Диагностический способ и набор для одновременного обнаружения и идентификации туберкулезной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определения рифампициновой устойчивости туберкулезной микобактерии на основе аналитической платформы quantamatrix

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к одновременному обнаружению и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определению устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду, а также к набору для одновременного обнаружения и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и для определения устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду. Способ включает выделение ДНК из образцов, амплификацию ДНК с помощью ПЦР с применением праймеров с последовательностями, указанными в SEQ ID NO: 1-12, и гибридизацию продуктов ПЦР-амплификации с дисками, сопряженными с олигомерными зондами, имеющими последовательности, указанные в SEQ ID NOS: 13-68, и визуализацию дисков с помощью программного обеспечения QuantaMatrix. Набор включает праймеры, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1-12, и диски, сопряженные с олигомерными зондами, имеющими последовательности, указанные в SEQ ID NO: 13-68. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 8 табл., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к диагностическому способу и набору для одновременного обнаружения и идентификации туберкулезной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определения устойчивости к рифампицину туберкулезных микобактерий на основе аналитической платформы QuantaMatrix.

Уровень техники

Туберкулез является хроническим инфекционным заболеванием, вызываемым туберкулезной микобактерией (МТБ), и его распространенность в Южной Корее неуклонно снижается, но все еще выше, чем в других странах. Несмотря на применение эффективных противотуберкулезных лекарственных средств, уровень неизлечимого туберкулеза, такого как туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью и туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью, растет. Около восьми миллионов человек заболевают туберкулезом во всем мире ежегодно и около двух миллионов умирают от этой болезни каждый год. Таким образом, быстрое определение резистентности трудно поддающейся обработке туберкулезной микобактерии имеет важное значение для эффективного лечения и выживания пациентов. Нетуберкулезные микобактерии (НТМ) также вызывают туберкулез. В других странах, помимо Южной Кореи, в особенности, в регионах, где часто встречаются нетуберкулезные микобактерии, от 30% до 50% образцов мокроты оказываются положительными по мазку на нетуберкулезные микобактерии. Сообщали, что число пациентов с туберкулезом, вызванным нетуберкулезными микобактериями, увеличивается по мере развития стран. Таким образом, идентификация микобактерий очень важна [Wright PW, Wallace RJ Jr, Wright NW, Brown BA, Griffith DE. J Clin Microbiol 1998;36:1046-9; Marras TK and Daley CL. Clin Chest Med 2002;23:553-67; Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. This official statement of the American Thoracic Society. Management of opportunist mycobacterial infections: Joint Tuberculosis Committee Guidelines 1999. Thorax 2000;55:210-8].

Известно, что частота заболеваний, вызванных нетуберкулезными микобактериями в Южной Корее, низкая. При таких обстоятельствах у большинства пациентов с положительными результатами по мазку на микобактерии диагностируют туберкулез, и их обычно лечат противотуберкулезными лекарственными препаратами. По имеющимся данным, в Южной Корее нетуберкулезные микобактерии были обнаружены в 10,3-12,2% мазков образцов мокроты, положительных по микобактериям, и эта доля возросла до уровня 30%. [Koh WJ, Kwon OJ, Yu CM, Jeon K, Suh GY, Chung MP, et al. Tuberc Respir Dis 2003;54:22-32]. Кроме того, нетуберкулезные микобактерии могут вызывать заболевания у пациентов с иммунодефицитом и их трудно диагностировать. Поскольку естественная лекарственная устойчивость нетуберкулезных микобактерий варьирует в зависимости от их вида, терапевтические способы лечения туберкулеза, вызванного нетуберкулезными микобактериями, могут отличаться от способов лечения туберкулеза, вызванного туберкулезной микобактерией. [Koh WJ, Kwon OJ, Lee KS. J Korean Med Sci 2005;20:913-25; Wagner D and Young LS. Nontuberculous mycobacterial infections: a clinical review. Infection 2004;32:257-70].

Таким образом, существует необходимость в подходящем способе тестирования для быстрой дифференциации туберкулезной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий.

