Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов, исследуемых методом хромато-масс-спектрометрии

Изобретение относится к биохимическим методам исследования микроорганизмов и может использоваться при проведении анализов в медицине, экологии, биотехнологии или ветеринарии. Для этого методом хромато-масс-спектрометрии определяют специфические селективные ионы, являющиеся характерными для микроорганизмов маркерами. На основании полученных данных определяют суммарную нагрузку каждого вида микроорганизмов и группируют их на резистентную и транзисторную группы, а также вычисляют процентное соотношение анаэробных микроорганизмов. Далее определяют допустимый интервал отклонений от нормы конкретного биотопа и рассчитывают референтный диапазон для каждой группы микроорганизмов. Изобретение обеспечивает определение микробных сообществ в субстрате биологического происхождения биологических жидкостей и тканей человека для контроля лечения пациентов, а также при мониторинге и коррекции дисбиоза кишечника. Кроме того, изобретение может быть использовано при контроле анализов животных или растений. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к биохимическим методам исследования с использованием измерения по селективным ионам, характеризующими маркеры микроорганизмов для молекулярного микробиологического анализа. В частности, способ относится к биохимическим методам исследования с применением газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ХМС) в режиме масс-фрагментографии, т.е. с использованием способа измерения по селективным ионам, характеризующими маркеры микроорганизмов, для молекулярного микробиологического анализа.

Способ может использоваться при анализе результатов исследований методом ХМС, применяемого в медицине, экологии, биотехнологии, ветеринарии. Используется при определении микробных сообществ в субстрате биологического происхождения, в частности, для клинических медицинских анализов биологических жидкостей и тканей (проб) человека, животных и растений, а также мониторинга лечебных мероприятий и коррекции дисбиозов человека, а также для контроля проведения лечебных процедур при ведении пациента врачом.

Из уровня техники известна заявка на изобретение «Анализ слюны», RU 2009101454, Конвенционный приоритет 17.08.2006. патент US 60/838,221, Публикация РСТ - WO 2008/020416 (21.02.2008), МПК G01N 33/48, включающий определение показателей для отдельного субъекта, для чего оцифровывают индивидуальный спектр образца слюны субъекта и сравнивают с эталонной моделью. Однако возможная существенная ошибка при выделении референтных групп и корреляция многокомпонентного анализа не может предоставить стопроцентного соответствия сравниваемых показателей. За показатели берут данные клинического анализа, а не анализа сообщества микроорганизмов, поэтому в данном методе могут применять прежде всего методы для получения ЯМР - спектра, с помощью которого определяют пики содержания кислот и органических веществ.

Известно изобретение «Анализы и способы применения биомаркеров», патент RU 2409817, конвенционный приоритет: от 16.08.2005, US 60/708,677; и от 24.05.2006, US 60/808,076, опубликовано 20.01.2011, позволяющий исследовать экспрессию одного или более биомаркеров в образце ткани или клеток млекопитающего. Позволяет определить группу патологий, в которую входят такие заболевания, при которых стимуляция иммунного ответа или вмешательство в иммунный ответ дают положительный эффект в отношении течения/прогрессирования болезни, а также определить деструкцию ткани больного, однако не предоставляет возможности определить референтный диапазон показателей исходя из индивидуальных особенностей организма.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является изобретение «Способ калибровки системы газовой хроматографии - масс спектрометрии (ГХ-МС), оснащенной специальным программным обеспечением, для определения маркеров микроорганизмов в исследуемой пробе материала биологического происхождения », патент RU 2501011, опубл. 10.01.2012, МПК G01N 33/48, G01N 30/00, в котором проводят качественный и количественный хромато-масс спектрометрический анализ исследуемого биологического материала с последующим выявлением полного сообщества микроорганизмов биологического происхождения. Перед измерением серии рутинных клинических проб исследуемого материала собирают произвольную пробу биоматериала, принимая ее в качестве эталонной смеси. Позволяет осуществить калибровку прибора, оснащенного специальным программным обеспечением, основанную на количественном определении маркерных веществ микроорганизмов, таких как высшие жирные кислоты, альдегиды, стерины, согласно времени выхода и площади хроматографического пика. Однако, в данном способе не выделяют референтный интервал в конкретном биотопе конкретного объекта (обследуемого).

Под конкретным биотопом конкретного объекта (обследуемого) в контексте данной заявки понимают биотопы, такие как: эндометрий, мочеполовой тракт, тонкая кишка и т.д. Под конкретным объектом понимают тех, у кого брали биотоп, например, конкретные люди (обследуемые). Кроме того, исследуемых разбиваютают на группы, например, по возрастам и т.п.

