Флуоресцентный сенсор для детектирования лизосом in vitro

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Флуоресцентный сенсор для детектирования лизосом in vitro содержит флуорофор семейства BODIPY, при этом в качестве флуорофора содержит 4,4-дифторо-5-фенил-3-(1,5-дифенил-3-1Н-пиразолил)-8-трифторметил-4-бора-3а,4а-диаза-8-индацен. Изобретение обеспечивает флуоресцентный сенсор, имеющий высокую фотостабильность, низкую токсичность, позволяющий достоверно выявлять лизосомы в живых клетках и подходящий для прижизненной окраски. 5 ил., 3 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а так же к медицине, и касается получения нового и ранее неизвестного химического соединения - флуорофора, которое может быть использовано в медицине в качестве флуоресцентного сенсора для детектирования лизосом in vitro.

Известно, что флуоресцентные сенсоры, за счет малых активных молекул, селективно связываются с клеточными органеллами и обеспечивают их фотовизуализацию, что чрезвычайно важно для проведения биохимических и диагностических исследований.

Также известно, что лизосомы являются мембранными органеллами, отвечающими за клеточный метаболизм, которые играют ключевую роль в клеточной защите, производстве антигенов, апоптозе и процессе аутофагии, а также в поддержании клеточного гомеостаза и в различных других физиологических процессах. Повышение или снижение образования лизосом и лизосомальных белков коррелирует более чем с пятьюдесятью заболеваниями, в частности и с заболеваемостью раком.

Флуоресцентные зонды играют важную роль в мониторинге лизосом в живых клетках. Идеальный флуоресцентный зонд должен быть биосовместимым для поддержания жизнеспособности клеток и иметь низкую токсичность. При этом зонды должны демонстрировать высокую специфичность и чувствительность к соответствующим органеллам, а также и высокий квантовый выход для минимизации эффекта фоновых шумов. Для такого применения нужен стабильный флуорофор с минимальными характеристиками фотообесцвечивания.

Известны флуоресцентные сенсоры для визуализации лизосом живых клеток, содержащие флуорофор семейства BODIPY, например, выпускаемые ThermoFisher Scientific (LysoTracker Blue DND-22, LysoTracker Green DND-26, LysoTracker Red DND-99) и Enzo Biochem Inc. (LYSO-ID Green detection kit и LYSO-ID Red detection kit).

Основные недостатки этих сенсоров обусловлены присутствием аминогрупп, которые изменяют рН клетки и обеспечивают эффект подщелачивания.

Кроме этого, использование сенсоров LysoTracker ограничено, т.к. они проявляют значительную клеточную токсичность, вследствие чего их применение ограничено только кратковременной визуализацией лизосом живых клеток.

Так, наборы для визуализации лизосом серии LYSO-ID к тому же обладают малой устойчивостью, из-за чего требуют особых условий хранения и транспортировки - при температурах не выше - 20°С и защиты от света как при хранении, так и при работе.

По способности окрашивать лизосомы прижизненно, наиболее близким к предлагаемому флуоресцентному сенсору, содержащему флуорофор семейства BODIPY, является сенсор LysoTracker Red DND-99, который имеет следующую структурную формулу:

(получено по ссылке с сайта производителя, https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L7528. Дата обращения 10.04.19)

К недостаткам известного сенсора следует отнести:

1) Ограниченное время инкубации - от 30 минут до 2 часов;

2) Ограниченный срок хранения - до 6 месяцев при правильном хранении;

3) Сенсор при хранении должен находится в растворе, т.к. требует предохранения от высушивания;

4) Температура хранения -20°С;

5) Для проведения пробы требуется полностью удалить среду хранения, т.к. среда, не удаленная из пробы, создает помехи и мешает визуализации. После окончания воздействия также требуется перемещения исследуемых клеток в свежую среду, что негативно сказывается на проведении эксперимента (усложнение), требует лишней траты сред.

