Штамм клеток cho-se-9/4 - продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом



Штамм клеток cho-se-9/4 - продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом
Штамм клеток cho-se-9/4 - продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом
Штамм клеток cho-se-9/4 - продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом
Штамм клеток cho-se-9/4 - продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом
Штамм клеток cho-se-9/4 - продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом

Владельцы патента RU 2717038:

Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства (RU)

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, способное специфически связываться с эритропоэтином человека. Также рассмотрен штамм-продуцент такого антитела. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в выделении и/или очистке рекомбинантного эритропоэтина человека методом иммуноаффинной хроматографии. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к получению антител к эритропоэтину человека. Изобретение может быть использовано для выделения и/или очистки рекомбинантного эритропоэтина человека из культуральной жидкости методом иммуноаффинной хроматографии.

Продукция красных кровяных клеток, эритроцитов, необходимых для транспорта кислорода, постоянно происходит в клетках костного мозга и регулируется специфическим гормоном - эритропоэтином. Эритропоэтин представляет собой кислый гликопротеин с молекулярным весом около 34000 Да, синтезируемый в почках. Функцией эритропоэтина является стимулирование пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников эритроцитарного ряда [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины, С-Пб, 2008].

В обычных условиях, когда ткани здорового организма получают достаточное количество кислорода, эритропоэтин содержится в плазме крови в очень низких концентрациях (10-15 мМЕ/мл). Эта низкая концентрация достаточна для поддержания воспроизводства красных кровяных телец взамен выбывающих в процессе старения.

Однако концентрация эритропоэтина в крови многократно возрастает в условиях гипоксии, когда снижается перенос кислорода кровяными клетками. Гипоксия может быть вызвана, например, потерей большого количества крови при кровотечениях, разрушением эритроцитов вследствие радиоактивного облучения, снижением потребления кислорода при нахождении в высоких слоях атмосферы, а также при анемиях [Симбирцев А.С. Цитокины в патогенезе и лечении заболеваний человека С-Пб, 2018].

В медицинской практике рекомбинантный эритропоэтин, полученный с использованием генно-инженерных технологий, применяют при анемиях, патологиях почек, кровопотерях и на поздних стадиях онкологических заболеваний. Рекомбинантный эритропоэтин получают путем культивирования клеток-продуцентов эритропоэтина с его последующей очисткой. Очистка эритропоэтина производится хроматографическими методами, которые могут включать стадию иммуноаффинной хроматографии с применением иммобилизованных моноклональных антител к эритропоэтину.

Известны моноклональные антитела к эритропоэтину (US 4558005 А, 10.12.1985; ЕР 0116446 В1, 22.08.1990; RU 2151184 С1, 20.06.2000; RU 2145610 С1, 20.02.2000, RU 2451071 С1, 02.05.2012). Описанные антитела могут применяться при очистке эритропоэтина, однако все они являются мышиными. Применение для очистки эритропоэтина мышиных моноклональных антител нежелательно из-за возможности развития иммунного ответа на мышиные антитела или их фрагменты, которые могут контаминировать препарат эритропоэтина вследствие протеолиза используемых для его очистки иммобилизованных антител.

Этого недостатка в значительной степени можно избежать за счет использования для очистки эритропоэтина химерного (мышь-человек) антитела к эритропоэтину, в котором константные области тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела мыши заменены на аналогичные области антитела человека.

Из патента RU 2513689 известно химерное антитело 6-4A3him. В примере 4 упомянутого патента представлено конструирование последовательностей ДНК (генов), кодирующих тяжелую и легкую цепи химерного антитела 6-4A3him, вставка полученных генов в экспрессионные векторы, трансфекция данными векторами клеток СНО линии DG-44, культивирование трансфицированных клеток в течение 7 дней с очисткой и определением свойств полученного химерного антитела. Известно, что в течение 1-2 недель трансфицированные плазмидными ДНК клетки продуцируют рекомбинантные белки, но данная продукция в дальнейшем многократно снижается вследствие генетической нестабильности трансфицированных клеток и так называемого «замолкания» промотора [Jia J., Hou C., Hughes В.S., Smede M., Leung K.M., Levine K., Rigby S., Gray P.P., Munro T.P. High-throughput ClonePix FL analysis of mAb-expressing clones using the UCOE expression system // New Biotechnology, 2014, 31(3): 214-220]. Однако внедрение химерного антитела в производственную практику требует создания штамма клеток - стабильных продуцентов такого антитела. В RU 2513689 такая задача не была решена.

Для выделения из пулов первично трансфицированных клеток стабильных штаммов-продуцентов применяют генетические и селекционные методы [там же; Nair A.R., Xie Jinger X., Hermiston Т.W. Effect of different UCOE-promoter combinations in creation of engineered cell lines for the production of Factor VIII // BMC Research Notes, 2011, 4:178].

Для удовлетворения растущих потребностей медицины в препаратах эритропоэтина существует необходимость в совершенствовании технологии его получения, в том числе в создании штамма клеток - стабильных продуцентов химерного антитела к эритропоэтину.

Задачей настоящего изобретения является создание штамма культивируемых клеток - стабильных продуцентов химерного антитела к эритропоэтину.

Поставленная задача решается тем, что предложен штамм культивируемых клеток яичников китайского хомячка CHO-SE-9/4 - продуцент химерного антитела SE-9/4 к эритропоэтину человека.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Штамм клеток яичников китайского хомячка Cricetulus griseus (авторское наименование штамма - CHO-SE-9/4) - продуцент рекомбинантного химерного антитела против эритропоэтина человека.

