Способ измерения изменения в иммунном репертуаре индивидуума
Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен способ определения изменения в иммунном репертуаре субъекта, включающий стадии количественного измерения клонотипов иммунных клеток в популяции или субпопуляции иммунных клеток в первом образце и втором образце, забранных у одного пациента, где клонотипы иммунных клеток количественно измеряют с использованием экстрагирования полинуклеотидов, arm-ПЦР и секвенирования следующего поколения, расчета данных по частоте для первого образца и второго образца посредством идентификации частоты каждого клонотипа, нормирования данных по частоте для первого образца и второго образца, определения абсолютного различия в частоте каждого клонотипа, присутствующего в первом образце и втором образце, и определения общих клонотипов для первого образца и второго образца с наибольшим изменением частоты. Способ может быть использован в медицине благодаря точности измерения скорости обмена иммунного репертуара и возможности классифицировать Т- и В- лимфоциты на уровне одной клетки. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 3 пр.
Перекрестная ссылка на родственную заявку
В данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США №62/129706, названной «Способ измерения изменения в иммунном репертуаре индивидуума» и поданной 6 марта 2015 г., которая включена в данный документ посредством ссылки.
Область изобретения
Настоящее раскрытие относится к способам классификации Т- и В-лимфоцитов индивида на уровне одной клетки на основе на дифференциально экспрессируемых рецепторов лимфоцитов и уникальных последовательностей CDR3, и к способам определения изменения в иммунном репертуаре индивида до, во время и/или после заболевания и/или лечения такого заболевания.
Предшествующий уровень техники
Посредством процесса гомеостаза иммунная система поддерживает определенное число и репертуар Т- и В-лимфоцитов, именуемых в совокупности «иммунный репертуар» индивида. Иммунный репертуар индивида, однако, постоянно изменяется в результате непрерывного обмена клеток и воздействия антигенов. Такие изменения иммунного репертуара могут включать, например, генерацию новых (наивных) Т- и В-лимфоцитов, размножение активных Т- и В-лимфоцитов и образование новых Т- и В-лимфоцитов памяти.
Иммунотерапии и клеточные терапии становятся все более популярными инструментами для лечения рака и аутоиммунного заболевания. Иммунотерапии могут включать лечение антителами для модуляции иммунных путей или для усиления иммунного ответа пациента на заболевание. Клеточные терапии могут включать воздействие на кровь или лейкоциты пациента антигена заболевания ех vivo и последующее повторное введение обработанной крови или лейкоцитов пациенту. В то время как в традиционных способах для нацеливания на определенные пути заболевания используются синтетические маленькие молекулы, иммунотерапии и клеточные терапии могут действовать посредством обучения иммунной системы пациента бороться с заболеванием.
При нахождении в болезненном состоянии или во время лечения такого болезненного состояния иммунная система пациента мобилизуется для борьбы с заболеванием. В результате, может изменяться скорость обмена иммунного репертуара. Измерение такого изменения может давать показатель эффективности лечения. В настоящее время, однако, не доступны инструменты или способы, которые позволили бы ученым или врачам измерять скорость обмена иммунного репертуара; современные способы, такие как определение уровня лейкоцитов в крови и проточная цитометрия, не являются идеальными. Измерение уровня лейкоцитов в крови пациента дает только общее число лимфоцитов или число клеток, которые принадлежат к категории лимфоцитов, а проточная цитометрия обеспечивает классификацию Т- и В-лимфоцитов на основе поверхностных маркеров. Ни один из данных способов, однако, не обеспечивает точного измерения скорости обмена иммунного репертуара. Современные способы, как таковые, не являются идеальными для оценки терапевтических результатов терапий, таких как иммунотерапии, получения маркеров для пациентов до скрининга и идентификации тех пациентов, которым лучше всего подходит конкретная терапия. Следовательно, требуется инструмент для классификации Т- и В-лимфоцитов на уровне одной клетки, основанный на дифференциально экспрессируемых рецепторах Т- или В-лимфоцитов, и способ использования данной информации для определения изменения иммунного репертуара индивида.
