Клетка

Авторы патента:

КОНГ Кхай (GB)

КОРДОБА Шон (GB)

ПЮЛЕ Мартен (GB)

C12Y301/03048 - Биохимия; пиво; алкогольные напитки; вино; уксус; микробиология; энзимология; получение мутаций; генная инженерия

C12N5/10 - клетки, модифицированные введением чужеродного генетического материала, например клетки, трансформированные вирусом

C12N5/0783 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

C07K19/00 - Гибридные пептиды

C07K14/7051 - Пептиды, содержащие более 20 аминокислот; гастрины; соматостатины; меланотропины; их производные

A61K39/0011 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

A61K35/17 - Лекарственные препараты, содержащие вещества или продукты реакции неизвестного строения

A61K2039/5158 - Лекарства и медикаменты для терапевтических, стоматологических или гигиенических целей (изготовление специальных лекарственных форм A61J; химические аспекты или использование материалов для дезодорации воздуха, для дезинфекции или стерилизации или для бандажей, перевязочных средств, впитывающих прокладок или хирургических приспособлений A61L; соединения как таковые C01, C07,C08,C12N; мыла C11D; микроорганизмы как таковые C12N)

Владельцы патента RU 2717984:

ЮСиЭл БИЗНЕС ЛТД (GB)

Настоящая группа изобретений относится к иммунологии и клеточной биологии. Предложены цитотоксическая Т-клетка и клетка естественного киллера (NK-клетка), содержащие по два химерных антигенных рецептора (CAR), один из которых содержит эндодомен CD3ξ, активирующий клетку в присутствии первого антигена, а второй - домен тирозиновой фосфатазы CD148 или CD45, ингибирующий клетку в отсутствии второго антигена. Такая система CAR позволяет клетке функционировать по принципу логического оператора "И", т.е. клетка активируется только в присутствии и первого, и второго антигенов. Дополнительно представлены: нуклеиновая кислота и наборы нуклеиновых кислот, кодирующих упомянутые CAR; вектор и способ получения цитотоксической T-клетки; а также фармацевтическая композиция и способ лечения и/или предотвращения заболевания путем уничтожения опухолевых клеток-мишеней, экспрессирующих первый антиген и второй антиген; применение фармацевтической композиции и T-клетки при изготовлении лекарственного средства и для лечения и/или предотвращения заболевания. 13 н. и 14 з.п. ф-лы, 31 ил., 6 табл., 14 пр.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к клетке, которая содержит больше чем один химерных антигенный рецептор (CAR). Клетка может быть способна специфично распознавать клетку-мишень благодаря отличительному паттерну экспрессии (или неэкспрессии) двух или более антигенов клеткой-мишенью.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описано множество иммунотерапевтических средств для использования в лечении злокачественных опухолей, в том числе терапевтические моноклональные антитела (mAb), иммуноконъюгированные mAb, радиоконъюгированные mAb и биспецифичные средства, вовлекающие T-клетки (Bi-specific T-cell Engager^®).

Типично эти иммунотерапевтические средства направлены на один антиген: например, ритуксимаб направлен на CD20; миелотарг направлен на CD33; и алемтузумаб направлен на CD52.

Однако, относительно редко присутствия (или отсутствия) одного антигена достаточно для того, чтобы описать злокачественную опухоль, что может вести к недостатку специфичности.

Большинство злокачественных опухолей нельзя дифференцировать от нормальных тканей на основании одного антигена. Таким образом, при терапии возникает существенная токсичность «в мишени вне опухоли», посредством которой происходит повреждение нормальных тканей. Например, в то время, как направленно воздействуют на CD20 для того, чтобы лечить B-клеточные лимфомы ритуксимабом, происходит истощение компартмента нормальных B-клеток, в то время, как направленно воздействуют на CD52 для того, чтобы лечить хронический лимфоцитарный лейкоз, происходит истощение всего лимфоидного компартмента, в то время, как направленно воздействуют на CD33 для того, чтобы лечить острый миелолейкоз, происходит повреждение всего миелоидного компартмента, и т.д.

Предсказанная проблема токсичности «в мишени вне опухоли» обнаружена в клинических исследованиях. Например, подход, в котором направленно воздействуют на ERBB2, вызвал смерть у пациента со злокачественной опухолью ободочной кишки, метастазировавшей в легкие и печень. У некоторых пациентов со злокачественной опухолью ободочной кишки повышена экспрессия ERBB2, но также он экспрессирован в некоторых нормальных тканях, включая сердце и нормальное сосудистое русло.

Для некоторых злокачественных опухолей направленное воздействие на присутствие двух антигенов злокачественной опухоли может быть более избирательным и, следовательно, эффективным, чем направленное воздействие на один. Например, хронический B-лимфоцитарный лейкоз (B-CLL) представляет собой обыкновенный лейкоз, который в настоящее время лечат посредством направленного воздействия на CD19. Это лечит лимфому, но также истощает весь компартмент B-клеток, так что лечение имеет существенный токсический эффект. B-CLL имеет необычный фенотип в том отношении, что совместно экспрессируются CD5 и CD19. Посредством направленного воздействия только на клетки, которые экспрессируют CD5 и CD19, будет возможно значительно снижать токсичность в мишени вне опухоли.

Таким образом, существует потребность в иммунотерапевтических средствах, которые способны к дополнительному направленному воздействию, чтобы отражать комплексный паттерн экспрессии маркеров, который связан со многими злокачественными опухолями.

Химерные антигенные рецепторы (CAR)

Химерные антигенные рецепторы представляют собой белки, которые прививают специфичность моноклонального антитела (mAb) эффекторной функции T-клетки. Их обычная форма относится к белку с трансмембранным доменом I типа с антигенраспознающим амино-концом, спейсером, трансмембранным доменом, все соединены в составной эндодомен, который передает сигналы выживаемости и активации T-клеток (см. фиг. 1A).

Наиболее распространенной формой этих молекул являются слитные конструкции из одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), полученных из моноклональных антител, распознающих антиген-мишень, которые слиты через спейсер и трансмембранный домен с сигнальным эндодоменом. Такие молекулы вызывают активацию T-клетки в ответ на распознавание с помощью scFv его мишени. Когда T-клетки экспрессируют такой CAR, они распознают и уничтожают клетки-мишени, которые экспрессируют антиген-мишень. Разработано несколько CAR против опухоль-ассоциированных антигенов, и в настоящее время клинические исследования проходят подходы адоптивного переноса с использованием таких CAR-экспрессирующих T-клеток для лечения различных злокачественных опухолей.

Однако использование CAR-экспрессирующих T-клеток также связано с токсичностью в мишени вне опухоли. Например, основанный на CAR подход, направленно воздействующий на карбоксиангидразу-IX (CAIX) для того, чтобы лечить почечноклеточную карциному, приводил к печеночной токсичности, которая предположительно обусловлена специфичной атакой на эпителиальные клетки желчного протока (Lamers et al (2013) Mol. Ther. 21:904-912.

Подходы двойного направленного воздействия с использованием CAR

Для того чтобы решить проблему токсичности «в мишени вне опухоли», разработаны CAR T-клетки с двойной антигенной специфичностью. В подходе «двойного направленного воздействия», два комплементарных CAR совместно экспрессируют в одной и той же популяции T-клеток, каждый направлен на отделенную опухолевую миешнь и сконструирован для того, чтобы предоставлять комплементарные сигналы.

Wlikie et al (2012 J Clin Immunol 32:1059-1070) описывают подход двойного направленного воздействия, в котором совместно экспрессируют ErbB2- и MUC1-специфичные CAR. ErbB2-специфичный CAR предоставлял только CD3ξ сигнал и MUC1-специфичный CAR предоставлял только CD28 костимуляторный сигнал. Обнаружено, что комплементарная передача сигналов возникала в присутствии обоих антигенов, что приводило к продукции IL-2. Однако продукция IL-2 была умеренной по сравнению с контрольными T-клетками со сконструированными CAR, в которых передачу сигналов обеспечивает слитный CD28+CD3ξ эндодомен.

Схожий подход описан у Kloss et al (2013 Nature Biotechnol. 31:71-75), в котором использовали CD-19-специфичный CAR, который предоставляет CD3ξ-опосредованный активационный сигнал в комбинации с химерным костимуляторным рецептором, специфичным к PSMA. С использованием этой конструкции «совместных CAR» CAR T-клетка получает активационный, сигнал когда она встречает клетку-мишень с одним антигеном, и костимуляторный сигнал, когда она встречает клетку-мишень с другим антигеном, и получает и активирующий и костимуляторный сигналы только когда встречает клетки-мишени, несущие оба антигена.

Это является ранней попыткой ограничения CAR активности только клеткой-мишенью, несущей два антигена. Однако этот подход ограничен: несмотря на то, что активность CAR T-клетки будет наибольшей в отношении мишеней, экспрессирующих оба антигена, CAR T-клетка все же будет уничтожать мишени, экспрессирующие только антиген, распознаваемый с помощью активирующего CAR; кроме того, костимуляция ведет к пролонгированным эффектам, оказываемым на T-клетки, которые длятся после ухода клетки-мишени. Таким образом, активность против положительных по одному антигену T-клеток, равная активности против двойных положительных, может быть возможна, например, в ситуации, когда одинарные положительные ткани находятся смежно с двойной положительной опухолью или на миграционном пути от нее.

Таким образом, существует потребность в усоверешенствованных терапевтических подходах на основе CAR со сниженной токсичностью в мишени вне опухоли, где активация T-клеток полностью ограничена клетками-мишенями, которые экспрессируют оба антигена.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1: (a) обобщенная архитектура CAR: связывающий домен распознает антиген; спейсер поднимает связывающий домен с клеточной поверхности; трансмембранный домен заякоривает белок в мембране и эндодомен передает сигналы. С (b) до (d): различные поколения и перестановки эндодоменов CAR: (b) начальные конструкции передавали ITAM сигналы только через эндодомен FcεR1-γ или CD3ξ, тогда как более поздние конструкции передавали дополнительный (c) один или (d) два костимуляторных сигнала в цис.

Фиг. 2: схематическое изображение, которое иллюстрирует изобретение

Изобретение относится к конструированию T-клеток, чтобы реагировать на логические правила антигенной экспрессии клетки-мишени. Это лучше всего проиллюстрировано с помощью воображаемой диаграммы рассеяния при FACS. Популяции клеток-мишеней экспрессируют оба, любой один или ни одного из антигенов «A» и «B». Различные популяции-мишени (помечены красным) подвержены уничтожению T-клетками, трансдуцированными парой CAR, соединенных с помощью различных логических элементов. При использовании рецепторов с логическим элементом ИЛИ будут уничтожены как одинарные положительные, так и двойные положительные клетки. При использовании рецепторов с логическим элементом И погибают только двойные положительные клетки-мишени. При использовании логического элемента И НЕ двойные положительные мишени сохранены, тогда как одинарные положительные мишени

Фиг. 3: создание популяций клеток-мишеней

Клетки SupT1 использовали в качестве клеток-мишеней. Эти клетки трансдуцировали для того, чтобы экспрессировать любое из CD19 и CD33 или оба CD19 и CD33. Клетки-мишени окрашивали подходящими антителами и анализировали с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 4: конструкция кассеты для логического элемента ИЛИ

Одна открытая рамка считывания обеспечивает оба CAR с последовательностью FMD-2A с сохранением рамки, что ведет к двум белкам. Сигнал1 представляет собой сигнальный пептид, полученный из IgG1 (но может представлять собой любой эффективный сигнальный пептид). scFv1 представляет собой одноцепочечный вариабельный сегмент, который распознает CD19 (но может представлять собой scFv или пептидную петлю или лиганд или фактически любой домен, который распознает любую желаемую произвольную мишень). STK представляет собой «стебель» CD8, но может представлять собой любой подходящий внеклеточный домен. CD28tm представляет собой трансмембранный домен CD28, но может представлять собой любой стабильный трансмембранный домен белка I типа и CD3Z представляет собой дзета-эндодомен CD3, но может представлять собой любой эндодомен, который содержит ITAM. Сигнал2 представляет собой сигнальный пептид, полученный из CD8, но может представлять собой любой эффективный сигнальный пептид, который отличается по последовательности ДНК от сигнала1. scFv распознает CD33, но как и для scFv1, является произвольным. HC2CH3 представляет собой шарнир-CH2-CH3 из IgG1 человека, но может представлять собой любой внеклеточный домен, который не образует перекрестную пару со спейсером, используемым в первом CAR. CD28tm' и CD3Z' кодируют ту же белковую последовательность, что и CD28tm и CD3Z, но в них внесена неоднозначность кодонов для того, чтобы предотвращать гомологичную рекомбинацию.

Фиг. 5: схематическое представление химерных антигенных рецепторов (CAR) для логического элемента ИЛИ

Конструировали стимулирующие CAR, содержащие любой из N-концевой A) scFV-домен против CD19, за которым следует внеклеточная шарнирная область CD8 человека или B) scFV-домен против CD33, за которым следует область внеклеточного шарнира, CH2 и CH3 (содержащая мутацию pvaa для того, чтобы снижать связывание FcR) из IgG1 человека. Оба рецептора содержат трансмембранный домен CD28 человека и внутриклеточный дзета-домен CD3 человека (CD247). «S» обозначает присутствие дисульфидных связей.

Фиг. 6: экспрессионные данные, показывающие коэкспрессию обоих CAR на поверхности одной T-клетки.

Фиг. 7: функциональный анализ логического элемента ИЛИ

Эффекторные клетки (5×10⁴ клеток), экспрессирующие конструкцию логического элемента ИЛИ, совместно инкубировали с различным числом клеток-мишеней и анализировали IL-2 после 16 часов с помощью ELISA. На графике представлен усредненная максимальная секреция IL-2 от химической стимуляции (PMA и иономицин) только эффекторных клеток и усредненный фоновый IL-2 от эффекторных клеток без какого-либо стимула из трех повторений.

Фиг. 8: схематическое представление, показывающее обе версии кассеты, используемой для экспрессии обоих логических элементов И

Активирующие и ингибирующие CAR совместно экспрессировали еще раз с использованием последовательности FMD-2A. Сигнал1 представляет собой сигнальный пептид, полученный из IgG1 (но может представлять собой любой эффективный сигнальный пептид). scFv1 представляет собой одноцепочечный вариабельный сегмент, который распознает CD19 (но может представлять собой scFv или пептидную петлю или лиганд или фактически любой домен, который распознает какую-либо желаемую произвольную мишень). STK представляет собой «стебель» CD8, но может представлять собой любой некрупный внеклеточный домен. CD28tm представляет собой трансмембранный домен CD28, но может представлять собой любой стабильный трансмембранный домен белка I типа и CD3Z представляет собой дзета-эндодомен CD3, но может представлять собой любой эндодомен, который содержит ITAM. Сигнал2 представляет собой сигнальный пептид, полученный из CD8, но может представлять собой любой эффективный сигнальный пептид, который отличается последовательностью ДНК от сигнала1. scFv распознает CD33, но как и для scFv1, является произвольным. HC2CH3 представляет собой шарнир-CH2-CH3 из IgG1 человека, но может представлять собой любой крупный внеклеточный домен. CD45 и CD148 представляют собой трансмембраные и эндодомены CD45 и CD148, соответственно, но могут быть получены из любого белка этого класса.

Фиг. 9: схематическое представление структуры белков химерных антигенных рецепторов (CAR) для логических элементов И

Стимулирующий CAR состоит из N-концевого scFV-домена против CD19, за которым следует область внеклеточного «стебля» из CD8 человека, трансмембранный домен CD28 человека и внутриклеточного дзета-домена CD3 человека (CD247). Тестировали два ингибирующих CAR. Они состоят из N-концевого scFV-домена против CD33, за которым следует область внеклеточного шарнира, CH2 и CH3 (содержащая мутацию pvaa для того, чтобы снижать связывание FcR) из IgG1 человека, за которой следует трансмембраный и внутриклеточный домен любого из CD148 или CD45 человека. «S» обозначает присутствие дисульфидных связей.

Фиг. 10: коэкспрессия активирующих и ингибирующих CAR

В качестве эффекторных клеток использовали клетки BW5147, которые трансдуцировали для того, чтобы экспрессировать как активирующий CAR против CD19, так и один из ингибирующих CAR против CD33. Эффекторные клетки окрашивали с использованием Fc мыши к CD19 и Fc кролика к CD33 и подходящих вторичных антител и анализировали с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 11: функциональный анализ логических элементов И

Эффекторные клетки (5×10⁴ клеток), экспрессирующие активирующий CAR против CD19 и ингибирующий CAR против CD33 с внутриклеточным доменом A) CD148 или B) CXD45, совместно инкубировали с различным числом клеток-мишеней и анализировали IL-2 после 16 часов с помощью ELISA. На графике представлена максимальная секреция IL-2 от химической стимуляции (PMA и иономицин) только эффекторных клеток и фоновый IL-2 от эффекторных клеток без какого-либо стимула из трех повторений.

Фиг. 12: схематическое представление трех версий кассеты, используемой для того, чтобы генерировать логический элемент И НЕ

Активирующие и ингибирующие CAR совместно экспрессировали еще раз с использованием последовательности FMD-2A. Сигнал1 представляет собой сигнальный пептид, полученный из IgG1 (но может представлять собой любой эффективный сигнальный пептид). scFv1 представляет собой одноцепочечный вариабельный сегмент, который распознает CD19 (но может представлять собой scFv или пептидную петлю или лиганд или фактически любой домен, который распознает любую желаемую произвольную мишень). STK представляет собой «стебель» CD8 человека, но может представлять собой любой некрупный внеклеточный домен. CD28tm представляет собой трансмембранный домен CD28, но может представлять собой любой стабильный трансмембранный домен белка I типа, и CD3Z представляет собой дзета-эндодомен CD3, но может представлять собой любой эндодомен, который содержит ITAM. Сигнал2 представляет собой сигнальный пептид, полученный из CD8, но может представлять собой любой эффективный сигнальный пептид, который отличается последовательностью ДНК от сигнала1. scFv распознает CD33, но как и для scFv1, является произвольным. muSTK представляет собой «стебель» CD8 мыши, но может представлять собой любой спейсер, который совместно локализован, но не образует перекрестные пары с таковым из активирующего CAR. dPTPN6 представляет собой фосфатазный домен из PTPN6. LAIR1 представляет собой трансмембраный и эндодомен из LAIR1. 2Aw представляет собой версию последовательности FMD-2A с неоднозначностью кодонов. SH2-CD148 представляет собой домен SH2 из PTPN6, слитый с фосфатазным доменом из CD148.

Фиг. 13: схематическое представление химерных антигенных рецепторов (CAR) для логических элементов НЕ И

A) стимулирующий CAR, состоящий из N-концевого scFV-домена против CD19, за которым следует область «стебля» из CD8 человека, трансмембранный домен CD28 человека и внутриклеточный домен CD247 человека. B) ингибирующий CAR, состоящий из N-концевого scFV-домена против CD33, за которым следует область «стебля» из CD8 мыши, трансмембранная область из CD8 мыши и фосфатазный домен из PTPN6. C) ингибирующий CAR, состоящий из N-концевого scFV-домена против CD33, за которым следует область «стебля» из CD8 мыши и трансмембраный и внутриклеточный сегменты из LAIR1. D) ингибирующий CAR, идентичный предыдущему CAR, за исключением того, что его коэкспрессируют со слитным белком из домена SH2 PTPN6 и фосфатазного домена CD148.

Фиг. 14: функциональный анализ логического элемента НЕ И

Эффекторные клетки (5×10⁴ клеток), экспрессирующие A) полноразмерный SHP-1 или B) усеченную форму SHP-1, совместно инкубировали с различным числом клеток-мишеней и анализировали IL-2 после 16 часов с помощью ELISA. На графике представлена усредненная максимальная секреция IL-2 от химической стимуляции (PMA и иономицин) только эффекторных клеток и усредненный фоновый IL-2 от эффекторных клеток без какого-либо стимула из трех повторений.

Фиг. 15: аминокислотная последовательность логического элемента ИЛИ

Фиг. 16: аминокислотная последовательность логического элемента И на основе CD148 и CD145

Фиг. 17: аминокислотная последовательность двух логических элементов И НЕ

Фиг. 18: разбор функции логического элемента И

A. Прототип логического элемента И проиллюстрирован справа и его функция в ответ на одинарные CD19, CD33 и двойные CD19, CD33 положительные мишени представлена слева. B. ScFv меняют местами так, что активирующий эндодомен запускают с помощью CD33, а ингибирующий эндодомен активируют с помощью CD19. Этот логический элемент И остается функциональным, несмотря на то, что эти scFv меняют местами. C. «Стебель» CD8 мыши заменял Fc в спейсере ингибирующего CAR. При этой модификации логический элемент не способен реагировать на любую из одинарной CD19 положительной или двойной CD19, CD33 положительной мишеней.

Фиг. 19: экспрессия антигенов-мишеней на искусственных клетках-мишенях

A. Представлены диаграммы рассеяния при проточной цитометрии CD19 в сравнении с CD33 из исходного набора искусственных клеток-мишеней, полученных из клеток SupT1. Слева направо: двойные негативные клетки SupT1, клетки SupT1, положительные по CD19, положительные по CD33 и положительные по CD19 и CD33. B. Представлены диаграммы рассеяния при проточной цитометрии CD19 в сравнении с GD2 из искусственных клеток-мишеней, созданных для того, чтобы тестировать логический элемент CD19 И GD2. Слева направо: негативные клетки SupT1, клетки SupT1, экспрессирующие CD19, клетки SupT1, трансдуцированные векторами синтазы GD2 и GM3, которые становаятся GD2 положительными, и клетки SupT1, трансдуцированные с использованием CD19, а также синтазы GD2 и GM3, которые положительны по обоим GD2 и CD19. C. Представлены диаграммы рассеяния при проточной цитометрии для CD19 в сравнении с EGFRvIII из искусственных мишеней, созданных для того, чтобы тестировать логический элемент CD19 И EGFRvIII. Слева направо: негативные клетки SupT1, клетки SupT1, экспрессирующие CD19, клетки SupT1, трансдуцированные с использованием EGFRvIII, и клетки SupT1, трансдуцированные с использованием как CD19, так и EGFRvIII. D. Представлены диаграммы рассеяния при проточной цитометрии для CD19 в сравнении с CD5 из искусственных мишеней, созданных для того, чтобы тестировать логический элемент CD19 И CD5. Слева направо: негативные 293T клетки, 293T клетки, трансдуцированные с использованием CD19, 293T клетки, трансдуцированные с использованием CD5, 293T клетки, трансдуцированные с использованием обоих векторов CD5 и CD19.

Фиг. 20: Генерализуемость логического элемента И

A. Схематическое изображение логического элемента И, модифицированного так, что специфичность второго CAR изменена с исходной специфичности CD33, чтобы генерировать 3 новых CAR: CD19 И GD2, CD19 И EGFRvIII, CD19 И CD5. B. Логический элемент CD19 И GD2 И: слева: экспрессия логического элемента И показана окрашиванием рекомбинантным CD19-Fc (ось x) для CD19 CAR, в зависимости от окрашивания против Fc человека (ось y) для GD2 CAR. Справа: функция в ответ на одинарные положительные и двойные положительные мишени. C. Логический элемент CD19 И EGFRvIII И: слева: экспрессия логического элемента И показана окрашиванием рекомбинантным CD19-Fc (ось x) для CD19 CAR, в зависимости от окрашивания против Fc человека (ось y) для EGFRvIII CAR. Справа: функция в ответ на одинарные положительные и двойные положительные мишени. D. Логический элемент CD19 И CD5 И: слева: экспрессия логического элемента И показана окрашиванием рекомбинантного CD19-Fc (ось x) для CD19 CAR, в зависимости от окрашивания против Fc человека (ось y) для CD5 CAR. Справа: функция в ответ на одинарные положительные и двойные положительные мишени.

Фиг. 21: функция логических элементов И НЕ

Представлена функция трех реализаций логического элемента И НЕ. Схематическое представление протестированных логических элементов приведено справа, а функция в ответ на одинарные положительные и двойные положительные мишени приведена слева. A. Логический элемент И НЕ на основе PTPN6, посредством которого первый CAR распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и ITAM-содержащий активирующий эндодомен; коэкспрессируют со вторым CAR, который распознает CD33, имеет спейсер «стебля» CD8 мыши и имеет эндодомен, который содержит фосфатазный домен PTPN6. B. логический элемент И НЕ на основе ITIM идентичен логическому элементу PTPN6, за исключением того, что эндодомен заменяют на эндодомен из LAIR1. C. Усиленный CD148 логический элемент И НЕ идентичен логическому элементу на основе ITIM, за исключением того, что экспрессируют дополнительное слияние между PTPN6 SH2 и эндодоменом из CD148. Все три логических элемента работают в соответствии с ожиданиями с активацией в ответ на CD19, но не в ответ на CD19 и CD33 вместе.

Фиг. 22: Разбор функции логического элемента И НЕ на основе PTPN6

Исходный логический элемент И НЕ на основе PTPN6 сравнивают с несколькими контролями для того, чтобы демонстрировать модель. Схематическое представление протестированных логических элементов приведено справа, а функция в ответ на одинарные положительные и двойные положительные мишени приведена слева. A. Исходный логический элемент И НЕ, с помощью которого первый CAR распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и ITAM-содержащий активирующий эндодомен; коэкспрессируют со вторым CAR, который распознает CD33, имеет спейсер «стебля» CD8 мыши и имеет эндодомен, состоящий из фосфатазного домена PTPN6. B. Логический элемент И НЕ, модифицированный так, что спейсер «стебля» CD8 мыши заменен на Fc спейсер. C. Логический элемент И НЕ, модифицированный с тем, чтобы заменить фосфатазный домен PTPN6 на эндодомен из CD148. Исходный логический элемент И НЕ (A.) функционирует в соответствии с ожиданиями, запускаясь в ответ на CD19, но не в ответ на оба CD19 и CD33. Логический элемент в B. запускается как в ответ только на CD19 или вместе на CD19 и CD33. Логический элемент в C. не запускается в ответ на одну или обе мишени.

Фиг. 23: разбор логического элемента И НЕ на основе LAIR1

Показана функциональная активность против CD19 положительных, CD33 положительных и CD19, CD33 двойных положительных мишеней. A. Структура и активность исходного логического элемента И НЕ на основе ITIM. Этот логический элемент состоит из двух CAR: первый распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и ITAM-содержащий эндодомен; второй CAR распознает CD33, имеет спейсер «стебля» CD8 мыши и ITIM-содержащий эндодомен. B. Структура и активность контрольного логического элемента на основе ITIM, где спейсер «стебля» CD8 мыши заменен на Fc домен. Этот логический элемент состоит из двух CAR: первый распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и ITAM-содержащий эндодомен; второй CAR распознает CD33, имеет Fc спейсер и ITIM-содержащий эндодомен. Оба логических элемента отвечают на одинарные CD19 положительные мишени, тогда как только исходный логический элемент неактивен в ответ на двойные CD19 и CD33 положительные мишени.

Фиг. 24: Модель кинетической сегрегации логических элементов CAR

Модель кинетической сегрегации и поведения логического элемента И, логического элемента НЕ И и контролей. CAR распознают или CD19 или CD33. Иммунологический синапс можно представить между голубой линией, которая представляет мембрану клетки-мишени, и красной линией, которая представляет T-клеточную мембрану. «45» представляет нативный белок CD45, присутствующий на T-клетках. «H8» представляет эктодомен CAR со «стеблем» CD8 человека в качестве спейсера. «Fc» представляет эктодомен CAR с HCH2CH3 человека в качестве спейсера. «M8» представляет собой эктодомен CAR с мышиным «стеблем» CD8 в качестве спейсера. «19» представляет CD19 на поверхности клетки-мишени. «33» представляет CD33 на поверхности клетки-мишени. Символ «⊕» представляет активирующий эндодомен, содержащий ITAM. Символ «« представляет фосфатазу с медленной кинетикой - «включаемый лигированием» эндодомен, такой как тот, что содержит каталитический домен из PTPN6 или ITIM. Символ «∅« представляет фосфатазу с быстрой кинетикой - «выключаемый лигированием» эндодомен, такой как эндодомен из CD45 или CD148. Этот символ увеличен на фиг., чтобы подчеркнуть его высокую активность.

