Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80ос с раствором гекмодиолит


A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2716574:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" (RU)

Изобретение относится к консервированию культуры клеток. Для замораживания клеток-предшественников периферической крови (КППК) производят выделение свежезаготовленного концентрата ядерных клеток (КЯК), смешивание КЯК с криоконсервантом Гекмодиолит (ГД) в полимерном криопакете (ПК) в равных пропорциях, его герметизацию, маркировку, укладку ПК в металлический пенал-холдер, КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной температурой изотермической холодовой адаптации клеток (TA), причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электроморозильник с TA плюс 4±1°С, на втором этапе холдер переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электроморозильник с TA минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище-морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации. Изобретение позволяет повысить сохранность ядерных клеток. 1 табл. 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии замораживания клеток-предшественников периферической крови (КППК) с комбинированным криоконсервантом Гекмодиолит (дальше - ГД)* (*Гекмодиолит (ГД) - комбинирований криоконсервант для замораживания ГСК костного мозга млекопитающих при низкой температуре (Костяев А.А. Автореф. дис. … докт. мед. наук. - Санкт-Петербург, 2003. - С.4, 5, 6, 8, 14 и др.)) на основе гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (ГМБТОЭМ) 20,0-40,0 и α-пропиленгликоля (1,2-ПД) 1,0-2,0; кроме того, в составе ГД динатриевая соль ЭДТА 0,05-0,15; лимонная кислота 0,5-1,5; бидистиллированная вода - Остальное. Имеет рН - 7,0-7,3 (см. патент RU №1772911 от 17.06.1993. Опубл. 10.04.1995), и может быть использовано в гематологических и онкологических центрах для лечения больных трансплантацией консервированных КППК. Включает выделение свежезаготовленного концентрата ядерных клеток (КЯК), смешивание КЯК с криоконсервантом ГД в равных пропорциях в полимерном криопакете (ПК), его герметизацию, маркировку, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной температурой изотермической холодовой адаптации клеток (TA), причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электроморозильник с TA плюс 4±1°С, на втором этапе холдер переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электроморозильник с TA минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище - морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации, затем проводят размораживание биообъекта. Размораживание производят покачиванием ПК в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси. Технический результат: способ обеспечивает высокую сохранность морфологической и функциональной полноценности деконсервированных КППК после 100 суток хранения. Присутствие в криоконсерванте ГД двух разных по механизму действия на организм и ядерные клетки криофилактиков с низкой токсичностью - эндоэкзоцеллюлярного ГМБТОЭМ и экзоцеллюлярного α-пропиленгликоля (1,2-ПД) минимизирует токсичность готового криоконсерванта, не требует отмывания его от размороженных КППК перед трансплантацией и удобен для применения (Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 210. - 80 с.).

Изобретение относится к медицине, а именно способам криоконсервирования КППК, и может найти применение в центрах лечения больных с депрессией кроветворения различного генеза. Важными составляющими в повышении эффективности замораживания КППК во всем мире являются сохранность большого процента гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), безвредность, простота выполнения и экономичность медикотехнической процедуры в целом.

В технологии замораживания КППК, костного мозга или эмбриональной кордовой крови известны способы их длительной консервации, например, техническое решение по RU 2624214 C1 03.07.2017 A01N 1/02, «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток». Опубл.: 03.07.2017 г., Бюл. №19, включающий смешивание криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ЯК в полимерном криопакете, холодовую адаптацию при температуре плюс 4°С в течение 10 мин, замораживание смеси от плюс 4°С до минус 80°С в режиме быстрой двухступенчатой программы в хладоагенте из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой плюс 4±1°С и минус 28±1°С. Недостатками такого способа криоконсервирования ГСК являются использование токсичного криопротектора ДМСО, трудоемкость медицинской технологии и другие факторы.

За прототип взят патент RU №1772911 С от 10.04.1995 г. МПК6 A01N 1/02 «Раствор для консервирования костного мозга млекопитающих при низкой температуре», в котором используется криоконсервант одинакового с заявляемым изобретением состава (содержит в основе ГМБТОЭМ и α-пропиленгликоль (1,2-ПД); предусматривает смешивание криоконсерванта с КЯК в ПК в соотношении 1:1, выдерживание при комнатной температуре в течение 20 мин, замораживание в жидкоазотном программном замораживателе по трехступенчатой программе до минус 80°С со скоростью: на первом этапе - минус 1°С/мин до минус 7°С, на втором - минус 10°С/мин до минус 40°С и на третьем - минус 20°С/мин до минус 90°С, после чего подвергают длительному хранению в этих условиях с последующим размораживанием. Обеспечивает сохранность 92% ядросодержащих клеточных элементов (Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 210. - С. 61).

