Способ оценки состояния мукозального иммунитета при урогенитальной инфекции у беременных

Авторы патента:


Способ оценки состояния мукозального иммунитета при урогенитальной инфекции у беременных
Способ оценки состояния мукозального иммунитета при урогенитальной инфекции у беременных
Способ оценки состояния мукозального иммунитета при урогенитальной инфекции у беременных
C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2715618:

Федеральное Бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционной патологии и иммунологии, и может быть использовано при прогнозировании исхода беременности при урогенитальной инфекции. Изобретение заключается в способе оценки состояния мукозального иммунитета у беременных с урогенитальной инфекцией с использованием классификационных правил линейного дискриминантного анализа уровней ЭГ TLRs. Задача решается таким образом, что у беременных с УГИ в соскобном материале со слизистых цервикального канала и/или влагалища устанавливают уровни ЭГ TLR2, TLR3, TLR8 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР РВ) с обратной транскрипцией (OT-Real-Time PCR). Затем для оценки состояния мукозального иммунитета рассчитывают значения классификационных функций по формулам, а полученные по формулам показатели классификационных линейных функций дискриминантного анализа F1, F2 и F3 применяют для установления их максимальных значений. При максимальном значении F1 устанавливают сниженное состояние мукозального иммунитета, при максимальном значении F2 устанавливают нормальное состояние мукозального иммунитета, при максимальном значении F3 устанавливают гиперреакцию мукозального иммунитета. 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционной патологии и иммунологии и может быть использовано при прогнозировании течения беременности, отягощенной урогенитальной инфекцией.

Основой формирования различных гестационных осложнений является влияние неблагоприятных факторов, среди которых наибольшее значение имеют стресс, преморбидный фон, факторы инфекционной природы, гормональные нарушения, генетическая составляющая и т.д. Однако при наличии одних и тех же факторов риска развитие патологических состояний реализуется не во всех случаях. С другой стороны, патологические состояния при беременности развиваются не только у женщин группы высокого риска (при наличии отягощенного соматического или акушерско-гинекологического анамнеза), но и у практически здоровых женщин, поскольку беременность в ряде случаев является триггером патологических процессов.

Существующие способы прогнозирования гестационных осложнений обладают рядом недостатков. Использование ряда способов прогнозирования течения беременности предполагается только во второй половине гестации (при полностью сформировавшейся плаценте, визуализации плодово-плацентарного кровообращения, угрозе позднего выкидыша или преждевременных родов), что не всегда позволяет осуществлять превентивные меры по предотвращению формирования патологических состояний [патент РФ №2475752, патент РФ №2268466, патент РФ №2290861, патент РФ №2401069, патент РФ №2300770]. Ряд способов прогнозирования исхода беременности связан с их использованием в отношении определенного контингента женщин, что существенно сужает круг обследуемых и снижает ценность разработанных технологий. Так, известны способы прогнозирования исхода беременности у женщин с привычным невынашиванием и высоким перинатальным риском [патент РФ №2033608], способы прогноза ранних репродуктивных потерь при наличии угрозы прерывания беременности [патент РФ №2103686, патент РФ №2033607.], инфекционного фактора [патент РФ №2444734, патент РФ №2281504, патент РФ №2341799, патент РФ №2281504, патент РФ №2501017], состояния микробиоценоза слизистых открытых полостей (патент РФ №2578028), имеющегося прерывания беременности в анамнезе [патент РФ №2454669] и другие. Вышеперечисленные факторы как изолированно, так и в сочетании друг с другом могут обусловливать нарушения процессов имплантации и плацентации, а также гемодинамические сдвиги, опосредующие в итоге нарушения в системе «мать-плацента-плод». Узконаправленный подход к прогнозированию исходов беременности, ограниченный либо конкретным патологическим состоянием, либо применением способа прогноза у определенного контингента женщин, не дает возможности оценить риск реализации гестационных осложнений в целом, что является наиболее востребованным как у пациенток с отягощенным акушерским анамнезом, так и у первобеременных женщин.

В связи с этим наиболее ценными являются безопасные (неинвазивные или малоинвазивные) способы прогнозирования исходов беременности, позволяющие вне зависимости от вида патологии и на ранних сроках гестации дифференцировать физиологическое и осложненное течение беременности.

Существенную роль при прогнозировании течения беременности играет состояние мукозального иммунитета. (патент 2556958)

Под местным (мукозальным) иммунитетом подразумевается комплекс клеточных и секреторных неспецифических и специфических реакций, включающий барьерные функции клеток кожи и слизистых оболочек, фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов, Т-клеточный иммунитет, антитела, антимикробные белки внешних секретов, ингибиторы ферментов, цитокины. Местный иммунитет не отождествляется с секреторным иммунитетом, но в качестве его центрального звена рассматривается B-клеточный ответ лимфоидной ткани слизистых оболочек с участием железистого эпителия, поставляющего секреторный компонент. Понятие местного иммунитета в настоящее время включает совокупность реагирования всех клеток лимфоидного ряда, заселяющих слизистые оболочки, в кооперации с макрофагами, нейтрофильными и эозинофильными гранулоцитами, тучными клетками и другими клетками соединительной ткани и эпителия. Следовательно, микробиоценозы слизистых открытых полостей и мукозальный иммунитет можно рассматривать как интегральную структурно-функциональную систему организма.