(a) Представлено предполагаемое поведение функционального логического элемента И, который содержит пару CAR, посредством чего первый CAR распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и активирующий эндодомен; и второй CAR распознает CD33, имеет Fc спейсер и эндодомен CD148;

(b) Представлено предполагаемое поведение контрольного логического элемента И. Здесь первый CAR распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и активирующий эндодомен; и второй CAR распознает CD33, но имеет спейсер «стебля» CD8 мыши и эндодомен CD148;

(c) Представлено поведение функционального логического элемента И НЕ, который содержит пару CAR, посредством чего первый CAR распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и активирующий эндодомен; и второй CAR распознает CD33, имеет спейсер «стебля» CD8 мыши и эндодомен PTPN6;

(d) Представлено предполагаемое поведение контрольного логического элемента И НЕ, который содерж*т пару CAR, посредством чего первый CAR распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и активирующий эндодомен; и второй CAR распознает CD33, но имеет Fc спейсер и эндодомен PTPN6;

В первой колонке клетки-мишени являются негативными как по CD19, так и по CD33. Во второй колонке мишени являются CD19 негативными и CD33 положительными. В третьей колонке клетки-мишени являются CD19 положительными и CD33 негативными. В четвертой колонке клетки-мишени являются положительными как по CD19, так и по CD33.

Фиг. 25: Конструкция CAR на основе APRIL.

Конструкцию CAR модифицировали с тем, чтобы заменять scFv на модифицированную форму индуцирующего пролиферацию лиганда (APRIL), который взаимодействует с BCMA, TACI и протеогликанами, чтобы действовать в качестве антигенсвязывающего домена: APRIL усечен с тем, чтобы отсутствовал амино-конец, связывающий протеогликаны. После этого сигнальный пептид прикрепляли к усеченному амино-концу APRIL, чтобы направлять белок на клеточную поверхность. Эти CAR генерировали с использованием этого связывающего домена на основе APRIL: A. В первом CAR домен «стебля» CD8 человека использовали в качестве спейсерного домена. B. Во втором CAR шарнир из IgG1 использовали в качестве спейсерного домена. C. В третьем CAR домены шарнира, CH2 и CH3 из IgG1 человека, модифицированные мутациями pva/a, описанными у Hombach et al (2010 Gene Ther. 17:1206-1213) для того, чтобы снижать связывание Fc рецептора, использовали в качестве спейсера (в дальнейшем обозначают как Fc-pvaa). Во всех CAR эти спейсеры соединяли с трансмембранным доменом CD28 и затем с тройным эндодоменом, содержащим слияние CD28, OX40 и дзета-эндодомена CD3 (Pule et al, Molecular Therapy, 2005: том 12; выпуск 5; стр. 933-41).

Фиг. 26: аннотированная аминокислотная последовательность трех вышеприведенных APRIL-CAR

A: представлена аннотированная аминокислотная последовательность CAR со «стеблем» CD8 и APRIL; B: представлена аннотированная аминокислотная последовательность CAR на основе шарнира IgG1 и APRIL; C: представлена аннотированная аминокислотная последовательность CAR на основе APRIL и Fc-pvaa.

Фиг. 27: экспрессия и связывание лиганда различными CAR на основе APRIL

A. Рецепторы совместно экспрессировали с маркерным геном усеченным CD34 в векторе с ретровирусными генами. Экспрессия маркерного гена на трансдуцированных клетках делает возможным подтверждение трансдукции. B. T-клетки трансдуцировали с использованием CAR на основе APRIL и спейсера из «стебля» CD8, шарнира IgG1 или Fc спейсера. Для того чтобы тестировать возможность стабильной экспрессии этих рецепторов на клеточной поверхности, затем T-клетки окрашивали с APC против APRIL-биотина/стрептавидина и против CD34. Осуществляли анализ проточной цитометрии. APRIL в равной мере обнаруживали на клеточной поверхности в трех CAR, что наводит на мысль об их стабильной экспрессии в равной мере. C. Затем определяли способность CAR распознавать TACI и BCMA. Трансдуцированные T-клетки окрашивали с использованием или рекомбинантного BCMA или TACI, слитого со слитной конструкцией IgG2a мыши Fc, наряду со вторичным против мыши и против CD34. Все три формата рецепторов демонстрировали связывание как с BCMA, так и с TACI. К удивлению, обнаруживали, что связывание BCMA казалось большим, чем с TACI. Кроме того, к удивлению обнаруживали, что несмотря на то, что все три CAR были экспрессированы в равной мере, CAR со «стеблем» CD8 и шарниром IgG1 выглядели лучше при распознавании BCMA и TACI, чем тот, что с Fc спейсером.

Фиг. 28: функция различных конструкций CAR.

Осуществляли функциональный анализ с использованием трех различных CAR на основе APRIL. T-клетки периферической крови нормального донора или не трансдуцировали (NT) или трансдуцировали для того, чтобы экспрессировать различные CAR. Трансдукцию осуществляли с использованием супернатантов с равными титрами. Затем эти T-клетки обедняли по CD56 для того, чтобы удалять неспецифичную NK активность и использовали в качестве эффекторов. Клетки SupT1, которые или не трансдуцировали (NT) или трансдуцировали для того, чтобы экспрессировать BCMA или TACI, использовали в качестве мишеней. Представленные данные представляют собой среднее и стандартное отклонение из 5 независимых экспериментов. A. Специфичное уничтожение T-клеток, экспрессирующих BCMA и TACI, определяли с использованием высвобождения хрома. B. Также определяли высвобождение интерферона-μ. Мишени и эффекторы совместно культивировали в соотношении 1:1. После 24 часов интерферон-μ в супернатанте анализировали с помощью ELISA. C. Пролиферация/выживаемость T-клеток с CAR также определяли посредством подсчета числа T-клеток с CAR в той же совместной культуре, которую инкубировали в течение дополнительных 6 суток. Все 3 CAR направляют ответ против мишеней, экспрессирующих BCMA и TACI. Ответы на BCMA были больше, чем для TACI.

Фиг. 29: функциональность логического элемента И в первичных клетках

PBMC выделяли из крови и стимулировали с использованием PHA и IL-2. Двумя сутками позже клетки трансдуцировали на покрытых ретронектином планшетах ретровирусом, содержащим конструкцию CD19:CD33 логического элемента И. На сутки 5 уровень экспрессии двух CAR, транслируемых с помощью конструкции логического элемента И, оценивали через проточную цитометрию, и клетки обедняли по CD56+ клеткам (преимущественно естественные киллерные клетки). В сутки 6 PBMC помещали в совместную культуру с клетками-мишенями с соотношением эффектора к клетке-мишени 1:2. В сутки 8 супернатант собирали и анализировали на секрецию IFN-γ с помощью ELISA

Фиг. 30: показан отбор/иерархия возможных спейсерных доменов увеличивающегося размера. Эктодомен CD3-дзета предложен в качестве самого короткого возможного спейсера, за которым следует (b) шарнир IgG1. (c) «стебель» CD8 мыши или человека, и эктодомены CD28 считают промежуточными по размеру и совместно сегрегирующимися. (d) домен шарнира, CH2 и CH3 из IgG1 больше и объемнее, и (e) шарнир, CH2, CH3 и CH4 домен из IgM еще больше. Учитывая свойства молекул-мишеней и эпитопа связывающих доменов на указанных молекулах-мишенях, возможно использовать эту иерархию спейсеров для того, чтобы создавать CAR систему передачи сигналов, которая или совместно сегрегируется или сегрегируется раздельно при формировании синапса.

Фиг. 31: правила конструирования для создания T-клеток с CAR с логическими элементами. CAR с логическими элементами ИЛИ, И НЕ и И представлены в схематическом формате с клеткой-мишенью сверху и T-клеткой внизу и с синапсом в середине. Клетки-мишени экспрессируют произвольные антигены-мишени A и B.

T-клетки экспрессируют два CAR, которые содержат распознающие домены против A и против B, спейсеры и эндодомены. Для логического элемента ИЛИ необходимы (1) спейсеры, которые просто делают возможным антигеное распознавание и активацию CAR, и (2) оба CAR, имеющие активирующие эндодомены; дл логического элемента И НЕ необходимы (1) спейсеры, которые ведут к совместной сегрегации обоих CAR при распознавании обоих антигенов и (2) один CAR с активирующим эндодоменом, и другой, эндодомен которого содержит или вовлекает слабую фосфатазу; для логического элемента И необходимы (1) спейсеры, которые ведут к сегрегации обоих CAR в различные части иммунологического синапса при распознавании обоих антигенов и (2) один CAR с активирующим эндодоменом, и другой, эндодомен которого содержит сильную фосфатазу.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ АСПЕКТОВ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения разработали панель пар химерных антигенных рецепторов «с логическими элементами», которые при экспрессии клеткой, такой как T-клетка, способны обнаруживать конкретный паттерн экспрессии по меньшей мере из двух антигенов-мишеней. Если по меньшей мере два антигена-мишени произвольно обозначены, как антиген A и антиген B, три возможных варианта представляют собой следующее:

«ЛОГИЧЕСКИЙ ЭЛЕМЕНТ ИЛИ» - T-клетка запускается, когда антиген A или антиген B присутствует на клетке-мишени

«ЛОГИЧЕСКИЙ ЭЛЕМЕНТ И» - T-клетка запускается только когда оба антигена A и B присутствуют на клетке-мишени

«ЛОГИЧЕСКИЙ ЭЛЕМЕНТ И НЕ» - T-клетка запускается, если только антиген A присутствует на клетке-мишени, но не если оба антигена A и B присутствуют на клетке-мишени

Сконструированные T-клетки, экспрессирующие эти комбинации CAR, можно адаптировать так, чтобы они обладали узкой специфичностью к клеткам злокачественной опухоли на основании их конкретной экспрессии (или отсутствия экспрессии) двух или более маркеров.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение предусматривает клетку, которая совместно экспрессирует первый химерный антигенный рецептор (CAR) и второй CAR на клеточной поверхности, каждый CAR содержит:

(i) антигенсвязывающий домен;

(ii) спейсер

(iii) трансмембранный домен; и

(iv) внутриклеточный домен T-клеточной сигнализации (эндодомен)

в которых антигенсвязывающие домены первого и второго CAR связывются с различными антигенами и в которых спейсер первого CAR отличается от спейсера второго CAR, так что первый и второй CAR не образуют гетеродимеры, и в которых

один из первого или второго CAR представляет собой активирующий CAR, который содержит активирующий внутриклеточный домен T-клеточной сигнализации, и другой CAR представляет собой ингибирующий CAR, который содержит «выключаемый лигированием» (как определено в настоящем документе) ингибирующий внутриклеточный домен T-клеточной сигнализации.

Клетка может представлять собой иммунную эффекторную клетку, такую как T-клетка или естественная киллерная клетка (NK). Признаки, отмеченные в настоящем документе применительно к T-клетке, применимы в равной мере к другим иммунным эффекторным клеткам, таким как естественные киллерные клетки.

Спейсер первого CAR может иметь длину и/или заряд и/или геометрическую форму и/или конфигурацию и/или гликозилирование, отличающиеся от спейсера второго CAR, так что когда первый CAR и второй CAR связывают соответствующие им антигены-мишени, первый CAR и второй CAR становятся пространственно разделенными на T-клетке. Лигирование первого и второго CAR с соответствующими им антигенами вызывает их компартментализацию вместе или отдельно в иммунологическом синапсе, что ведет к управлению активацией. Это можно понять, рассмотрев модель кинетического разделения активации T-клеток (см. далее).

Первый спейсер или второй спейсер может содержать «стебель» CD8 и другой спейсер может содержать домен шарнира, CH2 и CH3 из IgG1.

В настоящем изобретении, которое относется к логическому элементу «И», один из первого или второго CAR представляет собой активирующий CAR, который содержит активирующий эндодомен, и другой CAR представляет собой «выключаемый лигированием» ингибирующий CAR, который содержит ингибирующий эндодомен. Выключаемый лигированием ингибирующий CAR ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR в отсутствие лигирования ингибирующего CAR, но не значительно ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR, когда ингибирующий CAR лигирован. Поскольку спейсер первого CAR имеет длину и/или заряд и/или геометрическую форму и/или конфигурацию и/или гликозилирование, отличающееся от спейсера второго CAR, когда оба CAR лигированы, они сегрегируются. Это вызывает пространственное отделение ингибирующего CAR от активирующего CAR с тем, чтобы могла происходить активация T-клетки. Следовательно, активация T-клеток происходит только в ответ на клетку-мишень, несущую оба когнатных антигена.

Ингибирующий эндодомен может содержать весь или часть эндодомена из рецептороподобной тирозиновой фосфатазы, такой как CD148 или CD45.

Антигенсвязывающий домен первого CAR может связывать CD5 и антигенсвязывающий домен второго CAR может связывать CD19. Это имеет применение при направленном воздействии на хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL). Это заболевание можно лечить посредством направленного воздействия только на CD19, но за счет истощения всего B-клеточного компартмента. CLL клетки отличаются тем, что они совместно экспрессируют CD5 и CD19. Направленное воздействие на эту пару антигенов с использованием логического элемента И будет увеличивать специфичность и снижать токсичность.

Во втором аспекте настоящее изобретение предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует как первый, так и второй химерные антигенные рецепторы (CAR), как определено в первом аспекте изобретения.

Соответственно, последовательность нуклеиновой кислоты может иметь следующую структуру: AgB1-спейсер1-TM1-эндо1-коэкспр-AgB2-спейсер2-TM2-эндо2,

в которой

AgB1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий домен первого CAR;

спейсер1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер первого CAR;

TM1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранный домен первого CAR;

эндо1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен первого CAR;

коэкспр представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая допускает коэкспрессию двух CAR (например, сайт расщепления);

AgB2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий домен второго CAR;

спейсер2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер второго CAR;

TM2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранный домен второго CAR;

эндо2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен второго CAR;

эта последовательность нуклеиновой кислоты, при экспрессии в T-клетке, кодирует полипептид, который расщепляют в сайте расщепления так, что первый и второй CAR совместно экспрессируют на поверхности T-клеток.

Последовательность нуклеиновой кислоты, допускающая коэкспрессию двух CAR, может кодировать саморасщепляющийся пептид или последовательность, которая допускает альтернативное средство коэкспрессирующих двух CAR, таких как внутренняя последовательность связывания рибосомы или второй промотор или другое такое средство, посредством которого специалист в данной области может экспрессировать два белка с одного и того же вектора.

Альтернативные кодоны можно использовать в областях последовательности, кодирующих одинаковые или схожие аминокислотные последовательности, во избежание гомологичной рекомбинации.

В третьем аспекте настоящее изобретение предусматривает набор, который содержит

(i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует первый химерный антигенный рецептор (CAR), как определено в первом аспекте изобретения, эта последовательность нуклеиновой кислоты имеет следующую структуру:

AgB1-спейсер1-TM1-эндо1

в которой

спейсер1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер первого CAR;

эндо1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен первого CAR; и

(ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует второй химерный антигенный рецептор (CAR), как определено в первом аспекте изобретения, эта последовательность нуклеиновой кислоты имеет следующую структуру:

AgB2-спейсер2-TM2-эндо2

спейсер2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер второго CAR;

эндо2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен второго CAR.

В четвертом аспекте настоящее изобретение предусматривает набор, который содержит: первый вектор, который содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, как определено выше; и второй вектор, который содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, как определено выше.

Векторы могут представлять собой плазмидные векторы, ретровирусные векторы или транспозонные векторы. Векторы могут представлять собой лентивирусные векторы.

В пятом аспекте настоящее изобретение предусматривает вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту изобретения. Вектор может представлять собой лентивирусный вектор.

Вектор может представлять собой плазмидный вектор, ретровирусный вектор или транспозонный вектор.

В шестом аспекте настоящее изобретение включает коэкспрессию больше чем двух CAR таким образом, что на клетке-мишени можно распознавать комплексный паттерн больше чем из двух антигенов.

В седьмом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения T-клетки согласно первому аспекту изобретения, который включает стадию введения одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих первый и второй CAR; или одного или нескольких векторов, как определено выше, в T-клетку.

T-клетка может быть из образца, выделенного у пациента, родственного или неродственного донора гематопоэтического трансплантата, полностью несвязанного донора, из пуповинной крови, дифференцирована из эмбриональной клеточной линии, дифференцирована из индуцибельной линии клеток-предшественников или получена из трансформированной линии Т-клеток.

В восьмом аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, которая содержит множество T-клеток в соответствии с первым аспектом изобретения.

В девятом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения и/или предотвращения заболевания, который включает стадию введения субъекту фармацевтической композиции в соответствии с восьмым аспектом изобретения.

Способ может включать следующие стадии:

(i) выделение T-клетки, как перечислено выше.

(ii) трансдукция или трансфекция T-клеток одной или несколькими последовательностями нуклеиновой кислоты, которые кодируют первый и второй CAR, или одним или несколькими векторами, которые содержат такую последовательность(последовательности) нуклеиновой кислоты; и

(iii) введение T-клеток из (ii) субъекту.

Заболевание может представлять собой злокачественную опухоль.

В десятом аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию в соответствии с восьмым аспектом изобретения для использования в лечении и/или предотвращении заболевания.

Заболевание может представлять собой злокачественную опухоль.

В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение предусматривает использование T-клетки в соответствии с первым аспектом изобретения при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предотвращения заболевания.

Заболевание может представлять собой злокачественную опухоль.

Настоящее изобретение также относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит:

a) первую нуклеотидную последовательность, которая кодирует первый химерный антигенный рецептор (CAR);

b) вторую нуклеотидную последовательность, которая кодирует второй CAR;

c) последовательность, которая кодирует саморасщепляющийся пептид расположенный между первой и второй нуклеотидными последовательностями, так что два CAR экспрессируют в виде отдельных объектов.

Альтернативные кодоны можно использовать в одной или нескольких частях первой и второй нуклеотидных последовательностях в областях, которые кодируют одинаковые или схожие аминокислотные последовательности.

Настоящее изобретение также относится к вектору и клетке, которые содержат такую нуклеиновую кислоту.

Логический элемент И на основе кинетической сегрегации по настоящему изобретению дает значительное техническое преимущество относительно ранее описанных «совместных CAR», т. е. подход двойного направленного воздействия, в котором два антигена распознаются двумя CAR, которые подают или активирующий или костимулирующий сигнал T-клетке.

При использовании подхода с совместными CAR, несмотря на то, что наибольшую активность можно ожидать в отношении клеток-мишеней, несущих оба антигена, можно ожидать существенную активность в отношении тканей, несущих только антиген, распознаваемый с помощью активирующего CAR. Можно ожидать, что эта активность должна быть по меньшей мере таковой CAR первого поколения. CAR первого поколения приводили к существенной токсичности: например, билиарную токсичность наблюдали при клиническом тестировании CAR первого поколения, распознающего карбоангидразу IX, которая неожиданно была экспрессирована на билиарном эпителии (ссылка на Rotterdam). Стоит отметить, что терминально дифференцированные эффекторы не требуют или не отвечают на костимуляторные сигналы, так что любые терминально дифференцированные CAR T-клетки будут действовать максимально, несмотря на отсутствие костимуляторного CAR сигнала.

Кроме того, костимуляторные сигналы ведут к длительным эффектам, оказываемым на популяцию T-клеток. Эти эффекты длятся дольше, чем взаимодействие в синапсе T-клетка/мишень. Следовательно, CAR T-клетки, которые становятся полностью активированными в опухоли и мигрируют, могут иметь максимально высокую активность в отношении нормальных тканей, несущих один антиген. Этот эффект «выхода за пределы» может быть наиболее выражен в тканях внутри или вблизи опухоли или в которые дренируется опухоль. Фактически, предложены и тестированы стратегии на основании концепции активности CAR первого поколения, усиливающейся костимуляторными сигналами, не связаны с CAR активацией, но опосредованы отдельным рецептором (Rossig, Blood. 2002 Mar 15;99(6):2009-16.).

Таким образом, можно ожидать, что подход с совместными CAR даст в лучшем случае снижение, но не устранение токсичности в отношении нормальной ткани, экспрессирующей одиночный антиген. В настоящем изобретении используют кинетическую сегрегацию в иммунологическом синапсе, образованном между T-клеткой и клеткой-мишенью, чтобы регулировать запуск самой T-клетки. Следовательно, достигают абсолютно строгого контроля запуска в отсутствие второго антигена. Таким образом, вся активация T-клеток ограничена клетками-мишенями, экспрессирующими оба антигена, логический элемент И должен функционировать независимо от типа эффекторной клетки или состояния дифференциации и невозможен эффект выходалогического элемента И за пределы активации T-клеток.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение также относится к аспектам, перечисленным в следующих номерных абзацах:

1. T-клетка, которая совместно экспрессирует первый химерный антигенный рецептор (CAR) и второй CAR на клеточной поверхности, каждый CAR содержит:

(i) антигенсвязывающий домен;

(ii) спейсер;

(iii) трансмембранный домен; и

(iv) эндодомен

в которых антигенсвязывающие домены первого и второго CAR связываются с различными антигенами, в которых спейсер первого CAR отличается от спейсера второго CAR и в которых один из первого или второго CAR представляет собой активирующий CAR, который содержит активирующий эндодомен, и другой CAR представляет собой или активирующий CAR, который содержит активирующий эндодомен, или ингибирующий CAR, который содержит включаемый лигированием или выключаемый лигированием ингибирующий эндодомен.

2. T-клетка в соответствии с п. 1, в которой спейсер первого CAR имеет длину и/или заряд и/или размер и/или конфигурацию и/или гликозилирование, отличающиеся от спейсера второго CAR, так что когда первый CAR и второй CAR связывают соответствующие им антигены-мишени, первый CAR и второй CAR становятся пространственно разделенными на мембране T-клетки.

3. T-клетка в соответствии с п. 2, в которой или первый спейсер или второй спейсер содержит «стебель» CD8 и другой спейсер содержит домен шарнира, CH2 и CH3 из IgG1.

4. T-клетка в соответствии с п. 1, в которой как первый, так и второй CAR представляют собой активирующие CAR.

5. T-клетка в соответствии с п. 4, в которой один CAR связывает CD19 и другой CAR связывает CD20.

6. T-клетка в соответствии с п. 2 или 3, в которой один из первого или второго CAR представляет собой активирующий CAR, который содержит активирующий эндодомен, и другой CAR представляет собой ингибирующий CAR, который содержит выключаемый лигированием ингибирующий эндодомен, этот ингибирующий CAR ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR в отсутствие лигирования ингибирующего CAR, но не значительно ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR, когда ингибирующий CAR лигирован.

7. T-клетка в соответствии с п. 6, в которой ингибирующий эндодомен содержит весь эндодомен из CD148 или CD45 или его часть.

8. T-клетка в соответствии с п. 6 или 7, в которой антигенсвязывающий домен первого CAR связывает CD5 и антигенсвязывающий домен второго CAR связывает CD19.

9. T-клетка в соответствии с п. 1, в которой первый и второй спейсеры достаточно различны с тем, чтобы предотвращать образование перекрестных пар первого и второго CAR, но достаточно схожи, чтобы это приводило к совместной локализации первого и второго CAR после лигирования.

10. T-клетка в соответствии с п. 9, в которой один из первого или второго CAR представляет собой активирующий CAR, который содержит активирующий эндодомен, и другой CAR представляет собой ингибирующий CAR, который содержит включаемый лигированием ингибирующий эндодомен, этот ингибирующий CAR не значительно ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR в отсутствие лигирования ингибирующего CAR, но ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR, когда ингибирующий CAR лигирован.

11. T-клетка в соответствии с п. 10, в которой включаемый лигированием ингибирующий эндодомен содержит по меньшей мере часть фосфатазы.

12. T-клетка в соответствии с п. 11, в которой включаемый лигированием ингибирующий эндодомен содержит весь PTPN6 или его часть.

13. T-клетка в соответствии с п. 10, в которой включаемый лигированием ингибирующий эндодомен содержит по меньшей мере один ITIM-домен.

14. T-клетка в соответствии с п. 13, в которой активность включаемого лигированием ингибирующего эндодомена усиливают посредством коэкспрессии слитного белка PTPN6-CD45 или -CD148.

15. T-клетка в соответствии с любым из пп. с 10 до 14, в которой CAR, который содержит активирующий эндодомен, содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и CAR, который содержит включаемый лигированием ингибирующий эндодомен, содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD34.

16. T-клетка, которая содержит больше чем два CAR, как определено в предшествующих пп., так что ее специфично стимулирует клетка, такая как T-клетка, несущая отличающий паттерн больше чем из двух антигенов.

17. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует как первый, так и второй химерные антигенные рецепторы (CAR), как определено в любом из пп. с 1 до 16.

18. Последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с п. 17, которая имеет следующую структуру:

AgB1-спейсер1-TM1-эндо1-коэкспр-AbB2-спейсер2-TM2-эндо2

в которой

спейсер1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер первого CAR;

эндо1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен первого CAR;

коэкспр представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая делает возможной коэкспрессию обоих CAR

спейсер2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер второго CAR;

эндо2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен второго CAR;

эта последовательность нуклеиновой кислоты, когда ее экспрессируют в T-клетке, кодирует полипептид, который расщепляют в сайте расщепления так, что на поверхности T-клеток совместно экспрессируют первый и второй CAR.

19. Последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с п. 18, в которой коэкспр кодирует последовательность, которая содержит саморасщепляющийся пептид.

20. Последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с п. 18 или 19, в которой альтернативные кодоны используют в областях последовательности, которая кодирует одинаковые или схожие аминокислотные последовательности, во избежание гомологичной рекомбинации.

21. Набор, который содержит

(i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует первый химерный антигенный рецептор (CAR), как определено в любом из пп. с 1 до 16, эта последовательность нуклеиновой кислоты имеет следующую структуру:

AgB1-спейсер1-TM1-эндо1

в которой

спейсер1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер первого CAR;

эндо1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен первого CAR; и

(ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует второй химерный антигенный рецептор (CAR), как определено в любом из пп. с 1 до 16, эта последовательность нуклеиновой кислоты имеет следующую структуру:

AgB2-спейсер2-TM2-эндо2

спейсер2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер второго CAR;

эндо2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен второго CAR.

22. Набор, который содержит: первый вектор, который содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, как определено в п. 21; и второй вектор, который содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, как определено в п. 21.

23. Набор в соответствии с п. 22, в котором векторы представляют собой интегрирующие вирусные векторы или транспозоны.

24. Вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с любым из пп. с 17 до 20.

25. Ретровирусный вектор или лентивирусный вектор или транспозон в соответствии с п. 24.

26. Способ получения T-клетки в соответствии с любым из пп. с 1 до 16, который включает стадию введения: последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с любым из пп. с 17 до 20; первой последовательности нуклеиновой кислоты и второй последовательности нуклеиновой кислоты, как определено в п. 21; и/или первого вектора и второго вектора, как определено в п. 22, или вектора в соответствии с п. 24 или 25 в T-клетку.