Из уровня техники известны также методы применения ион - селективных ионов в биологии и биохимии для определения активности ионов, что определяет активность участвующих в биологических процессах веществ, однако не ставят задачу определить референтный диапазон норм конкретного биологического объекта. Этому посвящена, например, работа С.М. Лопатина, «Теоретические основы электрохимических методов анализа», М., Высшая школа, 1975 год, и см. Аналитическая химия. Проблемы и подходы, т. 2, редакторы Р. Кельмер и др. М., Мир, Аст, 2004 г. стр. 56.

Требуется изучение референтных значений микроорганизмов для оценки микроэкологического статуса методом ХМС, т.к. у каждого микроорганизма в каждом отдельном микробном сообществе конкретного пациента (обследуемого, объекта) нормальный диапазон присутствия разный. Он зависит от суммарной нагрузки и общей микробной нагрузки на организм.

Под микроэкологическим статусом понимают - микроэкологический статус человека, то есть - это состояние равновесия микробной составляющей организма человека или микроорганизма. Под микроэкологическим нарушением понимают нарушение дасбаланса микробного сообщества организма, например, дефицит Bifidobacterium spp и Lactobacillus spp, т.е. Дисбиоз кишечника.

Для более детального анализа и учета индивидуальных особенностей организма необходимо наглядно определить и продемонстрировать долю резидентных и транзиторных микроорганизмов и других микроорганизмов в зависимости от общей микробной нагрузки на организм. При этом, для принятия решения врачом важно знать допустимый интервал отклонений и встречаемость микроорганизма в конкретном биотопе конкретного обследуемого. Поскольку понятие нормы выводится обычно как среднее арифметическое среди произвольной выборки обследуемых и принято за величину, являющуюся статистически достоверной величиной, в конкретном биотопе для разных обследуемых людей (объектов) понятие нормы может быть недостоверно. Поэтому величину нормального количества микроорганизмов искусственно завышают (занижают) для подстраховки врача при принятии решения о программе лечения. Для правильного плана лечения врачу требуется определить встречаемость микроорганизма и определить характерна ли такая встречаемость для конкретного исследуемого организма или она является отклонением от нормы. В настоящее время требуется предложить такой способ, который бы помогал врачу при оценке результатов исследования, что в первую очередь предполагает определение нормального микробного баланса, а для назначения лечения, которое обеспечит наибольшую эффективность и не нарушит этот баланс, требуется привести в норму микробный баланс конкретного организма и осуществить эффективное лечение того или иного заболевания отдельного органа, т.е. привести референтный диапазон для этого организма в норму.

Поскольку количественные колебания в биоценозе могут достигать для некоторых бактерий нескольких порядков и, тем не менее, укладываться в принятые нормативы, необходимо анализировать полученные результаты микробиологического анализа по группам микроорганизмов. Нормальная микробиота обладает достаточно высокой видовой и индивидуальной специфичностью со значимыми различиями отдельных биотопов, но она подчиняется ряду основных закономерностей: она относительно стабильна; образует биопленку; представлена несколькими видами, среди которых выделяют доминантные виды и виды-наполнители; преобладающими являются анаэробные бактерии. Нормальная микробиота характеризуется следующими физиологическими особенностями: некоторые биотопы стабильны по своему составу (резидентная микробиота), а другие - (транзиторная микробиота) постоянно меняются в зависимости от внешних факторов; микроорганизмы, составляющие нормальную микробиоту, образуют четкую морфологическую структуру - биопленку; в состав нормальной микробиоты входят как анаэробные, так и аэробные бактерии, соотношение которых в большинстве биоценозов составляет 10:1-100:1.

Состав микробиоты может меняться в зависимости от: возраста, условий внешней среды, условий труда, рациона питания, перенесенных заболеваний, травм и стрессовых ситуаций, географического места проживания, народности (расы). Результаты проведенного исследования оформляют в виде микробиотограммы с количественной и графической характеристикой каждого исследованного маркера бактерий, вирусов и грибов. Очевидно, что самостоятельный анализ полученных данных в силу их новизны и значительного объема, крайне затруднителен в ходе практической работы лечащего врача. Целью предложенного способа является облегчение использования этих результатов лечащим врачом. В настоящее время при известных способах выделения референтных диапазонов требуется «консультативное заключение», осуществляемое клиническим патологом с оценкой общей микробной нагрузки и преобладающего вида постоянных и транзиторных бактерий, вирусов и грибов, и их сопоставления с клиническими данными. Предложенный способ обеспечивает возможность «видеть» присутствие анаэробной микрофлоры (в т.ч. как норму), которое составляет основной микробный массив (до 60% и более), что ранее в рутинной практике почти не оценивалось. При этом для врача возникает необходимость уточнять пределы количественных показателей в норме и патологии, а также учитывать, оценивать и тщательнее исследовать факторы резистентности микроорганизма, нарушение которых может приводить к заболеванию или неэффективному лечению.