Для диагностики туберкулеза обычно применяют тесты на микобактериальные мазки и посевы. Тесты на микобактериальный мазок выгодны тем, что их результаты могут быть получены быстро, а процедура проста в проведении, но она имеет недостатки, связанные с низкой чувствительностью и специфичностью, а также с трудной дифференциацией между туберкулезной микобактерией и нетуберкулезными микобактериями. Культуральные тесты являются наиболее точными диагностическими стандартами для туберкулеза. Однако культуральные тесты невыгодны тем, что медленный рост туберкулезной микобактерии требует длительного времени для диагностики туберкулеза, а длительное культивирование вызывает частое заражение другими бактериями. [Yang HY, Lee HJ, Park WY, Lee KK, Suh JT. Korean J Lab Med 2006;26:174-8]. Недавно, для сокращения времени, необходимого для культивирования микобактерий туберкулеза, появились автоматизированные способы тестирования с применением жидких сред. Однако эти способы также требуют дополнительных процедур идентификации из-за их неспособности различать туберкулезную микобактерию и нетуберкулезные микобактерии. [Yang HY, Lee HJ, Park WY, Lee KK, Suh JT. Korean J Lab Med 2006;26:174-8]. Микробную диагностику применяют в качестве золотого стандарта для определения лекарственной устойчивости. Согласно этим способам, лекарственную устойчивость определяют путем культивирования образцов мокроты от пациентов с микобактерией туберкулеза, с последующим культивированием в средах, содержащих лекарственные средства. Эта процедура требует не менее 4-8 недель для определения наличия устойчивости микобактерии к лекарственным средствам.

Лечение туберкулеза, задержанное резистентной туберкулезной микобактерией, приводит к локальному распространению инфекции с резистентной микобактерией туберкулеза. Соответственно, очень важно определить резистентность микобактерий туберкулеза во время начальной диагностики туберкулеза. Для этого необходима молекулярная диагностика для быстрого определения резистентности. В последнее время было разработано много способов диагностики туберкулеза, основанных на современных способах молекулярной диагностики [Chakravorty S and Tyagi JS. Novel multipurpose methodology for detection of Mycobacteria in pulmonary and extrapulmonary specimens by smear microscopy, culture, and PCR. J Clin Microbiol 2005;43:2697-702; Kim YJ, Park MY, Kim SY, Cho SA, Hwang SH, Kim HH, et al. Korean J Lab Med 2008;28:34-8]. Надежная диагностика туберкулеза основана на демонстрации инфекции микобактериями туберкулеза. Поэтому прямое обнаружение МТБ в клинических образцах считается наиболее надежным подходом.

В таких условиях все чаще применяют способы выявления туберкулезной микобактерии в прямых изолятах от пациентов, основанные на быстрых молекулярно-биологических способах с высокой чувствительностью и специфичностью. Такие молекулярно-биологические способы включают, например, ПЦР [Yang HY, Lee HJ, Park WY, Lee KK, Suh JT. Korean J Lab Med 2006;26:174-8;Chakravorty S and Tyagi JS. J Clin Microbiol 2005;43:2697-702], ПЦР в реальном времени [Kim YJ, Park MY, Kim SY, Cho SA, Hwang SH, Kim HH, et al. Korean J Lab Med 2008;28:34-8; Jung CL, Kim MY, Seo DC, Lee MA. Korean J Clin Microbiol 2008;1;29-33], гибридизацию [Makinen J, Marjamaki M, Marttila H, Soini H. Clin Microbiol Infect. 2006;12:481-3; Padilla E, Gonzalez V, Manterola JM, Perez A, Quesada MD, Gordillo S, et al. J Clin Microbial. 2004;42:3083-8; Sanguinetti M, B Posteraro, F Ardito, S Zanetti, A Cingolani, L Sechi, et al. J Clin Microbiol. 1998;36:1530-3; Tortuli, E, A Mariottini, and G Mazzarelli. J Clin Microbiol. 2003;41:4418-20], и панели олигонуклеотидов [Park H, Jang H, Song E, Chang CL, Lee M, Jeong S, et al. J Clin Microbial 2005;43:1782-8]. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP) (PRA) представляет собой один из наиболее широко применяемых способов идентификации нетуберкулезных микобактерий. PRA выполняют с помощью ПЦР-амплифицируемых генных областей, где можно идентифицировать туберкулезную микобактерию и нетуберкулезные микобактерии, обрабатывая амплифицированные генные области соответствующими ферментами рестрикции, идентифицируя бактерии на основе профилей секций. [Lee HY, Park HJ, Cho SN, Bai GH, Kim SJ. J Clin Microbiol. 2000;38:2966-71; Bannalikar AS, Verma R. Indian J Med Res. 2006;123:165-72; Aravindhan V, Sulochana S, Narayanan S, Paramasivam CN, Narayanan PR. Indian J Med Res. 2007;126:575-9].

