Способ получения лактоферрина


G01N2030/027 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание
C07K1/18 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2717340:

Общество с ограниченной ответственностью "НПК "Альтернативные технологии" (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения лактоферрина. Способ получения лактоферрина заключается в том, что сухой лактоферрин-содержащий препарат чистотой 90% и менее растворяют в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,5, содержащем 0,35М NaCl, далее проводят фильтрование от нерастворенной взвеси через фильтр 2,5 мкм, внесение на колонку с катионообменным сорбентом, промывку 10 мМ фосфатным буфером рН 7,5, содержащим 0,35 М NaCl и 0,01% твин-20, для удаления липополисахарида, связанного с лактоферрином, элюцию лактоферрина в градиенте NaCl 0,35-1,0 М, обессоливание путем диализа или диафильтрации или гель-фильтрации, микрофильтрацию через фильтр 0,22 мкм и лиофильное высушивание. Способ позволяет получить лактоферрин чистотой 99%, не содержащий ЛПС.

 

Изобретение относится к биотехнологии.

Коммерческие препараты лактоферрина чистотой 90% и менее, содержат как белки молока, так и возможна контаминация ЛПС, с которыми лактоферрин образует прочный комплекс. Из белков молока возможны примеси лактопероксидазы, ангиогенина и иммуноглобулинов.

Ввиду того, что лактоферрин - многофункциональный белок, обладающий антибактериальной, противовирусной, иммуномодулирующей активностями, он может использоваться в качестве фармацевтической основы для создания многих препаратов. Препарат лактоферрина, полученный по предложенному методу, может быть использован в качестве активной основы как фармацевтических препаратов широкого спектра действия (например, для восстановления слизистой оболочки ЖКТ при гастроэнтерологических заболеваниях, в качестве противоопухолевого агента, как антибактериальное средство при разных бактериальных инфекциях глаз и кожи, для лечения инфекционных заболеваний дыхательных путей, в профилактике остеопороза), также пищевых БАД в том числе в питании новорожденных.

Известен способ получения лактоферрина из коровьего молока, заключающийся в хроматографии лактоферрина из молочного сырья в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером, элюирование лактоферрина 0,05М натрий-фосфатным буфером, ультрафильтрации, обессоливания и лиофилизации раствора лактоферрина, в котором, согласно изобретению, в качестве молочного сырья используют сырое коровье молоко, хроматографию лактоферрина из сырого коровьего молока проводят в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером, в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют их на вторую хроматографию лактоферрина во вторую колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина со второй колонки проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером, в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании вновь собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют их на ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизацию. Недостатком этого способа является двухстадийная очистка, а также возможная контаминация ЛПС из-за его достаточно прочного связывания с лактоферрином. Известна также технология получения рекомбинантного лактоферрина человека из молока коз-продуцентов (патент RU 2554742). Способ включает ионообменную хроматографию на сильном катионообменнике, элюирование лактоферрина в градиенте натрия хлористого 0,3-1,0 М, обессоливание, лиофильное высушивание. Способ отличается тем, что в качестве молочного сырья используют молоко трансгенных коз, хроматографию проводят на сильном катионообменнике, несущем сульфопропильные группы, используют натрий-ацетатный буфер, применяют ступенчатую промывку сорбента 20 мМ натрий-ацетатным буфером рН 7,0, содержащим 0,3 М натрия хлористого и 10% этанола для удаления связанного с лактоферрином ЛПС.

Область изобретения.

Изобретение относится к качеству лактоферрина и направлено на доочистку коммерческих (промышленных) препаратов лактоферрина, содержащих 90% и менее лактоферрина в образце. При этом происходит удаление сторонних белков молока и удаление ЛПС, которые обладают сродством к лактоферрину и находятся в связанном с ними виде, ухудшая качество лактоферрина и влияя на его антибактериальную активность. К белкам-контаминантам, в частности, относится ангиогенин, молекулярная масса которого ок 15 кДа, а изоэлектрическая точка 9,5, что близко по свойствам к лактоферрину, содержание ангиогенина, по литературным данным, 1-8 мг/л молока. При получении лактоферрина в промышленных масштабах может происходить увеличение содержания ангиогенина в несколько раз, что отрицательным образом может сказываться на здоровье потребителя продукции. Кроме того, белками-контаминантами могут быть лактопероксидаза, которая имеет молекулярную массу ок 80 кДа, как и лактоферрин, а также иммуноглобулины молока.

