Триалкиловые катионные липиды и способы их использования

Изобретение относится к липиду, имеющему структурную формулу X-A-Y-Z (I), или его соли, которые могут найти применение для доставки терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота, в клетку. В формуле (I) X является диалкиламиногруппой; A является C₁-C₆ алкилом; Y выбран из группы, состоящей из карбамата, сложного эфира, необязательно замещенного алкилом карбамата и простого эфира; Z является гидрофобным фрагментом и имеет формулу , где R₁, R₂ и R₃ - каждый независимо выбран из группы, состоящей из C₈-C₁₁ алкила, причем каждый из R₁, R₂ и R₃ независимо может быть насыщенным или ненасыщенным. Изобретение относится также к конкретным липидам формулы (I), липидным частицам, содержащим указанные липиды, фармацевтической композиции, содержащей указанные липидные частицы, способам введения и доставки in vivo терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота, в клетку. 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 6 табл., 4 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым триалкиловым катионным липидам, липидным частицам, содержащим один или более триалкиловых катионных липидов, способам получения частиц липидов, а также способам доставки и/или введения липидных частиц (например, для лечения заболевания у млекопитающих).

Уровень техники

Терапевтические нуклеиновые кислоты включают, например, малые интерферирующие РНК (миРНК), микроРНК (микроРНК), антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, плазмиды, и иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, но, не ограничиваясь ими. Эти нуклеиновые кислоты действуют с помощью различных механизмов. В случае интерферирующих молекул РНК, таких как миРНК и микроРНК, эти нуклеиновые кислоты могут понижать регуляцию внутриклеточного уровня специфических белков с помощью процесса, который называют РНК-интерференцией (РНКи). После введения интерферирующих РНК в цитоплазму клетки, эти двунитевые конструкции РНК могут связываться с белком, называемым RISC. Кодирующая нить интерферирующей РНК перемещенная из комплекса RISC, обеспечивает матрицу внутри RISC, которая может распознавать и связывать мРНК с комплементарной последовательностью связанной интерферирующей мРНК. Связав комплементарную мРНК, RISC комплекс расщепляет РНК и освобождает расщепленные нити. РНКи может обеспечить понижение регуляции специфических белков с помощью целевого специфического уничтожения соответствующих мРНК, которые кодируют синтез белка.

Терапевтическое применение РНКи очень широко, так как интерферирующие РНК конструкции могут быть синтезированы с любой нуклеотидной последовательностью, направленной против белка-мишени. На сегодняшний день, миРНК конструкции показали способность специфически понижать регуляцию белка-мишени в как in vitro, так и in vivo модельных условиях. Кроме того, миРНК конструкции в настоящее время оцениваются в клинических исследованиях.

Тем не менее, две проблемы в настоящее время стоят перед интерферирующими РНК конструктами, во-первых, их восприимчивость к нуклеазному расщеплению в плазме и, во-вторых, их ограниченная способность получать доступ к внутриклеточному пространству, где они могут связывать RISC системно, как свободные, интерферирующие РНК молекулы. Эти двухцепочечные конструкции могут быть стабилизированы путем введения химически модифицированных нуклеотидных линкеров в молекулы, например, фосфотиоатных групп. Тем не менее, такие химически модифицированные линкеры обеспечивают только ограниченную защиту от нуклеазы и могут снижать активность конструкции. Внутриклеточная доставка интерферирующих РНК может быть облегчена за счет использования систем-носителей, таких как полимеры, катионные липосомы, или путем ковалентного присоединения группы холестерина к молекуле. Тем не менее, улучшение систем доставки необходимо для увеличения специфической активности интерферирующих РНК молекул, таких как миРНК и микроРНК и для уменьшения или устранения потребности в химически модифицированных нуклеотидных линкерах.

Кроме того, остаются проблемы с ограниченной способностью терапевтических нуклеиновых кислот, таких как интерферирующие РНК, пересекать клеточные мембраны (см., Vlassov и др., Biochim. Biophys. Acta, 1197: 95-1082 (1994)) и проблемы, связанные с системной токсичностью, такие как комплемент-опосредованная анафилаксия, измененные коагулятивные свойства, и цитопения (Galbraith и др., Antisense Nucl. Acid DrugDes., 4: 201-206 (1994)).

В попытке улучшить эффективность, исследователи также использовали системы-носители на основе липидов, чтобы доставить химически модифицированные или немодифицированные терапевтические нуклеиновые кислоты. Zelphati и др. (J. Contr. Rel., 41:99-119 (1996)) описывает использование анионных (обычных) липосом, чувствительных к pH липосом, иммунолипосом, слитых липосом, и катионных липидных/антисмысловых агрегатов. Аналогично, миРНК были системно введены в катионные липосомы, и эти нуклеиновые кислотно-липидные частицы, как сообщается, обеспечивают улучшенную понижающую регуляцию белков-мишеней у млекопитающих, включая приматов (Zimmermann и др.. Nature, 441: 111-114 (2006)).

Несмотря на этот прогресс, остается потребность в данной области для улучшения липидно-терапевтических композиций нуклеиновых кислот, которые пригодны для общего терапевтического использования. Предпочтительно, эти композиции будут инкапсулировать нуклеиновые кислоты с высокой эффективностью, имеют высокое соотношение препарат: липид, защищают инкапсулированную нуклеиновую кислоту от деградации и расщепления в сыворотке, подходят для системной доставки, а также обеспечивают внутриклеточную доставку инкапсулированной нуклеиновой кислоты. Кроме того, эти частицы нуклеиновых кислот, липидов, должны быть хорошо переносимыми, и обеспечивать адекватный терапевтический индекс, такой, что лечение пациента эффективной дозой нуклеиновой кислоты не связано с существенной токсичностью и/или риском для пациента.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к новым триалкиловым катионным (амино) липидам и липидным частицам, содержащим эти липиды, которые являются выгодными для in vivo доставки нуклеиновых кислот, а также кислотно-липидных композиций нуклеиновых частиц, пригодных in vivo для терапевтического применения. Настоящее изобретение также относится к способам получения таких композиций, а также способам введения нуклеиновых кислот в клетки с помощью этих композиций, например, для лечения различных болезненных состояний. Настоящее изобретение также включает все новые соединения и промежуточные соединения, раскрытые в данном документе.

Как описано в примере 2 в настоящем документе, триалкиловые катионные липиды по настоящему изобретению являются более мощными, в мышином АроВ миРНК анализе, чем другие идентичные липиды, имеющие более длинные алкильные цепи

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к катионным липидам, имеющим структурную формулу (I):

или их солей, например, их фармацевтически приемлемых солей, где:

X является алкиламиногруппой;

A является от C₁ до C₆ необязательно замещенным алкилом, где указанный необязательно замещенный C₁-C₆-алкил может быть насыщенным или ненасыщенным, и где A может присутствовать или может не присутствовать;

Y выбран из группы, состоящей из кеталя, сложного эфира, необязательно замещенного карбамата, эфира, и необязательно замещенного амида; и

Z является гидрофобным фрагментом, состоящим из трех алкильных цепей, где каждая из алкильных цепей имеет длину от C₈ до C₁₁, где каждая из трех алкильных цепей может быть насыщенной или ненасыщенной, и где каждая из трех алкильных цепей является необязательно замещенной.

В отношении липидов формулы (I), типичные примеры алкиламиногрупп состоят из диметиламино-, диэтиламино-, и этилметиламиногрупп.

В отношении липидов формулы (I), типичный пример присутствия необязательного заместителя в виде карбамата и/или амидной группы представляет собой насыщенную или ненасыщенную алкильную группу (например, C₁-C₆ алкил).

В отношении липидов формулы (I), типичный пример необязательного заместителя, который может присутствовать на одной или более из трех алкильных цепей гидрофобного фрагмента Z представляет собой гидроксильную группу.