27. Способ в соответствии с п. 24, в котором T-клетка происходит из образца, выделенного у субъекта.

28. Фармацевтическая композиция, которая содержит множество T-клеток в соответствии с любым из пп. с 1 до 16.

29. Способ лечения и/или предотвращения заболевания, который включает стадию введения фармацевтической композиции в соответствии с п. 28 субъекту.

30. Способ в соответствии с п. 29, который включает следующие стадии:

(i) выделение образца, содержащего T-клетки, у субъекта;

(ii) трансдукция или трансфекция T-клеток с использованием: последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с любым из пп. с 17 до 20; первой последовательности нуклеиновой кислоты и второй последовательности нуклеиновой кислоты, как определено в п. 21; первого вектора и второго вектора, как определено в п. 22 или 23, или вектора в соответствии с п. 24 или 25; и

(iii) введение T-клеток из (ii) субъекту.

31. Способ в соответствии с п. 29 или 30, в котором заболевание представляет собой злокачественную опухоль.

32. Фармацевтическая композиция в соответствии с п. 28 для использования в лечении и/или предотвращении заболевания.

33. Использование T-клетки в соответствии с любым из пп. с 1 до 16 при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предотвращения заболевания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ (CAR)

CAR, которые схематически представлены на фиг. 1, представляют собой химерные трансмембранные белки I типа, которые соединяют внеклеточный антигенраспознающий домен (связывающее средство) с внутриклеточным сигнальным доменом (эндодомен). Связывающее средство типично представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из моноклонального антитела (mAb), но оно может быть основано на других форматах, которые содержат антителоподобный антигенсвязывающий участок. Спейсерный домен обычно необходим для того, чтобы отделять связывающее средство от мембраны и сделать возможной его подходящую ориентацию. Обыкновенный используемый спейсерный домен представляет собой Fc из IgG1. Может быть достаточно более компактного спейсера, например, «стебля» из CD8α и даже просто только шарнира IgG1, в зависимости от антигена. Трансмембранный домен заякоривает белок в клеточной мембране и соединяет спейсер с эндодоменом.

Ранние конструкции CAR содержали эндодомены, полученные из внутриклеточных частей или γ цепи из FcεR1 или CD3ξ. Следовательно, эти рецепторы первого поколения передавали иммунологический сигнал 1, которого было достаточно для того, чтобы запускать уничтожение T-клетками когнатных клеток-мишеней, но не достаточно для того, чтобы полностью активировать T-клетку для пролиферации и выживания. Чтобы преодолеть это ограничение, сконструированы составные эндодомены: слияние внутриклеточной части из костимуляторной молекулы T-клеткы с таковой из CD3ξ дает рецепторы второго поколения, которые могут передавать активирующий и костимуляторный сигнал одновременно после распознавания антигена. Наиболее широко используют костимуляторный домен из CD28. Это обеспечивает наиболее сильный костимуляторный сигнал, а именно, иммунологический сигнал 2, который запускает T-клеточную пролиферацию. Также описаны некоторые рецепторы, которые содержат эндодомены семейства рецепторов TNF, такие как близкородственные OX40 и 41BB, которые передают сигналы выживания. Сейчас даже описаны еще более сильные CAR третьего поколения, которые имеют эндодомены, способные передавать сигналы активации, пролиферации и выживания.

Кодирующие CAR нуклеиновые кислоты можно переносить в T-клетки с использованием, например, ретровирусных векторов. Можно использовать лентивирусные векторы. Таким образом, большое число T-клеток со специфичностью к злокачественной опухоли можно создавать для адоптивного переноса клеток. Когда CAR связывает антиген-мишень, это ведет к передаче активирующего сигнала в T-клетку, на которой он экспрессирован. Таким образом CAR определяет специфичность и цитотоксичность T-клетки в направлении опухолевых клеток, которые экспрессируют антиген-мишень.

Первый аспект изобретения относится к T-клетке, которая совместно экспрессирует первый CAR и второй CAR так, что T-клетка может распознавать желаемый паттерн экспрессии на клетках-мишенях наподобие логического элемента, как подробно изложено в таблицах истинности: таблица 1, 2 и 3.

И первый и второй (и необязательно последующие) CAR содержат:

(i) антигенсвязывающий домен;

(ii) спейсер;

(iii) трансмембранный домен; и

(iii) внутриклеточный домен.

Таблица 1 Таблица истинности для CAR логического элемента ИЛИ
Антиген A	Антиген B	Ответ
Отсутствует	Отсутствует	Нет активации
Отсутствует	Присутствует	Активация
Присутствует	Отсутствует	Активация
Присутствует	Присутствует	Активация

Таблица 2 Таблица истинности для CAR логического элемента И
Антиген A	Антиген B	Ответ
Отсутствует	Отсутствует	Нет активации
Отсутствует	Присутствует	Нет активации
Присутствует	Отсутствует	Нет активации
Присутствует	Присутствует	Активация

Таблица 3 Таблица истинности для CAR логического элемента И НЕ
Антиген A	Антиген B	Ответ
Отсутствует	Отсутствует	Нет активации
Отсутствует	Присутствует	Нет активации
Присутствует	Отсутствует	Активация
Присутствует	Присутствует	Нет активации

Первый и второй CAR T-клетки по настоящему изобретению можно получать в виде полипептида, который содержит оба CAR, вместе с сайтом расщепления.

В SEQ ID № с 1 до 5 приведены примеры таких полипептидов, каждый из которых содержит два CAR. Следовательно, CAR может содержать одну или другую часть следующих аминокислотных последовательностей, которые соответствуют одному CAR.

SEQ ID № 1 представляет собой CAR логический элемент ИЛИ, который распознает CD19 ИЛИ CD33

SEQ ID № 2 представляет собой CAR логический элемент И, который распознает CD19 И CD33 с использованием фосфатазы CD148

SEQ ID № 3 представляет собой альтернативную реализацию CAR логического элемента И, который распознает CD19 И CD33, который использует фосфатазу CD45

SEQ ID № 4 представляет собой CAR логический элемент И НЕ, который распознает CD19 И НЕ CD33 на основании фосфатазы PTPN6

SEQ ID № 5 представляет собой альтернативную реализацию CAR логического элемента И НЕ, который распознает CD19 И НЕ CD33 и основан на ITIM-содержащем эндодомене из LAIR1

SEQ ID № 6 представляет собой дополнительную альтернативную реализацию CAR логического элемента И НЕ, который распознает CD19 И НЕ CD33 и рекрутирует слитный белок PTPN6-CD148 в эндодомен, содержащий ITIM.

SEQ ID № 1

SEQ ID № 2

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLIYDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA

SEQ ID № 3

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLIYDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKALIAFLAFLIIVTSIALLVVLYKIYDLHKKRSCNLDEQQELVERDDEKQLMNVEPIHADILLETYKRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQNKNRYVDILPYDYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIWEQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRAFGDVVVKINQHKRCPDYIIQKLNIVNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAENKVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPYLHNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSYRSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPYDYNRVPLKHELEMSKESEHDSDESSDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPEVMIAAQGPLKETIGDFWQMIFQRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKRKDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEPKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKSTPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLLESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSVNGPASPALNQGS

SEQ ID № 4

SEQ ID № 5

SEQ ID № 6

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMAVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLIYDTNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDPATTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDILIGVSVVFLFCLLLLVLFCLHRQNQIKQGPPRSKDEEQKPQQRPDLAVDVLERTADKATVNGLPEKDRETDTSALAAGSSQEVTYAQLDHWALTQRTARAVSPQSTKPMAESITYAAVARHRAEGRGSLLTCGDVEENPGPWYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYSGGGGSFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIASGS

CAR может содержать вариант CAR-кодирующей части последовательности, представленной в качестве SEQ ID № 1, 2, 3, 4, 5 или 6, которая имеет по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичность последовательностей, при условии, что вариант последовательности представляет собой CAR, который обладает необходимыми свойствами.

Способы выравнивания последовательностей хорошо известны в данной области, и их реализуют с использованием подходящих программ для выравнивания. Процент идентичности последовательностей относится к процентной доле остатков аминокислот или нуклеотид, которые идентичны в двую последовательностях, когда они выровнены оптимально. Гомологию или идентичность нуклеотидных и белковых последовательностей можно определять с использованием стандартных алгоритмов, таких как программа BLAST (Basic Local Alignment Search Tool в National Center for Biotechnology Information) с параметрами по умолчанию, которая общедоступна на http://blast.ncbi.nlm.nih.gov. Другие алгоритмы для определения идентичности или гомологии последовательностей включают: LALIGN (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/ и http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/nucleotide.html), AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences, http://www.compbio.dundee.ac.uk/Software/Amas/amas.html), FASTA (http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/), Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), SIM (http://web.expasy.org/sim/) и EMBOSS Needle (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html).

CAR ЛОГИЧЕСКИЙ ЭЛЕМЕНТ ИЛИ

В этом варианте осуществления антигенсвязывающие домены первого и второго CAR по настоящему изобретению связываются с различными антигенами, и оба CAR содержат активирующий эндодомен. Оба CAR имеют различные спейсерные домены для того, чтобы предотвращать образование перекрестных пар из двух различных рецепторов. Таким образом, можно конструировать T-клетки для того, чтобы активация происходила при распознавании любого или обоих антигенов. Это можно использовать в области онкологии, как показан в гипотизе Goldie-Coldman: одиночное направленное воздействие на один антиген может вести к ускользанию опухоли посредством модуляции указанного антигена из-за высокой частоты мутаций, свойственной большинству злокачественных опухолей. Посредством одновременного направленного воздействия на два антигена вероятность такого ускользания снижается экспоненциально.

Известны различные опухоль-ассоциированные антигены, как показано в следующей таблице 4. Для данного заболевания первый CAR и второй CAR может связываться с двумя различными TAA, связанными с этим заболеванием. Таким образом, предотвращено ускользание опухоли посредством модуляции одного антигена, поскольку на второй антиген также воздействуют направленно. Например, при направленном воздействии на B-клеточное злокачественное новообразование, можно одновременно направленно воздействовать на CD19 и CD20. В этом варианте осуществления важно, что два CAR не образуют гетеродимеров.

ТАБЛИЦА 4
Тип злокачественно опухоли	TAA
Диффузная В-крупноклеточная лимфома	CD19, CD20
Злокачественная опухоль молочной железы	ErbB2, MUC1
AML	CD13, CD33
Нейробластома	GD2, NCAM
B-CLL	CD19, CD52
Злокачественная опухоль толстой кишки	Фолатсвязывающий белок, CA-125

МОДЕЛЬ КИНЕТИЧЕСКОЙ СЕГРЕГАЦИИ

Последующее образование пар CAR для создания логического элемента И и логического элемента И НЕ основано на модели кинетической сегрегации (KS) активации T-клеток. Она представляет собой функциональную модель, подтвержденную экспериментальными данными, которая объясняет, как распознавание антигена T-клеточным рецептором превращается в нисходящие сигналы активации. В кратком изложении: в основном состоянии сигнальные компоненты на мембране T-клетки находятся в динамическом гомеостазе, за счет чего дефосфорилированные ITAM предпочтительнее фосфорилированных ITAM. Это обусловлено более высокой активностью трансмембранного CD45/фосфатазы CD148, чем у киназ, связанных с мембраной, таких как lck. Когда T-клетка связывается с клеткой-мишенью через распознавание когнатного антигена T-клеточным рецептором (или CAR), образуются плотные иммунологические синапсы. Такое тесное расположение T-клетки и мембран-мишеней исключает CD45/CD148 из-за их больших эктодоменов, которые не могут поместиться в синапсе. Сегрегация высокой концентрации ассоциированных с T-клеточным рецептором ITAM и киназ в синапсе, в отсутствие фосфатазы, ведет к состоянию, в котором предпочтительны фосфорилированные ITAM. ZAP70 распознает порог фосфорилированных ITAM и распространяет сигнал активации T-клеток. Это глубокое понимание активации T-клеток используют в настоящем изобретении. В частности, изобретение основано на этом понимании того, как эктодомены с различной длиной и/или объемом и/или зарядом и/или конфигурацией и/или гликозилированием ведут к дифференциальной сегрегации при формировании синапса.

CAR ЛОГИЧЕСКИЙ ЭЛЕМЕНТ И

В этом варианте осуществления один CAR содержит активирующий эндодомен и один CAR содержит ингибирующий эндодомен, посредством чего ингибирующий CAR конститутивно ингибирует первый активирующий CAR, но при распознавании своего когнатного антигена, снимает свое ингибирование активирующего CAR. Таким образом, можно конструировать T-клетку для запуска, только если клетка-мишень экспрессирует оба когнатных антигена. Этого поведения достигают с помощью активирующего CAR, который содержит активирующий эндодомен, содержащий ITAM-домены, например эндодомен CD3 дзета, и ингибирующего CAR, который содержит эндодомен из фосфатазы, способный дефосфорилировать ITAM (например, CD45 или CD148). Самое главное, спейсерные домены обоих CAR значительно отличаются по размеру и/или геометрической форме и/или заряду и т.д. Когда лигирован только активирующий CAR, ингибирующий CAR находится в растворе на поверхности T-клетки и может диффундировать в и из синапса, ингибируя активирующий CAR. Когда лигированы оба CAR, из-за различий в свойствах спейсера, активирующий и ингибирующий CAR дифференциально сегрегированны, что позволяет активирующему CAR запускать активацию T-клеток без пространственного затруднения со стороны ингибирующего CAR.

Это обладает существенной полезностью в области терапии злокачественных опухолей. В настоящее время иммунотерапия типично направлена на один антиген. Большинство злокачественных опухолей нельзя отличить от нормальных тканей на основании одного антигена. Таким образом, имеет место существенная токсичность «в мишени вне опухоли», за счет которой при терапии происходит повреждение нормальных тканей. Например, при направленном воздействии на CD20 для того, чтобы лечить B-клеточные лимфомы ритуксимабом, происходит истощение всего компартмента нормальных B-клеток. Например, при направленном воздействии на CD52 для того, чтобы лечить хронический лимфоцитарный лейкоз, происходит истощение всего лимфоидного компартмента. Например, при направленном воздействии на CD33 для того, чтобы лечить острый миелолейкоз, происходит истощение всего миелоидного компартмента и т.д. С помощью ограничения активности парой антигенов можно разработать значительно более точное направленное воздействие и, таким образом, менее токсичную терапию. Практическим примером является направленное воздействие на CLL, который экспрессирует и CD5 и CD19. Только небольшая доля нормальных B-клеток экспрессирует оба антигена, так что токсичность вне мишени при направленном воздействии на оба антигена с использованием логического элемента И по существу меньше, чем индивидуальное направленное воздействие на каждый антиген.

Конструкция по настоящему изобретению представляет собой существенное усовершенствование предыдущей реализации, как описано у Wilkie et al. ((2012). J. Clin. Immunol. 32, 1059-1070) и затем протестировано in vivo (Kloss et al (2013) Nat. Biotechnol. 31, 71-75). В этой реализации первый CAR содержит активирующий эндодомен, а второй - костимуляторный домен. Таким образом, T-клетка получает только активирующий и костимуляторный сигнал, когда присутствуют оба антигена. Однако T-клетка все же будет активировать в присутствии только первого антигена, что ведет к возможной токсичности вне мишени. Кроме того, реализация по настоящему изобретению допускает множественные составные сцепленные логические элементы, посредством которых клетка может интерпретировать комплексный паттерн антигенов.

ТАБЛИЦА 5
Тип злокачественной опухоли	Антигены
Хронический лимфоцитарный лейкоз	CD5, CD19
Нейробластома	ALK, GD2
Глиома	EGFR, виментин
Множественная миелома	BCMA, CD138
Почечноклеточная карцинома	Карбоангидраза IX, G250
T-ALL	CD2, N-кадгерин
Злокачественная опухоль предстательной железы	PSMA, гепсин (или другие)

CAR ЛОГИЧЕСКИЙ ЭЛЕМЕНТ И НЕ

В этом варианте осуществления один CAR содержит активирующий эндодомен и один CAR содержит ингибирующий эндодомен так, что этот ингибирующий CAR активен только когда он распознает свой когнатный антиген. Таким образом, T-клетка, сконструированная таким образом, активируется в ответ на присутствие только первого антигена, но не активируется, когда присутствуют оба антигена. Это изобретение реализовано с помощью ингибирующих CAR со спейсером, который может быть локализован совместно с первым CAR, но или фосфатазная активность ингибирующего CAR не должна быть настолько высокой, чтобы он ингибировал в растворе, или ингибирующий эндодомен фактически рекрутирует фосфатазу только когда ингибирующий CAR распознает свою когнатную мишень. В настоящем документе такие эндодомены называют «включаемыми лигированием» или полуингибирующими.

Это изобретение полезно для уточнения направленного воздействия, когда опухоль можно отличать от нормальной ткани по присутствию опухоль-ассоциированного антигена и утрате антигена, экспрессированного на нормальной ткани. Логический элемент И НЕ обладает существенной полезностью в области онкологии, поскольку он делает возможным направленное воздействие на антиген, который экспрессирует нормальная клетка, эта нормальная клетка также экспрессирует антиген, распознаваемый с помощью CAR, который содержит активирующий эндодомен. Примером такго антигена является CD33, который экспрессируют нормальные стволовые клетки и клетки острого миелолейкоза (AML). CD34 экспрессируют стволовые клетки, но типично не экспрессируют клетки AML. T-клетка, распознающая CD33 И НЕ CD34, будет вести к разрушению клеток лейкоза, но беречь нормальные стволовые клетки.

Возможные пары антигенов для использования с логическими элементами И НЕ приведены в таблице 6.

ТАБЛИЦА 6
Заболевание	TAA	Нормальная клетка, которая экспрессирует TAA	Антиген, экспрессируемый нормальной клеткой, но не клеткой злокачественной опухоли
AML	CD33	Стволовые клетки	CD34
Миелома	BCMA	Дендритные клетки	CD1c
B-CLL	CD160	Естественные киллерные клетки	CD56
Злокачественная опухоль предстательной железы	PSMA	Нервная ткань	NCAM
Злокачественная опухоль кишечника	A33	Нормальный кишечник	I класс HLA

СОСТАВНЫЕ ЛОГИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ

Модель кинетической сегрегации с вышеуказанными компонентами допускает создание составных логических элементов, например, T-клетку, которая запускается в ответ на паттерны из больше чем двух антигенов-мишеней. Например, возможно создать T-клетку, которая запускается только когда присутствуют три антигена (A И B И C). Здесь клетка экспрессирует три CAR, каждый распознает антигены A, B и C. Один CAR является возбуждающим, а два являются ингибирующими, где каждый CAR имеет спейсерные домены, которые ведут к дифференциальной сегрегации. Только когда все три лигированы, T-клетка будет активна. Дополнительный пример: (A ИЛИ B) И C: здесь CAR, распознающие антигены A и B, являются активирующими и имеют спейсеры которые могут быть совместно локализованы, тогда как CAR, распознающий антиген C, является ингибирующим и имеет спейсер, результатом чего является другая совместная сегрегация. Дополнительный пример (A И НЕ B) И C: здесь CAR против антигена A имеет активирующий эндодомен и совместно локализован с CAR против антигена B, который имеет эндодомен, ингибирующий при определенных условиях. CAR против антигена C имеет спейсер, который сегрегируется отлично от A или B, и является ингибирующим. Фактически, с использованием этих простых компонентов по изобретению и любого числа CAR и спейсеров можно программировать даже более сложную булеву логика.

СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД

CAR T-клетки по настоящему изобретению могут содержать сигнальный пептид с тем, чтобы когда CAR экспрессируют внутри клетки, такой как T-клетка, направлять появляющийся белок на эндоплазматический ретикулум и впоследствии на клеточную поверхность, где он будет экспрессирован.

Сердцевина сигнального пептида может содержать длинный участок гидрофобных аминокислот, который имеет склонность к формированию одной альфа-спирали. Сигнальный пептид может начинаться коротким положительно заряженным участком аминокислот, который помогает укреплять надлежащую топологию полипептида во время транслокации. На конце сигнального пептида типично имеет место участок аминокислот, которые распознает и отщепляет сигнальная пептидаза. Сигнальная пептидаза может осуществлять отщепление или во время транслокации или по ее завершении, чтобы создавать свободный сигнальный пептид и зрелый белок. После этого специфичные протеазы расщепляют свободные сигнальные пептиды.

Сигнальный пептид может находиться на амино-конце молекулы.

Сигнальный пептид может содержать SEQ ID № 7, 8 или 9 или их вариант, который имеет 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотную мутацию (инсерцию, замену или вставку) при условии, что сигнальный пептид все еще функционирует, обеспечивая экспрессию CAR на клеточной поверхности.

SEQ ID № 7: MGTSLLCWMALCLLGADHADG

Сигнальный пептид SEQ ID № 7 является компактным и высоко эффективным. Предсказано, что он дает расщепление приблизительно 95% после концевого глицина, давая эффективное удаление сигнальной пептидазой.

SEQ ID № 8: MSLPVTALLLPLALLLHAARP

Сигнальный пептид SEQ ID № 8 получают из IgG1.

SEQ ID № 9: MAVPTQVLGLLLLWLTDARC

Сигнальный пептид SEQ ID № 9 получают из CD8.

Сигнальный пептид для первого CAR может иметь последовательность, отличную от сигнального пептида из второго CAR (и от третьего CAR и четвертого CAR и т. п.).

АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН

Антигенсвязывающий домен представляет собой часть CAR, которая распознает антиген. Многие антигенсвязывающие домены известны в данной области, в том числе те, которые основаны на антигенсвязывающем участке антитела, миметике антитела и T-клеточных рецепторах. Например, антигенсвязывающий домен может содержать: одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из моноклонального антитела; природный лиганд антигена-мишени; пептид с достаточной аффинностью к мишени; однодоменное антитело; искусственное одиночное связывающее средство, такое как Darpin (сконструированный белок с анкириновым повтором); или одна цепь, полученная из T-клеточного рецептора.

Антигенсвязывающий домен может содержать домен, который не основан на антигенсвязывающем участке антитела. Например, антигенсвязывающий домен может содержать домен на основании белка/пептида, который представляет собой растворимый лиганд для рецептора клеточной поверхности опухоли (например, растворимый пептид, такой как цитокин или хемокин); или внеклеточный домен лиганда или рецептора, заякоренного в мембране, для которого вторая часть пары связывания экспрессирована на опухолевой клетке.

Примеры с 11 до 13 относятся к CAR, который связывает BCMA, в котором антигенсвязывающий домен содержит APRIL, лиганд для BCMA.

Антигенсвязывающий домен может быть основан на природном лиганде антигена.

Антигенсвязывающий домен может содержать аффинный пептид из комбинаторной библиотеки или сконструированный de novo аффинный белок/пептид.

СПЕЙСЕРНЫЙ ДОМЕН

CAR содержит спейсерную последовательность для соединения антигенсвязывающего домена с трансмембранным доменом и пространственного отделения антигенсвязывающего домен от эндодомена. Гибкий спейсер позволяет антигенсвязывающему домену ориентироваться в различных направлениях для того, чтобы содействовать связыванию.

В T-клетке по настоящему изобретению первый и второй CAR содержат различные спейсерные молекулы. Например, спейсерная последовательность, например, может содержать Fc-область IgG1, шарнир IgG1 или «стебель» CD8 человека или «стебель» CD8 мыши. Спейсер альтернативно может содержать альтернативную линкерную последовательность, которая имеет схожую длину и/или свойства разнесения доменов, как у Fc-области IgG1, шарнира IgG1 или «стебля» CD8. Спейсер IgG1 человека можно изменять для того, чтобы удалять мотивы связывания Fc.

Примеры аминокислотных последовательностей для этих спейсеров приведены ниже:

SEQ ID № 10 (шарнир-CH2CH3 из IgG1 человека)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD

SEQ ID № 11 («стебель» CD8 человека):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI

SEQ ID № 12 (шарнир IgG1 человека):

AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK

SEQ ID № 13 (эктодомен CD2)

KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD

SEQ ID № 14 (эктодомен CD34)

SLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKT

Поскольку CAR типично представляют собой гомодимеры (см. фиг. 1a), перекрестное образование пар может вести к гетеродимерному химерному антигенному рецептору. Это нежелательно по различным причинам, например: (1) эпитоп может не быть на том же «уровне» на клетке-мишени, так что перекрестно-спареный CAR может быть способен только связываться с одним антигеном; (2) VH и VL из двух различных scFv могут меняться местами и оказываться неспособными распознавать мишень или, хуже того, распознавать неожиданный и непредсказуемый антиген. Для логического элемента «ИЛИ» и логического элемента «И НЕ» спейсер первого CAR достаточно отличен от спейсера второго CAR во избежание образования перекрестных пар. Аминокислотная последовательность первого спейсера может иметь меньше чем 50%, 40%, 30% или 20% идентичности со вторым спейсером на аминокислотном уровне.

В других аспектах изобретения (например, логический элемент И) важно, что спейсер первого CAR имеет отличающуюся длину и/или заряд и/или геометрическую форму и/или конфигурацию и/или гликозилирование, так что когда первый и второй CAR связывают свой антиген-мишень, различия в заряде или размерах спейсера ведет к пространственному разделению CAR двух типов на различные части мембраны, чтобы приводить к активации, как предсказано с помощью модели кинетического разделения. В этих аспектах отличающуюся длину, геометрическую форму и/или конфигурацию спейсеров осторожно выбирают, принимая во внимание размер и связывающий эпитоп на антигене-мишени для того, чтобы сделать возможным дифференциальную сегрегацию при распознавании когнатной мишени. Например, предположительно шарнир IgG1, «стебель» CD8, Fc из IgG1, эктодомен CD34, эктодомен CD45 способны к дифференциальной сегрегации.

Примеры пар спейсеров, которые способны к дифференциальной сегрегации и, следовательно, пригодны для использования с логическим элементом И, представлены в следующей таблице:

Спейсер стимулирующего CAR	Спейсер ингибирующего CAR
CD8STK человека	Шарнир-CH2CH3 из IgG человека
Эктодомен CD3z человека	Шарнир-CH2CH3 из IgG человека
Шарнир IgG человека	Шарнир-CH2CH3 из IgG человека
CD28STK человека	Шарнир-CH2CH3 из IgG человека
CD8STK человека	Шарнир-CH2CH3CD4 из IgM человека
Эктодомен CD3z человека	Шарнир-CH2CH3CD4 из IgM человека
Шарнир IgG человека	Шарнир-CH2CH3CD4 из IgM человека
CD28STK человека	Шарнир-CH2CH3CD4 из IgM человека

В других аспектах изобретения (например, логический элемент И НЕ) важно, чтобы спейсер достаточно отличался для того, чтобы предотвращать образование перекрестных пар, но был достаточно схожим для совместной локализации. Можно использовать пары ортологичных спейсерных последовательностей. Примерами являются «стебли» CD8 мыши и человека или альтернативно спейсерные домены, которые являются мономерными, например, эктодомен CD2.

Примеры пар спейсеров, которые совместно локализуются и, следовательно, пригодны для использования с логическим элементом И НЕ, представлены в следующей таблице:

Спейсер стимулирующего CAR	Спейсер ингибирующего CAR
CD8aSTK человека	CD8aSTK мыши
CD28STK человека	CD8aSTK мыши
Шарнир IgG человека	Эктодомен CD3z человека
CD8aSTK человека	CD28STK мыши
CD28STK человека	CD28STK мыши
Шарнир-CH2CH3 из IgG человека	Шарнир-CH2CH3CD4 из IgM человека

Все указанные выше спейсерные домены формируют гомодимеры. Однако механизм не ограничен использованием гомодимерных рецепторов и будет работать с мономерными рецепторами до тех пор, пока спейсер является достаточно жестким. Примером такого спейсера является CD2 или усеченный CD22.

