоцитов.

III. Трансдукция Т-клеток наработанным рекомбинантным лентивирусом

Заражение Т-лимфоцитов проводили из расчета 10 вирусных частиц на 1 клетку. Процесс заражения проводили в течение 8 часов, в бессывороточной питательной среде AIM-V, после чего клетки осаждали центрифугированием и рассаживали на свежую порцию питательной среды AIM-V. В результате работ получали популяцию цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор.

Анализ эффективности разработанной методики получения цитотоксических Т-лимфоцитов

Конкурентное преимущество предложенной методики базируется на возможности получения высокого титра рекомбинантного вируса, нарабатываемого в CD46-дефицитной линии HEK293T. Соответственно, анализ эффективности изобретения включал в себя оценку нокаута CD46 в HEK293T и последующий расчет титра вируса, нарабатываемого трансгенными клетками этой линии в сравнении с CD46-позитивной линией HEK293T, используемой в качестве упаковщика ближайшими аналогами заявленной разработки.

Эффективность нокаута CD46 была подтверждена в ходе иммуноферментного анализа (Фиг. 7).

Определение титра вирусных частиц проводили методом предельных разведений с последующим анализом количества зараженных клеток в ходе проточной цитометрии. Последовательность работ включала наработку препаратов рекомбинантного лентивируса, псевдотипированного гетерологичными гликопротеинами вируса кори в CD46 (-) и исходной CD46 (+) линиях HEK293T, и дальнейшее заражение различными разведениями сопоставляемых препаратов модельной культуры клеток. Через 48 часов после заражения, осуществляли цитометрический анализ клеточных культур. Расчет титра вируса проводился с использованием следующей формулы: титр={(F × Cn) /V} × DF, где F - количество флуоресцирующих клеток, Cn - общее количество клеток, V - объем добавленного препарата, DF - фактор разведения вируса.

Результаты определения титра вирусных частиц, полученных при наработке вируса в клетках в CD46-дефицитной линии HEK293T, представлены в табл.1, соответствующие результаты для исходной линии HEK293T обобщены в табл. 2.

На основе представленных данных был рассчитан титр вируса, составивший:

- 2×108 вирусных частиц/мл для CD46-дефицитной линии HEK293T и

- 2,8×107 вирусных частиц/мл для исходной линии HEK293T.

Значительный прирост титра наработанного вируса в случае использовании CD46-дефицитной линии HEK293T подтверждает конкурентное преимущество разработанной методики и позволяют рекомендовать ее для эффективного получения цитотоксических Т-лимфоцитов.

Изобретение иллюстрировано следующим графическим материалом:

Фиг. 1 - Нуклеотидная последовательность CD46-специфичной направляющей РНК

Фиг. 2 - Схема участка экзона-1 гена CD46, комплементарного подобранной направляющей РНК

Фиг. 3 - Схематичное изображение вектора pCas-Guide-PVR1-P2A-tagRFP

Фиг. 4 - Схематичное изображение генетической конструкции, кодирующей структуру

Т-клеточного химерного рецептора на основе одноцепочечных VHH-антител, специфичных к опухолевому рецептору CD47

Фиг. 5 - Схематическое изображение генетической конструкции pMD2-Fd30

Фиг. 6 - Схематическое изображение генетической конструкции pCD-4AHcd24

Фиг. 7 - Результаты иммуноферментного анализа эффективности нокаута CD46 в клетках линии HEK293T

Табл. 1 - Результаты определения титра вирусных частиц, полученные при наработке вируса в клетках в CD46-дефицитной линии HEK293T

Табл. 2 - Результаты определения титра вирусных частиц, полученные при наработке вируса в клетках в CD46-позитивной линии HEK293T

Способ получения цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор, включающий стадии, на которых:

1) получают клеточную линию-упаковщик HEK293T с подавленной экспрессией клеточного рецептора CD46 путем введения экспрессионной конструкции для экспрессии фермента CRISP/Cas9 и направляющей РНК (sgРНК), комплементарной участку одного из экзонов гена CD46;

2) трансфицируют клеточную линию-упаковщик с подавленной экспрессией CD46, полученную на стадии (1), лентивирусной генетической конструкцией, кодирующей Т-клеточный химерный рецептор, и двумя упаковочными плазмидами, несущими гены гликопротеинов F и Н вируса кори, нарабатывают и выделяют рекомбинантный лентивирус;

3) трансдуцируют цитотоксические Т-лимфоциты наработанным рекомбинантным лентивирусом, полученным на стадии (2).