Однако в случае, когда сосуществуют два или более видов бактерий, включая микобактерии туберкулеза и нетуберкулезные микобактерии, получаются сложные профили секций после обработки рестрикционными агентами, что делает невозможным идентификацию бактериальных видов. В попытках устранить этот недостаток, недавно были разработаны молекулярные диагностические тесты на основе аналитической платформы QuantaMatrix assay platform (QMAP) для одновременной диагностики и идентификации туберкулезной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий, а также для выявления туберкулезной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий. QMAP, основанная на технологии панели в суспензии (suspension array), первоначально была разработана компанией QuantaMatrix Inc. (смотри Корейские патенты №№ 1011013100000 (26 декабря 2011) и 1015823840000 (28 декабря 2015). В соответствии с тестом QMAP, зонды связываются с магнитными микродисками, имеющими размер 50 мкм, микродиски, связанные с образцом, могут реагировать с продуктами ПЦР, и мутации определяют по флуоресценции. Диски наделены внутренними кодами, число которых технически будет не более 1024. Самая существенная особенность QMAP - это способность дифференцировать закодированные диски без интерференции. Применение закодированных дисков позволяет проводить множественные тесты. Всю эту процедуру выполняют в 96-луночных планшетах. Соответственно, QMAP рассматривают как систему с высокой пропускной способностью (фиг. 1).

Осуществление изобретения

Проблемы, решаемые изобретением

Настоящее изобретение было сделано в целях удовлетворения вышеуказанных потребностей, и одна из целей настоящего изобретения представляет собой создание нового способа диагностики для выявления и идентификации туберкулезной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определения устойчивости к рифампицину туберкулезной микобактерии.

Другая цель настоящего изобретения представляет собой создание нового диагностического набора для обнаружения и идентификации туберкулезной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определения устойчивости к рифампицину туберкулезной микобактерии.

Способы решения проблем

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ одновременного выявления и идентификации туберкулезной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определения устойчивости к рифампицину и изониазиду микобактерии туберкулеза, способ включает в себя а) выделение ДНК из образцов, б) амплификацию ДНК с помощью ПЦР с применением праймеров, имеющих последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1-12 и в) гибридизацию продуктов амплификации ПЦР с дисками, сопряженными с олигомерными зондами, имеющими последовательности, указанные в SEQ ID NOS: 13-68 и визуализацию дисков с помощью программного обеспечения для аналитической платформы QuantaMatrix.

В одном из воплощений настоящего изобретения туберкулезную микобактерию и нетуберкулезные микобактериальные штаммы предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Mycobacterium tuberculosis H37Rv, M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. abscessus, M. chelonae, M. fortuitum, M. ulcerans, M. marinum, M. kansasii, M. genavense, M. simmiae, M. terrae, M. nonchromogenicum, M. celatum, M. gordonae, M. szulgail, M. mucogenicum, M. aubagnense, M. malmoense, M. phlei, M. smegmatis, M. xenopi, M. peregrinum и M. flavescens, но не ограничиваются ими.

В дополнительном воплощении настоящего изобретения праймеры предпочтительно представляют собой биотинилированные праймеры, но настоящее изобретение ими не ограничивается.

Настоящее изобретение также обеспечивает набор для одновременного обнаружения и идентификации туберкулезной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определения устойчивости к рифампицину и изониазиду микобактерий туберкулеза, набор, включающий праймеры с последовательностями, указанными в SEQ ID NO: 1-12, и диски, сопряженные с олигомерными зондами, имеющими последовательности, указанные в SEQ ID NO: 13-68.

Набор предпочтительно дополнительно включает ДНК-полимеразу, dNTP и буфер в качестве реагентов для амплификации ПЦР, но реагенты этим не ограничиваются.

