Способ профилактики экспериментальной токсической нефропатии

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной биологии и фармакологии, и может быть использовано для профилактики рабдомиолиз-индуцированного повреждения почек. Экспериментальному животному внутримышечно вводят 50% раствор глицерина в дозе 0,8 мл/100 г веса. Со следующего дня после воспроизведения экспериментального повреждения почек в течение 30 дней животным ежедневно вводят ацизол внутрижелудочно в дозе 30 мг/кг. Способ обеспечивает изучение профилактического действия ацизола на восстановление функции почек на фоне токсической нефропатии, вызванной рабдомиолизом, за счет того, что с последующего дня после экспериментального повреждения почек в течение 30 дней вводят ацизол. 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, фармакологии и может быть использовано при исследовании механизмов профилактики токсических нефропатий.

Заболевания почек приобретают все большее значение для современного здравоохранения. Так, по данным Каприна А.Д., Аполихина О.И. и др. за период с 2002 по 2014 год в России прирост количества больных гломерулярными и тубулоинтерстициальными болезнями почек (нефропатиями) составил +3,2%. Также наблюдается большой прирост числа пациентов с почечной недостаточностью - 131,7%. (Каприн А.Д., Аполихин О.И., Сивков А.В., Солнцева Т.В., Комарова В.А. Анализ уронефрологической заболеваемости и смертности в Российской Федерации за период 2002-2014 гг. по данным официальной статистики. Экспериментальная и клиническая урология. №3, 2016).

Нефропатий - группа заболеваний почек, характеризующихся поражением клубочков и канальцев нефрона. В то же время, несмотря на полиэтиологичный характер, они имеют общие патогенетические механизмы. Так, определяющими прогрессирование нефропатий неспецифическими факторами являются такие, как изменение агрегатного состояния крови, нарушение транспорта белка, изменение экспрессии медиаторов повреждения клеток. Следствием комплексного действия этих процессов является фиброзирование тканей почек и утрата функционирующей массы нефронов (Калюжин В.В., Уразова О.И., Калюжина Е.В., Сибирева О.Ф., Ткалич Л.М., Зибницкая Л.И., Терентьева Н. Н. Неспецифические механизмы прогрессирования хронической болезни почек // Бюллетень сибирской медицины. 2015. №4. С. 87-98).

Важную роль в патогенезе заболеваний почек играет перекисное окисление липидов (ПОЛ) мембран клеток. Установлено, что окислительный стресс является одним из ключевых звеньев в развитии нефропатий (Золотухин П.В., Александрова А.А., Довжик А.Д., Лебедева Ю.А., Кузьминова О.Н., Гутникова Л.В. Интерактомика - аналитический инструмент для изучения молекулярных основ нефропатий // Нефрология. 2013. №5. С. 9-15). Большое количество образующихся при этом свободных радикалов вызывают альтерацию и разрушение клеток. Деструктивные процессы при ПОЛ обусловлены тем, что разрушаются клеточные мембраны или же происходит повреждение ДНК клеток, которое вызывает PARP1-зависимую репарацию. PARP1, ПАРП1 - поли(АДФ-рибозо)полимераза 1, фермент, который при возникновении разрывов ДНК связывается с местами разрывов за счет так называемых «цинковых пальцев», и одновременно активируется. В результат происходит деконденсация хроматина в месте разрыва, что облегчает доступ ферментов репарации. Это приводит к истощению пула NAD+ и АТФ, что приводит к необратимому сбою работы энергетических систем клетки и ее гибели. Эти процессы усугубляются на фоне ишемии и гипоксии, так как в этом случае в ткани почек увеличивается активность фермента GSK3B, который является фактором апоптоза и некроза. Кроме того он подавляет работу антиоксидантной системы. (Золотухин П.В., Беланова А.А., Лебедева Ю.А., Батюшин М.М., Чистяков В.А. Клеточная Физиология повреждения и восстановления почек // Нефрология. 2015. №5. С. 17-22).

