Питательная среда для выделения и идентификации неферментирующих бактерий

Изобретение относится к области медицинской микробиологии. Питательная среда для выделения и идентификации неферментирующих бактерий содержит питательный бульон сухой, экстракт кормовых дрожжей для микробиологических питательных сред, Д-глюкозу, Д-галактозу, натрия хлорид, натрий серноватистокислый, железо (III) лимоннокислое водное, натрий углекислый, натрий сернистокислый, феноловый красный, бромтимоловый синий, кальций углекислый, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданных количествах компонентов. Изобретение позволяет дифференцировать неферментирующие бактерии от ферментирующих с одновременной первичной дифференциацией различных представителей бактерий по изменению цвета среды и/или цвета колоний. 3 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано для выделения и идентификации неферментирующих грамотрицательных бактерий (НФБ) из клинического материала: отделяемого ран, мокроты, мочи, кала, с подозрением на загрязнение нормальной микрофлорой.

Неферментирующие грамотрицательные бактерии являются одними из основных возбудителей внутрибольничных инфекций (ВБИ). Частота возникновения обусловленных НФБ внутрибольничных инфекций достигает 15% от всех ВБИ, связанных с аэробными и факультативно-аэробными грамотрицательными бактериями. При этом их видовой состав в последние годы существенно расширился.

Выделение штаммов НФБ на простых питательных средах типа мясо-пептонного агара или кровяного осложнено, поскольку в этих средах сильнее разрастаются культуры Staphylococcus и других сопутствующих бактерий, маскирующих присутствие НФБ, при этом идентификация НФБ на указанных средах также затруднена в связи с малой ферментативной активностью данных штаммов и относительной близостью их морфологических и культуральных признаков.

Для выделения штаммов НФБ, таких, как Pseudomonas aeruginosa, из клинических образцов и для дифференцирования их от других псевдомонад на основании формирования пигмента пиоцианина используют BD Pseudomonas Isolation Agar (агар для выделения псевдомонад. Агар содержит пептон Bacto (источник углерода и азота), противомикробный агент иргазан (Irgasan), избирательно ингибирующий сопутствующие грамположительные и грамотрицательные бактерии, в качестве источника энергии глицерин, способствующий выработке пигмента пиоцианина, а также хлорид магния и сульфат калия, способствующие формированию синего или сине-зеленого пигмента пиоцианина от P. aeruginosa. Данный пигмент диффундирует в среду, окружающую зону роста (Инструкции по применению - готовая к использованию среда в чашках РА-257002.04 Ред.: April 2013 http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=25359)

Для выделения и идентификации НФБ используют также дифференциально-диагностические среды нового поколения - флюорогенные и хромогенные, позволяющие идентифицировать различные микроорганизмы непосредственно в процессе культивирования на питательных средах на этапе первичного посева. Принцип действия указанных сред основан на выявлении высокоспецифичных ферментов у искомых микроорганизмов. В состав этих сред входит хромогенный субстрат - вещество, при расщеплении которого ферментами, специфичными для определенного вида микроорганизмов, образуются окрашенные и/или флюоресцирующие продукты. В результате колонии искомых микроорганизмов и/или среда окрашиваются в определенный цвет, или приобретают способность к флюоресценции при ультрафиолетовом облучении.

Известна основа ХайФлюоро агара для Pseudomonas aeruginosa - HiFluoro Pseudomonas Agar Base (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), предназначенная для селективного выделения и идентификации бактерий P. aeruginosa из клинического материала флюоресцентным методом, в состав которой входит цетримид для подавления роста сопутствующих микроорганизмов и флюорогенная смесь. P. aeruginosa при росте на среде разрушает флюорогенный субстрат, освобождая флюороген, который дает видимую флюоресценцию при ультрафиолетовом облучении (Инструкция по применению: http://art-medika.com/catalog/mikrobiologia/chromo/product-487.html (http://www.himedialabs.ru/m1469).