ТРАНСМЕМБРАННЫЙ ДОМЕН

Трансмембранный домен представляет собой последовательность CAR, которая пронизывает мембрану.

Трансмембранный домен может представлять собой любую белковую структуру, которая термодинамически стабильна в мембране. Типично она представляет собой альфа-спираль, которая содержит несколько гидрофобных остатков. Трансмембранный домен любого трансмембранного белка можно использовать для предоставления трансмембранной части по изобретению. Присутствие и размер трансмембранного домена белка могут определять специалисты в данной области с использованием алгоритма TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/). Кроме того, учитывая, что трансмембранный домен белка представляет собой относительно простую структуру, т. е. полипептидная последовательность, согласно прогнозу, может формировать гидрофобную альфа-спираль достаточной длины, чтобы пронизывать мембрану, также можно использовать искусственно сконструированный TM домен (в US 7052906 B1 описаны синтетические трансмембранные компоненты).

Трансмембранный домен можно получать из CD28, который дает хорошую стабильность рецепторов.

АКТИВИРУЮЩИЙ ЭНДОДОМЕН

Эндодомен представляет собой передающую сигналы часть CAR. После распознавания антигена, рецепторы образуют кластер, нативные CD45 и CD148 исключены из синапса и сигнал передается в клетку. Наиболее широко используемый эндодоменным компонентом является таковой из CD3-дзета, который содержит 3 ITAM. Он передает активационный сигнал в T-клетку после связывания антигена. CD3-дзета может не предоставлять полностью достаточный активационный сигнал и может быть необходима передача дополнительных костимуляторных сигналов. Например, химерный CD28 и OX40 можно использовать с CD3-дзета для того, чтобы передавать пролиферативный сигнал/сигнал выживания, или можно использовать вместе все три.

Когда T-клетка по настоящему изобретению содержит CAR с активирующим эндодоменом, он может содержать только эндодомен CD3-дзета, эндодомен CD3-дзета с таковым из любого из CD28 или OX40 или эндодомен CD28 и OX40 и эндодомен CD3-дзета.

Любой эндодомен, который содержит мотив ITAM, в этом изобретении может действовать в качестве активационного эндодомена. Известно, что некоторые белки содержат эндодомены с одним или несколькими мотивами ITAM. Примеры таких белков, среди прочего, включают эпсилон-цепь CD3, гамма-цепь CD3 и дельта-цепь CD3. Мотив ITAM можно легко распознавать как тирозин, отделенный от лейцина или изолейцина какими-либо двумя другими аминокислотами, дающими сигнатуру YxxL/I. Типично, но не всегда, два из этих мотивов разделены 6-8 аминокислотами в хвосте молекулы (YxxL/Ix(6-8)YxxL/I). Таким образом, специалист в данной области может легко найти существующие белки, которые содержат один или несколько ITAM, чтобы передавать активационный сигнал. Кроме того, данный мотив является простым, и сложная вторичная структура не требуется, специалист в данной области может конструировать полипептиды, содержащие искусственные ITAM для того, чтобы передавать активационн* сигнал (см. WO 2000063372, которая относится к синтетическим сигнальным молекулам).

T-клеточный трансмембраный и внутриклеточный сигнальный домен (эндодомен) в CAR с активирующим эндодоменом может содержать последовательность, представленную как SEQ ID № 15, 16 или 17 или ее вариант, который имеет по меньшей мере 80% идентичности последовательностей.

SEQ ID № 15, содержащая трансмембранный домен CD28 и эндодомен CD3 Z

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID № 16, содержащая трансмембранный домен CD28 и эндодомены CD28 и CD3-дзета

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID № 17, содержащая трансмембранный домен CD28 и эндодомены CD28, OX40 и CD3-дзета.

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

Вариант последовательности может иметь по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательностей с SEQ ID № 15, 16 или 17, при условии, что последовательность предусматривает эффективный трансмембранный домен и эффективный внутриклеточный домен T-клеточной сигнализации.

«ВЫКЛЮЧАЕМЫЙ ЛИГИРОВАНИЕМ» ИНГИБИРУЮЩИЙ ЭНДОДОМЕН

В варианте осуществления, указанном выше в качестве логического элемента И, один из CAR содержит ингибирующий эндодомен так, что ингибирующий CAR ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR в отсутствие лигирования ингибирующего CAR, но не значительно ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR, когда ингибирующий CAR лигирован. Это называют «выключаемым лигированием» ингибирующим эндодоменом.

В этом случае, спейсер ингибирующего CAR имеет длину, заряд, геометрическую форму и/или конфигурацию и/или гликозилирование, отличающиеся от спейсера активирующего CAR, так что когда оба рецептора лигированы, различия в размерах спейсеров ведут к выделению активирующих CAR и ингибирующих CAR в различные мембранные компартменты иммунологического синапса с тем, чтобы снять ингибирование активирующего эндодомена ингибирующим эндодоменом.

Следовательно, ингибирующие эндодомены для использования в выключаемом лигированием ингибирующем CAR могут содержать какую-либо последовательность, которая ингибирует T-клеточную сигнализацию с помощью активирующего CAR, когда она находится в том же мембранном компартменте (т. е. в отсутствие антигена для ингибирующего CAR), но которая не значительно ингибирует T-клеточную сигнализацию, когда она изолирована в отдельной части мембраны от ингибирующего CAR.

Выключаемый лигированием ингибирующий эндодомен может представлять собой или содержать тирозиновую фосфатазу, такую как рецептороподобная тирозиновая фосфатаза. Ингибирующий эндодомен может представлять собой или содержать любую тирозиновую фосфатазу, которая способна ингибировать передачу сигнала TCR, когда лигирован только стимулирующий рецептор. Ингибирующий эндодомен может представлять собой или содержать любую тирозиновую фосфатазу с достаточно высокой скоростью катализа для фосфорилированных ITAM, которая способна ингибировать передачу сигнала TCR, когда лигирован только стимулирующий рецептор.

Например, ингибирующий эндодомен логического элемента И может содержать эндодомен из CD148 или CD45. Показано, что CD148 и CD45 действует естественным путем на фосфорилированные тирозины выше по каскаду реакций от передачи сигнала TCR.

CD148 представляет собой рецептороподобную белковую тирозиновую фосфатазу, которая отрицательно регулирует передачу сигнала TCR посредством препятствования фосфорилированию и функционированию PLCγ1 и LAT.

CD45 присутствует на всех гематопоэтических клетках, представляет собой белковую тирозиновую фосфатазу, которая способна регулировать сигнальную трансдукцию и функциональные реации, также посредством фосфорилирования PLCγ1.

Ингибирующий эндодомен может содержать всю рецептороподобную тирозиновую фосфатазу или ее часть. Фосфатаза может препятствовать фосфорилированию и/или функционированию элементов, вовлеченных в передачу T-клеточных сигналов, таких как PLCγ1 и/или LAT.

Трансмембраный и эндодомен из CD45 и CD148 представлены как SEQ ID № 18 и № 19, соответственно.

SEQ ID 18 - последовательность трансмембранного и эндодомена CD45

ALIAFLAFLIIVTSIALLVVLYKIYDLHKKRSCNLDEQQELVERDDEKQLMNVEPIHADILLETYKRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQNKNRYVDILPYDYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIWEQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRAFGDVVVKINQHKRCPDYIIQKLNIVNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAENKVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPYLHNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSYRSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPYDYNRVPLKHELEMSKESEHDSDESSDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPEVMIAAQGPLKETIGDFWQMIFQRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKRKDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEPKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKSTPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLLESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSVNGPASPALNQGS

SEQ ID 19 - последовательность трансмембраного и эндодомена CD148

AVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA

Ингибирующий CAR может содержать всю SEQ ID № 18 или 19 или ее часть (например, он может содержать фосфатазную функцию эндодомена). Он может содержать вариант последовательности или ее части, имеющий по меньшей мере 80% идентичности последовательностей до тех пор, пока вариант сохраняет способность базово ингибировать передачу T-клеточных сигналов с помощью активирующего CAR.

Другие спейсеры и эндодомены можно тестировать, например, с использованием модельной системы, проиллюстрированной в настоящем документе. Популяции клеток-мишеней можно создавать посредством трансдукции подходящей клеточной линии, такой как клеточная линия SupT1, или однократно или двукратно для того, чтобы создавать клетки, негативные по обоим антигенам (дикого типа), положительные по любому и положительные по обоим (например CD19-CD33-, CD19+CD33-, CD19-CD33+ и CD19+CD33+). T-клетки, такие как линия Т-клеток мыши BW5147, которые высвобождают IL-2 при активации, можно трансдуцировать парами CAR, и измерять их способность функционировать в логическом элементе через измерение высвобождения IL-2 (например, с помощью ELISA). Например, в примере 4 показано, что оба эндодомена CD148 и CD45 могут выполнять функцию ингибирующих CAR в комбинации с активирующим CAR, содержащим дзета-эндодомен CD3. Эти CAR основаны на коротком/некрупном спейсере из «стебля» CD8 на одном CAR и крупном Fc спейсере на другом CAR, чтобы получать логическую функцию И. Когда оба рецептора лигированы, различие в размерах спейсеров ведет к выделению различных рецепторов в различные мембранные компартменты, что снимает ингибирование рецептора CD3-дзета эндодоменами CD148 или CD45. Таким образом, активация возникает только когда активируют оба рецептора. Можно легко видеть, что эту модульную систему можно использовать для того, чтобы тестировать альтернативные пары спейсеров и ингибирующих эндодоменов. Если спейсеры не достигают изоляции после лигирования обоих рецепторов, ингибирование не будет устранено и поэтому не произойдет активация. Если тестируемый ингибирующий эндодомен не эффективен, следует ожидать активации в присутствии лигирования активирующего CAR независимо от состояния лигирования ингибирующего CAR.

«ВКЛЮЧАЕМЫЙ ЛИГИРОВАНИЕМ» ЭНДОДОМЕН

В варианте осуществления, упомянутом выше в качестве логического элемента И НЕ, один из CAR содержит «включаемый лигированием» ингибирующий эндодомен так, что ингибирующий CAR не значительно ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR в отсутствие лигирования ингибирующего CAR, но ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR, когда ингибирующий CAR лигирован.

«Включаемый лигированием» ингибирующий эндодомен может представлять собой или содержать тирозиновую фосфатазу, которая не способна ингибировать передачу сигнала TCR, когда лигирован только стимулирующий рецептор.

«Включаемый лигированием» ингибирующий эндодомен может представлять собой или содержать тирозиновую фосфатазу с достаточно низкой скоростью катализа для фосфорилированных ITAM, которая не способна ингибировать передачу сигнала TCR, когда лигирован только стимулирующий рецептор, но она способна ингибировать ответ на передачу сигнала TCR, когда сконцентрирована в синапсе. Концентрация в синапс достигается через лигирование ингибирующего рецептора.

Если тирозиновая фосфатаза имеет скорость катализа, которая слишком велика для «включаемого лигированием» ингибирующего эндодомена, то возможно снижать скорость катализа фосфатазы через модификацию, такую как точечные мутации и короткие линкеры (которые вызывают стерические затруднения), чтобы делать ее подходящей для «включаемого лигированием» ингибирующего эндодомена.

В этом первом варианте осуществления эндодомен может представлять собой или содержать фосфатазу, которая значительно менее активна, чем CD45 или CD148, так что значимое дефосфорилирование ITAM возникает только когда активирующие и ингибирующие эндодомены совместно локализованы. В данной области известны многие подходящие последовательности. Например, ингибирующий эндодомен логического элемента НЕ И может содержать всю белковую тирозиновую фосфатазу, такую как PTPN6, или ее часть.

Белковые тирозиновые фосфатазы (PTP) представляют собой сигнальные молекулы, которые регулируют различные клеточные процессы, в том числе клеточный рост, дифференциацию, митотический цикл и онкогенная трансформация. N-концевая часть этой PTP содержит два тандемных гомологичных (SH2) домена Src, которые действуют в качестве белковых фосфотирозин-связывающих доменов и опосредуют взаимодействие этой PTP с ее субстратом. Эту PTP экспрессируют в первую очередь гематопоэтические клетки, и она функционирует в качестве важного регулятора множества путей передачи сигналов в гематопоэтических клетках.

Ингибирующий домен может содержать всю PTPN6 (SEQ ID № 20) или только фосфатазный домен (SEQ ID № 21).

SEQ ID 20 - последовательность PTPN6

MVRWFHRDLSGLDAETLLKGRGVHGSFLARPSRKNQGDFSLSVRVGDQVTHIRIQNSGDFYDLYGGEKFATLTELVEYYTQQQGVLQDRDGTIIHLKYPLNCSDPTSERWYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYYATRVNAADIENRVLELNKKQESEDTAKAGFWEEFESLQKQEVKNLHQRLEGQRPENKGKNRYKNILPFDHSRVILQGRDSNIPGSDYINANYIKNQLLGPDENAKTYIASQGCLEATVNDFWQMAWQENSRVIVMTTREVEKGRNKCVPYWPEVGMQRAYGPYSVTNCGEHDTTEYKLRTLQVSPLDNGDLIREIWHYQYLSWPDHGVPSEPGGVLSFLDQINQRQESLPHAGPIIVHCSAGIGRTGTIIVIDMLMENISTKGLDCDIDIQKTIQMVRAQRSGMVQTEAQYKFIYVAIAQFIETTKKKLEVLQSQKGQESEYGNITYPPAMKNAHAKASRTSSKHKEDVYENLHTKNKREEKVKKQRSADKEKSKGSLKRK

SEQ ID 21 - последовательность фосфатазного домена из PTPN6

FWEEFESLQKQEVKNLHQRLEGQRPENKGKNRYKNILPFDHSRVILQGRDSNIPGSDYINANYIKNQLLGPDENAKTYIASQGCLEATVNDFWQMAWQENSRVIVMTTREVEKGRNKCVPYWPEVGMQRAYGPYSVTNCGEHDTTEYKLRTLQVSPLDNGDLIREIWHYQYLSWPDHGVPSEPGGVLSFLDQINQRQESLPHAGPIIVHCSAGIGRTGTIIVIDMLMENISTKGLDCDIDIQKTIQMVRAQRSGMVQTEAQYKFIYVAIAQF

Второй вариант осуществления включаемого лигированием ингибирующего эндодомена представляет собой ITIM (иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив)-содержащий эндодомен, такой как таковой из CD22, LAIR-1, семейства рецепторов подавления цитотоксичности (KIR), LILRB1, CTLA4, PD-1, BTLA и т.д. Когда фосфорилированы, ITIM рекрутируют эндогенную PTPN6 через свой домен SH2. При совместной локализации с ITAM-содержащим эндодоменом, происходит дефосфорилирование и ингибирование активирующего CAR.

ITIM представляет собой консервативную последовательность аминокислот (S/I/V/LxYxxI/V/L), которую находят в цитоплазматических хвостах многих ингибирующих рецепторов иммунной системы. Специалист в данной области может легко найти белковые домены, содержащие ITIM. Список вероятных ITIM-содержащих белков человека создан посредством сканирования всего протеома (Staub, et al (2004) Cell. Signal. 16, 435-456). Кроме того, поскольку хорошо известна консенсусная последовательность и, по-видимому, необходима небольшая вторичная структура, специалист в данной области может создавать искусственные ITIM.

ITIM-эндодомены из PDCD1, BTLA4, LILRB1, LAIR1, CTLA4, KIR2DL1, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL1 и KIR3DL3 представлены в SEQ ID с 22 до 31, соответственно.

SEQ ID 22 эндодомен PDCD1

CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL

SEQ ID 23 BTLA4

KLQRRWKRTQSQQGLQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTLRFPEMNIPRTGDAESSEMQRPPPDCDDTVTYSALHKRQVGDYENVIPDFPEDEGIHYSELIQFGVGERPQAQENVDYVILKH

SEQ ID 24 LILRB1

LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH

SEQ ID 25 LAIR1

HRQNQIKQGPPRSKDEEQKPQQRPDLAVDVLERTADKATVNGLPEKDRETDTSALAAGSSQEVTYAQLDHWALTQRTARAVSPQSTKPMAESITYAAVARH

SEQ ID 26 CTLA4

FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN

SEQ ID 27 KIR2DL1

GNSRHLHVLIGTSVVIIPFAILLFFLLHRWCANKKNAVVMDQEPAGNRTVNREDSDEQDPQEVTYTQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP

SEQ ID 28 KIR2DL4

GIARHLHAVIRYSVAIILFTILPFFLLHRWCSKKKENAAVMNQEPAGHRTVNREDSDEQDPQEVTYAQLDHCIFTQRKITGPSQRSKRPSTDTSVCIELPNAEPRALSPAHEHHSQALMGSSRETTALSQTQLASSNVPAAGI

SEQ ID 29 KIR2DL5

TGIRRHLHILIGTSVAIILFIILFFFLLHCCCSNKKNAAVMDQEPAGDRTVNREDSDDQDPQEVTYAQLDHCVFTQTKITSPSQRPKTPPTDTTMYMELPNAKPRSLSPAHKHHSQALRGSSRETTALSQNRVASSHVPAAGI

SEQ ID 30 KIR3DL1

KDPRHLHILIGTSVVIILFILLLFFLLHLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP

SEQ ID 31 KIR3DL3

KDPGNSRHLHVLIGTSVVIIPFAILLFFLLHRWCANKKNAVVMDQEPAGNRTVNREDSDEQDPQEVTYAQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTSV

Третий вариант осуществления включаемого лигированием ингибирующего эндодомена представляет собой ITIM-содержащий эндодомен, совместно экспрессируемый со слитным белком. Слитный белок может содержать по меньшей мере часть белковой тирозиновой фосфатазы и по меньшей мере часть рецептороподобной тирозиновой фосфатазы. Слитная конструкция может содержать один или несколько доменов SH2 из белковой тирозиновой фосфатазы. Например, слитная конструкция может быть между доменом SH2 PTPN6 и эндодоменом CD45 или между доменом SH2 PTPN6 и эндодоменом CD148. Когда фосфорилированы, ITIM-домены рекрутируют слитный белок, приводя высоко активную фосфатазу CD45 или CD148 в непосредственную близость с активирующим эндодоменом, блокируя активацию.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ слитных белков перечислены 32 и 33

SEQ ID 32 слитный белок PTPN6-CD45

WYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYKIYDLHKKRSCNLDEQQELVERDDEKQLMNVEPIHADILLETYKRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQNKNRYVDILPYDYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIWEQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRAFGDVVVKINQHKRCPDYIIQKLNIVNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAENKVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPYLHNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSYRSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPYDYNRVLKHELEMSKESEHDSDESSDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPEVMIAAQGPLKETIGDFMIQRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKRKDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEPKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKSTPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLLESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSVNGPASPALNQGS

SEQ ID 33 слитный белок PTPN6-CD148

ETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA

Включаемый лигированием ингибирующий CAR может содержать всю SEQ ID № 20 или 21 или ее часть. Он может содержать всю SEQ ID с 22 до 31 или ее часть. Он может содержать всю SEQ ID с 22 до 31 или ее часть, совместно экспрессированную с любой SEQ ID 32 или 33. Он может содержать вариант последовательности или его часть, который имеет по меньшей мере 80% идентичности последовательностей, до тех пор, пока вариант сохраняет способность ингибировать T-клеточную сигнализацию с помощью активирующего CAR при лигировании ингибирующего CAR.

Как указано выше, альтернативные спейсеры и эндодомены можно тестировать, например, с использованием модельной системы, приведенной в качестве примера в настоящем документе. В примере 5 показано, что эндодомен PTPN6 может выполнять функцию полуингибирующего CAR в комбинации с активирующим CAR, который содержит дзета-эндодомен CD3. Эти CAR основаны на спейсере из «стебля» CD8 человека на одном CAR и спейсере из «стебля» CD8 мыши на другом CAR. Ортологичные последовательности препятствуют образованию перекрестных пар. Однако, когда оба рецептора лигирвоаны, сходство между спейсерами ведет к совместной сегрегации различных рецепторов в одних и тех же мембранных компартментах. Это ведет к ингибированию CD3 дзета рецептора эндодоменом PTPN6. Если лигирован только активирующий CAR, эндодомен PTPN6 не достаточно активен для того, чтобы предотвращать активацию T-клетки. Таким образом, активация происходит, если лигирован только активирующий CAR, а ингибирующий CAR не лигирован (логическая функция И НЕ). Можно легко видеть, что модульную систему можно использовать для того, чтобы тестировать альтернативные пары спейсеров и ингибирующие домены. Если спейсеры не достигают совместной сегрегации после лигирования обоих рецепторов, ингибирование не будет эффективным и, таким образом, будет происходить активация. Если тестируемый полуингибирующий эндодомен неэффективен, следует ожидать активации в присутствии лигирования активирующего CAR, независимо от состояния лигирования полуингибирующего CAR.

МЕСТО КОЭКСПРЕССИИ

Второй аспект изобретения относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует первый и второй CAR.

Нуклеиновая кислота может давать полипептид, который содержит две молекулы CAR, соединенные через сайт расщепления. Сайт расщепления может быть саморасщепляющимся, так что при получении полипептида, он незамедлительно расщепляется на первый и второй CAR без потребности в какой-либо внешней расщепляющей активности.

Известны различные саморасщепляющиеся сайты, в том числе саморасщепляющийся пептид 2a вируса ящура (FMDV), который имеет последовательность, представленную в качестве SEQ ID № 34:

SEQ ID № 34

RAEGRGSLLTCGDVEENPGP

Коэкспрессирующая последовательность может представлять собой внутреннюю последовательность связывания рибосомы (IRES). Коэкспрессирующая последовательность может представлять собой внутренний промотор.

КЛЕТКА

Первый аспект изобретения относится к клетке, которая совместно экспрессирует первый CAR и второй CAR на клеточной поверхности.

Клетка может представлять собой какую-либо эукариотическую клетка, способную экспрессировать CAR на поверхности клетки, такой как иммунная клетка.

В частности, клетка может представлять собой иммунную эффекторную клетку, такую как T-клетка или естественная киллерная (NK) клетка.

T-клетки или T-лимфоциты представляют собой тип лимфоцитов, который играет центральную роль в клеточно-опосредованном иммунитете. Их можно отличать от других лимфоцитов, таких как B-клетки и естественные киллерные клетки, с помощью присутствия T-клеточного рецептора (TCR) на клеточной поверхности. Существуют различные типы T-клетки, как кратко изложено далее.

T-хелперные клетки (TH клетки) помогают другим белым клеткам крови в иммунологических процессах, в том числе в созревании B-клеток в плазматические клетки и B-клетки памяти и активации цитотоксических T-клеток и макрофагов. На своей поверхности TH клетки экспрессируют CD4. Активация TH клеток происходит, когда молекулы MHC II класса на поверхности антигенпредставляющих клеток (APC) презентируют им пептидные антигены. Эти клетки можно отнести к одному из нескольких подтипов, в том числе TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 или TFH, которые секретируют различные цитокины для того, чтобы содействовать различными типам иммунного ответа.

Цитотоксические T-клетки (TC клетки или CTL) уничтожают инфицированные вирусами клетки и опухолевые клетки, и также участвуют в отторжении трансплантата. CTL экспрессируют CD8 на своей поверхности. Эти клетки распознают свои мишени посредством связывания с антигеном, связанным с MHC I класса, который присутствует на поверхности всех ядросодержащих клеток. Через IL-10, аденозин и другие молекулы, секретируемые регуляторными T-клетками, CD8+ клетки можно инактивировать до анергического состояния, которое препятствует аутоиммунным заболеваниям, таким как экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит.

T-клетки памяти представляют собой подмножество антигенспецифичных T-клеток, которые персистируют длительное время после разрешения инфекции. Они быстро размножаютя до большого числа эффекторных T-клеток при повторном воздействии их когнатного антигена, таким образом обеспечивая «память» иммунной системы о прошлых инфекциях. T-клетки памяти содержат три подтипа: центральные T-клетки памяти (TCM клетки) и два типа эффекторных T-клеток памяти (TEM клетки и TEMRA клетки). Клетки памяти могут быть или CD4+ или CD8+. T-клетки памяти типично экспрессируют белок клеточной поверхности CD45RO.

Регуляторные T-клетки (клетки Treg), ранее известные как супрессорные T-клетки, критически важны для поддержания иммунологической толерантности. Их основная роль состоит в том, чтобы переключать T-клеточно-опосредованный иммунитет в направлении окончания иммунной реакции и продавлять аутореактивные T-клетки, которые избежали процесса негативной селекции в тимусе.

Описано два основных класса CD4+ клеток Treg - встречающиеся в природе клетки Treg и адаптивные клетки Treg.

Встречающиеся в природе клетки Treg (также известные как CD4+CD25+FoxP3+ клетки Treg) образуются в тимусе и связаны с взаимодействиями развивающихся T-клеток как с миелоидными (CD11c+), так и с плазмоцитоидными (CD123+) дендритными клетками, которые активированы с использованием TSLP. Встречающиеся в природе клетки Treg можно отличать от других T-клеток по присутствию внутриклеточной молекулы, называемой FoxP3. Мутации гена FOXP3 могут препятствовать развитию регуляторных T-клеток, вызывая смертельное аутоиммунное заболевание IPEX.

Адаптивные клетки Treg (также известные как клетки Tr1 или клеткми Th3) могут появляться во время нормального иммунного ответа.

T-клетка по изобретению может относиться к любому из типов T-клеток, которые указаны выше, в частности, к CTL.

Естественные киллерные (NK) клетки относятся к типу цитолитических клеток, которые образуют часть врожденной иммунной системы. Естественные киллерные клетки обеспечивают быстрый ответ на врожденный сигнал от инфицированных вирусами клеток независимым от MHC образом.

Естественные киллерные клетки (относящиеся к группе врожденных лимфоидных клеток) определяют как большие гранулярные лимфоциты (LGL), который составляют третий тип клеток, дифференцированный от общего лимфоидного предшественника, образующего B- и T-лимфоциты. Известно, что естественные киллерные клетки дифференцируются и созревают в костном мозге, лимфатических узлах, селезенке, миндалинах и тимусе, где после этого они выходят в циркуляцию.

CAR клетки по изобретению могут относиться к любому указанному выше типу клеток.

CAR-экспрессирующие клетки, такие как CAR-экспрессирующие T-клетки или естественные киллерные клетки, можно или создавать ex vivo или брать из собственной периферической крови пациента (1-я сторона), или в условиях трансплантата гематопоэтических стволовых клеток из донорской периферической крови (2-я сторона) или периферической крови от неродственного донора (3-я сторона).

Настоящее изобретение также предусматривает клеточную композицию, которая содержит CAR-экспрессирующие T-клетки и/или CAR-экспрессирующие естественные киллерные клетки в соответствии с настоящим изобретением. Клеточную композицию можно создавать посредством трансдукции или трансфекции образца крови ex vivo с использованием нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением.

Альтернативно, CAR-экспрессирующие клетки можно получать путем дифференциации ex vivo индуцибельных клеток-предшественников или эмбриональных клетлк-предшественников в клетки релевантного типа, такие как T-клетки. Альтернативно, можно использовать бессмертную клеточную линию, такую как линия Т-клеток, которая сохраняет свою литическую функцию и может действовать в качестве терапевтического средства.

Во всех этих вариантах осуществления CAR клетки получают посредством введения ДНК или РНК, кодирующих CAR, с помощью одного из множества средств, включая трансдукцию с использованием вирусного вектора, трансфекцию с использованием ДНК или РНК.