Поэтому доочистка промышленных препаратов лактоферрина, которые предполагается использовать в качестве фармацевтической субстанции, является предпочтительным. Известно, что рост и развитие желудочно-кишечного тракта новорожденных животных, вскармливаемых материнским молоком, интенсивнее, чем у вскармливаемых молочными смесями. Значительная роль в росте и развитии новорожденного принадлежит лактоферрину, поэтому введение его в рацион питания новорожденных является предпочтительным. В Японии компания Morinaga Milk Industry Co. Ltd с 1986 г. производит детское питание, обогащенное коровьим лактоферрином. Защитные свойства ЛФ против микробных и вирусных инфекций продемонстрированы во многих научных работах и к настоящему времени известно о проведении несколько клинических испытаний терапевтических препаратов на основе этого белка. Тем не менее, наши современные знания позволяют определить ЛФ не только, как ключевой компонент первичной защитной системы организма, но и как многофункциональный регуляторный фактор, который взаимодействует и влияет на микробные, вирусные или клеточные компоненты, вовлеченные в процесс инфекции.

Известно, что лактоферрин коровьего молока проявляет бактериостатическую активность по отношению к бактериям. Наиболее чувствительны к его действию штаммы E.coli. Было показано, что лактоферрин вызывает изменение проницаемости наружной мембраны некоторых грам-отрицательных бактерий. Дестабилизация клеточной стенки бактерий может быть результатом неспецифического связывания с лактоферрином кальция и магния. Таким образом, лактоферрин способен выщеплять молекулы липополисахаридов (эндотоксинов) из наружной мембраны грам-отрицательных бактерий, связываясь с ними. Ингибирование лактоферрином бактериальной сорбции на небиологические и клеточные поверхности.

Микробиологическая адгезия и последующая колонизация и образование биопленки на небиологические поверхности, например, хирургический и медицинский инструмент, является серьезной проблемой приводящей к различным заболеваниям и воспалениям. Основной подход для решения этой проблемы заключается в создании новых композиционных материалов, которые обладают минимальной специфичностью к сорбированию микрофлоры. В связи с этим, очень привлекательной выглядит возможность использования ЛФ, как нового компонента, защищающего поверхность от микробиологической адгезии. В практическом аспекте покрытие ЛФ-ном глазных линз приводит к защите их поверхности от P. aeruginosa (Williams Т. J., Schneider R. R and Willcox M. D. (2003) The effect of protein-coated contact lenses on the adhesion and viability of gram negative bacteria. Curr. Eye Res. 27: 227-235).

Отмечен ряд ингибирующих влияний лактоферрина на различные звенья иммунных и воспалительных реакций. Ингибирующее действие лактоферрина находится в обратной зависимости от степени насыщенности его железом.

Отмечена положительная роль лактоферрина в профилактике остеопороза (Молекулярный механизм влияния лактферрина на костеобразование. Критический обзор. П.Е. Садчиков, И.Л. Гольдман, С.В. Разин, А.Д. Черноусов, Л.И. Алексеева, Е.Р. Садчикова. Журнал Остеопороз и остеопатии, 2016, №3 стр 12-64).

Имеется патент (2465004 RU)» Применение апо-формы лактоферрина человека в качестве антигипоксанта и стабилизатора гипоксия-индуцибельного фактора -1 альфа.» Кроме того, имеются данные о положительном влиянии лактоферрина в профилактике болезни Альцгеймера и Паркинсона.

Поэтому доочистка промышленных образцов лактоферрина для применения в качестве фармацевтической основы является актуальной.

Раскрытие изобретения

Сырьем для получения лактоферрина являются различные лактоферрин-содержащие препараты чистотой 90% и менее. К ним относятся коммерческие препараты лактоферрина, чистота которых сильно варьирует по содержанию белка, содержание ЛПС зачастую не контролируется.

К сорбентам-катионообменникам, которые могут быть использованы по данному изобретению, относятся сорбенты, содержащие карбоксиметильные или сульфопропильные группы. Основой этих сорбентов может служить целлюлоза, декстран, агароза, полиакрил и др.

Способ получения лактоферрина, заключающийся в том, что растворяют сухой лактоферрин-содержащий препарат чистотой 90% и менее, в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,5, содержащем 0,35М NaCl, далее проводят фильтрование от нерастворенной взвеси через фильтр 2,5 мкм, внесение на колонку с катионообменным сорбентом, промывку 10 мМ фосфатным буфером рН 7,5, содержащим 0,35 М NaCl и 0,01% твин-20, для удаления липополисахарида, связанного с лактоферрином, элюцию лактоферрина в градиенте NaCl 0,35-1,0 М, обессоливание путем диализа или диафильтрации или гель-фильтрации, микрофильтрацию через фильтр 0,22 мкм и лиофильное высушивание. Способ позволяет получить лактоферрин чистотой 99%, не содержащий ЛПС.