Родословная штамма: Родительская клеточная линия CHOdhfr-. Котрансфекция плазмидами pTVK4g/hybEpo-H и pTVK4d/hybEpo-L с последовательным отбором стабильного высокопродуктивного клона на среде без гипоксантина/тимидина с метотрексатом и на среде с генетицином. Плазмида pTVK4g/hybEpo-H несет последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь химерного антитела против эритропоэтина человека, ген устойчивости к генетицину и служебные последовательности, обеспечивающие транскрипцию мРНК тяжелой цепи химерного антитела к эритропоэтину и интеграцию плазмиды в транскрипционно активные участки хроматина. Плазмида pTVK4d/hybEpo-L несет последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь химерного антитела против эритропоэтина человека, ген устойчивости к метотрексату и служебные последовательности, обеспечивающие транскрипцию мРНК легкой цепи химерного антитела против эритропоэтина человека и интеграцию плазмиды в транскрипционно активные участки хроматина.

Культуральные свойства: Суспензионное культивирование в пробирках, колбах или 6-луночных планшетах на орбитальном шейкере с частотой вращения 130-180 об/мин, либо в биореакторе (ферментере). Посевная доза 0,3⋅106-0,5⋅106 клеток/мл, пересев каждые 3-4 суток. Время удвоения 24-26 часов. Устойчив к 5 мкг/мл метотрексата и к 0,2 мг/мл генетицина.

Стандартные условия выращивания: Среда CDM4 СНО (HyClone) без гипоксантина/тимидина с 6 мМ глутамина, 5 нМ метотрексата, 37°С, 5% CO2.

Характеристика культивирования в организме животного: культивирование в организме животного не применяется.

Характеристики полезного вещества, продуцируемого штаммом: Рекомбинантное химерное (мышь-человек) антитело (изотип IgG1, каппа) к эритропоэтину человека (оценка с помощью иммуноферментного анализа, вестерн-блота).

Характеристика биосинтеза полезных продуктов: Рекомбинантное химерное антитело к эритропоэтину человека, секретируется в культуральную среду в количестве не менее 20 пг на клетку в сутки. Стабильность продукции антитела сохраняется после 30 пассажей в неселективных условиях.

Способ криоконсервирования: 45% свежей среды CDM4 СНО, 45% кондиционной среды, 10% DMSO, 3⋅106-5⋅106 клеток/мл, заморозка до -70°C со скоростью 1°C/мин, далее помещение в жидкий азот, жизнеспособность после размораживания и отмывки от криоконсерванта составила 90% (с трипановым синим).

Продуцируемое химерное антитело характеризуется наличием следующих отличительных признаков:

а) аминокислотная последовательность тяжелой цепи по SEQ ID NO: 12;

б) аминокислотная последовательность легкой цепи по SEQ ID NO: 14;

в) аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность антитела:

CDRH-1 по SEQ ID NO: 5, CDRH-2 по SEQ ID NO: 6, CDRH-3 по SEQ ID NO: 7;

CDRL-1 по SEQ ID NO: 8, CDRL-2 no SEQ ID NO: 9, CDRL-3 по SEQ ID NO: 10;

г) константа диссоциации с рекомбинантным эритропоэтином Kd=6,3-10-8 M;

д) изоэлектрическая точка в диапазоне pI от 7,86 до 8,53;

е) молекулярный вес 160 кД.

Изобретение иллюстрируются следующими графическими материалами.

На Фиг. 1 представлены схемы плазмид pTVK4d/hybEpo-L (А) и pTVK4g/hybEpo-H (Б), где

CMV Promoter - промотор предранних белков цитомегаловируса;

hybEpo-L - последовательность ДНК, кодирующая легкую цепь химерного антитела к эритропоэтину человека (SEQ ID NO: 13);

hybEpo-H - последовательность ДНК, кодирующая тяжелую цепь химерного антитела к эритропоэтину человека (SEQ ID NO: 11);

TKpolyA - сайт полиаденилирования РНК из гена тимидинкиназы;

SV40 Promoter - промотор ранних белков вируса SV40;

DHFR - ген дигидрофолатредуктазы;

Neo - ген устойчивости к неомицину;

SV40 PolyA - сайт полиаденилирования ранних белков вируса SV40;

pUC Ori - точка начала репликации;

Amp - ген бактериального фермента β-лактамазы;

UCOE - регуляторный элемент, усиливающий экспрессию целевого гена.

На Фиг. 2 представлена динамика накопления химерного антитела SE-9/4 (мкг/мл) и числа жизнеспособных клеток (млн/мл) штамма-продуцента CHO-SE-9/4.

На Фиг. 3 представлены результаты электрофореза антитела SE-9/4 в 4-20% полиакриламидном геле с ДДС натрия в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. 1 - восстанавливающие условия, 2 - маркеры молекулярной массы, 3 - невосстанавливающие условия.

На Фиг. 4 представлено изофокусирование антитела SE-9/4. Фракция в - pI 8,53; фракция г - pI 8,49; фракция д - pI 8,37; фракция е - pI 8,17; фракция ж - pI 8,00; фракция з - pI 7,91 и фракция и - pI 7,86.

На Фиг. 5 представлен анализ связывания антитела SE-9/4 с эритропоэтином методом поверхностного плазмонного резонанса. Концентрация эритропоэтина: к - 200 нМ, л - 100 нМ, м - 50 нМ, н - 25 нМ, о - 12,5 нМ.

На Фиг. 6 представлены результаты аффинной хроматографии рекомбинантного эритропоэтина человека на колонке с иммобилизованным антителом SE-9/4. 4 - элюция посторонних белков 1 М раствором NaCl, 5 - элюция рекомбинантного эритропоэтина человека 0,1 М раствором лимонной кислоты, 6 - очистка колонки от загрязнений.