CAR T-клетка по изобретению может представлять собой T-клетку ex vivo от субъекта. T-клетка может быть из образца мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). T-клетки можно активирвоать и/или размножать перед трансдукцией кодирующей CAR нуклеиновой кислотой, например, посредством обработки моноклональным антителом против CD3.

CAR T-клетку по изобретению можно создавать путем:

(i) выделения содержащего T-клетки образца у субъекта или из других источников, перечисленных выше; и

(ii) трансдукции или трансфекции T-клеток одной или несколькими последовательностями нуклеиновых кислот, которые кодируют первый и второй CAR.

Затем T-клетки можно очищать, например, отбирать на основании коэкспрессии первого и второго CAR.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Второй аспект изобретения относится к одной или нескольким последовательностям нуклеиновых кислот, которые кодируют первый CAR и второй CAR, как определено в первом аспекте изобретения.

Последовательность нуклеиновой кислоты может содержать одну из следующих последовательностей или ее вариант

SEQ ID 35 логический элемент ИЛИ

SEQ ID 36 логический элемент И с использованием CD45

SEQ ID 37 логический элемент И с использованием CD148

SEQ ID 38 логический элемент И НЕ с использованием PTPN6 в качестве эндодомена

SEQ ID 39 логический элемент И НЕ с использованием эндодомена LAIR1

SEQ ID 40 логический элемент И НЕ с использованием слитой конструкции LAIR1 и PTPN6 SH2 с фосфатазой CD148

SEQ ID № 35:

>MP13974.SFG.aCD19fmc63-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-HCH2CH3pvaa-CD28tmZw

SEQ ID № 36

>MP14802.SFG.aCD19fmc63_clean-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-HCH2CH3pvaa-dCD45

ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGCCGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGTTGCTACTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGACATCCAGATGACACAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGATCGCGTCACCATCACCTGTCGAGCAAGTGAGGACATTTATTTTAATTTAGTGTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATACAAATCGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCTCTGGATCTGGCACACAGTATACTCTAACCATAAGTAGCCTGCAACCCGAAGATTTCGCAACCTATTATTGTCAACACTATAAGAATTATCCGCTCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAAATCAAAAGATCTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGCGGAGGCAGCGGAGGCGGTGGCTCGGGAGGCGGAGGCTCGAGATCTGAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCTTGGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTCTCAGTAATTATGGCATGCACTGGATCAGGCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCGTCTATTAGTCTTAATGGTGGTAGCACTTACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGGGACAATGCAAAAAGCACCCTCTACCTTCAAATGAATAGTCTGAGGGCCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGCAGCACAGGACGCTTATACGGGAGGTTACTTTGATTACTGGGGCCAAGGAACGCTGGTCACAGTCTCGTCTATGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCAGGCAAGAAGGACCCCAAGGCACTGATAGCATTTCTGGCATTTCTGATTATTGTGACATCAATAGCCCTGCTTGTTGTTCTCTACAAAATCTATGATCTACATAAGAAAAGATCCTGCAATTTAGATGAACAGCAGGAGCTTGTTGAAAGGGATGATGAAAAACAACTGATGAATGTGGAGCCAATCCATGCAGATATTTTGTTGGAAACTTATAAGAGGAAGATTGCTGATGAAGGAAGACTTTTTCTGGCTGAATTTCAGAGCATCCCGCGGGTGTTCAGCAAGTTTCCTATAAAGGAAGCTCGAAAGCCCTTTAACCAGAATAAAAACCGTTATGTTGACATTCTTCCTTATGATTATAACCGTGTTGAACTCTCTGAGATAAACGGAGATGCAGGGTCAAACTACATAAATGCCAGCTATATTGATGGTTTCAAAGAACCCAGGAAATACATTGCTGCACAAGGTCCCAGGGATGAAACTGTTGATGATTTCTGGAGGATGATTTGGGAACAGAAAGCCACAGTTATTGTCATGGTCACTCGATGTGAAGAAGGAAACAGGAACAAGTGTGCAGAATACTGGCCGTCAATGGAAGAGGGCACTCGGGCTTTTGGAGATGTTGTTGTAAAGATCAACCAGCACAAAAGATGTCCAGATTACATCATTCAGAAATTGAACATTGTAAATAAAAAAGAAAAAGCAACTGGAAGAGAGGTGACTCACATTCAGTTCACCAGCTGGCCAGACCACGGGGTGCCTGAGGATCCTCACTTGCTCCTCAAACTGAGAAGGAGAGTGAATGCCTTCAGCAATTTCTTCAGTGGTCCCATTGTGGTGCACTGCAGTGCTGGTGTTGGGCGCACAGGAACCTATATCGGAATTGATGCCATGCTAGAAGGCCTGGAAGCCGAGAACAAAGTGGATGTTTATGGTTATGTTGTCAAGCTAAGGCGACAGAGATGCCTGATGGTTCAAGTAGAGGCCCAGTACATCTTGATCCATCAGGCTTTGGTGGAATACAATCAGTTTGGAGAAACAGAAGTGAATTTGTCTGAATTACATCCATATCTACATAACATGAAGAAAAGGGATCCACCCAGTGAGCCGTCTCCACTAGAGGCTGAATTCCAGAGACTTCCTTCATATAGGAGCTGGAGGACACAGCACATTGGAAATCAAGAAGAAAATAAAAGTAAAAACAGGAATTCTAATGTCATCCCATATGACTATAACAGAGTGCCACTTAAACATGAGCTGGAAATGAGTAAAGAGAGTGAGCATGATTCAGATGAATCCTCTGATGATGACAGTGATTCAGAGGAACCAAGCAAATACATCAATGCATCTTTTATAATGAGCTACTGGAAACCTGAAGTGATGATTGCTGCTCAGGGACCACTGAAGGAGACCATTGGTGACTTTTGGCAGATGATCTTCCAAAGAAAAGTCAAAGTTATTGTTATGCTGACAGAACTGAAACATGGAGACCAGGAAATCTGTGCTCAGTACTGGGGAGAAGGAAAGCAAACATATGGAGATATTGAAGTTGACCTGAAAGACACAGACAAATCTTCAACTTATACCCTTCGTGTCTTTGAACTGAGACATTCCAAGAGGAAAGACTCTCGAACTGTGTACCAGTACCAATATACAAACTGGAGTGTGGAGCAGCTTCCTGCAGAACCCAAGGAATTAATCTCTATGATTCAGGTCGTCAAACAAAAACTTCCCCAGAAGAATTCCTCTGAAGGGAACAAGCATCACAAGAGTACACCTCTACTCATTCACTGCAGGGATGGATCTCAGCAAACGGGAATATTTTGTGCTTTGTTAAATCTCTTAGAAAGTGCGGAAACAGAAGAGGTAGTGGATATTTTTCAAGTGGTAAAAGCTCTACGCAAAGCTAGGCCAGGCATGGTTTCCACATTCGAGCAATATCAATTCCTATATGACGTCATTGCCAGCACCTACCCTGCTCAGAATGGACAAGTAAAGAAAAACAACCATCAAGAAGATAAAATTGAATTTGATAATGAAGTGGACAAAGTAAAGCAGGATGCTAATTGTGTTAATCCACTTGGTGCCCCAGAAAAGCTCCCTGAAGCAAAGGAACAGGCTGAAGGTTCTGAACCCACGAGTGGCACTGAGGGGCCAGAACATTCTGTCAATGGTCCTGCAAGTCCAGCTTTAAATCAAGGTTCATAG

SEQ ID № 37:

>MP14801.SFG.aCD19fmc63_clean-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-HCH2CH3pvaa-dCD148

ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGCCGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGTTGCTACTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGACATCCAGATGACACAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGATCGCGTCACCATCACCTGTCGAGCAAGTGAGGACATTTATTTTAATTTAGTGTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATACAAATCGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCTCTGGATCTGGCACACAGTATACTCTAACCATAAGTAGCCTGCAACCCGAAGATTTCGCAACCTATTATTGTCAACACTATAAGAATTATCCGCTCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAAATCAAAAGATCTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGCGGAGGCAGCGGAGGCGGTGGCTCGGGAGGCGGAGGCTCGAGATCTGAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCTTGGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTCTCAGTAATTATGGCATGCACTGGATCAGGCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCGTCTATTAGTCTTAATGGTGGTAGCACTTACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGGGACAATGCAAAAAGCACCCTCTACCTTCAAATGAATAGTCTGAGGGCCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGCAGCACAGGACGCTTATACGGGAGGTTACTTTGATTACTGGGGCCAAGGAACGCTGGTCACAGTCTCGTCTATGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCAGGCAAGAAGGACCCCAAGGCGGTTTTTGGCTGTATCTTTGGTGCCCTGGTTATTGTGACTGTGGGAGGCTTCATCTTCTGGAGAAAGAAGAGGAAAGATGCAAAGAATAATGAAGTGTCCTTTTCTCAAATTAAACCTAAAAAATCTAAGTTAATCAGAGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTCAAGAAGCAGCAAGCTGACTCCAACTGTGGGTTCGCAGAGGAATACGAAGATCTGAAGCTTGTTGGAATTAGTCAACCTAAATATGCAGCAGAACTGGCTGAGAATAGAGGAAAGAATCGCTATAATAATGTTCTGCCCTATGATATTTCCCGTGTCAAACTTTCGGTCCAGACCCATTCAACGGATGACTACATCAATGCCAACTACATGCCTGGCTACCACTCCAAGAAAGATTTTATTGCCACACAAGGACCTTTACCGAACACTTTGAAAGATTTTTGGCGTATGGTTTGGGAGAAAAATGTATATGCCATCATTATGTTGACTAAATGTGTTGAACAGGGAAGAACCAAATGTGAGGAGTATTGGCCCTCCAAGCAGGCTCAGGACTATGGAGACATAACTGTGGCAATGACATCAGAAATTGTTCTTCCGGAATGGACCATCAGAGATTTCACAGTGAAAAATATCCAGACAAGTGAGAGTCACCCTCTGAGACAGTTCCATTTCACCTCCTGGCCAGACCACGGTGTTCCCGACACCACTGACCTGCTCATCAACTTCCGGTACCTCGTTCGTGACTACATGAAGCAGAGTCCTCCCGAATCGCCGATTCTGGTGCATTGCAGTGCTGGGGTCGGAAGGACGGGCACTTTCATTGCCATTGATCGTCTCATCTACCAGATAGAGAATGAGAACACCGTGGATGTGTATGGGATTGTGTATGACCTTCGAATGCATAGGCCTTTAATGGTGCAGACAGAGGACCAGTATGTTTTCCTCAATCAGTGTGTTTTGGATATTGTCAGATCCCAGAAAGACTCAAAAGTAGATCTTATCTACCAGAACACAACTGCAATGACAATCTATGAAAACCTTGCGCCCGTGACCACATTTGGAAAGACCAATGGTTACATCGCCTAA

SEQ ID № 38

>16076.SFG.aCD19fmc63-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-muCD8STK-tm-dPTPN6

SEQ ID № 39

>MP16091.SFG.aCD19fmc63-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-muCD8STK-LAIR1tm-endo

SEQ ID № 40

>MP16092.SFG.aCD19fmc63-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-muCD8STK-LAIR1tm-endo-2A-PTPN6_SH2-dCD148

ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGCCGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGTTGCTACTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGACATCCAGATGACACAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGATCGCGTCACCATCACCTGTCGAGCAAGTGAGGACATTTATTTTAATTTAGTGTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATACAAATCGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCTCTGGATCTGGCACACAGTATACTCTAACCATAAGTAGCCTGCAACCCGAAGATTTCGCAACCTATTATTGTCAACACTATAAGAATTATCCGCTCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAAATCAAAAGATCTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGCGGAGGCAGCGGAGGCGGTGGCTCGGGAGGCGGAGGCTCGAGATCTGAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCTTGGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTCTCAGTAATTATGGCATGCACTGGATCAGGCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCGTCTATTAGTCTTAATGGTGGTAGCACTTACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGGGACAATGCAAAAAGCACCCTCTACCTTCAAATGAATAGTCTGAGGGCCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGCAGCACAGGACGCTTATACGGGAGGTTACTTTGATTACTGGGGCCAAGGAACGCTGGTCACAGTCTCGTCTATGGATCCCGCCACCACAACCAAGCCCGTGCTGCGGACCCCAAGCCCTGTGCACCCTACCGGCACCAGCCAGCCTCAGAGACCCGAGGACTGCCGGCCTCGGGGCAGCGTGAAGGGCACCGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATTCTCATCGGGGTCTCAGTGGTCTTCCTCTTCTGTCTCCTCCTCCTGGTCCTCTTCTGCCTCCATCGCCAGAATCAGATAAAGCAGGGGCCCCCCAGAAGCAAGGACGAGGAGCAGAAGCCACAGCAGAGGCCTGACCTGGCTGTTGATGTTCTAGAGAGGACAGCAGACAAGGCCACAGTCAATGGACTTCCTGAGAAGGACCGGGAGACCGACACCAGCGCCCTGGCTGCAGGGAGTTCCCAGGAGGTGACGTATGCTCAGCTGGACCACTGGGCCCTCACACAGAGGACAGCCCGGGCTGTGTCCCCACAGTCCACAAAGCCCATGGCCGAGTCCATCACGTATGCAGCCGTTGCCAGACACAGGGCAGAAGGAAGAGGTAGCCTGCTGACTTGCGGGGACGTGGAAGAGAACCCAGGGCCATGGTATCATGGCCACATGTCTGGCGGGCAGGCAGAGACGCTGCTGCAGGCCAAGGGCGAGCCCTGGACGTTTCTTGTGCGTGAGAGCCTCAGCCAGCCTGGAGACTTCGTGCTTTCTGTGCTCAGTGACCAGCCCAAGGCTGGCCCAGGCTCCCCGCTCAGGGTCACCCACATCAAGGTCATGTGCGAGGGTGGACGCTACACAGTGGGTGGTTTGGAGACCTTCGACAGCCTCACGGACCTGGTGGAGCATTTCAAGAAGACGGGGATTGAGGAGGCCTCAGGCGCCTTTGTCTACCTGCGGCAGCCGTACAGCGGTGGCGGTGGCAGCTTTGAGGCCTACTTCAAGAAGCAGCAAGCTGACTCCAACTGTGGGTTCGCAGAGGAATACGAAGATCTGAAGCTTGTTGGAATTAGTCAACCTAAATATGCAGCAGAACTGGCTGAGAATAGAGGAAAGAATCGCTATAATAATGTTCTGCCCTATGATATTTCCCGTGTCAAACTTTCGGTCCAGACCCATTCAACGGATGACTACATCAATGCCAACTACATGCCTGGCTACCACTCCAAGAAAGATTTTATTGCCACACAAGGACCTTTACCGAACACTTTGAAAGATTTTTGGCGTATGGTTTGGGAGAAAAATGTATATGCCATCATTATGTTGACTAAATGTGTTGAACAGGGAAGAACCAAATGTGAGGAGTATTGGCCCTCCAAGCAGGCTCAGGACTATGGAGACATAACTGTGGCAATGACATCAGAAATTGTTCTTCCGGAATGGACCATCAGAGATTTCACAGTGAAAAATATCCAGACAAGTGAGAGTCACCCTCTGAGACAGTTCCATTTCACCTCCTGGCCAGACCACGGTGTTCCCGACACCACTGACCTGCTCATCAACTTCCGGTACCTCGTTCGTGACTACATGAAGCAGAGTCCTCCCGAATCGCCGATTCTGGTGCATTGCAGTGCTGGGGTCGGAAGGACGGGCACTTTCATTGCCATTGATCGTCTCATCTACCAGATAGAGAATGAGAACACCGTGGATGTGTATGGGATTGTGTATGACCTTCGAATGCATAGGCCTTTAATGGTGCAGACAGAGGACCAGTATGTTTTCCTCAATCAGTGTGTTTTGGATATTGTCAGATCCCAGAAAGACTCAAAAGTAGATCTTATCTACCAGAACACAACTGCAATGACAATCTATGAAAACCTTGCGCCCGTGACCACATTTGGAAAGACCAATGGTTACATCGCCAGCGGTAGCTAA

Последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать ту же аминокислотную последовательность, как та, которую кодирует SEQ ID № 35, 36, 37, 38, 39 или 40, но может иметь отличающуюся последовательность нуклеиновой кислоты из-за вырожденности генетического кода. Последовательность нуклеиновой кислоты может иметь по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности с последовательностью, представленной в качестве SEQ ID № 35, 36, 37, 38, 39 или 40, при условии, что она кодирует первый CAR и второй CAR, как определено в первом аспекте изобретения.

ВЕКТОР

Настоящее изобретение также относится к вектору или набору векторов, которые содержат одну или несколько CAR-кодирующих последовательностей нуклеиновых кислот. Такой вектор можно использовать для того, чтобы вводить последовательность (последовательности) нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина с тем, чтобы она экспрессировала первый и второй CAR.

Вектор может представлять собой, например, плазмидный или вирусный вектор, такой как ретровирусный вектор или лентивирусный вектор, или вектор на основе транспозона или синтетическую мРНК.

Вектор может быть способен к трансфекции или трансдукции T-клетки.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая содержит множество CAR-экспрессирующих клеток, таких как T-клетки или естественные киллерные клетки, в соответствии с первым аспектом изобретения. Фармацевтическая композиция дополнительно может содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент. Фармацевтическая композиция необязательно может содержать один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений. Такой состав, например, может быть в форме, подходящей для внутривенной инфузии.

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ

T-клетки по настоящему изобретению могут быть способны уничтожать клетки-мишени, такие как клетки злокачественной опухоли. Клетка-мишень может быть распознана с помощью определенного паттерна антигенной экспрессии, например, экспрессии антигена A И антигена B; экспрессии антигена A ИЛИ антигена B; или экспрессии антигена A И НЕ антигена B или комплексных итераций этих логических элементов.

T-клетки по настоящему изобретению можно использовать для лечения инфекции, такой как вирусная инфекция.

T-клетки по изобретению также можно использовать для управления патогенными иммунными ответами, например, при аутоиммунных заболеваниях, аллергиях и реакциях трансплантат против хозяина.

T-клетки по изобретению можно использовать для лечения злокачественных заболеваний, таких как злокачественная опухоль мочевого пузыря, злокачественная опухоль молочной железы, злокачественная опухоль ободочной кишки, злокачественная опухоль эндометрия, злокачественная опухоль почки (клеток почки), лейкоз, злокачественная опухоль легких, меланома, неходжкинская лимфома, злокачественная опухоль поджелудочной железы, злокачественная опухоль предстательной железы и злокачественная опухоль щитовидной железы.

В частности, это подходит для лечения солидных опухолей, когда доступность хороших избирательных одинарных мишеней ограничена.

T-клетки по изобретению можно использовать для того, чтобы лечить: злокачественные опухоли полости рта и глотки, которые включают злокачественную опухоль языка, рта и глотки; злокачественные опухоли пищеварительной системы, которые включают злокачественные опухоли пищевода, желудка и толстой кишки; злокачественные опухоли печени и желчных протоков, которые включают гепатоцеллюлярные карциномы и холангиокарциномы; злокачественные опухоли дыхательной системы, которые включают бронхогенные злокачественные опухоли и злокачественные опухоли гортани; злокачественные опухоли костей и суставов, которые включают остеосаркому; злокачественные опухоли кожи, которые включают меланому; злокачественную опухоль молочной железы; злокачественные опухоли полового тракта, которые включают злокачественные опухоли матки, яичников и шейки матки у женщин, злокачественные опухоли предстательной железы и яичек у мужчин; злокачественные опухоли мочевыделительной системы, которые включают почечноклеточную карциному и переходно-клеточные карциномы уретры или мочевого пузыря; злокачественные опухоли головного мозга, включая глиомы, мультиформную глиобластому и медуллобластомы; злокачественные опухоли эндокринной системы, включая злокачественную опухоль щитовидной железы, карциному надпочечника, и злокачественные опухоли, связанные с синдромами множественных эндокринных новообразований; лимфомы, включая лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому; множественную миелому и плазмоцитомы; лейкозы, как острые, так и хронические, миелоидные или лимфоидные; и злокачественные опухоли других и неустановленных мест, включая нейробластому.

Лечение с использованием T-клеток по изобретению может помогать предотвращать ускользание или освобождение опухолевых клеток, которые часто возникают при стандартных подходах.

Далее изобретение дополнительно описано в виде примеров, которые должны служить в качестве помощи специалисту в данной области при выполнении изобретения и не предназначены каким-либо образом ограничивать объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - создание популяций клеток-мишеней

С целью подтверждения принципа изобретения произвольно выбирали рецепторы на основании средств против CD19 и против CD33. Используя ретровирусные векторы, клонировали CD19 и CD33. Эти белки усекали с тем, чтобы они не передавали сигнал и могли быть стабильно экспрессированы в течение длительных периодов. Затем эти векторы использовали для трансдукции клеточной линии SupT1, или однократно или двукратно, чтобы создавать клетки, негативные по обоим антигенам (дикого типа), положительные по любому и положительные по обоим. Экспрессионные данные представлены на фиг. 3.

Пример 2 - конструкция и функция логического элемента ИЛИ

Для того чтобы конструировать логический элемент ИЛИ, совместно экспрессировали пару рецепторов, распознающих CD19 и CD33. Различные спейсеры использовали для того, чтобы предотвращать образование перекрестных пар. Оба рецептора имели трансмембранный домен, полученный из CD28, чтобы повышать поверхностную стабильность, и эндодомен, полученный из такового в CD3 дзета, чтобы предоставлять простой активирующий сигнал. Таким образом, совместно экспрессировали пару независимых CAR первого поколения. В ретровирусной векторной кассете, используемой для того, чтобы совместно экспрессировать последовательности, используют саморасщепляющийся пептид 2A вируса ящура, чтобы сделать возможным коэкспрессию обоих рецепторов 1:1. Конструкция кассеты показана на фиг. 4, а структуры белков на фиг. 5. В нуклеотидную последовательность гомологичных областей вносили неоднозначность кодонов для того, чтобы предотвращать рекомбинацию во время обратной транскрипции ретровирусного вектора.

Пример 3 - тестирование логического элемента ИЛИ

Экспрессию обоих CAR тестировали на поверхности T-клеток посредством окрашивания когнатным антигеном, слитым с Fc. Используя Fc домены различных видов (мышиные для CD19 и кроличьи для CD33), коэкспрессию обоих CAR определяли на клеточной поверхности посредством окрашивания различными вторичными антителами, конъюгированными с различными флуорофорами. Это показано на фиг. 6.

Затем осуществляли функциональное тестирование с использованием линии Т-клеток мыши BW5147. Эта клеточная линия секретирует IL-2 при активации, что делает возможным простое количественное считывание. Эти T-клетки совместно культивировали с возрастающими количествами искусственных клеток-мишеней, описанных выше. T-клетки реагировали на клетки-мишени, экспрессирующие их антиген, как показано с помощью секреции IL-2, измеряемой посредством ELISA. Показана экспрессия обоих CAR на клеточных поверхностях и показано, что T-клетки реагировали на любой или оба антигена. Эти данные представлены на фиг. 7.

Пример 4 - конструкция и функция логического элемента И

Логический элемент И объединяет простой активирующий рецептор с рецептором, который осуществляет базовое ингибирование активности, но у которого ингибирование выключается, когда рецептор лигирован. Этого достигали посредством объединения стандартного CAR первого поколения с коротким/некрупным спейсером из «стебля» CD8 и дзета-эндодоменом CD3 со вторым рецептором с крупным Fc спейсером, эндодомен которого содержал или эндодомен CD148 или эндодомен CD45. Когда оба рецептора лигированы, различия в размерах спейсеров ведут к выделению различных рецепторов в различные мембранные компартменты, устранению ингибирования CD3 дзета рецептора с помощью эндодоменов CD148 или CD45. Таким образом, активация происходит только когда активируют оба рецептора. Для этого выбрали CD148 и CD45, поскольку они функционируют так нативным образом: например, очень крупный CD45 эктодомен исключает весь рецептор из иммунологического синапса. Экспрессирующая кассета изображена на фиг. 8 и последующие белки на фиг. 9.

Окрашивание поверхности по другой специфичности демонстрировало, что обе пары рецепторов могут быть эффективно экспрессированы на клеточной поверхности, представленной на фиг. 10. Функционирование в BW5147 показывает, что активация T-клеток происходит только в присутствии обоих антигенов (фиг. 11).

Пример 5: демонстрация генерализуемости логического элемента И

Чтобы гарантировать, что наблюдения не представляли собой манифестацию некоторой конкретной характеристики CD19/CD33 и использованных их связывающих средств, два направленных scFv меняли местами так, что после этого передача активирующего (ITAM) сигнала происходила при распознавании CD33 вместо CD19; а передача ингибирующего (CD148) сигнала происходила при распознавании CD19 вместо CD33. Поскольку эндодомены CD45 и CD148 считают функционально схожими, эксперименты ограничивали логическими элементами И с эндодоменом CD148. Это все еще должно давать функциональный логический элемент И. T-клетки, экспрессирующие новый логический элемент, стимулировали мишенями, несущими отдельно CD19 или CD33 или их оба. T-клетки отвечали на мишени, экспрессирующие как CD19, так и CD33, но не на мишени, экспрессирующие только один или ни одного из этих антигенов. Это демонстрирует, что логический элемент И все еще функционален в этом формате (фиг. 18B).

На тех же линиях предполагали установить, насколько генерализуемым является логический элемент И: логический элемент И должен быть генерализуемым среди различных мишеней. Хотя может иметь место меньшая или большая точность логического элемента с учетом относительной антигенной плотности, кинетики когнатного связывания scFv и конкретного расстояния до связывающего эпитопа scFv, следует ожидать увидеть некоторые манифестации логического элемента И с широким набором мишеней и связывающих средств. Для того чтобы тестировать это, создавали три дополнительных логических элемента И. Еще раз, эксперименты ограничивали версией логического элемента И с CD148. Второй scFv из исходного логического элемента И с CD148 заменяли на scFv huK666 против GD2 (SEQ ID 41 и SEQ ID 42) или на scFv против CD5 (SEQ ID 43 и SEQ ID 44) или scFv MR1.1 против EGFRvIII (SEQ ID 45 И SEQ ID 46) для того, чтобы создавать следующие CAR логические элементы И: CD19 И GD2; CD19 И CD5; CD19 И EGFRvIII. Также создавали следующие искусственные экспрессирующие антиген клеточные линии: посредством трансдукции SupT1 и SupT1.CD19 по изобретению синтазами GM3 и GD2 создавали SupT1.GD2 и SupT1.CD19.GD2. Посредством трансдукции SupT1 и SupT1.CD19 ретровирусным вектором, кодирующим EGFRvIII, создавали SupT1.EGFRvIII и SupT1.CD19.EGFRvIII. Поскольку CD5 экспрессирован на клетках SupT1, использовали другую клеточную линию для того, чтобы создавать клетки-мишени: создавали 293T клетки, которые экспрессируют только CD19, только CD5 и вместе CD5 и CD19. Экспрессию подтверждали с помощью проточной цитометрии (фиг. 19). T-клетки, экспрессирующие три новых CAR логических элемента И, стимулировали с использованием SupT1.CD19 и соответствующих когнатных двойных положительных и одинарных положительных клеток-мишеней. Все три логических элемента И демонстрировали пониженную активацию двойными положительными клеточными линиями в сравнении с одинарными положительными мишенями (фиг. 20). Это демонстрирует генерализуемость конструкции логического элемента И на произвольные мишени и когнатные связывающие средства.