Известны хромогенные питательные среды, предназначенные для выделения неферментирующих бактерий Burkholderia cepacia из клинических образцов:

- BD Cepacia Medium (Becton Dickinson GmbH Heidelberg/Germany), содержащая источники азота (пептоны, сульфат аммония), фосфаты для поддержания стабильного рН, источник углерода (пируват натрия), факторы роста НФБ (магний, железо), а также ингибиторы для подавления сопутствующей микрофлоры (соли желчных кислот, кристаллический фиолетовый, тикарциллин и полимиксин В), и, в качестве индикатора рН -феноловый красный. В процессе метаболизма пирувата натрия происходит накопление ионов натрия, вызывающих повышение рН, что приводит к изменению цвета среды с желто-оранжевого на розовый или красный вокруг колоний В. cepacia и интенсивно-розовый в областях плотного роста (BD Cepacia Medium BD OFPBL Agar Инструкции по применению - готовая к использованию среда в чашках РА-254481.04 Ред.: Oct 2014: http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=25339):

- BD OFPBL Agar (Becton Dickinson GmbH Heidelberg/Germany), содержит ингибиторы сопутствующих бактерий (бацитрацин - ингибитор грамположительных микроорганизмов и Neisseria, полимиксин В - грамотрицательной микрофлоры), калия гидрофосфат для поддержания стабильного рН, и бромтимоловый синий в качестве индикатора рН. При ферментации лактозы в кислотные продукты, и, соответственно, понижении рН среды индикатор рН бромтимоловый синий изменяет цвет среды с синего на желтый, колонии В. cepacia также будут иметь желтый цвет. При этом в Инструкции по применению среды приведены ограничения применения среды, заключающиеся в том, что на агаре OFPBL возможен рост других микроорганизмов, например В. gladioli, которые внешне похожи на В. cepacia (желтые колонии), и подчеркнуто, что данная среда не должна использоваться в качестве единственной среды для идентификации В. cepacia. (BD Cepacia Medium BD OFPBL Agar Инструкции по применению - готовая к использованию среда в чашках РА-254481.04 Ред.: Oct 2014: www.bd.com/resource.aspx?IDX=25919).

Таким образом, известные питательные среды зарубежного производства, предназначенные для выделения отдельных видов НФБ, не обеспечивают возможности одновременного выделения и идентификации нескольких видов НФБ, особенно при проведении широкомасштабного эпидемиологического мониторинга за ассоциациями штаммов НФБ, циркулирующими внутри стационаров, к тому же являются дорогостоящими.

Известна также отечественная дифференциально-диагностическая среда для выделения неферментирующих грамотрицательных бактерий (SU 1351975), которая содержит селективный агент - 2,3,5-трифенил-тетразолий хлористый и, в качестве индикатора - бромтимоловый синий, и позволяет выделить НФБ из клинического материала и дифференцировать их от ферментирующих сахара энтеробактерий и протеев.

Указанная среда имеет следующий состав:

Данная среда, являясь хромогенной, обеспечивает окраску группы неферментирующих бактерий в бордовый цвет, ферментирующих - в желтый цвет, Proteus mirabilis формирует колонии черного цвета. Но указанная среда не обеспечивает дифференциацию между отдельными представителями неферментирующих бактерий.

Целью предлагаемого изобретения является дифференциально-диагностическая среда, позволяющая проводить дифференциацию неферментирующих бактерий от ферментирующих и, одновременно, первичную дифференциацию разных представителей неферментирующих бактерий по изменению цвета среды и/или колоний бактерий, и содержащая отечественные ингредиенты.

Поставленная задача достигается введением в состав питательной среды двухкомпонентной индикаторной системы (феноловый красный + бромтимоловый синий), обеспечивающей дифференциацию неферментирующих бактерий от ферментирующих и, одновременно, первичную дифференциацию разных представителей НФБ по изменению цвета колоний и характеру роста. Добавление карбоната кальция предотвращает чрезмерное закисление среды продуктами жизнедеятельности бактерий. Среда содержит отечественные ингредиенты.

Предлагаемая питательная среда (МодСИ - Модифицированная Среда с Индикатором) имеет следующий состав:

Способ приготовления питательной среды МодСИ. Для приготовления 1 литра среды навески ингредиентов (питательный бульон сухой, экстракт кормовых дрожжей для микробиологических питательных сред, Д-глюкоза, Д-галактоза, натрия хлорид, натрий серноватистокислый, железо (III) лимоннокислое водное, натрий углекислый, натрий сернистокислый, феноловый красный, бромтимоловый синий, кальций углекислый, агар микробиологический) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят объем до 1 литра, нагревают до кипения до полного растворения ингредиентов; рН среды доводят до 7,5±0,1. Среду МодСИ разливают по флаконам и стерилизуют при 0,5 атм. в течение 30 минут. Готовая среда сиренево-розового цвета, непрозрачная. Перед употреблением флакон со средой расплавляют на кипящей водяной бане и разливают в стерильные чашки Петри по 15-20 мл. Готовые чашки со средой МодСИ хранят при температуре +6 С° в течение недели.