Окислительный взрыв и развивающееся вследствие этого перекисное окисление липидов клеточных мембран особенно проявляется при токсических нефропатиях. Кроме того развивается сильная воспалительная реакция в ткани почек, которая усугубляет процессы пероксидации липидов и вызывает циркуляторные нарушения в органе-мишени. При комплексном действии всех патогенетических звеньев поражаются клубочки и проксимальные канальцы, что вызывает нарушение процессов фильтрации и реабсорбции, из-за чего нарушается диурез и экскреторная функция в целом.

Описанные эффекты наблюдаются при экспериментальных токсических нефропатиях, в том числе и при рабдомиолиз-индуцированной, что делает актуальным поиск способов профилактики этих патологических состояний.

Специфического лечения токсической нефропатий не существует. Для терапии данных заболеваний применяются лекарственные средства различных групп, назначаемых с целью восстановления функции почек (диуретики, инфузионные препараты, аминокислоты и другие). Однако в общепринятой тактике лечения токсических повреждений почек не уделено место препаратам, корригирующим окислительный статус. В этой связи нами был выбран препарат ацизол.

Ацизол (бис-(1-винилимидазол)цинк-диацетат) был создан в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН и представляет собой производное 1-алкенилимидазола. Этот препарат является мощным антигипоксантом, который эффективен при отравлениях угарным газом. В условиях низкой оксигенации этот препарат способен снижать потребность органов в кислороде и повышать их устойчивость к дефициту кислорода. Ацизол способен восполнять недостаток цинка в организме и тем самым нормализует работу Zn-зависимых ферментов. Кроме того он способен выступать мембранопротектором и обладает антиоксидантыми свойствами. Также можно отметить его вазодилатирующий эффект.

Наиболее близким к заявляемому является способ профилактики токсической нефропатий с помощью семян арбуза, взятый за прототип (Патент №2144829 С1, опубл. 27.01.2000, Бюл. №3, Заявка: 98110824/14, 04.06.1998, A61K 35/78 (2000.01), авторы: Дмитриенко Н.В., Емцов В.И.), заключающийся в том, что ежедневно вводили внутрижелудочно 0,1 мл масла из семян арбуза на 100 г веса животных, начиная со следующих суток с момента однократной затравки четыреххлористого углерода (ЧХУ).

К недостаткам прототипа можно отнести сложность поддержания и контроля оптимального состава веществ в масле из семян арбуза, обладающего нефропротективным эффектом. Также нет достоверных данных о профилактическом влиянии данного лечебного состава на патогенетические звенья нефропатий, в том числе на повреждение клеточных мембран свободными радикалами. Ограниченные области выращивания арбуза не позволяют широко применять масло из их семян в качестве средства профилактики заболеваний почек.

Целью исследования было изучить профилактическое действие препарата ацизол на уровень перекисного окисления липидов и функцию почек на фоне токсической нефропатий, вызванной рабдомиолизом.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики глицериновой нефропатий у экспериментальных животных.

Решение этой задачи обеспечивает восстановление функции почек при их токсическом поражении путем улучшения тканевого дыхания, уменьшения уровня перекисного окисления липидов за счет цитопротекторного действия, улучшения органного кровоснабжения за счет вазодилатирующего эффекта ацизола.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способа профилактики токсической нефропатий у экспериментальных животных при рабдомиолизном поражении почек имеет следующие отличительные признаки: животным ежедневно, один раз в сутки, вводят ацизол в дозе 30 мг/кг через зонд в желудок на следующий день после однократного внутримышечного введения 50% раствора глицерина в дозе 0,8 мл/100 г веса.

Ацизол, являясь мощным антигипоксантом и донатором цинка, улучшает процессы тканевого дыхания, стабилизирует мембраны клеток и уменьшает деструктивное действие продуктов свободнорадикального окисления. Также в лаборатории кафедры нормальной физиологии СОГМА было установлено, что ацизол ускоряет клубочковую фильтрацию.