Краткое изложение сущности изобретения
В одном воплощении настоящее раскрытие относится к способу расчета изменения иммунного репертуара индивида, где такое изменение представляет собой измерение скорости обмена самых динамичных иммунных клеток. Данный способ может включать количественное измерение клонотипов (т.е. клональных типов) в популяциях иммунных клеток из двух или более чем двух образцов, забранных у одного пациента. В одном воплощении данные по частоте рассчитываются для двух или более чем двух образцов посредством идентификации частоты каждого клонотипа, где данные по частоте нормируются для поправки на различия образцов. Затем можно рассчитывать абсолютные качественные и количественные различия в частоте каждого клонотипа в образцах пациента для определения общих для каждого образца клонотипов с наибольшей частотой изменения. Данный способ может затем включать определение процентной доли клонотипов с наибольшей степенью изменения между образцами. Образцы могут быть забраны в один и тот же момент времени для определения исходного иммунного репертуара индивида или забраны в разные моменты времени для расчета скорости изменения иммунного репертуара. В некоторых воплощениях скорость изменения иммунного репертуара определяется в момент времени до, во время или после события, имеющего отношение к состоянию здоровья. Раскрытые в настоящем изобретении способы обеспечивают анализ большого количества данных по секвенированию при устранении несоответствий забора проб и секвенирования, которые ранее делали невозможными расчет изменений иммунного репертуара.
Краткое описание графических материалов
Данное раскрытие можно лучше понять со ссылкой на следующие графические материалы.
ФИГ. 1 представляет собой иллюстрацию необработанных данных по секвенированию CDR3, полученных от пациентов в разные моменты времени.
ФИГ. 2 иллюстрирует расчеты, используемые при определении нормированных данных по последовательности: столбик А представляет необработанные данные по последовательности, и столбики В и С представляют нормированные данные.
ФИГ. 3 представляет расчет, используемый в определении индекса дельта двух образцов, забранных у одного пациента: столбик D представляет абсолютное различие между частотами числа считываемых фрагментов CDR3 в каждом образце; столбик Е представляет расчет интервала влияния двух образцов; и столбик F представляет расчет индекса дельта двух образцов.
ФИГ. 4 представляет оптимизацию сигнала для образцов: столбец Н представляет расчет отношения сигнала к шуму для интервала влияния 100; столбец I представляет расчет отношения сигнала к шуму для интервала влияния 1000; и столбец J представляет расчет отношения сигнала к шуму для интервала влияния 10000. Индекс дельта в действительности означает следующее: если мы рассматриваем интервал влияния 7,27% (процентная доля репертуара, обеспечиваемая верхними 100 клонами) в качестве нового «отобранного репертуара» (и теперь он составляет 100%), в пределах данного «отобранного репертуара» 6,53% изменилось между образцами PAT1S1 и PAT1S2. Общим описанием индекса дельта может быть следующее: он представляет собой меру скорости обмена репертуара, вызванную самыми динамичными клонами. Сколько верхних клонов нам следует включать в расчет индекса дельта? Чем больше верхних клонов мы включаем, тем больше «шум» (экспериментальные переменные, наблюдаемые как индекс дельта между двумя образцами одного человека в один и тот же момент времени (PAT1S1 и PAT1S2). С другой стороны, большее число включенных верхних клонов может не увеличивать сигнал (индекс дельта между двумя образцами одних и тех же индивидов в разные моменты времени, такие как PAT1S1 и PAT2S1). Следовательно, наилучшее отношение сигнала к шуму получается выбором верхних 100 CDR3.
ФИГ. 5 иллюстрирует рассчитанный индекс дельта для нескольких групп образцов: группа А представляет один образец, взятый от одного пациента, где данный образец делится на два подобразца; группа В представляет много образцов, взятых от одного индивида в один и тот же момент времени; группа С представляет образцы; взятые от одного индивида в два разных момента времени с интервалом одни или двое суток; группа D представляет образцы, взятые от одного индивида в два разных момента времени с интервалом три месяца; и группа Е представляет образцы, взятые от разных индивидов в разные моменты времени. В данной ситуации ожидается то, что индекс дельта составляет около 100%.
Подробное описание
Автор изобретения разработал способ определения изменения в иммунном репертуаре индивида, страдающего от заболевания или подвергающегося терапии для лечения заболевания. В данных способах используется различие между изменением в уровне разнообразия иммунных клеток, наблюдаемом у индивида до, во время или после события, имеющего отношение к состоянию здоровья, для определения эффекта заболевания или эффекта схемы лечения на индивида. Такое событие, имеющее отношение к состоянию здоровья, может включать, в одном воплощении, природное появление (т.е. начало заболевания) или искусственное появление (т.е. начало лечения заболевания). В одном аспекте изобретения различие в уровне разнообразия иммунных клеток называется индексом дельта. Индекс дельта определяется в данном документе как количественное изменение (повышающая или понижающая регуляция CDR3) и качественное изменение (приобретение или потеря клонов) наиболее динамичных иммунных клеток индивида с течением времени. В одном воплощении в настоящем изобретении определяется изменение в третьей гипервариабельной области (CDR3) - области, нуклеотидная последовательность которой является уникальной для каждого клона Т- или В-клеток. В одном воплощении наиболее динамичные иммунные клетки в пределах иммунной системы индивида называются интервалом влияния иммунного репертуара. В одном воплощении интервал влияния определяется как 100 клонов CDR3 в пределах выборочной популяции, которые демонстрируют наибольшее изменение в их нуклеотидной последовательности. В других воплощениях интервал влияния может включать другое число клонов, например, 1000 или 10000 клонов, демонстрирующих наибольшее изменение. Термин «иммунные клетки» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к Т-лимфоцитам и/или В-лимфоцитам.
