Производные, применяемые для лечения мышечной атрофии

Изобретение относится к применению производного общей формулы I

где R¹ и R² независимо друг от друга представляют собой водород, n представляет собой целое число между 1 и 2, R³ представляет собой группу -OH или группу -O(C₁-C₆ алкил), R⁴ представляет собой C₁-C₆ алкильную группу, R⁵ и R⁶ представляют собой независимо друг от друга атом галогена, или его фармацевтически приемлемой соли в качестве лекарственного средства для лечения и/или предотвращения мышечной атрофии у млекопитающих, и/или для ограничения мышечной атрофии у млекопитающих, и/или для стимуляции мышечного роста у тренирующихся млекопитающих, стремящихся увеличить массу и качество мышц, предотвращая появление симптомов саркопении, связанных с возрастом или реабилитацией после потери мышц, возрастной мышечной атрофии и/или последствий лекарственного лечения, и/или иммобилизации, и/или кахексии. 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

 

Данное изобретение относится к производным, применяемым для лечения заболеваний, связанных с мышечной атрофией.

Область техники

На сегодняшний день существует очевидный недостаток в новых способах лечения, которые задерживают начало и развитие возрастных расстройств и заболеваний, которые сопровождаются уменьшением мышечной силы или мощи, таких как саркопения, при этом проблемы с подвижностью, связанные со старением, являются очень серьезными проблемами с далеко идущими последствиями для здоровья.

Пожилые люди с определенными расстройствами или нарушениями обмена веществ чаще всего сталкиваются с потерей мышечной массы тела вследствие, по меньшей мере частично, снижения синтеза мышечного белка (такого как саркопения), уменьшения потребления пищи или наличия воспаления. Известно, что уменьшение мышечной массы тела связано с усталостью, пониженной способностью выполнять задачи, необходимые для повседневной жизни, повышенным риском переломов костей, увеличением падений и госпитализаций, нарушенными метаболизмом (толерантностью к глюкозе, чувствительностью к инсулину) и когнитивной способностью, а также пониженным качеством жизни (Frontera WR et al., 1991, Baumgartner et al., 1998, Lloyd BD et al., 2009). В отличие от кахексии пациенты с саркопенией могут иметь стабильный вес, но демонстрировать четкую потерю мышечной массы, пока в то же самое время масса жировой ткани обычно увеличивается.

Многие факторы влияют на уменьшение мышечной массы. В основном наблюдается анаболическая резистентность скелетной мышцы к синтезу белка, как видно из иммобилизации, которая может быть улучшена по меньшей мере частично упражнением с сопротивлением и пищевой добавкой (Farnfield MM et al. 2012). Также было показано, что потеря иннервации и окислительное повреждение могут играть важную роль (Chai RJ et al., 2011, ED et al., 2010) и приводить к мышечной атрофии, включая разные пути клеточной сигнализации, в то же время приводя к запрограммированной гибели клеток (апоптозу), повышенному разрушению белка или даже уменьшенной активации клеток, отвечающих за мышечную регенерацию. Следовательно, саркопения является результатом дисбаланса между разрушением белков и их синтезом, когда точный вклад каждого из упомянутых выше факторов изменяется в зависимости от модели или изучаемого случая. Некоторые протеолитические системы были описаны как участвующие в разрушении мышц, такие как активируемые кальцием протеазы, такие как кальпаин и каспазы; убиквитин-протеасомная система (Hasselgren РО et al., 2002, Purintrapiban J et al., 2003). Среди разных мишеней, определенных в ходе разработки саркопении, было обнаружено, что атрогин-1 (также известный как MAFbx) и MURF-1 были повышены, и Akt/mTOR/S6K понижен.

Аутокринный вырабатываемый миостатин, вырабатываемый самими мышцами, также является особо важным фактором, поскольку этот белок действует, и стимулируя протеолиз, и ингибируя синтез белка. В то время как старение сопровождается значительными гормональными изменениями, наблюдается повышенная секреция миостатина ( et al., 2008), экспрессия которого в мышцах взрослого человека увеличивается со степенью атрофии. Миостатин, также известный как фактор роста и дифференцировки-8 (GDF-8, от англ. "growth and differentiation factor-8"), обладает всеми структурными особенностями, свойственными белкам семейства трансформирующего фактора роста бета (TGF-β, от англ. "transforming growth factor-beta"): гидрофобный аминоконцевой, который действует как секреторный сигнал, девять неизменяющихся цистеиновых остатков, и сайт протеолитического процессинга фурина, "RXXR". Протеолитическое расщепление белка приводит к С-концевому домену, который образует гомодимер, который является биологически активной формой миостатина (Thies et al., 2001). Выравнивания аминокислотной последовательности миостатина многочисленных видов позвоночных указывает на то, что белок является высококонсервативным (100% идентичности) между людьми, обезьянами, коровами, собаками, мышами, крысами, индюками и курицами (McPherron et al., 1997). Его экспрессия ограничена в первую очередь скелетной мышцей и жировой тканью, где он играет роль отрицательного регулятора развития скелетных мышц (Lee LS, 2010, 10:183-194).

