Молекулярная самособирающаяся конструкция наноразмерного диапазона на основе искусственной y-подобной днк-матрицы и белка dps

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области молекулярного конструирования частиц наноразмерного диапазона, а также к способам получения регулярного распределения таких частиц, и может быть использована в наноэлектронике для создания ячеек памяти высокой плотности. Техническим результатом является создание молекулярных конструкций с заданной стехиометрией, содержащих белок Dps и искусственно синтезированные полинуклеотидные Y-подобные матрицы, обеспечивающие возможность их ферментативной сшивки друг с другом с образованием упорядоченного массива с регулярным расположением белков Dps на его поверхности. Самосборка Y-подобной матрицы осуществляется на основе принципа комплементарности из трех одноцепочечных искусственно синтезированных частично комплементарных друг другу олигонуклеотидов SEQ ID NO Y1, Y2, Y3. Сформированная Y-подобная матрица обладает необходимой последовательностью нуклеотидов, обеспечивающей формирование структуры в точке ветвления, при которой взаимодействие белка Dps с матрицей происходит именно в этом месте за счет расположения пар аденинов и тиминов. 4 ил.

 

Изобретение относится к области молекулярного конструирования частиц наноразмерного диапазона, а также к способам получения регулярного распределения таких частиц, и может быть использована в наноэлектронике, для создания ячеек памяти высокой плотности.

Ферритины - это сферические белки, обычно состоящие из 12-24 одинаковых субъединиц с молекулярной массой около 18 кДа. Субъединицы, собираясь в сферическую структуру, формируют внутри белковой молекулы полость размером 5-8 нм. Эта полость служит для хранения депонированных из внешней среды ионов Fe²⁺, которые являются токсичными для живых клеток. Ионы Fe²⁺ попадают внутрь белковой полости через специальные поры, в которых происходит их окисление до Fe³⁺ с использованием кислорода или перекиси водорода, в зависимости от конкретного представителя этого белкового семейства. Общее число ионов железа в полости одного белка по разным данным может составлять от 500 до 4500 штук. Однако существуют данные, свидетельствующие о возможности дополнительного или альтернативного насыщения ионами других металлов с переменной валентностью. Данное свойство может быть широко востребовано для создания логических элементов нового поколения (Choi S.H., Kim J.-W., Chu S.-H., Park Y., King G.C., Lillehei P.T., Kim S.-J., Elliott J.R. Ferritin-templated quantum-dots for quantum logic gates / In: Proceedings of 12th SPIE Smart Structures and Smart Materials. - 2005. - Vol. 5763. - P. 213-232), ячеек памяти с супервысокой плотностью хранения информации (Yamashita I. Fabrication of a two-dimensional array of nano-particles using ferritin molecule // Thin Solid Films. - 2001. - Vol. 393. - P. 12-18.), квантовых электронных приборов (Jelinski L. Biologically related aspects in nanostructure science and technology / In: R&D status and trends in nanoparticles, nanostructured materials and nanodevices (eds: Siegel R.W., Hu E., Roco M.C.). 1999. National science and technology council), биомедицинских нанороботов, биосенсоров высокой чувствительности (Jaaskelainen A., Harinen R.R., Soukka Т., Lamminmaki U., Korpimaki Т., Virta M. Biologically produced bifunctional recombinant protein nanoparticles for immunoassays // Anal. Chem. - 2008. - Vol. 80. - P. 583-587), многослойных бионанобатарей (G.D. Watt, J-W. Kim, B. Zhang, T. Miller, J.N. Harb, R.C. Davis, S.H. Choi A Protein-Based Ferritin Bio-Nanobattery / Journal of Nanotechnology, 2012, Article ID 516309, 9 pages, doi: 10.1155/2012/516309) и нанореакторов для получения необычных форм сплавов (Warne В., Kasyutich O.I., Mayes E.L., Wiggins J.A.L., Wong K.K.W. Self assembled nanoparticulate Co:Pt for data storage applications // IEEE Transactions on magnetics. -2000. - Vol. 36. - P. 3009-3011).

На сегодняшний день известен ряд попыток создания квантовых точек полевых затворов, логических элементов и других изделий, в которых требуется регулярное расположение частиц, на основе ферритинов. Практически все они реализованы на основе метода био-нано-процессинг (фиг. 1) предложенной в работе (T.Hikono, T. Matsumura, A. Miura, Y. Uraoka, T. Fuyuki, M. Takeguchi, S. Yoshii, I.Yamashita. Electron confinement in a metal nanodot monolayers embedded in silicon dioxide produced using ferritin protein. (2006) Appl. Phys. Letters, v. 88, paper 023108). Взаимодействие соседних молекул ферритинов при этом осуществляется за счет гидрофобных связей, которые можно контролировать за счет свойств буферного раствора.

