Способ идентификации в иммунном репертуаре cdr3 участков, ассоциированных с заболеваниями

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен способ диагностики заболевания, которое вызывает ответ иммунной системы, включающий забор образца ткани или крови у каждого из многих субъектов в группе пациентов и в контрольной группе, где группа пациентов включает субъектов, которые имеют одинаковое заболевание, и контрольная группа включает субъектов, которые являются здоровыми; выделение лимфоцитов из каждого образца; выделение полинуклеотидов из лимфоцитов каждого образца; амплификацию выделенных полинуклеотидов с использованием способа arm-ПЦР и секвенирование иммунного репертуара каждого субъекта в каждой из двух групп для идентификации каждой уникальной последовательности CDR3, присутствующей в образцах, и для определения частоты встречаемости каждой уникальной последовательности CDR3; идентификацию последовательностей CDR3, которые являются общими между по меньшей мере двумя субъектами в каждой из контрольной группы и группы пациентов; ранжирование последовательностей CDR3 по порядку частоты встречаемости; идентификацию связок из каждой группы; и идентификацию связок, которые в статистически значимой степени ассоциированы с группой пациентов, с предоставлением сигнатуры заболевания. Способ позволяет улучшить оценку иммунного ответа, что может быть использовано для разработки диагностического анализа для разных заболеваний. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственную заявку

В данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США №62/130512, названной «Способ идентификации в иммунном репертуаре CDR3 участков, ассоциированных с заболеваниями» и поданной 9 марта 2015 г., которая включена в данный документ посредством ссылки.

Область изобретения

Данное изобретение относится к способам распознавания у человеческих и/или животных субъектов иммунных репертуаров, ассоциированных с заболеваниями, и к применению таких способов для диагностики заболевания и для исследования процессов заболевания.

Предшествующий уровень техники

Разнообразные рецепторы антигенов Т- и В-лимфоцитов продуцируются соматической рекомбинацией ограниченного, но большого числа сегментов генов. Данные сегменты генов - V (вариабельный), D (разнообразие), J (соединительный) и С (константный) - определяют специфичность связывания и последующие применения иммуноглобулинов и рецепторов Т-клеток (TCR, от англ. Т Cell receptors). Подвергнувшаяся реаранжировке часть V(D)J рецептора, именуемая V-область, представляет огромный интерес, так как она отвечает за распознавание эпитопов. При трансляции V(D)J в аминокислотную последовательность V-область может подразделяться на несколько частей, состоящих из лидерной последовательности, каркаса (FR) 1, гипервариабельной области 1 (CDR1), FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 и С-доменов.

CDR3 представляет особый интерес, так как исследования показали то, что данная область ассоциирована со специфичностью в отношении антигена. По сравнению с нормальными субъектами, пациенты с разными заболеваниями могут претерпевать количественные и/или качественные изменения в их иммунном репертуаре. Количественные изменения могут проявляться в виде увеличений и уменьшений разнообразия иммунного репертуара. Качественные изменения могут присутствовать в виде повышенного перекрывания специфичных в отношении заболевания CDR3 в Т- или В-клетках.

Иммунная система создает ответ на разные состояния, такие как раковое заболевание, бактериальные инфекции, вирусные инфекции и грибковые инфекции. Кроме того, у некоторых субъектов она может на самом деле продуцировать вредный ответ на ткани организма, например, приводя к аутоиммунному заболеванию или отторжению трансплантатов. Типы и степени данных иммунных ответов могли бы, при точной оценке, потенциально быть одними из самых важных и точных индикаторов присутствия или отсутствия конкретного заболевания или нежелательных иммунных ответов.

Однако оценивается, что люди имеют без малого 1015-1025 разных Т-клеток из-за целого ряда возможных реаранжировок VDJ, n-присоединений и комбинаций альфа-бета цепи. Предполагая то, что для конкретного заболевания имеются лишь 103 специфичных для заболевания CDR3, которые могут количественно (через повышающую или понижающую регуляцию) или качественно (через приобретение или потерю) изменяться, отношение сигнала к шуму в данных обстоятельствах является очень слабым. Следовательно, традиционные способы являются непрактичными для оценки данной информации для диагностических целей.

То, что требуется - это улучшенные способы оценки иммунного ответа и разработки диагностических анализов на основе такого иммунного ответа и формирующегося в результате иммунного репертуара.