Теперь настоящее изобретение будет описано.

В настоящем изобретении эффективность основанного на QMAP двойного ID, разработанного авторами настоящего изобретения, оценивали в твердых и жидких питательных средах.

Диагностический способ (в дальнейшем в настоящем документе также называемый «Myco-ID на основе QMAP») в соответствии с настоящим изобретением представляет собой аналитический способ молекулярной диагностики, который позволяет обнаруживать и идентифицировать в общей сложности 26 видов, включая туберкулезную микобактерию и основные нетуберкулезные микобактерии (22 вида и 3 группы) и определять устойчивость к рифампицину микобактерий туберкулеза. Основные нетуберкулезные микобактерии представляют собой M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, комплекс M. abscessus, M. chelonae, комплекс M. fortuitum, M. ulcerans/M.marinum, M. kansasii, M. genavense/M.simiae, M. terrae, M. nonchromogenicum, M. celatum, M. gordonae, M. szulgai, M. mucogenicum, M. aubagnense, M. malmoense, M. phlei, M. smegmatis, M. xenopi, M. peregrinum/M. septicum и M. flavescens. Конкретно, способ диагностики по настоящему изобретению осуществляют путем амплификации области гена rpoB, содержащую видоспецифичные полиморфизмы (Корейский патент № 10-1377070 (12 марта 2014) с помощью биотинилированных праймеров и взаимодействия полученных продуктов ПЦР с микродисками, прикрепленными к видоспецифическим зондам. Myco-ID на основе QMAP может быть осуществлен в автоматическом режиме, что способствует экономии времени. Конкретно, для Myco-ID на основе QMAP требуется всего 3 часа времени (включая 30 минут для выделения ДНК, 1 час для ПЦР и полтора часа для обнаружения и идентификации туберкулезные бактерии/нетуберкулезные бактерии (TB/NTM) и определения устойчивости к рифампицину) для автоматического тестирования в 96-луночных планшетах.

Эффекты изобретения

Myco-ID на основе QMAP в соответствии с настоящим изобретением позволяет за короткое время точно идентифицировать возбудителей туберкулеза благодаря его способности различать туберкулезную микобактерию и нетуберкулезные микобактерии, выявлять нетуберкулезные микобактерии, определять рифампицин- и изониазид-резистентность микобактерий туберкулеза. Таким образом, Myco-ID на основе QMAP в соответствии с настоящим изобретением предоставляет полезную информацию для назначения правильных лекарственных препаратов, действующих на нетуберкулезные микобактерии. Считается, что Myco-ID на основе QMAP в соответствии с настоящим изобретением снизит риск ошибочного диагноза нетуберкулезных микобактерий вместо микобактерий туберкулеза, в ситуации, когда туберкулезная микобактерия была смешана с быстрорастущими нетуберкулезными микобактериями при культивировании в жидкой культуре, которая все чаще применяется. Таким образом, Myco-ID на основе QMAP в соответствии с настоящим изобретением очень полезен при диагностике инфекционных заболеваний, вызванных туберкулезной микобактерией и нетуберкулезными микобактериями.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена диаграмма системы QMAP.

Фиг. 2 показывает результаты REBA Myco-ID. Дорожки 1-2, 9, 11, 13: M.

intracellulare; дорожка 3: M. mucogenicum; дорожка 4-8, 16-19: M. tuberculosis, дорожка 10: M. massiliense, дорожка 12: M. avium, дорожка 14: M. fortuitum; дорожка 15: M. abscessus, дорожка 20: отрицательный контроль.

Способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие неограничивающие примеры. Однако эти примеры предназначены только для иллюстративных целей и не рассматриваются как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Твердые бактериальные культуры (234 образца) и жидкие бактериальные культуры (297 образцов), выделенные из пациентов с подозрением на заражение туберкулезной микобактерией, госпитализированных в Сеульский медицинский центр Асан (Южная Корея) и в больницу Сент-Винсент (Южная Корея) в период с мая 2009 года по сентябрь 2009 года были запрошены для исследования микобактериального мазка и посева.