Так, при изучении урогенитальных хламидиоза и уреаплазмоза была установлена взаимосвязь толл-подобных рецепторов - TLR (контролируют запуск цитокинового каскада местной антиинфекционной резистентности, через который запускаются иммуноглобулиновое звено и воспалительная реакция) с микрофлорой биотопа, определяющей колонизационную резистентность слизистых, характеризующую течение инфекционного процесса, выраженность клинических и лабораторных проявлений и исход заболевания (излечение, хронизация). Колонизационная резистетность выступает как неотъемлемая часть мукозального иммунитета.

В последнее время прогнозирование преждевременных родов, способа течения урогенитальных инфекций у беременных осуществляют на основании значений уровней экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета - TLR (патент РФ №2334233, патент РФ №2649127, патент РФ №2651707, патент РФ 2632435).

Технической проблемой, решаемой изобретением, является разработка способа ранней информативной оценки состояния мукозального иммунитета, по классификационным правилам линейного дискриминантного анализа уровней ЭГ TLRs, что позволяет прогнозировать течение и исход беременности на ранних сроках гестации.

Задача решена тем, что у беременных с урогенитальной инфекцией в соскобном материале со слизистых цервикального канала и/или влагалища устанавливают уровни ЭГ TLR2, TLR3, TLR8 в реакции ПЦР в режиме реального времени и с помощью линейного дискриминантного анализа оценивают состояние мукозального иммунитета.

Технический результат, получаемый в результате реализации предложенного способа, состоит в том, что заявляемый способ позволит контролировать динамику течения беременности и прогнозировать степень риска невынашивания беременности, повысить точность прогнозирования исхода беременности в 1 и 2 триместре при верифицированной урогенитальной инфекции для назначения своевременной адекватной терапии.

Иммунологическая система беременных обеспечивает одновременное развитие гестационного процесса и реакцию макроорганизма на плод и на инфекционный процесс (ИП), вызванный полиинфицированием. Мукозальный иммунитет (МИ) и рецепторы врожденного клеточного иммунитета - TLRs обеспечивают одновременно развитие беременности и ИП [1, 2]. При урогенитальной инфекции (УГИ) беременных различают стадию угнетения МИ (уровни экспрессии генов (ЭГ) TLR2 ниже 21,2 ОЕ, TLR4 ниже 23,0 ОЕ, TLR8 ниже 26,0 ОЕ), стадию физиологического состояния (TLRs - 22-23 ОЕ), стадию повышенной реакции (уровни ЭГ TLR2 - 21,2 ОЕ и выше, TLR4 - 23,0 ОЕ и выше, TLR8 - 26,0 ОЕ и выше), стадию гиперреакции (уровень ЭГ TLR8 выше 28 ОЕ) [3, 4]. Слизистые открытых полостей организма функционируют как единый орган, поэтому независимо от биотопа слизистых открытых полостей одновременно регистрируются однотипные изменения (одинаковые типы - степени) их микробиоценозов и однотипные изменения со стороны рецепторов врожденного иммунитета [5].

Наиболее близким аналогом - является «Способ ведения беременных с инфекционной патологией урогенитального тракта» (Патент №2649127), характеризующийся тем, что исследуют экспрессию генов рецепторов врожденного иммунитета - состояние мукозального иммунитета, течение инфекционного и гестационного процессов. Предложен алгоритм ведения беременных на ранних сроках гестации с урогенитальной инфекцией, определяющий выбор лечебных мероприятий в зависимости от состояния мукозального иммунитета, течения инфекционного процесса и беременности.

В данном способе патента-аналога учитываются TLRs-опосредованные механизмы урогенитальной инфекции (УГИ) беременных, установлены пороговые значения соотношений уровней ЭГ TLRs при нарушении их функциональной активности в виде гиперреакции, сниженной реакции на паттерное воздействие микроорганизмов. Соотношения и уровни ЭГ, использующиеся для прогноза течения беременности и для оценки состояния мукозального иммунитета, представлены в таблице, значения которой основывались на обследовании 89 беременных I, II триместра гестации, в возрасте от 18 до 35 лет (средний возраст 27,5±5,6 лет). Дизайн исследования и методология верификации возбудителей УГИ беременных представлены в ранее опубликованных материалах (Караулов А.В., Афанасьев С.С., 2017 г.) [3, 4]. Разделение пациенток по характеру течения беременности: срочные роды (наличие инфицированности) - CP (инфицированность), срочные роды (наличие инфицированности и клинических проявлений - КПР) - CP, преждевременные роды (наличие инфицированности, КПР и рецидивов КПР) - ПР, прерывание беременности (наличие инфицированности, КПР и их рецидивов) - ПРБ, по прогнозу течения беременности (физиологическое течение, иммунологическое раздражение, осложненное течение, иммунологическое отторжение плода), установление типов дисбиоза слизистых цервикального канала, а также оценку ЭГ TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-8 (в относительных единицах - ОЕ) проводили согласно руководствам (Караулов А.В., Афанасьев С.С., 2017 г.; Воропаева Е.А., Караулов А.В., Афанасьев С.С., 2012 г.) [6, 7]. Клинические проявления УГИ беременных: острые респираторные инфекционно-воспалительные инфекции, лабильный герпес и другие проявления генитального герпеса рецидивирующего и нерецидивирующего характера в течении срока беременности [6, 7].

