Способ диагностики полиморфизма гена nhlrc2, обуславливающего генетический дефект дупликации развития крупного рогатого скота абердин-ангусской породы


C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2715330:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста" (ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам определения полиморфизма гена, ассоциированного с нежелательным рецессивным генетическим дефектом дупликации развития, характерного для крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, а именно гена NHLRC2, ассоциированного с гаплотипом DDC. Способ включает анализ выделенной из биоматериала животных ДНК методом ПЦР, отличающийся тем, что для амплификации фрагмента ДНК области мутации используют олигонуклеотидные праймеры длиной 20 п.н. с температурой плавления 59°С и содержанием гуанина-цитозина 55%, образующие в ходе ПЦР ампликон длиной 404 п.о., который затем подвергают ПДРФ-анализу при помощи фермента BstMW I (эндонуклеазы рестрикции) с сайтом узнавания GCNNNNN↑NNGC (CGNN↓NNNNNCG), разрезающий ПЦР-продукт в случае наличия мутации на два фрагмента ДНК - 320 п.н. и 84 п.о. Способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в гене NHLRC2 крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, ассоциированного с гаплотипом носителя генетического дефекта дупликации развития (DD), с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота в племенных и товарных хозяйствах отрасли мясного скотоводства. 1 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма гена NHLRC2, обуславливающего рецессивный генетический дефект крупного рогатого скота абердин-ангусской породы дупликации развития (DD), и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота.

Одной из задач Государственной программы развития сельского хозяйства на 2013-2020 годы является развитие мясного скотоводства. Важнейшую роль в процессе ускоренного развития этой отрасли играет практически заново сформированная племенная база за счет использования лучших племенных ресурсов [Государственная программа развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013-2020 годы. Утверждена Постановлением Правительства Российской Федерации от 14 июля 2012 г. №717, с. 66.], что, отчасти, достигается импортом племенного материала крупного рогатого скота мясного направления продуктивности из-за рубежа.

Однако, практически у всех мясных пород зарубежной селекции были выявлены генетические дефекты, проявление которых вместо ожидаемой пользы может нанести серьезный экономический ущерб [Gholap P.N., Kale D.S. and Sirothia A.R. Genetic Diseases in Cattle: A Review. Research Journal of Animal, Veterinary and Fishery Sciences. 2014; 2(2): 24-33].

Одним из нежелательных генетических дефектов крупного рогатого скота является дупликация развития (Developmental duplication, DD). Нежелательный гаплотип был картирован на хромосоме 26 [OMIA, Online Mendelian Inheritance in Animals // URL: http://omia.org/OMIA002103/9913/ (дата обращения 07.02.2017)].

Причиной DD является точковая мутация - замена тимина на цитозин в позиции 34618072 (g.34618072T>C) во втором гене, содержащем повторы NHL, в результате которой происходит замена аминокислоты валин на аланин в кодируемом белке (OMIA 002103-9913) [Beever, J.E., Marron, В.М., Parnell, P.F., Teseling, C.F., Steffen, D.J., Denholm, L.J.: Developmental Duplications (DD): 1. Elucidation of the underlying molecular genetic basis of polymelia phenotypes in Angus cattle. Proc. XXVIII World Buiatrics Congress, Cairns Australia: Abstract 0106, 2014; http://omia.org/OMIA002103/9913/].

