Способ укоренения ремонтантной земляники в культуре in vitro
Владельцы патента RU 2715695:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Удмуртский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ укоренения микрочеренков земляники ремонтантной, включающей укоренение микрочеренков in vitro на питательной среде по прописи Мурасиге-Скуга с добавлением продуктов жизнедеятельности восковой моли и использованием освещения. Микрочеренки помещают базальной частью в питательную среду МС 1/2, содержащую 0,5 мг/л индолил-3-масляной кислоты с добавлением продуктов жизнедеятельности восковой моли 2-3 мг/л при освещении светодиодным фитооблучателем с соотношением в спектре красного, синего и белого света 2:1:1 освещенностью 2500-3000 люкс (75-85 мМоль/м2⋅сек-1), 6500 К. Изобретение позволяет повысить процент укореняемости микрочеренков и сократить продолжительность укоренения. 3 ил., 1 табл., 5 пр.
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к отрасли биотехнологии в растениеводстве и может применяться в клональном микроразмножении (культура in vitro) для сокращения продолжительности этапа укоренения микрочеренков ягодных культур, улучшения качества их корневой системы и выходу кондиционных микрорастений с высокой адаптационной способностью к нестерильным (in vivo) условиям.
Известен Патент на изобретение 2614261 от 24.03.2017 «Способ адаптации растений-регенерантов земляники, включающий увлажнение регенерантов земляники водной суспензией кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая». Изобретение позволяет успешно акклиматизировать землянику благодаря подкормке на стадии адаптации. Недостатком данного изобретения является то, что процесс осуществляется в культуре ex vitro, где условия уже не стерильны. Этап укоренения микрочеренков земляники проходит в стерильных условиях in vitro и применить механокомпозит будет проблематично.
Известен Патент на изобретение 2679077 от 05.02.2019 (Прототип) «Способ повышения эффективности ризогенеза растений in vitro с помощью кофеина», заключающийся в том, что экспланты базальной частью высаживают на питательную среду укоренения по прописи Мурасиге-Скуга, содержащую 1,0 мг/л индолил-3-масляной кислоты с добавлением 1-50 мг/л кофеина. Изобретение позволяет повысить эффективность ризогенеза in vitro микрочеренков растений, культивируемых на питательных средах. Недостатками прототипа являются: в данной работе не изучено влияние кофеина в питательной среде для укоренение эксплантов культуры земляника садовая; укореняемость микрочеренков не превышает 82,6%, значит данный показатель может быть приближен к 100% за счет использования других регуляторов роста.
Не все виды растений одинаково успешно размножаются и укореняются в условиях культуры in vitro. В зависимости от генотипа, могут проявляться сложности на этапе укоренения растений на питательных средах, в частности укоренения такой культуры, как ремонтантная земляника. В связи с этим, при укоренении растений in vitro используют различные факторы химической и физической природы, стимулирующие ризогенез. В качестве физического фактора в данной работе применяется светодиодный фитооблучатель с соотношением в спектре красного, синего и белого света 2:1:1 (патент на полезную модель №127286 от 27.04.2013 г. «Светодиодная система для облучения меристемных растений»). В качестве фактора химической природы в данной работе применяется продукт жизнедеятельности личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L.).
Техническим результатом предлагаемого изобретения является 100%-ная укореняемость микрочеренков земляники ремонтантной с применением продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли в концентрации 2 мл/л при освещении светодиодным фитооблучателем и сокращение этапа до 20 суток после высадки микрочеренков на укоренение.
Продукты жизнедеятельности личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L.) представляют собой сухой продукт черного цвета с содержанием первоначальной влаги 4-4,5%. По консистенции представляет собой рассыпчатое вещество с размером частиц от 0,1 мм до 3 мм. Запах специфический, приятный, смесь ароматов меда, прополиса, перги и других пчелопродуктов. В соответствии с проведенными испытаниями на изучение содержания водорастворимых микроэлементов выявлено:
Методом рентгенофотоэлектронной спектроскопии - углерода 65,3%, кислорода 25,2%, фосфора 0,7%, азота 3,5%, калия 1,0%;
Методом атомно-абсорбционной спектрометрии - К(калий) - 2915 мг/кг, Cu(медь) - 9,8 мг/кг, Zn(цинк) - 56,6 мг/кг, B(бор) - менее 0,25 мг/кг, Mn(марганец) - 706,0 мг/кг, Co(кобальт) - 10,3 мг/кг, Mo(молибден) - 0,24 мг/кг, содержание общего фосфора - 4,0%, массовая доля общего калия - 3,8%, массовая доля общего азота - 10,0%.