Техническим результатом предложенного изобретения является возможность определения референтного диапазона норм по каждому микроорганизму в конкретном биотопе конкретного объекта.

В контексте данной заявки термины объект, обследуемый, организм, пациент имеют одинаковое значение, так как референтный диапазон может относится как к отдельному органу, отдельному микробному сообществу в субстрате биологического происхождения, так и к организму в целом, например, животному, человеку, растению.

Заявленный технический результат достигается за счет того, что применен способ определения референтных диапазонов показателей микроорганизмов, исследуемых методом хромато масс-спектрометрии, включающий - определение референтного диапазона норм, значение которых вычислено с применением калибровочного шаблона на основе выборки произвольной группы исследуемых объектов, и выбор аутентичных поставленной задаче групп специфических (селективных) ионов в пробах после анализа всех маркеров стандартной базы данных. В частности, выбирают такие группы специфических (селективных) ионов, характеризующие тот или иной маркер микроорганизма, который будет аутентичен поставленной задаче, например, мониторингу лечения конкретного заболевания или определения совокупности микробного сообщества человека, или растения, или исследуемого материала с превалирующей биологической составляющей.

Новым является то, что определяют референтный диапазон норм по каждому микроорганизму в конкретном биотопе конкретного объекта (обследуемого), выведенный по формуле среднеквадратичного отклонения, для чего: полученные показатели проб биологических материалов вычисляют по формуле: корень квадратный из числа, полученного делением квадратичного отклонения совокупности количеств каждого из микроорганизмов, внесенных в таблицу протокола произвольной выборки обследуемых, на количество обследуемых этой выборки без экстремальных значений, (не характерных конкретному биотопу конкретного объекта - обследуемого), определяют встречаемость в конкретном биотопе, рассчитанное как процентное отношение частоты встречаемости при статистической обработке каждого микроорганизма произвольной выборки обследуемых, группируют микроорганизмы по группам «Резидентные» и «Транзиторные» в зависимости от частоты встречаемости микроорганизмов в конкретном биотопе; если встречаемость микроорганизма свыше 50% случаев, то его относят к резидентной группе микроорганизмов, если встречаемость микроорганизма ниже 50% случаев, то его относят к транзиторной группе микроорганизмов. Разделяют микроорганизмы по группам, соответствующим группировке на резидентные и транзиторные, вычисляют суммарную нагрузку по каждому виду микроорганизмов:

- - резидентным микроорганизмам,

- - транзиторным микроорганизмам,

- - анаэробным микроорганизмам,

- - микроскопическим грибам,

- - вирусам,

- вычисляют общую бактериальную или микробную нагрузку.

Вычисляют процентное соотношение резидентных и транзиторных микроорганизмов от общей бактериальной или микробной нагрузки, вычисляют процентное соотношение анаэробных микроорганизмов от общей бактериальной или микробной нагрузки, определяют допустимый интервал отклонений от нормы для конкретного биотопа конкретного обследуемого (объекта) после сравнения допустимого интервала отклонений, рассчитанного без экстремальных значений и допустимого интервала отклонений, рассчитанного по всем значениям выборки допустимого интервала отклонений, рассчитанного с применением калибровочного шаблона по стандартной произвольной выборки обследуемых. Иными словами выявляют стандартные пики, время выхода и их отображение. После чего находят референтный диапазон показателей микроорганизмов исходя из допустимого интервала отклонений от нормы для конкретного обследуемого (объекта). В частном случае для удобства работы с таблицами после разделения микроорганизмов на группы резидентные и транзиторные, их отображают в разных разделах таблицы протокола. Кроме того, могут выделить микроорганизмы в таблице протоколов с помощью окраски. Например, резидентных микроорганизмов цветами красного спектра, а транзиторных микроорганизмов - цветами синего, или голубого спектров. Также могут осуществлять произвольную выборку обследуемых с учетом возраста или расовой группы или региона проживания или режима питания, что важно для ведения пациента во время его лечения или особенностей внешней среды и традиций.