Способы по изобретению могут проводиться с использованием следующих этапов для оценки скорости изменения наиболее динамичных иммунных клеток индивида с течением времени: (а) забор по меньшей мере двух образцов популяций лейкоцитов у субъекта; (б) амплифицирование по отдельности полинуклеотидов из каждой популяции лейкоцитов в реакционной смеси, содержащей специфичные в отношении мишени вложенные праймеры (англ. - nested primers, также «гнездные» праймеры), с получением набора первых ампликонов, по меньшей мере часть специфичных в отношении мишени вложенных праймеров, содержащих дополнительные нуклеотиды, которые во время амплификации служат в качестве матрицы для включения в первые ампликоны сайта связывания для по меньшей мере одного общего праймера; (в) перенос по отдельности части каждой из первых реакционных смесей, содержащих первые ампликоны, во вторые реакционные смеси, содержащие по меньшей мере один общий праймер; (г) для каждой популяции амплифицирование с использованием по меньшей мере одного общего праймера первых ампликонов с получением набора вторых ампликонов; (д) секвенирование каждого из вторых ампликонов с идентификацией частоты специфичных областей CDR3, присутствующих в образце; (е) нормирование данных по частоте CDR3; (ж) сравнение нормированных данных по частоте CDR3 первого образца и второго образца с определением абсолютного различия между частотой каждой последовательности CDR3; (з) определение общих для первого образца и второго образца последовательностей CDR3 с наибольшей частотой изменений и (и) определение последовательностей со стадии (з) с наибольшей степенью изменения. Термин «субъект» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает либо человека, либо животное.
Ранее было сложно широко оценивать иммунную систему, так как число и разнообразие клеток в иммунной системе человека или животного является таким большим, что секвенирование более чем маленького поднабора клеток было непрактичным. Автор изобретения разработал полуколичественный способ ПЦР (полимеразная цепная реакция) (arm-ПЦР, более подробно описанная в патенте США №7999092, включенном в данный документ посредством ссылки во всей его полноте), который обеспечивает повышенную чувствительность и специфичность по сравнению со способами, доступными ранее, давая полуколичественные результаты. Именно эта способность увеличивать специфичность и чувствительность и, посредством этого, увеличивать число выявляемых мишеней в пределах одного образца делает данный способ идеальным для выявления относительного числа клонотипов иммунного репертуара. Автор данного изобретения совсем недавно открыл то, что применение данного способа секвенирования позволяет ему сравнивать изменение или скорость обмена иммунного репертуара индивидуальных субъектов, что привело к разработке настоящего способа. Данный способ был использован для оценки субъектов, которые подвергаются лечению в отношении конкретного заболевания, например, рака. Автор данного изобретения продемонстрировал то, что изменение в разнообразии иммунного репертуара можно легко выявлять с использованием способов по изобретению. Данные способы, следовательно, могут быть полезными в качестве индикаторов эффективности лечения, подобно тому, как и определения количества клеток и биохимические анализы, используемые в настоящее время в клинической практике.
Клонотипы иммунного репертуара определяются посредством реаранжировки вариабельных (V), придающих разнообразие (D) и соединительных (J) сегментов генов посредством соматической рекомбинации на ранних стадиях продукции иммуноглобулинов (Ig) и рецепторов Т-клеток (TCR) иммунной системы. Реаранжировка V(D)J может быть амплифицирована и выявлена из цепей альфа, бета, гамма и дельта рецепторов Т-клеток, а также из тяжелой цепи (IgH) и легких цепей (IgK, IgL) иммуноглобулинов. Клетки могут быть получены от пациента, например, посредством получения периферической крови, лимфоидной ткани, раковой ткани или ткани или жидкостей из других органов и/или систем органов. Методики получения данных образцов, таких как образцы крови, известны специалистам в данной области. Фраза «количественная оценка клонотипов» в том виде, в котором она используется в данном документе, означает подсчет или получение надежного приближения чисел клеток, принадлежащих к конкретному клонотипу. Числа клеток могут быть экстраполированы из числа последовательностей, выявленных ПЦР-амплификацией и секвенированием.