Пример 1. Подбор концентраций индикаторов в составе среды МодСИ Предлагаемая питательная среда МодСИ приготовлена по вышеуказанному способу в 2-х вариантах, отличающихся концентрацией индикаторов: феноловый красный и бромтимоловый синий при добавлении в среду МодСИ использованы в двух концентрациях: по 0,025 г и по 0,05 г.

Вариант 1

Вариант 2

Для определения оптимальных концентраций индикаторов в составе среды использовали следующие тест-штаммы: НФБ - Pseudomonas aeruginosa №453, Burkholderia cepacia № B-7518, Stenotrophomonas maltophilia № B-7520. Указанные тест-штаммы выращивают на скошенном мясо-пептонном агаре (МПА) 24 часа при +37°С, выросшие культуры смывают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия (0,85%), готовят взвесь бактерий по оптическому стандарту мутности 10 ME и титруют до содержания 1000 мт/мл. 0,1 мл полученной взвеси культур высевают сплошным газоном шпателем Дригальского на 2 варианта предлагаемой среды МодСИ. Посевы инкубируют при +37°С в течение 24 час. Эффективность роста бактерий и дифференцирующие свойства 2 вариантов МодСИ определяют по количеству колониеобразующих клеток (КОЕ) и по изменению цвета колоний и характеру роста.

Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, установлены оптимальные концентрации в составе предлагаемой питательной среды МодСИ индикаторов феноловый красный - 0,05 г и бромтимоловый синий - 0,05 г (вариант 2), при которых эффективность роста неферментирующих бактерий составляет 91-97 КОЕ, а дифференцирующие свойства среды обеспечивают различие разных представителей неферментирующих бактерий между собой, в отличие от среды по варианту 1 с концентрацией индикаторов - 0,025 г.

Пример 2. Эффективность роста бактерий (НФБ, грамотрицательных энтеробактерий, стафилококков) на предлагаемой среде МодСИ (в сравнении с дифференциально-диагностической средой по SU 1351975, питательной средой Эндо и желточно-солевым агаром).

При изучении эффективности роста бактерий использовали следующие тест-штаммы: НФБ - Pseudomonas aeruginosa №453, Burkholderia cepacia №B-7518, Stenotrophomonas maltophilia № B-7520; грамотрицательные энтеробактерий - Escherichia coli M-17, Proteus vulgaris №869, Proteus mirabilis №878, Klebsiella pneumoniae №63, Salmonella typhimurium №67, Salmonella enteritidis №2269, Salmonella dublin №1976; грамположительные кокки - Staphylococcus aureus №209-p, Staphylococcus epidermidis №136.

Указанные тест-штаммы выращивают на скошенном мясо-пептонном агаре (МПА) 24 часа при +37°С, выросшие культуры смывают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия (0,85%), готовят взвесь бактерий по оптическому стандарту мутности 10 ME, и титруют до содержания 1000 мт/мл. 0,1 мл полученной взвеси культур высевают сплошным газоном шпателем Дригальского: на предлагаемую среду МодСИ - все тест-штаммы (НФБ, грамотрицательных энтеробактерий, стафилококков); на дифференциально-диагностическую среду по SU 1351975 - тест-штаммы НФБ, грамотрицательных энтеробактерий; на питательную среду Эндо - тест-штаммы грамотрицательных энтеробактерий; на желточно-солевой агар - тест-штаммы стафилококков. Посевы инкубируют при +37°С в течение 24 час. Учитывают количество колониеобразующих клеток (КОЕ), и процент высеваемости на чашках со средой, исходя из количества микробных тел в 1 мл микробной взвеси.

Результаты представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, на предлагаемой питательной среде МодСИ эффективность роста неферментирующих бактерий составила 91-97 КОЕ (91-97%), что сопоставимо с результатами роста НФБ на дифференциально-диагностической среде по SU 1351975 (91-100 КОЕ).

При этом установлена также достаточно высокая эффективность роста на предлагаемой среде грамотрицательных энтеробактерий (КОЕ 91-98) и стафилококков (КОЕ 90-92), соответствующая показателям роста указанных бактерий на элективных, питательных средах (среда Эндо для грамотрицательных энтеробактерий, ЖСА - стафилококков), что позволит использовать МодСИ для выращивания широкого спектра микроорганизмов.