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения мышиных моноклональных антител, специфичных к различным штаммам вируса гриппа В Ямагатской и Викторианской эволюционных линий и имеющих высокую специфичность к NP-белку, включающий стадии получения антитело-продуцирующих спленоцитов; накопления клеток мышиной миеломы; слияния антитело-продуцирующих спленоцитов с миеломными клетками; отбора гибридом; инокуляции клеток гибридомы в брюшную полость праймированных пристаном мышей; накопления моноклональных антител в асцитах; очистки полученных моноклональных антител.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оптимизации крупномасштабной продукции парвовируса в существенно бессывороточной среде. Описан способ оптимизации продукции парвовируса, включающий существенно бессывороточную среду, которая позволяет увеличить продукцию парвовируса по сравнению со стандартной средой, предпочтительно для продукции H-1PV.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения мышиных моноклональных антител, специфичных к F-белку респираторно-синцитиального вируса групп А и В.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложены способы получения популяции Т-клеток, специфичных в отношении папилломавируса человека (HPV), включающие разделение образца HPV-позитивной опухоли головы и шеи на многочисленные фрагменты; культивирование многочисленных фрагментов по отдельности; получение Т-клеток из культивируемых многочисленных фрагментов; тестирование по отдельности Т-клеток из многочисленных фрагментов на специфичное распознавание HPV; отбор Т-клеток, которые демонстрируют специфичное распознавание HPV, и увеличение числа отобранных Т-клеток для получения популяции HPV-специфичных Т-клеток.

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и представляет собой рекомбинантный белок, содержащий антигенно-значимый фрагмент белка вируса гепатита Е 1 генотипа, используемый в тест-системах для серодиагностики гепатита Е (варианты).

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, в частности к рекомбинантному вирусному вектору, индуцирующему иммунный ответ против вируса гриппа собачьих, содержащему полинуклеотид, кодирующий белок гемагглютинин (НА).

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный вирус гриппа, который способен инфицировать животных из группы псовых и вызывать респираторное заболевание у представителей псовых.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты для увеличения эффективности продукции трансгена, экспрессируемого в клетке млекопитающего.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен аденовирусный геном для защиты аденовируса от нейтрализующих антител, отличающийся тем, что он содержит последовательность, кодирующую альбумин-связывающий участок, вставленную в кодирующую область гипервариабельного участка 1 (HVR1) гексонного белка, что приводит к экспрессии слитого белка, содержащего гексонный белок и альбумин-связывающий участок, и где альбумин-связывающий участок располагается на наружной поверхности гексонного белка, когда сборка гексонного белка имеет место в аденовирусном капсиде.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/2017/7178 (H3N2) - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса А/Брисбен/190/2017 (H3N2) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения мышиных моноклональных антител, специфичных к различным штаммам вируса гриппа В Ямагатской и Викторианской эволюционных линий и имеющих высокую специфичность к NP-белку, включающий стадии получения антитело-продуцирующих спленоцитов; накопления клеток мышиной миеломы; слияния антитело-продуцирующих спленоцитов с миеломными клетками; отбора гибридом; инокуляции клеток гибридомы в брюшную полость праймированных пристаном мышей; накопления моноклональных антител в асцитах; очистки полученных моноклональных антител.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения мышиных моноклональных антител, специфичных к F-белку респираторно-синцитиального вируса групп А и В.