Область CDR3, содержащая примерно 30-90 нуклеотидов, охватывает соединение рекомбинированных вариабельного (V), придающего разнообразие (D) и соединительного (J) сегментов гена. Она кодирует специфичность связывания рецептора и является полезной в качестве метки последовательности для идентификации уникальных реаранжировок V(D)J.
Аспекты данного изобретения включают амплификацию областей CDR3 из Т-клеток, В-клеток и/или поднаборов Т- или В-клеток посредством arm-ПЦР. Термин «популяция» клеток в том виде, в котором он используется в данном документе, следовательно, охватывает то, что обычно называют либо «популяциями», или «субпопуляциями» клеток. Большое число амплифицированных продуктов можно затем эффектвно секвенировать с использованием платформ секвенирования следующего поколения.
Способ arm-ПЦР обеспечивает высокочувствительную, полуколичественную амплификацию многих полинуклеотидов в одной реакции. Способ arm-ПЦР также можно осуществлять автоматизированными способами в системе закрытой кассеты (iCubate®, Huntsville, Ala.), что является полезным в настоящем способе, так как, например, репертуары разных Т- и В-клеток являются слишком большими. В способе arm-ПЦР целевые количества увеличиваются в реакции, управляемой ДНК-полимеразой, что является результатом включения в реакцию специфичных в отношении мишени праймеров. Дополнительным результатом данной реакции амплификации является введение сайтов связывания для общих праймеров, которые будут использоваться в последующей амплификации посредством переноса части первой реакционной смеси, содержащей первый набор ампликонов, во вторую реакционную смесь, содержащую общие праймеры. Фраза «по меньшей мере один общий праймер» в том виде, в котором она используется в данном документе, относится к по меньшей мере одному праймеру, который будет связываться с таким сайтом связывания, и включает пары праймеров, таких как прямые и обратные праймеры. Данный перенос может быть осуществлен либо выделением части реакционной смеси из первой реакции амплификации и введением данного образца во вторую реакционную пробирку или камеру, либо удалением части жидкости из завершенной первой амплификации, оставляя часть, и добавлением свежих реактивов в пробирку, в которой проводилась первая амплификация. В любом случае затем могут быть добавлены дополнительные буферы, полимераза и т.д. в сочетании с общими праймерами для продуцирования амплифицированных продуктов для выявления. Амплификация целевых молекул с использованием общих праймеров дает полуколичественный результат, где количественные числа мишеней, амплифицированных в первой амплификации, амплифицируются с использованием общих, а не специфичных в отношении мишени праймеров, делая возможным продуцирование значительно большего числа мишеней для выявления и для определения относительного числа клеток, содержащих разные реаранжировки в пределах образца крови пациента. Также объединение второй реакционной смеси с частью первой реакционной смеси обеспечивает добавление в первую реакционную смесь более высоких концентраций специфичных в отношении мишени праймеров, приводя к большей чувствительности в первой реакции амплификации. Именно комбинация специфичности и чувствительности, наряду со способностью достигать количественных результатов посредством применения такого способа, как способ arm-ПЦР, обеспечивает достаточно чувствительную и количественную оценку типа и числа клонотипов в популяции клеток с получением индекса дельта, который имеет диагностическое применение.
Клональное размножение из-за распознавания антигена приводит к большей популяции клеток, которые распознают данный конкретный антиген, и оценка клеток по их относительному числу дает способ определения того, влияло ли воздействие антигена на размножение В-клеток, продуцирующих антитела, или Т-клеток, несущих рецепторы. Это полезно для оценки того, может ли конкретная популяция клеток быть превалирующей у индивидов, у которых был поставлен диагноз конкретного заболевания. Например, данный способ может быть особенно полезным в оценке того, достигло ли лечение или вакцина желательного иммунного ответа у индивидов, которым давалось лечение или вакцина.
