Модификации структуры направляющей нуклеазу spcas9 молекулы рнк для обеспечения импорта в митохондрии клеток человека

Авторы патента:


Модификации структуры направляющей нуклеазу spcas9 молекулы рнк для обеспечения импорта в митохондрии клеток человека
Модификации структуры направляющей нуклеазу spcas9 молекулы рнк для обеспечения импорта в митохондрии клеток человека
C12N2310/20 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)
C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2717977:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Заявлена импортируемая в митохондрии гидовая РНК с субдоменами транспортной РНК лизина HD и HF. Каждая из представленных направляющих РНК (gRNA-HF-HF, gRNA-HF-HD, gRNA-HD-HF и gRNA-HD-HD) взаимодействует с человеческой митохондриальной тРНК-лизил синтазой (pre-KARS2) и белком ENO2, которые импортируются в митохондрии совместно с направляющей РНК. В митохондриях направляющая РНК связывается с нуклеазой SpCas9, формируя функциональный комплекс, вносящий двухцепочечные разрывы в мтДНК, которые приводят к ее элиминации ферментами системы репликации митохондрий. Общий пул мтДНК в митохондриях восстанавливается за счет оставшихся мтДНК. Техническим результатом изобретения является обеспечение системы элиминации определенных гаплотипов мтДНК RGEN/SpCas9 и способа доставки ее РНК в части органеллы. 2 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, терапии наследственных заболеваний и молекулярной биологии и может, в комплексе с РНК-направляемой нуклеазой SpCas9, быть использовано для элиминирования определенных гаплотипов митохондриальной ДНК (мтДНК).

Известно изобретение «Система доставки нуклеиновых кислот в митохондрии» (Mitochondrial nucleic acid delivery systems) (патент Канады № CA 2678572 2008 г. A61K 48/00 D2, C12N 15/864 A, C12N 15/90 B4). В основе данной технологии лежит использование вирусных конструкций, что накладывает ряд ограничений на работу с клетками человека, в частности с яйцеклетками. Кроме того, заявленные конструкции выполнены на основе аденоассоциированного вируса, геном которого представлен молекулой ДНК.

Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам не известны модификации направляющих нуклеазу SpCas9 молекул РНК, способных функционально взаимодействовать с нуклеазой и при этом эффективно импортироваться в митохондрии клеток человека. Представленные в данной заявке модификации структуры направляющей РНК не влияют на взаимодействие с нуклеазой SpCas9 и обеспечивают их импорт внутрь митохондрий клеток человека.

Отличительным признаком изобретения является модификация структуры направляющей нуклеазу SpCas9 молекулы РНК, обеспечивающая импорт РНК в митохондрии, где объединяясь с нуклеазой SpCas9, формируется функциональный комплекс белок-РНК для элиминации определенных гаплотипов митохондриальной ДНК. Новизну представляют нуклеотидные последовательности направляющих нуклеазу SpCas9 молекул РНК.

Задачей заявляемого изобретения является элиминирование определенных гаплотипов митохондриальной ДНК. Это может быть использовано как для сдвига уровня гетероплазмии патогенных мутаций мтДНК (патогенный гаплотип), так и для элиминации «старых» мтДНК, захваченных в ходе процедуры донации митохондрий.

Поставленная задача решается тем, что модификации направляющей нуклеазу SpCas9 молекулы РНК, после попадания последней в цитоплазму клеток, обеспечивают ее импорт в митохондрии клеток человека. Для этого в структуру направляющей РНК, вместо двух последовательностей GAAA были интегрированы детерминанты импорта РНК, представляющие собой субдомены транспортной РНК лизина (HF и HD). В результате были разработаны четыре варианта модификаций структуры направляющей РНК, названные нами gRNA-HF-HF, gRNA-HF-HD, gRNA-HD-HF и gRNA-HD-HD.

Техническим результатом изобретения является обеспечение системы элиминации определенных гаплотипов мтДНК RGEN/SpCas9 и способа доставки ее РНК-части в органеллы.

Принцип функционирования предлагаемых веществ базируется на особенностях работы системы RGEN/SpCas9. Нуклеаза SpCas9 (патент на изобретение РФ №2634395) взаимодействует с представленными в данной заявке направляющими молекулами РНК образуя функциональный комплекс, который специфически взаимодействует с участком двухцепочечной ДНК комплементарным участку направляющей РНК. В результате такого взаимодействия функциональные домены SpCas9 вносят разрывы в обе цепи ДНК. Двухцепочечные разрывы в мтДНК, полученные таким образом, приводят к ее элиминации ферментами системы репликации митохондрий. Общий пул мтДНК в митохондриях восстанавливается за счет мтДНК, не подверженных элиминации.

Каждая из представленных направляющих РНК (gRNA-HF-HF, gRNA-HF-HD, gRNA-HD-HF и gRNA-HD-HD), в силу своих структурных особенностей, взаимодействует с митохондриальной тРНК-лизил синтазой (pre-KARS2) и белком ENO2, которые импортируются в митохондрии совместно с направляющей РНК (ко-импорт). В митохондриях направляющая РНК связывается с нуклеазой SpCas9 для элиминации определенных гаплотипов мтДНК.

