Биогеосорбент для очистки нефтезагрязненных водных объектов

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен биогеосорбент для очистки нефтезагрязненных водных объектов. Сорбент состоит из носителя – глауконитсодержащей породы и иммобилизованной на нем смеси штаммов бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D, дрожжей Rhodotorula glutinis ВКМ Y-2998D и микроводорослей Chlorella vulgaris f. Globosa IPPAS C-2024 в заданном соотношении. Изобретение позволяет повысить степень очистки водных объектов от нефти. 4 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для очистки загрязненных нефтью водных объектов.

Известен биосорбент для ликвидации нефти с поверхности водоемов [патент РФ № 2 529 771]. Биосорбент содержит (мас.%): глину - 70-80; отходы обогащения бурого угля - 19,5-28,5; штамм Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 - 0,5-1,5. Изобретение направлено на эффективную очистку поверхности водоемов от нефти при сокращении времени и затрат с использованием биосорбента с высокой углеводородокисляющей активностью. Недостатком данного препарата является использование для очистки от нефти жидкой культуры Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 - 0,5-1,5. Известно, что жидкая культура используется сразу после приготовления, т.к. при длительном хранении она портится, т.е. срок годности незначителен.

Известен «Экобиопрепарат для очистки воды от нефтепродуктов» [патент РФ № №2393215]. Биопрепарат представляет собой культуру клеток биодеструктора, искусственно иммобилизованную на сорбенте-носителе из полых сферических частиц, внутренняя полость которых заполнена азотом и двуокисью углерода, имеющим состав (мас.%): SiO₂ - 50-60; Al₂O₂ - 25-30; Fe₂O₃ - 1,8- 2,0; CaO - 1-5; MgO - 0,5-1,5; Na₂O - 0,3-1,5; К₂О - 0,2-2,9. В качестве биодеструктора нефтепродуктов применяется штамм Pseudomonas fluorescens ВКГМ 68-44. Недостатком препарата является использование азота и двуокиси углерода - удорожает стоимость известного препарата для очистки воды от нефтепродуктов, что соответственно удорожает процесс очистки. К тому же применение данного препарата позволяет очищать поверхность водоема от нефти и нефтепродуктов в течение не менее 30 суток, что является длительным процессом.

Известно, что для очистки буровых сточных вод используют торф. Перед применением проводят его обработку кислотами и щелочами, подвергают обработке магнитным полем, добавляя хлорид кальция для повышения коэффициента нефтеемкости [Ф.А. Каменщиков, Е.И. Богомольный, «Нефтяные сорбенты», Москва-Ижевск, 2005, с.152-156]. Однако добавление хлоридов еще больше увеличит их содержание в буровой жидкости, что нецелесообразно.

Известен гидрофобный порошкообразный адсорбент, состоящий из гидрофобизованного вспученного перлита, с относительной плотностью меньше единицы и бактериальный препарат, состоящий из жидкой культуры микроорганизмов Pseudomonas putida 36 [а.с. №1710515]. Перлит представляет минеральный материал на основе оксида кремния, содержание которого составляет 75%. Недостатком адсорбента является наличие дополнительной технологии обработки перлита различными химическими веществами, например карбоновыми кислотами и их солей, что значительно удорожает процесс.

Задачей заявленного изобретения является разработка биогеосорбента на основе модифицированной глауконитсодержащей породы и иммобилизованных на нем углеводородокисляющих микроорганизмов для использования в технологиях очистки водных объектов от нефтяных загрязнений.

Микроорганизмы, входящие в состав биогеосорбента, обладают повышенной нефтеокисляющей активностью. Минеральный носитель, на который иммобилизованы штаммы микроорганизмов, обеспечивает сохранность и выживаемость клеток микроорганизмов в экологически неблагоприятных условиях. Способ позволяет использовать биогеосорбент для очистки загрязненных нефтепродуктами водных объектов. В этом состоит технический результат.

Технический результат достигается тем, что биогеосорбент содержит глауконитсодержащую породу и смесь штаммов бактерий Pseudomonas yamanorum, дрожжей Rhodotorula glutinis, микроводорослей Chlorella vulgaris f. Globosa, взятых при соотношении:

штамм бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ B-3033D
с титром клеток 1012 вкм	40%
штамм дрожжей Rhodotorula glutinis BKM Y-2998D
с титром клеток 109	40%
микроводоросли Chlorella vulgaris f. Globosa IPPAS C-2024
с титром клеток 108	20%.