Статистический анализ. Подбор порога показателей ЭГ TLRs осуществлялся при помощи итерационных вычислений специфичности и чувствительности признака на основании доли пациентов с истинно положительными и отрицательными результатами [8]. Математическую обработку полученных данных проводили с использованием методов вариационной статистики (пакет Statistica 8.0. и MS OfficeExel 2010). По каждому признаку в сравниваемых группах определяли среднюю арифметическую величину (М) с средним квадратическим отклонением. Сравнение групп номинальных признаков проводили с помощью критерия χ2-Пирсона с поправкой Йетса. Для оценки силы корреляционной связи (КСВ) уровней ЭГ TLRs использовали корреляционный анализ Пирсона и Спирмена, а для оценки КСВ состояния МИ, прогноза течения беременности, КПР и рецидивов КПР и прочих категориальных переменных использовали корреляционный анализ Спирмена (при rs≥0,7 связь считали сильной; при 0,5≤rs<0,7 связь являлась средней; при rs<0,5 связь считали слабой. Если rs=0 - линейная связь отсутствует) [8, 9]. Нулевую гипотезу отвергали при критическом уровне значимости р<0,05. Для оценки различия средних значений выборок использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, который является альтернативой t-критерию Стьюдента (если распределение признаков не соответствует нормальному распределению) [10, 11]. Достоверность корреляции и различий по U-критерию Манна Уитни считали при уровне р<0,05 [12]. Для оценки прогностической ценности оценивали AUC (площадь под кривой) в ROC-анализе уровня ЭГ TLRs в зависимости от состояния МИ и выраженности ИП. Учитывали значения AUC выше 0,9, что соответствует высокому уровню специфичности и чувствительности данного параметра в классификации групп [12]. Для определения граничного уровня ЭГ (CutOff), разделяющих принадлежность данной концентрации к различным группам по состоянию МИ выраженности ИП, использовали значение ROC threshold (максимум чувствительности при максимальной специфичности).

Основным недостатком известного способа является то, что для оценки состояния мукозального иммунитета используется большое количество параметров, а решающие правила не формализованы для однозначного трактования результата.

Сущность изобретения заключается в том, что с использованием математического моделирования для оценки состояния мукозального иммунитета была рассчитана математическая модель с использованием линейного дискриминантного анализа, анализом сопряженности с прямой пошаговой процедурой включения показателей экспрессии генов TLR-2, TLR-3,TLR-8 (12).

При проведении дискриминантного анализа состояния мукозального иммунитета в результате анализа толерантности в пошаговой процедуре исключения показателей был исключен показатель TLR4 и заменен на TLR3.