Пример 6: экспериментальное подтверждение модели кинетической сегрегации CAR логического элемента И

Цель заключалась в подтверждении моделированием того, что дифференциальная сегрегация, обусловленная различными спейсерами, представляет собой центральный механизм, лежаший в основе способности генерировать эти CAR логические элементы. Модель представляет собой то, что если лигирован только активирующий CAR, сильный ингибирующий «выключаемый лигированием» CAR находится в растворе в мембране и может ингибировать активирующий CAR. Когда лигированы оба CAR, если оба CAR спейсера достаточно различны, они будут сегрегироваться в синапсе и не локализоваться совместно. Таким образом, ключевое требование состоит в том, чтобы спейсеры было достаточно различными. Если модель верна, если оба спейсера достаточно схожи, что они были совместно локализованы, когда оба рецептора лигированы, логический элемент не сможет функционировать. Для того чтобы тестировать это, «крупный» Fc спейсер в исходом CAR заменяли на мышиный CD8 спейсер. Предсказано, что он имеет схожую длину, объем и заряд с CD8 человека, но при этом не образует перекрестных пар с ним. Таким образом, новый логический элемент имел первый CAR, который распознает CD19, спейсер «стебля» CD8 человека и активирующий эндодомен; тогда как второй CAR распознает CD33, имеет спейсер «стебля» CD8 мыши и эндодомен CD148 (фиг. 18C). T-клетки трансдуцировали для того, чтобы экспрессировать этот новый CAR логический элемент. Затем эти T-клетки стимулировали клетками SupT1, экспрессирующими только CD19, только CD33 или оба CD19 и CD33 вместе. T-клетки не отвечали на клетки SupT1, экспрессирующие любой антиген отдельно, как и исходный логический элемент И. Однако CAR T-клетки не могли отвечать на клетки SupT1, экспрессирующие оба антигена, тем самым подтверждая модель (фиг. 18C). Для функционального логического элемента И необходимо, чтобы оба CAR имели спейсеры, достаточно различные, чтобы они не локализовались совместно в иммунологическом синапсе (фиг. 23A и B).

Пример 7 - Конструкция и функция логического элемента И НЕ

Фосфатазы, такие как CD45 и CD148, достаточно активны, чтобы даже малое количество, входящее в иммунологический синапс, могло ингибировать ITAM активацию. Это является основной ингибирования логического элемента И. Другие классы фосфатаз не настолько активны, например, PTPN6 и родственные фосфатазы. Предсказано, что небольшое количество PTPN6, попадающее в синапс посредством диффузии, не будет ингибировать активацию. Кроме того, предсказано, что если ингибирующий CAR имеет достаточно схожи спейсер с активирующим CAR, они могут локализоваться совместно в синапсе, если оба CAR лигированы. В этом случае большие количества ингибирующего эндодомена будут достаточны для того, чтобы останавливать ITAM активацию, когда оба антигена присутствуют. Таким образом, можно создавать логический элемент И НЕ.

Для логического элемента НЕ И второй сигнал должен запрещать активацию. Это выполняют посредством привнесения ингибирующего сигнала в иммунологический синапс, например, посредством привнесения фосфатазы фермента, такого как PTPN6. Таким образом, авторы изобретения создавали начальный логический элемент И НЕ следующим образом: совместно экспрессировали два CAR, где первый распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и активирующий эндодомен; и CAR против CD33 со спейсером «стебля» CD8 мыши и эндодоменом, который содержит каталитический домен из PTPN6 (SEQ ID 38, фиг. 13A и B). На фиг. 12 представлена подходящая кассета, а на фиг. 14 представлены предварительные функциональные данные.

Кроме того, для создания логического элемента И НЕ разрабатывали альтернативную стратегию. Иммунорецепторные тирозиновые ингибирующие мотивы (ITIM) активировали подобно ITAM в том отношении, что они становятся фосфорилированными с помощью lck при кластеризации и исключении фосфатаз. Взамен запуска активации посредством связывания ZAP70, фосфорилированные ITIM привлекают фосфатазы, такие как PTPN6, через их когнатные домены SH2. ITIM может выполнять функцию ингибирующего эндодомена до тех пор, пока спейсеры на активирующих и ингибирующих CAR могут локализоваться совместно. Для того чтобы создать эту конструкцию, логический элемент И НЕ создавали следующим образом: совместно экспрессировали два CAR - первый распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и активирующий эндодомен; и CAR против CD33 со спейсером «стебля» CD8 мыши и ITIM-содержащим эндодоменом, полученным из такового из LAIR1 (SEQ ID 39, фиг. 13A и C).

Также разрабатывали более сложный логический элемент И НЕ также, посредством чего ITIM усиливали с помощью присутствия дополнительного химерного белка: внутриклеточное слияние домена SH2 из PTPN6 и эндодомена из CD148. В этой конструкции экспрессируют три белка - первый распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и активирующий эндодомен; совместно экспрессировали с CAR против CD33 со спейсером «стебля» CD8 мыши и ITIM-содержащим эндодоменом, полученным из такового из LAIR1. Дополнительный пептид 2A делает возможной коэкспрессию слитного белка PTPN6-CD148 (SEQ ID 40, фиг. 13A и D). Предсказано, что эти логические элементы И НЕ будут иметь различный диапазон ингибирования: PTPN6-CD148 > PTPN6 >> ITIM.

T-клетки трансдуцировали с использованием этих логических элементов и стимулировали мишенями, экспрессирующими отдельно CD19 или CD33 или оба CD19 и CD33 вместе. Все три логических элемента отвечали на мишени, экспрессирующие только CD19, но не мишени, экспрессирующие оба CD19 и CD33 вместе (фиг. 21), что подтверждало, что все три логических элемента И НЕ были функциональны.

Пример 8: экспериментальное подтверждение модели кинетической сегрегации логического элемента И НЕ на основе PTPN6.

Модель логического элемента И НЕ основана на том факте, что свойства спейсеров, используемых в обоих CAR, являются ключевыми для правильного функционирования логического элемента. В функциональном логическом элементе И НЕ с использованием PTPN6, оба спейсера CAR достаточно схожи, чтобы, когда оба CAR лигированы, оба совместно локализовались в синапсе, так что высокая концентрация даже слабой PTPN6 является достаточной для того, чтобы ингибировать активацию. Если спейсеры различны, сегрегация в синапсе будет изолировать PTPN6 от ITAM, что делает возможной активацию, нарушающую логический элемент И НЕ. Для того чтобы тестировать это, создавали контроль, в котором заменяли мышиный спейсер из «стебля» CD8 на таковой из Fc. В этом случае, тестовый логический элемент состоял из двух CAR, первый распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и ITAM эндодомен; тогда как второй CAR распознает CD33, имеет Fc спейсер и эндодомен, состоящий из фосфатазы из PTPN6. Этот логический элемент активирует в ответ на CD19, но также активирует в ответ на CD19 и CD33 вместе (фиг. 22B, где функционирование этого логического элемента сравнивают с таковой у исходного И НЕ и контрольного варианта логического элемента И, описанного в примере 6). Эти экспериментальные данные подтверждают модель, в которой для функционального логического элемента И НЕ с использованием PTPN6 необходимы совместно локализующие спейсеры.

Пример 9: экспериментальное подтверждение модели кинетической сегрегации логического элемента И НЕ на основе ITIM.

Подобно логическому элементу И НЕ на основе PTPN6, для логического элемента на основе ITIM также необходима совместная локализация в иммунологическом синапсе, чтобы функционировать в качестве логического элемента И НЕ. Чтобы подтвердить эту гипотезу, создавали контрольный логический элемент на основе ITIM следующим образом: совместно экспрессировали два CAR - первый распознает CD19, имеет спейсер «стебля» CD8 человека и активирующий эндодомен; второй CAR против CD33 с Fc спейсером и ITIM-содержащим эндодоменом, полученным из такового из LAIR1. Активность этого логического элемента сравнивали с таковой у исходного логического элемента И НЕ на основе ITIM. В этом случае активация модифицированного логического элемента происходила в ответ на мишени, экспрессирующие CD19, но также происходила в ответ на клетки, экспрессирующие оба CD19 и CD33. Эти данные показывают, что логические элементы И НЕ на основе ITIM придерживаются модели, основанной на кинетической сегрегации, и правильный спейсер следует выбирать для того, чтобы создавать функциональный логический элемент (фиг. 23B).

Пример 10: краткое описание модели логических элементов CAR, созданной посредством кинетической сегрегации

На основании текущего понимания модели кинетической сегрегации и экспериментальных данных, описанных в настоящем документе, краткое описание модели для логического элемента из двух CAR представлено на фиг. 24. На фиг. Показана клетка, которая экспрессирует два CAR, каждый распознает отличающийся антиген. Когда любой один или оба CAR распознают антиген-мишень на клетке, происходит формирование синапса и исключение нативных CD45 и CD148 из синапса из-за массивности их эктодомена. Это задает основу для активации T-клеток. В том случае, когда клетка-мишень несет только один когнатных антиген, когнатный CAR лигирован и когнатный CAR сегрегируется в синапс. Нелигированный CAR остается в растворе на мембране T-клетки и может диффундировать в синапс и из него с тем, чтобы происходило формирование области высокой локальной концентрации лигированного CAR с низкой концентрацией нелигированного CAR. В этом случае, если лигированный CAR имеет ITAM и нелигированный CAR имеет ингибирующий эндодомен «выключаемого лигированием», типа такой как таковой из CD148, количество нелигированного CAR является достаточным для того, чтобы ингибировать активацию и выключать логический элемент. В отличие от этого, в том случае, если лигированный CAR имеет ITAM и нелигированный CAR имеет ингибирующий эндодомен «включаемого лигированием» типа, такой как PTPN6, количество нелигированного CAR является недостаточным для того, чтобы осуществлять ингибирование, и логический элемент включен. Когда стимулируют клеткой-мишенью, несущей оба когнатных антигена, оба когнатных CAR лигированы и образуют часть иммунологического синапса. Важно, если CAR спейсеры достаточно схожи, CAR совместно локализованы в синапсе, но если CAR спейсере достаточно различны, CAR сегрегируются внутри синапса. В этом последнем случае, происходит формирование областей мембраны, в которых присутствуют высокие концентрации одного CAR, но другой CAR отсутствует. В этом случае, поскольку сегрегация выполнена, даже если ингибирующий эндодомен относится к «выключаемому лигированием» типу, логический элемент включен. В первом случае, происходит формирование областей мембраны с высокими концентрациями обоих CAR, смешанных вместе. В этом случае, поскольку оба эндодомена концентрированы, даже если ингибирующий эндодомен относится ко «включаемому лигированием» типу, логический элемент выключен. Посредством отбора в CAR T-клетке можно программировать правильную логическую комбинацию спейсера и эндодомена.

На основании вышеописанной работы авторов изобретения, они установили ряд правил разработки для того, чтобы сделать возможным поколение CAR для логических элементов (проиллюстрировано на фиг. 31). Для того чтобы создавать T-клетку с CAR логическим элементом «антиген A ИЛИ антиген B», следует создавать CAR против A и против B так, что (1) каждый CAR имеет спейсер, который делает возможным легкий доступ к антигену и формирование синапса так, что CAR функционирует, и (2) каждый CAR имеет активирующий эндодомен; для того чтобы генерировать T-клетку с CAR логическим элементом «антиген A И НЕ B», CAR против A и против B следует создавать так, что (1) оба CAR имеют спейсеры, которые не образуют перекрестных пар, но которые допускают совместную сегрегацию CAR при распознавании обоих когнатных антигенов на клетке-мишени, (2) и один CAR имеет активирующий эндодомен, тогда как другой CAR имеет эндодомен, который содержит или рекрутирует слабую фосфатазу (например, PTPN6); (3) для того чтобы генерировать T-клетку с CAR логическим элементов «антиген A И антиген B», следует создавать CAR против A и против B так, что (1) один CAR имеет спейсер, достаточно отличающийся от другого CAR так, что оба CAR не будет совместно сегрегироваться при распознавании обоих когнатных антигенов на клетке-мишени, (2) один CAR имеет активирующий эндодомен, тогда как другой CAR имеет эндодомен, который состоит из сильной фосфатазы (например, таковой из CD45 или CD148). Правильные спейсеры для достижения желаемого эффекта можно выбирать из набора спейсеров с известными размером/геометрической формой и т.п., а также принимая во внимание размер/геометрическую форму и т.п. антигена-мишени (например, см. фиг. 30) и местоположение когнатного эпитопа на антигене-мишени.

SEQ ID № 41: SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aGD2-HCH2CH3pvaa-dCD148

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMETDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLQESGPGLVKPSQTLSITCTVSGFSLASYNIHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLTISKDNSKNQVFLKMSSLTAADTAVYYCAKRSDDYSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGKAPKVWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYSGYPITFGQGTKVEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA

SEQ ID № 42: SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aGD2-HCH2CH3pvaa-dCD148

ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCCAGCCAGACCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGGCCAGCTACAACATCCACTGGGTGCGGCAGCCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGCTGGCGGCAGCACCAACTACAACAGCGCCCTGATGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAACCAGGTGTTCCTGAAGATGAGCAGCCTGACAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGCGGAGCGACGACTACAGCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGAACCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCTTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGGGTGACCATGACCTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCAAGGCCCCAAAGGTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCGGCTACCCCATCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCAGGCAAGAAGGACCCCAAGGCGGTTTTTGGCTGTATCTTTGGTGCCCTGGTTATTGTGACTGTGGGAGGCTTCATCTTCTGGAGAAAGAAGAGGAAAGATGCAAAGAATAATGAAGTGTCCTTTTCTCAAATTAAACCTAAAAAATCTAAGTTAATCAGAGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTCAAGAAGCAGCAAGCTGACTCCAACTGTGGGTTCGCAGAGGAATACGAAGATCTGAAGCTTGTTGGAATTAGTCAACCTAAATATGCAGCAGAACTGGCTGAGAATAGAGGAAAGAATCGCTATAATAATGTTCTGCCCTATGATATTTCCCGTGTCAAACTTTCGGTCCAGACCCATTCAACGGATGACTACATCAATGCCAACTACATGCCTGGCTACCACTCCAAGAAAGATTTTATTGCCACACAAGGACCTTTACCGAACACTTTGAAAGATTTTTGGCGTATGGTTTGGGAGAAAAATGTATATGCCATCATTATGTTGACTAAATGTGTTGAACAGGGAAGAACCAAATGTGAGGAGTATTGGCCCTCCAAGCAGGCTCAGGACTATGGAGACATAACTGTGGCAATGACATCAGAAATTGTTCTTCCGGAATGGACCATCAGAGATTTCACAGTGAAAAATATCCAGACAAGTGAGAGTCACCCTCTGAGACAGTTCCATTTCACCTCCTGGCCAGACCACGGTGTTCCCGACACCACTGACCTGCTCATCAACTTCCGGTACCTCGTTCGTGACTACATGAAGCAGAGTCCTCCCGAATCGCCGATTCTGGTGCATTGCAGTGCTGGGGTCGGAAGGACGGGCACTTTCATTGCCATTGATCGTCTCATCTACCAGATAGAGAATGAGAACACCGTGGATGTGTATGGGATTGTGTATGACCTTCGAATGCATAGGCCTTTAATGGTGCAGACAGAGGACCAGTATGTTTTCCTCAATCAGTGTGTTTTGGATATTGTCAGATCCCAGAAAGACTCAAAAGTAGATCTTATCTACCAGAACACAACTGCAATGACAATCTATGAAAACCTTGCGCCCGTGACCACATTTGGAAAGACCAATGGTTACATCGCCTAA

SEQ ID № 43: SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD5-HCH2CH3pvaa-dCD148

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMETDTLLLWVLLLWVPGSTGQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDVYYNPSLKNQLTISKDASRDQVFLKITNLDTADTATYYCVRRRATGTGFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSNIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIACKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCHQYNSYNTFGSGTRLELKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA

SEQ ID № 44: SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD5-HCH2CH3pvaa-dCD148

ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCACCGGCCAGGTGACCCTGAAGGAGAGCGGTCCCGGCATCCTGAAGCCCAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCAGCTTCAGCGGCTTCAGCCTGAGCACCAGCGGCATGGGCGTGGGCTGGATTCGGCAGCCCAGCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGACGTGTACTACAACCCCAGCCTGAAGAACCAGCTGACCATCAGCAAGGACGCCAGCCGGGACCAGGTGTTCCTGAAGATCACCAACCTGGACACCGCCGACACCGCCACCTACTACTGCGTGCGGCGCCGGGCCACCGGCACCGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGTGGCAGCAACATCGTGATGACCCAGAGCCACAAGTTCATGAGCACCAGCGTGGGCGACCGGGTGAGCATCGCCTGCAAGGCCAGCCAGGACGTGGGCACCGCCGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGACCAGCACCCGGCACACCGGCGTGCCCGACCGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCACCAACGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGCCACCAGTACAACAGCTACAACACCTTCGGCAGCGGCACCCGGCTGGAGCTGAAGCGGTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCAGGCAAGAAGGACCCCAAGGCGGTTTTTGGCTGTATCTTTGGTGCCCTGGTTATTGTGACTGTGGGAGGCTTCATCTTCTGGAGAAAGAAGAGGAAAGATGCAAAGAATAATGAAGTGTCCTTTTCTCAAATTAAACCTAAAAAATCTAAGTTAATCAGAGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTCAAGAAGCAGCAAGCTGACTCCAACTGTGGGTTCGCAGAGGAATACGAAGATCTGAAGCTTGTTGGAATTAGTCAACCTAAATATGCAGCAGAACTGGCTGAGAATAGAGGAAAGAATCGCTATAATAATGTTCTGCCCTATGATATTTCCCGTGTCAAACTTTCGGTCCAGACCCATTCAACGGATGACTACATCAATGCCAACTACATGCCTGGCTACCACTCCAAGAAAGATTTTATTGCCACACAAGGACCTTTACCGAACACTTTGAAAGATTTTTGGCGTATGGTTTGGGAGAAAAATGTATATGCCATCATTATGTTGACTAAATGTGTTGAACAGGGAAGAACCAAATGTGAGGAGTATTGGCCCTCCAAGCAGGCTCAGGACTATGGAGACATAACTGTGGCAATGACATCAGAAATTGTTCTTCCGGAATGGACCATCAGAGATTTCACAGTGAAAAATATCCAGACAAGTGAGAGTCACCCTCTGAGACAGTTCCATTTCACCTCCTGGCCAGACCACGGTGTTCCCGACACCACTGACCTGCTCATCAACTTCCGGTACCTCGTTCGTGACTACATGAAGCAGAGTCCTCCCGAATCGCCGATTCTGGTGCATTGCAGTGCTGGGGTCGGAAGGACGGGCACTTTCATTGCCATTGATCGTCTCATCTACCAGATAGAGAATGAGAACACCGTGGATGTGTATGGGATTGTGTATGACCTTCGAATGCATAGGCCTTTAATGGTGCAGACAGAGGACCAGTATGTTTTCCTCAATCAGTGTGTTTTGGATATTGTCAGATCCCAGAAAGACTCAAAAGTAGATCTTATCTACCAGAACACAACTGCAATGACAATCTATGAAAACCTTGCGCCCGTGACCACATTTGGAAAGACCAATGGTTACATCGCCTAA

SEQ ID № 45: SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aEGFRvIII-HCH2CH3pvaa-dCD148

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMETDTLLLWVLLLWVPGSTGQVKLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA

SEQ ID № 46: SFG.aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aEGFRvIII-HCH2CH3pvaa-dCD148

ATGAGCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCAGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCAAGGCCGGAGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCAAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCACGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCTCAGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCAGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCACCGGCCAGGTGAAGCTGCAGCAGAGCGGCGGAGGCCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCCTGAAGCTGAGCTGCGTGACCAGCGGCTTCACCTTCCGGAAGTTCGGCATGAGCTGGGTGCGGCAGACCAGCGACAAGCGGCTGGAGTGGGTGGCCAGCATCAGCACCGGCGGCTACAACACCTACTACAGCGACAACGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGAGAACGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGAAGAGCGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCACCCGGGGCTACAGCAGCACCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGAGCAGCGGCGGAGGAGGCAGTGGTGGGGGTGGATCTGGCGGAGGTGGCAGCGACATCGAGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGAGCGTGGCCACCGGCGAGAAGGTGACCATCCGGTGCATGACCAGCACCGACATCGACGACGACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCGAGCCCCCAAAGTTCCTGATCAGCGAGGGCAACACCCTGCGGCCCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCAGCAGCGGCACCGGCACCGACTTCGTGTTCACCATCGAGAACACCCTGAGCGAGGACGTGGGCGACTACTACTGCCTGCAGAGCTTCAACGTGCCCCTGACCTTCGGCGACGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGGTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCAGGCAAGAAGGACCCCAAGGCGGTTTTTGGCTGTATCTTTGGTGCCCTGGTTATTGTGACTGTGGGAGGCTTCATCTTCTGGAGAAAGAAGAGGAAAGATGCAAAGAATAATGAAGTGTCCTTTTCTCAAATTAAACCTAAAAAATCTAAGTTAATCAGAGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTCAAGAAGCAGCAAGCTGACTCCAACTGTGGGTTCGCAGAGGAATACGAAGATCTGAAGCTTGTTGGAATTAGTCAACCTAAATATGCAGCAGAACTGGCTGAGAATAGAGGAAAGAATCGCTATAATAATGTTCTGCCCTATGATATTTCCCGTGTCAAACTTTCGGTCCAGACCCATTCAACGGATGACTACATCAATGCCAACTACATGCCTGGCTACCACTCCAAGAAAGATTTTATTGCCACACAAGGACCTTTACCGAACACTTTGAAAGATTTTTGGCGTATGGTTTGGGAGAAAAATGTATATGCCATCATTATGTTGACTAAATGTGTTGAACAGGGAAGAACCAAATGTGAGGAGTATTGGCCCTCCAAGCAGGCTCAGGACTATGGAGACATAACTGTGGCAATGACATCAGAAATTGTTCTTCCGGAATGGACCATCAGAGATTTCACAGTGAAAAATATCCAGACAAGTGAGAGTCACCCTCTGAGACAGTTCCATTTCACCTCCTGGCCAGACCACGGTGTTCCCGACACCACTGACCTGCTCATCAACTTCCGGTACCTCGTTCGTGACTACATGAAGCAGAGTCCTCCCGAATCGCCGATTCTGGTGCATTGCAGTGCTGGGGTCGGAAGGACGGGCACTTTCATTGCCATTGATCGTCTCATCTACCAGATAGAGAATGAGAACACCGTGGATGTGTATGGGATTGTGTATGACCTTCGAATGCATAGGCCTTTAATGGTGCAGACAGAGGACCAGTATGTTTTCCTCAATCAGTGTGTTTTGGATATTGTCAGATCCCAGAAAGACTCAAAAGTAGATCTTATCTACCAGAACACAACTGCAATGACAATCTATGAAAACCTTGCGCCCGTGACCACATTTGGAAAGACCAATGGTTACATCGCCTAA

Пример 11: разработка и конструкция CAR на основе APRIL.

APRIL в его природной форме представляет собой секретируемый белок II типа. Использование APRIL в качестве BCMA связывающего домена для CAR требует превращения этого секретируемого белка II типа в связанный с мембраной белок I типа, и для этого белок должен быть стабильным и сохранять связывание с BCMA в этой форме. Для того чтобы создавать возможно подходящие молекулы, дальний амино-конец APRIL удаляли для того, чтобы удалять связывание с протеогликанами. Затем добавляли сигнальный пептид для того, чтобы направлять появляющийся белок в эндоплазматический ретикулум, и таким образом, на клеточную поверхность. Также, поскольку свойства используемого спейсера могут менять функционирование CAR, тестировали три различных спейсерных доменах: создавали CAR на основе APRIL, содержащий (i) спейсер IgG1 человека, измененный для того, чтобы удалять Fc связывающие мотивы; (ii) «стебель» CD8; и (iii) отдельно шарнир IgG1 (рисунок на фиг. 25 и аминокислотные последовательности на фиг. 26). Эти CAR экспрессировали в бицистронном ретровирусном векторе (фиг. 27A) с тем, чтобы маркерный белок - усеченный CD34 можно было совместно экспрессировать в качестве удобного маркерного гена.

Пример 12: экспрессия и функционирование CAR на основе APRIL.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы тестировать экспрессию сконструированных CAR на основе APRIL на клеточной поверхности и формирует ли укладка APRIL нативный белок. T-клетки трансдуцировали этими конструкциями с различными CAR и окрашивали с использованием коммерчески доступного mAb против APRIL наряду с окрашиванием по маркерному гену и анализировали с помощью проточной цитометрии. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 27B, где на график нанесено связывание APRIL в зависимости от флуоресценции маркерного гена. Эти данные показывают, что в этом формате CAR на основе APRIL экспрессированы на клеточной поверхности и APRIL укладывается достаточно, чтобы быть распознанным с помощью mAb против APRIL.

Затем определяли, может ли APRIL в этом формате распознавать BCMA и TACI. Рекомбинантные BCMA и TACI создавали в виде слитных белков с IgG2a-Fc мыши. Эти рекомбинантные белки инкубировали с трансдуцированными T-клетками. После этого клетки промывали и окрашивали антимышиным антителом, конъюгированным с флуорофором, и антителом для обнаружения маркерного гена, конъюгированным с другим флуорофором. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и результаты представлены на фиг. 27C. Различные CAR способны связывать как BCMA, так и TACI. К удивлению, CAR способны связывать BCMA лучше, чем TACI. Также, к удивлению, CAR со «стеблем» CD8 или шарнирным IgG1 спейсером способны лучше связывать BCMA и TACI, чем CAR с Fc спейсером.

Пример 13: химерные антигенные рецепторы на основе APRIL активны против экспрессирующих BCMA клеток

T-клетки от нормальных доноров трансдуцировали различными APRIL CAR и тестировали на клетках SupT1 или дикого типа или сконструированных для того, чтобы экспрессировать BCMA и TACI. Использовали несколько различных анализов для того, чтобы определять функцию. Осуществляли классический анализ на высвобождение хрома. Здесь клетки-мишени (клетки SupT1) метили с использованием ⁵¹Cr и смешивали с эффекторами (трансдуцированные T-клетки) в различных соотношениях. Лизис клеток-мишеней определяли посредством подсчета ⁵¹Cr в супернатанте совместной культуры (на фиг. 28A представлены кумулятивные данные).

Кроме того, супернатант от T-клеток, которые культивировали 1:1 с клетками SupT1, анализировали с помощью ELISA на интерферон-γ (на фиг. 28B представлены кумулятивные данные). Также осуществляли измерение размножения T-клеток после одной недели совместного культивирования с клетками SupT1 (фиг. 28C). T-клетки считали с помощью проточного цитометра, который калибровали с использованием счетных гранул. Эти экспериментальные данные показывают, что CAR на основе APRIL могут уничтожать мишени, экспрессирующие BCMA. Кроме того, эти данные показывают, что CAR, основанные на «стебле» CD8 или шарнире IgG1, работали лучше, чем CAR на основе Fc-pvaa.

Пример 14: функциональный анализ логического элемента И в первичных клетках

PBMC выделяли из крови и стимулировали с использованием PHA и IL-2. Двумя сутками позже клетки трансдуцировали в покрытых ретронектином планшетах с использованием ретровируса, содержащего конструкцию логического элемента И CD19:CD33. В сутки 5 уровень экспрессии двух CAR, транслируемых конструкцией логического элемента И, оценивали через проточную цитометрию, и клетки обедняли по CD56+ клеткам (преимущественно естественные киллерные клетки). В сутки 6 PBMC помещали в совместную культуру с клетками-мишенями в соотношении эффекторы к клеткам-мишеням 1:2. В сутки 8 супернатант собирали и анализировали на секрецию IFN-γ с помощью ELISA (фиг. 29).

Эти данные демонстрируют, что логический элемент И функционирует в первичных клетках.