Подробное описание изобретения

Для создания химерного антитела против эритропоэтина человека первоначально была получена мышиная гибридома, секретирующая моноклональное антитело к эритропоэтину человека. Из клеток данной гибридомы была выделена РНК, на матрице которой была синтезирована кДНК, которая, в свою очередь, была использована в качестве матрицы для синтеза ДНК, кодирующих вариабельные области легкой и тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела. Данные ДНК были слиты с последовательностями, кодирующими, соответственно, константные области легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина G человека с получением генов тяжелой и легкой цепей химерного (мышь-человек) антитела SE-9/4. Было показано, что экспрессия химерных цепей антитела в клетках СНО приводит к секреции антитела, эффективно связывающего эритропоэтин человека. Рекомбинантное антитело по настоящему изобретению имеет аффинность к эритропоэтину с константой диссоциации Кd=6,3⋅10-8 М, вычисленной по результатам связывания SE-9/4 с эритропоэтином, установленным методом поверхностного плазмонного резонанса, и может быть использовано для аффинной хроматографии эритропоэтина.

На основе химерного антитела SE-9/4 могут быть также получены одноцепочечные и гуманизированные антитела к эритропоэтину человека.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример 1. Получение гибридомы мыши, продуцирующей моноклональное антитело против эритропоэтина человека.

Мышей линии Balb/c иммунизировали рекомбинантным эритропоэтином человека в полном адъюванте Фрейнда в концентрации 10 мкг/мышь в апоневроз задних конечностей. На 28 день мышам повторно вводили антиген в неполном адъюванте Фрейнда в дозе 5 мкг/мышь. Еще через 21 день мышей иммунизировали в дозе 10 мкг/мышь внутривенно. Далее проводили выделение клеток селезенки и их слияние с клетками миеломы SP2/0 по стандартной процедуре [Pandey S. Hybridoma Technology For Production Of Monoclonal Antibodies // International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 2010, 1(2): 017]. После отбора на селективной НАТ-среде в образцах культуральной жидкости определяли наличие антител к эритропоэтину методом твердофазного иммуноферментного анализа. Позитивные клоны подвергали дальнейшему клонированию и скринингу. В результате был отобран клон гибридных клеток, стабильно продуцирующих моноклональное антитело к эритропоэтину человека. С помощью иммуноферментного набора ISO-2 kit 072K4849 (Sigma, США) был установлен изотип тяжелой цепи продуцируемого антитела (G1) и легкой цепи (каппа). С помощью иммуноферментного анализа было установлено, что данное антитело не связывается с белками сыворотки крови и селезенки мышей, а также с белками сыворотки крови человека и растворимыми белками гомогената культивируемых клеток яичников китайского хомячка (СНО).

Пример 2. Выделение кДНК и секвенирование вариабельных областей легкой и тяжелой цепей.

Из клеток полученной гибридомы была выделена тотальная РНК. 100 нг полученной РНК подвергали обратной транскрипции с набором случайных гексануклеотидных праймеров.

На матрице полученной кДНК с помощью наборов синтетических праймеров были амплифицированы фрагменты генов, кодирующие вариабельные области тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей антитела. Полученные фрагменты генов были вставлены в вектор pAL-TA (Евроген, Москва) и секвенированы со стандартных праймеров M13F и M13R. Последовательности ДНК, кодирующие VH и VL, представлены в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, вычисленные аминокислотные последовательности VH и VL представлены в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4. Анализ последовательностей аминокислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела производили с помощью программы IMGTACQUEST (Immunogenetics Information System, http://www.imgt.org). Это позволило выделить участки мышиного моноклонального антитела, определяющие комплементарность к антигену для тяжелой цепи: CDR-H1, CDR-Н2 и CDR-H3, представленные в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 соответственно, и легкой цепи: CDRL-1, CDRL-2 и CDRL-3, представленные в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 соответственно.

Пример 3. Конструирование химерного антитела SE-9/4 к эритропоэтину.

С помощью полимеразной цепной реакции последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела, были состыкованы с последовательностями ДНК, кодирующими константную область тяжелой цепи IgG1 человека и константную область легкой каппа цепи иммуноглобулина G человека соответственно.

Полученная последовательность нуклеотидов, кодирующая тяжелую цепь химерного (мышь-человек) антитела, представлена в SEQ ID NO: 11, последовательность аминокислот тяжелой цепи химерного антитела - в SEQ ID NO: 12.

Полученная последовательность нуклеотидов, кодирующая легкую цепь химерного антитела, представлена в SEQ ID NO: 13, последовательность аминокислот легкой цепи химерного антитела - в SEQ ID NO: 14. Сконструированное химерное антитело получило название SE-9/4.

Пример 4. Создание штамма-продуцента химерного антитела SE-9/4 против эритропоэтина человека.

Полученные в примере 3 ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи химерного антитела, удлиняли путем постановки ПЦР с праймерами, содержавшими сайты рестрикции XbaI и NotI, обрабатывали данными рестриктазами и лигировали с рестрицированными XbaI и NotI плазмидными векторами серии pTVK4. В результате были получены плазмиды pTVK4g/hybEpo-H (Фиг. 1Б) и pTVK4d/hybEpo-L (Фиг. 1А). Плазмида pTVK4g/hybEpo-H несет последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь химерного антитела против эритропоэтина человека, промотор цитомегаловируса, сайт полиаденилирования, ген устойчивости к генетицину и элемент UCOE из генома мыши, длиной 2990 нуклеотидов, обеспечивающий преимущественную интеграцию вектора в транскрипционно активные участки хроматина [Jia J. Hou C., Hughes В.S., Smede M., Leung K.M., Levine K., Rigby S., Gray P.P., Munro T.P. High-throughput ClonePix FL analysis of mAb-expressing clones using the UCOE expression system // New Biotechnology, 2014, 31(3): 214-220; Nair A. R., Xie Jinger X., Hermiston T.W. Effect of different UCOE-promoter combinations in creation of engineered cell lines for the production of Factor VIII // BMC Research Notes, 2011, 4:178]. Плазмида pTVK4d/hybEpo-L несет последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь химерного антитела против эритропоэтина человека, промотор цитомегаловируса, сайт полиаденилирования, ген дигидрофолатредуктазы, обеспечивающий устойчивость к метотрексату, и элемент UCOE из 5'-нетранслируемой области гена RPS3 мыши, длиной 2990 нуклеотидов.