Краткое изложение сущности изобретения

В одном воплощении настоящее раскрытие относится к способу разработки диагностического анализа с использованием иммунного репертуара, включающему следующие стадии: (а) забор образца от каждого из многих субъектов в группе пациентов и в контрольной группе, где группа пациентов содержит субъектов, которые имеют одинаковое заболевание, и контрольная группа содержит субъектов, которые классифицируются как здоровые; (б) амплификация и секвенирование иммунного репертуара каждого субъекта в каждой из двух групп для идентификации каждой уникальной последовательности CDR3, присутствующей в образце, и для определения частоты появления каждой уникальной последовательности CDR3; (в) идентификация последовательностей CDR3, которые являются общими между по меньшей мере двумя субъектами в каждой из контрольной группы и группы пациентов; (г) ранжирование идентифицированных последовательностей CDR3 по порядку частоты встречаемости; (д) идентификация связок из каждой группы; и (е) идентификация связок, которые в статистически значимой степени ассоциированы с группой пациентов с предоставлением сигнатуры заболевания.

В некоторых воплощениях образец представляет собой периферическую кровь. В других воплощениях образец представляет собой ткань. В некоторых воплощениях в качестве общих между по меньшей мере двумя субъектами идентифицируется меньше чем 1000 CDR3. В других воплощениях в качестве общих между по меньшей мере двумя субъектами идентифицируются по меньшей мере 1000 CDR3. В некоторых воплощениях из каждой группы идентифицируются по меньшей мере примерно 106 связок. В других воплощениях из каждой группы идентифицируются меньше чем 106 связок.

Краткое описание графических материалов

Данное раскрытие можно лучше понять со ссылкой на следующие графические материалы.

Фиг. 1 представляет собой рисунок, иллюстрирующий базовую идею раскрытого способа, где данные по полинуклеотидной последовательности из клеток иммунной системы обрабатываются с использованием программы, разработанной для сортировки и подсчета последовательностей, их ранжирования по номерам частот, получения значений р и других критериев, с получением диагностической сигнатуры из связок, обозначенных как «значимые связки».

Фиг. 2 представляет собой таблицу, иллюстрирующую ранжирование CDR3 по числу клонов, присутствущих в образце. Типично результат секвенирования из одного образца будет генерировать без малого 400000 CDR3. Каждая CDR3 ассоциирована с числом считываемых фрагментов; из-за полуколичественной природы способа амплификации (arm-ПЦР) число считываемых фрагментов также отражает относительную распространенность клона. Анализ посредством программы устраняет ошибки и ранжирует CDR3 с получением файла результатов, как показано в таблице.

Фиг. 3 представляет собой таблицу, иллюстрирующую то, как в последовательностях, полученных из образцов крови, выявляются связки. Последовательности CDR3 подсчитываются с предоставлением списка последовательностей CDR3, которые присутствуют в образце крови в наибольшем количестве. Среди данных последовательностей CDR3 связки представляют собой пары CDR3, которые присутствуют в одном и том же образце на уровне, который выше, чем обозначенный уровень отсечения.

Фиг. 4 представляет собой репрезентативный список некоторых связок, идентифицированных во время исследования рака молочной железы (сравнение между связками, выявленными в двух исследуемых группах - первой группе субъектов, у которых был поставлен диагноз рака молочной железы, и второй группе субъектов, которые были определены как здоровые контроли).

На Фиг. 5 перечислены публичные связки, выявленные в исследовании рака молочной железы на основе их значений р. Первой по рангу связкой, например, является пара CDR3 «ASSYSRGEEF» и «ASSLGRTHQPQH», и данная связка была общей в 32 из 98 образцов пациентов с раком молочной железы, тогда как лишь 1 из 106 контрольных образцов имел ее. Значение р составляло 0. В конечный список включаются только те связки со значением р меньше 0,05, которые представляют диагностическую сигнатуру рака молочной железы. Всего было идентифицировано 101902 значимых связки.

Фиг. 6 представляет собой диаграмму разброса данных, иллюстрирующую результаты в трех группах: контроль, рак молочной железы и CMV (цитомегаловирус). Анализ кривой зависимости чувствительности от частоты ложно положительных заключений (ROC, от англ. receiver operating characteristic) свидетельствовал о значении порога отсечения 600 DSL (от англ. Disease Signature Linklet - сигнатурная связка заболевания). Из 103 пациентов с раком молочной железы 98 имели больше, чем 600 значимых связок; из 110 контролей только 7 имели больше, чем 600 значимых связок. Диагностические чувствительность и специфичность, следовательно, составляли 95% и 93% соответственно. При исследовании 188 образцов, не являющихся образцами рака молочной железы (от пациентов, включенных в исследование CMV), относительно сигнатуры заболевания раком молочной железы только 3 образца были ложно положительными с более чем 600 значимых связок, давая специфичность 98,4%.

Подробное описание изобретения

Настоящее раскрытие, в общем, относится к способу разработки диагностических анализов, которые основываются на иммунном ответе и образующемся в результате иммунном репертуаре. Раскрытый в настоящем изобретении способ увеличивает сигнал и уменьшает фон, позволяя идентифицировать общие CDR3, которые можно использовать для получения сигнатуры заболевания. Раскрытый в настоящем изобретении способ может быть использован для разработки диагностического анализа для разных заболеваний, включающих рак, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание и инфекционное заболевание, но не ограничивающихся ими.