Недостатками такой технологии замораживания КППК являются: потребность в дефицитном, токсичном жидком азоте, сложности при работе с криогенной техникой, человеческий фактор, риск инфицирования обслуживающего персонала.

Целью изобретения является исключение из технологии криоконсервирования КППК вредного для здоровья жидкого азота, снижение влияния негативного человеческого фактора, повышение сохранности деконсервированных ЯК.

Этот результат достигается тем, что суспензию клеток в присутствии раствора криоконсерванта ГД в пластиковом криопакете герметизируют, помещают в пенал-холдер и замораживают от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной TA, причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электрический холодильник с ТА плюс 4±1°С, на втором этапе переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электрический морозильник с TA минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, а затем переносят в хранилище - морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации, затем биообъект размораживают. Размораживание производят покачиванием ПК в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси. Технический результат: способ способствует лучшим результатам криоконсервации КППК. Присутствие в криоконсерванте ГД двух разных по механизму действия на организм и ядерные клетки криофилактиков с низкой токсичностью - эндоэкзоцеллюлярного ГМБТОЭМ и экзоцеллюлярного α-пропиленгликоля (1,2-ПД) минимизирует токсичность криоконсерванта ГД, не требует отмывания его от размороженных КППК перед трансплантацией и делает удобным для практического применения.

Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

Существенными признаками предложенного способа, совпадающими с известными признаками, являются: А - предоперационное охлаждение приготовленного криоконсерванта ГД в электрическом холодильнике до плюс 4°С; Б - выделение свежезаготоаленного КЯК; В - смешивание КЯК с ГД в КП в равных пропорциях в ПК; герметизацию, паспортизацию, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной ТА; Д - полное замораживание клеточной взвеси и длительная консервация при температуре минус 80°С, Е - размораживание биообъекта в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа замораживания КППК являются: Д - исключение из технологии криоконсервирования КППК хладоагента жидкого азота, Е - использование для холодовой адаптации смеси КЯК с ГД в качестве хладоагента морозильной камеры электрохолодильника с регулируемой TA; И - снижение влияния негативного человеческого фактора; К - повышение сохранности деконсервированных ЯК.

Пример выполнения заявляемого способа замораживания КППК: производят охлаждение ГД в электрохолодильнике при температуре плюс 4±°С, заготовку концентрата ядерных клеток (КЯК) в полимерный криопакет (ПК), смешивание КЯК с криоконсервантом в ПК в соотношении 1:1, герметизацию, паспортизацию, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной TA: плюс 4±1°С, минус 7±1°С; минус 28±1°С. На первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электрический холодильник с TA плюс 4±1°С, на втором - переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем - холдер переносят в электрический морозильник с ТА минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище - морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации. Размораживание производят покачиванием ПК в 20-литровой водной среде с температурой плюс 39°С в течение 20-25 сек до температуры плюс 2°С в клеточной взвеси. Берут пробы размороженного клеточного материала одноразовым шприцем для контрольных морфологических и функциональных тестов.

Сравнительный анализ результатов замораживания КППК с ГСК известным и заявляемым способами представлен в табл.1.

Использование технического решения «Способ замораживания клеток-предшественников периферической крови» с раствором Гекмодиолит при температуре минус 80°С по сравнению с прототипом позволяет исключить осложнения криогенной природы, обеспечивает сохранность до 90,71% ядерных клеток, из которых насчитывается до 92,30% - эозинорезистентных и 87,63% - CD34+ клеток. Техническое решение доступно и безопасно при реализации в центрах, использующих трансплантации замороженных КППК.

При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа замораживания КППК.

Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.

Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.

Исследования выполнены на базе лаборатории клеточных технологий ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».

Способ замораживания клеток-предшественников периферической крови, включающий выделение свежезаготовленного концентрата ядерных клеток (КЯК), смешивание КЯК с криоконсервантом Гекмодиолит (ГД) в полимерном криопакете (ПК) в равных пропорциях, его герметизацию, маркировку, укладку ПК в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание клеток-предшественников периферической крови (КППК) в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной температурой изотермической холодовой адаптации клеток (TA), причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электроморозильник с TA плюс 4±1°С, на втором этапе холдер переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электроморозильник с TA минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище-морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, клеточным биотехнологиям, регенеративной медицине. Выполняют отделение эпителиальной части зачатка зуба от мезенхимы с сохранением фрагмента мезенхимальной ткани.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к применению композиции, применению мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и способу лечения сепсиса у индивидуума.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к стимуляции клеток MDBK для репродукции вирусов. Способ включает внесение в питательную среду с культурой клеток MDBK интерлейкина-6 в дозе 30-60 пг/мл.