Основным признаком заболевания является появление телят с большим, чем в норме, количеством отдельных частей тела (чаще всего дополнительных конечностей). Существует ряд фенотипов, связанных с этой болезнью, которые классифицируются в соответствии с точкой прикрепления дополнительной конечности к телу. Общим является только то, что все они представлены дополнительными тканями организма. Больные животные могут быть рождены с дополнительной конечностью (конечностями), лишними лоскутами кожи на голове или как «двухголовые» телята [L. Denholm, 2011. Developmental duplications (DD) in Angus calves [Электронный ресурс] URL: http://www.flockandherd.net.au/cattle/reader/developmental-duplication-angus.html]. За исключением смертности, связанной с трудными отелами, эти телята часто могут успешно развиваться, особенно если экстраконечности были удалены хирургически [М. McClure, J. McClure. Genetic Disease and Trait Information for IDB Genotyped Animals in Ireland. 2016]. Заболевание наследуется по простому рецессивному типу наследования с неполной пенетрантностью. Т.е. не все гомозиготные животные будут проявлять видимые деформации. Пенетрантность фенотипа DD оценивается значением 54%, при этом 46% от ожидаемого числа гомозигот визуально нормальные особи, несмотря на то, что некоторые из этих животных, вероятно, имеют субклинические поражения, характерные для DD и развивают клинические признаки в более позднее время.

Анализ коров и быков, зарегистрированных в Американской ассоциации абердин-ангусской породы, проведенный по данным 2008-2017 гг., показал, что за рубежом частота встречаемости животных-носителей дефекта дупликации развития довольно высока и составляет 20,4% [Konovalova E.N., Gladyr' Е.А., Kostiunina O.V., Zinovieva N.A. Congenital defects of beef cattle breeds and general principles of their prevention. Journal of Agriculture and Environment, 2017, p. 3].

Ряд зарубежных лабораторий осуществляет диагностику порока дупликации развития крупного рогатого скота абердин-ангусской породы путем анализа ДНК методом ПЦР (Лаборатория генетики животных в Школе ветеринарии Университета Квинсленда, Корпорация Neogen (GeneSeek), Линкольн, Небраска и Zoetis Inc.) [http://omia.org/OMIA002103/9913/]. Однако, описание используемых ими методов в доступных источниках не обнаружено.

При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа обнаружения дефектного аллеля в гене NHLRC2, ассоциированного с гаплотипом DDC, с целью идентификации скрытых носителей DD и разработки программ их использования в селекции без риска получения больных телят.

Задача нашего изобретения - создание простого, не требующего использования дорогостоящего оборудования, специфичного способа идентификации полиморфизма в гене NHLRC2, ассоциированного с гаплотипом DDC, для использования в селекции крупного рогатого скота.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ диагностики полиморфизма гена NHLRC2, обуславливающего нежелательный генетический дефект дупликации развития крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, включающий анализ выделенной из биоматериала животных (кожа, кровь, сперма, молоко и пр.) ДНК методом ПЦР, отличающийся тем, что для амплификации фрагмента ДНК области мутации используют олигонуклеотидные праймеры длиной 20 п.н. с температурой плавления 59°С и содержанием гуанина-цитозина 55%, образующие в ходе ПЦР ампликон длиной 404 п.о., который затем подвергают ПДРФ-анализу при помощи фермента BstMW I (эндонуклеазы рестрикции) с сайтом узнавания GCNNNNN↑NNGC (CGNN↓NNNNNCG), разрезающий ПЦР-продукт в случае наличия мутации на два фрагмента ДНК - 320 п.н. и 84 п.о., а при электрофорезе в агарозном геле у животных-носителей мутации визуализируют два фрагмента ДНК 404 п.о. и 320 п.о., фрагмент длиной 84 п.о. - невидим, в случае отсутствия мутации ПЦР-продукт не разрезается и на электрофорезе наблюдают один фрагмент длиной 404 п.о.

Данный подход имеет следующие преимущества: 1) отсутствие различий между праймерами в температуре плавления и содержании гуанина-цитозина позволяют легче оптимизировать температурно-временные условия ПЦР; 2) длина фрагментов ДНК, получаемых в ходе ПЦР и ПДРФ анализа оптимальна для визуализации их в агарозном геле; 3) использование эндонуклеазы рестрикции обуславливает высокую специфичность метода.

Принцип действия разрабатываемого способа основан на использовании метода ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Разрабатываемый способ базируется на определении точковой мутации во втором гене, содержащем повторы NHL (NHLRC2), в ходе которой происходит замена тимина на цитозин в позиции 34618072 (g.34618072T>C). С этой целью был выбран участок гена NHLRC2 крупного рогатого скота внутри точковой мутации и за ее пределами.