Термин «заболевание» в том виде, в котором он используется в данном документе, включает диагностированное заболевание и другие нарушения, диагностированные и недиагностированные, по отношению к нормальному состоянию здоровья субъекта.

Термин «здоровый» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает не демонстрирующий в настоящее время симптомов, и у которого в настоящее время не диагностировано заболевание.

Термин «иммунный репертуар» в том виде, в котором он используется в данном документе, включает функционально разнообразные Т- и В-клетки субъекта.

«Связка» в том виде, в котором данный термин используется в данном документе, представляет собой пару уникальных CDR3, которые присутствут в одном и том же образце. Когда у двух или более чем двух людей имеется общая конкретная связка, она представляет собой «публичную связку». Если связка выявляется только у одного субъекта, она представляет собой «приватную связку». Публичные связки происходят из публичных CDR3 (т.е. CDR3, которые выявляются у более чем одного субъекта). В общем, репертуар каждого субъекта является, главным образом, «приватным», и лишь маленькая процентная доля данного иммунного репертуара субъекта представляет собой общие CDR3. Публичные связки, следовательно, присутствуют на значительно меньшем уровне, чем приватные связки, причем данный факт делает более затруднительной идентификацию сигнатур заболевания. Следовательно, важно использовать подход, в котором уменьшается фон для обеспечения идентификации значимого репертуара CDR3, который составляет одну или более чем одну сигнатуру заболевания.

Термин «образец» в том виде, в котором он используется в данном документе, включает кровь и ткань. В некоторых воплощениях кровь представляет собой периферическую кровь, забранную у субъекта. В некоторых воплощениях ткань представляет собой биопсию, полученную у субъекта.

Термин «субъект» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает человека или животное.

В некоторых воплощениях в раскрытом в настоящем изобретении способе уменьшается фон посредством применения «позитивных связок». При секвенировании двух последовательностей CDR3 - А и В - также получается количественная информация, представленная числами считываемых фрагментов. Если используемый способ амплификации иммунного репертуара является полуколичественным (arm-ПЦР), и если CDR3-A экспрессируется в образце на более высоком уровне, чем CDR3-B, для А будет получено большее число считываемых последовательностей, чем для В. При таком сценарии пара А-В обозначается как положительная связка, тогда как пара В-А была бы обозначена как отрицательная связка. В некоторых воплощениях способа, раскрытого в настоящем изобретении, для дальнейшего анализа используются только положительные связки. Применение положительных связок обогащает диагностический сигнал, так как оно помогает отфильтровать экспериментальный шум.

Биологически с конкретным заболеванием обычно ассоциирован более чем один антиген или эпитоп. Следовательно, релевантные рецепторы Т- и В-клеток обычно появлялись бы в образцах пациентов в виде кластеров. Количественная информация, предоставленная положительными связками (и отрицательными связками) может отражать специфичный для заболевания профиль экспрессии антигенов.

Экспериментальные методики могут вносить дополнительный «шум» в полученные данные. Например, обычной практикой является объединение многих образцов от разных субъектов в один прогон секвенирования для уменьшения затрат (иммунный репертуар амплифицируется раздельно с использованием праймеров со штрих-кодом). Однако, если CDR3 является очень доминирующей в одном образце, она будет проявляться на чипе для секвенирования много раз. Данный доминирующий клон будет иметь вероятность 1/8000 того, что ему будет приписан неправильный штрих-код, и что он будет «общим» для всех других образцов в том же самом прогоне. Если CDR3 используется в качестве базовой аналитической единицы, данные «загрязненные» последовательности рассматривались бы как общие биологически и использовались бы в качестве диагностических сигналов. Применение связок обеспечивает отфильтровывание данных шумов, так как те неправильно назначенные CDR3 обычно представлены с очень малой частотой, и снижается вероятность того, что они будут частью одной или более чем одной положительной связки (с большей вероятностью того, что они будут образовывать отрицательные связки). Посредством рассмотрения только положительных связок можно отфильтровывать шум. Также при использовании только CDR3 наивысшего ранга (как, например, 5000 или от 1000 до 50000 CDR3 наивысшего ранга) те CDR3, которые неправильно определены, обычно не будут рассматриваться из-за их низких частот.

Когда обнаруживается то, что группа публичных связок в большей степени ассоциирована с группой субъектов, которые имеют конкретное общее заболевание, данные публичные связки могут быть интерпретированы как специфичные для заболевания связки или «значимые связки». Группа значимых связок, ассоциированная с конкретным заболевением, может, следовательно, составлять «сигнатуру заболевания». Следовательно, если обнаруживается то, что образец субъекта имеет статистически значимое перекрывание с сигнатурой заболевания, для данного субъекта может быть поставлен диагноз такого заболевания.