Для снижения нежелательных флуктуаций в регулярном распределении частиц на поверхности кремния в работе (Y. Nakama, S. Nagamachi, J. Ohta, M. Nunoshita. Position - controlled Si nanocrystals in SiO₂ thin film using a novel amorphous Si ultra-thin "nanomask" due to a bio-nanoprocess for low-energy ion implantation. (2008) APEX, (Applied Physics Express), v. 1, No 3, paper 034001) использовали плотно упакованный ферритин (с железом внутри) в качестве шаблона для синтеза кремниевых квантовых точек полевого затвора в диоксиде кремния путем низкоэнергетичной (Е_ион<1 кэВ) ионной имплантации Si в SiO₂, а в качестве ионного «резиста» применили все тот же кремний, но аморфный, толщиной 2 нм. Лазерный отжиг производился облучением имплантированной пленки излучением твердотельного лазера на иттрий-алюминиевом гранате с неодимом при плотности мощности в пятне (2×2 мм²) 34,4 Дж/см² в течение 5 сек. Температура при этом составила 1050±50°C. На врезке - электронно-микроскопический снимок высокого разрешения, на котором видны атомные плоскости кремниевого нанокристалла (Фиг. 2). Однако данный подход не позволил полностью избавиться от имеющихся флуктуаций и получить идеальное регулярное распределение частиц белка и соответственно частиц железа (Фиг. 2), что делает малоэффективным использование данного подхода в производстве носителей информации высокой плотности.

Задачей настоящего изобретения является конструирование элементарной единицы массива самоорганизующихся на плоскости и в пространстве нанообъектов, содержащих белки семейства ферритинов.

Техническим результатом является создание молекулярных конструкций с заданной стехиометрией, содержащих белок Dps и искусственно синтезированные полинуклеотидные Y-подобные матрицы, обеспечивающие возможность их ферментативной сшивки друг с другом с образованием упорядоченного массива с регулярным расположением белков Dps на его поверхности.

Технический результат достигается тем, что молекулярная самособирающаяся конструкция наноразмерного диапазона содержит белок Dps и, согласно изобретения, искусственную Y-подобную полинуклеотидную матрицу. Самосборка Y-подобной матрицы осуществляется на основе принципа комплементарности из трех одноцепочечных, искусственно синтезированных частично комплементарных друг другу олигонуклеотидов SEQ ID NO Y1, Y2, Y3. Сформированная Y-подобная матрица обладает необходимой последовательностью нуклеотидов, обеспечивающей формирование структуры в точке ветвления, при которой взаимодействие белка Dps с матрицей происходит именно в этом месте за счет расположения пар аденинов и тиминов.

На фиг. 1 приведена схематичная иллюстрация метода био-нано-процессинга.

На фиг. 2 приведено электронно-микроскопическое изображение кремниевых нанокристаллов в матрице SiO₂, полученных методом ионной имплантации.

На фиг. 3 изображена Y-подобная искусственная ДНК матрица, полученная в результате комплементарной самсоборки из отдельных синтетических олигонуклеотидов.

На фиг. 4 приведены изображения, полученные с помощью атомно-силового микроскопа, (а) искусственной Y-подобной полинуклеотидной матрицы, (б) комплексов с Dps с Y-подобной матрицей (белая полоса соответствует 100 нм).

Заявленное изобретение представляет собой самособирающуюся конструкцию на основе искусственных полинуклеотидных Y-подобных разветвленных матриц и гибридных биологических наночастиц - молекул бактериального белка Dps - и имеет заданные размеры и геометрию. Предложенное решение позволяет иммобилизировать гибридную биологическую наночастицу (белок Dps) на разветвленной полинуклеотидной матрице в режиме самосборки и, тем самым, создать элементарную единицу их массива. В дальнейшем формирование такого массива может происходить в водном растворе с использованием хорошо известной группы ферментов, которые называются ДНК-лигазы, за счет сшивки полинуклеотидных матриц по их не занятым «тупым» или «липким» концам.

Предложенный способ самосборки элементарных единиц их массива подтвержден методом атомно-силовой микроскопии с высоким разрешением. Полученные конструкции имеют заданную геометрию области взаимодействия гибридной наночистицы и полинуклеотидной матрицы.