Было показано, что мыши и крупный рогатый скот, которые генетически испытывают дефицит в миостатине, демонстрируют впечатляющие увеличения скелетной мышечной массы, таким образом подтверждая роль миостатина в подавлении мышечного роста (Wolfman et al., 2003). У некоторых бычьих пород мышечная гипертрофия происходит из-за миссенс-мутации в третьем экзоне бычьего гена миостатина (Bass et al., 1999), которая сопровождается увеличением как числа клеток или гиперпластическим ростом, так и размером клеток или гипертрофическим ростом, что в результате приводит к большим и тяжелым мышечным волокнам.

Также увеличенная скелетная мышечная масса и сила связаны с метаболическими адаптациями, которые положительно влияют на состав тела, расход энергии, гомеостаз глюкозы и потребности в инсулине. Фармакологические и генетические данные указывают на то, что миостатин регулирует энергетический метаболизм, и что его ингибирование может значительно понизить развитие нарушений обмена веществ, таких как ожирение и диабет. Например, мыши с генетическим дефицитом миостатина имеют небольшое накопление жировых отложений на теле (McPherron et al., 2002) по сравнению с мышами дикого типа того же возраста, связанное со снижением числа и размера адипоцитов, что таким образом демонстрирует важную роль миостатина в адипогенезе и миогенезе.

Современные экспериментальные способы лечения саркопении основываются на диетологических подходах, физической нагрузке, применении стимуляторов аппетита или анаболических соединений, таких как тестостерон, но эффекты от этих способов лечения неудовлетворительны (Morley et al., 2007) и могут вызывать побочные эффекты.

Данное изобретение относится к производным и фармацевтическим композициям, включающим их, для применения в лечении и/или предотвращении мышечной атрофии у млекопитающих.

Подробное описание изобретения

Следовательно, данное изобретение относится к производным следующей общей формулы I:

,

где:

R¹ и R² независимо друг от друга представляют собой водород или (С₁-С₆) алкил, предпочтительно метил;

n представляет собой целое число между 1 и 2, предпочтительно n равен 1;

R³ представляет собой

- группу -ОН;

- группу -O(С₁-С₆ алкил), предпочтительно -OEt или -OiPr;

группу -О(С₃-С₆ циклоалкил), предпочтительно -О-циклопентил;

группу -О(С₃-С₇ гетероциклический), предпочтительно -О-тетрагидропиран-4-ил;

-О-гетероарильную группу, предпочтительно -О-пиридил;

-О-арильную группу, предпочтительно -О-фенил;

-O(С₁-С₆ алкил) арильную группу, предпочтительно -О-бензил;

- группу -NR⁷R⁸, в которой

R⁷ представляет собой атом водорода или С₁С₆ алкильную группу, и R⁸ представляет собой

- атом водорода;

- гетероарильную группу, предпочтительно содержащую один или более атомов азота, в частности пиридазинильную группу или пиридильную группу;

- C₁-C₆ алкильную группу, предпочтительно этильную группу, необязательно замещенную группой -NR⁹R¹⁰, в которой R⁹ и R¹⁰ представляют собой независимо друг от друга атом водорода или C₁-С₆ алкильную группу, предпочтительно метильную группу;

- C₁-C₆ алкильную группу, предпочтительно этильную группу, необязательно замещенную группой -OR¹¹, в которой R¹¹ представляет собой атом водорода или C₁-C₆ алкильную группу, предпочтительно метильную группу;

или R⁷ и R⁸ образуют с атомом азота гетероцикл, в частности пирролидин, пиперидин, морфолин, пиперазин, причем гетероцикл необязательно замещен С₁-С₆ алкильной группой, предпочтительно метильной группой, в частности R⁷ и R⁸ образуют метилпиперазинил;

R⁴ представляет собой атом водорода или C₁-C₆ алкильную группу, в частности -Me или -Et, конкретнее -Et;

R⁵ и R⁶ представляют собой независимо друг от друга водород, атом галогена, предпочтительно Cl, или группу, выбранную из:

группы -CN;

группы -ОН;

группы -O(С₁-С₆ алкил), предпочтительно -ОМе, алкильная группа необязательно замещена одним или более чем одним атомом галогена, предпочтительно F, такой как, например -OCF₃ или -OCHF₂;

С₁-С₆ алкильной группы, предпочтительно метильной, необязательно замещенной одним или более чем одним атомом галогена, предпочтительно F, такой как, например -CF₃, группы -O(С₃-С₆ циклоалкил), предпочтительно О-циклопропил;

или их энантиомеру, диастереомеру, гидрату, сольвату, таутомеру, рацемической смеси или фармацевтически приемлемой соли

для применения в качестве лекарственного средства для лечения и/или предотвращения мышечной атрофии у млекопитающих, и/или для ограничения мышечной атрофии у млекопитающих, и/или для содействия улучшению мышц млекопитающих, минимум у млекопитающих, которые тренируются и стремятся увеличить массу и качество мышц, предотвращая появление возрастных симптомов саркопении или реабилитации после потери мышц,

мышечной атрофии, которая связана с возрастом и/или последствиями лекарственного лечения, и/или иммобилизацией, и/или кахексией.