Для количественного определения уровней ЭГ TLR2, TLR3 и TLR8 используют метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР РВ) с обратной транскрипцией (OT-Real-Time PCR), выполняемый с помощью амплификатора iCycler IQ5 («Bio-Rad», США). Уровни ЭГ TLRs стандартизируют по гену GAPDH. Полученный материал суспендируют в растворе EverFresh RNA (ЗAO "Силекс" г. Санкт-Петербург) в соотношении 1:5 относительно объема клеточной суспензии. Конструирование олигонуклеотидных праймеров к генам TLR2, TLR3, и TLR8 проводят с применением биоинформационного анализа комплексом компьютерных программ: Vector NTI Advance 9.0 (PC) (http://www.invitrogen.com/site/us/en/home.html), DNASTAR, BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/). Уровень экспрессии mRNA генов TLRs определяют с использованием специфических праймеров. Праймеры синтезированы на базе ЗАО «Синтол» (Москва). Уровни экспрессии mRNA TLRs контролируют (стандартизируют) по гену GAPTAH-F за счет сходной экспрессии этого гена среди человеческих тканей. Из исследуемого материала выделяют тотальную RNA согласно протоколу к наборам для выделения тотальной RNA на магнитных частицах SiO2 - бесфенольное выделение для микроанализа (ЗАО "Силекс", г. Санкт-Петербург). Синтез первой цепи cDNA проводят, согласно указаниям инструкции набора для синтеза первой цепи cDNA mRNA (базовый) (ЗАО "Силекс" г. Санкт-Петербург). Амплификацию с последующим определением уровнней ЭГ TLRs проводят методом PCR с детекцией накопления продуктов реакции "в режиме реального времени" (Real-Time PCR, USA) с помощью детектирующего амплификатора АНК-32 («Синтол», Россия) и специфических праймеров к TLR-2, TLR-3 и TLR-8. Количество исследуемых cDNA в образцах рассчитывают путем определения пороговых циклов PCR в РВ на образцах серийных разведений очищенного PCR-продукта в качестве матрицы. Нормализация количества изучаемых транскриптов к общему количеству cDNA в пробе проводится с помощью отношений TLR2/GAPDH, TLR3/GAPDH, TLR8/GAPDH. Для определения уровня экспрессии мРНК TLRs возможно использовать сравнительный СТ-метод (уровень СТ - номер цикла, при котором флуоресцентный сигнала превышает пороговое значение термоциклера). В сравнительном СТ-методе для относительного определения уровня экспрессии mRNA TLRs используют следующую арифметическую формулу: 2-ΔΔСт. Для расчета величины ΔΔСТ: - определяют величину ΔCT путем вычитания средней величины СТ эндогенного контроля (GAPDH) из средней величины СТ мишени: mRNA TLRs; - определяют величину ΔΔСТ путем вычитания величины ΔCT калибратора (TLRs здоровых пациентов) из величины ΔCT исследуемого образца (TLRs пациентов с патологией) [4]. ЭГ TLRs оценивают в относительных единицах (ОЕ).

Примерный протокол ведения исследования.

1. Сбор материала.

Материал необходимо собирать в фиксатор для стабилизации RNA такие как, EverFresh RNA (Силекс) или Фиксатор IntactRNA (Евроген). Полученный материал суспендировали в растворе EverFresh RNA (ЗАО "Силекс" г. Санкт-Петербург) в соотношении 1:5 относительно объема клеточной суспензии. До выделения RNA, образец в фиксаторе необходимо хранить при -20°С.

2. Выделение RNA.

Выделение RNA проводится с использованием коммерческих наборов таких как, «АмплиПрайм РИБО-сорб» AmpliSens (ЦНИИЭ, Россия), «РИБО-преп» AmpliSens (ЦНИИЭ, Россия), ExtractRNA (Евроген, Россия) или других, согласно протоколу производителя.

Протокол для выделения RNA с использованием коммерческого набора «РИБО-преп» AmpliSens (ЦНИИЭ, Россия).

Раствор для лизиса (если он хранился при температуре от 2 до 8°С) прогреть при температуре 65°С до полного растворения кристаллов.

Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл с плотно закрывающимися крышкам. Добавить в пробирки по 300 мкл раствора для лизиса. Промаркировать пробирки.

В пробирки с раствором для лизиса, внести по 100 мкл подготовленных проб, используя наконечники с аэрозольным барьером.

Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе, процентрифугировать в течение 5 с на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки и прогреть 5 мин при 65°С в термостате.

Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешать на вортексе.

Процентрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 5 мин при 13 тыс об/мин.

Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 200 мкл для каждой пробы.

Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки, осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно провести процедуру одновременно для всех пробирок, для этого необходимо накрыть пробирки в штативе сверху крышкой или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив.

Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге.

Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.

Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.

Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге.

Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.

Поместить пробирки в термостат при температуре 65°С на 5 мин для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты).

Добавить в пробирки по 50 мкл RNA-буфера. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 65°С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе. Допускается при необходимости увеличение объема элюции до 90 мкл.

Процентрифугировать пробирки при 13 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге.

Надосадочная жидкость содержит очищенные RNA и DNA. Пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции и PCR. После выделения RNA, рекомендуется сразу произвести обратную транскрипцию. Выделенную RNA хранить при -20°.

3. Обратная транскрипция.

Для получения cDNA на матрице, выделенной RNA, используются коммерческие наборы для обратной транскрипции такие как «PEBEPTA-L» (AmpliSens, ЦНИИЭ, Россия), набор реактивов MMLV RT kit (Евроген, Россия), согласно протоколу производителя.

Протокол проведения обратной транскрипции с использованием коммерческого набора «PEBEPTA-L» AmpliSens (ЦНИИЭ, Россия).

Отобрать необходимое количество микропробирок объемом 0,2 мл.

Приготовить реакционную смесь на 12 реакций. Для этого в пробирку с RT-mix внести 5 мкл RT-G-mix-1 (RT-G-mix-2), тщательно перемешать на вортексе, осадить капли с крышки пробирки кратковременным центрифугированием.

К полученному раствору добавить 6 мкл ревертазы (MMlv), пипетировать 5 раз, перемешать на вортексе. Осадить капли с крышки пробирки кратковременным центрифугированием.

Внести в микропробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси.

Используя наконечники с аэрозольным барьером, добавить по 10 мкл RNA-пробы в пробирки с реакционной смесью. Осторожно перемешать пипетированием.