Задачей заявляемого технического решения является разработка флуоресцентного сенсора, лишенного недостатков известных сенсоров, используемых для детектирования лизосом in vitro.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение нового флуоресцентного сенсора, способного эффективно детектировать лизосомы in vitro при длительном сроке наблюдения - до 1-х суток - за живыми клетками, а также стабильно сохранять свои фотофизические и биологические свойства при хранении в условиях комнатной температуры.

Технический результат предлагаемого флуоресцентного сенсора для детектирования лизосом in vitro содержит ранее неизвестный флуорофор семейства BODIPY.

Отличие заявляемого флуоресцентного сенсора заключается в том, что в качестве флуорофора он содержит 4,4-дифторо-5-фенил-3-(1,5-дифенил-3-1H-пиразолил)-8-трифторметил-4-бора-3а,4а-диаза-s-индацен (1), имеющий следующую структурную формулу:

Заявляемый флуоресцентный сенсор отличается от существующих аналогов высокой фотостабильностью при хранении на свету при комнатной температуре как в твердом виде, так и в состоянии раствора, не проявляет заметного фотообесцвечивания. Низкая токсичность и высокая селективность по отношению к лизосомам позволяет осуществлять длительные прижизненные наблюдения за клетками. Высокий квантовый выход флуоресценции позволяет минимизировать фоновые шумы и обеспечивает надежную визуализацию лизосом.

Синтез флуорофора 1 осуществлен конденсацией 1,5-дифенил-3-(1H-пиррол-2-ил)-1H-пиразола 2 с 2,2,2-трифтор-1-(5-фенил-1H-пиррол-2-ил)этан-1-олом 3 (Р2О5, CH2Cl2, 20-25°С, 16 ч) с последующими окислением (DDQ, CH2Cl2, 20-25°С, 10 мин) и комплексобразованием (BF3⋅Et2O, i-Pr2NEt, CH2Cl2, 0°С, 2 ч) 1,5-дифенил-3-(5-(2,2,2-трифтор-1-(5-фенил-1H-пиррол-2-ил)этил)-1H-пиррол-2-ил)-1H-пиразола 4.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Синтез флуорофора BODIPY 1.

К смеси 1,5-дифенил-3-(1H-пиррол-2-ил)-1H-пиразола 2 (1 г, 3.5 ммоль) и 2,2,2-трифтор-1-(5-фенил-1H-пиррол-2-ил)этан-1-ола 3 (0.845 г, 3.5 ммоль) в 15 мл сухого CH2Cl2 прибавляли P2O5 (0.5 г, 3.5 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 16 часов, затем прибавляли NaHCO3 (15% избыток, 0.34 г, 4 ммоль) и перемешивали еще 1 час. Осадок отфильтровывали и промывали CH2Cl2. Остаток после удаления растворителя фракционировали колоночной хроматографией (SiO2, н-гексан/ CH2Cl2, 3:1) и получали 1.42 г (80%) 1,5-дифенил-3-(5-(2,2,2-трифтор-1-(5-фенил-1H-пиррол-2-ил)этил)-1H-пиррол-2-ил)-1H-пиразола 4. Далее к раствору 1.42 г (2.8 ммоль) соединения 4 в 20 мл CH2Cl2 прибавляли (0.635 г, 2.8 ммоль) дихлордицианобензохинона (DDQ) и перемешивали 1 час при комнатной температуре. Затем прибавляли при перемешивании (i-Pr)2NEt (3.49 г, 27 ммоль), через 10 минут охлаждали реакционную смесь до 0°С, прикапывали BF3⋅Et2O (4.22 г, 29.7 ммоль) и продолжали перемешивание при 0°С еще в течение 2 часов. После чего удаляли ~2/3 растворителя, остаток фракционировали колоночной хроматографией (SiO2, н-гексан/ CH2Cl2, 3:1) и выделяли 0.600 г (39%) флуорофора BODIPY 1.