Праймеры для амплификации и секвенирования вариабельных областей клеток иммунной системы имеются в продаже и были описаны в таких публикациях, как опубликованные патентые заявки автора изобретения WO 2009137255 и US 201000021896 А1, которые обе включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
Существует несколько коммерчески доступных технологий высокопроизводительного секвенирования, как, например, система секвенирования 454 от Hoffman-LaRoche Inc. В способе секвенирования 454°, например, адапторы А и Б связываются на ПЦР-продуктах либо во время ПЦР, либо лигируются на них после ПЦР-реакции. Данные адапторы используются для стадий амплификации и секвенирования. При осуществлении в сочетании с методикой arm-ПЦР адапторы А и Б могут использоваться в качестве общих праймеров (которые иногда называются «коммунальные праймеры» или «суперпраймеры») в реакциях амплификации. После физического присоединения адапторов А и Б к библиотеке образца (такой как ПЦР-ампликоны) готовят библиотеку одноцепочечной ДНК с использованием методик, известных специалистам в данной области. Данная библиотека одноцепочечной ДНК иммобилизуется на специально разработанных шариках для захвата ДНК. Каждый шарик несет уникальный фрагмент библиотеки одноцепочечной ДНК. Связанную с шариками библиотеку эмульгируют с амплифицирующими реактивами в смеси типа «вода в масле», получая микрореакторы, каждый из которых содержит только один шарик с одним уникальным фрагментом библиотеки образца. Каждый уникальный фрагмент библиотеки образца амплифицируется в пределах его собственного микрореактора, исключая конкурирующие или загрязняющие последовательности. Амплификация полного набора фрагментов осуществляется параллельно. Для каждого фрагмента это приводит к числу копий несколько миллионов на шарик. Затем эмульсия ПЦР разрушается, тогда как амплифицированные фрагменты остаются связанными со специфичными для них шариками. Клонально амплифицированные фрагменты обогащаются и загружаются на прибор для секвенирования PicoTiterPlate®. Диаметр лунок PicoTiterPlate® обеспечивает размещение только одного шарика на лунку. После добавления ферментов секвенирования жидкостная подсистема секвенатора обеспечивает ток индивидуальных нуклеотидов в фиксированном порядке через сотни тысяч лунок, каждая из которых содержит один шарик. Добавление одного (или более чем одного) нуклеотида, комплементарного нити матрицы, приводит к хемилюминисцентному сигналу, записываемому камерой на основе CCD (полупроводниковая светочувствительная матрица) в приборе. Комбинация интенсивности сигнала и позиционной информации, генерируемой по всему прибору PicoTiterPlate®, позволяет программе определять последовательность из более чем 1000000 индивидуальных считываемых фрагментов, каждый из которых состоит из вплоть до примерно 450 пар оснований, с использованием системы GS FLX.
В одном воплощении изобретения информация по последовательности из области CDR3 Т-клеток, В-клеток и/или поднаборов Т- или В-клеток получается от одного пациента. Как проиллюстрировано на ФИГ. 1, данные клетки могут быть забраны в разные моменты времени. Например, многие образцы могут быть забраны у одного пациента в один и тот же момент времени (PAT1S1, PAT1S2). В данном воплощении образцы забираются до начала схемы лечения. Как будет описано ниже более подробно, анализ информации по последовательности из образцов, взятых в один и тот же момент времени, обеспечивает установление исходной или базовой скорости обмена иммунного репертуара наиболее динамичных иммунных клеток пациента. В дополнительном воплощении способы по изобретению воплощаются на практике на образцах, забранных у одного пациента в разные моменты времени (PAT1S1, PAT2S1) (ФИГ. 1). В одном воплощении образцы могут быть забраны до, во время или после схемы лечения, расписание чего может быть продиктовано лечащим врачом пациента. Анализ данной информации по последовательности позволяет определять изменение скорости обмена иммунного репертуара наиболее динамичных иммунных клеток пациента в результате схемы лечения.
Различия в том, как забирается образец, в числе забранных клеток, числе полученных считываемых фрагментов секвенирования (т.е. числе последовательностей, полученных из образца) и числе отобранных последовательностей CDR3 делают невозможным сравнение двух образцов без исходного нормирования образцов к общему числу считываемых фрагментов. Следовательно, должна быть установлена точка отсчета как основа сравнения для более поздних измерений. Следовательно, получив последовательности с использованием количественного и/или полуколичественного способа затем предпочтительно нормировать данные для учета таких различий.
На ФИГ. 2 и 3 проиллюстрирован способ расчета базового изменения в иммунном репертуаре. В столбце А ФИГ. 2 представлены необработанные данные последовательности для целого ряда областей CDR3 популяции иммунных клеток из первого образца пациента. Как очевидно из столбца А, каждая выявленная последовательность гена имеет сопровождающую частоту 10 миллионов (считываемых фрагментов). В одном воплощении данного изобретения каждый образец нормируется к 10 миллионам считываемых фрагментов для учета данных расхождений. В данном воплощении получается нормированное число считываемых фрагментов посредством умножения числа считываемых фрагментов (т.е. того, сколько раз каждая уникальная последовательность CDR3 выявляется в образце) для каждой последовательности CDR3 на нормировочный множитель (10 миллионов/общее число считываемых фрагментов для образца) (столбец В), которое затем делится на 10 миллионов (столбец С). Хотя в настоящем примере число считываемых фрагментов и нормируется к 10 миллионам, данное число может нормироваться в других воплощениях к другим концентрациям клеток.