Поставить пробирки в амплификатор (термостат) с температурой 37°С на 30 мин.

Полученную в реакции обратной транскрипции cDNA для последующей постановки PCR развести в 2 раза DNA-буфером (к 20 мкл cDNA отдельным наконечником с аэрозольным барьером добавить 20 мкл DNA-буфера, аккуратно перемешать пипетированием 10 раз). Полученную cDNA хранить при -20°С.

4. Проведение ОТ-ПЦР.

ОТ ПЦР проводится в готовых 2,5-кратных реакционных смесях, содержащих краситель SYBR Green (НПО "Синтол").

Последовательность используемых праймеров:

Для каждой пары праймеров готовится реакционная смесь в отдельных пробирках, расчет на один образец следующий:

2,5 кратная реакционная смесь - 10 мкл;

25 mM MgCl2 - 1 мкл;

прямой праймер (10 mM) - 0,5 мкл;

обратный праймер (10 mM) - 0,5 мкл;

вода - 9 мкл;

матрица cDNA - 1 мкл.

Каждый клинический образец ставится в трех повторах.

Параметры циклов амплификации:

1) 95°С - 10 мин;

2) 50 циклов: 94°С 20 сек, 58°С 20 сек, 72°С 20 сек.

5. Обсчет результатов.

Детекция проводится на светофильтре FAM, оценивается уровень СТ-номера цикла, при котором флуоресцентный сигнала превышает пороговое значение. Для определения уровня экспрессии mRNA TLRs используется сравнительный СТ-метод. В сравнительном СТ-методе для относительного определения количества используют арифметические формулы, а не стандартную кривую. Количество мишени, нормированное на количество эндогенного контроля и по отношению к калибратору, определяют по формуле

2-ΔΔСт.

Чтобы выполнить расчет величины ΔΔCT:

- определяют величину ΔCT путем вычитания средней величины СТ эндогенного контроля (GAPDH) из средней величины СТ мишени: mRNA TLRs; - определяют величину ΔΔСТ путем вычитания величины ΔCT калибратора (TLRs здоровых пациентов) из величины ΔCT исследуемого образца (TLRs пациентов с патологией). ЭГ TLRs оценивают в относительных единицах (ОЕ).

Для расчета диагностических коэффициентов, определяющих состояние мукозального иммунитета был использован метод линейного дискриминантного анализа, анализом сопряженности с прямой пошаговой процедурой включения показателей экспрессии генов TLR2, TLR3 и TLR8. Значения полученных диагностических коэффициентов состояния мукозального иммунитета сравниваются между собой. Состояние мукозального иммунитета определяют по максимальному значению соответствующей функции.

Состояние мукозального иммунитета (СМИ). Расчет диагностической формулы состояния мукозального иммунитета был проведен на основании данных экспрессии генов TL рецепторов пациентов с физиологическим, нормальным состоянием мукозального иммунитета, нарушенным, пониженным состоянием и гиперреакцией.

Статистическая значимость дискриминации групп подтверждается достоверными значениями квадратов расстояний Махалонобиса между всеми центроидами: «Физиологическое состояние - снижение» = 3,61 (p=2,2810-16); «Физиологическое состояние - гиперреакция» = 12,32 (р=1,5210-11); «Снижение - гиперреакция» = 16,08 (р=5,5810-14).

Диагностические коэффициенты, используемые для классификации состояния мукозального иммунитета имеют вид классификационных функций:

F1=-15,1728+1,1512×TLR2+0,5478×TLR3-0,0551×TLR8

F2=-26,3414+1,4962×TLR2+0,6706×TLR3+0,0367×TLR8

F3=-30,925+2,0642×TLR2-0,5254×TLR3+0,5283×TLR8

где:

F1 - значение диагностического коэффициента, указывающее на снижение состояния мукозального иммунитета,

F2 - значение диагностического коэффициента, указывающее на нормальное состояние мукозального иммунитета,

F3 - значение диагностического коэффициента, указывающее на состояние гиперреакции мукозального иммунитета

TLR2 - экспрессия генов TLR2, ОЕ,

TLR3 - экспрессия генов TLR3, ОЕ,

TLR8 - экспрессия генов TLR8, ОЕ.

При максимальном значении F1 устанавливают сниженное состояние мукозального иммунитета, при максимальном значении F2 устанавливают нормальное состояние мукозального иммунитета, при максимальном значении F3, устанавливают гиперреакцию мукозального иммунитета.

В результате проведенных нами исследований впервые были получены решающие правила, позволяющие оценить состояние мукозального иммунитета.

Заявленный способ оценки состояния мукозального иммунитета является новым и в литературе не описан.