Ниже описаны штаммы микроорганизмов, входящих в состав биогеосорбента.

Штамм бактерий Pseudomonas yamanorum выделен с грунта, отобранного с участка железнодорожного полотна в г. Сыктывкаре Республики Коми, способен активизировать деструкцию нефти и нефтепродуктов в воде, в дерново-подзолистой почве, а также в масляных грунтах на участках железной дороги. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM В-3033D.

Штамм характеризуется следующими признаками:

I. Культурально-морфологические:

На среде МПА колонии точечные ∅<1 мм, со слизистым чехлом (до 5 мм), палево-желтые, непрозрачные, блестящие, круглые, профиль выпуклый, край ровный. В среду диффундирует неоново-желтый пигмент. На средах Чапека-Докса, Виноградского и КАА окраска колоний палевая, на средах Виноградского и КАА не образует слизи. На средах Эндо и Гисса с глюкозой отмечено обильное образование слизи.

II. Физиолого-биохимические:

Аэроб с окислительным типом метаболизма. Не нуждается в факторах роста. Каталазаположительный. Способен к нитрификации. Обладает амилолитической активностью. Использует как единственный источник углеводов сахарозу, глюкозу, лактозу, маннит.

III. Данные молекулярно-генетического анализа:

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды – Пептон – 20 г, NaCl – 3,0 г; KCl – 1,0 г; MgSO₄×7H₂O – 0,5 г; агар микробиологический – 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.

Штамм Rhodotorula glutinis выделен в 2014 году из нефтяного шламонакопителя Усинского района Республики Коми, способный к нефтеокислению. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM Y-2998D.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические особенности штамма

Колонии красные слизистые выпуклые блестящие гладкие, край ровный.

Клетки почкующиеся округлые, овальные, 2.5-6.0 × 4.0-8.5 мкм, с небольшой капсулой. Баллистоспоры и псевдомицелий отсутствуют.

Образование истинного мицелия и телиоспор не наблюдалось как в монокультуре, так и при скрещивании с типами спаривания Rhodosporidium babjevae Golubev, R. paludigenum Fell et Tallman и R. toruloides Banno.

Сахара не сбраживает.

Ассимилирует глюкозу, мальтозу, мелецитозу (слабо), L-арабинозу (слабо), рамнозу (медленно), сорбит, маннит, этанол. Не ассимилирует лактозу, эритрит, арабит, дульцит, инозит, глюкуронат.

Усваивает нитраты, нитриты (медленно), лизин, этиламин (слабо).

Крахмалоподобные вещества не образует.

При +37°С не растет.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) – периодические пересевы – 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - Сахароза 30 г, NaNO₃ – 3,0 г; KH₂PO₄ – 1,0 г; KCl – 0,5 г; MgSO₄×7H₂O - 0,5 г; агар микробиологический – 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.

Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris f. globosa выделен в 2010 г. из почвы на стоянке оленеводов в Приполярном Урале, способен к нефтеокислению. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Штамму присвоен номер IPPAS-2024.

Морфологическая характеристика штамма:

Форма клеток – шаровидная, размер от 3.3 до 13.3 мкм в диаметре. Пириноид округлый с 2-4 крахмальными зернами, хорошо заметный. Хроматофор чашевидный, зеленый. Жгутиков нет, автоспоры освобождаются путем разрыва материнской оболочки и имеют форму от неправильно шаровидной до тетраэдрической, пустые оболочки материнских клеток двух-трехдольчатые. Особенности морфологии при длительном хранении: увеличение размеров клеток за счет вакуолизации, образование бесцветных капель масла в клетках. Особенности морфологии в условиях оптимального роста: большая часть клеток находится в диапазоне 6-8 мкм.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма – для подготовки биомассы с целевым использованием – периодические пересевы – 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды Болда (табл.1):

Таблица 1

Состав среды Болда

В 936 мл дистиллированной воды необходимо добавить по 10 мл раствора каждого из 6 макроэлементов и по 1 мл каждого микроэлемента и по 1 мл каждого раствора микроэлементов, затем автоклавировать. рН конечного раствора – 6.6. Среда хранится в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.