Пример 3 Изучение дифференцирующих свойств предлагаемой питательной среды МодСИ и контрольных сред для неферментирующих бактерий, грамотрицательных энтеробактерий, стафилококков

При изучении дифференцирующих свойств МодСИ использовали следующие тест-штаммы: НФБ - Pseudomonas aeruginosa №453, Burkholderia cepacia № B-7518, Stenotrophomonas maltophilia № B-7520; грамотрицательные энтеробактерий - Escherichia coli M-17, Proteus vulgaris №869, Proteus mirabilis №878, Klebsiella pneumoniae №63, Salmonella typhimurium №67, Salmonella enteritidis №2269, Salmonella dublin №1976; грамположительные кокки - Staphylococcus aureus №209-p, Staphylococcus epidermidis №136. Указанные тест-штаммы выращивают, готовят взвесь, и высевают на чашки с испытуемыми средами, как указано в примере 2.

Данные по изучению дифференцирующих свойств представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 2, на предлагаемой питательной среде МодСИ тест-штаммы НФБ (P.aeruginosa, B.cepacia, S.maltophilia) отличались по цвету колоний и характеру роста как от тест-штаммов других бактерий (грамотрицательных энтеробактерий, стафилококков), так и между собой.

Таким образом, из вышеприведенных таблиц следует, что на предлагаемой среде МодСИ эффективность роста всех микроорганизмов, взятых в качестве тест-штаммов, достаточно высока и сопоставима со средами, предназначенными для выделения и дифференциации соответствующих микроорганизмов (среда Эндо для грамотрицательных энтеробактерий, ЖСА - для стафилококков, дифференциально-диагностическая среда для выделения неферментирующих грамотрицательных бактерий по SU 1351975), что свидетельствует о возможности использования МодСИ для выращивания широкого спектра микроорганизмов.

При оценке дифференцирующих свойств среды МодСИ установлено, что предлагаемая среда позволяет по цвету колоний и характеру роста отличить тест-штаммы НФБ (P.aeruginosa, В.cepacia, S.maltophilia) как от тест-штаммов других бактерий (грамотрицательных энтеробактерий, стафилококков), так и между собой.

Таким образом, предлагаемая питательная среда МодСИ может быть использована для дифференциации неферментирующих бактерий от ферментирующих и, одновременно, первичной дифференциации разных представителей неферментирующих бактерий, по изменению цвета среды и различному цвету колоний, при первичном посеве образцов клинического материала, и, что особенно важно, при эпидемиологическом мониторинге за штаммами НФБ, циркулирующими в стационаре.

Питательная среда для выделения и идентификации неферментирующих бактерий, содержащая питательный бульон сухой, экстракт кормовых дрожжей для микробиологических питательных сред, Д-глюкозу; Д-галактозу, натрия хлорид, натрий серноватистокислый, железо (III) лимоннокислое водное, натрий углекислый, натрий сернистокислый, кальций углекислый, агар микробиологический, дистиллированную воду, в которую дополнительно введены индикаторы феноловый красный и бромтимоловый синий при следующих количествах компонентов:

питательный бульон сухой 20,0 г
экстракт кормовых дрожжей для микробиологических 1,0 г
питательных сред
Д-глюкоза 1,0 г
Д-галактоза 20,0 г
натрия хлорид 5,0 г
натрий серноватистокислый 0,3 г
железо (III) лимоннокислое водное 0,6 г
натрий углекислый 0,5 г
натрий сернистокислый 0,5 г
феноловый красный 0,05 г
бромтимоловый синий 0,05 г
кальций углекислый 5,0 г
агар микробиологический 11,0±2,0 г
дистиллированная вода до 1 л
рН 7,5±0,1



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ выделения бактерий p.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ идентификации бактерий Acinetobacter nosocomialis предусматривает предварительный отбор культуры бактерий для исследования с совокупностью фенотипических признаков комплекса Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii, посев ее в 0,1 мл среды, содержащей мочевину, Na2HPО4, КН2РО4, NaCl, 0,4% водно-щелочной раствор фенолового красного и дистиллированную воду в заданных соотношениях.

Группа изобретений относится к медицинской микробиологии. Предложены питательная среда для выделения и идентификации парагемолитических вибрионов (варианты) и способ получения предложенной среды (варианты).