Анализы микобактериальных мазков и посевов для выявления микобактерии туберкулеза были проведены в Сеульском медицинском центре Асан (Южная Корея) и больнице Сент-Винсент (Южная Корея). Анализ микобактериальных мазков проводили окрашиванием по способу Циля-Нильсена с применением карболового фуксина, и результаты регистрировали в соответствии со стандартизированной процедурой, принятой в Центрах по контролю и профилактике заболеваний США. Анализ культуры проводили следующим образом. Сначала каждый образец обрабатывали NaOH. Затем собранные бактериальные клетки инокулировали в 3%-ную среду Ogawa (Asan Pharmaceuticals Co., Ltd., Южная Корея) и BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson Microbiology System, Sparks, Md, США) для культивирования возбудителей, присутствующих в образце.

Пример 1: Выделение и идентификация микобактерий

Каждый образец инокулировали в 3%-ную среду Ogawa и систему BACTEC MGIT 960 и культивировали при 37°C. Порции культуральной среды собирали, нагревали при 100°С в течение 20-ти мин и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин. Собранные супернатанты применяли для последующих анализов. Туберкулезную микобактерию и нетуберкулезные микобактерии дифференцировали способом молекулярной диагностики с применением набора для ПЦР MTB-ID.

Пример 2: REBA Myco-ID

Для способа REBA Myco-ID нуклеиновые кислоты, выделенные из каждого образца, амплифицировали с помощью ПЦР с применением биотинилированных праймеров. Сначала нуклеиновые кислоты предварительно денатурировали при 94°С в течение 5-ти минут. Затем продукты реакции денатурировали при 94°С в течение 30 сек, после чего проводили 45 циклов отжига и удлинения при 65°С в течение 30 сек. Конечный цикл проводили при 72°С в течение 7-ми мин для получения продуктов ПЦР с молекулярной массой 270 п.н. Продукты ПЦР амплифицировали.

REBA Myco-ID проводили с применением амплифицированных продуктов ПЦР. Условия эксперимента были в соответствии с протоколом производителя. Экспериментальная процедура была следующей. Продукты ПЦР смешивали с таким же количеством раствора для денатурации (0,2 н. NaOH, 0,2 мМ ЭДТА), оставляли стоять при комнатной температуре в течение 5-ти минут и добавляли к полоскам REBA Myco-ID (M & D, Корея), которые были предварительно приготовлены разбавлением с 2X SSPE/0,1% SDS. Реакции позволяли протекать при 50°С в течение 30 мин. Реакционную смесь дважды промывали промывочным раствором (WS) при 62°C в течение 10-ти минут и обрабатывали меченным щелочной фосфатазой конъюгатом стрептавидина (Roche, Mannheim, Германия), разбавленным до 1:2000 (объем/объем). Реакции позволяли протекать при комнатной температуре в течение 30-ти минут. После завершения реакции полоски дважды промывали раствором TBS (pH 7,5) при комнатной температуре в течение 1 мин и подвергали воздействию NBT/BCIP (хлорид нитросинего тетразолия и 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат, соль толуидина, Roche, Германия), разведенному до 1:50 раствором TBS (pH 9,5), при комнатной температуре в течение 5-ти минут. NBT/BCIP представляет собой хромогенный раствор субстрата, реагирующего с щелочной фосфатазой. Детектировали продукты ПЦР, связанные с зондами.

Пример 3: Двойной-ID на основе QMAP

Для способа Myco-ID на основе QMAP, нуклеиновые кислоты, выделенные из каждого образца, амплифицировали с помощью ПЦР с применением биотинилированных праймеров. Сначала нуклеиновые кислоты предварительно денатурировали при 94°С в течение 5-ти минут. Затем продукты реакции денатурировали при 94°С в течение 30 сек, после чего проводили 45 циклов отжига и удлинения при 65°С в течение 30 сек. Конечный цикл проводили при 72°С в течение 7-ми мин для получения продуктов ПЦР длиной в 250 п.н. Продукты ПЦР амплифицировали.