Минеральный носитель – глауконитсодержащая глина (глауконитсодержащий песчаник, песок). Местонахождение – мезозойские отложения Тимано-Североуральского региона. Минеральный состав пород по данным рентгено-фазового анализа - кальцит, кварц, опал, глауконит, иллит, хлорит, апатит, рентгеноаморфные соединения железа. Удельная поверхность – 43.26 м²/г. Рабочий номер – 539-40. Модифицирование образца 539-40 проводилось с помощью термической обработки при температурах  370 и 500°С в течение 2 ч.

Для определения сорбционных и деструктивных характеристик биогеосорбента были проведены эксперименты.

Пример 1.

0.5 г нефти добавляли в 100 мл среды Чапека без сахарозы. Аэрировали на шейкере при 180 об/мин в течение 4 суток при комнатной температуре и естественном освещении. Воду отфильтровывали.

В колбы на 250 мл разливали подготовленную загрязненную нефтью воду и добавляли 1 г исходного сорбента (без микроорганизмов) или 1 г биогеосорбента. Эксперимент проводили в течение 4 суток при комнатной температуре, естественном освещении, аэрации на шейкере (180 об/мин).

Содержание нефтепродуктов в образцах модельной воды, отфильтрованных исходных сорбентах и биогеосорбентах анализировали методом флуориметрии на анализаторе жидкости «Флюорат – 02» в соответствии с ПНД Ф 16.1.21-98 [Методика выполнения …, 1998].

Образец исходной глауконитсодержащей породы - сорбент (539-40) обладает высокими сорбционными свойствами. Содержание нефтепродуктов в экспериментальной воде снижается относительно контрольного образца на 80 % за 4 суток (табл.2). Сорбционные свойства минерального носителя снижаются в 3 раза после иммобилизации на нем штаммов биопрепарата (табл.2). Это связано с частичным снижением емкости биогеосорбента за счет уменьшения удельной площади поверхности сорбента адгезионно закрепленной на поверхности биомассой микроорганизмов и снижения пористости.

Отношение величин остаточного содержания нефтепродуктов в биогеосорбенте (539-40-Б) к сорбенту (539-40) иллюстрирует степень нефтедеструкции иммобилизованными микроорганизмами и составляет 65% за 4 суток (табл.2).

Таблица 2

Изменение концентрации нефтепродуктов в воде в присутствии исходного минерального носителя и биогеосорбента

№ образца	Содержание нефтепродуктов*	№ образца	Содержание нефтепродуктов*
539-40	0.024±0.009 58±23	539-40-Б	0.072±0.025 20±8
Загрязненная нефтью вода (контроль)	0.12±0.041

*Примечание: в числителе содержание нефтепродуктов в экспериментальной воде, мг/дм³, в знаменателе – содержание нефтепродуктов в исходном сорбенте и биогеосорбенте после эксперимента, мг/г.

Пример 2. Для анализа различных функциональных показателей иммобилизованных на носителях клеток, таких как жизнеспособность, метаболическая и синтетическая активности, предлагаются биохимические методы. В нашем случае, выбран метод определения дегидрогеназной активности, т.к. культуральные жидкости микроорганизмов-нефтедеструкторов, входящие в состав биогеосорбента, обладают высокой дегидрогеназной активностью. В результате иммобилизации на глауконите клетки микроорганизмов, а также их разнообразные ферменты стабилизируются и длительное время сохраняют свою активность. Следовательно, по дегидрогеназной активности самих биогеосорбентов можно судить о жизнеспособности на них клеток.

Проведено определение дегидрогеназной активности в образцах сорбентов и биогеосорбентов в 3-х повторностях. В таблице 3 даны усредненные данные.

Установлена высокая дегидрогеназная активность в биогеосорбентах, что указывает на наличие в них живых клеток микроорганизмов, т.е. биогеосорбенты способны к деструкции нефтепродуктов.