В отношении липидов формулы (I), должно быть понятно, что там, где алкильная цепь гидрофобного фрагмента Z содержит один или несколько двойных связей или тройных связей, алкильную цепь называют ненасыщенной.

В отношении липидов формулы (I), должно быть понятно, во избежание сомнений, что одна или более алкильная цепь, содержащая гидрофобный фрагмент Z может включать в себя циклоалкильную группу (например, циклопропил).

В отношении липидов формулы (I), следует понимать, что термин "эфир" содержит сложные эфиры, имеющие структуру -C(=O)O- или -OC(=O)-. Термин "амид" содержит амиды, имеющие структуру -C(=O)NR- или -NR(=O)C-. Термин "карбамат" содержит карбаматы, имеющие структуру -OC(=O)NR- или -NRC(=O)O-.

Липиды формулы (I) могут быть использованы, например, для изготовления липидных частиц по настоящему изобретению, которые полезны, например, для доставки терапевтических агентов (например, биологически активных молекул нуклеиновых кислот, таких как миРНК) млекопитающему (например, человеку), нуждающемуся в этом.

В некоторых вариантах реализации липидов формулы (I), Z имеет формулу:

где R¹, R² и R³, каждый отдельно, независимо выбраны из группы, состоящей из C₈ до C₁₁ алкила, где каждый из R¹, R², и R³ независимо друг от друга может быть насыщенным или ненасыщенным, и где каждый из R¹, R², и R³ является необязательно замещенным.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к липидным частицам, содержащим один или более из вышеуказанных катионных липидов формулы I или их солей, например, фармацевтически приемлемых солей. В некоторых вариантах реализации липидные частицы дополнительно содержат один или более некатионных липидов, такие как нейтральные липиды. В некоторых других вариантах реализации липидные частицы дополнительно содержат один или более конъюгированных липидов, способных снижать или ингибировать агрегацию частиц. В дополнительных вариантах реализации липидные частицы дополнительно содержат один или более активных агентов или терапевтических агентов.

В некоторых вариантах реализации, некатионный липидный компонент липидной частицы может содержать фосфолипид, холестерин (или производное холестерина), или их смесь. В одном конкретном варианте реализации фосфолипид содержит дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), или их смесь. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения конъюгированный липидный компонент из липидной частицы содержит полиэтиленгликоль (PEG)-липидный конъюгат. В некоторых случаях PEG-липидный конъюгат содержит PEG-диацилглицерольный (PEG-DAG) конъюгат, PEG-диалкилоксипропиловый (PEG-DAA) конъюгат, или их смесь. В других вариантах реализации липидный конъюгат содержит полиоксазолин (POZ) - липидный конъюгат, такой как конъюгат POZ-DAA.

В некоторых вариантах реализации активное вещество или терапевтический агент включает нуклеиновую кислоту. В некоторых случаях, нуклеиновая кислота содержит интерферирующую молекулу РНК, такую как, например, в миРНК, аиРНК, микроРНК, дайсер-субстратную дсРНК, мхРНК, или их смеси. В некоторых других случаях, нуклеиновая кислота содержит одноцепочечную или двухцепочечную ДНК, РНК или ДНК/РНК гибрид такие, например, как антисмысловой олигонуклеотид, рибозим, плазмиды, иммуностимулирующие олигонуклеотиды или их смеси.

В других вариантах реализации активный агент или терапевтический агент полностью инкапсулируются в липидную часть липидной частицы таким образом, что активный агент или терапевтический агент в липидной частице устойчивы в водном растворе к ферментативному расщеплению, например, с помощью нуклеазы или протеазы. В других вариантах реализации липидные частицы, по существу, не токсичны для млекопитающих, таких как люди.

В некоторых вариантах реализации, данное изобретение обеспечивает липидные частицы (например, LNP), включают: (a) одну или несколько нуклеиновых кислот, таких как интерферирующие молекулы РНК; (b) один или несколько катионных липидов формулы I или их солей, например, фармацевтически приемлемых солей; (c) один или несколько некатионных липидов; и (d) один или более конъюгированных липидов, которые ингибируют агрегацию частиц.

В некоторых вариантах реализации, данное изобретение обеспечивает липидные частицы (например, LNP), которые содержат: (a) одну или несколько нуклеиновых кислот; (b) один или несколько катионных липидов формулы I или их солей, например, фармацевтически приемлемых солей, содержащих от примерно 50 моль % до примерно 85 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; (с) один или несколько некатионных липидов содержащих от примерно 13 моль % до примерно 49,5 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; и (d) один или более конъюгированных липидов, которые ингибируют агрегацию частиц, содержащих от примерно 0,5 моль % до примерно 2 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице.

В одном аспекте варианта реализации, липидные частицы (например, LNP) содержат: (a) нуклеиновую кислоту; (b) катионный липид формулы I или его соль, например, фармацевтически приемлемую соль, содержащую от примерно 52 моль % до примерно 62 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; (c) смесь фосфолипидов и холестерина или его производного, содержащая от примерно 36 моль % до примерно 47 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; и (d) PEG-липидный конъюгат, содержащий от примерно 1 моль % до примерно 2 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице. Этот вариант реализации нуклеиновых кислотно-липидных частиц обычно называют в данном описании как "1:57" композиция. В одном конкретном варианте реализации композиция 1:57 состоит из четырехкомпонентной системы, содержащей примерно 1,4 моль % PEG-липидного конъюгата (например, PEG2000-C-DMA), примерно 57,1 моль % катионного липида формулы I или его соль, примерно 7,1 моль % DPPC (или DSPC), и примерно 34.3 моль % холестерина (или их производных).

В другом аспекте настоящего варианта реализации, липидная частица (например, LNP) содержит: (a) нуклеиновую кислоту; (b) катионный липид формулы I или его соль, например, фармацевтически приемлемую соль, содержащую от примерно 56.5 моль % до примерно 66.5 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; (c) холестерин или его производное, содержащий от примерно 31,5 моль % до примерно 42,5 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; и (d) PEG-липидный конъюгат, содержащий от примерно 1 моль % до примерно 2 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице. Этот вариант реализации нуклеиновой кислотно-липидной частицы обычно называется в данном описании как "1:62" композиция. В одном конкретном варианте реализации композиция 1:62 представляет собой систему из трех компонентов, которая является свободной от фосфолипида и содержит примерно 1,5 моль % PEG-липидного конъюгата (например, PEG2000-C-DMA), примерно 61.5 моль % катионного липида формулы I или его соли, и примерно 36,9 моль % холестерина (или его производного).

Дополнительные варианты реализации, относящиеся к 1:57 и 1:62 композициям, описаны в РСТ публикации WO 09/127060, раскрытие которой входит в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

В других вариантах реализации настоящее изобретение предлагает липидные частицы (например, LNP), содержащие: (a) одну или несколько нуклеиновых кислот; (b) один или несколько катионных липидов формулы I или II или их солей, например, фармацевтически приемлемых солей, содержащих от примерно 2 моль % до примерно 50 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; (c) один или более некатионный липид, содержащий от примерно 5 моль % до примерно 90 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; и (d) один или более конъюгированный липид, который ингибирует агрегацию частиц, содержащий от примерно 0,5 моль % до примерно 20 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице.

В одном аспекте этого варианта реализации, липидная частица (например, LNP) содержит: (a) нуклеиновые кислоты; (b) катионный липид формулы I или его соль, например, фармацевтически приемлемую соль, содержащую от примерно 30 моль % до примерно 50 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; (c) смесь фосфолипидов и холестерина или его производного, содержащий от примерно 47 моль % до примерно 69 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; и (d) PEG-липидного конъюгата, содержащего от примерно 1 моль % до примерно 3 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице. Этот вариант реализации липидных частиц, как правило, упоминается в настоящем документе как "2:40" композиция. В одном конкретном варианте реализации композиция 2:40 представляет собой систему из четырех компонентов, которые содержатся в примерно 2 моль % PEG-липидных конъюгатов (например, PEG2000-C-DMA, примерно 40 моль % катионного липида формулы I или его соли, примерно 10 моль % DPPC (или DSPC), и примерно 48 моль % холестерина (или его производного).