Амплифицированные продукты ПЦР смешивали с тем же количеством раствора для денатурации (0,2 н NaOH, 0,2 мМ ЭДТА), оставляли стоять при комнатной температуре в течение 5-ти минут и добавляли к сопряженным дискам (Quantamatrix, Сеул, Корея), которые были предварительно приготовленный разведением гибридизационным буфером. Реакции позволяли протекать при 40°С в течение 30-ти минут. Реакционную смесь трижды промывали промывным раствором (WS) при 25°С в течение 1-ой минуты и обрабатывали конъюгатом стрептавидин R-фикоэритрин (Prozyme, San Leandro, CA), разбавленным до 1:2000 (объем/объем). Реакции позволяли протекать при комнатной температуре в течение 10-ти минут. После завершения реакции микродиски трижды промывали промывочным раствором при комнатной температуре в течение 1-ой мин, и получали их изображения в автоматическом режиме с помощью предоставленного программного обеспечения QMAP для обнаружения MTB или NTM, выделения NTM и определения устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину и изониазиду.

Последовательности примененных праймеров и зондов описаны в таблице 8. Синтез праймеров и зондов запрашивали в Bioneer, Южная Корея.

Результаты, полученные в Примерах 1-3, описаны ниже.

Различие между туберкулезной микобактерией и нетуберкулезными микобактериями после амплификации ДНК, выделенной из культивируемых образцов, с помощью мультиплексной ПЦР аналитической чувствительности и специфичности на основе QMAP (MTB-ID)

Для исследования аналитической чувствительности к MTB и NTM на основе QMAP, каждый из стандартных штаммов (Mycobacterium tuberculosis H37Rv, M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. abscessus, M. chelonae, M. fortuitum, M. marinum, M. kansasii, M. genavense, M. terrae, M. nonchromogenicum, M. celatum, M. gordonae, M. szulgail, M. mucogenicum, M. aubagnense, M. malmoense, M. phlei, M. smgmatis, M. xenopi, M. peregrinum и M. flavescens) перед тестированием разбавляли в 10 раз (10 нг, 1 нг, 100 пг, 10 пг, 1 пг, 100 фг и 10 фг (1 бацилла)). В результате предел обнаружения составлял от 1 пг (100 бацилл) до 100 фг (10 бацилл) (таблица 1). Для определения специфичности, основанной на QMAP, для тестирования использовали в общей сложности 108 штаммов (MTB H37Rv, 44 штамма NTM и 63 немикобактериальных штамма). 28 стандартных штаммов были точно обнаружены на дисках, сопряженных со специфическими зондами, и три зонда были обнаружены вместе с M. fortuitum-M.marinum, M. kansasii-M.gastri и M. genavense-M. avium (Таблица 2).

Оценка эффективности Myco-ID на основе QMAP в клинических образцах

Для оценки эффективности способа Myco-ID на основе QMAP протестировали 531 штамм (включая 234 твердые бактериальные культуры и 297 жидких бактериальных культур) для определения MTB/NTM и идентификации NTM. В результате 234 твердых бактериальных культуры были идентифицированы как 223 штамма MTB и 11 штаммов NTM, а диапазоны интенсивности флуоресценции обнаруженных штаммов 223 MTB и 11 штаммов NTM составили 2074-4765 (в среднем 4255,6 ± SD 458,7) и 609-3569 (1892 ± 923,2) соответственно. 212 штаммов MTB и 77 штаммов NTM в 297 жидких культуральных средах показали положительные сигналы в тестах QMAP. 527 (99,2%) из 531 штамма были точно определены как штаммы MTB и NTM. Два штамма из 4 необнаруженных штаммов были отрицательными для культуры, а два других штамма с помощью секвенирования были идентифицированы как Rhodococcus erythropolis и R. jostii. Результаты, полученные с помощью Myco-ID на основе QMAP, были подтверждены сравнением с результатами другого способа молекулярной диагностики (REBA Myco-ID) (рис. 2). Было установлено, что результаты, полученные с помощью Myco-ID на основе QMAP, полностью согласуются с результатами, полученными способом REBA Myco-ID (Таблица 3).

Positive = положительный, Negative = отрицательный, Total = общий, Co-infection = совместное заражение

Сокращения: AFB, кислотоустойчивые бациллы; M. tuberculosis; NTM, нетуберкулезные микобактерии; ND, не обнаружено

^a Два штамма NTM не были обнаружены в системе QMAP и REBA Myco-ID и были идентифицированы как Rhodococcus erythropolis и R. jostii секвенированием rpoB.