Зеленые кристаллы, Тпл=175-177°С.

1Н NMR (400.1 MHz, CDCl3) δ 7.94 (м, 2Н), 7.58 (с, 1Н), 7.47 (м, 5Н), 7.40 (м, 1Н), 7.33 (м, 8Н), 7.26 (м, 1H), 7.25 (м, 1Н), 6.72 (м, 1Н).

13C NMR (100.6 MHz, CDCl3) δ 159.9, 155.1, 145.0, 143.5, 139.7, 134.4, 132.9, 132.4, 130.4, 130.0, 129.9, 129.7, 129.2, 129.1, 128.9, 128.7, 128.5, 128.4, 128.3, 125.4, 125.3 (q, J=32.8 Hz), 123.3, 122.8 (q, J=275.9 Hz), 122.1, 111.3.

19F NMR (376.5 MHz, CDCl3) δ -54.9 (CF3), -136.0 (BF2).

IR (KBr, cm-1): 1574, 1521, 1472, 1397, 1351, 1279, 1224, 1137, 1086, 1020, 919, 797, 760, 692.

Anal. Calcd for C31H20BF5N4: C, 67.17; H, 3.64; B, 1.95; F, 17.14; N, 10.11; Found: C, 67.26; H, 3.90; N, 9.89%.

Пример 2.

Исследование предлагаемого флуоресцентного сенсора для детектирования лизосом in vitro проведено на культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха, полученных из перевиваемой культуры, поддерживаемой в белых лабораторных мышах. Культура данного перевиваемого штамма приобретена в питомнике Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Россия, Новосибирская область, поселок Кольцово), ветеринарный сертификат 254 №0336050 от 28 июля 2010 г. Забор асцитной жидкости осуществляли на log-фазе размножения штамма асцитной карциномы Эрлиха (через 9 суток). Полученную клеточную суспензию разводили в 500 раз питательной средой DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, «Sigma-Aldrich»), дополненной 50 мкг/мл антибиотика гентамицина, после чего культивировали 1 сутки в 24-луночных планшетах при температуре 37°С, влажности - 80%, содержании CO2 - 5%, используя CO2-инкубатор BioStation СТ (Nikon).

BODIPY растворяли в DMSO, добавляли бидистиллированную воду. Затем полученный раствор вносили в питательную среду DMEM с культивируемыми клетками с доведением до конечных концентраций 0,04 мкМ, 0,2 мкМ, 1 мкМ, 5 мкМ, 25 мкМ, 100 мкМ.

Фотофиксацию проводили каждые 2 часа в течение суток, используя CO2-инкубатор BioStation СТ (Nikon).

Установлено, что через 2 часа после добавления BODIPY, флуоресцентный сенсор обнаруживается в виде яркого специфического свечения в лизосомах. Свечения межклеточного вещества не наблюдалось. Через 4 часа после внесения в среду 1 мкМ BODIPY проявилась яркая специфическая окраска лизосом клеток карциномы Эрлиха, окраска межклеточного вещества не наблюдалась (фиг. 1).

Экспериментальными исследованиями авторов установлено, что достаточное для регистрации свечение выявлено при использовании концентраций: 1 мкМ, 5 мкМ, 25 мкМ, 100 мкМ; свечение низкой яркости - при концентрациях: 0,04 мкМ, 0,2 мкМ.

Авторами так же отмечено нарастание яркости свечения в динамике наблюдения, что наглядно подтверждают фиг. 2 и фиг. 3. Так на фиг. 2 показано специфическое свечение лизосом клеток карциномы Эрлиха через 2 часа инкубации после добавления 100 мкМ BODIPY; на фиг. 3 - через 24 часа инкубации со 100 мкМ BODIPY - показано нарастание интенсивности специфического свечения лизосом клеток карциномы Эрлиха.

Пример 3.