Способ получения лактоферрина, заключающийся в том, что растворяют сухой лактоферрин-содержащий препарат чистотой 90% и менее в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,5, содержащем 0,35М NaCl, далее проводят фильтрование от нерастворенной взвеси через фильтр 2,5 мкм, внесение на колонку с катионообменным сорбентом, промывку 10 мМ фосфатным буфером рН 7,5, содержащим 0,35 М NaCl и 0,01% твин-20, для удаления липополисахарида, связанного с лактоферрином, элюцию лактоферрина в градиенте NaCl 0,35-1,0 М, обессоливание путем диализа или диафильтрации или гель-фильтрации, микрофильтрацию через фильтр 0,22 мкм и лиофильное высушивание.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, в частности к применению комбинации ионообменных картриджей типа Chromafix HR-XC в Н+-форме и Chromafix 30-PS в НСО3-форме в устройстве для очистки и концентрирования элюата генератора 68Ge/68Ga для синтеза радиофармпрепаратов на основе галлия-68.

Изобретение относится к электрохимии твердых кислород - ионных электролитов. Способ согласно изобретению заключается в том, что исследуемый образец при комнатной температуре и давлении помещают в кварцевый реактор, через который осуществляют циркуляцию газа по газовому контуру, сообщающемуся с реактором с образованием общего газового пространства, газовый контур с реактором откачивают на высокий вакуум, открывают сообщение между масс-спектрометром и газовым контуром, посредством масс-спектрометра стабилизируют ионный ток массовых чисел 18, 28 или 32, задают температуру и давление, при которых необходимо провести измерения, исследуемый образец приводят в равновесие с газовой фазой, перекрывают сообщение реактора с газовым контуром, из газового контура откачивают кислород природного изотопного состава и напускают обогащенный изотопом кислород 18О, посредством масс-спектрометра записывают зависимости ионного тока для массовых чисел 32, 34, 36 от времени, устанавливают постоянный поток между газовым контуром и масс-спектрометром, после этого открывают реактор и начинают процесс исследований с помощью изотопного обмена.

Изобретение относится к способу ионообменного разделения метионина и глицина и может найти применение в биохимической, фармацевтической и пищевой промышленности.
Изобретение относится к новому способу одновременного определения суммарного содержания F-, Cl-, Br-, I-, S- и Р-органических соединений в воздухе, который может быть использован для эколого-аналитического контроля и для контроля в химической промышленности соответствующих соединений.

Изобретение относится к химии органических соединений, их идентификации и контролю качества, а именно к области органического элементного анализа. .
Изобретение относится к области контроля качества нефти и продуктов нефтепереработки, в частности высококачественных моторных топлив, смазочных масел каталитических процессов и индивидуальных углеводородов и других химических веществ высокой чистоты.
Изобретение относится к области химии и касается области экологии, а именно эколого-аналитического контроля. .

Изобретение относится к средствам неразрушающего контроля и может широко использоваться в таможенных службах в аэропортах, морских портах, железнодорожных вокзалах, службах безопасности коммерческих структур, при проведении инструментального контроля, досмотра, в подразделениях военизированой охраны и в других службах, принимающих активное участи в борьбе с терроризмом с применением взрывчатых веществ и взрывных устройств.

Изобретение относится к аналитической химии. .

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в металлургии, химической индустрии, экологии, медицине, пищевой промышленности. .

Изобретение относится к аналитической химии. Способ количественного определения летучих органических веществ в клатратных комплексах путем ГЖХ-анализа газовой фазы, выделившейся в результате взаимодействия взвешенной пробы клатратного комплекса с водным щелочным или кислотным раствором, в котором пробу клатратного комплекса предварительно смешивают с известным количеством другого клатратного комплекса, содержащим один или несколько внутренних стандартов, затем взвешенную объединенную пробу, помещенную в хроматографическую виалу, вакуумируют при 2-100 мм рт.ст.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения токсичных компонентов в имплантатах на основе полилактид-гликолида (PLGA) методом газовой хроматографии.

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к количественному определению содержания в моллюсках йессотоксинов, максимально допустимый уровень содержания йессотоксинов в моллюсках - не более 3,75 мг/кг.

Изобретение относится к биохимическим методам исследования микроорганизмов и может использоваться при проведении анализов в медицине, экологии, биотехнологии или ветеринарии.