На фиг. 1 представлены нуклеотидные последовательности разработанных модификаций. Первая модификация (gRNA-HF-HF) включает детерминанты импорта HF в положениях 13-19 и 66-82 нуклеотидной последовательности направляющей РНК. Вторая модификация (gRNA-HF-HD) включает детерминанту импорта HF в положении 13-19 и HD в положении 66-82 нуклеотидной последовательности направляющей РНК. Третья модификация (gRNA-HD-HF) включает детерминанту импорта HD в положении 13-19 и HF в положении 66-82 нуклеотидной последовательности направляющей РНК. Четвертая модификация (gRNA-HD-HD) включает детерминанты импорта HD в положениях 13-19 и 66-82 нуклеотидной последовательности направляющей РНК.

На фиг. 2 представлена функциональная активность модифицированных направляющих РНК. Для этого были синтезированы четыре двух-цепочечные ДНК, кодирующие модифицированные направляющие РНК и не модифицированная направляющая РНК в качестве положительного контроля. Направляющие РНК были фланкированы Т7 промотором и последовательностью для узнавания определенного сайта ДНК с одной стороны, и Т7 терминатором - с другой, для проведения in vitro транскрипции, используя Т7-полимеразу и рибо-нуклеотиды. Используя полученные модифицированные молекулы РНК (gRNA-HF-HF, gRNA-HF-HD, gRNA-HD-HF и gRNA-HD-HD), не модифицированную контрольную направляющую РНК и коммерчески доступный белок SpCas9 была поставлена реакций in vitro разрезания матрицы ДНК. Было показано, что модификации структуры направляющей РНК не влияют на ее функциональную активность. На фиг. 2 слева направо: gRNA-HF-HF, gRNA-HF-HD, gRNA-HD-HD, gRNA-HD-HF, gRNA и ДНК маркер.

Для детекции модифицированной направляющей РНК в митохондриях проводили трансфекцию клеток линии Phoenix, полученной в ходе реакции in vitro транскрипции РНК. Для этого клетки выращивали в 6 луночном планшете. Первую лунку трансфецировали липофильным агентом Lipofectamine 3000 молекулами РНК gRNA-HF-HF, вторую - gRNA-HF-HD, третью - gRNA-HD-HF, четвертую - gRNA-HD-HD, пятую -немодифицированой gRNA, шестую - Lipofectamine 3000 без РНК (Мосk-трансфекция). Через 48 часов после трансфекции выделяли митохондрии, используя коммерческий набор Qproteome Mitochondria Isolation Kit (QIAGEN), согласно протоколу производителя. Из митохондрий выделяли РНК, используя стандартный фенол-хлороформный метод. Полученную РНК использовали для постановки реакции капельной цифровой полимеразной цепной реакции, совмещенной с обратной транскрипцией, используя коммерческий набор One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes (Life Science), согласно протоколу производителя. Для детекции направляющих РНК использовали следующие праймеры и пробы: For GACTCGGTGCCACTTCTC; Rev TTATGGCGTCAGCGAGTTT; Probe FAM-CCCGAAAGTTGATAACGGACTAGCCT-BHQ1. Выявили, что модифицированная детерминантами импорта РНК (gRNA-HF-HF, gRNA-HF-HD, gRNA-HD-HF и gRNA-HD-HD) детектируется в количестве 650-700 копий на реакцию, тогда как не модифицированная РНК и Мосk-трансфекция не показывают наличие РНК в митохондриях клеток.

Импортируемая в митохондрии гидовая РНК с субдоменами транспортной РНК лизина HD и HF, где добавление в структуру гидовой РНК субдоменов транспортной РНК лизина HF и HD, как показано на фиг. 1, обеспечивает ее импорт в митохондрии клеток человека и не влияет на формирование функционально активного комплекса с нуклеазой SpCas9.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена новая клеточная линия рака молочной железы человека BrCCh4e, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к экспрессионному вектору для рекомбинантной экспрессии интересующего полипептида, содержащему экспрессионную кассету, включающую полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор в качестве селективного маркера, при этом мутантный фолатный рецептор имеет сниженную аффинность связывания фолата по сравнению с фолатным рецептором дикого типа.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к экспрессионным кластерам, содержащим коровый элемент сайта гиперчувствительности к ДНКазе I 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина или сайт гиперчувствительности 40 (HS40) кластера человеческого гена α-глобина и часть промотора человеческого гена Aγ-глобина.