^b Смешанные случаи НТМ и НТМ

^c Два случая, отрицательных по мазку/культуре

Распределение обнаружения нетуберкулезных микобактерий

При применении системы на основе QMAP было обнаружено, что 94 из 531 культивируемых бактериальных образцов представляют собой NTM. 94 штамма были распределены в следующем порядке: 36 штаммов (39,1%), 21 штамм (22,8%), 14 штаммов (15,2%) и 7 штаммов (7,6%) были идентифицированы как M. intracellulare, M. avium, комплекс M. abscessus и M. fortuitum, соответственно. 4 штамма (4,3%), 2 штамма (2,2%) и 1 штамм (1,1%) были определены как M. gordonae, M. kansasii и M. chelonae, соответственно. Были определены две смеси из M. avium и M. intracellulare (2,2%), две смеси из M. avium и M. abscessus (2,2%), одна смесь из M. avium и M. mucogenicum (1,1 %) и одна смесь из M. avium и M. mucogenicum (1,1 %) (Таблица 4). Эти результаты хорошо согласуются с результатами, полученными с помощью REBA Myco-ID. Как видно из приведенных выше результатов, даже системы из двух или более нетуберкулезных микобактерий были выделены системой QMAP.

и

и

и

и
Total = общий, Co-infection = совместное заражение

Оценка эффективности устойчивости к рифампицину и изониазиду, определенная с помощью системы QMAP

Было выявлено, что 435 штамма из 531 штаммов представляют собой штаммы микобактерий туберкулеза. Из 435 штаммов 223 твердые бактериальные культуры, результаты для которых в обычном тесте на лекарственную чувствительность (DST) были известны, применяли для оценки эффективности устойчивости к рифампицину, определяемой системой QMAP. 27 (12,1%) из 223 штаммов микобактерий туберкулеза были подтверждены как устойчивые к рифампицину, что хорошо согласуется с традиционными результатами DST. Устойчивые области в 27 устойчивых штаммах представляли собой 531TTG (13, 48,1%), ΔWT4 (5, 18,5%), ΔWT5 и 526TAC (каждый по 3, 11,1%) и 516GTC, ΔWT4, ΔWT2 и ΔWT4 (каждый по 1, 3,7%). Эти результаты сравнивали с результатами, полученными с помощью REBA MTB-MDR по определению устойчивости к рифампицину. Устойчивость к рифампицину и области устойчивости, определенные с помощью системы QMAP, соответствовали областям, определенным с помощью REBA MTB-MDR. (Таблица 5).

Было выявлено, что 108 штаммов устойчивы к изониазиду. 82 (75,9%) из 108 штаммов были резистентны к katG 315 (таблица 6). Эти результаты сравнивали с результатами секвенирования ДНК для определения устойчивости к изониазиду. Устойчивость к изониазиду и области устойчивости, определенные с помощью системы QMAP, соответствовали этим параметрам, определенным с помощью REBA Myco-ID (Таблица 6).

INH-susceptible = чувствительный к INH, INH-resistance = устойчивый к INH

Wild type = дикий тип, Mutant type = мутантный тип

G-A at position = G-A в положении, C-A at position = C-A в положении

Кроме того, результаты, полученные с помощью системы QMAP, сравнивали с фенотипическими результатами DST. Полученные с помощью системы на основе QMAP чувствительности к устойчивости к рифампицину и изониазиду составили 96,4% (106/110) и 75% (108/144), соответственно. Напротив, при сравнении с результатами секвенирования ДНК чувствительность к устойчивости к рифампицину и изониазиду на основе QMAP была все 100% (124/124; 95% CI: 0,9743-1,0000) и 100% (110/110, 95% CI: 0,9711-1,0000) (Таблица 7).