В еще одном варианте реализации настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотно-липидным частицам (например, LNP) содержащим: (a) одну или несколько нуклеиновых кислот; (b) один или несколько катионных липидов формулы I или их солей, например, фармацевтически приемлемых солей, содержащих от примерно 50 моль % до примерно 65 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; (c) один или более некатионных липидов, содержащих от примерно 25 моль % до примерно 45 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; и (d) один или более конъюгированных липидов, которые ингибируют агрегацию частиц, содержащихся от примерно 5 моль % до примерно 10 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице.

В одном аспекте этого варианта реализации нуклеиновая кислотно-липидная частица содержит: (a) нуклеиновые кислоты; (b) катионный липид формулы I или его соль, например, его фармацевтически приемлемую соль, содержащий от примерно 50 моль % до примерно 60 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; (c) смесь фосфолипидов и холестерина или его производного, содержащий от примерно 35 моль % до примерно 45 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; и (d) PEG-липидный конъюгат, содержащий от примерно 5 моль % до примерно 10 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице. Этот вариант реализации нуклеиновых кислотно-липидных частиц обычно называют в данном описании как "7:54" композиция. В некоторых случаях, некатионная липидная смесь в композиции 7:54 содержит: (i) фосфолипид от примерно 5 моль % до примерно 10 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; и (ii) холестерин или его производное от примерно 25 моль % до примерно 35 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице. В одном конкретном варианте реализации композиция 7:54 представляет собой систему из четырех компонентов, которая содержит примерно 7 моль % PEG- липидного конъюгата (например, PEG750-C-DMA), примерно 54 моль % катионного липида формулы I или его соль, примерно 7 моль % DPPC (или DSPC), и примерно 32 моль % холестерина (или его производного).

В другом аспекте данного варианта реализации нуклеиновая кислотно-липидная частица содержит: (a) нуклеиновую кислоту; (b) катионный липид формулы I или его соль, например, его фармацевтически приемлемую соль, содержащий от примерно 55 моль % до примерно 65 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; (c) холестерин или его производное, включающий от примерно 30 моль % до примерно 40 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице; и (d) PEG-липидный конъюгат, содержащий от примерно 5 моль % до примерно 10 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице. Этот вариант реализации нуклеиновой кислотно-липидной частицы обычно называют в данном описании как "7:58" композиция. В одном конкретном варианте реализации композиция 7:58 представляет собой систему из трех компонентов, которая является свободной от фосфолипида и содержит примерно 7 моль % PEG-липидного конъюгата (например, PEG750-C-DMA), примерно 58 моль % катионного липида формулы I или его соль, и примерно 35 моль % холестерина (или его производного).

Дополнительные варианты реализации, относящиеся к 7:54 и 7:58 композициям описаны в опубликованной патентной заявке № US2011/0076335, поданной 30 июня 2010, описание которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим липидные частицы, такие как нуклеиновые кислотно-липидные частицы (например, LNP) и фармацевтически приемлемые носители.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам введения одного или более терапевтических агентов, таких как нуклеиновые кислоты, в клетку, включая контактирование клетки с липидной частицей, описанной в настоящем документе (например, LNP). В одном варианте реализации клетка является клеткой млекопитающего и млекопитающим является человек.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к способам доставки в естественных условиях одного или нескольких терапевтических агентов, таких как нуклеиновые кислоты, причем способ включает введение млекопитающему липидной частицы, описанной в настоящем документе (например, LNP). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения липидные частицы (например, LNP) вводят одним из следующих путей введения: пероральным, интраназальным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутрисуставным, внутриочаговым, внутритрахеальным, подкожным, и внутрикожным. В конкретных вариантах реализации частицы липидов (например, LNP) вводят системно, например, с помощью энтерального или парентерального путей введения. В предпочтительных вариантах реализации млекопитающее является человеком.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способам лечения заболевания или расстройства у млекопитающего, нуждающегося в этом, включающем введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества липидной частицы (например, LNP) содержащей один или более терапевтический агент, такой как нуклеиновые кислоты. Неограничивающие примеры заболеваний или нарушений содержат вирусную инфекцию, заболевание или нарушения печени и рак. Предпочтительно млекопитающее является человеком.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к способам лечения заболевания или расстройства печени путем введения нуклеиновой кислоты, такой как интерферирующая РНК (например, миРНК) в нуклеиновых кислотно-липидных частицах (например, LNP), отдельно или в комбинации с гиполипидемическим агентом. Примеры липидных заболеваний и расстройств содержат дислипидемии (например, гиперлипидемии, такие как повышение уровня триглицеридов (гипертриглицеридемия) и/или повышение уровня холестерина (гиперхолестеринемия)), атеросклероз, коронарная болезнь сердца, заболевания коронарной артерии, атеросклеротическое заболевание сердечно-сосудистой системы (CVD), жировая болезнь печени (стеатоз печени), нарушение липидного обмена, нарушение метаболизма холестерина, сахарный диабет (в том числе сахарный диабет 2 типа), ожирение, сердечно-сосудистые заболевания, а также другие расстройства, связанные с нарушением метаболизма, но не ограничиваются ими. Не ограничивающие примеры гиполипидемических агентов содержат статины, фибраты, эзетимибы, тиазолидиндионы, ниацины, бета-блокаторы, нитроглицерины, антагонисты кальция, и рыбий жир.

В одном конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу снижения или уменьшения уровня холестерина у млекопитающего (например, человека), нуждающегося в этом (например, млекопитающему с уровнем холестерина в крови), причем способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества нуклеиновых кислотно-липидных частиц (например, композиция LNP), описанного в настоящем документе, содержащих одну или более интерферирующих РНК (например, миРНК), которые предназначаются для одного или нескольких генов, связанных с метаболическими заболеваниями и расстройствами. В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу снижения или уменьшения уровня триглицеридов в организме млекопитающего (например, человека), нуждающегося в этом (например, млекопитающего с повышенным уровнем триглицеридов в крови), причем способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислотно-липидной частицы (например, композиция LNP), описанной в настоящем документе, содержащей одну или несколько интерферирующих РНК (например, миРНК), которые предназначаются для одного или нескольких генов, связанных с метаболическими заболеваниями и расстройствами. Эти способы могут быть проведены in vitro с использованием стандартных технических приемов с культурой ткани или in vivo путем введения интерферирующей РНК (например, миРНК) с помощью любых средств, известных в данной области. В предпочтительных вариантах реализации интерферирующая РНК (например, миРНК) поступает в клетки печени (например, гепатоциты) у млекопитающего, такого как человек.

Дополнительные варианты реализации, связанные с лечением заболевания печени или нарушением использования липидных частиц описаны, например, в РСТ заявке РСТ/СА2010/000120, поданной 26 января 2010, и заявке на патент США №2006/0134189, раскрытие которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей.

В других вариантах реализации настоящее изобретение относится к способам лечения клеточного пролиферативного нарушения, такого как рак, путем введения нуклеиновой кислоты, такой как интерферирующая РНК (например, миРНК) в нуклеиновых кислотно-липидных частицах (например, LNP), по отдельности или в комбинации с химиотерапевтическими препаратами. Эти методы могут быть выполнены in vitro с использованием стандартных технических приемов с культурой ткани или in vivo путем введения интерферирующей РНК (например, миРНК) с помощью любых средств, известных в данной области. В предпочтительных вариантах реализации интерферирующая РНК (например, миРНК) поступает в клетку рака у млекопитающего, такого как человек, отдельно или в комбинации с химиотерапевтическим препаратом. Нуклеиновые кислотно-липидные частицы и/или химиотерапевтические препараты также могут быть введены совместно с обычными гормональными, иммунотерапевтическими и/или радиотерапевтическими агентами.