В частности мышечная атрофия является возрастной, такой как пресаркопения, саркопения или тяжелая саркопения. Мышечная атрофия также может быть связана с последствиями лекарственного лечения, такого как лечение рака. Мышечная атрофия также может быть связана с иммобилизацией, в частности независимо от причины, например из-за возрастной слабости, аварии или операции, такой как протезирование колена или бедра. Наконец, мышечная атрофия может быть связана с кахексией, в частности по любой причине, например из-за нервной анорексии, рака, сердечной недостаточности, печеночной недостаточности, почечной недостаточности, туберкулеза или синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).

А именно, млекопитающее может представлять собой животного или человека, предпочтительно представлять собой человека.

Согласно данному изобретению, производные формулы (I) таким образом обладают активностью для лечения и/или предотвращения мышечной атрофии, в частности возрастной мышечной атрофии, такой как пресаркопения, саркопения или тяжелая саркопения, и/или связанной с последствиями лекарственного лечения, такого как лечение рака, и/или связанной с иммобилизацией, в частности по любой причине, такой как, например слабость, связанная с возрастом, авария, хирургическая операция, такая как установка протеза колена или бедра, кахексией, и, в общем, патологиями, связанными с мышечной атрофией у млекопитающих.

Производные формулы (I) также применяются для стимуляции мышечного роста у млекопитающих, особенно людей, тренирующихся и стремящихся увеличить массу и качество мышц, например, предотвращая появление симптомов саркопении, связанных с возрастом.

Изобретатели обнаружили, что производные по данному изобретению позволяют ингибировать экспрессию гена миостатина, увеличивать синтез белка в мышечных клетках и/или увеличивать диаметр мышечных трубочек в клетках С2С12.

Кроме того, данное изобретение относится к применению производного формулы (I) по изобретению, как определено выше, для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предотвращения мышечной атрофии у млекопитающих, и/или ограничения мышечной атрофии у млекопитающих, и/или стимуляции мышечного роста у млекопитающих, которые тренируются и стремятся увеличить массу и качество мышц, чтобы предотвратить появление симптомов саркопении, связанных с возрастом или реабилитацией после потери мышц.

Также изобретение относится к способу лечения и/или предотвращения, и/или профилактического лечения, и/или замедления начала мышечной атрофии у млекопитающих, и/или ограничения мышечной атрофии у млекопитающих, и/или стимуляции мышечного роста у млекопитающих, которые тренируются и стремятся увеличить массу и качество мышц, предотвращая появление возрастных симптомов саркопении или реабилитации после потери мышц, согласно которому вводят эффективное количество производного формулы (I) по изобретению объекту, нуждающемуся в этом.

Эффективное количество будет подобрано в соответствии с природой и тяжестью подвергаемой лечению патологии, способом введения и также весом и возрастом объекта. В общем, единица дозировки будет изменяться от 0,5 мг до 2000 мг в день, за одну или более доз, предпочтительно от 1 до 1000 мг, когда объектом является человек.

В предпочтительном воплощении производные формулы (I), применяемые в рамках данного изобретения, являются такими, что R⁴ представляет собой - (С₁-С₆) алкильную группу, предпочтительно -Et.

В другом предпочтительном воплощении производные формулы (I), применяемые в рамках данного изобретения, являются такими, что n равен 1.

В еще другом предпочтительном воплощении производные формулы (I), применяемые в рамках настоящего изобретения, являются такими, что группы R⁵ и/или R⁶ представляют собой атом галогена, предпочтительно атом хлора.

В еще другом предпочтительном воплощении производные формулы (I), применяемые в рамках настоящего изобретения, являются такими, что R⁵ и R⁶ представляют собой независимо друг от друга атом галогена, предпочтительно Cl; особенно R⁵ и R⁶ представляют собой хлор, и R⁴ представляет собой C₁C_{6 алкильную группу, в частности Et.}

В другом предпочтительном воплощении производные формулы (I), применяемые в рамках данного изобретения, являются такими, что оба R¹ и R² представляют собой атом водорода.

В еще другом предпочтительном воплощении производные формулы (I), применяемые в рамках данного изобретения, являются такими, что R³ представляет собой группу -ОН или группу -O(С₁-С₆ алкил), предпочтительно -OEt или -OiPr.

В частности производные формулы (I), применяемые в рамках данного изобретения, выбраны из следующих соединений:

(1) 4-(3,4-дихлорфенил)-4-этоксиимино-бутановая кислота;

(2 4-(3,4-дихлорфенил)-4-метоксиимино-бутановая кислота;

(3) изопропил 4-(3,4-дихлорфенил)-4-этоксиимино-бутаноат;

(4) 5-(3,4-дихлорфенил)-5-этоксиимино-пентановая кислота;

(5) 4-(3,4-дихлорфенил)-4-этоксиимино-N-(2-пиридил)бутанамид;

(6) 4-(3,4-дихлорфенил)-4-этоксиимино-N-(3-пиридил)бутанамид;

(7) 4-(3,4-дихлорфенил)-4-этоксиимино-N-пиридазин-3-ил-бутанамид;

(8) 4-(3,4-дихлорфенил)-N-(2-диметиламиноэтил)-4-этоксиимино-бутанамид;

(9) (4Е)-4-(3,4-дихлорфенил)-4-этоксиимино-N-(3-гидроксипропил)бутанамид;

(10) 4-(3,4-дихлорфенил)-4-этоксиимино-1-(4-метилпиперазин-1-ил)бутан-1-он.