Раскрытый в настоящем изобретении способ включает следующие стадии: (1) забор образцов у субъектов, приписанных к группе пациентов и контрольной группе; (2) амплификация и секвенирование иммунного репертуара каждого образца; (3) идентификация уникальных последовательностей CDR3 из иммунного репертуара каждого образца; (4) подсчет того, сколько раз выявляется в иммунном репертуаре индивидуальная (уникальная) последовательность CDR3, идентифицируя, посредством этого, те клоны, которые являются доминирующими (определенными посредством их ранжирования в порядке от наибольшей частоты встречаемости до наименьшей частоты встречаемости); (5) сравнение иммунных репертуаров субъектов для идентификации CDR3, которые являются общими по меньшей мере между двумя субъектами («публичные CDR3»); (6) ранжирование публичных CDR3 на основе их частот встречаемости; (7) получение списка позитивных связок из CDR3 наивысшего ранга; (8) отфильтровывание приватных связок и сохранение публичных связок; и (9) идентификация публичных связок, которые ассоциированы с пациентами в группе целевого заболевания, но не с контрольной группой.

В некоторых воплощениях к каждой группе приписывается по меньшей мере примерно 100 субъектов. В некоторых воплощениях иммунный репертуар амплифицируется с использованием способа arm-ПЦР (описанного в WO 2009/124293). В некоторых воплощениях верхние 5000 клонов идентифицируются как доминирующие. В некоторых воплощениях список положительных связок включает от 1000 до 20000 CDR3 наивысшего ранга. В некоторых воплощениях уровень достоверности для публичных связок, ассоциированных с пациентом в группе целевого заболевания, но не с контрольной группой, составляет р меньше 0,05.

Список публичных связок, которые ассоциированы с пациентами (связки, ассоциированные с заболеванием, или DSL), но не с контрольной группой, составляет группу, которая обозначается как «сигнатурные связки». В некоторых воплощениях сигнатура может быть получена посредством анализа примерно 100 пациентов и равного числа контролей. Затем определяется значение порога отсечения сигнатурной связки заболевания (DSL). Неизвестные образцы могут быть протестированы секвенированием, с последующим подсчетом DSL. Если число DSL соответствует или превышает порог отсечения, ставится диагноз конкретного заболевания.

Например, в некоторых воплощениях для получения данных последовательности для анализа цельная кровь от субъекта (например, человека или животного, группы заболевания или контроля (здоровые)) обрабатывается Ficoll® для экстракции одноядерных клеток периферической крови или РВМС (от англ. - peripheral blood mononuclear cells), с получением наивысшей концентрации лимфоцитов. Каждый тип лимфоцита имеет специфический идентификатор, именуемый CD (от англ. cluster of defferentiation) маркер или маркер кластера дифференциации, который нумеруется. Например, цитотоксические Т-клетки имеют маркер CD8, и хелперные Т-клетки имеют маркер CD4. В суспензию клеток могут быть добавлены магнитные шарики, которые были мечены специфическим маркером против CD. После приложения к колонке магнитного поля клетки, связанные с шариками, будут захватываться или подвергаться позитивной селекции, при одновременном обеспечении протекания через колонку других типов клеток. Протекающая через колонку или подвергнувшаяся негативной селекции суспензия клеток может быть использована для дальнейшего выделения других популяций клеток в последующих приложениях. В других воплощениях образец может представлять собой ткань, которую можно обрабатывать для выделения лимфоцитов с использованием способов, известных в данной области.

Поскольку имеются субпопуляции в пределах определенных популяций Т-клеток (например, регуляторные Т-клетки представляют собой субпопуляцию хелперных Т-клеток), если субпопуляции нужно разделять, к клеткам, связавшимся с шариками против CD4, можно добавлять высвобождающие реактивы для высвобождения шарика таким образом, что с клеткой может связаться другой магнитный шарик. В случае регуляторных Т-клеток, например, к суспензии клеток может быть добавлен селективный микрошарик CD25+ для экстракции популяции регуляторных Т-клеток из популяции хелперных Т-клеток.

Выделение полинуклеотидов (РНК или ДНК) можно проводить способами, известными специалистам в данной области (см., например, Murray, ВМС Res Notes. 2013 Nov 1;6:440). Амплификацию последовательностей можно проводить с использованием способа, описанного в WO 2009/124293 (arm-ПЦР), который обеспечивает чувствительность и специфичность, которые необходимы для достижения превосходных результатов в способе, раскрытом в настоящем изобретении.