Дополнительные варианты реализации, связанные с лечением клеточного пролиферативного нарушения, использующие липидную частицу, описаны, например, в РСТ публикации WO 09/082817, заявке на патент США №2009/0149403, и РСТ публикации WO 09/129319, раскрытие которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

В еще одном варианте реализации настоящее изобретение относится к способам профилактики или лечения вирусной инфекции, такой как ареновирус (например, вирус лихорадки Ласса) или филовирус (например, вирус Эбола, вирус Марбург и т.д.), инфицирование которыми приводит к геморрагической лихорадке или гепатиту (например, вирус гепатита C), которые вызывают острые или хронические гепатиты путем введения нуклеиновой кислоты, такой как интерферирующая РНК (например, миРНК) в нуклеиновых кислотно-липидных частицах (например, LNP), отдельно или в сочетании с введением обычного средства, применяемого для лечения или облегчения вирусного состояния или любого из признаков, связанных с ним. Эти способы могут быть выполнены in vitro с использованием стандартных методов культуры ткани или in vivo путем введения интерферирующей РНК с использованием любых средств, известных в данной области. В некоторых вариантах реализации, интерферирующая РНК (например, миРНК) доставляется в клетки, ткани или органы млекопитающего, такого как человек, которые инфицированы и/или допускается заражение вирусом геморрагической лихорадки, таких как, например, клеток ретикулоэндотелиальной системы (например, моноцитов, макрофагов и т.д.). В некоторых других вариантах реализации, интерферирующая РНК (например, миРНК) доставляется в клетки, ткани или органы млекопитающего, такого как человек, которые инфицированы и/или допускается заражение вирусом гепатита, таких как, например, клеток печени (например, гепатоцитов).

Дополнительные варианты реализации, относящиеся к профилактике или лечению вирусной инфекции с использованием липидной частицы, описаны, например, в заявке на патент США №2007/0218122, заявке на патент США 2007/0135370, и РСТ заявке РСТ/СА2010/000444, озаглавленной "Композиции и способы для усмирения экспрессии вируса гепатита С", поданной 19 марта 2010, описания которых приведены в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

Липидные частицы по настоящему изобретению (например, LNP), содержащие один или более катионный липид формулы I или его соли, например, фармацевтически приемлемые соли, являются особенно предпочтительными, и подходят для использования при введении нуклеиновых кислот, таких как интерферирующие РНК, субъекту (например, млекопитающему, такому как человек), так как они стабильны в обращении, имеют требуемый размер для фармакодинамического поведения при доступе к экстраваскулярным сайтам и способны достигать популяции клеток-мишеней.

Другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны для специалиста в данной области из следующего подробного описания и фигур.

Осуществление изобретения

Вступление

Настоящее изобретение основано, частично, на открытии новых катионных (амино) липидов, которые обеспечивают преимущества при использовании липидных частиц для доставки in vivo активного или терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота, в клетку млекопитающего. В частности, настоящее изобретение относится к композиции нуклеиновых кислотно-липидных частиц, включающих один или более новых катионных липидов, описанный в настоящем документе, которые обеспечивают повышение активности нуклеиновой кислоты (например, интерферирующих РНК) и улучшают переносимость композиций in vivo, в результате чего значительно увеличивается терапевтический индекс по сравнению с композициями нуклеиновых кислотно-липидных частиц, описанных выше.

В конкретных вариантах реализации, данное изобретение обеспечивает новые катионные липиды, которые позволяют разработать улучшенные композиции для in vitro и in vivo доставки интерферирующих РНК, таких как миРНК. Показано, что в данном документе эти улучшенные композиции липидных частиц эффективны при понижающей регуляции (например, выключении) уровней белка и/или уровней мРНК генов-мишеней. Кроме того, в настоящем документе показано, что активность этих улучшенных композиций липидных частиц зависит от присутствия новых катионных липидов согласно изобретению.

Липидные частицы и композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для различных целей, в том числе доставки инкапсулированных или связанных (например, комплексов) терапевтических агентов, таких как нуклеиновые кислоты в клетки, как in vitro, так и in vivo. Соответственно, настоящее изобретение также относится к способам лечения заболеваний или нарушений у субъектов, нуждающихся в этом, путем контактирования субъекта с липидной частицей, которая инкапсулирует или связывает соответствующий терапевтический агент, отличающийся тем, что липидная частица содержит один или более новых катионных липидов, описанных в настоящем документе.

Как описано в настоящем документе, липидные частицы по настоящему изобретению особенно полезны для доставки нуклеиновых кислот, в том числе, например, интерферирующих РНК-молекул, таких как миРНК. Таким образом, могут быть использованы частицы липидов и композиции по настоящему изобретению для снижения экспрессии генов-мишеней и белков in vitro и in vivo путем контактирования клеток с липидной частицей, содержащей один или более новых катионных липидов, описанных в настоящем документе, в котором липидная частица инкапсулирует или связывает нуклеиновую кислоту, которая уменьшает экспрессию генов-мишеней (например, миРНК). Альтернативно, липидные частицы и композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для увеличения экспрессии целевого белка in vitro и in vivo путем контактирования клеток с липидной частицей, содержащей один или более новых катионных липидов, описанных в настоящем документе, который инкапсулирован в липидную частицу или связан с нуклеиновой кислотой, что повышает экспрессию желаемого белка (например, плазмиду, кодирующую желаемый белок).

Различные примерные варианты реализации катионных липидов по настоящему изобретению, липидных частиц и композиций, которые их содержат, и их использование для доставки активных или терапевтические агентов, таких как нуклеиновые кислоты, чтобы модулировать экспрессии генов и белков, более подробно описаны ниже.

Определения

В настоящем описании следующие термины имеют значения, закрепленные за ними, если не указано иное.

Термин "примерно", используемый в связи с количеством компонента в липидной частице или композиции по настоящему изобретению содержит значения, плюс или минус 5% от указанного количества компонента (например, примерно 10% охватывает значения от 9,5% до 10,5%). Термин "примерно", следовательно, также содержит значения, плюс или минус 1%, 2%, 3%, или 4% от указанного количества компонента.

Термины "интерферирующие РНК" или РНКи" или "интерферирующие последовательности РНК", используемые в настоящем документе, включают в себя одноцепочечные РНК (например, зрелые микроРНК, ссРНК олигонуклеотиды, ссДНК олигонуклеотиды) или двухцепочечные РНК (т.е., дуплекс РНК, такие как миРНК, дайсер-субстратные дцРНК, мхРНК, аиРНК, или пре-микроРНК), которые способны уменьшать или ингибировать экспрессию гена-мишени или последовательности (например, непосредственным вмешательством в деградацию или ингибированием трансляции мРНК, комплементарный интерферирующей последовательности РНК), когда интерферирующая РНК находится в той же клетке, что и ген-мишень или последовательность. Интерферирующие РНК, таким образом, относятся к одноцепочечным РНК, комплементарным последовательности мРНК-мишени или двухцепочечной РНК, образованной двумя комплементарными нитями или одной, самостоятельно комплементарной цепью. Интерферирующие РНК могут иметь существенное или полное тождество с целевым геном или последовательностью, или могут содержать область несоответствия (т.е. несоответствующий мотив). Последовательность интерферирующих РНК может соответствовать целевому гену полной длины, или его подпоследовательности. Предпочтительно, интерферирующие РНК-молекулы синтезированы химически.