Для установления исходной скорости обмена репертуара для индивида затем сравниваются нормированные данные последовательностей из двух образцов, забранных в один период времени (PAT1S1 и PAT1S2). Обращаясь теперь к ФИГ. 3, определяется абсолютное различие между частотами числа считываемых фрагментов каждой CDR3 в каждом образце (столбец D). Поскольку настоящий способ используется для определения изменения в иммунном репертуаре индивида, в данные расчеты включаются все количественные изменения (т.е. увеличение или уменьшение частоты уникальной последовательности CDR3). В дополнительном воплощении абсолютное различие между частотами каждой последовательности CDR3 также будет включать качественные изменения. Например, факт того, что конкретная последовательность CDR3 может присутствовать в первом образце, но отсутствовать во втором образце (или наоборот), будет-присутствовать в расчетах для определения абсолютного различия в разнообразии клонотипов между двумя образцами.
Вновь обращаясь к ФИГ. 3, следующая стадия в определении исходной скорости обмена иммунного репертуара для пациента включает расчет интервала влияния двух образцов (столбец Е). Интервал влияния в том виде, в котором он используется в данном документе, рассчитывается посредством определения процентной доли иммунного репертуара пациента, обеспечиваемого самыми динамичными клонами. Интервал влияния необходимо определять таким образом, чтобы могли устраняться различия при заборе образцов между двумя популяциями. Как было описано ранее, такие несоответствия при заборе образцов могут включать, например, различия в числе клеток, включенных в образец пациента, различия в эффективности амплификации во время arm-ПЦР, введение систематической ошибки секвенирования и различия в глубине секвенирования. Присутствие данных переменных образца делает невозможным сравнение изменчивости частоты между двумя популяциями. Нормирование данных секвенирования к 10 миллионам считываемых фрагментов, как описано выше, помогает устранять некоторые из этих несоответствий. Однако должны быть использованы дополнительные стадии, такие как расчет интервала влияния, для обеспечения анализа большого количества данных по секвенированию и для обеспечения прямого сравнения двух образцов. Обсуждавшиеся выше переменные будут маскировать любые изменения частоты и делать такое сравнение невозможным. В одном воплощении интервал влияния определяется посредством расчета процента иммунного репертуара пациента, которому содействуют 100 клонов с наибольшим различием частоты между образцами. Как проиллюстрировано на ФИГ. 4, в других воплощениях в расчет интервала влияния могут быть включены другие числа клонов, например, 1000 или 10000 клонов с наибольшим различием частоты между образцами.
На следующей стадии, проиллюстрированной на ФИГ. 3, столбец F, рассчитывается индекс дельта для двух образцов. Индекс дельта в том виде, в котором он используется в данном документе, представляет общую процентную долю секвенированных клонов CDR3 в пределах интервала влияния, которые демонстрируют различие в частоте между первым и вторым образцом. В примере, проиллюстрированном на ФИГ. 4, столбец Н, интервал влияния образцов 1 и 2 (усредненный) составляет 7,27%, показывая то, что 100 наиболее динамичных клонов CDR3 составляют 7,27% секвенированного иммунного репертуара пациента. На конечной стадии рассчитывается индекс дельта для двух образцов. В данном воплощении индекс дельта представляет собой процентную долю клонов CDR3, включенных в интервал влияния, которая изменилась между образцом 1 и образцом 2. Как проиллюстрировано на ФИГ. 4, столбец Н, индекс дельта 6,53% представляет собой расчет исходного обмена иммунного репертуара для пациента, рассчитанный из двух образцов, забранных в один и тот же момент времени, например, до начала события, имеющего отношение к состоянию здоровья.