Персонифицировать терапию могут помочь так называемые биомаркеры.

Биомаркеры должны быть тщательно исследованы для точной диагностики болезни и для помощи в разработке таргетной терапии для улучшения результатов заболевания.

Биомаркеры обладают характеристиками, которые могут быть объективно измерены для выявления патологического процесса или констатации нормы, а также ответа организма на терапию или применение новых лекарств. Такие индикаторы используются для ранней диагностики, профилактики и лечения заболеваний.

Биомаркеры могут быть клиническими, имиджевыми (например, те, что используются в процессе магнитно-резонансной томографии) или биохимическими (находятся в крови, спинномозговой жидкости, слюне, моче или на поверхности кожи), как в представленном способе. Такие биомаркеры для персонифицированной медицины позволят определить лекарства, которые подобраны строго по «адресу» микробиоты.

Таким образом, биомаркер - это исследуемый параметр, измерение которого отличается высокой точностью, надежностью и воспроизводимостью, что позволяет отражать напряженность биологических процессов, состояние здоровья, степень риска или факт развития болезни, его стадию и прогноз.

Каждый биомаркер (высшие жирные кислоты, альдегиды и стерины, содержащиеся в составе клеточной стенки или продуктов метаболизма соответствующего микроорганизма) характеризуется специфическими ионами, которые обеспечат необходимое и достаточное количество детектируемых микроорганизмов для исследуемого микробного сообщества в конкретной пробе исходного биологического материала.

В качестве примера определение референтного диапазона норм значений результатов исследований данным методом, применяя калибровочный шаблон на основе произвольной пробы фекалий, который позволяет при анализе всех маркеров стандартной базы данных выбрать такие группы специфических (селективных) ионов, характеризующие тот или иной маркер микроорганизма, который будет аутентичен поставленной задаче, например, мониторингу лечения конкретного заболевания или определения совокупности микробного сообщества человека, или растения, или исследуемого материала с превалирующей биологической составляющей для произвольной группы исследуемых объектов.

Для определения референтных значений (медицинский термин), которые употребляют при оценке результатов лабораторных исследований, определяется как среднее значение конкретного лабораторного показателя, которое было получено при массовом обследовании здорового населения, так и значения для конкретного обследуемого. Однако при использовании разброса показаний по конкретному параметру для конкретного обследуемого требуется использовать среднеквадратичное отклонение значений этого параметра, т.е. рассчитать показатель рассеивания значений случайной величины. Для представленного способа - применен этот вариант оценки полученных значений для субъекта.

В предложенном способе результаты исследований рассматривают в совокупности со всеми характеристиками и показателями пациента, то есть комплексно.

Первым шагом в определении диапазона референтных значений обследуемого выявляется референтное значение норм, значение которых вычислено с применением калибровочного шаблона, а с помощью калибровочного шаблона находят точное местонахождение пика. Предварительно осуществляют выбор аутентичных поставленной задаче групп специфических (селективных) ионов. По полученным хроматограммам и масс-спектрам определяют концентрацию микробных маркеров микроорганизмов в исследуемом биоматериале. С помощью стандартного банка данных маркеров микроорганизмов определяют исследуемые микроорганизмы методом ХМС. Создаются выборки результатов, для этого используют группы населения, например, отбираются люди по выбранному признаку: возраст или принадлежность к расовой группе или региону проживания или режиму питания. Затем группа из этой категории проходит обследования методом хромато масс-спектрометрии (ХМС), получают шаблон со значением норм для расчета. Результаты этих исследований приводят к среднему показателю, и, таким образом, вычисляют диапазон референтных значений (плюс-минус 2 стандартных единицы отклонения от среднего значения), иными словами определяют среднее арифметическое конечного числа обследуемых, т.е. оценивают математическое ожидание.

Специфические ионы определяют до начала анализа для расшифровки хроматограммы, по котрой затем вычисляют площадь пика. Площади пиков берут для расчетов количества микроорганизма в материале. Находят выборку для биоматериала, например, крови, затем формируют таблицу Фиг 1. Далее находят выборки также для других биологических материалов, например, кала, эндометрия, мочи, эякулята, вагинального отделяемого и т.д. Например, если берут выборку для биоматриала, которым является кровь, то выбирают еще и группу обследуемых, например по возрасту.