Таблица 3

Дегидрогеназная активность, мг формазана/ 1 г образца

№	Дегидрогеназная активность биогеосорбента	Дегидрогеназная активность сорбента
539-40-Б исх	3.46±0.17	0.496±0.02
539-40-Б 370°С	8.12±0.41	0.10±0.005
539-40-Б 500°С	3.16±0.16	0.09±0.004

Пример 3

Проведено сравнительное испытание исходного биогеосорбента 539-40-Б исх с модифицированными биогеосорбентами (539-40-Б 370°С и 539-40-Б 500°С) на снижение содержания нефтепродуктов в загрязненной воде.

В колбы на 250 мл готовили 100 мл среды Чапека без сахарозы, стерилизовали при температуре 121°С, охлаждали, добавляли нефть в количестве 0.5 г и вносили по 1 г исходного и модифицированных биогеосорбентов.

Условия: аэрация при 180 об/мин, комнатная температура, естественное освещение, в течении 14 суток. Контролем был образец загрязненной нефтью воды без внесения биогеосорбентов. Эксперимент был поставлен в 3-х повторностях. В таблице 4 даны усредненные данные.

Как видно, из таблицы 4, как исходный биогеосорбент, так и модифицированные образцы обладают нефтедеструктивными свойствами. Наиболее эффективным оказался образец 539 370°С. Снижение содержания нефтепродуктов в сильно загрязненной экспериментальной воде, при использовании биогеосорбентов составило 40-60 % за 14 суток.

Таблица 4

Содержание нефтепродуктов в экспериментальной воде

№	НП, мг/дм3
539-40-Б исх	168±25
539-40-Б 370°С	109±16
539-40-Б 500°С	122±18
Контроль	279±42

Пример 4

Приготовление биогеосорбента включая стадию культивирования штаммов и способа получения конечного продукта.

Стадия культивирования штаммов. Питательная среда для культивирования штамма бактерий Pseudomonas yamanorum следующего состава: вода, гидролизат куриного белка (HCP Premium), NaCl; KCl; MgSO₄×7H₂O г.

Питательную среду для культивирования бактерий Pseudomonas yamanorum, объемом 4.5 л стерилизуют в емкости в автоклаве при температуре 121°С, атмосферном давлении 1.2 в течении 20 минут. Охлаждают до температуры 23-27°С и подают в ферментер объемом на 5 литров. Добавляют заранее приготовленный (приготовление описано выше) или оставленный после предыдущего ферментирования инокулят штамма Pseudomonas yamanorum по 100 мл из емкости. Параметры культивирования: температура 25-30°С, перемешивание среды с помощью лопастной мешалки 150 об/мин, рН 6-7, аэрация через стерильный фильтр 0.5 дм³ воздуха на 1 дм³ культуральной жидкости. Культивирование жидкого препарата продолжается от 3 до 5 суток. Наработанная культуральная жидкость должна иметь титр клеток 10¹² КОЕ/мл.

Питательная среда для культивирования штамма дрожжей Rhodotorula glutinis следующего состава (М9): вода, дизельное топливо марки «Л», Na₂HPO₄; KH₂PO₄; NaCl; NH₄Cl. Питательную среду для культивирования дрожжей Rhodotorula glutinis, объемом 4.5 л стерилизуют в емкости в автоклаве при температуре 121°С, атмосферном давлении 1.2, в течении 20 минут. Охлаждают до температуры 23-27°С и подают в ферментер объемом на 5 литров. Добавляют заранее приготовленный (приготовление описано выше) или оставленный после предыдущего ферментирования инокулят культуры Rhodotorula glutinis, по 100 мл из емкости. Параметры культивирования: температура 25-30 ºС, перемешивание среды с помощью лопастной мешалки 150 об/мин, рН 6-7, аэрация через стерильный фильтр 0.5 дм3 воздуха на 1 дм³ культуральной жидкости. Культивирование жидкого препарата продолжается от 3 до 5 суток. Наработанная культуральная жидкость должна иметь титр клеток 10⁹ КОЕ/мл.

При интенсивном пенообразовании в качестве пеногасителя используют стерилизованное подсолнечное масло. Пеногаситель вносят из емкости в ферментеры.

Питательная среда Люка (Патент РФ № 2556126) для культивирования штамма Chlorella vulgaris f. globosa.