Интерферирующие РНК включают "малые-интерферирующие РНК" или "миРНК", например, интерферирующие РНК из примерно 15-60, 15-50 или 15-40 (дуплекс) нуклеотидов, более типично примерно из 15-30, 15-25, или 19-25 (дуплекс) нуклеотидов в длину, и предпочтительно примерно из 20-24, 21-22, или 21-23 или (дуплекс) нуклеотидов в длину (например, каждая комплементарная последовательность в двухцепочечной миРНК является 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, или 19-25 нуклеотидами в длину, примерно 20-24, 21-22, или 21-23 нуклеотидами в длину, и двухцепочечные миРНК является примерно 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, или 19-25 парами оснований в длину, предпочтительно примерно 18-22, 19-20, или 19-21 парами оснований в длину). МиРНК дуплексы могут включать 3' выступающих от примерно 1 до примерно 4 нуклеотидов или от примерно 2 до примерно 3 нуклеотидов и 5' фосфат концов. Примеры миРНК содержат двухцепочечную молекулу полинуклеотида, собранную из двух отдельных скрученных молекул, в которой одна цепь является смысловой цепью, а другой является дополнительной антисмысловой цепью; двухцепочечную молекулу полинуклеотида, собранную из одноцепочечной молекулы, где смысловая и антисмысловая области связаны посредством нуклеинового кислотно-основного или ненуклеинового кислотно-основного линкера; двухцепочечную молекулу полинуклеотида со шпилькой вторичной структуры, имеющей самокомплементарную смысловую и антисмысловую области; и кольцевую одноцепочечную молекулу полинуклеотида с двумя или более структурами петли и штока, имеющую самокомплементарную смысловую и антисмысловую области, где круговой полинуклеотид может быть обработан in vivo или in vitro, чтобы сформировать активную двухцепочечную молекулу миРНК.

Предпочтительно, миРНК являются химически синтезированными. МиРНК также могут быть получены путем расщепления длинной дцРНК (например, дцРНК большей, чем примерно 25 нуклеотидов в длину) с помощью РНКазы III или Дайсер Е. coli. Эти ферменты превращают дцРНК в биологически активную миРНК (см., например, Yang и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 9942-9947 (2002); Calegari и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 14236 (2002); Byrom и др., Ambion TechNotes. 10 (1): 4-6 (2003); Kawasaki и др., Nucleic Acids Res., 31: 981-987 (2003); Knight и др.. Science, 293: 2269-2271 (2001); and Robertson и др., J. Biol. Chem., 243: 82 (1968)). Предпочтительно, дцРНК имеет от по меньшей мере 50 нуклеотидов до примерно 100, 200, 300, 400, или 500 нуклеотидов в длину. ДцРНК может иметь длину 1000, 1500, 2000, 5000 нуклеотидов в длину, или больше. ДцРНК может кодировать весь транскрипт гена или частичный транскрипт гена. В некоторых случаях, миРНК могут быть закодированы с помощью плазмиды (например, прописаны в виде последовательностей, которые автоматически складываются в дуплексы с шпилечными петлями).

Как используется в настоящем документе, термины "мотив несоответствия" или "область несоответствия" относятся к части последовательности интерферирующих РНК (например, миРНК), которая не имеет 100% комплементарность с целевой последовательностью. Интерферирующая РНК может иметь, по меньшей мере, один, два, три, четыре, пять, шесть, или более несоответствующих областей. Несоответствующие области могут быть непрерывными или могут быть разделены с помощью 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более нуклеотидов. Несоответствующие мотивы или области могут состоять из одного нуклеотида или могут содержать два, три, четыре, пять, или более нуклеотидов.

Фраза "ингибировать экспрессию гена-мишени" относится к способности интерферирующих РНК (например, миРНК), или других терапевтических агентов выключать, уменьшать или ингибировать экспрессию гена-мишени. Чтобы исследовать степень выключения генов, тестируемый образец (например, образец клеток в культуре, экспрессирующих ген-мишень) или тестируемое млекопитающее (например, млекопитающее, такое как человек или животная модель, такая как модель грызуна (например, мыши) или нечеловеческого примата (например, обезьяны)) приводят в контакт с интерферирующей РНК (например, миРНК), что выключает, уменьшает или ингибирует экспрессию гена-мишени. Экспрессия гена-мишени в исследуемом образце или подопытном животном по сравнению с экспрессией гена-мишени в контрольном образце (например, образце клеток в культуре, экспрессирующих ген-мишень) или контрольном млекопитающем (например, млекопитающем, таком как человек или животная модель, например, модель грызуна (например, мыши) или нечеловеческого примата (например, обезьяны)), что не контактирует с или не подвергается введению интерферирующей РНК (например, миРНК). Экспрессии гена-мишени в контрольном образце или контрольном млекопитающем может быть присвоено значение 100%. В конкретных вариантах реализации, выключение, ингибирование или снижение экспрессии гена-мишени достигается, когда уровень экспрессии гена-мишени в исследуемом образце или тестируемом млекопитающем по сравнению с уровнем экспрессии гена-мишени в контрольном образце или контрольном млекопитающем составляет примерно 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или 0%. Другими словами, интерферирующая РНК (например, миРНК) выключает, уменьшает или ингибирует экспрессию гена-мишени по меньшей мере примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% в тестируемом образце, или тестируемом млекопитающем по сравнению с уровнем экспрессии генов-мишеней в контрольном образце или контрольном млекопитающем, которые не контактируют с или не подвергаются введению интерферирующей РНК (например, миРНК). Подходящие анализы для определения уровня экспрессии гена-мишени включают, без ограничения, уровни тестирования белка или мРНК с использованием способов, известных специалистам в данной области, таких как, например, дот блот анализ, Нозерн-блоттинг, in situ гибридизация, ELISA, иммунопреципитация, функции ферментов, а также фенотипические анализы, известные специалистам в данной области.

Термин "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" активного агента или терапевтического агента, такого как интерферирующая РНК, является количеством, достаточным для получения желаемого эффекта, например, ингибирования экспрессии последовательности-мишени по сравнению с нормальным уровнем экспрессии, обнаруженном в отсутствии интерферирующих РНК. Ингибирование экспрессии последовательности-мишени или гена-мишени достигается тогда, когда значение, полученное с помощью интерферирующих РНК по отношению к контролю составляет примерно 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или 0%. Подходящие анализы для измерения экспрессии гена-мишени или последовательности-мишени включают в себя, например, тестирование уровней белка или РНК с использованием способов, известных специалистам в данной области, таких как дот блот анализ, Нозерн-блоттинг, in situ гибридизация, ELISA, иммунопреципитация, ферментные функции, а также фенотипические анализы, известные специалистам в данной области.

Под "снижать", "снижение", "уменьшать" или "уменьшение" иммунного ответа с помощью интерферирующих РНК имеют в виду обнаруживаемое снижение иммунного ответа, который дается на интерферирующие РНК (например, измененные интерферирующие РНК) или другие терапевтические агенты. Количество снижения иммунного ответа с помощью модифицированных интерферирующих РНК может быть определено по отношению к уровню иммунного ответа в присутствии немодифицированных интерферирующих РНК. Обнаруживаемое уменьшение может быть примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% или более низким, чем иммунный ответ, обнаруживаемый в присутствии немодифицированных интерферирующих РНК. Снижение иммунного ответа на интерферирующие РНК, как правило, измеряется с помощью снижения продукции цитокинов (например, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-6, или IL-12) с помощью отвечающей клетки in vitro или уменьшением продукции цитокинов в сыворотке млекопитающего после введения интерферирующих РНК.

Как используется в настоящем документе, термин "отвечающая клетка" относится к клетке, предпочтительно клетке млекопитающего, которая производит детектируемый иммунный ответ при контакте с иммуностимулирующей интерферирующей РНК, такой как немодифицированная миРНК. Примеры иммунокомпетентных клеток содержат, например, дендритные клетки, макрофаги, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), спленоциты и тому подобное. Обнаруживаемые иммунные реакции, включают, например, продукцию цитокинов или факторов роста, таких как TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, TGF, а также их комбинации. Обнаруживаемые иммунные реакции также включают, например, индукцию интерферон-индуцированного белка с тетратрикопептид повтором 1 (IFIT1) мРНК.

"В основном идентичная" относится к последовательности, которая гибридизуется с эталонной последовательностью в жестких условиях или с последовательностью, которая имеет указанный процент идентичности к указанной области эталонной последовательности.

