Способ определения микросателлитной нестабильности



Способ определения микросателлитной нестабильности
Способ определения микросателлитной нестабильности
Способ определения микросателлитной нестабильности
G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2717309:

Общество с ограниченной ответственностью "ОНКОДИАГНОСТИКА АТЛАС" (RU)

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения микросателлитной нестабильности. Осуществляют таргетное обогащение целевых участков методом мультиплексной ПЦР, высокопроизводительное секвенирование полученного образца ДНК-библиотеки, анализ результатов секвенирования и поиск генетических вариантов с покрытием не менее 10 прочтений и долей мутантного аллеля не менее 0,1%. Интерпретацию обнаруженных генетических вариантов проводят путем установления длин фрагментов. Если для не менее 2 и не более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как низкая микросателлитная нестабильность - MSI-L. Если для более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как высокая микросателлитная нестабильность. Изобретение обеспечивает повышение точности секвенирования и снижает вероятность ошибочного определения дины фрагмента. 1 ил., 1 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к методам генетического анализа, в частности к методам молекулярной диагностики в онкологии.

Уровень техники

Известны методы определения микросателлитной нестабильности на основе аналища полиморфизма длин коротких тандемных повторов. Эти методы основаны на ПЦР-амплификации панели целевых локусов с последующим определением длин фрагментов с помощью гель-электрофореза или капиллярного электрофореза.

Аналоги отличаются преимущественно только выбором панели локусов и количеством анализируемых повторов. Наиболее распространенной является 5-маркерная панель Bethesda, включающая повторы ВАТ-25, ВАТ-26, MONO-27, NR-21 и NR-24. При этом наличие нестабильности требует сравнения аллельных вариантов повторов в онормальной ткани/крови и в опухоли. Если для каждого локуса (повтора) присутствуют идентичные аллели и в нормальной ткани и в опухоли, то считается что образей демонстрирует микросателлитную стабильность (MSS) При обнаружении 1-2 нестабильных повторов делается вывод о низкой микросателлитной нестабильности, если нестаблильных локусов 3-5 - образец считается микросатллитно-нестабильным (MSI-H)

Использование высокопроизводительного секвенирования является наиболее перспективным подходом для определения микросателлитной нестабильности так как позволяет одновременно исследовать широкий спектр микросателлитных маркеров и другие типы клинически значимых генетических изменений (в т.ч. соматические мутации, изменение числа копий генов и др.).

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является выявление микросателлитной нестабильности в образцах опухоли и циркулирующей ДНК крови. Отличительной чертой изобретения является использование для выявления MSI метода NGS и возможность определения MSI без контрольного образца нормальной ткани.

Это достигается тем, что в отличие от известных технических решений используется расширенная панель микросателлитных повторов (18 локусов). Выбранные локусы характеризуются тем, что могут быть одновременно наработаны в одной реакционной смеси методом мультиплексной ПЦР. Высокая полиморфность локусов позволяет исследовать их без необходимости проводить сравнение с профилем микросателлитов в нормальной ткани. Кроме того, подобранные повторы составлены не длинными гомо-полимерными, что повышает точность секвенирования и снижает вероятность ошибки «проскальзывания» ошибочного определения дины фрагмента.

Осуществление изобретения

Изобретение является методом, включающим:

1) Выделение ДНК из образца биоматериала, например ткани опухоли, архивного парафинизированного блока или плазмы крови (выделение циркулирующей ДНК).

2) таргетное обогащение целевыми участками тандемных повторов из нижеперечисленных

chr4:55598212-55598236

chr2:47641560-47641586

chr2:39564894-39564921

chr14:23652347-23652367

chr2:95 849362-95849384

chr1:201754411-201754427

chr2:62063094-62063110

chr2:108479623-108479640

chr5:172421761-172421775

chr6:142691951-142691967

chr7:1787520-1787536

chr7:74608741-74608753

chr11:106695515-106695526

chr15:45897772-45897785

chr16:18882660-18882674

chr17:19314918-19314935

chr13:31722621-31722637

chr22:29696469-29696484.

3) Высокопроизводительное секвенирование полученного образца «ДНК-библиотеки», после введения универсальных олигонуклеотидных адаптеров.

4) Анализ результатов секвенирования и поиск генетических вариантов с покрытием не менее 10 прочтений и долей мутантного аллеля не менее 0,1%.

5) Интерпретация обнаруженных генетических вариантов путем установления длин фрагментов: если для не менее 2 и не более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как низкая микросателлитная нестабильность - MSI-L, если для более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как высокая микросателлитная нестабильность.

Обнаруженные генетические варианты соответствуют генотипу исследуемого образца биоматериала (опухоли) и могут быть использованы для принятия решений о постановке диагноза синдром Линча или выборе лекарственного лечения.

Устройство работает следующим образом.