Все публикации, указанные в приведенном выше описании, включены в настоящий документ посредством ссылки. Различные модификации и вариации описанных способов и систем по изобретению будут очевидны специалисты в данной области, не отступая от объема и сущности изобретения. Несмотря на то, что изобретение описан применительно к конкретным предпочтительным вариантам осуществления, следует понимать, что изобретение, как заявлено, не должно быть чрезмерно ограничено такими конкретными вариантами осуществления. В действительности, предусмотрено, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в молекулярной биологии, клеточной биологии или связанных областях, включены в объем следующей формулы изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> UCL Business PLC

<120> T-клетка

<130> P103294PCT1

<150> GB 1410934.2

<151> 2014-06-19

<160> 53

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1129

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный антигенный рецептор (CAR)

<400> 1

Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

145 150 155 160

Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly

165 170 175

Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg

180 185 190

Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr

195 200 205

Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser

210 215 220

Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr

225 230 235 240

Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala

245 250 255

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Pro

260 265 270

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

275 280 285

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Phe Trp

305 310 315 320

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val

325 330 335

Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg

340 345 350

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

370 375 380

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

385 390 395 400

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

405 410 415

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

420 425 430

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

435 440 445

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Glu Gly Arg Gly

450 455 460

Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala

465 470 475 480

Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Asp Ala

485 490 495

Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

500 505 510

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr

515 520 525

Phe Asn Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

530 535 540

Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe

545 550 555 560

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

565 570 575

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Lys Asn Tyr

580 585 590

Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Gly

595 600 605

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

610 615 620

Gly Gly Ser Arg Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

625 630 635 640

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

645 650 655

Thr Leu Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys

660 665 670

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Leu Asn Gly Gly Ser Thr Tyr

675 680 685

Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

690 695 700

Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

705 710 715 720

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gln Asp Ala Tyr Thr Gly Gly Tyr Phe

725 730 735

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Met Asp Pro

740 745 750

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

755 760 765

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

770 775 780

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

785 790 795 800

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

805 810 815

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

820 825 830

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

835 840 845

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

850 855 860

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

865 870 875 880

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

885 890 895

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

900 905 910

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

915 920 925

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

930 935 940

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

945 950 955 960

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

965 970 975

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu

980 985 990

Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val

995 1000 1005

Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg

1010 1015 1020

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

1025 1030 1035

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

1040 1045 1050

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

1055 1060 1065

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

1070 1075 1080

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

1085 1090 1095

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

1100 1105 1110

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

1115 1120 1125

Arg

<210> 2

<211> 1350

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный антигенный рецептор (CAR)

<400> 2

Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

145 150 155 160

Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly

165 170 175

Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg

180 185 190

Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr

195 200 205

Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser

210 215 220

Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr

225 230 235 240

Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala

245 250 255

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Pro

260 265 270

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

275 280 285

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Phe Trp

305 310 315 320

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val

325 330 335

Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg

340 345 350

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

370 375 380

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

385 390 395 400

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

405 410 415

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

420 425 430

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

435 440 445

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Glu Gly Arg Gly

450 455 460

Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala

465 470 475 480

Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Asp Ala

485 490 495

Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

500 505 510

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr

515 520 525

Phe Asn Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

530 535 540

Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe

545 550 555 560

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

565 570 575

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Lys Asn Tyr

580 585 590

Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Gly

595 600 605

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

610 615 620

Gly Gly Ser Arg Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

625 630 635 640

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

645 650 655

Thr Leu Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys

660 665 670

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Leu Asn Gly Gly Ser Thr Tyr

675 680 685

Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

690 695 700

Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

705 710 715 720

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gln Asp Ala Tyr Thr Gly Gly Tyr Phe

725 730 735

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Met Asp Pro

740 745 750

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

755 760 765

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

770 775 780

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

785 790 795 800

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

805 810 815

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

820 825 830

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

835 840 845

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

850 855 860

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

865 870 875 880

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

885 890 895

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

900 905 910

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

915 920 925

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

930 935 940

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

945 950 955 960

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

965 970 975

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Ala Val Phe Gly

980 985 990

Cys Ile Phe Gly Ala Leu Val Ile Val Thr Val Gly Gly Phe Ile Phe

995 1000 1005

Trp Arg Lys Lys Arg Lys Asp Ala Lys Asn Asn Glu Val Ser Phe

1010 1015 1020

Ser Gln Ile Lys Pro Lys Lys Ser Lys Leu Ile Arg Val Glu Asn

1025 1030 1035

Phe Glu Ala Tyr Phe Lys Lys Gln Gln Ala Asp Ser Asn Cys Gly

1040 1045 1050

Phe Ala Glu Glu Tyr Glu Asp Leu Lys Leu Val Gly Ile Ser Gln

1055 1060 1065

Pro Lys Tyr Ala Ala Glu Leu Ala Glu Asn Arg Gly Lys Asn Arg

1070 1075 1080

Tyr Asn Asn Val Leu Pro Tyr Asp Ile Ser Arg Val Lys Leu Ser

1085 1090 1095

Val Gln Thr His Ser Thr Asp Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Met

1100 1105 1110

Pro Gly Tyr His Ser Lys Lys Asp Phe Ile Ala Thr Gln Gly Pro

1115 1120 1125

Leu Pro Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Arg Met Val Trp Glu Lys

1130 1135 1140

Asn Val Tyr Ala Ile Ile Met Leu Thr Lys Cys Val Glu Gln Gly

1145 1150 1155

Arg Thr Lys Cys Glu Glu Tyr Trp Pro Ser Lys Gln Ala Gln Asp

1160 1165 1170

Tyr Gly Asp Ile Thr Val Ala Met Thr Ser Glu Ile Val Leu Pro

1175 1180 1185

Glu Trp Thr Ile Arg Asp Phe Thr Val Lys Asn Ile Gln Thr Ser

1190 1195 1200

Glu Ser His Pro Leu Arg Gln Phe His Phe Thr Ser Trp Pro Asp

1205 1210 1215

His Gly Val Pro Asp Thr Thr Asp Leu Leu Ile Asn Phe Arg Tyr

1220 1225 1230

Leu Val Arg Asp Tyr Met Lys Gln Ser Pro Pro Glu Ser Pro Ile

1235 1240 1245

Leu Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Phe Ile

1250 1255 1260

Ala Ile Asp Arg Leu Ile Tyr Gln Ile Glu Asn Glu Asn Thr Val

1265 1270 1275

Asp Val Tyr Gly Ile Val Tyr Asp Leu Arg Met His Arg Pro Leu

1280 1285 1290

Met Val Gln Thr Glu Asp Gln Tyr Val Phe Leu Asn Gln Cys Val

1295 1300 1305

Leu Asp Ile Val Arg Ser Gln Lys Asp Ser Lys Val Asp Leu Ile

1310 1315 1320

Tyr Gln Asn Thr Thr Ala Met Thr Ile Tyr Glu Asn Leu Ala Pro

1325 1330 1335

Val Thr Thr Phe Gly Lys Thr Asn Gly Tyr Ile Ala

1340 1345 1350

<210> 3

<211> 1717

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный антигенный рецептор (CAR)

<400> 3

Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

145 150 155 160

Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly

165 170 175

Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg

180 185 190

Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr

195 200 205

Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser

210 215 220

Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr

225 230 235 240

Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala

245 250 255

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Pro

260 265 270

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

275 280 285

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Phe Trp

305 310 315 320

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val

325 330 335

Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg

340 345 350

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

370 375 380

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

385 390 395 400

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

405 410 415

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

420 425 430

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

435 440 445

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Glu Gly Arg Gly

450 455 460

Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala

465 470 475 480

Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Asp Ala

485 490 495

Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

500 505 510

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr

515 520 525

Phe Asn Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

530 535 540

Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe

545 550 555 560

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

565 570 575

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Lys Asn Tyr

580 585 590

Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Gly

595 600 605

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

610 615 620

Gly Gly Ser Arg Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

625 630 635 640

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

645 650 655

Thr Leu Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys

660 665 670

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Leu Asn Gly Gly Ser Thr Tyr

675 680 685

Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

690 695 700

Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

705 710 715 720

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gln Asp Ala Tyr Thr Gly Gly Tyr Phe

725 730 735

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Met Asp Pro

740 745 750

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

755 760 765

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

770 775 780

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

785 790 795 800

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

805 810 815

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

820 825 830

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

835 840 845

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

850 855 860

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

865 870 875 880

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

885 890 895

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

900 905 910

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

915 920 925

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

930 935 940

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

945 950 955 960

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

965 970 975

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Ala Leu Ile Ala

980 985 990

Phe Leu Ala Phe Leu Ile Ile Val Thr Ser Ile Ala Leu Leu Val Val

995 1000 1005

Leu Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys Arg Ser Cys Asn Leu

1010 1015 1020

Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp Glu Lys Gln Leu

1025 1030 1035

Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu Glu Thr Tyr

1040 1045 1050

Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala Glu Phe

1055 1060 1065

Gln Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe Pro Ile Lys Glu Ala

1070 1075 1080

Arg Lys Pro Phe Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr Val Asp Ile Leu

1085 1090 1095

Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile Asn Gly Asp

1100 1105 1110

Ala Gly Ser Asn Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly Phe Lys

1115 1120 1125

Glu Pro Arg Lys Tyr Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr

1130 1135 1140

Val Asp Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val

1145 1150 1155

Ile Val Met Val Thr Arg Cys Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys

1160 1165 1170

Ala Glu Tyr Trp Pro Ser Met Glu Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly

1175 1180 1185

Asp Val Val Val Lys Ile Asn Gln His Lys Arg Cys Pro Asp Tyr

1190 1195 1200

Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile Val Asn Lys Lys Glu Lys Ala Thr

1205 1210 1215

Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln Phe Thr Ser Trp Pro Asp His

1220 1225 1230

Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu Leu Lys Leu Arg Arg Arg

1235 1240 1245

Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly Pro Ile Val Val His

1250 1255 1260

Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ile Asp

1265 1270 1275

Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val Asp Val Tyr

1280 1285 1290

Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met Val Gln

1295 1300 1305

Val Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu Tyr

1310 1315 1320

Asn Gln Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser Glu Leu His Pro

1325 1330 1335

Tyr Leu His Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser

1340 1345 1350

Pro Leu Glu Ala Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp

1355 1360 1365

Arg Thr Gln His Ile Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn

1370 1375 1380

Arg Asn Ser Asn Val Ile Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Pro Leu

1385 1390 1395

Lys His Glu Leu Glu Met Ser Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp

1400 1405 1410

Glu Ser Ser Asp Asp Asp Ser Asp Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr

1415 1420 1425

Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met Ser Tyr Trp Lys Pro Glu Val Met

1430 1435 1440

Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys Glu Thr Ile Gly Asp Phe Trp

1445 1450 1455

Gln Met Ile Phe Gln Arg Lys Val Lys Val Ile Val Met Leu Thr

1460 1465 1470

Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu Ile Cys Ala Gln Tyr Trp Gly

1475 1480 1485

Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp Ile Glu Val Asp Leu Lys Asp

1490 1495 1500

Thr Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Thr Leu Arg Val Phe Glu Leu Arg

1505 1510 1515

His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr

1520 1525 1530

Thr Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu

1535 1540 1545

Ile Ser Met Ile Gln Val Val Lys Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn

1550 1555 1560

Ser Ser Glu Gly Asn Lys His His Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile

1565 1570 1575

His Cys Arg Asp Gly Ser Gln Gln Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu

1580 1585 1590

Leu Asn Leu Leu Glu Ser Ala Glu Thr Glu Glu Val Val Asp Ile

1595 1600 1605

Phe Gln Val Val Lys Ala Leu Arg Lys Ala Arg Pro Gly Met Val

1610 1615 1620

Ser Thr Phe Glu Gln Tyr Gln Phe Leu Tyr Asp Val Ile Ala Ser

1625 1630 1635

Thr Tyr Pro Ala Gln Asn Gly Gln Val Lys Lys Asn Asn His Gln

1640 1645 1650

Glu Asp Lys Ile Glu Phe Asp Asn Glu Val Asp Lys Val Lys Gln

1655 1660 1665

Asp Ala Asn Cys Val Asn Pro Leu Gly Ala Pro Glu Lys Leu Pro

1670 1675 1680

Glu Ala Lys Glu Gln Ala Glu Gly Ser Glu Pro Thr Ser Gly Thr

1685 1690 1695

Glu Gly Pro Glu His Ser Val Asn Gly Pro Ala Ser Pro Ala Leu

1700 1705 1710

Asn Gln Gly Ser

1715

<210> 4

<211> 1114

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный антигенный рецептор (CAR)

<400> 4

Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

145 150 155 160

Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly

165 170 175

Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg

180 185 190

Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr

195 200 205

Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser

210 215 220

Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr

225 230 235 240

Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala

245 250 255

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Pro

260 265 270

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

275 280 285

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Phe Trp

305 310 315 320

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val

325 330 335

Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg

340 345 350

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

370 375 380

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

385 390 395 400

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

405 410 415

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

420 425 430

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

435 440 445

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Glu Gly Arg Gly

450 455 460

Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala

465 470 475 480

Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Asp Ala

485 490 495

Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

500 505 510

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr

515 520 525

Phe Asn Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

530 535 540

Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe

545 550 555 560

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

565 570 575

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Lys Asn Tyr

580 585 590

Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Gly

595 600 605

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

610 615 620

Gly Gly Ser Arg Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

625 630 635 640

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

645 650 655

Thr Leu Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys

660 665 670

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Leu Asn Gly Gly Ser Thr Tyr

675 680 685

Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

690 695 700

Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

705 710 715 720

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gln Asp Ala Tyr Thr Gly Gly Tyr Phe

725 730 735

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Met Asp Pro

740 745 750

Ala Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro

755 760 765

Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly

770 775 780

Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Trp Ala

785 790 795 800

Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr

805 810 815

Leu Ile Cys Tyr His Arg Ser Arg Lys Arg Val Cys Lys Ser Gly Gly

820 825 830

Gly Ser Phe Trp Glu Glu Phe Glu Ser Leu Gln Lys Gln Glu Val Lys

835 840 845

Asn Leu His Gln Arg Leu Glu Gly Gln Arg Pro Glu Asn Lys Gly Lys

850 855 860

Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Ser Arg Val Ile Leu

865 870 875 880

Gln Gly Arg Asp Ser Asn Ile Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn

885 890 895

Tyr Ile Lys Asn Gln Leu Leu Gly Pro Asp Glu Asn Ala Lys Thr Tyr

900 905 910

Ile Ala Ser Gln Gly Cys Leu Glu Ala Thr Val Asn Asp Phe Trp Gln

915 920 925

Met Ala Trp Gln Glu Asn Ser Arg Val Ile Val Met Thr Thr Arg Glu

930 935 940

Val Glu Lys Gly Arg Asn Lys Cys Val Pro Tyr Trp Pro Glu Val Gly

945 950 955 960

Met Gln Arg Ala Tyr Gly Pro Tyr Ser Val Thr Asn Cys Gly Glu His

965 970 975

Asp Thr Thr Glu Tyr Lys Leu Arg Thr Leu Gln Val Ser Pro Leu Asp

980 985 990

Asn Gly Asp Leu Ile Arg Glu Ile Trp His Tyr Gln Tyr Leu Ser Trp

995 1000 1005

Pro Asp His Gly Val Pro Ser Glu Pro Gly Gly Val Leu Ser Phe

1010 1015 1020

Leu Asp Gln Ile Asn Gln Arg Gln Glu Ser Leu Pro His Ala Gly

1025 1030 1035

Pro Ile Ile Val His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly Thr

1040 1045 1050

Ile Ile Val Ile Asp Met Leu Met Glu Asn Ile Ser Thr Lys Gly

1055 1060 1065

Leu Asp Cys Asp Ile Asp Ile Gln Lys Thr Ile Gln Met Val Arg

1070 1075 1080

Ala Gln Arg Ser Gly Met Val Gln Thr Glu Ala Gln Tyr Lys Phe

1085 1090 1095

Ile Tyr Val Ala Ile Ala Gln Phe Ile Glu Thr Thr Lys Lys Lys

1100 1105 1110

Leu

<210> 5

<211> 918

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный антигенный рецептор (CAR)

<400> 5

Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

145 150 155 160

Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly

165 170 175

Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg

180 185 190

Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr

195 200 205

Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser

210 215 220

Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr

225 230 235 240

Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala

245 250 255

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Pro

260 265 270

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

275 280 285

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Phe Trp

305 310 315 320

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val

325 330 335

Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg

340 345 350

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

370 375 380

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

385 390 395 400

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

405 410 415

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

420 425 430

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

435 440 445

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Glu Gly Arg Gly

450 455 460

Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala

465 470 475 480

Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Asp Ala

485 490 495

Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

500 505 510

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr

515 520 525

Phe Asn Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

530 535 540

Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe

545 550 555 560

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

565 570 575

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Lys Asn Tyr

580 585 590

Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Gly

595 600 605

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

610 615 620

Gly Gly Ser Arg Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

625 630 635 640

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

645 650 655

Thr Leu Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys

660 665 670

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Leu Asn Gly Gly Ser Thr Tyr

675 680 685

Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

690 695 700

Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

705 710 715 720

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gln Asp Ala Tyr Thr Gly Gly Tyr Phe

725 730 735

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Met Asp Pro

740 745 750

Ala Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro

755 760 765

Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly

770 775 780

Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Leu Ile Gly

785 790 795 800

Val Ser Val Val Phe Leu Phe Cys Leu Leu Leu Leu Val Leu Phe Cys

805 810 815

Leu His Arg Gln Asn Gln Ile Lys Gln Gly Pro Pro Arg Ser Lys Asp

820 825 830

Glu Glu Gln Lys Pro Gln Gln Arg Pro Asp Leu Ala Val Asp Val Leu

835 840 845

Glu Arg Thr Ala Asp Lys Ala Thr Val Asn Gly Leu Pro Glu Lys Asp

850 855 860

Arg Glu Thr Asp Thr Ser Ala Leu Ala Ala Gly Ser Ser Gln Glu Val

865 870 875 880

Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His Trp Ala Leu Thr Gln Arg Thr Ala Arg

885 890 895

Ala Val Ser Pro Gln Ser Thr Lys Pro Met Ala Glu Ser Ile Thr Tyr

900 905 910

Ala Ala Val Ala Arg His

915

<210> 6

<211> 1363

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный антигенный рецептор (CAR)

<400> 6

Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

145 150 155 160

Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly

165 170 175

Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg

180 185 190

Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr

195 200 205

Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser

210 215 220

Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr

225 230 235 240

Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala

245 250 255

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Pro

260 265 270

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

275 280 285

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Phe Trp

305 310 315 320

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val

325 330 335

Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg

340 345 350

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

370 375 380

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

385 390 395 400

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

405 410 415

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

420 425 430

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

435 440 445

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Glu Gly Arg Gly

450 455 460

Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala

465 470 475 480

Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Asp Ala

485 490 495

Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

500 505 510

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr

515 520 525

Phe Asn Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

530 535 540

Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe

545 550 555 560

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

565 570 575

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Lys Asn Tyr

580 585 590

Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Gly

595 600 605

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

610 615 620

Gly Gly Ser Arg Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

625 630 635 640

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

645 650 655

Thr Leu Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys

660 665 670

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Leu Asn Gly Gly Ser Thr Tyr

675 680 685

Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

690 695 700

Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

705 710 715 720

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gln Asp Ala Tyr Thr Gly Gly Tyr Phe

725 730 735

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Met Asp Pro

740 745 750

Ala Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro

755 760 765

Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly

770 775 780

Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Leu Ile Gly

785 790 795 800

Val Ser Val Val Phe Leu Phe Cys Leu Leu Leu Leu Val Leu Phe Cys

805 810 815

Leu His Arg Gln Asn Gln Ile Lys Gln Gly Pro Pro Arg Ser Lys Asp

820 825 830

Glu Glu Gln Lys Pro Gln Gln Arg Pro Asp Leu Ala Val Asp Val Leu

835 840 845

Glu Arg Thr Ala Asp Lys Ala Thr Val Asn Gly Leu Pro Glu Lys Asp

850 855 860

Arg Glu Thr Asp Thr Ser Ala Leu Ala Ala Gly Ser Ser Gln Glu Val

865 870 875 880

Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His Trp Ala Leu Thr Gln Arg Thr Ala Arg

885 890 895

Ala Val Ser Pro Gln Ser Thr Lys Pro Met Ala Glu Ser Ile Thr Tyr

900 905 910

Ala Ala Val Ala Arg His Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr

915 920 925

Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Trp Tyr His Gly His Met

930 935 940

Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly Glu Pro Trp

945 950 955 960

Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Asp Phe Val Leu

965 970 975

Ser Val Leu Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser Pro Leu Arg

980 985 990

Val Thr His Ile Lys Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr Thr Val Gly

995 1000 1005

Gly Leu Glu Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu His Phe

1010 1015 1020

Lys Lys Thr Gly Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr Leu

1025 1030 1035

Arg Gln Pro Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Glu Ala Tyr Phe

1040 1045 1050

Lys Lys Gln Gln Ala Asp Ser Asn Cys Gly Phe Ala Glu Glu Tyr

1055 1060 1065

Glu Asp Leu Lys Leu Val Gly Ile Ser Gln Pro Lys Tyr Ala Ala

1070 1075 1080

Glu Leu Ala Glu Asn Arg Gly Lys Asn Arg Tyr Asn Asn Val Leu

1085 1090 1095

Pro Tyr Asp Ile Ser Arg Val Lys Leu Ser Val Gln Thr His Ser

1100 1105 1110

Thr Asp Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Met Pro Gly Tyr His Ser

1115 1120 1125

Lys Lys Asp Phe Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Pro Asn Thr Leu

1130 1135 1140

Lys Asp Phe Trp Arg Met Val Trp Glu Lys Asn Val Tyr Ala Ile

1145 1150 1155

Ile Met Leu Thr Lys Cys Val Glu Gln Gly Arg Thr Lys Cys Glu

1160 1165 1170

Glu Tyr Trp Pro Ser Lys Gln Ala Gln Asp Tyr Gly Asp Ile Thr

1175 1180 1185

Val Ala Met Thr Ser Glu Ile Val Leu Pro Glu Trp Thr Ile Arg

1190 1195 1200

Asp Phe Thr Val Lys Asn Ile Gln Thr Ser Glu Ser His Pro Leu

1205 1210 1215

Arg Gln Phe His Phe Thr Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Asp

1220 1225 1230

Thr Thr Asp Leu Leu Ile Asn Phe Arg Tyr Leu Val Arg Asp Tyr

1235 1240 1245

Met Lys Gln Ser Pro Pro Glu Ser Pro Ile Leu Val His Cys Ser

1250 1255 1260

Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Phe Ile Ala Ile Asp Arg Leu

1265 1270 1275

Ile Tyr Gln Ile Glu Asn Glu Asn Thr Val Asp Val Tyr Gly Ile

1280 1285 1290

Val Tyr Asp Leu Arg Met His Arg Pro Leu Met Val Gln Thr Glu

1295 1300 1305

Asp Gln Tyr Val Phe Leu Asn Gln Cys Val Leu Asp Ile Val Arg

1310 1315 1320

Ser Gln Lys Asp Ser Lys Val Asp Leu Ile Tyr Gln Asn Thr Thr

1325 1330 1335

Ala Met Thr Ile Tyr Glu Asn Leu Ala Pro Val Thr Thr Phe Gly

1340 1345 1350

Lys Thr Asn Gly Tyr Ile Ala Ser Gly Ser

1355 1360

<210> 7

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сигнальный пептид

<400> 7

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Gly

<210> 8

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сигнальный пептид

<400> 8

Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

<210> 9

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сигнальный пептид

<400> 9

Met Ala Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys

<210> 10

<211> 234

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер (шарнир-CH2CH3 из IgG1 человека)

<400> 10

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp

225 230

<210> 11

<211> 46

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер (стебель CD8 человека)

<400> 11

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

35 40 45

<210> 12

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер (шарнир IgG1 человека)

<400> 12

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Lys Asp Pro Lys

<210> 13

<211> 185

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер (эктодомен CD2)

<400> 13

Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp

1 5 10 15

Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp

20 25 30

Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg

35 40 45

Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys

50 55 60

Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile

65 70 75 80

Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys

85 90 95

Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser

100 105 110

Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr

115 120 125

Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser

130 135 140

Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe

145 150 155 160

Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro

165 170 175

Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu Asp

180 185

<210> 14

<211> 259

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер (эктодомен CD34)

<400> 14

Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro Thr Gln Gly

1 5 10 15

Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu Thr Thr Thr

20 25 30

Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser Gln His Gly

35 40 45

Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys Phe Thr Ser

50 55 60

Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser Ser Val Gln

65 70 75 80

Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro Ala Asn Val

85 90 95

Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro Gly Asn Val

100 105 110

Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser Pro Thr Lys

115 120 125

Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys Ala Glu Ile

130 135 140

Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly Ile Cys Leu

145 150 155 160

Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys Asp Arg Gly

165 170 175

Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala Asp Ala Asp

180 185 190

Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser Glu Val Arg

195 200 205

Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu Ile Ser Ser

210 215 220

Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly

225 230 235 240

Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln Ser Tyr Ser

245 250 255

Gln Lys Thr

<210> 15

<211> 140

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Трансмембранный домен CD28 и эндодомены CD3 Z

<400> 15

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe

20 25 30

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

35 40 45

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

50 55 60

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

65 70 75 80

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

85 90 95

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

100 105 110

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

115 120 125

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

130 135 140

<210> 16

<211> 180

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Трансмембранный домен CD28 и эндодомены CD28 и CD3 дзета

<400> 16

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

65 70 75 80

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

85 90 95

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

100 105 110

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

115 120 125

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

130 135 140

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

145 150 155 160

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

165 170 175

Leu Pro Pro Arg

180

<210> 17

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Трансмембранный домен CD28 и эндодомены CD28, OX40 и CD3 дзета

<400> 17

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro

65 70 75 80

Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp

85 90 95

Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

100 105 110

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

115 120 125

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

130 135 140

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

145 150 155 160

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

165 170 175

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

180 185 190

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

195 200 205

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

210 215

<210> 18

<211> 729

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Трансмембранный и эндодомен CD45

<400> 18

Ala Leu Ile Ala Phe Leu Ala Phe Leu Ile Ile Val Thr Ser Ile Ala

1 5 10 15

Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys Arg Ser

20 25 30

Cys Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp Glu Lys

35 40 45

Gln Leu Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu Glu Thr

50 55 60

Tyr Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala Glu Phe

65 70 75 80

Gln Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe Pro Ile Lys Glu Ala Arg

85 90 95

Lys Pro Phe Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr Val Asp Ile Leu Pro Tyr

100 105 110

Asp Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile Asn Gly Asp Ala Gly Ser

115 120 125

Asn Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly Phe Lys Glu Pro Arg Lys

130 135 140

Tyr Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr Val Asp Asp Phe Trp

145 150 155 160

Arg Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val Ile Val Met Val Thr Arg

165 170 175

Cys Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala Glu Tyr Trp Pro Ser Met

180 185 190

Glu Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly Asp Val Val Val Lys Ile Asn Gln

195 200 205

His Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile Val Asn

210 215 220

Lys Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln Phe Thr

225 230 235 240

Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu Leu Lys

245 250 255

Leu Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly Pro Ile

260 265 270

Val Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Gly

275 280 285

Ile Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val Asp Val

290 295 300

Tyr Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met Val Gln

305 310 315 320

Val Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu Tyr Asn

325 330 335

Gln Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser Glu Leu His Pro Tyr Leu

340 345 350

His Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro Leu Glu

355 360 365

Ala Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Thr Gln His

370 375 380

Ile Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser Asn Val

385 390 395 400

Ile Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Pro Leu Lys His Glu Leu Glu Met

405 410 415

Ser Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp Ser

420 425 430

Asp Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met Ser

435 440 445

Tyr Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys Glu

450 455 460

Thr Ile Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile Phe Gln Arg Lys Val Lys Val