Термин "жесткие условия гибридизации" относится к условиям, при которых нуклеиновая кислота гибридизуется с целевой последовательностью, как правило, в виде сложной смеси нуклеиновых кислот, но без других последовательностей. Жесткие условия являются последовательность-зависимыми и будет отличаться в разных обстоятельствах. Более длинные последовательности гибридизуются в частности, при более высоких температурах. Обширное пособие для гибридизации нуклеиновых кислот находится в Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Как правило, жесткие условия выбираются так, чтобы быть примерно 5-10°C ниже точки плавления (Т_п) для конкретной последовательности при определенной ионной силе pH. Т_п представляет собой температуру (при определенной ионной силе, pH и нуклеиновой концентрации), при которой 50% зондов, комплементарных к мишени гибридизируют с последовательностью-мишенью в равновесии (так как последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Т_п, 50% зондов заняты в равновесии). Жесткие условия могут быть также достигнуты с добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации, позитивный сигнал, по меньшей мере, в два раза, предпочтительно в 10 раз больше исходной гибридизации.

Примерные жесткие условия гибридизации могут быть следующими: 50% формамида, 5×SSC, и 1% SDS, инкубации при 42°C, или, 5×SSC, 1% SDS, инкубации при 65°C, с промывкой в 0.2×SSC и 0,1% SDS при 65°C. Для PCR, при температуре примерно 36°C, что характерно для амплификации низкой жесткости, хотя температура отжига может варьироваться между примерно 32°C и 48°C в зависимости от длины праймера. Для высокой жесткости PCR-амплификации температура примерно 62°C является типичной, хотя высокая жесткая температура отжига может находиться в диапазоне от примерно 50°C до примерно 65°C, в зависимости от длины праймера и специфичности. Типичные условия цикла для амплификации высокой и низкой жесткости включают в себя фазу денатурации 90°C-95°C в течение 30 сек.-2 мин., фазу отжига длительностью 30 сек. - 2 мин., и фазу расширения примерно 72°C в течение 1-2 мин. Протоколы и руководствующие принципы для реакций амплификации с низкой и высокой жесткостью предусмотрены, например, в Innis и др., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y. (1990).

Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в жестких условиях все еще, по существу, идентичны, если полипептиды, которые они кодируют, по существу идентичны. Это происходит, например, когда копию нуклеиновой кислоты создают с использованием максимума вырожденного кодона, допускаемого генетическим кодом. В таких случаях, нуклеиновые кислоты, как правило, гибридизуются в умеренно жестких условиях гибридизации. Примеры "умеренно жестких условий гибридизации" включают в себя гибридизацию в буфере 40% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS при 37°C и промывку в 1XSSC при 45°C. Положительная гибридизация по меньшей мере вдвое больше исходной. Специалисты легко поймут, что альтернативные условия гибридизации и отмывки могут быть использованы, чтобы обеспечить условия аналогичной жесткости. Дополнительные руководствующие принципы для определения параметров гибридизации представлены в многочисленных ссылках, например. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel и др., eds.

Термины "по существу идентичны" или "в основном идентичны", в контексте двух или более нуклеиновых кислот, относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые одинаковы или имеют определенный процент нуклеотидов, которые являются одинаковыми (т.е., по меньшей мере примерно 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности в пределах определенной области), при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в рамке сравнения, или обозначенная область измеряется с помощью одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем ручного выравнивания и визуального осмотра. Это определение, когда контекст указывает, также аналогично относится к комплементу последовательности. Предпочтительно, значительная идентичность существует в области, которая имеет, по меньшей мере, примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, или 60 нуклеотидов в длину.

Для сравнения последовательностей, как правило, одна последовательность действует в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают тестовые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей, тестируемая и эталонная последовательности вводятся в компьютер, обозначают координаты подпоследовательности, при необходимости, и обозначают параметры программы алгоритма последовательности. Могут быть использованы параметры программы по умолчанию, или могут быть определены альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей рассчитывает процент совпадения последовательностей для тестовых последовательностей относительно эталонной последовательности, на основе параметров программы.

"Рамка сравнения", как она использована в настоящем документе, содержит ссылку на сегмент любого одного из ряда смежных положений, выбранных из группы, состоящей из примерно от 5 до примерно 60, обычно от примерно 10 до примерно 45, более обычно примерно от 15 до примерно 30, в котором последовательность можно сравнить с эталонной последовательностью одного и того же количества смежных положений после того, как эти две последовательности оптимально выровнены. Способы выравнивания последовательностей для сравнения, хорошо известны в данной области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman, Adv. Appl. Math, 2: 482 (1981), с помощью алгоритма выравнивания гомологии Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 (1970), в способе поиска подобия Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 (1988), с использованием компьютерных реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), или ручным выравниванием и визуальным осмотром (см, например. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel и др., eds. (1995 supplement)).

He ограничивающие примеры алгоритмов, которые подходят для определения процента идентичности последовательности и сходства последовательностей являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul и др., Nuc. Acids Res., 25: 3389-3402 (1977) и Altschul и др., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990), соответственно. BLAST и BLAST 2.0 используются с описанными в настоящем документе параметрами, чтобы определить процентную идентичность последовательностей для нуклеиновых кислот согласно изобретению. Программное обеспечение для реализации BLAST анализов является общедоступным через Национальный центр биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Другим примером является алгоритм глобального выравнивания для определения процента идентичности последовательности, такой как алгоритм Needleman-Wunsch для выравнивания белковых или нуклеотидных (например, РНК) последовательностей.

Алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см, например, Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5787 (1993)). Одним из показателей сходства с помощью алгоритма BLAST является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая обеспечивает индикацию вероятности, с которой совпадение между двумя нуклеотидными последовательностями было бы случайно. Например, нуклеиновая кислота считается аналогичной эталонной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестовой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой меньше, чем примерно 0,2, более предпочтительно менее чем примерно 0,01, и наиболее предпочтительно менее чем примерно 0,001.

Термин "нуклеиновая кислота", используемый в настоящем документе, относится к полимеру, содержащему по меньшей мере два дезоксирибонуклеотида или рибонуклеотида в любой одноцепочечной или двухцепочечной форме и содержит ДНК и РНК. ДНК может быть в форме, например, антисмысловых молекул, ДНК плазмид, предварительно конденсируемой ДНК, PCR-продукта, векторов (Р1, РАС, ВАС, YAC, искусственных хромосом), кассет экспрессии, химерных последовательностей, хромосомной ДНК, или производных и комбинации этих групп. РНК может быть в виде малых интерферирующих РНК (миРНК), Дайсер-субстратных дсРНК, небольшой шпильки РНК (ншРНК), асимметричных интерферирующих РНК (аиРНК), микроРНК (микроРНК), мРНК, тРНК, рРНК, тРНК, вирусной РНК (вРНК), поливалентной РНК (ПВ РНК), а также их комбинации. Нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированных остатков или связей, которые являются синтетическими, встречающимися в природе, не встречающимися в природе, и которые имеют сходные свойства связывания в качестве эталонной нуклеиновой кислоты. Примеры таких аналогов содержат, без ограничения, фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метил-фосфонаты, хиральные метил-фосфонаты, 2'-O-метил рибонуклеотиды, и пептид-нуклеиновые кислоты (ПНК). Без специального ограничения, термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют аналогичные свойства связывания в качестве эталонной нуклеиновой кислоты. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также косвенно охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также последовательности, указанные в явном виде. В частности, замены вырожденных кодонов могут быть достигнуты путем создания последовательности, в которой третье положение одного или более выбранных (или всех) кодонов замещено смешано-основным и/или дезоксиинозиновыми остатками (Batzer и др., Nucleic Acid Res., 19: 5081 (1991); Ohtsuka и др., J. Biol. Chem., 260: 2605-2608 (1985); Rossolini и др., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)). "Нуклеотиды" содержат сахара дезоксирибозы (ДНК) или рибозы (РНК), основание, и фосфатную группу. Нуклеотиды связаны друг с другом через фосфатные группы. "Основы" содержат пурины и пиримидины, которые дополнительно содержат природные соединения аденин, тимин, гуанин, цитозин, урацил, инозин, и природные аналоги и синтетические производные пуринов и пиримидинов, которые содержат модификации, но не ограничиваются ими, которые имеют новые реакционноспособные группы, такие как амины, спирты, тиолы, карбоксилаты и алкилгалогениды, но не ограничиваясь ими.