Ежедневное введение ацизола в течение месяца, один раз в сутки, через зонд в желудок в дозе 30 мг/кг после инициирования рабдомиолиза и токсического повреждения почек миоглобином приводит к уменьшению патологических процессов у экспериментальных животных. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики токсической нефропатий у экспериментальных животных при глицериновом повреждении почек, включающего введение ацизола каждый день через атравматичный зонд в желудок в течение 30 дней, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики токсической нефропатий путем восстановления функции почек за счет улучшения тканевого дыхания, уменьшения уровня перекисного окисления липидов за счет цитопротекторного действия, улучшения органного кровоснабжения за счет вазодилатирующего эффекта ацизола, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для моделирования токсической глицериновой нефропатий в бедренную мышцу экспериментальных крыс вводится 50% раствор глицерина в дозе 0,8 мл/100 г веса, что вызывает высвобождение из разрушенных миоцитов миоглобина (обладает нефротоксическим действием) и активных форм кислорода в системный кровоток. Растворяя 3 г ацизола в 100 мл дистиллированной воды, получаем раствор ацизола в соотношении 30 мг вещества в 1 мл. Ежедневно один раз в сутки в течение месяца вводим в желудок через атравматичный зонд при помощи шприца 0,1 мл раствора ацизола на каждые 100 г веса экспериментальных животных.

Через 14 и 30 дней производились исследования уровня продуктов перекисного окисления, активности ферментов антиоксидантной защиты и изучение функциональных показателей почек - объема диуреза, скорости клубочковой фильтрации, относительной реабсорбции воды, экскреции натрия, калия и белка с мочой. Животные выводились из эксперимента с помощью внутрибрюшинного введения тиопентала натрия.

Пример. Опыт проводился на 65 крысах-самцах линии Wistar средней массой 267±13 г, поделенных на 5 групп: 1-интактная группа; 2-животные с токсической нефропатией, выводившиеся из эксперимента через 14 дней (2 недели); 3- животные с токсической нефропатией, выводившиеся из эксперимента через 30 дней (4 недели); 4-животные с профилактическим внутрижелудочным введением ацизола на фоне токсической нефропатий в течение 14 дней; 5- животные с профилактическим внутрижелудочным введением ацизола на фоне токсической нефропатий в течение 30 дней.

Ацизол вводился с помощью атравматичного внутрижелудочного зонда ежедневно в дозе 30 мг/кг четвертой, пятой группе крыс.

Через месяц определялась концентрация в крови таких продуктов пероксидации липидов мембран клеток, как гидроперекиси (ГП) в плазме по методу Гавриловой В.Б., Гавриловой А.Р. и Мажуль Л.М. и малоновый диальдегид (МДА) в эритроцитах по методу, основанному на его взаимодействии с тиобарбитуровой кислотой. Также была определена активность каталазы по методу Е. Beutler и супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах. В крови и моче на спектрофотометре UNICO 2800 UV/VIS с помощью диагностических наборов «Ольвекс» определяли содержание эндогенного креатинина и белка. Концентрацию Na и K в крови измеряли с помощью анализатора электролитов АЭК-01, а в моче - с помощью пламенного фотометра ПФА-378. На основании полученных данных были рассчитаны функциональные показатели почек: объем диуреза (мл/ч/100 г), скорость клубочковой фильтрации (СКФ, мл/ч/100 г), относительная канальцевая реабсорбция воды (R_H2O, %), фильтрационный заряд (ФЗ) натрия, калия и кальция (мкмоль/ч/100 г), их экскреция (Е_х, мкмоль/ч/100 г) и относительная реабсорбция натрия и кальция (R_x, %). Статистическая обработка результатов с применением t-критерия Стьюдента была проведена с помощью программы GraphPad Prism 6.01.