Группа изобретений относится к биотехнологии и касается получения генетической конструкции, обеспечивающей синтез в клетках Escherichia coli рекомбинантного полипептида G4223 (рG4223).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и может быть использовано для получения вакцин против вируса ящура (FMDV). Получена композиция, содержащая антиген FMDV - слитый белок FMDV-дигидролипоил-ацетилтрансферазы (E2).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к редактированию генов, и может быть использовано в медицине. Способ лечения дистрофического буллезного эпидермолиза включает доставку в кератиноциты пациента путем введения в эпидермис синтетической РНК, кодирующей редактирующий ген белок, который нацелен на ген COL7 и вызывает двухцепочечный разрыв в гене COL7, и доставку матрицы для репарации COL7 пациенту, для редактирования гена COL7.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения генетически сконструированных Т-клеток для иммунотерапии, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к культуральной среде для увеличения в количестве популяции взрослых стволовых клеток, где указанная культуральная среда содержит базальную среду, к которой добавлены агонист Wnt, ингибитор BMP и один или несколько ингибиторов TGF-бета, которые представляют собой ингибитор ALK5, ALK4 и/или ALK7, а также к ее применению для увеличения в количестве стволовой клетки, популяции стволовых клеток или фрагмента ткани или органоида, содержащих стволовую клетку или популяцию стволовых клеток.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложены способы получения популяции Т-клеток, специфичных в отношении папилломавируса человека (HPV), включающие разделение образца HPV-позитивной опухоли головы и шеи на многочисленные фрагменты; культивирование многочисленных фрагментов по отдельности; получение Т-клеток из культивируемых многочисленных фрагментов; тестирование по отдельности Т-клеток из многочисленных фрагментов на специфичное распознавание HPV; отбор Т-клеток, которые демонстрируют специфичное распознавание HPV, и увеличение числа отобранных Т-клеток для получения популяции HPV-специфичных Т-клеток.

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к области стабилизации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) человека и микроорганизмов, присутствующей в сложных биологических образцах, таких как фекалии.

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны антисмысловые олигонуклеотиды, состоящие из 10-28 нуклеотидов, и, по меньшей мере, два из 10-28 нуклеотидов представляют LNA, и антисмысловой олигонуклеотид комплементарен участку гена, кодирующего TGF-RII, или участку мРНК, кодирующей TGF-RII.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к нуклеотидной последовательности, содержащей оптимизированный для экспрессии в E. coli ген консенсусного гликопротеина вируса бешенства с SEQ ID NO: 1.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области молекулярного конструирования частиц наноразмерного диапазона, а также к способам получения регулярного распределения таких частиц, и может быть использована в наноэлектронике для создания ячеек памяти высокой плотности.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен векторный геном на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для ингибирования или подавления экспрессии гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) в клетке млекопитающего, а также соответствующая частица, способ ингибирования экспрессии гена, фармацевтическая композиция, способ лечения бокового амиотрофического склероза и дуплекс siРНК.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложена композиция, содержащая один или несколько вирусных векторов, кодирующих систему CRISPR/Cas, для применения в лечении заболевания или расстройства мозга.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и касается плазмиды для трансфекции в клетки человека для выявления их эпителиального состояния в отношении процесса эпителиально-мезенхимальной трансформации, включающей участок с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:l промотера гена-маркера эпителиального состояния, в качестве которого используют эпителиальный кадгерин человека и по меньшей мере одну последовательность флуоресцентного белка TurboGFP, при этом участок нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка находится под контролем промотера гена-маркера эпителиального состояния.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой плазмиду для трансфекции в клетки человека для выявления их мезенхимального состояния в отношении процесса эпителиально-мезенхимальной трансформации, включающую участок с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 промотера гена-маркера мезенхимального состояния, в качестве которого используют нейрональный кадгерин человека, и по меньшей мере одну последовательность флуоресцентного белка TurboGFP, при этом участок нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка находится под контролем промотера гена-маркера мезенхимального состояния.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционной патологии и иммунологии, и может быть использовано при прогнозировании исхода беременности при урогенитальной инфекции.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционной патологии и иммунологии, и может быть использовано при прогнозировании исхода беременности при урогенитальной инфекции.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложена композиция, содержащая один или несколько вирусных векторов, кодирующих систему CRISPR/Cas, для применения в лечении заболевания или расстройства мозга.

Изобретение относится к биотехнологии. Заявлена импортируемая в митохондрии гидовая РНК с субдоменами транспортной РНК лизина HD и HF. Каждая из представленных направляющих РНК взаимодействует с человеческой митохондриальной тРНК-лизил синтазой и белком ENO2, которые импортируются в митохондрии совместно с направляющей РНК. В митохондриях направляющая РНК связывается с нуклеазой SpCas9, формируя функциональный комплекс, вносящий двухцепочечные разрывы в мтДНК, которые приводят к ее элиминации ферментами системы репликации митохондрий. Общий пул мтДНК в митохондриях восстанавливается за счет оставшихся мтДНК. Техническим результатом изобретения является обеспечение системы элиминации определенных гаплотипов мтДНК RGENSpCas9 и способа доставки ее РНК в части органеллы. 2 ил., 1 пр.

Наверх