В частности следующие соединения (1-10), которые охватывает общая формула (I), описаны в предшествующем уровне техники для других заявок:

Собственно говоря, заявка на патент WO 2010011302 описывает синтез соединений 1-10, охватываемых общей формулой (I), и их применения в области лечения нейродегенеративных заболеваний, однако без описания активности в отношении мышечной атрофии. Таким образом, изобретатели неожиданно обнаружили, что эти известные соединения обладают активностью в лечении и/или предотвращении патологий, связанных с мышечной атрофией у млекопитающих.

В рамках данного изобретения термин "арильная группа" означает ароматическое кольцо, имеющее 5-8 атомов углерода, или несколько конденсированных ароматических колец, имеющих 5-14 атомов углерода. В частности арильные группы могут представлять собой моноциклические или бициклические группы, предпочтительно фенил или нафтил. Предпочтительно представляет собой фенильную группу (Ph).

В рамках данного изобретения термин "гетероарильная группа" означает любую ароматическую углеводородную группу от 3 до 9 атомов, содержащую один или более гетероатомов, в частности один или два, таких как, например атомы серы, азота или кислорода, в частности, один или более атомов азота. Гетероарил по данному изобретению может состоять из одного или более конденсированных колец. Примерами гетероарильных групп являются фурил, изоксазил, пиридил, тиазолил, пиримидил, пиридазинил, бензимидазол, бензоксазол, бензотиазол, пиразол. Предпочтительно гетероарильная группа выбрана из групп пиридазинила, пиразола и пиридила.

В рамках данного изобретения под термином "атом галогена" понимают любой атом галогена, предпочтительно выбранный из Cl, Br, I или F, в частности выбранный из F, Cl или Br, в частности F или Cl, а именно Cl.

В рамках данного изобретения термин "С₁-С₆ алкильная группа" означает любую алкильную группу от 1 до 6 атомов углерода, линейную или разветвленную, в частности метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, н-гексил. Предпочтительно представляет собой метильную (Me), этильную (Et), изопропильную (iPr) или трет-бутильную (tBu) группу, в частности метильную, этильную или изопропильную группу, конкретнее метильную или этильную группу.

В рамках настоящего изобретения термин "С₃-С₆ циклоалкильная группа" означает любой насыщенный и на основе углеводорода цикл, включающий от 3 до 6 атомов углерода, в частности циклопропильную, циклобутильную, циклопентильную или циклогексильную группу. Предпочтительно представляет собой циклопентильную или циклогексильную группу.

В рамках данного изобретения термин "гетероциклическая группа" означает любую насыщенную циклическую углеводородную группу от 3 до 9 атомов, содержащую один или более гетероатомов, таких как, например атомы серы, азота или кислорода, в частности атомы азота и кислорода, конкретнее один или более атомов азота. Гетероциклическая группа по данному изобретению может состоять из одного или более конденсированных колец. Примерами гетероциклических групп являются группы тетрагидрофурана, тетрагидропирана, пирролидина, пиперазина, пиперидина, тиолана, оксирана, океана, тиана, тиазолидина, морфолина. Предпочтительно гетероциклическая группа выбрана из групп тетрагидропирана, пиперидина, пирролидина, пиперазина и морфолина.

В объеме данного изобретения термин "фармацевтически приемлемый" означает применимый для получения фармацевтической композиции, которая, как правило, безопасна, нетоксична и не является ни биологически, ни иным образом нежелательной, и которая приемлема для использования в ветеринарии, а также в фармацевтических препаратах человеком.

В объеме данного изобретения термин "фармацевтически приемлемые соли соединения" означает соли, которые являются фармацевтически приемлемыми, как определено в данном документе, и которые обладают требуемой фармакологической активностью исходного соединения. Такие соли включают:

(1) соли присоединения кислоты, образованные неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и подобные; или образованные органическими кислотами, такими как уксусная кислота, бензолсульфоновая кислота, бензойная кислота, камфорсульфоновая кислота, лимонная кислота, этансульфоновая кислота, фумаровая кислота, глюкогептоновая кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, гидроксинафтойная кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, молочная кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, муконовая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, пропионовая кислота, салициловая кислота, янтарная кислота, дибензоил-L-винная кислота, винная кислота, п-толуолсульфоновая кислота, триметилуксусная кислота, трифторуксусная кислота и подобные; или

(2) соли образованные при замене кислого протона, находящегося в исходном соединении, ионом металла, например ионом щелочного металла, ионом щелочноземельного металла или ионом алюминия; или при координации с органическим или неорганическим основанием. Приемлемые органические основания включают диэтаноламин, этаноламин, N-метилглюкамин, триэтаноламин, трометамин и подобные. Приемлемые неорганические основания включают гидроксид алюминия, гидроксид кальция, гидроксид калия, карбонат натрия и гидроксид натрия.