Изобретение относится к области медицины. Предложен биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций in vivo.

Настоящая группа изобретений относится к адоптивной терапии. Предложены химерные рецепторы антигена (CAR), содержащие мезотелин-связывающий домен, а также кодирующие их нуклеиновые кислоты, вектор и клетка.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к улучшению размораживания банков клеток, замораживанию клеток яичника китайского хомячка (СНО), композиции для замораживания клеток СНО и банку клеток.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения генетически сконструированных Т-клеток для иммунотерапии, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к культуральной среде для увеличения в количестве популяции взрослых стволовых клеток, где указанная культуральная среда содержит базальную среду, к которой добавлены агонист Wnt, ингибитор BMP и один или несколько ингибиторов TGF-бета, которые представляют собой ингибитор ALK5, ALK4 и/или ALK7, а также к ее применению для увеличения в количестве стволовой клетки, популяции стволовых клеток или фрагмента ткани или органоида, содержащих стволовую клетку или популяцию стволовых клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению и размножению популяции первично полученных стволовых клеток in vitro из эксплантированной ткани. Способ включает промывку указанной эксплантированной ткани, которая представляет собой послеродовую ткань, и минимальные манипуляции с указанной эксплантированной тканью.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к улучшению размораживания банков клеток, замораживанию клеток яичника китайского хомячка (СНО), композиции для замораживания клеток СНО и банку клеток.

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии замораживания клеток-предшественников периферической крови с криоконсервантом Гекмолит. Замораживание клеток-предшественников периферической крови (КППК) проводят поэтапно: производят смешивание его с концентратом КППК в равных пропорциях в одноразовом пластиковом контейнере, затем его герметизируют, паспортизируют, помещают в металлический пенал-холдер, после чего осуществляют поэтапное замораживание клеточной взвеси от плюс 4°С до минус 80°С в электрических рефрижераторах с регулируемой установкой температуры холодовой адаптации клеток, размораживание в водяной бане до температуры плюс 2÷4°С в клеточной взвеси, при этом на первом этапе замораживания контейнеры с суспензией КППК выдерживают 10 минут в электрическом морозильнике, с установленной температурой плюс 4°С, на втором этапе биообъект переносят в электроморозильник с температурой минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего биообъект переносят в морозильник-хранилище с температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к питательной среде для транспортировки клеток для дальнейшего цитологического и иммуноцитохимического исследования.

Изобретение относится к медицине. Средство для гипотермической консервации трансплантата роговицы включает ингредиенты при следующем их соотношении, мас.%: Среда 199 с солями Хэнкса 41,15 Среда F-12 с Hepes 25,00 Среда DMEM с Hepes 25,00 L-глутамин 0,145 Хондроидина сульфат А 1,00 Декстран-40 5,70 Антибиотик-антимикотик (Пенициллин- Стрептомицин- Амфотерицин В) 2,00 Триметазидина дигидрохлорид 0,005 Изобретение позволяет осуществить фармакологическую защиту клеточных мембран кератоцитов и эндотелия роговицы в процессе холодового хранения, содействовать восстановлению поврежденных структур, защите трансплантата роговицы от гипоксического и гипотермического стрессов, и как следствие, предупреждить развитие энергодефицитного состояния в результате снижения внутриклеточной концентрации аденозинтрифосфата, а также пролонгировать сроки консервации без существенного снижения плотности эндотелиальных клеток.

Изобретение относится к способу получения костного имплантата и может быть использовано в медицине. Предложен способ получения костного имплантата на основе стерильного деорганифицированного костного матрикса, включающий механическую обработку кости фрезерованием с учетом направления остеонных структур кости в среде охлажденного до 4°С стерильного раствора, удаление органической фазы из костной заготовки, инкубацию деминерализованного костного матрикса в растворе сангвиритрина для его иммобилизации с последующей 2-этапной комбинированной стерилизацией озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6-8 мг/л, продолжительностью 10-20 мин в проточном режиме на первом этапе и радиационным облучением потоком быстрых электронов с величиной поглощенной дозы 11-15 кГр герметично упакованных образцов на втором этапе.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к нерегламентирорванному замораживанию клеток-предшественников периферической крови. Способ включает приготовление раствора криоконсерванта, для чего берут раствор Dimethylsulfoxide («Sigma-Aldrich», France) высокой степени очистки (≥99,99%) с ПП 0,200-0,220, в условиях гипотермии добавляют его в раствор для инфузий из натрия хлорида 2,25 г и воды для инъекций до 250 мл в пластиковом контейнере до получения концентрации DMSO 10% и производят смешивание его с концентратом аферезных клеток-предшественников периферической крови в равных пропорциях, замораживание от плюс 17÷ плюс 25°С до минус 80°С в режиме трехступенчатой программы в электрических рефрижераторах с установленной контрольной температурой изотермической холодовой адаптации на каждом этапе замораживания.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к безопасному хранению и транспортировке трансплантируемого охлажденного сердца животных под давлением консервирующей газовой среды и мобильному устройству для этого.