Для создания серии референтных образцов с известными генотипами по гену NHLRC2 (n=60) были использованы образцы ткани (ушной вышип) быков и коров абердин-ангусской породы. ДНК выделяли при помощи набора реагентов «ДНК-Экстран-1» (ЗАО «Синтол», Россия) согласно инструкции. Создание серии референтных генотипов проводили посредством использования разработанного способа. С этой целью проводили амплификацию фрагментов длиной 404 п.о. Путем дальнейшего ПДРФ-анализа получали следующие фрагменты ДНК: 404 п.о., характерного для здорового аллеля, 320 п.о. - характерный для мутантного аллеля и 86 п.о. - характерный для мутантного аллеля.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - теоретическая модель тест-системы определения гаплотипа DDC на основе метода ПЦР-ПДРФ (А) и результаты генотипирования образцов (Б).

В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n=60), в том числе 5 образцов с генотипом DDC (носитель DD) и 55 образцов с генотипом DDF (не носитель).

Определение полиморфизма гена предложенным способом выполняли следующим образом:

1. Исходя из локализации SNP были подобраны два праймера -смысловой и антисмысловой, одинаковые по температуре плавления (59°С) и GC-содержанию (55%).

DDI - 5'-AGA GGC ATG ATG AAG GCG AG

DD3 - 5'-CCA AGG GGA ACT AAT GGG CT

Продукт амплификации праймеров DD1 и DD3 характерен для «здорового» аллеля и имеет длину 404 п.о. Участок мутации помечен звездочкой. Фиг. 1А иллюстрирует описанный выше вариант настоящего изобретения.

2. Выполняли 37 циклов ПЦР в 15 мкл реакционной смеси следующего состава: 1×ПЦР буфер (16.6 мМ (NH4)2SO4, 67.7 мМ Трис HCl, рН=8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl2), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 95°С - 3 мин, 35 циклов последовательно - 95°С - 0,75 мин, 61°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 4 мин;

3. В ходе ПДРФ-анализа полученный ПЦР-продукт подвергался воздействию эндонуклеазы рестрикции BstMW I с сайтом узнавания GCNNNNN↑NNGC (CGNN↓NNNNNCG) (где N обозначает аденин, гуанин, цитозин или тимин) при температуре 55°С в течение 12 ч, и при наличии мутации происходило его разрезание на два фрагмента ДНК: 320 п.о., видимый на электрофореграмме и 86 п.о. - невозможно визуализировать вследствие малого размера при данных условиях электрофореза.

4. Определение аллелей DDC и DDF гена NHLRC2 осуществляли методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 2% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1× ТАЕ буфере 25 мин при 110 В и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ). При этом генотипу DDF (не носителю DD) соответствует фрагмент длиной 404 п.о., генотипу DDC (носителю DD) - два фрагмента длиной 404 и 320 п.о. и генотипу DDI (не встречался) - фрагмент длиной 320 п.о. (Фиг. 1Б). Длины фрагментов сравнивали в сопоставлении с М - маркером длины 100 п.о. (500×2), Биосан, Россия;

5. Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.

Пример. Контрольное использование предложенного способа определения полиморфизма гена NHLRC2 было апробировано на выборке племенного поголовья крупного рогатого скота абердин-ангусской (n=1253 голов, четыре популяции) породы, разводимой в различных регионах Российской Федерации. Исследование выявило наличие 98 животных с генотипом DDC (носители DD). Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся скрытыми носителями точковой мутации в гене NHLRC2, ассоциированной с гаплотипом DDC.

Положительный результат изобретения заключается в том, что с применением технически простых методов, не требующих использования дорогостоящих реактивов, оборудования, больших затрат сил и времени, возможно выявление мутантного аллеля DDC гена NHLRC2, что позволит применить данный метод в селекции животных.

Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в гене NHLRC2 крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, ассоциированного с гаплотипом DDC, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота в племенных и товарных хозяйствах отрасли мясного скотоводства.

Способ диагностики полиморфизма g.34618072T>C гена NHLRC2, обуславливающего нежелательный генетический дефект дупликации развития крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, включающий анализ выделенной из биоматериала животных (кожа, кровь, сперма, молоко и пр.) ДНК методом ПЦР, отличающийся тем, что для амплификации фрагмента ДНК области мутации используют олигонуклеотидные праймеры DD1 - 5'-AGA GGC ATG ATG AAG GCG AG и DD3 - 5'-CCA AGG GGA ACT AAT GGG CT длиной по 20 п.н. с температурой плавления 59°С и содержанием гуанина-цитозина 55%, образующие в ходе ПЦР ампликон длиной 404 п.о., который затем подвергают ПДРФ-анализу в течение 12 ч при температуре 55°С при помощи фермента (эндонуклеазы рестрикции) BstMW I из расчета 1 е.а. фермента на пробу с сайтом узнавания GCNNNNN↑NNGC (CGNN↓NNNNNCG), разрезающий ПЦР-продукт в случае наличия мутации на два фрагмента ДНК - 320 п.н. и 84 п.о., а при электрофорезе в агарозном геле у животных-носителей мутации визуализируют три фрагмента ДНК 404, 320 и 84 п.о., в случае отсутствия мутации ПЦР-продукт не разрезается и на электрофорезе наблюдают один фрагмент длиной 404 п.о.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и связано с диагностикой и лечением злокачественных опухолей, а конкретно, со способом диагностики наличия метастазов злокачественной опухоли путем детектирования в плазме Hsp90α, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в качестве опухолевого маркера.

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, онкологии и реабилитологии. Предложен способ прогнозирования развития антрациклин-индуцированной кардиотоксичности после полихимиотерапии антибиотиками антрациклинового ряда у пациенток с раком молочной железы.

Изобретение относится к области медицины, в частности к дерматологии, и предназначено для прогнозирования риска возникновения кожной патологии в виде меланоза или дисхромии, ассоциированной с избыточной контаминацией мышьяком.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оптимизации крупномасштабной продукции парвовируса в существенно бессывороточной среде. Описан способ оптимизации продукции парвовируса, включающий существенно бессывороточную среду, которая позволяет увеличить продукцию парвовируса по сравнению со стандартной средой, предпочтительно для продукции H-1PV.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана система CRISPR класса 2, содержащая: (i) единичный полинуклеотид, содержащий (a) нацеленную на мишень область, содержащую дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК); и (b) активирующую область, смежную с указанной нацеленной на мишень областью, содержащую ДНК; и где указанная активирующая область содержит стебель и выпетливание и способна взаимодействовать с белком Cas9; и (ii) Cas9.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая применение тест-системы для изготовления набора для обнаружения и определения характеристики вируса гриппа типа «А» или типа «В», диагностическую тест-систему для обнаружения и определения характеристики вируса гриппа типа «А» или типа «В», набор для обнаружения и определения характеристики вируса гриппа типа «А» или типа «В».

Настоящее изобретение относится к системе анализа, выполненной с возможностью осуществления операций в отношении анализируемого вещества, которое может вступать в соединение с несколькими реактивами до введения в проточную кювету.

Изобретение относится к вариантам системы и способу для селективного сбора стоков. Система содержит проточную ячейку, через которую в ходе операции генетического секвенирования прокачивают множество реагентов; сточную линию, которая в ходе операции отводит использованный реагент; клапан использованного реагента для приема использованного реагента из сточной линии, выполненный с возможностью управления для выбора одного из множества сливных каналов для использованного реагента; и управляющую схему, соединенную с клапаном использованного реагента и в ходе операции управляющую этим клапаном использованного реагента для выбора одного из сливных каналов, требуемого в зависимости от того, какой реагент прокачивается через проточную ячейку.