Исследование проведено на культуре фибробластов. BODIPY растворяли в ДМСО, добавляли бидистиллированную воду. Затем полученный раствор вносили в питательную среду DMEM с культивируемыми клетками с доведением до конечных концентраций 0,04 мкМ, 0,2 мкМ, 1 мкМ, 5 мкМ, 25 мкМ, 100 мкМ. Фотофиксацию проводили в течение суток с периодичностью 1 раз в 2 часа, используя CO2-инкубатор BioStation СТ (Nikon).

Результаты: Через 2 часа после добавления BODIPY обнаруживалось свечение лизосом. Окраски межклеточного вещества не зафиксировано.

Свечение низкой яркости выявлено при использовании концентраций 0,04 мкМ, 0,2 мкМ; достаточной яркости - при концентрациях 1 мкМ, 5 мкМ; избыточно яркая окраска - при концентрациях 25 мкМ, 100 мкМ. При использовании любой из указанных концентраций свечения межклеточного вещества зарегистрировано не было.

На фиг. 4 показана окраска лизосом фибробласта через 24 часа инкубации при использовании концентрации 0,04 мкМ; зарегистрировано отсутствие свечения межклеточного вещества.

На фиг. 5 показана окраска лизосом фибробласта через 24 часа инкубации при использовании концентрации 5 мкМ; зарегистрировано отсутствие свечения межклеточного вещества.

Таким образом, доказано, что тестируемое вещество - флуоресцентный сенсор, перспективно для применения для детектирования лизосом in vitro и, за счет прижизненной окраски, позволяет осуществлять длительные наблюдения за клетками.

Предлагаемый флуоресцентный сенсор после внесения в клеточную культуру селективно накапливается в лизосомах. Концентрация 5 мкМ является достаточной для визуализации лизосом на исследованных культурах фибробластов и раковых клеток. Предлагаемый сенсор обладает высокой фотостабильностью (более 24-х часов), его флуоресцентные свойства сохраняются в полной мере при хранении в условиях комнатной температуры более полугода.

Флуоресцентный сенсор для детектирования лизосом in vitro, содержащий флуорофор семейства BODIPY, отличающийся тем, что в качестве флуорофора содержит 4,4-дифторо-5-фенил-3-(1,5-дифенил-3-1Н-пиразолил)-8-трифторметил-4-бора-3а,4а-диаза-8-индацен.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к новым комплексам металла, содержащим по меньшей мере один N-аминогуанидинатный лиганд, где этот комплекс металла имеет приведенную ниже формулу 1а или 1b .М - металл, выбранный из группы, включающей металлы групп 1-15 Периодической системы элементов (РТЕ), лантаниды или актиниды, R1 - водород или циклический, линейный или разветвленный алкильный радикал, содержащий до 5 атомов углерода, NH2, NH(CH3), N(CH3)2, N(C2H5)2 или N-пирролидинил, или R1 и R2 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пирролидинильное кольцо; R2 - водород или циклический, линейный или разветвленный алкильный радикал, содержащий до 5 атомов углерода, NH2, N(CH3)2, N(C2H5)2, или R2 и R1 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пирролидинильное кольцо; R3 - водород или циклический, линейный или разветвленный алкильный радикал, содержащий до 8 атомов углерода, NH2, NH(CH3), N(CH3)2, N(C2H5)2 или N-пирролидинил, или группу SiMe3, R4 и R5 независимо друг от друга обозначают водород или линейный или разветвленный алкильный радикал, содержащий до 4 атомов углерода, или R4 и R5 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пирролидинильное кольцо; X - моноанионный солиганд, выбранный из гидрид-аниона (Н-), из группы, включающей галогениды, из группы, включающей циклические, линейные или разветвленные алкилиды, содержащие до 8 атомов углерода, из группы, включающей замещенные или незамещенные арилиды или гетероарилиды, содержащие до 10 атомов С, из группы, включающей алкоксилатные лиганды, из группы, включающей алкилтиолатные или алкилселенатные лиганды, или из группы, включающей вторичные амидные лиганды, Y - дианионный солиганд, выбранный из оксогруппы [О]2-, сульфидной группы [S]2- или имидной группы [NR6]2-, где R6 - циклический, разветвленный или линейный алкил, содержащий до 8 атомов углерода, или замещенный или незамещенный арил, содержащий до 20 атомов углерода, L - нейтральный лиганд, являющийся донором 2 электронов, а - целое число, равное от 1 до 4, и n, m и p каждый независимо друг от друга равен 0, 1, 2, 3 или 4, при условии, что значение М является другим, чем медь, если R3 обозначает NH2, R1, R2, R4 и R5 обозначают водород, X обозначает хлорид и n равен 3.