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны способы очистки рекомбинантного лентивирусного вектора (rLV).
Изобретение относится к биотехнологии, а именно, способу получения парвовируса, происходящего из неконцентрированного супернатанта клеточной культуры. Способ включает (a) стадию предварительного расчета каждые 24 часа зависимого от времени изменения плотности клеток в культуральном субстрате, когда клетки-хозяева инфицируются парвовирусом, для каждой плотности клеток (A) при инфицировании вирусом; (b) стадию определения на основе зависимого от времени изменения клеточной плотности, рассчитанной предварительно на стадии (a), (b1) время (Tmax) от инфицирования до времени пика зависимого от времени изменения плотности клеток, (b2) плотность клеток (Bmax) при Tmax и A1, которая представляет собой A, которая удовлетворяет следующему уравнению (1) Bmax/A1>1,2, (b3) максимальную (Amax) плотность клеток A1 при инфицировании вирусом и (b4) A2, которая удовлетворяет следующему уравнению (2) Amax≥A2≥Amax/10; (c) стадию инокуляции посевного парвовируса в культуральный субстрат, содержащий клетки-хозяева, имеющие плотность клеток A2, где инфицирующий вирус, определенный в (b4) стадии (b), и сывороточная среда дают множественность заражения (MOI) от 0,001 до 0,1; (d) стадию культивирования культивируемого продукта, содержащего клетки-хозяева и парвовирус, полученные на стадии (c), в течение периода времени Tmax или более до менее (Tmax+48) часов, где Tmax определено в (b1) стадии (b); (e) стадию замены культурального супернатанта, полученного на стадии (d), бессывороточной средой и культивирования в течение 12 часов или более; и (f) стадию сбора содержащего парвовирус культурального супернатанта, полученного путем культивирования на стадии (e); где на стадии (b), когда A, удовлетворяющая уравнению (1), отсутствует, стадии (a) и (b) осуществляют повторно путем использования другой плотности клеток A при инфицировании вирусом.

Группа изобретений относится к области генетической инженерии, в частности к иммортализованным фибробластам эмбриона цыпленка (ФЭЦ) для размножения вирусов, способам их получения, к культурам клеток, включающим иммортализованные ФЭЦ, к способам репликации вирусов птиц в таких клетках и к способам получения вакцин.

Группа изобретений относится к области генетической инженерии, в частности к иммортализованным фибробластам эмбриона цыпленка (ФЭЦ) для размножения вирусов, способам их получения, к культурам клеток, включающим иммортализованные ФЭЦ, к способам репликации вирусов птиц в таких клетках и к способам получения вакцин.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ очистки вируса без оболочки или с псевдооболочкой, продуцированного in vitro, с использованием композиции с по меньшей мере одним детергентом.

Группа изобретений относится к области диагностики в ветеринарии, в частности, к тесту для обнаружения антител против CSFV. Раскрыт способ обнаружения антител против вируса классической чумы свиней (CSFV) дикого типа в тестируемом образце, где указанный образец также может содержать антитела против мутантного эпитопа TAVSPTTLR из CSFV E2, где способ включает стадию совместной инкубации указанного тестового образца с иммобилизованным носителем, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2 и с носителем, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2.

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа I путем проведения ИФА, включающий получение антигена.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен иммортализованный альвеолярный макрофаг свиней (PAM) для репликации вируса PRRS.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения генетически сконструированных Т-клеток для иммунотерапии, и может быть использовано в медицине.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор. Согласно представленному способу для трансдукции Т-лимфоцитов используют рекомбинантные лентивирусные частицы, псевдотипированные поверхностными гликопротеинами вакцинного штамма вируса кори, а наработку лентивирусных частиц осуществляют с помощью CD46-дефицитной линии-упаковщика, полученной с помощью экспрессионной конструкции для экспрессии фермента CRISPRCas9 и направляющей РНК, комплементарной участку одного из экзонов гена CD46. Преимущество способа обусловлено эффективностью наработки лентивирусных частиц за счет сведения к минимуму негативных эффектов формирования синцития и реабсорбции вируса клетками упаковывающей линии. 7 ил., 2 табл.

Наверх