Впервые оценка состояния мукозального иммунитета проводится при одновременном использовании уровней ЭГ TLR2, TLR3 и TLR8 в сочетании с определением значения классификационной линейной функции дискриминантного анализа, указывающего на вероятность сниженного состояния МИ, значения классификационной линейной функции дискриминантного анализа, указывающего на гиперреакцию МИ, и значения классификационной линейной функции дискриминантного анализа, указывающего на нормальное состояние МИ у беременных с УГИ с высокой достоверностью (77,8%).

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - обеспечения ранней информативной оценки состояния мукозального иммунитета.

Предлагаемый способ может быть реализован многократно.

Заявляемое изобретение апробировано при обследовании 89 беременных с УГИ. Ниже приводятся результаты этой апробации.

Пример 1. Пациентка Б. Клиника невынашивания: угроза прерывания беременности; жалобы на тянущие боли внизу живота; бели. Клинические проявления генитального герпеса и ОРВИ во время беременности.

Уровни экспрессии генов TLR:

TLR2 - 12,1 ОЕ;

TLR 3 - 12,1 ОЕ;

TLR 8 - 9,3 ОЕ;

Затем рассчитали значения диагностических коэффициентов модели СМИ по формулам:

F1=-15,1728+1,1512×TLR2+0,5478×TLR3-0,0551×TLR8

F2=-26,3414+1,4962×TLR2+0,6706×TLR3+0,0367×TLR8

F3=-30,925+2,0642×TLR2-0,5254×TLR3+0,5283×TLR8

где:

F1 - значение диагностического коэффициента, указывающее на снижение состояния мукозального иммунитета,

F2 - значение диагностического коэффициента, указывающее на нормальное состояние мукозального иммунитета,

F3 - значение диагностического коэффициента, указывающее на состояние гиперреакции мукозального иммунитета

TLR2 - экспрессия генов TLR2, ОЕ,

TLR3 - экспрессия генов TLR3, ОЕ,

TLR8 - экспрессия генов TLR8, ОЕ.

Данные значения составили: для F1=4,87, для F2=0,22, для F3=-7,39.

В связи с тем, что значение F1 было больше значения F2 и F3, установили сниженное состояние мукозального иммунитета. Таким образом у пациентки Б. отмечается сниженное состояние мукозального иммунитета.

Пример 2. Пациентка К. Клиника невынашивания: угроза прерывания беременности; жалобы на тянущие боли внизу живота; бели. Клинические проявления генитального герпеса и ОРВИ во время беременности.

Уровни экспрессии генов TLRs:

TLR 2-21,1 ОЕ;

TLR 3 - 24,0 ОЕ;

TLR 8 - 26,8 ОЕ;

Затем рассчитали диагностические коэффициенты модели СМИ по формулам:

F1=-15,1728+1,1512×TLR2+0,5478×TLR3-0,0551×TLR8

F2=-26,3414+1,4962×TLR2+0,6706×TLR3+0,0367×TLR8

F3=-30,925+2,0642×TLR2-0,5254×TLR3+0,5283×TLR8

где:

F1 - значение диагностического коэффициента, указывающее на снижение состояния мукозального иммунитета,

F2 - значение диагностического коэффициента, указывающее на нормальное состояние мукозального иммунитета,

F3 - значение диагностического коэффициента, указывающее на состояние гиперреакции мукозального иммунитета

TLR2 - экспрессия генов TLR2, ОЕ,

TLR3 - экспрессия генов TLR3, ОЕ,

TLR8 - экспрессия генов TLR8, ОЕ.

Данные значения составили: для F1=20,788, для F2=22,306, для F3=14,178. Значение F2 было больше значений F1 и F3, поэтому установили нормальное, физиологическое состояние мукозального иммунитета.

Таким образом, у пациентки К. отмечается нормальное, физиологическое состояние мукозального иммунитета

Пример 3. Пациентка О. Клиника невынашивания: неразвивающаяся беременность, самопроизвольный аборт.

Для оценки состояния мукозального иммунитета у пациентки определили в полимеразно цепной реакции соскоба со стенок влагалища уровни экспрессии генов TLR:

TLR2 - 26,1 ОЕ;

TLR3 - 12,1 ОЕ;

TLR 8 - 29,8 ОЕ;

Затем рассчитали диагностические коэффициенты модели СМИ по формулам:

F1=-15,1728+1,1512×TLR2+0,5478×TLR3-0,0551×TLR8

F2=-26,3414+1,4962×TLR2+0,6706×TLR3+0,0367×TLR8

F3=-30,925+2,0642×TLR2-0,5254×TLR3+0,5283×TLR8

где:

F1 - значение диагностического коэффициента, указывающее на снижение состояния мукозального иммунитета,

F2 - значение диагностического коэффициента, указывающее на нормальное состояние мукозального иммунитета,

F3 - значение диагностического коэффициента, указывающее на состояние гиперреакции мукозального иммунитета

TLR2 - экспрессия генов TLR2, ОЕ,

TLR3 - экспрессия генов TLR3, ОЕ,

TLR8 - экспрессия генов TLR8, ОЕ.

Данные значения составили: для F1=19,85992, для F2=21,91734, для F3=32,33662.