Поскольку не существует такого понятия, как единый диапазон референтных значений, то при оценке результатов лабораторных исследований врачу необходимо обратиться к диапазону референтных значений конкретного субъекта, и, желательно, чтобы их предоставила лаборатория,

Для этого полученные показатели проб биологических материалов вычисляют по формуле стандартного отклонения по выборке используя программу EXCEL. Показатель равен корень квадратный из числа, полученного делением квадратичного отклонения совокупности количеств каждого из микроорганизмов, внесенных в таблицу протокола произвольной выборки обследуемых, на количество обследуемых, исключив из этой выборки экстремальные значения, которые не характерные конкретному биотопу конкретного объекта.

Иными словами определяют среднеквадратичное отклонение, т.е. рассеивание значений случайной величины относительно ее математического ожидания, что означает квадратный корень из дисперсии случайной величины.

При сравнении этих результатов большее значение среднеквадратического отклонении показывает больший разброс значений в представленном: множестве со среднеарифметической величиной множества; меньшее значение, соответственно, показывает, что значения в множестве сгруппированы вокруг среднего значения,

В общем смысле, определяя среднеквадратическое отклонение для индивида, можно считать, что для него определяют меру неопределенности.

Для определения неопределенности, далее определяют медианное значение для всех параметров конкретного индивида относительно параметров произвольной выборки обследуемых. Иными словами, определяют медиану, т.е. такое число выборки, при котором ровно половина из элементов выборки больше него, а другая половина меньше него. Относительно случайных величин - медианой случайной величины является такое число, при котором соблюдается условие - что вероятность получить значение случайной величины справа от него равна вероятности получить значение слева от него и они обе равны .

При наличии нулевых значений более 40% от количества выборки вводят показатель доверительного интервала для среднего генеральной совокупности с использованием нормального распределения. Уровень значимости статистической зависимости принимается α=0,05. В связи с необходимостью индивидуально рассматривать референтные значения для данных конкретного микроорганизма.

Затем группируют микроорганизмы по группам «Резидентные» и «Транзиторные» в зависимости от частоты встречаемости микроорганизмов в конкретном биотопе. Если встречаемость микроорганизма свыше 50% случаев, то его относят к резидентной группе микроорганизмов, если встречаемость микроорганизма ниже 50% случаев, то его относят к транзиторной: группе микроорганизмов.

Для конкретного индивида важно определить, какое количество значений может выйти за пределы установленного диапазона референтных значений, даже если обследуемый абсолютно здоров.

По статистике выход референтных значений за пределы среднеарифметического значения наблюдается примерно у 5% обследуемых.

Далее разделяют микроорганизмы по соответствующим группам на резидентные и транзиторные, вычисляют суммарную нагрузку по каждому виду микроорганизмов: резидентным микроорганизмам, транзиторным микроорганизмам, анаэробным микроорганизмам, микроскопическим грибам, вирусам и вычисляют общую бактериальную или микробную нагрузку, а затем вычисляют процентное соотношение резидентных и транзиторных микроорганизмов от общей бактериальной нагрузки, применяя формулу деления частного понятия к общему.

Далее - определяют допустимый интервал отклонений от нормы для конкретного биотопа конкретного обследуемого (объекта) после сравнения допустимого интервала отклонений, рассчитанного без экстремальных значений и допустимого интервала отклонений, рассчитанного по всем значениям выборки допустимого интервала отклонений, рассчитанного с применением калибровочного шаблона по стандартной произвольной выборки обследуемых и находят референтный диапазон микроорганизмов для исследований методом ХМС. Среднестатистическое отклонение показывает пределы допустимых отклонений среднего арифметического показателя, т.е. интервал нормы.

Использование предложенного способа обусловлено тем, что:

Во-первых, выход значений за пределы диапазона связан с физиологическими особенностями человеческого организма. Если сдать один и тот же анализ несколько раз в течение суток, есть определенный шанс, что результат будет выходить за референтного диапазона, тем более, если значения показателей приближены к границе. По биологическим причинам изо дня в день показатели могут изменяться. Поэтому предложенный способ может обеспечить диагностические выводы на основании единичных измерений в данный конкретный момент времени суток, года, при конкретном воздействии внешних факторов,, а не требовать определять динамику изменения результатов во времени.

Во- вторых, индивидуальные особенности организма также могут повлиять на результаты. Референтные значения обычно вычисляют путем опытных клинических исследований большого числа людей определенных категорий, затем данные приводят к среднему значению, учитывая средние стандартные отклонения. Это всего лишь данные статистики, а не биологический закон. Поэтому бывает, что у здоровых людей определенные показатели, являющиеся «нормой» для них, что не являются в итоге «нормой» для большинства населения и не попадают в диапазон общепринятых референтных значений.