Секвенирование также можно проводить с использованием способов, известных в данной области. Принимая во внимание число последовательностей, которые должны быть определены, обычно используются высокопроизводительные способы секвенирования, такие как, например, секвенирование следующего поколения от Illumina с использованием праймеров для секвенирования Illumina.

Генерируется большое количество данных, и их необходимо анализировать и проводить с ними манипуляции как результат секвенирования, подсчитывая сколько раз встречается определенная последовательность (представляющая индивидуальный клон), ранжируя клоны в порядке, основанном на частоте встречаемости, и осуществляя другие анализы, описанные в данном документе. Это удобнее всего и эффективнее всего проводить с использованием программ анализа данных последовательностей. Одной такой программой является CDR3 Algebra, которая осуществляет для исследователя сортировку, ранжирование и образование пар. Статистический анализ, такой как расчет значений р, также может проводиться с использованием таких программ.

Раскрытый в настоящем изобретении способ является пригодным к разработке диагностических анализов для целого ряда заболеваний, включающих рак, аутоиммунное заболевание, бактериальные инфекции, вирусные инфекции и грибковые инфекции, но не ограничивающихся ими, давая, посредством этого, исследователям и лечащим врачам ценный инструмент для постановки диагноза и исследования интересующего заболевания.

Способ, раскрытый в настоящем изобетении, может быть дополнительно описан посредством следующих неограничивающих примеров.

ПРИМЕРЫ

Выделение одноядерных клеток периферической крови (РВМС) из цельной крови

Цельную кровь от здоровых субъектов (контрольная группа) и пациентов, у которых ранее был поставлен диагноз рака молочной железы (группа пациентов), разводили буфером PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) в 2-4 раза относительно исходного объема. 10 мл цельной крови, собранной в гепарин натрия, переносили в 50 мл коническую пробирку и разводили буфером до риски 35 мл. Разведенную суспензию клеток (35 мл) осторожно наслаивали на 15 мл Ficoll-Paque® в отдельной 50 мл конической пробирке. Данную пробирку центрифугировали при 400 g в течение 30 минут при 20 градусах Цельсия в бакет-роторе без тормоза.

Верхний слой, содержащий буфер PBS и плазму, тщательно отсасывали для его удаления. Мутный слой одноядерных клеток аккуратно переносили в свежую 50 мл коническую пробирку. Данную пробирку затем заполняли буфером до 50 мл риски и центрифугировали при 300 g в течение 20 минут при 20 градусах Цельсия. Прозрачный супернатант удаляли, и клеточный осадок ресуспендировали в 8 мл буфера.

Выделение моноцитов из выделенных РВМС

Клетки подсчитывали с использованем гемоцитометра, и образец центрифугировали при 300 g в течение 10 минут при комнатной температуре. Супернатант удаляли посредством отсасывания. Клетки ресуспендировали в 80 мкл буфера на 107 клеток.

Добавляли двадцать микролитров микрошариков CD14 на 1×107 клеток, и смешивание проводили посредством аккуратного впускания и выпускания из пипетки. Смесь микрошариков/клеток инкубировали при 4°С в течение 15 минут. Клетки промывали добавлением 2 мл буфера на 1×107 клеток и затем центрифугировали при 300 g в течение 10 минут.

Супернатант полностью отсасывали и ресуспендировали в буфере (108 клеток в 500 мкл буфера). Магнитную колонку LS помещали на магнит и промывали 3 мл буфера. Проходящий через колонку буфер отбрасывали. Суспензию клеток наносили на колонку, и немеченые клетки, которые проходят через колонку, собирали в помеченную 15 мл коническую пробирку. Колонку промывали 3 раза 3 мл буфера, причем новый буфер добавляли только тогда, когда резервуар колонки был пуст.

Новую чистую 15 мл коническую пробирку, помеченную «моноциты», помещали под колонку, и колонку удаляли с магнита. При помощи пипетки вводили в колонку буфер (5 мл), и магнитно меченные клетки немедленно смывали посредством сильного вдавливания поршня в колонку.

Обе пробирки центрифугировали в течение 10 минут при 300 д, и супернатант полностью отсасывали. Для пробирки, помеченной «моноциты», клетки ресуспендировали в 2 мл буфера. Двадцать микролитров извлекали пипеткой для использования для протокола подсчета клеток, и пробирку центрифугировали при 300 g в течение 10 минут. Клетки ресуспендировали в 500 мкл RNAprotect® и хранили при 4°С для последующей экстракции РНК. Для пробирки, помеченной «CD14-», клетки ресуспендировали в 80 мкл буфера на 107 клеток.

Экстракция РНК

Клетки центрифугировали в течение 3 минут при 3000 об./мин при 20°С, супернатант удаляли, и клеточный осадок ослабляли посредством постукивания по пробирке. Добавляли в образец буфер ВМЕ (350 мкл), и клеточный осадок полностью растворяли посредством вихревой мешалки.