Для постоянной трансфекции использовали клетки линии яичников китайского хомячка, дефицитные по гену дигидрофолатредуктазы (CHOdhfr-), ранее адаптированные к суспензионному росту в бессывороточных условиях (Biaggio R.T., Abreu-Neto M.S., Covas D.T., Swiech K. Serum-free suspension culturing of human cells: adaptation, growth, and cryo-preservation // Bioprocess Biosyst Eng., 2015, 38(8): 1495-1507).

Клетки культивировали в среде CDM4CHO (HyClone, США) с добавлением 4 мМ аланилглутамина, 0,1 мМ гипоксантина, 0,016 мМ тимидина и 0,1% Pluronic F-68 (Sigma, США) в микробиореакторах типа TubeSpin 50 (ТРР, Швейцария) на орбитальном шейкере Sanyo MIR-S100C (200 об/мин), который был помещен в СО2-инкубатор, обеспечивающий содержание в воздухе 5% СО2 и температуру 37°С.

Трансфекцию проводили с помощью липосомального реагента «Free-style» (Life Technologies, США) по инструкции производителя, используя смесь из 3,6 мкг плазмиды pTVK4g/hybEpo-H и 2,4 мкг плазмиды pTVK4d/hybEpo-L на 5-106 клеток. Через 48 часов после трансфекции клетки переводили на среду без гипоксантина/тимидина с добавлением 5 мкг/мл метотрексата. В последующие дни среду меняли с интервалом 3 суток. Выросшие клетки затем пересевали на среду, содержавшую 0,2 мг/мл генетицина. Через 15 суток клетки переносили в колбы Эрленмейера в культуральную среду для последующего наращивания, после чего производили клонирование путем высева клеток в плотности одна клетка на лунку 96-луночного планшета. Таким образом было засеяно 20 планшетов по 96 лунок в каждом. Через 12 суток визуально отбирали лунки, содержащие единственный клон. Всего было идентифицировано 500 клонов. Через 3 суток культивирования с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) оценивали содержание иммуноглобулинов человека в образцах культуральной среды индивидуальных клонов.

Для дальнейшей работы было отобрано 18 клонов, обеспечивших накопление иммуноглобулинов человека в концентрации более 1200 нг/мл. Отобранные клоны были целиком перенесены в 48-луночные планшеты. Через 48 часов культивирования был проведен повторный анализ концентрации иммуноглобулинов в образцах культуральной среды. По результатам второго анализа было отобрано 9 клонов с максимальной волюметрической продукцией рекомбинантных антител, концентрация иммуноглобулинов в культуральной среде которых была более 6000 нг/мл. Далее клетки каждого клона высевали в 12-луночные планшеты по 0,5⋅106 клеток на лунку в 2 мл среды и культивировали в тех же условиях. Продукцию антител оценивали на 5 сутки после посева. В результате были отобраны 7 клонов с максимальной продукцией антитела на 5 сутки.

Полученные клоны культивировали на шейкере в микробиореакторах типа TubeSpin 50 в 5 мл культуральной среды. Начальная плотность культуры составляла 0,5⋅106 клеток/мл, пересев проводили с интервалом 3 суток. После третьего пассажа клетки высевали в плотности 0,5⋅106 клеток/мл в 5 мл среды без метотрексата и генетицина и анализировали продукцию антител и динамику роста клеток. На основании полученных данных рассчитывали удельную продуктивность клеток клонов, которая оказалась наилучшей у клона 41.

Далее клетки клона 41 последовательно адаптировали к росту на среде с 5 нМ метотрексата (МТХ). После 7 пассажей в среде с МТХ клетки субклонировали в 96-луночные планшеты в среде с 5 нМ МТХ, при этом был получен 61 субклон. В результате анализа их продуктивности было показано, что субклон 9/4 обладает наилучшими ростовыми характеристиками и продуктивностью: на 6 сутки культивирования плотность жизнеспособных клеток составила 4,3⋅106 клеток/мл при жизнеспособности 90%, а максимальная волюметрическая продукция рекомбинантных антител - 20 мкг/мл. Субклон 9/4 был помещен в клеточный банк ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» под названием CHO-SE-9/4.

Клетки штамма-продуцента CHO-SE-9/4 рассевали в мини-биореакторы, содержавшие по 5 мл среды CDM4CHO (HyClone, США), в которую добавляли 4 мМ аланил-глутамина (Applichem, Германия), 0,1% Plutonic F-68 (Sigma, США) и 5% EX-CELL® CD Hydrolysate Fusion (HyClone, США). Исходная концентрация клеток составляла 0,6⋅106 клеток/мл. Культивирование проводили на шейкере-инкубаторе LT-X (Kuhner, Швейцария), со скоростью вращения 200 об/мин и амплитудой 50 мм при 5% СО2. В первые трое суток культивирования поддерживали температуру 37 С, затем ее понижали до 32 С. Дальнейшее культивирование проводили при 32 С. Начиная с четвертых суток, в мини-биореакторы ежедневно добавляли питательные добавки Cell Boost 7а и Cell Boost 7b (HyClone, США) по 2% и 0,2% от первоначального объема культуры соответственно. Культивирование продолжали до 14 суток, достигнув максимальной плотности клеток более 9⋅106/мл и концентрации химерного антитела 1200 мкг/мл (Фиг. 2). Удельная продукция целевого антитела, рассчитанная по методике, описанной в статье Chusainow J., Yuan Sheng Yang Y.S., J.H.M. Yeo, Toh C.P., Asvadi P., Wong N.S.C, Yap M.S.G. A Study of Monoclonal Antibody-Producing CHO Cell Lines: What Makes a Stable High Producer? // Biotechnol. Bioeng., 2009, 102:1182-1196, составила 20 пг антитела SE-9/4 на клетку в сутки. Для оценки стабильности продукции химерного антитела клетки штамма CHO-SE-9/4 последовательно культивировали в 5 мл среды CDM4CHO без добавления метотрексата и генетицина в течение 3 суток, после чего пересевали в 5 мл аналогичной среды. Данную процедуру повторяли 30 раз, после чего вновь культивировали клетки в мини-биореакторе с добавлением питательных добавок и понижением температуры до 32°С на 4-е сутки культивирования. Концентрация химерного антитела в культуральной среде на 14 сутки культивирования составила 1150±100 мкг/мл. Таким образом, клетки штамма-продуцента CHO-SE-9/4 сохранили первоначальную продуктивность после 30 пассажей в неселективных условиях культивирования, что говорит о стабильности полученного штамма-продуцента.