После установления исходной скорости обмена иммунного репертуара рассчитывается индекс дельта для двух образцов, забранных в разные периоды времени. В одном воплощении первый образец может быть забран до начала лечения, и второй образец, забранный во время или после лечения, является завершенным. Как проиллюстрировано на ФИГ. 4, необработанные данные по последовательности CDR3 из двух образцов, забранных в разные моменты времени (PAT1S1 и PAT2S1), являются: (1) нормированными; (2) рассчитывается абсолютное различие между частотами; (3) рассчитывается интервал влияния двух образцов; и (4) определяется индекс дельта для двух образцов. Данные стадии осуществляются таким же способом, как описано ранее в отношении ФИГ. 2-4 (т.е. таким же способом, как и при расчете исходного индекса дельта). Как проиллюстрировано далее на ФИГ. 4, затем может определяться отношение сигнала к шуму расчета индекса дельта посредством сравнения исходного индекса дельта с экспериментальным индексом дельта, как проиллюстрировано следующим расчетом:
Сигнал/шум=Индекс дельта (PAT1S1-PAT2S1)/Индекс дельта (PAT1S1-PAT1S2)
В воплощении, проиллюстрированном на ФИГ. 4, выбор интервала влияния 100 дает наименьшее отношение сигнала к шуму и обеспечивает результаты с меньшим шумом.
Настоящее изобретение обеспечивает расчет скорости обмена репертуара наиболее динамичных иммунных клеток. Стадии данного способа включают манипуляцию большими количествами данных по последовательностям, например, при нормировании размеров образцов, получая значения частоты для каждого CDR3, получая абсолютные изменения частоты и рассчитывая интервалы влияния. В данных расчетах необходимо принимать во внимание то, что некоторые клоны могут подвергаться повышающей регуляции во время события, имеющего отношение к состоянию здоровья, другие могут подвергаться понижающей регуляции, некоторые клоны могут исчезать во второй момент времени, и некоторые новые клоны могут появляться в другой момент времени. В настоящем изобретении данные проблемы преодолеваются посредством определения общих изменений репертуара и количественного измерения изменений, ассоциированных с каждым CDR3. Настоящие способы обеспечивают анализ огромного количества данных секвенирования при устранении несоответствий при заборе образцов и секвенировании, которые ранее делали невозможным сравнение изменений иммунного репертуара,
ПРИМЕРЫ
Пример 1: расчеты индекса дельта для образцов пациента От каждого из двух здоровых индивидов с трехмесячными интервалами забирали два образца цельной крови. На данных образцах от каждого индивида осуществляли два протокола секвенирования следующего поколения (NGS). РНК экстрагировали из, в среднем, 1 миллиона клеток, и для получения библиотеки NGS использовали arm-ПЦР. Секвенирование проводили с использованием прибора Illumina HiSeq®.
На ФИГ. 5 проиллюстрирован рассчитанный индекс дельта для нескольких групп образцов:
Группа А представляет собой один образец, взятый от одного пациента, где образец делится на два подобразца. Индекс дельта для данной популяции составляет 0,00%, так как два образца были забраны в один и тот же момент времени без изменения образца.
Группа В представляет собой много образцов, взятых от одного индивида в один и тот же момент времени. Изменение репертуара (индекс дельта) измеряется на уровне от 3,88% до 6,53%. Данные типы образца являются полезными для расчета исходного изменения репертуара для индивида.
Группа С представляет собой образцы, взятые от одного индивида в два разных момента времени с интервалом одни или двое суток. Данные рассчитанные изменения репертуара могут варьировать от 0% до 100% и являются полезными в определении изменений репертуара, вызванных событием, имеющим отношение к состоянию здоровья.
Группа D представляет собой образцы, взятые от одного индивида в два разных момента времени с интервалом три месяца. Данные рассчитанные изменения репертуара могут варьировать от 0% до 100% и являются полезными в определении изменений репертуара, вызванных событием, имеющим отношение к состоянию здоровья.
Группа Е представляет собой образцы, взятые от разных индивидов в разные моменты времени. В данной ситуации ожидается то, что индекс дельта составляет около 100%.
Пример 2: образцы от здорового пациента
Два образца цельной крови забирали у каждого из 19 здоровых индивидов с интервалами три месяца. Осуществляли два протокола NGS на образцах от каждого индивида. РНК экстрагировали из, в среднем, 1 миллиона клеток, и для получения библиотеки NGS использовали arm-ПЦР. Секвенирование проводили с использованием прибора lllumina HiSeq®. В среднем для каждого образца секвенировали 5 миллионов молекул рецепторов Т-клеток (всего 10 миллионов считываемых фрагментов на индивида). Из каждого образца было получено приблизительно от 100000 до 300000 уникальных последовательностей CDR3.
В Таблице 1 проиллюстрированы результаты анализа около 200 миллионов считываемых фрагментов последовательности (один считываемый фрагмент равен одной молекуле), включающего расчетный индекс дельта, с интервалом от 5,52% до 23,33%, со средним значением 13%.