Изобретение относится к химии полиэдрических боргидридных соединений и 5-аминотетразола, а именно к дигидрату додекагидро-клозо-додекабората 5-аминотетразол кобальта состава [Co(CH3N5)]B12H12⋅2H2O.

Изобретение относится к способам синтеза йодсодержащих контрастных веществ, конкретно к способу получения Йопамидола (II), который включает указанную ниже реакцию, где Х представляет собой OR2 или R3, и R2 и R3 представляют собой С1-С6линейный или разветвленный алкил, С3-С6циклоалкил, C6арил, необязательно замещенный группой, выбранной из группы, состоящей из метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, втор-бутила, трет-бутила и фенила.

Изобретение относится к дигидрату додекагидро-клозо-додекабората 5-аминотетразол никеля состава [Ni(CH3N5)]B12H12⋅2H2O. Также предложен способ его получения.

Изобретение относится к твердой форме, включающей кристаллическое соединение формулы 1: или его фармацевтически приемлемой соли, гидрату или сольвату. Кристаллическое соединение формулы 1 представляет собой кристаллическую форму А формулы 1 и имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую пики, в приблизительных положениях пиков: 17,26±0,10, 21,60±0,10 и 27,73±0,10 градусов 2θ и по меньшей мере в приблизительных положениях пиков: 9,68±0,10, 24,68±0,10, 25,48±0,10 и 29,08±0,10 градусов 2θ.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к фосфолипидному флуоресцентному зонду, и может быть использовано в медицине. Указанный фосфолипидный флуоресцентный зонд, характеризующийся следующим названием 1-[13-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-диаза-s-индацен-8-ил)тридеканоил]-2-(10-{[(2-гидроксинафтил-1)азофенил-4]азофенил-4}деканоил)-sn-глицеро-3-фосфохолин, используют в составе тест-системы для определения активности фосфолипазы А2 группы IIA (секФЛА2(IIA)) в сыворотке крови, которая также содержит везикулярную фосфолипидную матрицу для включения зонда, состоящую из фосфатидилхолина, лизофосфатидилхолина и фосфатидилглицерина, буферный раствор и фосфолипазу А2 пчелиного яда в качестве стандарта.

Изобретение относится к области элементоорганической химии и касается способа получения В-триаллилборазола (БТАБ). .

Изобретение относится к соединению, содержащему бороксиновый цикл, в котором атомы бора данного цикла имеют заместитель, содержащий оксифункцию, связанную с (1) атомом бора и с (2) ненасыщенной не ароматической частью, содержащей тройную углерод-углеродную связь.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Флуоресцентный сенсор для детектирования лизосом in vitro содержит флуорофор семейства BODIPY, при этом в качестве флуорофора содержит 4,4-дифторо-5-фенил-3--8-трифторметил-4-бора-3а,4а-диаза-8-индацен. Изобретение обеспечивает флуоресцентный сенсор, имеющий высокую фотостабильность, низкую токсичность, позволяющий достоверно выявлять лизосомы в живых клетках и подходящий для прижизненной окраски. 5 ил., 3 пр.

Наверх