Сущность способа заключается в повышении эффективности ризогенеза микрочеренков земляники (Fragaria ananassa) ремонтантной in vitro за счет оптимизации питательной среды для укоренения с помощью продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли при освещении светодиодным фитооблучателем. Повышение эффективности ризогенеза микрочеренков земляники ремонтантной in vitro достигается за счет того, что стерильные микрочеренки земляники ремонтантной высаживаются на питательную среду укоренения Мурасиге-Скуга 1/2 [1], содержащую 0,5 мг/л индолил-3-масляной кислоты, с добавлением продуктов жизнедеятельности большой восковой моли и освещаются в течение этапа светодиодным фитооблучателем.
Питательная среда для укоренения по прописи Мурасиге-Скуга с половинной дозой макро- и микросолей (MS 1/2) содержит следующие компоненты мг/л: NH4NO3 - 825; KNO3 - 950; KH2PO4 - 85; CaCl2 - 220; FeSO4*7H2O - 28,8; Na2 ЭДТА 2Н2O - 37,4; MgSO4*7H2O - 185 мг/л Н3ВО3 - 4,3; MnSO4*4H2O - 11,1; ZnSO4*7H2O - 3,1; KJ - 0,41; Na2MoO4 - 0,12-0,15; CuSO4*5H2O - 0,011-0,015; CoCl2⋅6H2O - 0,011-0,015; мезоинозит - 50; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,1-0,3; глицин - 1,0; ИМК - 0,5-1,0; сахароза - 15000-20000; агар - 4000-6000; остальное дистиллированная вода до 1 л; рН 5,6-5,8. Согласно современным представлениям питание организмов должно быть сбалансировано по микроэлементам. Используемая питательная среда отличается хорошо сбалансированным составом питательных веществ, однако в нем не учтена необходимость балансировки по таким элементам, как кремний, селен, хром, серебро, ванадий, недостаток которых восполняется добавлением в питательную среду MS 1/2 продуктов жизнедеятельности большой восковой моли, в котором содержатся данные микроэлементы в водорастворимой форме.
Положительное влияние кремния (Si) на рост надземных органов растений можно объяснить усилением фосфорилирования сахаров, что в свою очередь увеличивает поступление энергии для метаболических процессов и синтеза сахаров [2]. Положительное влияние кремния на развитие корневой системы растений объясняется тем, что его дефицит служит одним из лимитирующих факторов развития корней [3].
В растительном организме селен (Se) влияет на устойчивость к разного рода стрессам: окислительному стрессу, вызванному УФ-облучением, стрессам, вызванным гербицидами, гипотермией, старением, солевым стрессом и т.д. [4].
Рядом исследователей отмечено положительное действие хрома (Cr) на рост растений. Небольшие концентрации хрома (0,05-0,0005%) стимулируют активность каталазы и протеаз, хром активирует и некоторые другие ферменты. Хром также повышает содержание хлорофилла и продуктивность фотосинтеза в листьях. При недостаточности хрома у растений наблюдается снижение роста и накопления биомассы, пожелтение и опадание листьев [5].
Ванадий (V) является стимулятором процесса фотосинтеза и дыхания, способствует увеличению количества хлорофилла в листьях, а также лучшему накоплению биомассы в целом. Известна роль ванадия как катализатора биохимических реакций [6].
Ионы серебра (Ag) способны уничтожать широкий спектр болезнетворных бактерий, грибков, вирусов, не затрагивая при этом полезные бактерии. Кроме того, патогенные микроорганизмы не способны выработать устойчивость к антибактериальному и противовирусному действию ионов серебра [7].
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является повышение количества и качества укорененных микрочеренков земляники ремонтантной с последующим сокращением этапа укоренения за счет оптимизации соотношения микросолей, входящих в состав питательной среды и освещения светодиодным фитооблучателем с соотношением в спектре красного, синего и белого света 2:1:1.
на фиг. 1 показано влияние продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли на укоренение земляники Брайтон на среде МС 1/2 с ИМК 0,5 мг/л;
на фиг. 2 показано влияние продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли на укоренение земляники Сан-Андреас на среде МС 1/2 с ИМК 0,5 мг/л;
на фиг. 3 показано влияние продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли на укоренение земляники Альбион на среде МС 1/2 с ИМК 0,5 мг/л.