Питательную среду для культивирования микроводорослей Chlorella vulgaris f. globosa объемом 4.5 л стерилизуют в емкости в автоклаве при температуре 121°С, атмосферном давлении 1.2, в течение 20 минут. Охлаждают до температуры 23-27°С и подают в стеклянный хемостат объемом на 5 литров. Добавляют заранее приготовленный (приготовление описано выше) или оставленный после предыдущего культивирования инокулят культуры Chlorella vulgaris f. globosa по 100 мл из емкости. Параметры культивирования: за хемостатом располагают 6 люминесцентных ламп мощностью 20 Ватт каждая. Аэрирование с помощью аквариумного насоса, подача углекислого газа 1 г/ литр /час из баллона в течение трех суток. Температура 25-27°С. Наработанная культуральная жидкость должна иметь титр клеток 10⁸ кл./мл.

Полученные бактерии, дрожжи и микроводоросли имеют регистрационные номера:

- ВКМ В-3033D - Штамм бактерий Pseudomonas yamanorum;

- ВКМ Y-2998D - Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis;

- IPPAS C-2024 - Микроводоросли Chlorella vulgaris f. Globosa.

Стадия смешивания биомассы бактерий, дрожжей и микроводорослей. Смесь штаммов бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D, дрожжей Rhodotorula glutinis ВКМ Y-2998D, микроводорослей Chlorella vulgaris f. Globosa IPPAS C-2024 берут при соотношении:

- штамм бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D с титром клеток 10¹² - 40%

- штамм дрожжей Rhodotorula glutinis ВКМ Y-2998D с титром клеток 10⁹ - 40%

- микроводоросли Chlorella vulgaris f. Globosa IPPAS C-2024 с титром клеток 10⁸ - 20%.

Смешивание происходит путем сливания через нижнюю часть ферментеров биомассы дрожжей Rhodotorula glutinis ВКМ Y-2998D, бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D и нижнюю часть хемостата биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris f. globosa IPPAS C-2024.

Часть культуральной жидкости остается для последующего цикла культивирования остается в ферментере и хемостате, в которые вносится новая порция простерилизованных питательных сред.

Стадия получения конечного продукта (биогеосорбента). Полученная смесь культуральных жидкостей микроорганизмов поступает в камеру смешения и далее разбрызгивается на минеральный носитель насыпной плотностью не толще 1 см. В качестве носителя берут глауконитсодержащую породу.

Полученный биогеосорбент высушивают в термостате при температуре не выше 30°С. Фасовку биогеосорбента в упаковочную тару осуществляют в ручную.

Упаковка: 3

Биосорбент фасуют от 1 до 15 кг в полиэтиленовый двойные пакеты, которые герметично запаяны со всех сторон.

Маркировка:

Каждую единицу упаковки снабжают этикеткой, характеризующей продукцию:

- наименование организации, в систему которой входит предприятие-изготовитель;

- наименование предприятия-изготовителя;

- масса нетто;

- дата изготовления;

- номер партии;

- гарантийный срок хранения;

- условия хранения;

- количество единиц фасовки;

- обозначение ТУ.

К каждой партии прилагается инструкция по применению биогеосорбента.

Транспортирование биогеосорбента должно производиться в соответствии с ГОСТ 59.04.070.24-83. Биогеосорбент транспортируется всеми видами транспорта с предохранением его от температур выше +40°С и ниже -25°С.

Хранение должно производиться с ГОСТом 59.04.070.24-83 при температуре от +4 до +25°С.

Гарантийный срок хранения препарата 2-3 года со дня изготовления.

Биогеосорбент для очистки нефтезагрязненных водных объектов, состоящий из носителя - глауконитсодержащей породы с иммобилизованной на нем смесью штаммов бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D, дрожжей Rhodotorula glutinis ВКМ Y-2998D, микроводорослей Chlorella vulgaris f. Globosa IPPAS C-2024, обладающей повышенной нефтеокисляющей активностью при следующем соотношении микроорганизмов:

штамм бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D
с титром клеток 1012	40 %
штамм дрожжей Rhodotorula glutinis ВКМ Y-2998D
с титром клеток 109	40 %
микроводоросли Chlorella vulgaris f. Globosa
IPPAS C-2024 с титром клеток 108	20 %