Размер Y-подобных разветвленных матриц составляют: длина каждого двухцепочечного полинуклеотидного тяжа составляет 10,88 нм (32 пары нуклеотидов × расстояние между парами нуклеотидов 0,34 нм) (Фиг. 4). Самосборка искусственной нуклеотидной матрицы осуществляется из трех одноцепочечных олигонуклеотидов, состав которых приведен в Перечне последовательностей. Последовательность спроектирована таким образом, что обеспечивает единственную возможность комплементарного спаривания олигонуклеотидов с двумя другими (Фиг. 3).

Вторым компонентом молекулярной конструкции является гибридная биологическая наночастица - белок Dps, который относиться к семейству белков ферритинов и имеет бактериальное происхождение (подсемейств о бактериоферритины). Первоначально он был обнаружен у Escherichia coli как белок, ассоциированный с ДНК в «голодающих» клетках (DNA-binding protein of starved cells), то есть в клетках, находящихся в стационарной фазе роста.

Процесс самосборки искусственной полинуклеотидной матрицы Y-матрицы включает следующие шаги. На первом этапе необходимо осуществить плавление отдельно каждого из трех олигонуклеотидов при 98°C в водном растворе на протяжении 5 минут для разрушения суперспиральных участков и дуплексов молекул. После этого необходимо произвести смешивание эквивалентных концентраций растворов олигонуклеотидов в предварительно нагретой до 98°C таре и проинкубировать смесь еще 5 минут, чтобы исключить возможность случайного взаимодействия между частицами. Далее смесь нужно перенести в 70°C на 10 минут для отжига комплементарных участков друг к другу, после довести температуру раствора до комнатной температуры без принудительного охлаждения. Концентрацию полученных Y-подобных нуклеотидных искусственных матриц можно оценить спектрофотометрически, а контроль их геометрии и морфологии с помощью атомно-силовой микроскопии (Фиг. 4а). Указанный способ обеспечивает максимально эффективную самосборку Y-подобных ДНК, основанную на принципе комплиментраности.

На следующем этапе к полученным Y-подобным полинуклеотидным матрицам, находящимся в водном растворе, необходимо добавить эквивалентное молярное соотношение белка Dps в буфере, содержащем 50 мМ Tris-Hcl (pH, 7.5), 10 мМ EDTA, 50 мМ NaCl, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут для обеспечения полноценного формирования конструкции.

Результаты проверки самосборки показали, что такая методика обеспечивает полноценно формирование элементарной частицы заданной конфигурации на основе использованных элементов и их свойств. На полученных АСМ изображениях для комплексов с Dps с Y-подобной структурой (Фиг. 4б) вставка справа иллюстрирует 3D-изображение готовой молекулярной конструкции наноразмерного диапазона.

В дальнейшем к раствору полученных конструкций можно добавить ДНК-лигазу с низкой температурой инактивации (40-45°C) инкубировать смесь в течении времени рекомендованного производителем фермента. По истечению времени инкубации необходимо провести инактивацию ДНК-лигазы при температуре рекомендованной ее производителем, но не выше 50°C. Набор таких манипуляций с раствором молекулярных самособирающихся конструкций наноразмерного диапазона на основе искусственной Y-подобной ДНК-матрицы и белка Dps позволит сформировать полноценный массив частиц белка на нуклеотидной сетки. После этого полученную сетку необходимо иммобилизировать на поверхности рабочей подложки, на пример кремниевой, и осуществить сжигание органической составляющей. Это позволит избавиться от органических компонентов смеси и получить массив частиц, содержащих ионы железа с заданным их расположением на поверхности подложки. После этого, в зависимости от формы соединения, в которой находятся ионы железа (оксид, гидроксид или др.) необходимо провести их восстановление доступными химическими или физико-химическими методами в зависимости от конкретной задачи, для которой будет использоваться массив.

Молекулярная самособирающаяся конструкция на основе искусственных полинуклеотидных Y-подобных разветвленных матриц, предназначенная для получения элементарных частиц полноценного массива частиц, содержащая двухцепочечные полинуклеотидные тяжи длиной 10,88 нм (32 пары нуклеотидов × расстояние между парами нуклеотидов 0,34 нм) и гибридные биологические наночастицы - молекулы бактериального белка Dps диаметром 9 нм на основе принципа комплементарности из трех одноцепочечных олигонуклеотидов SEQ ID NO Y1, Y2, Y3 и обеспечивают расположение молекулы белка Dps в точке ветвления матрицы, содержащей кольцо из трех тиминов и трех аденинов не формирующих комплементарных пар, так как расположены на удалении друг от друга, при котором невозможно формирование водородных связей.