Образец переносили в колонку QIAshredder и гомогенизировали посредством центрифугирования в течение 2 минут при 10000 об./мин. Колонку отбрасывали, а фильтрат сохраняли. В фильтрат добавляли этанол (70%, 350 мкл), и образец перемешивали посредством впускания и выпускания из пипетки. Образец (700 мкл) переносили в центрифугируемую колонку RNeasy® и помещали в 2 мл пробирку для сбора. Образец центрифугировали в течение 15 сеунд при 10000 об./мин. Фильтрат отбрасывали. В случаях, когда имелось более 700 мкг образца, данный этап повторяли с использованием той же самой колонки.

В центрифугируемую колонку добавляли 700 мкл буфера RW1, и образец центрифугировали при 10000 об./мин в течение 15 секунд, отбрасывая фильтрат. В центрифугируемую колонку добавляли 500 мкл буфера RPE, и образец центрифугировали при 10000 об./мин в течение 15 секунд, отбрасывая фильтрат.

В центрифугируемую колонку добавляли 500 мкл буфера RPE, и образец центрифугировали в течение 2 минут при 10000 об./мин. Центрифугируемую колонку помещали в новую 2 мл пробирку для сбора и центрифугировали в течение 1 минуты при 10000 об./мин для сушки мембраны колонки. Центрифугируемую колонку помещали в новую 1,5 мл пробирку для сбора. Во все образцы, за исключением образцов, содержащих выделенные регуляторные Т-клетки, добавляли 25 мкл воды, не содержащей РНКаз. В образцы регуляторных Т-клеток добавляли 20 мкл воды, не содержащей РНКаз. Образцу давали отстояться при комнатной температуре в течение 1 минуты. Образец центрифугировали в течение 1 минуты при 10000 об./мин, и колонку отбрасывали.

Амплификация последовательностей CDR3 с использованием полимеразной цепной реакции

ПЦР-амплификацию последовательностей CDR3 проводили с использованием способа arm-ПЦР, раскрытого в WO 2009/124293 (Han). Минимум 100 нг РНК или гДНК (геномная ДНК) (в зависимости от выбранной системы реактивов) с поглощением при 260/280 нм 1,8 или больше обычно рекомендуют в качестве исходного материала для получения библиотеки иммунного репертуара, генерированной arm-ПЦР, с наилучшим разнообразием. Во время первого цикла ПЦР использовали вложенные геноспецифичные праймеры (англ. - nested gene specific primers, также «гнездные» геноспецифичные праймеры), нацеленные на каждый из V и J (или С) генов. Прямые праймеры - Fo (прямой наружный праймер) и Fi (прямой внутренний праймер) - нацелены на V гены. Обратные праймеры - Ro (обратный наружный) и Ri (обратный внутренний) - нацелены на каждый из генов J или С. Праймеры Fi и Ri также включали адапторы для секвенирования В и А соответственно для платформ lllumina® (HiSeq, MiSeq и GAIIx) для секвенирования спаренных концов. Второй цикл ПЦР проводили с использованием коммунальных (общих) праймеров В и А. После очистки на геле полученный в результате продукт был готов для высокопроизводительного секвенирования с использованием платформ lllumina®. Первый цикл ПЦР вводил в ПЦР-продукты штрих-коды и праймеры секвенирования.

Экспоненциальная фаза амплификации достигалась посредством коммунальных праймеров во втором цикле ПЦР; следовательно, целевой иммунный репертуар амплифицировался равномерно и полуколичественно, без введение дополнительного отклонения в амплификации.

Идентификация сигнатуры рака молочной железы

Всего забирали 213 образцов, включая 103 от пациентов с раком молочной железы и 110 от контролей. Всего было идентифицировано 14666172 CDR3 из 213 образцов, в среднем 68855 CDR3 из каждого образца. Было обнаружено 8301648 уникальных CDR3 из 213 образцов. После удаления приватных CDR3 было идентифицировано всего 98076 публичных (т.е. общих для по меньшей мере двух субъектов) и доминатных (т.е. ранжированных в пределах верхних 5000 CDR3 в каждом образце) CDR3 из 213 образцов с использованием программы iRepertoire (Huntsville, Alabama, США) посредством веб-сайта компании (например, CDR3 Algebra). Из 213 образцов всего было генерировано 287198206 положительных связок, в среднем 1003236 связок из каждого образца. После удаления приватных связок оставалось 16921605 связок, и они были общими с по меньшей мере одним другим человеком. Для каждой общей связки было получено значение р для идентификации связок, которые были предпочтительно общими среди пациентов. Всего 117069 связок было идентифицировано как значимые связки с р меньше 0,05, предоставляя «сигнатуру» для заболеваний. Всего 6171 CDR3 вносили вклад в 117069 связок сигнатуры заболевания. С использованием значения порога отсечения в 600 значимых связок могло быть диагностировано 95% случаев рака молочной железы со специфичностью 93,6%. При исследовании 188 образцов, не являющихся образцами рака молочной железы, только три образца были ложно позитивными (имеющими больше, чем 600 DSL), давая специфичность 98,4%.