Пример 5. Очистка химерного антитела SE9/4 и определение его свойств.

Клетки штамма-продуцента CHO-SE-9/4 культивировали в 5 колбах Эрленмейера емкостью 1 л, заполненных 50 мл среды. Состав среды, питательные добавки и режим культивирования использовали, как в примере 4. Накопление в среде культивирования химерного моноклонального антитела SE-9/4 определяли методом иммуноферментного анализа. В результате на 12 сутки культивирования было получено 200 мл культуральной среды, которую наносили на колонку, содержавшую 5 мл сефарозы с иммобилизованным белком A (GE Healthcare Life Sciences, США), промывку колонки и элюирование антитела проводили по инструкции изготовителя. В результате был получен лабораторный образец очищенного рекомбинантного химерного антитела SE-9/4 против эритропоэтина человека в количестве 80 мг.

Анализ химерного антитела SE-9/4 методом электрофореза в 4-20% полиакриламидном геле с ДДС натрия показал, что оно имеет молекулярный вес примерно 160 кД в невосстанавливающих условиях, в восстанавливающих условиях антитело диссоциирует на белки с молекулярной массой 49 и 24 кДа, что соответствует ожидаемым показателям для тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина (Фиг. 3). Изоэлектрическое фокусирование антитела SE-9/4 в мочевине при 20 С проводили с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель-105М» (Люмэкс, Россия), в нейтральном капилляре длиной 45 см и внутренним диаметром 50 мкм, используя амфолиты «Pharmalyte 3-10» (GE, США) и пептидные маркеры с известными изоэлектрическими точками («Beckman Coulter», США). Результаты регистрировали по светопоглощению при длине волны 280 нм с последующей обработкой в программе «Эльфоран» (Фиг. 4). Антитело SE-9/4 имеет изоэлектрические точки в диапазоне pI от 7,86 до 8,53, что может быть связано с гетерологичным гликозилированием. Основная фракция (фракция е), содержащая 74,89% материала, соответствует изоточке с pI=8,17, кроме того, наблюдаются другие фракции: фракция в имеет pI 8,53; фракция г - pI 8,49; фракция д - pI 8,37; фракция ж - pI 8,00; фракция з - pI 7,91 и фракция и - pI 7,86. (Фиг. 4).

Для определения аффинности антитела SE-9/4 к рекомбинантному эритропоэтину человека был использован метод поверхностного плазмонного резонанса с использованием прибора «Biacore X100» с двойной проточной ячейкой (GE-Healthcare, США). После иммобилизации антитела против IgG человека (Abeam, США) в ячейке прибора (4,9 нг на 1 мм2 поверхности ячейки) в ячейку добавляли раствор антитела SE-9/4 (50 нМ), промывали от несвязавшегося антитела, вводили раствор эритропоэтина человека в концентрации от 12,5 нМ до 200 нМ, после чего диссоциацию комплекса антиген-антитело проводили путем промывки ячейки буферным раствором (Фиг. 5). Равновесная константа диссоциации Kd комплекса SE-9/4-эритропоэтин была определена по зависимости установившегося значения ответа (RU) от концентраций эритропоэтина (ЕРО), при этом полученные данные соответствовали уравнению Ленгмюра для модели одноцентрового связывания:

где Req - ответ (RU) при достижении равновесия, Rmax - ответ (RU) при насыщении поверхности антителом SE-9/4. Kd - равновесная константа диссоциации комплекса антитела SE-9/4 с эритропоэтином, [ЕРО] -концентрация эритропоэтина. Было получено значение Kd=63 нМ.

Пример 6. Применение химерного антитела SE-9/4 для очистки рекомбинантного эритропоэтина человека.

Химерное антитело SE-9/4 очищали из среды культивирования с помощью хроматографии на белок А-сефарозе. Выделенное антитело в количестве 5 мг иммобилизовывали на 2 мл CNBr-активированной матрицы Sepharose FF (GE Healthcare, США) по методике изготовителя и помещали в хроматографическую колонку. На колонку, предварительно уравновешенную фосфатным буфером, наносили 20 мл кондиционной культуральной среды, содержащей рекомбинантный эритропоэтин человека (Фиг. 6). После промывки колонки фосфатным буфером, содержащим 1 М хлористого натрия и 0,02% неионного детергента (пик 4 на Фиг. 6), сорбированный эритропоэтин человека элюировали 0,1 М раствором лимонной кислоты (пик 5 на Фиг. 6). рН полученного раствора эритропоэтина человека доводили до значения 7,5 дробным добавлением 0,1 М раствора NaOH, после чего анализировали свойства эритропоэтина. По данным электрофореза в полиакриламидном геле чистота эритропоэтина, очищенного с помощью иммобилизованного антитела SE-9/4, составила 95%, выход не менее 80%. Биологическая активность полученного эритропоэтина, определяемая по приросту ретикулоцитов в крови мышей после подкожного введения, составила 1,2⋅105 МЕ/мг белка.