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм микромицета Trichoderma atrobrunneum, обладающий антибактериальной активностью в отношении Bacillus anthracis, депонирован в ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ F-1434.

Изобретение относится к области аналитической химии и заключается в создании пьезоэлектрического сенсора для определения лекарственных веществ фторхинолонового ряда – левофлоксацина и ципрофлоксацина.

Изобретение относится к клинической и санитарной микробиологии. Питательная среда для выделения клебсиелл содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон мясной, дрожжевой экстракт, мезо-инозит, натрий хлористый, соли желчных кислот, кристаллический фиолетовый, нейтральный красный, натрий углекислый, карбенициллин, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к ускоренному и высокочувствительному способу обнаружения бактериальных патогенов. Раскрыт способ обнаружения бактерий, включающий обеспечение одной или более чем одной суспензии, причем каждая содержит по меньшей мере один вид меченых тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению; добавление образца, подлежащего проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий; фильтрацию полученной реакционной смеси; обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги в концентрате; обнаружение несвязанных бактериофагов в фильтрате; обработку полученных сигналов, сгенерированных в результате обнаружения, и вывод результатов обнаружения пользователю.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ культивирования микроорганизма, выбранного из родов Saccharomyces sensu stricto, Kazachstania, Naumovozyma, Nakaseomyces и Vanderwaltozyma, в присутствии гуанидинобутирата в качестве единственного источника азота, включающий встраивание в указанный микроорганизм молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую гуанидинобутиразу c номером EC 3.5.3.7 и функционально связанную с последовательностями промотора и терминатора, последующее культивирование указанного микроорганизма таким образом, что молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гуанидинобутиразу, экспрессируется в указанном микроорганизме, и культивирование указанного микроорганизма в присутствии гуанидинобутирата в качестве единственного источника азота.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для определения показаний к операции программированной санационной релапаротомии при перитоните.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен биогеосорбент для очистки нефтезагрязненных водных объектов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм бактерий Xanthomonas theicola 6.3, обладающий способностью продуцировать ксантан, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-11268.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения эффективного многофункционального штаммового средства для активации микроорганизмов в канализационных водах.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения питательных сред для культивирования бифидо- и лактобактерий предусматривает получение питательных сред на основе гидролизатов крахмалосодержащего зернового сырья, полученных путем предварительной обработки суспензий возобновляемого крахмалосодержащего зернового сырья в соотношении с водой 1:5 - 1:40 протеолитическими ферментными препаратами в дозировке 0,5 - 4,0% и амилолитическими ферментными препаратами в дозировке 1,0 - 3,0%.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ выделения бактерий p.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ идентификации бактерий Acinetobacter nosocomialis предусматривает предварительный отбор культуры бактерий для исследования с совокупностью фенотипических признаков комплекса Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii, посев ее в 0,1 мл среды, содержащей мочевину, Na2HPО4, КН2РО4, NaCl, 0,4% водно-щелочной раствор фенолового красного и дистиллированную воду в заданных соотношениях.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм бактерий Раеnibacillus jamilae ВКПМ В-13067, используемый как фунгицид и стимулятор клубеньковых бактерий.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения молочной кислоты.

Группа изобретений относится к штамму Streptococcus thermophilus, используемому для получения ферментированного молочного продукта, и ферментированному молочному продукту, содержащему указанный штамм.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан микроорганизм рода Escherichia, обладающий улучшенной способностью продуцировать L-триптофан по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, где активность фосфатазы, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, модифицирована с инактивацией для того, чтобы поддерживать внутриклеточную концентрацию E4P (эритрозо-4-фосфата).

Изобретение относится к области медицинской микробиологии. Питательная среда для выделения и идентификации неферментирующих бактерий содержит питательный бульон сухой, экстракт кормовых дрожжей для микробиологических питательных сред, Д-глюкозу, Д-галактозу, натрия хлорид, натрий серноватистокислый, железо лимоннокислое водное, натрий углекислый, натрий сернистокислый, феноловый красный, бромтимоловый синий, кальций углекислый, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданных количествах компонентов. Изобретение позволяет дифференцировать неферментирующие бактерии от ферментирующих с одновременной первичной дифференциацией различных представителей бактерий по изменению цвета среды иили цвета колоний. 3 табл., 3 пр.

Наверх