Способ иллюстрируется примерами, отраженными в таблицах и графиках.

Фиг. 1 - приведены результаты исследований произвольной группы пациентов.

Фиг. 2 - приведены результаты исследований конкретного исследуемого - пациента 32 года. Красным шрифтом выделены резидентные микроорганизмы. Синим шрифтом выделены транзиторные микроорганизмы.

Фиг. 3 - показан пример точечной диаграммы - математического ожидания для показания взаимосвязи показателей микроорганизма Actinomyces в произвольной группе обследуемых. Доверительный интервал показывает пределы допустимых отклонений, выпадающих из конкретной выборки. По нему убирают экстремальные значения, не характерные для конкретного индивидуума.

ПРИМЕР реализации способа.

Первоначально осуществляют произвольную выборку обследуемых по конкретному биотопу с учетом возраста или расовой группы или региона проживания.

В ней отображены показатели после разделения микроорганизмов на группы резидентные и транзиторные в разных разделах таблицы протокола. В таблице протоколов выделены микроорганизмы с помощью окраски шрифта

- - резидентных микроорганизмов цветами красного спектра,

- - транзиторных микроорганизмов - цветами синего, или голубого спектров.

Отчет по вирусной нагрузке для удобства оценки ведется в условных компьютерных единицах и обозначает не количество вирусных тел, а маркерную (химическую) нагрузку.

В данном примере представлен микробном «Энлометрий» конкретного человека, т.е. совокупность микроорганизмов, колонизирующих его внутренние органы, слизистые покровы, к которым относятся не только бактерии, но и микроскопические грибы и вирусы.

На Фиг. 1 приведены результаты исследований произвольной группы пациентов, которые определены при осуществлении следующих действий:

- подобрана выборка,

- выявлены значения, отличные от нуля, для вычисления встречаемости,

- вычислено среднеарифметическое значение,

- вычислено сумма квадратов отклонений данных от среднего,

- выявлены количество значений без экстремальных значений,

- выделен корень квадратный из частного суммы квадратов отклонений на количество значений без экстремальных значений,

- проведено сравнение со стандартным отклонением по выборке, за референтные значения взяты показатели стандартного отклонения от среднего значения по микроорганизму.

На Фиг. 2 приведены результаты исследований конкретного исследуемого - пациента 32 года в соответствии с показателями встречаемости и сгруппрованны резидентные и транзиторные микроорганизмы. В графической части таблицы Фиг 2 показано соотношение в данном конкретном биотопе значений конкретной пробы и нормы в сравнении. Выделены анаэробные бактерии. Вычислено процентное соотношение резидентных и транзиторных микроорганизмов от общей бактериальной нагрузки, процентное соотношение анаэробных микроорганизмов от общей бактериальной нагрузки. Избыток или недостаток микроорганизмов находится за пределами доверительного интервала, что выделено заливкой красного или синего колера соответственно.

Для определения биотопа используют то обстоятельство, что высшие жирные кислоты, альдегиды и стерины в составе клеточной стенки с возможным отнесением их к конкретному микроорганизму, позволяют принять их в качестве маркера этого микроорганизма.

Каждому маркеру соответствует определенное число атомов углерода в цепи молекулы, что в свою очередь, соответствует хроматографическому времени удерживания соответствующего иона, поэтому по селективным ионам возможно определить в конечном итоге микроорганизм исследуемого сообщества, применив формулу реконструкции, (распределения ионов по временным интервалам в программе по методике ХМС для анализа микробных маркеров в пробах биологических жидкостей и тканей человека с указанием детектируемых маркеров и соответствующих им микроорганизмов). Хроматографическое разделение пробы традиционно осуществляют на капиллярной колонке в режиме селективных ионов, или масс-фрагментографии (МФ), на ГХ-МС системе AT-5973 Аджилент Технолоджис (Agilent Technologies Inc.) при периодическом сканировании ионов в интервалах времени. Интервалы времени и ионы выбирают таким образом, чтобы оптимально детектировать маркеры определяемых видов микроорганизмов.

Применение калибровочного шаблона на основе, например, фекалий, позволяет при анализе всех маркеров стандартной базы данных выбрать такие группы специфических (селективных) ионов, характеризующие тот или иной маркер микроорганизма, который будет аутентичен поставленной задаче, например, мониторингу лечения конкретного заболевания или определения совокупности микробного сообщества человека, или растения, или исследуемого материала с превалирующей биологической составляющей.