Штамм-продуцент CHO-SE-9/4 был помещен на хранение в музей ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России. Удельная продуктивность клеток штамма CHO-SE-9/4 составляет не менее 20 пг антитела SE-9/4 на клетку в сутки, время удвоения от 24 до 26 часов.

Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Штамм клеток CHO-SE-9/4 - продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом» на предмет выдачи патента РФ на изобретение.

--->

Перечень последовательностей нуклеотидов

<110> Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства

Federal State Unitary Enterprise «State Research Institute of Ultra Pure Biologicals» of the Federal Medical and Biological Agency

<120> Штамм клеток СНО SE-9/4 — продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом

<130>

<160> 14

<210> 1

<211> 358

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<220>

<223> ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела мыши к эритропоэтину человека

<400> 1

CAG GTT CAG CTG CAA CAA TCT GGG GCT GAG CTG GTG AGG 39
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

1 5 10

CCT GGG GCT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TTG GGC 78

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly

15 20 25

TAC ACT TTT ACT GAC TAT GAA ATG CAC TGG GTG AAG CAG 117

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln
30 35

ACA CCT GTG CAT GGC CTG GAA TGG ATT GGA GCT ATT TAT 156

Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr
40 45 50

CCA GGA AGT GGT GGT ACT GTC TAC AAT CAG AAG TTC AAG 195

Pro Gly Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
55 60 65

GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA 234

Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
70 75

GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT 273
Gly Lys Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

80 85 90

GCT GTC TAT TAC TGT ACA AGA ATA GGG ATT ATG ACA GGG 312
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Ile Met Thr Gly

95 100

TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGG ACC ACG GTC ACC GTC 351
Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val

105 110 115

TCG AGC G 358

Ser Ser
119

<210> 2

<211> 336

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(336)

<223> ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела мыши к эритропоэтину человека

<400> 2

GAT GTT TTG ATG ACC CAA AGT CCA CTC TCC CTG CCT GTC 39
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

1 5 10

AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT 78
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
15 20 25
CAG AGC ATT GTA TAT AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA GAA 117
Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
30 35
TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG 156
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
40 45 50
ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC 195
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp

55 60 65

AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC 234
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
70 75
AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT 273
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr
80 85 90
TAC TGT TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA 312
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly
95 100

GGG GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA 336
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

105 110 112

<210> 3

<211> 119

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(119)

<223> Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

1 5 10

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly

15 20 25

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln
30 35
Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr
40 45 50
Pro Gly Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
55 60 65
Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
70 75

Gly Lys Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

80 85 90

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Ile Met Thr Gly

95 100

Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val

105 110 115

Ser Ser
119

<210> 4

<211> 112

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(112)

<223> Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 4

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

1 5 10

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
15 20 25
Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
30 35
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
40 45 50
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp

55 60 65

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
70 75
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr
80 85 90
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly
95 100

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

105 110 112

<210> 5

<211> 8

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(8)

<223> Последовательность аминокислот участка CDRH-1 моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 5

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu
1 5 8

<210> 6

<211> 8

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(8)

<223> Последовательность аминокислот участка CDRH-2 моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 6

Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr
1 5 8

<210> 7

<211> 12

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(12)

<223> Последовательность аминокислот участка CDRH-3 моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 7

Thr Arg Ile Gly Ile Met Thr Gly Tyr Phe Asp Val
1 5 10 12

<210> 8

<211> 11

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(11)

<223> Последовательность аминокислот участка CDRL-1 моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 8

Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10 11

<210> 9

<211> 3

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(3)

<223> Последовательность аминокислот участка CDRL-2 моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 9

Lys Val Ser
1 3

<210> 10

<211> 9

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(9)

<223> Последовательность аминокислот участка CDRL-3 моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 10

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5 9

<210> 11

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<222> (1)…(1347)

<223> ДНК, кодирующая тяжелую цепь химерного антитела SE-9/4

<400> 11

CAG GTT CAG CTG CAA CAA TCT GGG GCT GAG CTG GTG AGG 39
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
1 5 10
CCT GGG GCT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TTG GGC 78
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly
15 20 25
TAC ACT TTT ACT GAC TAT GAA ATG CAC TGG GTG AAG CAG 117
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln
30 35
ACA CCT GTG CAT GGC CTG GAA TGG ATT GGA GCT ATT TAT 156
Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr
40 45 50
CCA GGA AGT GGT GGT ACT GTC TAC AAT CAG AAG TTC AAG 195
Pro Gly Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
55 60 65
GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA 234
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
70 75
GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT 273
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
80 85 90
GCT GTC TAT TAC TGT ACA AGA ATA GGG ATT ATG ACA GGG 312
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Ile Met Thr Gly
95 100
TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGG ACC ACG GTC ACC GTC 351
Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val
105 110 115
TCG AGC GCT TCT ACC AAG GGC CCC TCC GTG TTC CCT CTG 390
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
120 125 130
GCC CCT TCC AGC AAG TCT ACC TCT GGC GGC ACA GCC GCT 429
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
135 140
CTG GGC TGC CTC GTG AAG GAC TAC TTC CCC GAG CCC GTG 468
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155
ACA GTG TCC TGG AAC TCT GGC GCT CTG ACC TCC GGC GTG 507
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
160 165
CAC ACC TTC CCG GCG GTG CTG CAG AGC AGC GGC CTG TAT 546
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
170 175 180
AGC CTG AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCG AGC AGC AGC CTG 585
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
185 190 195
GGC ACC CAG ACC TAT ATT TGC AAC GTG AAC CAT AAA CCG 624
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
200 205
AGC AAC ACC AAA GTG GAT AAA AAA GTG GAA CCG AAA AGC 663
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
TGC GAT AAA ACC CAT ACC TGC CCG CCG TGC CCG GCG CCG 702