465 470 475 480

Ile Val Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu Ile Cys Ala

485 490 495

Gln Tyr Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp Ile Glu Val Asp

500 505 510

Leu Lys Asp Thr Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Thr Leu Arg Val Phe Glu

515 520 525

Leu Arg His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg Thr Val Tyr Gln Tyr Gln

530 535 540

Tyr Thr Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu

545 550 555 560

Ile Ser Met Ile Gln Val Val Lys Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn Ser

565 570 575

Ser Glu Gly Asn Lys His His Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His Cys

580 585 590

Arg Asp Gly Ser Gln Gln Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn Leu

595 600 605

Leu Glu Ser Ala Glu Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln Val Val

610 615 620

Lys Ala Leu Arg Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr Phe Glu Gln

625 630 635 640

Tyr Gln Phe Leu Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Tyr Pro Ala Gln Asn

645 650 655

Gly Gln Val Lys Lys Asn Asn His Gln Glu Asp Lys Ile Glu Phe Asp

660 665 670

Asn Glu Val Asp Lys Val Lys Gln Asp Ala Asn Cys Val Asn Pro Leu

675 680 685

Gly Ala Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ala Lys Glu Gln Ala Glu Gly Ser

690 695 700

Glu Pro Thr Ser Gly Thr Glu Gly Pro Glu His Ser Val Asn Gly Pro

705 710 715 720

Ala Ser Pro Ala Leu Asn Gln Gly Ser

725

<210> 19

<211> 362

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Трансмембранный и эндодомен CD148

<400> 19

Ala Val Phe Gly Cys Ile Phe Gly Ala Leu Val Ile Val Thr Val Gly

1 5 10 15

Gly Phe Ile Phe Trp Arg Lys Lys Arg Lys Asp Ala Lys Asn Asn Glu

20 25 30

Val Ser Phe Ser Gln Ile Lys Pro Lys Lys Ser Lys Leu Ile Arg Val

35 40 45

Glu Asn Phe Glu Ala Tyr Phe Lys Lys Gln Gln Ala Asp Ser Asn Cys

50 55 60

Gly Phe Ala Glu Glu Tyr Glu Asp Leu Lys Leu Val Gly Ile Ser Gln

65 70 75 80

Pro Lys Tyr Ala Ala Glu Leu Ala Glu Asn Arg Gly Lys Asn Arg Tyr

85 90 95

Asn Asn Val Leu Pro Tyr Asp Ile Ser Arg Val Lys Leu Ser Val Gln

100 105 110

Thr His Ser Thr Asp Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Met Pro Gly Tyr

115 120 125

His Ser Lys Lys Asp Phe Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Pro Asn Thr

130 135 140

Leu Lys Asp Phe Trp Arg Met Val Trp Glu Lys Asn Val Tyr Ala Ile

145 150 155 160

Ile Met Leu Thr Lys Cys Val Glu Gln Gly Arg Thr Lys Cys Glu Glu

165 170 175

Tyr Trp Pro Ser Lys Gln Ala Gln Asp Tyr Gly Asp Ile Thr Val Ala

180 185 190

Met Thr Ser Glu Ile Val Leu Pro Glu Trp Thr Ile Arg Asp Phe Thr

195 200 205

Val Lys Asn Ile Gln Thr Ser Glu Ser His Pro Leu Arg Gln Phe His

210 215 220

Phe Thr Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Asp Thr Thr Asp Leu Leu

225 230 235 240

Ile Asn Phe Arg Tyr Leu Val Arg Asp Tyr Met Lys Gln Ser Pro Pro

245 250 255

Glu Ser Pro Ile Leu Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly

260 265 270

Thr Phe Ile Ala Ile Asp Arg Leu Ile Tyr Gln Ile Glu Asn Glu Asn

275 280 285

Thr Val Asp Val Tyr Gly Ile Val Tyr Asp Leu Arg Met His Arg Pro

290 295 300

Leu Met Val Gln Thr Glu Asp Gln Tyr Val Phe Leu Asn Gln Cys Val

305 310 315 320

Leu Asp Ile Val Arg Ser Gln Lys Asp Ser Lys Val Asp Leu Ile Tyr

325 330 335

Gln Asn Thr Thr Ala Met Thr Ile Tyr Glu Asn Leu Ala Pro Val Thr

340 345 350

Thr Phe Gly Lys Thr Asn Gly Tyr Ile Ala

355 360

<210> 20

<211> 595

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность PTPN6

<400> 20

Met Val Arg Trp Phe His Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr

1 5 10 15

Leu Leu Lys Gly Arg Gly Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser

20 25 30

Arg Lys Asn Gln Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln

35 40 45

Val Thr His Ile Arg Ile Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr

50 55 60

Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr

65 70 75 80

Gln Gln Gln Gly Val Leu Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu

85 90 95

Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ser Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Tyr His

100 105 110

Gly His Met Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly

115 120 125

Glu Pro Trp Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Asp

130 135 140

Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser

145 150 155 160

Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr

165 170 175

Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu

180 185 190

His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr

195 200 205

Leu Arg Gln Pro Tyr Tyr Ala Thr Arg Val Asn Ala Ala Asp Ile Glu

210 215 220

Asn Arg Val Leu Glu Leu Asn Lys Lys Gln Glu Ser Glu Asp Thr Ala

225 230 235 240

Lys Ala Gly Phe Trp Glu Glu Phe Glu Ser Leu Gln Lys Gln Glu Val

245 250 255

Lys Asn Leu His Gln Arg Leu Glu Gly Gln Arg Pro Glu Asn Lys Gly

260 265 270

Lys Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Ser Arg Val Ile

275 280 285

Leu Gln Gly Arg Asp Ser Asn Ile Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala

290 295 300

Asn Tyr Ile Lys Asn Gln Leu Leu Gly Pro Asp Glu Asn Ala Lys Thr

305 310 315 320

Tyr Ile Ala Ser Gln Gly Cys Leu Glu Ala Thr Val Asn Asp Phe Trp

325 330 335

Gln Met Ala Trp Gln Glu Asn Ser Arg Val Ile Val Met Thr Thr Arg

340 345 350

Glu Val Glu Lys Gly Arg Asn Lys Cys Val Pro Tyr Trp Pro Glu Val

355 360 365

Gly Met Gln Arg Ala Tyr Gly Pro Tyr Ser Val Thr Asn Cys Gly Glu

370 375 380

His Asp Thr Thr Glu Tyr Lys Leu Arg Thr Leu Gln Val Ser Pro Leu

385 390 395 400

Asp Asn Gly Asp Leu Ile Arg Glu Ile Trp His Tyr Gln Tyr Leu Ser

405 410 415

Trp Pro Asp His Gly Val Pro Ser Glu Pro Gly Gly Val Leu Ser Phe

420 425 430

Leu Asp Gln Ile Asn Gln Arg Gln Glu Ser Leu Pro His Ala Gly Pro

435 440 445

Ile Ile Val His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly Thr Ile Ile

450 455 460

Val Ile Asp Met Leu Met Glu Asn Ile Ser Thr Lys Gly Leu Asp Cys

465 470 475 480

Asp Ile Asp Ile Gln Lys Thr Ile Gln Met Val Arg Ala Gln Arg Ser

485 490 495

Gly Met Val Gln Thr Glu Ala Gln Tyr Lys Phe Ile Tyr Val Ala Ile

500 505 510

Ala Gln Phe Ile Glu Thr Thr Lys Lys Lys Leu Glu Val Leu Gln Ser

515 520 525

Gln Lys Gly Gln Glu Ser Glu Tyr Gly Asn Ile Thr Tyr Pro Pro Ala

530 535 540

Met Lys Asn Ala His Ala Lys Ala Ser Arg Thr Ser Ser Lys His Lys

545 550 555 560

Glu Asp Val Tyr Glu Asn Leu His Thr Lys Asn Lys Arg Glu Glu Lys

565 570 575

Val Lys Lys Gln Arg Ser Ala Asp Lys Glu Lys Ser Lys Gly Ser Leu

580 585 590

Lys Arg Lys

595

<210> 21

<211> 272

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность фосфатазного домена из PTPN6

<400> 21

Phe Trp Glu Glu Phe Glu Ser Leu Gln Lys Gln Glu Val Lys Asn Leu

1 5 10 15

His Gln Arg Leu Glu Gly Gln Arg Pro Glu Asn Lys Gly Lys Asn Arg

20 25 30

Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Ser Arg Val Ile Leu Gln Gly

35 40 45

Arg Asp Ser Asn Ile Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile

50 55 60

Lys Asn Gln Leu Leu Gly Pro Asp Glu Asn Ala Lys Thr Tyr Ile Ala

65 70 75 80

Ser Gln Gly Cys Leu Glu Ala Thr Val Asn Asp Phe Trp Gln Met Ala

85 90 95

Trp Gln Glu Asn Ser Arg Val Ile Val Met Thr Thr Arg Glu Val Glu

100 105 110

Lys Gly Arg Asn Lys Cys Val Pro Tyr Trp Pro Glu Val Gly Met Gln

115 120 125

Arg Ala Tyr Gly Pro Tyr Ser Val Thr Asn Cys Gly Glu His Asp Thr

130 135 140

Thr Glu Tyr Lys Leu Arg Thr Leu Gln Val Ser Pro Leu Asp Asn Gly

145 150 155 160

Asp Leu Ile Arg Glu Ile Trp His Tyr Gln Tyr Leu Ser Trp Pro Asp

165 170 175

His Gly Val Pro Ser Glu Pro Gly Gly Val Leu Ser Phe Leu Asp Gln

180 185 190

Ile Asn Gln Arg Gln Glu Ser Leu Pro His Ala Gly Pro Ile Ile Val

195 200 205

His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly Thr Ile Ile Val Ile Asp

210 215 220

Met Leu Met Glu Asn Ile Ser Thr Lys Gly Leu Asp Cys Asp Ile Asp

225 230 235 240

Ile Gln Lys Thr Ile Gln Met Val Arg Ala Gln Arg Ser Gly Met Val

245 250 255

Gln Thr Glu Ala Gln Tyr Lys Phe Ile Tyr Val Ala Ile Ala Gln Phe

260 265 270

<210> 22

<211> 97

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эндодомен PDCD1

<400> 22

Cys Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln

1 5 10 15

Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr

20 25 30

Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val

35 40 45

Pro Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser

50 55 60

Gly Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro

65 70 75 80

Arg Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro

85 90 95

Leu

<210> 23

<211> 141

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эндодомен BTLA4

<400> 23

Lys Leu Gln Arg Arg Trp Lys Arg Thr Gln Ser Gln Gln Gly Leu Gln

1 5 10 15

Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys Lys Val Arg

20 25 30

Arg Ala Pro Leu Ser Glu Gly Pro His Ser Leu Gly Cys Tyr Asn Pro

35 40 45

Met Met Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Thr Leu Arg Phe Pro Glu Met

50 55 60

Asn Ile Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu Ser Ser Glu Met Gln Arg Pro

65 70 75 80

Pro Pro Asp Cys Asp Asp Thr Val Thr Tyr Ser Ala Leu His Lys Arg

85 90 95

Gln Val Gly Asp Tyr Glu Asn Val Ile Pro Asp Phe Pro Glu Asp Glu

100 105 110

Gly Ile His Tyr Ser Glu Leu Ile Gln Phe Gly Val Gly Glu Arg Pro

115 120 125

Gln Ala Gln Glu Asn Val Asp Tyr Val Ile Leu Lys His

130 135 140

<210> 24

<211> 168

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эндодомен LILRB1

<400> 24

Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln Arg Lys

1 5 10 15

Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro Thr Asp

20 25 30

Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln Glu Glu

35 40 45

Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly Val Glu

50 55 60

Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val Thr Tyr

65 70 75 80

Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser Pro Pro

85 90 95

Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln Ala Glu

100 105 110

Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gln

115 120 125

Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg Glu Ala

130 135 140

Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val Pro Ser

145 150 155 160

Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His

165

<210> 25

<211> 101

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эндодомен LAIR1

<400> 25

His Arg Gln Asn Gln Ile Lys Gln Gly Pro Pro Arg Ser Lys Asp Glu

1 5 10 15

Glu Gln Lys Pro Gln Gln Arg Pro Asp Leu Ala Val Asp Val Leu Glu

20 25 30

Arg Thr Ala Asp Lys Ala Thr Val Asn Gly Leu Pro Glu Lys Asp Arg

35 40 45

Glu Thr Asp Thr Ser Ala Leu Ala Ala Gly Ser Ser Gln Glu Val Thr

50 55 60

Tyr Ala Gln Leu Asp His Trp Ala Leu Thr Gln Arg Thr Ala Arg Ala

65 70 75 80

Val Ser Pro Gln Ser Thr Lys Pro Met Ala Glu Ser Ile Thr Tyr Ala

85 90 95

Ala Val Ala Arg His

100

<210> 26

<211> 62

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эндодомен CTLA4

<400> 26

Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr

1 5 10 15

Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg

20 25 30

Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro

35 40 45

Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn

50 55 60

<210> 27

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эндодомен KIR2DL1

<400> 27

Gly Asn Ser Arg His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile

1 5 10 15

Ile Pro Phe Ala Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ala

20 25 30

Asn Lys Lys Asn Ala Val Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg

35 40 45

Thr Val Asn Arg Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val Thr

50 55 60

Tyr Thr Gln Leu Asn His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr Arg

65 70 75 80

Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Ile Ile Val Tyr Thr

85 90 95

Glu Leu Pro Asn Ala Glu Ser Arg Ser Lys Val Val Ser Cys Pro

100 105 110

<210> 28

<211> 143

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эндодомен KIR2DL4

<400> 28

Gly Ile Ala Arg His Leu His Ala Val Ile Arg Tyr Ser Val Ala Ile

1 5 10 15

Ile Leu Phe Thr Ile Leu Pro Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser

20 25 30

Lys Lys Lys Glu Asn Ala Ala Val Met Asn Gln Glu Pro Ala Gly His

35 40 45

Arg Thr Val Asn Arg Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val

50 55 60

Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His Cys Ile Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr

65 70 75 80

Gly Pro Ser Gln Arg Ser Lys Arg Pro Ser Thr Asp Thr Ser Val Cys

85 90 95

Ile Glu Leu Pro Asn Ala Glu Pro Arg Ala Leu Ser Pro Ala His Glu

100 105 110

His His Ser Gln Ala Leu Met Gly Ser Ser Arg Glu Thr Thr Ala Leu

115 120 125

Ser Gln Thr Gln Leu Ala Ser Ser Asn Val Pro Ala Ala Gly Ile

130 135 140

<210> 29

<211> 143

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эндодомен KIR2DL5

<400> 29

Thr Gly Ile Arg Arg His Leu His Ile Leu Ile Gly Thr Ser Val Ala

1 5 10 15

Ile Ile Leu Phe Ile Ile Leu Phe Phe Phe Leu Leu His Cys Cys Cys

20 25 30

Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asp

35 40 45

Arg Thr Val Asn Arg Glu Asp Ser Asp Asp Gln Asp Pro Gln Glu Val

50 55 60

Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His Cys Val Phe Thr Gln Thr Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Thr Thr Met Tyr

85 90 95

Met Glu Leu Pro Asn Ala Lys Pro Arg Ser Leu Ser Pro Ala His Lys

100 105 110

His His Ser Gln Ala Leu Arg Gly Ser Ser Arg Glu Thr Thr Ala Leu

115 120 125

Ser Gln Asn Arg Val Ala Ser Ser His Val Pro Ala Ala Gly Ile

130 135 140

<210> 30

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эндодомен KIR3DL1

<400> 30

Lys Asp Pro Arg His Leu His Ile Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile

1 5 10 15

Ile Leu Phe Ile Leu Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Leu Trp Cys Ser

20 25 30

Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg

35 40 45

Thr Ala Asn Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Glu Glu Val Thr

50 55 60

Tyr Ala Gln Leu Asp His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr Arg

65 70 75 80

Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Thr Ile Leu Tyr Thr

85 90 95

Glu Leu Pro Asn Ala Lys Pro Arg Ser Lys Val Val Ser Cys Pro

100 105 110

<210> 31

<211> 97

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эндодомен KIR3DL3

<400> 31

Lys Asp Pro Gly Asn Ser Arg His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser

1 5 10 15

Val Val Ile Ile Pro Phe Ala Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg

20 25 30

Trp Cys Ala Asn Lys Lys Asn Ala Val Val Met Asp Gln Glu Pro Ala

35 40 45

Gly Asn Arg Thr Val Asn Arg Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln

50 55 60

Glu Val Thr Tyr Ala Gln Leu Asn His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys

65 70 75 80

Ile Thr Arg Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Thr Ser

85 90 95

Val

<210> 32

<211> 807

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитный белок PTPN6-CD45

<400> 32

Trp Tyr His Gly His Met Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln

1 5 10 15

Ala Lys Gly Glu Pro Trp Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln

20 25 30

Pro Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly

35 40 45

Pro Gly Ser Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys Val Met Cys Glu Gly

50 55 60

Gly Arg Tyr Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp

65 70 75 80

Leu Val Glu His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala

85 90 95

Phe Val Tyr Leu Arg Gln Pro Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys

100 105 110

Arg Ser Cys Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp

115 120 125

Glu Lys Gln Leu Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu

130 135 140

Glu Thr Tyr Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala

145 150 155 160

Glu Phe Gln Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe Pro Ile Lys Glu

165 170 175

Ala Arg Lys Pro Phe Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr Val Asp Ile Leu

180 185 190

Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile Asn Gly Asp Ala

195 200 205

Gly Ser Asn Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly Phe Lys Glu Pro

210 215 220

Arg Lys Tyr Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr Val Asp Asp

225 230 235 240

Phe Trp Arg Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val Ile Val Met Val

245 250 255

Thr Arg Cys Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala Glu Tyr Trp Pro

260 265 270

Ser Met Glu Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly Asp Val Val Val Lys Ile

275 280 285

Asn Gln His Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile

290 295 300

Val Asn Lys Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln

305 310 315 320

Phe Thr Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu

325 330 335

Leu Lys Leu Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly

340 345 350

Pro Ile Val Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr

355 360 365

Ile Gly Ile Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val

370 375 380

Asp Val Tyr Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met

385 390 395 400

Val Gln Val Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu

405 410 415

Tyr Asn Gln Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser Glu Leu His Pro

420 425 430

Tyr Leu His Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro

435 440 445

Leu Glu Ala Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Thr

450 455 460

Gln His Ile Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser

465 470 475 480

Asn Val Ile Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Leu Lys His Glu Leu Glu

485 490 495

Met Ser Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp

500 505 510

Ser Asp Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met

515 520 525

Ser Tyr Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys

530 535 540

Glu Thr Ile Gly Asp Phe Met Ile Gln Arg Lys Val Lys Val Ile Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu Ile Cys Ala Gln Tyr

565 570 575

Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp Ile Glu Val Asp Leu Lys

580 585 590

Asp Thr Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Thr Leu Arg Val Phe Glu Leu Arg

595 600 605

His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr Thr

610 615 620

Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu Ile Ser

625 630 635 640

Met Ile Gln Val Val Lys Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn Ser Ser Glu

645 650 655

Gly Asn Lys His His Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His Cys Arg Asp

660 665 670

Gly Ser Gln Gln Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Glu

675 680 685

Ser Ala Glu Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln Val Val Lys Ala

690 695 700

Leu Arg Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr Phe Glu Gln Tyr Gln

705 710 715 720

Phe Leu Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Tyr Pro Ala Gln Asn Gly Gln

725 730 735

Val Lys Lys Asn Asn His Gln Glu Asp Lys Ile Glu Phe Asp Asn Glu

740 745 750

Val Asp Lys Val Lys Gln Asp Ala Asn Cys Val Asn Pro Leu Gly Ala

755 760 765

Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ala Lys Glu Gln Ala Glu Gly Ser Glu Pro

770 775 780

Thr Ser Gly Thr Glu Gly Pro Glu His Ser Val Asn Gly Pro Ala Ser

785 790 795 800

Pro Ala Leu Asn Gln Gly Ser

805

<210> 33

<211> 434

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитный белок PTPN6-CD148

<400> 33

Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly Glu Pro Trp Thr Phe Leu Val Arg

1 5 10 15

Glu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp

20 25 30

Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys

35 40 45

Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe

50 55 60

Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu

65 70 75 80

Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr Leu Arg Gln Pro Tyr Arg Lys Lys

85 90 95

Arg Lys Asp Ala Lys Asn Asn Glu Val Ser Phe Ser Gln Ile Lys Pro

100 105 110

Lys Lys Ser Lys Leu Ile Arg Val Glu Asn Phe Glu Ala Tyr Phe Lys

115 120 125

Lys Gln Gln Ala Asp Ser Asn Cys Gly Phe Ala Glu Glu Tyr Glu Asp

130 135 140

Leu Lys Leu Val Gly Ile Ser Gln Pro Lys Tyr Ala Ala Glu Leu Ala

145 150 155 160

Glu Asn Arg Gly Lys Asn Arg Tyr Asn Asn Val Leu Pro Tyr Asp Ile

165 170 175

Ser Arg Val Lys Leu Ser Val Gln Thr His Ser Thr Asp Asp Tyr Ile

180 185 190

Asn Ala Asn Tyr Met Pro Gly Tyr His Ser Lys Lys Asp Phe Ile Ala

195 200 205

Thr Gln Gly Pro Leu Pro Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Arg Met Val

210 215 220

Trp Glu Lys Asn Val Tyr Ala Ile Ile Met Leu Thr Lys Cys Val Glu

225 230 235 240

Gln Gly Arg Thr Lys Cys Glu Glu Tyr Trp Pro Ser Lys Gln Ala Gln

245 250 255

Asp Tyr Gly Asp Ile Thr Val Ala Met Thr Ser Glu Ile Val Leu Pro

260 265 270

Glu Trp Thr Ile Arg Asp Phe Thr Val Lys Asn Ile Gln Thr Ser Glu

275 280 285

Ser His Pro Leu Arg Gln Phe His Phe Thr Ser Trp Pro Asp His Gly

290 295 300

Val Pro Asp Thr Thr Asp Leu Leu Ile Asn Phe Arg Tyr Leu Val Arg

305 310 315 320

Asp Tyr Met Lys Gln Ser Pro Pro Glu Ser Pro Ile Leu Val His Cys

325 330 335

Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Phe Ile Ala Ile Asp Arg Leu

340 345 350

Ile Tyr Gln Ile Glu Asn Glu Asn Thr Val Asp Val Tyr Gly Ile Val

355 360 365

Tyr Asp Leu Arg Met His Arg Pro Leu Met Val Gln Thr Glu Asp Gln

370 375 380

Tyr Val Phe Leu Asn Gln Cys Val Leu Asp Ile Val Arg Ser Gln Lys

385 390 395 400

Asp Ser Lys Val Asp Leu Ile Tyr Gln Asn Thr Thr Ala Met Thr Ile

405 410 415

Tyr Glu Asn Leu Ala Pro Val Thr Thr Phe Gly Lys Thr Asn Gly Tyr

420 425 430

Ile Ala

<210> 34

<211> 20

<212> Белок

<213> Вирус ящура

<400> 34

Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

<210> 35

<211> 3390

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR

(MP13974.SFG.aCD19fmc63-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-HCH2CH3pvaa-CD

28tmZw)

<400> 35

atgagcctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgccgccaga 60

ccagacatcc agatgaccca gaccaccagc agcctgagcg ccagcctggg cgaccgggtg 120

accatcagct gcagagccag ccaggacatc agcaagtacc tgaactggta ccagcagaag 180

cccgacggca ccgtgaagct gctgatctac cacaccagcc ggctgcacag cggcgtgccc 240

agccggttca gcggcagcgg cagcggcacc gactacagcc tgaccatcag caacctggag 300

caggaggaca tcgccaccta cttctgccag cagggcaaca ccctgcccta caccttcgga 360

ggcggcacca agctggagat caccaaggcc ggaggcggag gctctggcgg aggcggctct 420

ggcggaggcg gctctggcgg aggcggcagc gaggtgaagc tgcaggagtc tggcccaggc 480

ctggtggccc caagccagag cctgagcgtg acctgcaccg tgagcggcgt gagcctgccc 540

gactacggcg tgagctggat caggcagccc ccacggaagg gcctggagtg gctgggcgtg 600

atctggggca gcgagaccac ctactacaac agcgccctga agagccggct gaccatcatc 660

aaggacaaca gcaagagcca ggtgttcctg aagatgaaca gcctgcagac cgacgacacc 720

gccatctact actgcgccaa gcactactac tatggcggca gctacgctat ggactactgg 780

ggccagggca ccagcgtgac cgtgagctca gatcccacca cgacgccagc gccgcgacca 840

ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 900

ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatcttttgg 960

gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt 1020

attattttct gggtgaggag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1080

cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1140

ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1200

caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1260

gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1320

acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgcctcc tcgcagagcc 1380

gagggcaggg gaagtcttct aacatgcggg gacgtggagg aaaatcccgg gcccatggcc 1440

gtgcccactc aggtcctggg gttgttgcta ctgtggctta cagatgccag atgtgacatc 1500

cagatgacac agtctccatc ttccctgtct gcatctgtcg gagatcgcgt caccatcacc 1560

tgtcgagcaa gtgaggacat ttattttaat ttagtgtggt atcagcagaa accaggaaag 1620

gcccctaagc tcctgatcta tgatacaaat cgcttggcag atggggtccc atcacggttc 1680

agtggctctg gatctggcac acagtatact ctaaccataa gtagcctgca acccgaagat 1740

ttcgcaacct attattgtca acactataag aattatccgc tcacgttcgg tcaggggacc 1800

aagctggaaa tcaaaagatc tggtggcgga gggtcaggag gcggaggcag cggaggcggt 1860

ggctcgggag gcggaggctc gagatctgag gtgcagttgg tggagtctgg gggcggcttg 1920

gtgcagcctg gagggtccct gaggctctcc tgtgcagcct caggattcac tctcagtaat 1980

tatggcatgc actggatcag gcaggctcca gggaagggtc tggagtgggt ctcgtctatt 2040

agtcttaatg gtggtagcac ttactatcga gactccgtga agggccgatt cactatctcc 2100

agggacaatg caaaaagcac cctctacctt caaatgaata gtctgagggc cgaggacacg 2160

gccgtctatt actgtgcagc acaggacgct tatacgggag gttactttga ttactggggc 2220

caaggaacgc tggtcacagt ctcgtctatg gatcccgccg agcccaaatc tcctgacaaa 2280

actcacacat gcccaccgtg cccagcacct cccgtggccg gcccgtcagt cttcctcttc 2340

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc gcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 2400

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 2460

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 2520

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 2580

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 2640

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 2700

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 2760

aatgggcaac cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 2820

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 2880

tcatgctccg tgatgcatga ggccctgcac aatcactata cccagaaatc tctgagtctg 2940

agcccaggca agaaggaccc caagttctgg gtcctggtgg tggtgggagg cgtgctggcc 3000

tgttactctc tcctggtgac cgtggccttc atcatctttt gggtgcgctc ccgggtgaag 3060

ttttctcgct ctgccgatgc cccagcctat cagcagggcc agaatcagct gtacaatgaa 3120

ctgaacctgg gcaggcggga ggagtacgac gtgctggata agcggagagg cagagacccc 3180

gagatgggcg gcaaaccacg gcgcaaaaat ccccaggagg gactctataa cgagctgcag 3240

aaggacaaaa tggccgaggc ctattccgag atcggcatga agggagagag aagacgcgga 3300

aagggccacg acggcctgta tcagggattg tccaccgcta caaaagatac atatgatgcc 3360

ctgcacatgc aggccctgcc acccagatga 3390

<210> 36

<211> 5154

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR

(MP14802.SFG.aCD19fmc63_clean-CD8STK-CD28tmZ-2A-aCD33glx-HCH2CH3p

vaa-dCD45)

<400> 36