Полученные данные свидетельствовали о том, что содержание продуктов перекисного окисления липидов было достоверно выше контроля как у животных с токсической нефропатией, так и с введением ацизола (табл. 1). Однако, содержание малонового диальдегида на фоне применения ацизола на всех сроках было достоверно меньше, чем на фоне глицериновой нефропатий. При этом отличий в содержании МДА на 14-е и 30-е сутки введения препарата не было выявлено (табл. 1). Аналогичная картина наблюдалась и при исследовании концентрации гидроперекисей (табл. 1). Активность каталазы возрастает лишь на 4 неделе рабдомиолиз-индуцированного повреждения почек, тогда как на фоне применения ацизола она повышалась уже со второй недели (табл. 1). Введение ацизола способствовало увеличению активности фермента, при этом достоверных отличий в разные сроки исследований на фоне применения препарата обнаружено не было (табл. 1). Активность другого фермента антиоксидантной системы - супероксиддисмутазы - возрастала лишь на 14-е сутки токсической нефропатий, тогда как на 30-е сутки даже была достоверно ниже интактных показателей. У животных с внутрижелудочным введением ацизола активность СОД соответствовала контролю (табл. 1).

При изучении водовыделительной картины почек отмечалось следующее. На 2 неделе глицериновой нефропатий была достоверно выявлена олигурия, а на 4 неделе диурез был в 2 раза выше фоновых значений (табл. 2). Это было обусловлено достоверным снижением скорости клубочковой фильтрации на 14-е сутки, что на 30-е сутки сменялось некоторым восстановлением скорости клубочковой фильтрации при сохраняющейся на низком уровне канальцевой реабсорбции (табл 2). У животных с введением ацизола объем выделенной мочи был значительно выше, чем на 14-е и 30-е сутки экспериментального поражения почек, при этом достоверных отличий между показателями диуреза на 2-й и 4 неделе применения ацизола не обнаружено (табл. 2). Увеличение диуреза у животных 4 и 5 групп объяснялось повышением скорости клубочковой фильтрации, тогда как канальцевая реабсорбция соответствовала контрольным показателям (табл. 2).

Анализ электролитовыделительной функции почек показал, что во 2 группе снизилась экскреция Na, а в 3 группе она была даже выше, чем у интактных животных (табл. 2). Таким изменениям на 2 неделе эксперимента способствовало значительное снижение фильтрационного заряда катиона, а на 4 неделе отмечалось снижение реабсорбции натрия, несмотря на некоторое восстановление его фильтрационного заряда в сравнении с двухнедельным сроком (табл. 2). У животных 4 и 5 группы отмечается значительное увеличение экскреции Na на всех сроках, что сопровождалось как увеличением реабсорбции катиона, так и многократным повышением его фильтрационного заряда (табл. 2). Экскреция калия при экспериментальной глицериновой нефропатий повышалась на всех сроках на фоне сниженного фильтрационного заряда катиона (табл. 2). Применение ацизола способствовало незначительному увеличению экскреции К на 14-е сутки, а на 30-е сутки показатель соответствовал фоновому (табл. 2).

Важным маркером нарушения функции почек является содержание белка в моче. Глицериновое поражение почечной ткани приводило к увеличению содержания белка в моче (табл. 2). На фоне в/ж введения ацизола концентрация белка в моче уменьшалась, а спустя месяц этот показатель не отличался от контрольных цифр (табл. 2).

Таким образом, применение ацизола при токсической глицериновой нефропатий снижало выраженность перекисного окисления липидов мембран клеток при активации ферментов антиоксидантной защиты, а также улучшало функцию почек.

Из вышеизложенного следует, что применение ацизола является эффективным способом профилактики экспериментальной глицериновой нефропатий.

Способ профилактики рабдомиолиз-индуцированного повреждения почек, включающий формирование рабдомиолиз-индуцированного повреждения почек путем внутримышечного введения 50% раствора глицерина в дозе 0,8 мл/100 г веса, отличающийся тем, что со следующего дня после воспроизведения экспериментального повреждения почек в течение 30 дней животным ежедневно вводят ацизол внутрижелудочно в дозе 30 мг/кг.