Настоящее изобретение относится к способу, который, под контролем схемы управления, реализующей протокол смешивания, предусматривает всасывание реактивов из нескольких различных резервуаров для реактивов в накопительный канал.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности описан основанный на применении микровезикул способ обнаружения некротического энтерита птиц, а также новые маркеры, которые идентифицированы в качестве приемлемых для обнаружения некротического энтерита птиц и/или заражения птиц Clostridium perfringens.

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыты синтетические олигонуклеотиды для выявления ДНК вируса Torque teno virus рода Alphatorquevirus семейства Anelloviridae.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен способ количественной оценки жизнеспособных бактерий в лекарственной субстанции для терапии для восстановления микробиоты (MRT), на основе количественной полимеразной цепной реакции (qПЦР).

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен способ определения изменения в иммунном репертуаре субъекта, включающий стадии количественного измерения клонотипов иммунных клеток в популяции или субпопуляции иммунных клеток в первом образце и втором образце, забранных у одного пациента, где клонотипы иммунных клеток количественно измеряют с использованием экстрагирования полинуклеотидов, arm-ПЦР и секвенирования следующего поколения, расчета данных по частоте для первого образца и второго образца посредством идентификации частоты каждого клонотипа, нормирования данных по частоте для первого образца и второго образца, определения абсолютного различия в частоте каждого клонотипа, присутствующего в первом образце и втором образце, и определения общих клонотипов для первого образца и второго образца с наибольшим изменением частоты.

Изобретение относится к биотехнологии и связано с диагностикой и лечением злокачественных опухолей, а конкретно, со способом диагностики наличия метастазов злокачественной опухоли путем детектирования в плазме Hsp90α, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в качестве опухолевого маркера.

Изобретение относится к биотехнологии и связано с диагностикой и лечением злокачественных опухолей, а конкретно, со способом диагностики наличия метастазов злокачественной опухоли путем детектирования в плазме Hsp90α, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в качестве опухолевого маркера.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено устройство для автоматического выделения и очистки нуклеиновых кислот из биологических образцов.

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, онкологии и реабилитологии. Предложен способ прогнозирования развития антрациклин-индуцированной кардиотоксичности после полихимиотерапии антибиотиками антрациклинового ряда у пациенток с раком молочной железы.

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, онкологии и реабилитологии. Предложен способ прогнозирования развития антрациклин-индуцированной кардиотоксичности после полихимиотерапии антибиотиками антрациклинового ряда у пациенток с раком молочной железы.

Изобретение относится к области медицины, в частности к дерматологии, и предназначено для прогнозирования риска возникновения кожной патологии в виде меланоза или дисхромии, ассоциированной с избыточной контаминацией мышьяком.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к методам определения видовой принадлежности мяса с помощью полимеразной цепной реакции. Выделяют ДНК из ткани птиц семейства дятловых (Picidae).

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыты синтетические олигонуклеотиды для выявления ДНК вируса Torque teno virus рода Alphatorquevirus семейства Anelloviridae.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам определения полиморфизма гена, ассоциированного с нежелательным рецессивным генетическим дефектом дупликации развития, характерного для крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, а именно гена NHLRC2, ассоциированного с гаплотипом DDC. Способ включает анализ выделенной из биоматериала животных ДНК методом ПЦР, отличающийся тем, что для амплификации фрагмента ДНК области мутации используют олигонуклеотидные праймеры длиной 20 п.н. с температурой плавления 59°С и содержанием гуанина-цитозина 55, образующие в ходе ПЦР ампликон длиной 404 п.о., который затем подвергают ПДРФ-анализу при помощи фермента BstMW I с сайтом узнавания GCNNNNN↑NNGC, разрезающий ПЦР-продукт в случае наличия мутации на два фрагмента ДНК - 320 п.н. и 84 п.о. Способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в гене NHLRC2 крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, ассоциированного с гаплотипом носителя генетического дефекта дупликации развития, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота в племенных и товарных хозяйствах отрасли мясного скотоводства. 1 ил., 1 пр.

Наверх