Под шаблоном понимают естественный набор маркеров микроорганизмов, содержащихся в самих микроорганизмах с конкретными характеристиками этих маркеров, выраженных набором специфических ионов. Причем шаблон для всех исследуемых особей и экологических ниш и биотехнологических продуктов применяется один и тот же. Идентификацию специфического иона осуществляют на основании детектирования пиков хроматограммы маркеров из стандартной (тестовой) базы данных. Далее осуществляют расчет концентрации маркеров методом внутреннего стандарта по известной формуле. Осуществляют серию проб и определяют среднеарифметическое отклонение, что отражено в Таблице (см. Фиг. 1) Под серией проб понимают - пробы конкретного биологического материала, взятые в течение определенного периода времени у N-го количества пациентов.

Предложенный способ позволяет обеспечить наиболее оптимальное определение микробного сообщества, присущее конкретному организму (исследуемому материалу), с учетом его изменения во времени, т.е обеспечить возможность разложения суперпозиции всего пула микробных маркеров, что позволяет оценить вклад от каждого из сотен видов микроорганизмов, присутствующих в исследуемом материале.

Расчет концентрации маркеров отнесение их к конкретным микроорганизмам осуществляют по формулам реконструкции микробного сообщества (см. утвержденную Росздравнадзором Технологию «Оценки микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010); и Осипов, Г.А. Хромато-массспектрометрический анализ микроорганизмов и их сообществ в клинических пробах при инфекциях и дисбиозах. / Химический анализ в медицинской диагностике. - М.: Наука, 2010. - С. 293-368.)

Конечные результаты клинических проб по количественному составу идентифицированных микроорганизмов сопоставляют с нормой содержания его в биологической жидкости или ткани (Jantzen, Bryn 1985; MeNabb et al., 1997; Вейант, 1999). А качественный состав сообщества микроорганизмов, определенный в клинических пробах сопоставляют с качественным (номенклатурным) составам сообщества микроорганизмов, определенных в произвольной пробе фекалий, который использовали для получения калибровочного шаблона системы газовой хроматографии - масс-спектрометрии, оснащенной специальным ПО.

Средние статистические показатели в индивидуальном отражении характеризуются определенным разбросом, особенно выраженным в эндометрии (от 10 до 90 тыс. кл/г × 10⁵ Для полного представления об особенностях микробиоценоза конкретного обследуемого учитывают соотношение соответствующих маркеров резидентных (постоянных) и транзиторных (временных) бактерий.

При оценке общей микробной нагрузки (ОМН) учитывают то, что:

- Минимальные значения снижают вероятность значимости воспаления как причины некоторых патологических состояний.

- Повышенные, наибольшие значения - объективизируют значимость инфекционного фактора при неясной клинической картине заболевания.

Для неспецифических воспалительных процессов возможна оценка преобладающего возбудителя (бактерии, вирусы, грибы) или ассоциации возбудителей и более обоснованного выбора первичной и/или вторичной лечебной тактики.

Поскольку организме человека существует особая структура - микробиота, жители которой заинтересованы в оптимальном состоянии среды обитания и потому старательно участвуют во всех приспособительных и защитных реакциях своего макроскопического покровителя, это тоже воздействует на общую микробную нагрузку.

Это обусловлено тем, что в случае чрезмерно негативного отношения «метрополии» к «микробиотической колонии» ее обитатели могут взбунтоваться и объявить войну своему притеснителю в виде органного дисбиоза или общего бактериального «восстания» (вплоть до развития аутогенного сепсиса), которое в отдельных случаях может быть настолько запредельным, что приведет к уничтожению неразумного хозяина. Проведение исследования методом ХМС произвольно выбранных групп нацелен на всеобщую оценку гомеостаза бактериально-вирусно-грибкового сообщества, обитающего в организме человека не только на протяжении всей его жизни, но и после смерти (за исключением случаев кремирования трупов). В отличие от этого, все остальные методы (бактериальный посев, ПЦР, ИФА и др.) по своей методологической сущности заняты поисками внешних патогенов. Метод ХМС с позиций глобальной оценки биологической сущности человека рассматривает его всесторонние и чаще всего взаимовыгодные отношения с многомиллиардным микробиологическим сообществом, населяющим кожные покровы и слизистые оболочки человеческого организма.

Определяют каждого участника в общей маркерной нагрузке резидентных (постоянных) бактерий и определяют те разновидности бактерий (они разделены в соответсвии алфавитному списку), которые наиболее приспособлены к обитанию в организме конкретного человека и, следовательно, составляют основу биологических пленок, выстилающих поверхность слизистых оболочек. Что и показано на примере - результата исследования микроэкологического статуса методом ХМС - таблица Фиг 2.