В рамках данного изобретения под термином "сольват соединения" понимают любое соединение, полученное при добавлении молекулы инертного растворителя к соединению по изобретению, сольват образуется вследствие силы их взаимного притяжения. Сольваты представляют собой, например, алкоголяты соединения. Гидрат является сольватом, в котором используемым инертным растворителем является вода. Может представлять собой моно, ди или тригидрат.

В рамках данного изобретения под термином "таутомер" подразумевают любой составляющий изомер соединений по данному изобретению, которые являются взаимопревращаемыми в ходе обратимой химической реакции, известной как таутомеризация. В большинстве случаев реакция происходит при миграции атома водорода, сопровождаемой изменением расположения двойной связи. В растворе соединения, способного к таутомеризации, создается равновесие между двумя таутомерами. Таким образом, соотношение между таутомерами зависит от растворителя, температуры и рН. Следовательно, таутомерия представляет собой преобразование одной функциональной группы в другую, чаще всего в ходе сопутствующего перемещения атома водорода и тт связи (двойной или тройной связи). Типичными таутомерами являются, например, пары альдегид/кетон-спирт или более точно енольные пары; амиды - имидокислоты; лактамы - лактимы; имины - енамины; енамины - енамины. В частности, могут включать цикло-цепную таутомерию, которая происходит, когда перемещение протона сопровождается преобразованием открытой структуры в цикл.

Производные по изобретению можно вводить в форме фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый эксципиент.

Эти композиции могут быть разработаны для введения млекопитающим, включая людей. Дозировка изменяется в зависимости от рассматриваемого лечения и состояния. Эти фармацевтические композиции подходят для введения любым подходящим способом, например перорально (включая буккальный и подъязычный способ), ректально, назально, местно (включая трансдермально), вагинально, внутрь глаза или парентерально (включая подкожно, внутримышечно или внутривенно). Предпочтительно фармацевтические композиции приспособлены для перорального введения. Эти препараты можно получить, используя любой из способов, известных квалифицированным специалистам в данной области техники, комбинируя активные ингредиенты с соответствующими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

Единичные формы подходящих пероральных введений включают таблетки, капсулы, порошки, гранулы и пероральные растворы или суспензии в водных или неводных жидкостях, съедобные или пищевые пены, или жидкие эмульсии вода в воде или масло, или масло в воде. При получении твердой композиции в форме таблетки основной активный ингредиент, предпочтительно в порошкообразной форме, смешивают с подходящим фармацевтическим эксципиентом, таким как желатин, крахмал, лактоза, стеарат магния, тальк, гуммиарабик или подобные. Таблетки могут быть покрыты сахарозой или другими подходящими веществами, или они могут быть обработаны таким образом, чтобы они обладали длительной или замедленной активностью, и непрерывно высвобождали заранее определенное количество активного ингредиента.

Препарат в капсулах получают, смешивая активный ингредиент, предпочтительно в порошкообразной форме, с разбавителем и выливая полученную в результате смесь в мягкие или твердые желатиновые капсулы, в частности желатиновые капсулы. Смазывающие вещества, такие как, например тальк, стеарат магния, стеарат кальция или полиэтиленгликоль в твердой форме, можно добавить в композицию до заполнения ею капсул. Разрыхлитель или солюбилизатор, такой как, например карбонат кальция или карбонат натрия, также можно добавить, чтобы улучшить доступность лекарственного средства после приема капсулы.

Кроме того, подходящие связующие вещества, смазывающие вещества и разрыхлители, а также красители при необходимости можно добавить к смеси. Подходящие связующие вещества могут представлять собой, например крахмал, желатин, природные сахара, такие как, например глюкоза или бета-лактоза, подсластители, полученные из маиса, синтетический или природный каучук, такой как акация, например, или альгинат натрия, карбоксиметил целлюлозу, полиэтиленгликоль, воски и подобные. Смазывающие вещества, применяемые в этих лекарственных формах, включают олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и подобные. Разрыхлители включают крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь и подобные. Таблетки разрабатывают, например, приготавливая порошкообразную смесь, гранулируя или осуществляя сухое прессование смеси, добавляя смазывающее вещество и разрыхлитель и прессуя смесь, чтобы получить таблетки. Порошкообразную смесь приготавливают, смешивая активный ингредиент, подходящим образом добавленный, с разбавителем или основой и необязательно со связующим веществом, таким как, например карбоксиметилцеллюлоза, альгинат, желатин или поливинилпирролидон, замедлителем растворения, таким как парафин, ускорителем абсорбции, таким как, например четвертичная соль, и/или абсорбирующим веществом, таким как, например бентонит, каолин или гидрофосфат кальция. Порошкообразные смеси можно подвергнуть грануляции, смачивая со связующим веществом, таким как, например сироп, крахмальная паста, слизь акации или растворы целлюлозы, или полимерные материалы, и проталкивая их через сито. Гранулы можно смазывать, добавляя стеариновую кислоту, соль стеариновой кислоты, тальк или минеральное масло, для того, чтобы предотвратить их прилипание к формам, используемым для изготовления таблеток. Затем смазанную смесь подвергают прессованию, получая таблетки. Непрозрачный или прозрачный защитный слой, состоящий из слоя шеллака, слоя сахара или полимерных материалов, необязательно может присутствовать. Можно добавить красители в эти покрывающие слои, чтобы отличать их от других таблеток.