Изобретение относится к области биотехнологии. Данный способ витрификации ооцитов млекопитающих может быть успешно применён к сельскохозяйственным животным, в частности для крупного рогатого скота (КРС).

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения гамма-глобулиновой и альбуминовой фракций плазмы крови с помощью химических дезинфектантов.

Изобретение относится к устройству для транспортировки и консервации вне организма биологического образца и соответствующему способу. Устройство (1) включает в себя камеру (2) для содержания биологического образца (100), ограниченную стенками (4), выполненными из теплоизоляционного материала.

Изобретение относится к медицине, а именно к области биотехнологии. Способ включает нарезание суставного хряща свиньи фрагментами размером не более 0,5 см, измельчают и выделяют частицы размером от 100 мкм до 250 мкм. Далее выполняют децеллюляризацию: не менее 3 циклов охлаждения при температуре -196°С в течение одного часа с последующим оттаиванием при 35-40°С в течение одного часа, инкубацию в трех сменах фосфатного буфера (138 мМ NaCl, 2.67 мМ KCl, 1.47 мМ KH2PO4, 8.1 мМ Na2HPO4, рН 7,4 (ФБС), рН=7.4), объемом 20-500 мл, содержащего 0,1% додецилсульфат натрия и повышающуюся концентрацию Тритона X100 (1, 2 и 3%, соответственно), инкубацию в течение 12-48 часов при температуре 37°С в 1-10 мл раствора, содержащего 30-50 Е/мл ДНКазы I типа в буферном растворе, полученном из состава 10 мМ Трис-HCl, 2,5 мМ MgCl2, 0.5 мМоль CaCl2, дистиллированная вода до 1 л с рН 7.6. Далее производят отмывку частиц хряща путем ополаскивания 100-500 мл бидистиллированной воды, экспозиции в течение суток в 20-500 мл бидистиллированной воды при комнатной температуре и периодическом перемешивании со скоростью 10-500 об/мин в течение одного часа трижды на протяжении суток, экспозиции по меньшей мере 48 часов при комнатной температуре в бидистиллированной воде, содержащей ампициллин из расчета 10-20 мкг/мл и амфотерицин из расчета 1,5-2,0 мкг/мл, ополаскивания в 20-500 мл бидистиллированной воды. После чего частицы хряща высушивают и стерилизуют γ-облучением в дозе 1,5 Мрад с получением образцов искомого матрикса. Изобретение позволяет повысить полноту удаления клеток за счет микронизации и предлагаемого оригинального комплексного воздействия физических (замораживание/оттаивание), химических (смесь ионных и не ионных ПАВ) и биологических (ДНКаза) факторов, примененных в оптимальной комбинации, облегчить рецеллюляризацию матрикса клетками за счет увеличения площади для заселения при сохранении объема и упрощении наблюдения за ней за счет увеличения площади адгезированных поверхностей матрикса путем его предварительной микронизации. 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 7 пр.

Изобретение относится к консервированию культуры клеток. Для замораживания клеток-предшественников периферической крови производят выделение свежезаготовленного концентрата ядерных клеток, смешивание КЯК с криоконсервантом Гекмодиолит в полимерном криопакете в равных пропорциях, его герметизацию, маркировку, укладку ПК в металлический пенал-холдер, КППК в присутствии ГД от плюс 4°С до минус 80°С по трехступенчатой программе в электрических холодильниках с установленной температурой изотермической холодовой адаптации клеток, причем на первом этапе замораживания холдер с КППК помещают на 10 мин в электроморозильник с TA плюс 4±1°С, на втором этапе холдер переносят на 10 мин в электроморозильник с TA минус 7±1°С, на третьем этапе холдер переносят в электроморозильник с TA минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего переносят в хранилище-морозильник с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной консервации. Изобретение позволяет повысить сохранность ядерных клеток. 1 табл. 1 пр.

Наверх