На Фиг. 3 показаны крестиками экстремальные значения, выходящие из выборки.

Представленные таблицы (Фиг. 1 и 2) показывают референсный диапазон норм по каждому микроорганизму, выведенный по формуле среднеквадратичного отклонения.

Таким образом, способ позволяет врачу увидеть для конкретного обследуемого «Допустимый интервал отклонений от нормы», который вычисляют по формуле стандартного отклонения по выборке а именно: корень квадратный из числа полученного делением квадратичного отклонения совокупности количеств каждого из микроорганизмов таблиц протоколов произвольной выборки обследуемых на количество обследуемых этой выборки без экстремальных значений; также показывает «Встречаемость в данном биотопе», которая является процентным отображением частоты встречаемости при статистической обработке каждого микроорганизма таблиц протоколов произвольной выборки обследуемых; показывают особый порядок в группировке микроорганизмов по большим группам «Резидентные» и «Транзиторные» в зависимости от частоты встречаемости микроорганизмов в данном биотопе; обладают наглядностью; наличие итоговых математических данные показывают результат вычисления: суммарную нагрузку по резидентным микроорганизмам, транзиторным микроорганизмам, анаэробным микроорганизмам, микроскопическим грибам, вирусам, общую бактериальную нагрузку, а так же процентное соотношение резидентных, транзиторных микроорганизмов, анаэробов от общей бактериальной нагрузки для конкретного обследуемого.

1. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов, исследуемых методом хромато-масс-спектрометрии, включающий определение референтного диапазона норм, значение которых вычислено с применением калибровочного шаблона на основе выборки произвольной группы исследуемых объектов, и выбор аутентичных поставленной задаче групп специфических (селективных) ионов в пробах после анализа всех маркеров стандартной базы данных, отличающийся тем, что определяют референтный диапазон норм по каждому микроорганизму в конкретном биотопе конкретного объекта (обследуемого), выведенный по формуле среднеквадратичного отклонения, для чего полученные показатели проб биологических материалов вычисляют по формуле: корень квадратный из числа, полученного делением квадратичного отклонения совокупности количеств каждого из микроорганизмов, внесенных в таблицу протокола произвольной выборки обследуемых, на количество обследуемых этой выборки без экстремальных значений, определяют встречаемость в конкретном биотопе относительно предварительно рассчитанной как процентное отношение частоты встречаемости при статистической обработке каждого микроорганизма произвольной выборки обследуемых, группируют микроорганизмы по группам «Резидентные» и «Транзиторные» в зависимости от частоты встречаемости микроорганизмов в конкретном биотопе, если встречаемость микроорганизма свыше 50% случаев, то его относят к резидентной группе микроорганизмов, если встречаемость микроорганизма ниже 50% случаев, то его относят к транзиторной группе микроорганизмов, разделяют микроорганизмы по группам, соответствующим группировке на резидентные и транзиторные, вычисляют суммарную нагрузку по каждому виду микроорганизмов: резидентным микроорганизмам, транзиторным микроорганизмам, анаэробным микроорганизмам, микроскопическим грибам, вирусам, вычисляют общую бактериальную или микробную нагрузку, вычисляют процентное соотношение резидентных и транзиторных микроорганизмов от общей бактериальной или микробной нагрузки, вычисляют процентное соотношение анаэробных микроорганизмов от общей бактериальной или микробной нагрузки, определяют допустимый интервал отклонений от нормы для конкретного биотопа конкретного обследуемого (объекта) после сравнения допустимого интервала отклонений, рассчитанного без экстремальных значений, и допустимого интервала отклонений, рассчитанного по всем значениям выборки допустимого интервала отклонений, рассчитанного с применением калибровочного шаблона по стандартной произвольной выборки обследуемых, и находят референтный диапазон для каждой группы микроорганизмов исходя из допустимого интервала отклонений от нормы для конкретного обследуемого.

2. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов по п. 1, отличающийся тем, что отображают после разделения микроорганизмов на группы резидентные и транзиторные в разных разделах таблицы протокола.

3. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов по п. 1, отличающийся тем, что выделяют микроорганизмы в таблице протоколов с помощью окраски резидентных микроорганизмов цветами красного спектра и транзиторных микроорганизмов цветами синего или голубого спектра.

4. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов по п. 1, отличающийся тем, что осуществляют произвольную выборку обследуемых с учетом возраста, или расовой группы, или региона проживания, или режима питания.