За счет подобранных олигонуклеотидных праймеров выполняется мультиплексная ПЦР для получения библиотеки фрагментов, содержащих микросателлитные локусы. После добавления реакционной смеси к анализируемым пробам ДНК выполняют термоциклирование включащее стандратные стадии плавления ДНК, отжига и элонгации. После 21 цикла ПЦР продукт амплификации готов для дальнейшего процессинга. Если ДНК в анализируемой пробе менее 1 нг, может быть выполнено дополнительное термоциклирование: до 3-5 дополнительных циклов ПЦР в зависимости от доступного количества ДНК.

Введение адаптеров может осуществляться разными способами, в том числе: использование олигонуклеотидных праймеров содержащих адаптерную последовательность на 5'-конце или дполнительное лигирование двуцепочечных адаптеров на следующем шаге после мультиплексной ПЦР и «тупления» концов ПЦР-продуктов. PGM/S5 или другие. Результаты анализируют стандартным программным обеспечением.

Секвенирвоание готовой библиотеки ДНК может выполняться на одной из платформ: Illumina или Torrent, в зависимости от использованных адаптеров. Для одновременного секвенирования более одного образца требуется введение уникального олигонуклеотидного индекса в каждый ПЦР-продукт библиотеки от данного образца.

После завершения цикла секвенирования полученные ВАМ файлы используют для определения длин фрагментов целевых локусов.

Вывод о наличие наличии микросателлитной нестабильности делают следующим образом: если для не менее 2 и не более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как низакая микросателлитная нестабильность - MSI-L, если для более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как высокая микросателлитная нестабильность.

Выбор микросателлитных локусов может быть изменен в сторону сокращения количества анализируемых участков, однако их количество не должно быть менее 10. Полный перечень приведен ниже в Таблице 1.

Результаты анализа MSI методом ПЦР и NGS можно представить следующим образом, как показано на Фиг. 1.

Способ определения микросателлитной нестабильности, в котором для получения результатов после выделения ДНК из образца ткани опухоли или плазмы крови выполняются последовательно следующие шаги:

- таргетное обогащение методом мультиплексной ПЦР по нижеперечисленным целевым участкам: chr4:55598212-55598236, chr2:47641560-47641586, chr2:39564894-39564921, chr14:23652347-23652367, chr2:95849362-95849384, chr1:201754411-201754427, chr2:62063094-62063110, chr2:108479623-108479640, chr5:172421761-172421775, chr6:142691951-142691967, chr7:1787520-1787536, chr7:74608741-74608753, chr11:106695515-106695526, chr15:45897772-45897785, chr16:18882660-18882674, chr17:19314918-19314935, chr13:31722621-31722637, chr22:29696469-29696484;

- высокопроизводительное секвенирование полученного образца ДНК-библиотеки, после введения универсальных олигонуклеотидных адаптеров;

- анализ результатов секвенирования и поиск генетических вариантов с покрытием не менее 10 прочтений и долей мутантного аллеля не менее 0,1%;

- интерпретация обнаруженных генетических вариантов путем установления длин фрагментов, причем:

если для не менее 2 и не более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как низкая микросателлитная нестабильность - MSI-L,

если для более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как высокая микросателлитная нестабильность.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения состояния липидной компоненты мембран клеток. Для этого осуществляют взятие пробы крови у пациента, ее центрифугирование и отмывание клеток эритроцитов физиологическим раствором.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови.
Изобретение относится к области медицины, в частности к эндокринологии и акушерству, и предназначено для прогнозирования риска развития гестационного сахарного диабета (ГСД) у беременных женщин.
Изобретение относится к области медицины, в частности к эндокринологии и акушерству, и предназначено для прогнозирования риска развития гестационного сахарного диабета (ГСД) у беременных женщин.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и раскрывает способ оценки адаптационного потенциала спортсменов. Способ включает измерение в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа уровня антител к эндогенным биорегуляторам, выбранным из группы β-эндорфин, орфанин, серотонин, дофамин, гистамин, ангиотензин, глутамат и гамма-аминомасляная кислота, рассчитывают показатель адаптации в условных единицах для уровня антител каждого эндогенного биорегулятора путем деления показателя разницы значений оптической плотности анализируемого образца и среднего по группе значения оптической плотности образцов сыворотки крови здоровых доноров, выбранных из среднестатистической группы людей одинакового возраста и пола с обследуемыми спортсменами, занимающихся оздоровительной физкультурой, на среднее по группе значение показателей оптической плотности образцов сыворотки крови здоровых доноров.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для определения показаний к релапаротомии у пациентов, первично прооперированных по поводу перитонита.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которое связывается с внеклеточным доменом протеинтирозинфосфатазы σ рецепторного типа человека (PTPRS человека) на плазмоцитоидной дендритной клетке (варианты), гибридому для получения вышеуказанного антитела, способ получения клетки, которая продуцирует антитело, способ получения антитела, распознающего PTPRS человека, применение клетки животного, которая сохраняет способность экспрессировать эндогенный полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность, включающую внеклеточный домен PTPRS человека, или фракцию мембран этой клетки для получения моноклонального антитела, способ детекции плазмацитоидной дендритной клетки, применение антитела или его фрагмента для детекции плазмоцитоидной дендритной клетки, способ подавления активности плазмацитоидной дендритной клетки ex vivo, применение антитела или его фрагмента для лечения заболевания, связанного с рDC и для лечения аутоиммунного заболевания, связанного с IFNальфа.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для контроля специфичности лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл по содержанию антител методом иммуноферментного анализа.