Пример 3: образцы рака молочной железы
Образцы были получены от 12 пациентов с раком молочной железы, подвергающихся неоадъювантному лечению, т.е. химиотерапии до хирургии для уменьшения опухолевой нагрузки до хирургии.
Образцы периферической крови забирали до и после лечения. На образцах от каждого индивида осуществляли два протокола NGS. РНК экстрагировали в среднем из 1 миллиона клеток, и для получения библиотеки NGS использовали arm-ПЦР. Секвенирование проводили с использованием прибора lllumina HiSeq®. Как проиллюстрировано в Таблице 2, интервал расчетного индекса дельта составлял от 20,49% до 97%, со средним значением 58,85%
Данные интервалы расчетного индекса дельта показывают значимо большую скорость обмена репертуара по сравнению со скоростью обмена, наблюдаемой для
здоровых индивидов (Таблица 1). Расчет скорости обмена иммунного репертуара с использованием методологий, описанных в данном документе, дает несколько преимуществ по сравнению с современными способами. Раскрытые в данном документе методологии могут, например, помогать оценивать результаты лечения или указывать начало болезненного состояния.
Описанные в данном документе методологии и их разные воплощения являются типичными. Возможны разные другие воплощения методологий, описанных в данном документе.
1. Способ определения изменения в иммунном репертуаре субъекта, включающий стадии:
количественного измерения клонотипов иммунных клеток в популяции или субпопуляции иммунных клеток в первом образце и втором образце, забранных у одного пациента, где клонотипы иммунных клеток количественно измеряют с использованием экстрагирования полинуклеотидов, arm-ПЦР и секвенирования следующего поколения;
расчета данных по частоте для первого образца и второго образца посредством идентификации частоты каждого клонотипа; 1.
нормирования данных по частоте для первого образца и второго образца;
определения абсолютного различия в частоте каждого клонотипа, присутствующего в первом образце и втором образце; и
определения общих клонотипов для первого образца и второго образца с наибольшим изменением частоты.
2. Способ по п. 1, в котором клонотипы представляют собой клонотипы CDR3.
3. Способ по п. 1, в котором первый образец и второй образец забирают в один и тот же момент времени.
4. Способ по п. 1, в котором первый образец и второй образец забирают в разные моменты времени.
5. Способ по п. 1, в котором идентифицируют по меньшей мере 100 клонотипов с наибольшим изменением частоты.
6. Способ по п. 1, в котором каждый образец содержит лейкоциты.
7. Способ по п. 1, в котором субъект является здоровым.
8. Способ по п. 1, в котором у субъекта было диагностировано или подозревается наличие заболевания.
9. Способ по п. 1, в котором субъекта лечат иммунотерапией.
10. Способ по п. 9, в котором субъект получает иммунотерапию после забора первого образца.
11. Способ определения изменения в иммунном репертуаре субъекта, включающий стадии:
забора по меньшей мере двух образцов популяций лейкоцитов от субъекта;
экстрагирования и амплификации по отдельности полинуклеотидов из каждой популяции лейкоцитов в реакционной смеси, содержащей специфичные к мишени вложенные праймеры для получения набора первых ампликонов, по меньшей мере часть специфичных к мишени вложенных праймеров, содержащих дополнительные нуклеотиды, которые на протяжении амплификации служат в качестве матрицы для включения в первые ампликоны сайта связывания для по меньшей мере одного общего праймера;
переноса по отдельности части каждой из первых реакционных смесей, содержащей первые ампликоны, во вторые реакционные смеси, содержащие по меньшей мере один общий праймер;
амплификации для каждой популяции с использованием по меньшей мере одного общего праймера, первых ампликонов с получением набора вторых ампликонов;
секвенирования каждого из вторых ампликонов для идентификации частоты специфических областей CDR3, присутствующих в образце;
нормирования данных по частоте CDR3;
сравнения нормированных данных по частоте CDR3 первого образца и второго образца для определения абсолютного различия между частотой каждой последовательности CDR3; и
определения общих последовательностей CDR3 для первого образца и второго образца с наибольшими изменениями частоты.
12. Способ по п. 11, в котором первый образец и второй образец забирают в один и тот же момент времени.
13. Способ по п. 11, в котором первый образец и второй образец забирают в разные моменты времени.
14. Способ по п. 11, в котором субъект является здоровым.
15. Способ по п. 11, в котором у субъекта было диагностировано или подозревается наличие заболевания.
16. Способ по п. 11, в котором субъекта лечат иммунотерапией.
17. Способ по п. 16, в котором субъект получает иммунотерапию после забора первого образца.