Изобретение относится к области экологии и предназначено для выявления источников загрязнения нефтяными углеводородами вод открытых акваторий морей. Способ определения источников загрязнения углеводородами открытых акваторий морей в районах разработки нефтегазовых месторождений включает в себя отбор образцов нефти/нефтепродуктов из разлива, при этом на предварительном этапе формируют инвентаризационную базу всех видов нефтепродуктов, добываемых и используемых на данной акватории, проводят экстракцию проб гексаном, извлекая эмульгированные и растворенные нефтяные компоненты, отделяя нефтепродукты от полярных углеводородов и примесей не нефтяного происхождения в колонке, заполненной силикагелем, с помощью ГХ/ПИД и ГХ/МС получают хроматограммы проб, которые сравнивают качественно и количественно с хроматограммами нефтей из инвентаризационной базы, рассчитывают их соотношения, определяют индексы и биохимические маркеры, далее идентификация углеводородных источников продолжается количественным анализом величин индексов и биомаркеров, соотношений параметров хроматограмм, при этом учет выветривания нефти в морской среде осуществляется с помощью биомаркеров.

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для определения содержания N-метилпирролидона в воздухе. Способ определения массовой концентрации N-метилпирролидона в воздухе методом газовой хроматографии включает подготовку хроматографической колонки, градуировку хроматографа, подачу пробы в токе несущего газа в испаритель, в котором поддерживают повышенную температуру, в качестве несущего газа применяют азот, температуру в испарителе поддерживают 150°С.

Настоящее изобретение относится к способу определения содержания ментола в композиции традиционного китайского лекарственного средства. Способ определения содержания ментола в композиции традиционного китайского лекарственного средства, состоящей из: Fructus Forsythia, Flos Lonicerae, Radix Isatidis, Semen Armeniacae Amarum, ментол, Herba Houttuyniae, ревень, Herba Pogostemonis, Rhizoma Dryopteris Crassirhizomae, Rhodiola rosea L., Herba Ephedrae, Radix Glycyrrhizae и гипса включает: 1) экстракцию композиции традиционного китайского лекарственного средства с применением неполярного растворителя с получением исследуемого раствора; 2) получение раствора сравнения с применением ментол-содержащего соединения сравнения и неполярного растворителя, такого же как на стадии 1); 3) определение при помощи газовой хроматографии содержания ментола в исследуемом образце и растворе сравнения, при этом условия хроматографирования следующие: слабополярная капиллярная хроматографическая колонка; начальная температура колонки 80-100°С; указанную температуру поддерживают в течение 10-15 минут, затем увеличивают до 120-160°С со скоростью 6-10°С в минуту, поддерживают в течение 1,5-3,5 минут, затем увеличивают до 240-300°С со скоростью 100-160°С в минуту и поддерживают в течение 5-20 минут.

Изобретение относится к области здравоохранения, в частности к контролю качества биологических лекарственных препаратов, и может быть использовано для количественного определения глицина в биологических лекарственных препаратах, содержащих глицин в качестве вспомогательного вещества.

Изобретение относится к биотехнологии, аналитической химии и касается способа определения содержания β-казеина А1 и/или А2 групп в молоке, молочных продуктах, молочных составных продуктах, молокосодержащих продуктах.

Изобретение относится к области аналитической химии и представляет собой способ определения бацитрацина в мясе и мясных продуктах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий отбор пробы, экстракцию, центрифугирование, фильтрацию, введение растворенного остатка в хроматограф с использованием элюента, обработку результатов анализа, отличающийся тем, что в качестве пробы берут навеску тканей или органов животных массой 5 г, экстракцию проводят 5 мл 1,5 мМ водным раствором трилона Б и 5 мл 1% раствором трихлоруксусной кислоты в течение 15 минут, раствор перемешивают 20 минут, центрифугируют 15 минут, фильтруют, после фильтрации проводят очистку экстракта путем твердофазной экстракции (ТФЭ) на картридже Oasis HLB 3 см3×60 мг, который предварительно перед использованием конденсируют 3 мл метанола и 3 мл водного раствора трихлоруксусной кислоты рН=4,0, полученный экстракт пропускают со скоростью 1 мл/мин через картридж, затем сушат в вакууме под давлением 20 мм рт.ст.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения лактоферрина. Способ получения лактоферрина заключается в том, что сухой лактоферрин-содержащий препарат чистотой 90 и менее растворяют в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,5, содержащем 0,35М NaCl, далее проводят фильтрование от нерастворенной взвеси через фильтр 2,5 мкм, внесение на колонку с катионообменным сорбентом, промывку 10 мМ фосфатным буфером рН 7,5, содержащим 0,35 М NaCl и 0,01 твин-20, для удаления липополисахарида, связанного с лактоферрином, элюцию лактоферрина в градиенте NaCl 0,35-1,0 М, обессоливание путем диализа или диафильтрации или гель-фильтрации, микрофильтрацию через фильтр 0,22 мкм и лиофильное высушивание. Способ позволяет получить лактоферрин чистотой 99, не содержащий ЛПС.

Наверх