Осуществление заявляемого способа показано в примерах.
Пример 1 (контроль: укоренение микрочеренков земляники на МС 1/2 без внесения продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли при освещении люминесцентным облучателем).
При выращивании растений в условиях in vitro применяли стандартные методики культивирования [8, 9]. Использовали среды по прописи Мурасиге и Скуга с рН 5,6-5,8. Культивирование проводили в условиях 16-часового фотопериода при температуре 22…25°С и использовании люминесцентного облучателя с освещенностью 2500-3000 люкс. Мультипликацию побегов осуществляли методом активации пазушных меристем ростовых побегов. В качестве индуктора побегообразования использовали цитокинин 6-бензиламинопурин в концентрациях 0,25-1,0 мг/л. Субкультивирование проводили через 25-30 суток. Опыты проведены на примере сортов земляники ремонтантной Брайтон, Сан-Андреас, Альбион.
Микрочеренки укореняли на агаризованной безгормональной питательной среде по прописи Мурасиге и Скуга с половинным содержанием макро- и микроэлементов, в качестве индуктора ризогенеза использовали индолил-3-масляную кислоту в концентации 0,5 мг/л. Опыты проводили в трехкратной повторности, в каждом варианте было использовано не менее 10 регенерантов. Продолжительность этапа укоренения составила 30 дней при 16-часовом фотопериоде, температуре 22…25°С, при использовании люминесцентного облучателя с освещенностью 2500-3000 люкс. Укореняемость растений фиксировали при формировании ими не менее 3 корней средней длиной не менее 10 мм, высотой розетки не менее 15 мм с числом нормально развитых листьев не менее 3 шт. [10]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методом дисперсионного анализа [11]. Полученные результаты приведены в таблице 1.
Пример 2 (опыт 1: МС 1/2 с добавлением продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли в концентрации 1 мг/л при освещении светодиодным фитооблучателем).
Заявляемый способ осуществляли по примеру 1 с двумя отличиями: в питательную среду МС 1/2 помимо ИМК, добавляли продукты жизнедеятельности личинок большой восковой моли в концентрации 1 мг/л и освещали, вместо люминесцентного, светодиодным фитооблучателем с соотношением в спектре красного, синего и белого света 2:1:1 (патент на полезную модель №127286 от 27.04.2013 г. «Светодиодная система для облучения меристемных растений») с освещенностью 2500-3000 люкс (75-85 мМоль/м2*сек-1), 6500 К. Продолжительность этапа укоренения составила 30 дней при формировании ими не менее 3 корней средней длиной не менее 10 мм, высотой розетки не менее 15 мм с числом нормально развитых листьев не менее 3 шт. [10]. Полученные результаты приведены в таблице 1.
Пример 3 (опыт 2: МС 1/2 с добавлением продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли в концентрации 2 мг/л при освещении светодиодным фитооблучателем).
Заявляемый способ осуществляли по примеру 1 с двумя отличиями: в питательную среду МС 1/2 помимо ИМК, добавляли продукты жизнедеятельности личинок большой восковой моли в концентрации 2 мг/л, и освещали, вместо люминесцентного, светодиодным фитооблучателем с соотношением в спектре красного, синего и белого света 2:1:1 с освещенностью 2500-3000 люкс (75-85 мМоль/м2*сек-1), 6500 К. Продолжительность этапа укоренения составила 20 суток при формировании ими не менее 3 корней средней длиной не менее 10 мм, высотой розетки не менее 15 мм с числом нормально развитых листьев не менее 3 шт. [10]. В данном примере укореняемость микрочеренков земляники ремонтантной максимальна и составила, в зависимости от сорта, 98,2-100%. Полученные результаты приведены в таблице 1.
Пример 4 (опыт 3: МС 1/2 с добавлением продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли в концентрации 3 мг/л при освещении светодиодным фитооблучателем).
Заявляемый способ осуществляли по примеру 1 с двумя отличиями: в питательную среду МС 1/2 помимо ИМК, добавляли продукты жизнедеятельности личинок большой восковой моли в концентрации 3 мг/л, и освещали, вместо люминесцентного, светодиодным фитооблучателем с соотношением в спектре красного, синего и белого света 2:1: с освещенностью 2500-3000 люкс (75-85 мМоль/м2*сек-1), 6500 К. Продолжительность этапа укоренения составила 20 суток при формировании ими не менее 3 корней средней длиной не менее 10 мм, высотой розетки не менее 15 мм с числом нормально развитых листьев не менее 3 шт. [10]. Полученные результаты приведены в таблице 1.