Изобретение относится в медицине и может быть использовано в кардиологии и терапии. Способ прогнозирования течения липидемии характеризуется тем, что проводят лабораторное исследование липидов крови до и после лечения липидемии с последующим определением коэффициента атерогенности, дополнительно до и после лечения определяют (QXC+ТАГ)/ХС ЛПВП и при одновременном снижении предлагаемого коэффициента атерогенности до 4,0 и ниже, уровня общего холестерола на 25% и более и уровня холестерола липопротеинов низкой плотности на 20% и более по сравнению с исходным уровнем прогноз течения липидемии считают благоприятным, а при снижении предлагаемого коэффициента атерогенности до 4,1 и более, уменьшении общего холестерола на 24% и менее и холестерола липопротеинов низкой плотности на 19% и менее по сравнению с исходным уровнем прогноз течения липидемии считают неблагоприятным.

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, онкологии и реабилитологии. Предложен способ прогнозирования развития антрациклин-индуцированной кардиотоксичности после полихимиотерапии антибиотиками антрациклинового ряда у пациенток с раком молочной железы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности описан основанный на применении микровезикул способ обнаружения некротического энтерита птиц, а также новые маркеры, которые идентифицированы в качестве приемлемых для обнаружения некротического энтерита птиц и/или заражения птиц Clostridium perfringens.

Группа изобретений относится к области аналитической химии. Раскрыт способ выявления присутствия или отсутствия целевой молекулы в образце, предусматривающий введение образца в контакт с молекулой, содержащей расщепляемый линкер, при этом указанный расщепляемый линкер специфически расщепляется в присутствии указанной целевой молекулы; загрузку указанного образца в устройство, содержащее нанопору; создание конфигурации устройства с возможностью пропускания каркаса, выбранного из нуклеиновых кислот, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), дендримеров, линеаризованных белков или пептидов, через указанную нанопору, расщепляемого линкера, содержащего первый домен, который связывается с указанным каркасом, и второй домен, который связывается с молекулярным грузом, тем самым образуя комплекс, и при этом устройство содержит датчик для измерения тока; и определение с помощью датчика, был ли расщепляемый линкер расщеплен путем выявления индивидуальной сигнатуры тока при транслокации указанного комплекса через нанопору.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложены способы диагностирования хронического заболевания клапанов у животного.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ идентификации устойчивого к киле крестоцветных растения, включающего фенотип высокого содержания олеиновой кислоты, низкого содержания линоленовой кислоты (HO/LL), где содержание олеиновой кислоты составляет приблизительно 77%, а содержание линоленовой кислоты составляет приблизительно 3%.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения иммобилизованной библиотеки фрагментов ДНК нуклеиновой кислоты-мишени со штрихкодами с использованием иммобилизованных на носителе транспозомных комплексов для захвата специфических фрагментов ДНК.

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована в медицинской диагностике и биохимических исследованиях для количественного обнаружения катехоламинов и их метаболитов в биологических жидкостях.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу отбора стабильной продуцирующей антитело под контролем промотора CMV человека с SEQ ID NO: 1 клетки яичника китайского хомячка СНО-К1.

Данное изобретение относится к медицине. Предложены способы и применение ингибитора СЕТР, а именно дальцетрапиба, для лечения субъекта с острым коронарным синдромом, где субъект имеет нуклеотидные полиморфизмы в гене аденилатциклазы типа 9 (ADCY9) в хромосоме 16.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Предложен способ комбинированного лечения немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) IB - III стадии.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и предназначено для идентификации штаммов Yersinia pestis средневекового биовара с последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом ПЦР в режиме реального времени.

Изобретение относится к биотехнологии и описывает способ неинвазивной диагностики анеуплоидий плода с помощью анализа внеклеточной ДНК из крови беременной женщины методом массового параллельного секвенирования ДНК.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения микросателлитной нестабильности. Осуществляют таргетное обогащение целевых участков методом мультиплексной ПЦР, высокопроизводительное секвенирование полученного образца ДНК-библиотеки, анализ результатов секвенирования и поиск генетических вариантов с покрытием не менее 10 прочтений и долей мутантного аллеля не менее 0,1. Интерпретацию обнаруженных генетических вариантов проводят путем установления длин фрагментов. Если для не менее 2 и не более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как низкая микросателлитная нестабильность - MSI-L. Если для более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как высокая микросателлитная нестабильность. Изобретение обеспечивает повышение точности секвенирования и снижает вероятность ошибочного определения дины фрагмента. 1 ил., 1 табл.

Наверх