Препарат сиропа или эликсира может содержать активный ингредиент вместе с подсластителем, антисептиком, а также ароматизатором и подходящим красителем. В общем, препараты сиропа получают, растворяя соединение в водном растворе с агентом, придающим соответствующий вкус, тогда как эликсиры получают, используя нетоксичный спиртовой наполнитель.

Водно-диспергируемые порошки или гранулы могут содержать активный ингредиент в смеси с диспергирующими агентами или смачивающими агентами, или суспендирующими агентами, такими как, например этоксилированные изостеариловые спирты и полиоксиэтиленовые эфиры сорбита, и с корректорами вкуса или подсластителями.

Для ректального введения используют суппозитории, которые получают со связующими веществами, которые плавятся при ректальной температуре, например какао-масло или полиэтиленгликоли.

Для парентерального, интраназального или внутриглазного введения используют водные суспензии, изотонические солевые растворы или стерильные и инъекционные растворы, содержащие диспергирующие агенты и/или фармакологически совместимые смачивающие агенты.

Активный ингредиент также может быть разработан в виде микрокапсул, необязательно с одной или более добавками.

Фармацевтические композиции, приспособленные к местному введению, могут быть разработаны в виде крема, мази, суспензии, лосьона, порошка, раствора, пасты, геля, спрея, аэрозоля или масла.

Фармацевтические композиции, приспособленные к назальному введению, в которых эксципиент находится в твердом состоянии, включая порошки, имеющие размеры частиц, например в диапазоне 20 - 500 микрон, вводят путем ингаляции из контейнера, содержащего порошок и расположенного рядом с носом.

Фармацевтические препараты, приспособленные к вагинальному введению, могут быть введены в форме буфера, крема, геля, пасты, мусса или спрея.

В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция по данному изобретению дополнительно включает другой активный ингредиент, предпочтительно обладающий дополняющим или синергическим эффектом.

Этот второй активный ингредиент может быть введен в той же самой фармацевтической композиции, что и производное формулы (I) по данному изобретению. Также может быть введен отдельно либо в то же самое время, либо через некоторое время.

Производные по изобретению изготавливают способами, которые хорошо известны квалифицированным специалистам в данной области техники, и в частности способы получения соединений 1-10 описаны в предшествующем уровне техники (WO 2010011302).

Изобретение станет более понятно в свете описания фигур и следующих примеров, которые приведены без ограничения описания.

Фигура 1 демонстрирует визуальное представление диаметра мышечного волокна (в мкм) в присутствии наполнителя (контроль: Контр), соединения 1 в концентрации 10 мкМ, с дексаметазоном (ДЕКС) в концентрации 10 мкМ, и инсулиноподобным фактором роста (ИФР1) в концентрации 10 нг/мл.

Скрининг каскада

Разработка скрининг-теста возникла из работы над литературой и исходя из характеристик патологии саркопении. На патофизиологическом уровне данное заболевание характеризуется сокращением синтеза белка и увеличением протеолиза. Следовательно, разбор вышеупомянутых соединений осуществляли с помощью тестов, которые позволяют оценить способность химических молекул ингибировать экспрессию гена миостатина и их способность увеличивать синтез белка в мышечных клетках. Кроме того, мы показали, что некоторые из продуктов, перечисленных выше, увеличивают диаметр мышечных трубочек в клетках С2С12.

Протоколы:

Измерение экспрессии миостатина в клетках С2С12:

Миобластические клетки С2С12 (Американская коллекция типовых культур (АТСС, от англ. "American type culture collection") CRL-1772) высевают в 24-луночные планшеты при плотности 30,000 клеток на лунку и культивируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM, от англ. "Dulbecco's Modified Eagle Medium"), содержащей глюкозу при 4,5 г/л и дополненной эмбриональной телячьей сывороткой (10%) и антибиотиками (пенициллин и стрептомицин). Через сорок восемь часов миобласты выборочно подвергают частичной депривации в сыворотке (2% вместо 10%) в течение 5 дней. Затем клетки помещают в обедненную глюкозой среду (DMEM, содержащая 1 г/л глюкозы) и лишенной сыворотки в присутствии исследуемых молекул или соединений для сравнения (ИФР-1 в концентрации 100 нг/мл) на 6 часов. В конце эксперимента матричные рибонуклеиновые кислоты (мРНК) извлекают, используя стандартную методику с фенолом и хлороформом. Кратко, клетки подвергают лизису в растворе тризола (Sigma Т9424), содержащем сильную кислоту и фенол. мРНК отделяют от белков, добавляя хлороформ с последующим центрифугированием. Затем их осаждают в изопропаноле и потом суспендируют при концентрации 1 мкг/мкл в ультрачистой воде без РНК и дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Затем 1 мкг мРНК преобразуют в ходе ретро-транскрипции в комплементарную ДНК под действием фермента AMV в присутствии праймера и смеси нуклеотидов согласно протоколу, предоставленному поставщиком (Applied Biosystems 4368814). Экспрессию гена исследуют в ходе полимеразной цепной реакции, инициируемой ферментом, и обычно называемой ПЦР в условиях количественного определения, поэтому точное название кПЦР. кПЦР осуществляют в быстродействующем ПЦР-анализаторе реального времени 7900НТ (Applied Biosystems). Условия выполнения программы являются стандартными и состоят из 1 цикла при 95°С в течение 15 минут, затем 40 циклов при 95°С в течение 15 секунд и 60°С в течение 1 минуты, и в завершении стадия плавления кривой при 60°С и 95°С. Все анализируемые образцы содержат 100 нг комплементарной ДНК (кДНК), буфер кПЦР, включая фермент, смесь олигонуклеотидов и интеркалирующий SYBR green, и пару специфичных праймеров изучаемого гена, стратегически выбранных между двумя последовательностями экзона, и при конечной концентрации 200 нМ. Флуоресцентные зонды связаны с двухцепочечной ДНК и флуоресцируют только присоединенными к ДНК. Порог флуоресценции установлен с помощью программы устройства. Когда количество ДНК позволяет флуоресцентному зонду превысить этот порог, получают число циклов ПЦР, называемое "Ct", для "порога цикла" или порог цикла. Это значение, которое является основой для вычислений количества ДНК относительным способом. Отношение R установлено между количеством начальной ДНК в образце и количеством контрольного образца, который не обрабатывали (т.е. R=2^{-(Cl Образца-Ct Контроля)}), и это измерение будет сравниваться с измерением гена "домашнего хозяйства", который, как известно, не модулируется в ходе обработки (или }.

Используемые праймеры записаны в следующей таблице:

Праймеры, используемые для оценки модификаций экспрессии гена

Tm - температура плавления (от англ. - melting temperature)

Синтез белка

Клетки подсчитывают и высевают при плотности 20000 клеток на лунку в 24-луночный планшет в среде DMEM, содержащей глюкозу при 4,5 г/л и дополненной эмбриональной телячьей сывороткой (10%) и антибиотиками (пенициллин и стрептомицин). Через сорок восемь часов миобласты выборочно подвергают частичной депривации в сыворотке (2% вместо 10%) в течение 5 дней. Затем клетки помещают в среду без глюкозы или лейцина (среду Кребса) на 1 час при 37°С, и потом инкубируют в течение 2 часов и 30 минут в присутствии исследуемых продуктов или соединения для сравнения (ИФР-1, 100 нг/мл) в бессывороточной среде DMEM, содержащей меченый радиоактивным изотопом лейцин 2,5 мкКи/мл. В конце инкубации надосадочные жидкости удаляют, и клетки подвергают лизису в 0,1 н растворе NaOH в течение 30 минут. Радиоактивность измеряют в клеточной фракции и общее количество белка определяют по анализу Лоури. Каждое состояние оценивают как минимум при n равном 6; ИФР-1, 100 нг/мл является нашим контрольным образцом, чтобы стимулировать синтез белка. Результаты выражены в импульс в минуту/мкг белков после 2,5 часов инкубации или в процентах относительно контрольного состояния.

Оценка диаметра мышечного волокна

Миобластические клетки С2С12 (АТСС CRL-1772) высевали в обработанные глицерином 8-луночные планшеты при плотности 10,000 клеток на лунку и культивировали в среде DMEM, содержащей глюкозу при 4,5 г/л и дополненной эмбриональной телячьей сывороткой (10%) и антибиотиками (пенициллин и стрептомицин).

Через сорок восемь часов миобласты выборочно подвергают частичной депривации в сыворотке (2% вместо 10%) в течение 3 дней. Затем клетки помещают в обедненную глюкозой среду (DMEM, содержащая 1 г/л глюкозы) и лишенной сыворотки в присутствии исследуемых молекул или соединений для сравнения (ИФР-1 в концентрации 10 нг/мл или 10 мкМ дексаметазон) на 3 дня. В конце культивирования клетки промывают и фиксируют с 2,5% глутаровым альдегидом/0,1% раствором Тритона в течение 1 часа при комнатной температуре. Клеточный слой покрывают 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (ДАФИ) (флуоресцентная метка клеточного ядра). После хранения в темноте в течение 16 часов на холоде предметные стекла рассматривают под флуоресцентным микроскопом (Carl Zeiss, AxioVert 200) и изображения анализируют, используя программное обеспечение Axiovision 4.1, для измерения диаметра волокон.

Результаты:

• Влияния на экспрессию миостатина (Таблица 1)

Для влияний на экспрессию миостатина результаты выражены в процентах экспрессии гена миостатина в клетках при контакте с молекулами, связанными с экспрессией в контрольных клетках. Предполагается, что продукт является активным, если это отношение менее или близко к 70%, среднее значение ИФР-1, найденное при концентрации 100 нг/мл в данном тесте, рассматривается как сравнительное.