5’-Biotin = 5’-Биотин, Rifampin = Рифампицин, Isoniazid = Изониазид

Продолжение таблицы 8

MTB complex = комплекс MTB

Продолжение таблицы 8

Продолжение таблицы 8

Сравнение заявляемого способа с традиционным способом REBA

Как видно из рис. 2, способом REBA Myco-ID обнаружили в общей сложности 19 видов, включая туберкулезную микобактерию. Напротив, дополнительные, по сравнению с REBA Myco-ID, 7 видов бактерий выделили с помощью способа диагностики, основанного на QMAP. В заключение, отметим, что система QMAP в соответствии с настоящим изобретением позволяет изолировать M. malmoense, M. phlei, M. smegmatis, M. xenopi, M. peregrinum, M. septicum и M. flavescens, а также 26 основных видов нетуберкулезных микобактерий (M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, комплекс M. abscessus, M. chelonae, комплекс M. fortuitum, M. ulcerans/M. marinum, M. kansasii, M. genavense/M. simiae, M. terrae, M. nonchromogenicum, M. celatum, M. gordonae, M. szulgai, M. mucogenicum и M. aubagnense), включая микобактерию туберкулеза.

REBA Myco-ID можно применять только для разграничения туберкулеза и NTM. В отличие от этого, способ диагностики на основе QMAP можно применять для быстрого определения устойчивости к рифампицину как наиболее важному первичному противотуберкулезному препарату. Следовательно, применение способа диагностики на основе QMAP может быть полезным при скрининге терапевтических средств от туберкулеза.

Основанный на QMAP молекулярный способ может быть применен для обнаружения устойчивых областей туберкулеза, восприимчивых и устойчивых к рифампицину и изониазиду (таблицы 5-7). Молекулярный способ на основе QMAP по настоящему изобретению показал лучшие результаты, чем традиционный способ. Применение способа REBA Myco-ID ограничено идентификацией туберкулезной микобактерии/NTM. Соответственно, для проведения дополнительного тестирования для определения устойчивости к рифампицину необходим другой способ молекулярный диагностики туберкулеза (например, REBA MTB-MDR). В противоположность этому, способ в соответствии с настоящим изобретением избавляет от необходимости дополнительного тестирования.

Другое преимущество способа диагностики на основе QMAP в соответствии с настоящим изобретением состоит в уменьшении времени, необходимого для обнаружения. При тестировании с помощью способа REBA Myco-ID обычно требуется не менее 5-ти часов для тестирования в 96-луночных планшетах (только для REBA). В отличие от этого, способ диагностики на основе QMAP может сократить время, необходимое для обнаружения, на 1 час и 40 минут. Эта экономия времени имеет огромное значение в диагностике.

1. Способ одновременного обнаружения и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определения устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду, включающий a) выделение ДНК из образцов, b) амплификацию ДНК с помощью ПЦР с применением праймеров с последовательностями, указанными в SEQ ID NO: 1-12, и c) гибридизацию продуктов ПЦР-амплификации с дисками, сопряженными с олигомерными зондами, имеющими последовательности, указанные в SEQ ID NOS: 13-68, и визуализацию дисков с помощью программного обеспечения QuantaMatrix.

2. Способ по п. 1, в котором туберкулёзную микобактерию и штаммы нетуберкулезных микобактерий выбирают из группы, состоящей из Mycobacterium tuberculosis H37Rv, M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. abscessus, M. chelonae, M. fortuitum, M. ulcerans, M. marinum, M. kansasii, M. genavense, M. simmiae, M. terrae, M. nonchromogenicum, M. celatum, M. gordonae, M. szulgail, M. mucogenicum, M. aubagnense, M. malmoense, M. phlei, M. smegmatis, M. xenopi, M. peregrinum и M. flavescens.

3. Способ по п. 1, в котором праймеры биотинилированы.

4. Набор для одновременного обнаружения и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и для определения устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду, включающий праймеры, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1-12, и диски, сопряженные с олигомерными зондами, имеющими последовательности, указанные в SEQ ID NO: 13-68.

5. Набор по п. 4, в котором туберкулёзную микобактерию и штаммы нетуберкулезных микобактерий выбирают из группы, состоящей из Mycobacterium tuberculosis H37Rv, M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. abscessus, M. chelonae, M. fortuitum, M. ulcerans, M. marinum, M. kansasii, M. genavense, M. simmiae, M. terrae, M. nonchromogenicum, M. celatum, M. gordonae, M. szulgail, M. mucogenicum, M. aubagnense, M. malmoense, M. phlei, M. smegmatis, M. xenopi, M. peregrinum и M. flavescens.

6. Набор по п. 4, в котором праймеры биотинилированы.