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230
GAA CTG CTG GGC GGC CCG AGC GTG TTT CTG TTT CCG CCG 741
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
235 240 245
AAA CCG AAA GAT ACC CTG ATG ATT AGC CGT ACC CCG GAA 780
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
250 255 260
GTG ACC TGC GTG GTG GTG GAT GTG AGC CAT GAA GAT CCG 819
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
265 270
GAA GTG AAA TTT AAC TGG TAT GTG GAT GGC GTG GAA GTG 858
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
CAT AAC GCG AAA ACC AAA CCG CGT GAA GAA CAG TAT AAC 897
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295
AGC ACC TAT CGT GTG GTG AGC GTG CTG ACC GTG CTG CAT 936
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
300 305 310
CAG GAT TGG CTG AAC GGC AAA GAA TAT AAA TGC AAA GTG 975

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 315 320 325

AGC AAC AAA GCG CTG CCG GCG CCG ATT GAA AAA ACC ATT 1014
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
330 335
AGC AAA GCG AAA GGC CAG CCG CGT GAA CCG CAG GTG TAT 1053
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
ACC CTG CCG CCG AGC CGT GAT GAA CTG ACC AAA AAC CAG 1092
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360
GTG AGC CTG ACC TGC CTG GTG AAA GGC TTT TAT CCG AGC 1131
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
365 370 375
GAT ATT GCG GTG GAA TGG GAA AGC AAC GGC CAG CCG GAA 1170
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
380 385 390
AAC AAC TAT AAA ACC ACC CCG CCG GTG CTG GAT AGC GAT 1209
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
395 400
GGC AGC TTT TTT CTG TAT AGC AAA CTG ACC GTG GAT AAA 1248
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
AGC CGT TGG CAG CAG GGC AAC GTG TTT AGC TGC AGC GTG 1287
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425
ATG CAT GAA GCG CTG CAT AAC CAT TAT ACC CAG AAA AGC 1326
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
430 435 440

CTG AGC CTG AGC CCG GGC AAA 1347

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
445 449

<210> 12

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<222> (1)…(449)

<223> Последовательность аминокислот тяжелой цепи химерного антитела SE-9/4

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
1 5 10
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly
15 20 25
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln
30 35
Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr
40 45 50
Pro Gly Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
55 60 65
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
70 75
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
80 85 90
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Ile Met Thr Gly
95 100
Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val
105 110 115
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
120 125 130
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
160 165
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
170 175 180
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
185 190 195
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
235 240 245
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
250 255 260
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
300 305 310

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 315 320 325

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
365 370 375
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
380 385 390
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
430 435 440

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
445 449

<210> 13

<211> 660

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<222> (1)…(660)

<223> ДНК, кодирующая легкую цепь химерного антитела SE-9/4

<400> 13

GAT GTT TTG ATG ACC CAA AGT CCA CTC TCC CTG CCT GTC 39
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
1 5 10
AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT 78
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
15 20 25
CAG AGC ATT GTA TAT AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA GAA 117
Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
30 35
TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG 156
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
40 45 50
ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC 195
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp
55 60 65
AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC 234
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
70 75
AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT 273
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr
80 85 90
TAC TGT TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA 312
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly
95 100
GGG GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGA ACT GTG GCT GCA 351
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
105 110 115
CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG 390
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
120 125 130
AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC 429
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
135 140
TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT 468
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
145 150 155
AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA 507
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
160 165
GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC 546
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
170 175 180
ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA 585
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
185 190 195
GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG 624

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

200 205

CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAG 660

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys ***
210 215 219 220

<210> 14

<211> 219

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<222> (1)…(219)

<223> Последовательность аминокислот легкой цепи химерного антитела SE-9/4

<400> 14

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
1 5 10
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
15 20 25
Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
30 35
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
40 45 50
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp
55 60 65
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
70 75
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr
80 85 90
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly
95 100
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
105 110 115
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
120 125 130
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
145 150 155
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
160 165
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
170 175 180
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
185 190 195

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys ***
210 215 219

<---

1. Антитело, способное специфически связываться с эритропоэтином человека, имеющее последовательность вариабельной области тяжелой цепи по SEQ ID NO: 12 и последовательность вариабельной области легкой цепи по SEQ ID NO: 14.

2. Штамм - продуцент антитела по п. 1, представляющий собой культивируемые клетки Cricetulus griseus линии CHO-SE-9/4, трансформированные плазмидой pTVK4g/hybEpo-H, несущей последовательность ДНК SEQ ID NO: 11, ген устойчивости к генетицину и служебные последовательности, обеспечивающие транскрипцию мРНК тяжелой цепи химерного антитела к эритропоэтину и интеграцию плазмиды в транскрипционно активные участки хроматина, и плазмидой pTVK4d/hybEpo-L, несущей последовательность ДНК SEQ ID NO: 13, ген устойчивости к метотрексату и служебные последовательности, обеспечивающие транскрипцию мРНК легкой цепи химерного антитела против эритропоэтина человека и интеграцию плазмиды в транскрипционно активные участки хроматина.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биохимии. Описано моноклональное антитело или его фрагмент, которое связывается с белком P респираторно-синцитиального вируса человека (RSV), отличающееся тем, что данное моноклональное антитело или его фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №:1 или SEQ ID №: 5 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №: 2 или SEQ ID №: 6.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложен способ получения Fc-области класса IgG человека, содержащей первый вариантный полипептид Fc-области и второй вариантный полипептид Fc-области.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено активируемое антитело, которое в активированном состоянии связывает рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), включающее антитело, маскирующий фрагмент, который в нерасщепленном состоянии ингибирует связывание антитела с EGFR, и расщепляемый фрагмент, который функционирует в качестве субстрата для протеазы.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу против Igβ. Также раскрыты полинуклеотид, кодирующий указанное антитело, экспрессионный вектор, содержащий указанный полинуклеотид, клетка-хозяин для получения указанного антитела, фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело.