Термин «ген» относится к последовательности нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), которая содержит частичную длину или целые длины последовательностей кодирования, необходимые для получения полипептида или предшественника полипептида.

"Генный продукт", как он использован в настоящем документе, относится к продукту гена, такого как РНК-транскрипт или полипептид.

Термин "липид" относится к группе органических соединений, которые охватывают сложные эфиры жирных кислот, но не ограничиваются ими, и характеризуется тем, что нерастворимы в воде, но растворимы во многих органических растворителях. Они, как правило, делятся по меньшей мере на три класса: (1) "простые липиды", которые включают в себя жиры и масла, а также воски; (2) "сложные липиды", которые содержат фосфолипиды и гликолипиды; и (3) "производные липиды", такие как стероиды.

Термин "липидная частица" охватывает липидный препарат, который может быть использован для доставки активного агента или терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота (например, интерферирующая РНК), в интересующий сайт-мишень (например, клетку, ткань, орган и тому подобное). В предпочтительных вариантах реализации липидная частица по настоящему изобретению представляет собой липидную наночастипу, которая, как правило, формируется из катионного липида, некатионного липида, и, необязательно, конъюгированного липида, который предотвращает агрегацию частиц. В других предпочтительных вариантах реализации, которые могут быть отнесены к "нуклеиновым кислотно-липидным частицам", активный агент или терапевтическое средство, например нуклеиновая кислота, могут быть инкапсулированы в липидную часть частицы, тем самым защищая ее от ферментативного расщепления.

Как используется в настоящем документе, термин "LNP" относится к липидной наночастице. LNP представляет собой частицу, изготовленную из липидов (например, катионный липид, некатионный липид, и, необязательно, конъюгированный липид, что предотвращает агрегацию частиц), где нуклеиновая кислота (например, интерферирующая РНК) полностью инкапсулируются в липид. В некоторых случаях, LNP чрезвычайно полезны для системных приложений, так как они могут иметь расширенный жизненный цикл после внутривенной (в.в.) инъекции, они могут накапливаться в дистальных участках (например, физически отделенных сайтах от сайта введения), и они могут опосредовать выключение экспрессии целевых генов в этих дистальных сайтах. Нуклеиновая кислота может быть в виде комплекса с конденсирующим агентом и инкапсулированными внутри LNP, как изложено в публикации РСТ WO 00/03683, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Липидные частицы по настоящему изобретению (например, LNP) обычно имеют средний диаметр от примерно 30 нм до примерно 150 нм, от примерно 40 нм до примерно 150 нм, от примерно 50 нм до примерно 150 нм, от примерно 60 нм до примерно 130 нм, от примерно 70 нм до примерно 110 нм, от примерно 70 нм до примерно 100 нм, от примерно 80 нм до примерно 100 нм, от примерно 90 нм до примерно 100 нм, от примерно 70 до примерно 90 нм, от примерно 80 нм до примерно 90 нм, от примерно 70 нм до примерно 80 нм, или примерно 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 55 нм, 60 нм, 65 нм, 70 нм, 75 нм, 80 нм, 85 нм, 90 нм, 95 нм, 100 нм, 105 нм, 110 нм, 115 нм, 120 нм, 125 нм, 130 нм, 135 нм, 140 нм, 145 нм, или 150 нм, и по существу не токсичны. Кроме того, нуклеиновые кислоты, если они присутствуют в липидных частицах по настоящему изобретению, являются устойчивыми в водном растворе к деградации с нуклеазой. Липидные наночастицы и способ их получения описаны, например, в публикации заявки на патент США №2004/0142025 и 2007/0042031, раскрытие которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей.

В настоящем описании, "инкапсулированный липид" может относиться к липидной частице, которая обеспечивает активный агент или терапевтическое средство, такое как нуклеиновая кислота (например, интерферирующая РНК), с полной герметизацией, частичной герметизацией, или обоими. В предпочтительном варианте реализации нуклеиновая кислота полностью заключена в липидную частицу (например, с образованием LNP).

Термин "липидный конъюгат" относится к коньюгированному липиду, который ингибирует агрегацию частиц липидов. Такие липидные конъюгаты охватывают PEG-конъюгаты липидов, таких как, например, PEG соединенные с диалкилоксипропилами (например, PEG-конъюгаты DAA), PEG соединен с диапилглицеринов (например, PEG-конъюгатов DAG), PEG соединенные с холестерином, связанные с PEG фосфатидилэтаноламины, и PEG, конъюгированные с церамидами (смотри, например, патент США №5885613), катионные PEG липиды, полиоксазолиновые (POZ)-липидные конъюгаты, полиамидные олигомеры (например, АТТА-липидные конъюгаты) и их смеси, но не ограничиваются ими. Дополнительные примеры POZ-липидных конъюгатов описаны в РСТ публикации WO 2010/006282. PEG или POZ могут быть конъюгированы непосредственно с липидом или могут быть связаны с липидами посредством линкерной части молекулы. Может быть использован любой связующий фрагмент, предназначенный для соединения PEG или POZ с липидом, в том числе, например, несодержащие эфир линкерные фрагменты и эфирсодержащие линкерные фрагменты. В некоторых предпочтительных вариантах реализации используются несодержащие эфир линкерные фрагменты, такие как амиды или карбаматы. Раскрытие каждого из указанных выше патентных документов, включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Термин "амфипатические липиды" относится, в частности, к любому подходящему материалу, отличающемуся тем, что гидрофобная часть липидного материала ориентирована в гидрофобной фазе, в то время как гидрофильная часть ориентирована по направлению к водной фазе. Гидрофильные характеристики вытекают из присутствия полярных или заряженных групп, таких как углеводных, фосфатных, карбоновых, сульфатных, амино, сульфгидрильных, нитро, гидроксильных, и других подобных групп. Гидрофобность может быть достигнута за счет включения неполярных групп, которые охватывают длинноцепочечные, насыщенные и ненасыщенные алифатические углеводородные группы, и такие группы, замещенные одной или более ароматической, циклоалифатической или гетероциклической группой(ами), но не ограничиваются ими. Примеры амфипатических соединений охватывают фосфолипиды, аминолипиды и сфинголипиды, но не ограничиваются ими.

Типичные примеры фосфолипидов охватывают фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидную кислоту, фосфатидилхолин, пальмитоилолеоил лизофосфатидилхолина, лизофосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилхолин, и дилинолеоилфосфатидилхолин, но не ограничиваются ими. Другие соединения, без фосфора, такие как сфинголипиды, семейство гликосфинголипидов, диацилглицерины и β-ацилокси кислоты, также находятся в группе, определяемой как амфипатические липиды. Кроме того, амфипатические липиды, описанные выше, могут быть смешаны с другими липидами, в том числе триглицериды и стерины.

Термин "нейтральный липид" относится к любому из нескольких видов липидов, которые существуют либо в незаряженной, либо в нейтральной цвиттер-ионной форме при выбранном значении pH. При физиологическом значении pH, такие липиды охватывают, например, диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, церамид, сфингомиелин, цефалин, холестерин, цереброзиды и диацилглицерины.

Термин "некатионный липид" относится к любому амфипатическому липиду, а также любому другому нейтральному липиду или анионному липиду.