В связи с тем, что округленное значение F3 было больше значения F1 и F2, установили гиперактивацию мукозального иммунитета.

Таким образом, у пациентки О. отмечается гиперактивация мукозального иммунитета.

Список литературы

1. Караулов А.В., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Бондаренко Н.Л., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С. и др. Роль возбудителей и факторов врожденного иммунитета в патогенезе урогенитальной инфекции беременных. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2018; 17 (2): 77-88. doi: 10.20953/1726-1678-2018-2-77-88

2. Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Несвижский Ю.В., Караулов А.В., Кафарская Л.И. и др. Роль и биологическое значение толл-подобных рецепторов в антиинфекционной резистентности организма. Вестник Российской академии медицинских наук. 2008; (1): 45-55.

3. Караулов А.В., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Бондаренко Н.Л., Агаева М.И., Воропаева Е.А. и др. Роль TLR и факторов мукозального иммунитета в патогенезе и предупреждении прерывания беременности при урогенитальной инфекции. Инфекционные болезни. 2017; 15(4): 82-90. doi: 10.20953/1729-9225-2017-4-82-90

4. Караулов А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Бондаренко Н.Л., Агаева М., Воропаева Е.А. и др. Роль TLR в патогенезе и диагностике урогенитальных инфекций женщин. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2017; 16 (4): 32-38. doi: 10.20953/1726-1678-2017-4-32-38

5. Микробиоценозы и здоровье человека / Под ред. В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева, А.В. Караулова. М.: Династия, 2015.

6. Караулов А.В., С.С. Афанасьев, Ю.В. Несвижский, В.А. Алёшкин, М.С. Афанасьев, Е.А. Воропаева и др. Мукозальный иммунитет и колонизационная резистентность слизистых открытых полостей человека в норме и при патологических состояниях. Учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования врачей. Регистрационный номер рецензии Координационного совета по области образования «Здравоохранение и медицинские науки»: №048 ЭКУ от 15 декабря 2016 г. М.: Издательство Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова; 2017.

7. Воропаева Е.А., Караулов А.В., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Макаров О.В., Несвижский Ю.В. и др. Оценка микробиоценоза влагалища при акушерской и гинекологической патологии (новая медицинская технология). ФС №2009/187 от 17. 07. 2009. Москва-Астрахань: Изд-во Астраханской государственной медицинской академии; 2012.

8. Гринхальд Т. Основы доказательной медицины. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2008.

9. Гржибовский A.M. Корреляционный анализ в медицинских исследованиях. Бюллетень Саратовского государственного медицинского университета. 2000; (2): 22-23.

10. Зайцев В.М., Лифляндский В.Г., Маринкин В.И. Прикладная медицинская статистика. СПб.: Фолиант; 2008.

11. Крамер Г. Математические методы статистики. М.: Мир; 1975.

12. Боровиков В.П. STATISTICA, искусство анализа данных на компьютере. СПб.: Издательство «Питер»; 2003.

Способ оценки состояния мукозального иммунитета при урогенитальной инфекции у беременных, характеризующийся тем, что у беременных с урогенитальной инфекцией определяют уровни экспрессии генов TLR2, TLR3, TLR8 в соскобе со слизистых цервикального канала и/или влагалища с помощью ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией, затем с использованием линейного дискриминантного анализа рассчитывают диагностические коэффициенты, оценивающие состояние мукозального иммунитета по формулам:

F1=-15,1728+1,1512×TLR2+0,5478×TLR3-0,0551×TLR8;

F2=-26,3414+l,4962×TLR2+0,6706×TLR3+0,0367×TLR8;

F3=-30,925+2,0642×TLR2-0,5254×TLR3+0,5283×TLR8,

где:

F1 - значение диагностического коэффициента, указывающее на снижение состояния мукозального иммунитета,

F2 - значение диагностического коэффициента, указывающее на нормальное состояние мукозального иммунитета,

F3 - значение диагностического коэффициента, указывающее на состояние гиперреакции мукозального иммунитета;

при максимальном значении F1 устанавливают сниженное состояние мукозального иммунитета, при максимальном значении F2 устанавливают нормальное состояние мукозального иммунитета, при максимальном значении F3 устанавливают гиперреакцию мукозального иммунитета.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области молекулярной биологии. Разработан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа методом ПЦР, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонда, сконструированного по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего флуоресцентную детекцию продукта амплификации размером 116 п.н.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к одновременному обнаружению и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определению устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду, а также к набору для одновременного обнаружения и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и для определения устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. Предложен способ диагностики нарушений гормонального статуса у мужчин, включающий гормональное исследование на пролактин, эстрадиол, тестостерон, индекс свободного тестостерона и глобулин, связывающий половые гормоны (ГСПГ).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской диагностике. Предложен набор реагентов, включающий олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентно-меченые ДНК-зонды, позволяющий достоверно выявлять специфические геномные участки микроорганизмов рода Brucella с одновременной идентификацией эпидемиологически значимых видов В.abortus, B.suis, B.canis, B.melitensis в образцах различного происхождения методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам определения полиморфизма гена, ассоциированного с нежелательным рецессивным генетическим дефектом дупликации развития, характерного для крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, а именно гена NHLRC2, ассоциированного с гаплотипом DDC.