Раскрытый в настоящем изобретении способ увеличивает сигнал и уменьшает фон с обеспечением идентификации общих CDR3, которые можно использовать для получения сигнатуры заболевания, что иным образом не возможно с использованием традиционных способов. В результате, раскрытый в настоящем изобретении способ имеет преимущество обеспечения разработки диагностического анализа для разных заболеваний, включающих рак, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание и инфекционное заболевание, но не ограничивающееся ими.

В данной заявке дается ссылка на разные публикации. Раскрытия данных публикаций во всей их полноте включаются тем самым в данную заявку посредством ссылки для более полного описания современного уровня техники, к которому относится данная заявка. Раскрытые ссылки также индивидуально и конкретно включаются в данный документ посредством ссылки в отношении материала, содержащегося в них, который обсуждается в предложении, на которое полагается ссылка.

Методологии и их разные воплощения, описанные в данном документе, являются типичными. Возможными являются разные другие воплощения методологий, описанных в данном документе.

1. Способ диагностики конкретного заболевания, которое вызывает ответ иммунной системы, включающий следующие стадии:

забор образца ткани или крови у каждого из многих субъектов в группе пациентов и в контрольной группе, где группа пациентов включает субъектов, которые имеют одинаковое заболевание, и контрольная группа включает субъектов, которые являются здоровыми;

выделение лимфоцитов из каждого образца;

выделение полинуклеотидов из лимфоцитов каждого образца;

амплификация выделенных полинуклеотидов с использованием способа arm-ПЦР и секвенирование иммунного репертуара каждого субъекта в каждой из двух групп для идентификации каждой уникальной последовательности CDR3, присутствующей в образцах, и для определения частоты встречаемости каждой уникальной последовательности CDR3;

идентификация последовательностей CDR3, которые являются общими между по меньшей мере двумя субъектами в каждой из контрольной группы и группы пациентов;

ранжирование последовательностей CDR3 по порядку частоты встречаемости;

идентификация связок из каждой группы; и

идентификация связок, которые в статистически значимой степени ассоциированы с группой пациентов, с предоставлением сигнатуры заболевания.

2. Способ по п. 1, в котором образец представляет собой кровь.

3. Способ по п. 1, в котором образец представляет собой ткань.

4. Способ по п. 1, в котором идентифицируют по меньшей мере примерно 1000 последовательностей CDR3, которые являются общими между по меньшей мере двумя субъектами в каждой из контрольной группы и группы пациентов.

5. Способ по п. 1, в котором идентифицируют по меньшей мере примерно 106 связок из каждой группы.

6. Способ по п. 1, в котором устанавливают минимальное число связок, ассоциированных с сигнатурой заболевания, в качестве диагностического числа таким образом, что при идентификации по меньшей мере данного числа связок в образце крови субъекта у данного субъекта диагностируют заболевание.

7. Способ по п. 6, в котором диагностическое число составляет по меньшей мере примерно 500.

8. Способ диагностики конкретного заболевания, которое вызывает ответ иммунной системы, включающий следующие стадии:

забор образца крови у каждого из многих субъектов в группе пациентов и в контрольной группе, где группа пациентов включает субъектов, которые имеют одинаковое заболевание, и контрольная группа включает субъектов, которые классифицируются как здоровые;

выделение лимфоцитов из каждого образца;

выделение полинуклеотидов из лимфоцитов каждого образца;

амплификация выделенных полинуклеотидов с использованием способа arm-ПЦР и секвенирование иммунного репертуара каждого субъекта в каждой из двух групп для идентификации каждой уникальной последовательности CDR3, присутствующей в образцах крови, и для определения частоты встречаемости каждой уникальной последовательности CDR3;

идентификация по меньшей мере примерно 1000 последовательностей CDR3, которые являются общими между по меньшей мере двумя субъектами в каждой из контрольной группы и группы пациентов;

ранжирование по меньшей мере примерно 1000 последовательностей CDR3 по порядку частоты встречаемости;

идентификация по меньшей мере примерно 106 связок из каждой группы;

идентификация связок, которые в статистически значимой степени ассоциированы с группой пациентов с предоставлением сигнатуры заболевания;

установление минимального числа связок, ассоциированных с сигнатурой заболевания, в качестве диагностического числа и сравнение числа связок в образце крови субъекта с диагностическим числом; и