Пример 5. (опыт 4: МС 1/2 с добавлением продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли в концентрации 4 мг/л при освещении светодиодным фитооблучателем).
Заявляемый способ осуществляли по примеру 1 с двумя отличиями: в питательную среду МС 1/2 помимо ИМК, добавляли продукты жизнедеятельности личинок большой восковой моли в концентрации 4 мг/л, и освещали, вместо люминесцентного, светодиодным фитооблучателем с соотношением в спектре красного, синего и белого света 2:1:1 с освещенностью 2500-3000 люкс (75-85 мМоль/м2*сек-1), 6500 К. Продолжительность этапа укоренения составила 20 суток при формировании ими не менее 3 корней средней длиной не менее 10 мм, высотой розетки не менее 15 мм с числом нормально развитых листьев не менее 3 шт. [10]. Полученные результаты приведены в таблице 1.
Результаты исследований показали, что через 20 суток культивирования микрочеренков земляники ремонтантной на питательной среде укоренения в вариантах с добавлением в питательную среду продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли в концентрациях 2 и 3 мг/л все изучаемые сорта продемонстрировали достоверно высокую укореняемость (94,7-100%) по сравнению с контрольными вариантами (73,5-80,0%) (фиг. 1, 2, 3). Укореняемость микрочеренков земляники ремонтантной в опыте с добавлением в питательную среду продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли в концентрации 2 мг/л и освещении светодиодным фитооблучателем максимальна и составила, в зависимости от сорта, 98,2-100% (фиг. 1, 2, 3).
Общественно-полезный эффект использования изобретения заключается в обеспечении населения оздоровленным посадочным материалом земляники крупноплодной ремонтантной, полученным в результате сокращенного по времени (ускоренного) клонального микроразмножения (выращивания с целью тиражирования in vitro).
Дополнительным положительным эффектом, достигаемым изобретением, является возможность экономии электроэнергии за счет использования светодиодного фитооблучателя.
Литература
1. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5, 95 - P. 473-497
2. Adams F. Interaction of phosphorus with other elements in soil and in plants // Proc. Symp. The Role of Phosphorus in Agriculture. Am. Soc. Agron., Madison, WI, 1980. - P. 655)
3. Колесников М.П. Формы кремния в растениях // Успехи биологической химии, 2001. - Т. 41. - С. 301-332; Savant N.K., Snyder G.H., Datnoff L.E. Silicon management and sustainable rice production //Adv. Agron., 1997. - V. 58. - P. 158-199
4. http://pharmacognosy.com.ua/index.php/makro-i-mikro-chudesa/selen-molodost-artivnost-produktivnost/selen-dlya-rasteniya-dvojnaja-stressostojkost
5. http://phaimacognosy.com.ua/index.php/makro-i-mikro-chudesa/khrom-proshchajte-diabet-i-ozhireniye/khrom-dlya-rasteniya-produktivnost-fotosinteza
6. https://agrostory.com/info-centre/agronomists/mikroelementy-vanadiy/
7. https://agrostory.com/info-centre/agronomists/mikroelementy-argentum/
8. Кашин В И. и др. Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур: методические указания. М.: МСХ РФ, РАСХН, ВСТИСП, 2001, 109 с.
9. Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. Киев: «Наукова Думка», 1992, 232 с.
10. Плодовые и ягодные культуры. Стерильные культуры и адаптированные микрорастения. Технические условия. ГОСТ Р 54051-2010.
11. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М.: Альянс, 2011. 352 с.
Способ укоренения микрочеренков земляники ремонтантной, включающий укоренение микрочеренков in vitro на питательной среде по прописи Мурасиге-Скуга с использованием освещения, отличающийся тем, что микрочеренки помещают базальной частью в питательную среду Мс 1/2, содержащую 0,5 мг/л индолил-3-масляной кислоты с добавлением продуктов жизнедеятельности личинок большой восковой моли 2-3 мг/л при освещении светодиодным фитооблучателем с соотношением в спектре красного, синего и белого света 2:1:1 освещенностью 2500-3000 люкс (75-85 мМоль/м2⋅сек-1), 6500 K.