Соединения 1 и 3 значительно ингибируют экспрессию миостатина.

• Влияния на синтез белка в ходе фосфорилирования S6K1 (Таблица 2)

Для влияний на синтез белка результаты выражены в процентах увеличения фосфорилирования S6K в мышечных клетках. Данный процент считается - значительным, когда он больше 120%, наблюдаемое среднее значение ИФР-1 при концентрации 100 нг/мл в данном тесте рассматривается как сравнительное.

Соединение 1 значительно увеличивает синтез белка в мышечных клетках при концентрации 0,5 мкМ.

• Влияние соединения 1 на диаметр мышечного волокна (фигура 1)

Клетки С2С12 дифференцируют и обрабатывают соединением 1 в течение последних трех дней дифференцировки. Результаты показаны на фигуре 1.

Как ожидалось, обработка ИФР-1 значительно увеличивает диаметр мышечных трубочек, и наоборот дексаметазон значительно уменьшает этот параметр. Диаметр мышечных трубочек значительно увеличивается после обработки соединением 1 (фигура 1).

Список литературы

Bass J et al., Domest Anim Endocrinol, 1999, 17(2-3): 1991-197

Baumgartner R N et al., The journals of gerontology. Series A, Biological sciences and medical sciences 1998, 53(4): M264-74

Chai RJ et al., PLoS One 2011, 6: e28090

Farnfield MM et al., Appl Physiol Nutr Metab 2012, 37:21-30

Frontera W R et al., Journal of applied physiology (Bethesda, Md.: 1985) 1991, 71(2): 644- 50

Hasselgren PO et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 2002, 290(1): 1-10

Lee SJ. Immunol Endocr Metab Agents Med Chem. 2010,10:183-194

Leger В et al., Rejuvenation Res 2008, 11(1): 163-175

Li ZB et al., J. Biol. Chem. 2008, 283(28): 19371-19378

Lloyd BD et al., J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2009 May, 64(5): 599-609

McPherron AC et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94:12457-12461

McPherron AC et al., J Clin Invest. 2002, 109: 595-601

Morley J E et al., Current Pharmaceutical Design 2007, 13(35): 3637-3647

ED et al., Age (Dordr) 2010, 32: 209-22

Purintrapiban J et al., Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology 2003, 136(3): 393-401

Thies RS et al., Growth Fact. 2001, 18: 251-259

Wolfman NM et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100:15842-15846

WO 2010011302

1. Применение производного общей формулы I

где R¹ и R² независимо друг от друга представляют собой водород;

- n представляет собой целое число между 1 и 2;

- R³ представляет собой:

- группу -OH;

- группу -O(C₁-C₆ алкил);

- R⁴ представляет собой C₁-C₆ алкильную группу;

- R⁵ и R⁶ представляют собой независимо друг от друга атом галогена;

или его фармацевтически приемлемой соли

в качестве лекарственного средства для лечения и/или предотвращения мышечной атрофии у млекопитающих, и/или для ограничения мышечной атрофии у млекопитающих, и/или для стимуляции мышечного роста у тренирующихся млекопитающих, стремящихся увеличить массу и качество мышц, предотвращая появление симптомов саркопении, связанных с возрастом или реабилитацией после потери мышц, возрастной мышечной атрофии и/или последствий лекарственного лечения, и/или иммобилизации, и/или кахексии.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что R⁵ и R⁶ представляют собой атомы хлора.

3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что R⁵ и R⁶ представляют собой независимо друг от друга атом галогена.

4. Применение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что R⁴ представляет собой С₁-С₆ алкильную группу.

5. Применение по любому из пп. 1-4, отличающееся тем, что R⁴ представляет собой -этил.

6. Применение по любому из пп. 1-5, отличающееся тем, что n равно 1.

7. Применение по любому из пп. 1-6, отличающееся тем, что R³ представляет собой группу -ОН или группу -O(C₁-C₆ алкил).

8. Применение по любому из пп. 1-7, отличающееся тем, что R³ представляет собой группу -OEt или -OiPr.

9. Применение по любому из пп. 1-8, отличающееся тем, что оба R¹ и R² представляют собой атом водорода.

10. Применение по любому из пп. 1-9, отличающееся тем, что производное выбрано из следующих соединений:

(1) 4-(3,4-дихлорфенил)-4-этоксиимино-бутановая кислота;

(2) 4-(3,4-дихлорфенил)-4-метоксиимино-бутановая кислота;

(3) изопропил 4-(3,4-дихлорфенил)-4-этоксиимино-бутаноат;

(4) 5-(3,4-дихлорфенил)-5-этоксиимино-пентановая кислота.

11. Применение по любому из пп. 1-10, отличающееся тем, что возрастная мышечная атрофия представляет собой пресаркопению, саркопению или тяжелую саркопению.

12. Применение по любому из пп. 1-11, отличающееся тем, что млекопитающее представляет собой человека.