Изобретение относится к биотехнологии и связано с диагностикой и лечением злокачественных опухолей, а конкретно, со способом диагностики наличия метастазов злокачественной опухоли путем детектирования в плазме Hsp90α, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в качестве опухолевого маркера.

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, онкологии и реабилитологии. Предложен способ прогнозирования развития антрациклин-индуцированной кардиотоксичности после полихимиотерапии антибиотиками антрациклинового ряда у пациенток с раком молочной железы.

Изобретение относится к области медицины, в частности к дерматологии, и предназначено для прогнозирования риска возникновения кожной патологии в виде меланоза или дисхромии, ассоциированной с избыточной контаминацией мышьяком.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оптимизации крупномасштабной продукции парвовируса в существенно бессывороточной среде. Описан способ оптимизации продукции парвовируса, включающий существенно бессывороточную среду, которая позволяет увеличить продукцию парвовируса по сравнению со стандартной средой, предпочтительно для продукции H-1PV.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана система CRISPR класса 2, содержащая: (i) единичный полинуклеотид, содержащий (a) нацеленную на мишень область, содержащую дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК); и (b) активирующую область, смежную с указанной нацеленной на мишень областью, содержащую ДНК; и где указанная активирующая область содержит стебель и выпетливание и способна взаимодействовать с белком Cas9; и (ii) Cas9.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области молекулярной биологии. Разработан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа методом ПЦР, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонда, сконструированного по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего флуоресцентную детекцию продукта амплификации размером 116 п.н.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области молекулярной биологии. Разработан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа методом ПЦР, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонда, сконструированного по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего флуоресцентную детекцию продукта амплификации размером 116 п.н.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к одновременному обнаружению и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определению устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду, а также к набору для одновременного обнаружения и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и для определения устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к одновременному обнаружению и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определению устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду, а также к набору для одновременного обнаружения и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и для определения устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. Предложен способ диагностики нарушений гормонального статуса у мужчин, включающий гормональное исследование на пролактин, эстрадиол, тестостерон, индекс свободного тестостерона и глобулин, связывающий половые гормоны (ГСПГ).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской диагностике. Предложен набор реагентов, включающий олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентно-меченые ДНК-зонды, позволяющий достоверно выявлять специфические геномные участки микроорганизмов рода Brucella с одновременной идентификацией эпидемиологически значимых видов В.abortus, B.suis, B.canis, B.melitensis в образцах различного происхождения методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской диагностике. Предложен набор реагентов, включающий олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентно-меченые ДНК-зонды, позволяющий достоверно выявлять специфические геномные участки микроорганизмов рода Brucella с одновременной идентификацией эпидемиологически значимых видов В.abortus, B.suis, B.canis, B.melitensis в образцах различного происхождения методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам определения полиморфизма гена, ассоциированного с нежелательным рецессивным генетическим дефектом дупликации развития, характерного для крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, а именно гена NHLRC2, ассоциированного с гаплотипом DDC.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам определения полиморфизма гена, ассоциированного с нежелательным рецессивным генетическим дефектом дупликации развития, характерного для крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, а именно гена NHLRC2, ассоциированного с гаплотипом DDC.

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыты синтетические олигонуклеотиды для выявления ДНК вируса Torque teno virus рода Alphatorquevirus семейства Anelloviridae.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам определения полиморфизма гена, ассоциированного с нежелательным рецессивным генетическим дефектом дупликации развития, характерного для крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, а именно гена NHLRC2, ассоциированного с гаплотипом DDC.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционной патологии и иммунологии, и может быть использовано при прогнозировании исхода беременности при урогенитальной инфекции. Изобретение заключается в способе оценки состояния мукозального иммунитета у беременных с урогенитальной инфекцией с использованием классификационных правил линейного дискриминантного анализа уровней ЭГ TLRs. Задача решается таким образом, что у беременных с УГИ в соскобном материале со слизистых цервикального канала иили влагалища устанавливают уровни ЭГ TLR2, TLR3, TLR8 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с обратной транскрипцией. Затем для оценки состояния мукозального иммунитета рассчитывают значения классификационных функций по формулам, а полученные по формулам показатели классификационных линейных функций дискриминантного анализа F1, F2 и F3 применяют для установления их максимальных значений. При максимальном значении F1 устанавливают сниженное состояние мукозального иммунитета, при максимальном значении F2 устанавливают нормальное состояние мукозального иммунитета, при максимальном значении F3 устанавливают гиперреакцию мукозального иммунитета. 1 табл., 3 пр.

Наверх