диагностирование у данного субъекта заболевания, когда число связок в образце крови субъекта по меньшей мере равно диагностическому числу.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционной патологии и иммунологии, и может быть использовано при прогнозировании исхода беременности при урогенитальной инфекции.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционной патологии и иммунологии, и может быть использовано при прогнозировании исхода беременности при урогенитальной инфекции.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к молекулярной биологии. Разработан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 1 генотипа методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, комплементарных фрагментам гена полипротеина вируса Западного Нила 1 генотипа, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонда, сконструированного по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего флуоресцентную детекцию продукта амплификации размером 152 п.н.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к молекулярной биологии. Разработан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 1 генотипа методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, комплементарных фрагментам гена полипротеина вируса Западного Нила 1 генотипа, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонда, сконструированного по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего флуоресцентную детекцию продукта амплификации размером 152 п.н.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционной патологии и иммунологии, и может быть использовано при прогнозировании исхода беременности при урогенитальной инфекции.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционной патологии и иммунологии, и может быть использовано при прогнозировании исхода беременности при урогенитальной инфекции.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области молекулярной биологии. Разработан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа методом ПЦР, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонда, сконструированного по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего флуоресцентную детекцию продукта амплификации размером 116 п.н.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области молекулярной биологии. Разработан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа методом ПЦР, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонда, сконструированного по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего флуоресцентную детекцию продукта амплификации размером 116 п.н.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к одновременному обнаружению и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определению устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду, а также к набору для одновременного обнаружения и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и для определения устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к одновременному обнаружению и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определению устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду, а также к набору для одновременного обнаружения и идентификации туберкулёзной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и для определения устойчивости туберкулёзной микобактерии к рифампицину и изониазиду.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена тест-система для определения ферментативной активности бактерий по аммиаку.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии. Питательная среда для выделения и идентификации неферментирующих бактерий содержит питательный бульон сухой, экстракт кормовых дрожжей для микробиологических питательных сред, Д-глюкозу, Д-галактозу, натрия хлорид, натрий серноватистокислый, железо (III) лимоннокислое водное, натрий углекислый, натрий сернистокислый, феноловый красный, бромтимоловый синий, кальций углекислый, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданных количествах компонентов.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ выделения бактерий p.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ идентификации бактерий Acinetobacter nosocomialis предусматривает предварительный отбор культуры бактерий для исследования с совокупностью фенотипических признаков комплекса Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii, посев ее в 0,1 мл среды, содержащей мочевину, Na2HPО4, КН2РО4, NaCl, 0,4% водно-щелочной раствор фенолового красного и дистиллированную воду в заданных соотношениях.

Группа изобретений относится к медицинской микробиологии. Предложены питательная среда для выделения и идентификации парагемолитических вибрионов (варианты) и способ получения предложенной среды (варианты).

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм микромицета Trichoderma atrobrunneum, обладающий антибактериальной активностью в отношении Bacillus anthracis, депонирован в ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ F-1434.

Изобретение относится к области аналитической химии и заключается в создании пьезоэлектрического сенсора для определения лекарственных веществ фторхинолонового ряда – левофлоксацина и ципрофлоксацина.

Изобретение относится к клинической и санитарной микробиологии. Питательная среда для выделения клебсиелл содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон мясной, дрожжевой экстракт, мезо-инозит, натрий хлористый, соли желчных кислот, кристаллический фиолетовый, нейтральный красный, натрий углекислый, карбенициллин, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к ускоренному и высокочувствительному способу обнаружения бактериальных патогенов. Раскрыт способ обнаружения бактерий, включающий обеспечение одной или более чем одной суспензии, причем каждая содержит по меньшей мере один вид меченых тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению; добавление образца, подлежащего проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий; фильтрацию полученной реакционной смеси; обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги в концентрате; обнаружение несвязанных бактериофагов в фильтрате; обработку полученных сигналов, сгенерированных в результате обнаружения, и вывод результатов обнаружения пользователю.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения таргетной ДНК клинических изолятов урогенитальных микоплазм. Жидкий культуральный образец с концентрацией живых клеток не менее 106 КОЕ/мл предварительно обрабатывают раствором, содержащим ДНКазу (100 U) и 10-кратный буфер состава 100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 (рН 7,5) (конечная концентрация буфера в образце должна быть однократной). Обработку проводят в течение 30±10 минут при температуре 37±1°С. Затем осуществляют ингибирование активности фермента нагреванием в течение 10 минут при 75±1°С и очистку таргетной ДНК магносорбционным способом. Изобретение может быть использовано в научно-исследовательской практике для получения высококачественной библиотеки ДНК с целью проведения последующего полногеномного секвенирования. 2 пр.
Наверх