Изобретение относится к биотехнологии. Описано моноклональное антитело, применяемое в иммуноферментном анализе для идентификации вируса Эбола.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана вирусоподобная частица для индуцирования и/или усиления иммунного ответа против антигена у млекопитающих, содержащая структурный полипептид вируса и по меньшей мере один антиген, в которой структурный полипептид вируса содержит по меньшей мере один первый сайт прикрепления, по меньшей мере один антиген содержит по меньшей мере один второй сайт прикрепления, структурный полипептид вируса и антиген соединяются через по меньшей мере один первый и по меньшей мере один второй сайт прикрепления, и структурный полипептид вируса получен из вируса Chikungunya (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), в которой антиген не происходит из вируса CHIKV или вируса VEEV.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая линкерное звено, содержащее центральную сердцевину, связывающие ветви и, необязательно, соединяющую ветвь (варианты).

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложено рекомбинантное антитело против С5, содержащее вариант Fc нативного полипептида Fc IgG1 дикого типа, где указанный вариант включает 428L/434S/259I, а нумерация приведена согласно индексу EU.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к фармацевтической композиции, содержащей выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфично связывается с альфа-токсином (AT) S.aureus, и выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфично связывается с антигеном S.aureus, являющимся поверхностной детерминантой, выбранным из группы, состоящей из IsdH и ClfA.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к линкерному звену, и может быть использовано в качестве сшивающего средства для объединения различных антител или иных биологически активных агентов в конъюгаты и построения молекулярных конструкций с конкретной комбинацией нацеливающих и эффекторных элементов с применением химического синтеза, либо рекомбинантной технологии.

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к способам получения рекомбинантного гликопротеина в условиях ферментационной культуры в СНО-клетке путем регулирования концентраций железа, меди, цинка и марганца в среде.

Изобретение относится к новым эукариотическим клеткам, подходящим для рекомбинантного продуцирования представляющего интерес продукта, где геном клетки-хозяина модифицируют для ингибирования функция белка FAM60A в указанной клетке, например, посредством снижения или блокирования функциональной экспрессии гена FAM60A, что приводит к повышению ее стабильности.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам получения рекомбинантного полипептида нейротрофина посредством расщепления прополипептида нейротрофина IgA-протеазой, где эндогенный сайт ферментативного расщепления между просегментом и полипептидом нейротрофина заменен сайтом расщепления IgA-протеазой.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению выделенной клетки млекопитающего, подходящей для рекомбинантной экспрессии интересующего полипептида, где клетку млекопитающего изменяют для ухудшения функции эндогенной протеазы матриптазы посредством нокаута, мутации, делеции или сайленсинга гена матриптазы.

Изобретение относится к способу получения нового пептидного противогрибкового антибиотика эмерициллипсина А, продуцируемого штаммом Emericellopsis alkalina F -1428, с противогрибковой активностью в отношении С.glabrata 1402м, Aspergillus ochraceus 497м 2015, а также Bipolaris hawaiiensis 988м 2015 и Aspergillus terreus 1133м 2011, обладающих природной резистентностью ко всем применяемым в химиотерапии антибиотикам - азолам.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения белковой биомассы. Предлагается штамм бактерий Methylococcus capsulatus, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им.

Изобретение относится к ферментативному синтезу L-нуклеиновых кислот в присутствии полимеразы. Предложен способ добавления одного или нескольких L-нуклеотидов к 3’-концу L-нуклеиновой кислоты, включающий стадию проведения реакции одного или нескольких L-нуклеотидов с L-нуклеиновой кислотой в присутствии полимеразы, где указанная полимераза способна добавлять один или несколько L-нуклеотидов к 3’-концу указанной L-нуклеиновой кислоты, при этом указанная полимераза состоит из аминокислотной последовательности, причём аминокислоты указанной аминокислотной последовательности представляют собой D-аминокислоты.
Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к штамму дрожжей Metschnikowia pulcherrima ВКПМ Y-4339 - продуценту микробного белка и этанола. Предложенный штамм Metschnikowia pulcherrima ВКПМ Y-4339 неприхотливый к культивированию и хранению, обладает невысокой температурой размножения, обеспечивает высокий прирост биомассы при получении микробного белка, а также высокий выход этанола..

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека (рчФСГ).

Изобретение относится к клеточным технологиям и может быть использовано для рекомбинантного получения фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека. Клеточную линию huFSHKKc6 получают путем трансформации клеток huFSHIK экспрессионной плазмидой длиной 7719 п.о., состоящей из гена устойчивости PuroR с SV40 polyA, укороченного 3'LTR HIV-1, гена устойчивости AmpR, промотора AmpR, ориджина репликации SV40 и pBR322, промотора NP гена р53 человека, pgk - конститутивного промотора гена фосфоглицераткиназы, синтетической нуклеотидной последовательности, кодирующей полноразмерную альфа-субъединицу ФСГ человека, сигнала терминации трансляции, состоящего из 3 пар оснований и консенсусной сигнальной последовательности Козак.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к экспрессионным кластерам, содержащим коровый элемент сайта гиперчувствительности к ДНКазе I 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина или сайт гиперчувствительности 40 (HS40) кластера человеческого гена α-глобина и часть промотора человеческого гена Aγ-глобина.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, способное специфически связываться с эритропоэтином человека. Также рассмотрен штамм-продуцент такого антитела. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в выделении иили очистке рекомбинантного эритропоэтина человека методом иммуноаффинной хроматографии. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.

Наверх