Термин "анионный липид" относится к любому липиду, который отрицательно заряжен при физиологическом значении pH. Эти липиды охватывают фосфатидилглицерины, кардиолипины, диацилфосфатидилсерины, диацилфосфорную кислоту, N-додеканоил фосфатидилэтаноламины, N-сукцинил фосфатидилэтаноламины, N-глютарилдиацилфосфатидилэтаноламин, лизилфосфатидилглицеролы, пальмитоилолеиолфосфатидилглицерол (POPG), и другие анионные модификации групп, соединенных в нейтральные липиды, но не ограничиваются ими.

Термин "гидрофобный липид» относится к соединениям, имеющим неполярные группы, которые охватывают длинноцепочечные насыщенные и ненасыщенные алифатические углеводородные группы и такие группы, необязательно замещенные одной или несколькими ароматическими, циклоалифатическими или гетероциклическими группами, но не ограничиваются ими. Подходящие примеры охватывают диацилглицерин, диалкилглицерол, N,N-диалкиламин, 1,2-диацилокси-3-аминопропан и 1,2-диалкил-3-аминопропан, но не ограничиваются ими.

Термин "слитые" относится к способности липидной частицы, такой как LNP, сливаться с мембранами клетки. Мембраны могут быть либо плазматическими мембранами или мембранами, окружающими органеллы, например, ядрышко, ядро, и т.д.

Как используется в настоящем документе, термин "водный раствор" относится к композиции, содержащей в целом или частично, воду.

Как использовано в данном описании, термин "органический раствор липидов" относится к композиции, содержащей в целом или частично, органический растворитель, содержащий липид.

"Дистальный сайт", как он использован в настоящем документе, относится к физически отдельному месту, которое не отделено от капиллярного русла, но охватывает участки, широко распределенные по всему организму.

"Сыворотка-стабильный" в отношении к нуклеиновой кислотно-липидной частице, такой как LNP, означает, что частица несущественно деградировала после воздействия сыворотки или нуклеазы, что существенно разрушает свободную ДНК или РНК. Подходящие анализы охватывают, например, стандартный сывороточный анализ, анализ ДНКазы, или анализ РНКазы.

"Системная доставка", как она использована в настоящем документе, относится к доставке липидных частиц, что приводит к широкому биораспределению активного агента, такого как интерферирующие РНК (например, миРНК) в организме. Некоторые способы введения могут привести к системной доставке определенных агентов, но не других. Системная доставка означает, что полезное, предпочтительное терапевтическое количество лекарственного средства, подвергает воздействию большую часть тела. Чтобы получить широкое биораспределение обычно требуется такое время жизни в крови, чтобы агент не быстро деградировался или очищался (например, с помощью пресистемных органов (печени, легких и т.д.) или быстрого, неспецифического связывания клетками) до достижения сайта болезни, дистального к сайгу введения. Системная доставка липидных частиц может производиться любым способом, известным в данной области, в том числе, например, внутривенно, подкожно и внутрибрюшинно. В предпочтительном варианте реализации, системная доставка липидных частиц является внутривенной доставкой.

"Локальная доставка", как используется в настоящем документе, относится к доставке активного агента, такого как интерферирующие РНК (например, миРНК) непосредственно в сайт-мишень в организме. Например, агент может быть доставлен на место путем прямой инъекции в место заболевания, такого как опухоль или другого сайта-мишени, такого как участок воспаления или органа-мишени, такого как печень, сердце, почки, поджелудочная железа и тому подобное.

Термин "млекопитающее" относится к любому виду млекопитающих, такому как человек, мыши, крысы, собаки, кошка, хомяк, морская свинка, кролик, скот и тому подобное.

Термин "рак" относится к любому члену класса заболеваний, характеризующихся неконтролируемым ростом аберрантных клеток. Этот термин включает все известные виды рака и опухолевых состояний, будь они охарактеризованы как злокачественные, доброкачественные, мягких тканей, или твердых, и рака на всех этапах и степенях, в том числе до и после метастатических раковых образований. Примеры различных видов рака охватывают рак печени, рак легких, рак толстой кишки, рак прямой кишки, анальный рак, рак желчных протоков, рак малого кишечника, рак желудка (гастроскопический), рак пищевода; рак желчного пузыря, рак поджелудочной железы, рак аппендикса, рак молочной железы, рак яичников; рак шейки матки, рак предстательной железы, рак почки (например, почечно-клеточный рак), рак центральной нервной системы, глиобластомы, рак кожи, лимфому, хориокарциному, рака головы и шеи, остеогенные саркомы, рак крови, но не ограничиваются ими. Неограничивающие примеры конкретных типов рака печени включают гепатоцеллюлярную карциному (НСС), вторичный рак печени (например, вызванный метастазами некоторых других раковых клеток непеченочного типа), и гепатобластому. Как использовано в настоящем документе, "опухоль" содержит одну или более раковые клетки.

Термин "поливалентные РНК", сокращенно "ПВ РНК", относится к полинуклеотидному комплексу, состоящему как минимум из трех полинуклеотидов, в котором каждый полинуклеотид гибридизуют по всей длине или по его части, до по меньшей мере двух других полинуклеотидов комплекса и отличающихся тем, что один или более полинуклеотидов необязательно содержит область-мишень, которая способна к гибридизации с последовательностью нуклеиновой кислоты. Каждый полинуклеотид может иметь, например, от 10 до 60 нуклеотидов в длину. Область-мишень (и) в полинуклеотиде могут быть способны к гибридизации с последовательностью-мишенью нуклеиновой кислоты, которая является одинаковой или отличной, от последовательности (ей) нуклеиновой кислоты-мишени, с которым область-мишень (и) других полинуклеотидов комплекса гибридизирует. Многовалентные РНК могут быть синтезированы in vitro (например, путем химического синтеза) или, например, они могут быть получены из предшественника в живой клетке. Например, предшественник может быть линейным полинуклеотидом, который содержит каждый из полинуклеотидов многовалентных РНК, которые вводят в живую клетку, и расщепляется в ней с образованием многовалентных РНК. Термин "поливалентные РНК" охватывает такого предшественника, который предназначен для того, чтобы быть расщепленным внутри живой клетки. Термин "поливалентные РНК" также охватывает, в качестве примера, трехсторонние полинуклеотидные комплексы, описанные, в частности или, в общем, в опубликованной международной патентной заявке, имеющей номер международной заявки PCT/US2010/036962.

III. Новые катионные липиды

Настоящее изобретение предусматривает, в частности, новые катионные (амино) липиды, которые могут быть преимущественно использованы в липидных частицах, описанных в настоящем документе, для in vitro и/или in vivo доставки терапевтических агентов, таких как нуклеиновые кислоты, в клетки. Новые катионные липиды согласно изобретению имеют структуры формулы I, изложенные в данном документе, и включают в себя их (R) и/или (S) энантиомеры.

В некоторых вариантах реализации липид, согласно настоящему изобретению, содержит рацемическую смесь. В других вариантах реализации липид, по настоящему изобретению, включает смесь одного или более диастереомеров. В некоторых вариантах реализации липид, по настоящему изобретению, обогащен одним энантиомером, таким образом, чтобы липид содержал по меньшей мере примерно 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, или 95% энантиомерного избытка. В некоторых других вариантах реализации липид, по настоящему изобретению, обогащен одним диастереомером, таким образом, чтобы липид содержал по меньшей мере примерно 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, или 95% диастереомерного избытка. В некоторых дополнительных вариантах реализации липид, по настоящему изобретению, является хирально чистым (например, содержит один оптический изомер). В других вариантах реализации липид, по настоящему изобретению, обогащен одним оптическим изомером (например, оптически активным изомером), таким образом, чтобы липид содержал по меньшей мере примерно 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% избытка изомеров. Настоящее изобретение обеспечивает синтез катионных липидов формулы I в виде рацемической смеси или в оптически чистой форме.

Термины "катионный липид" и "амино липид" используются в настоящем документе взаимозаменяемо и охватывают те липиды и соли, например, фармацевтически приемлемые соли, которые имеют одну, две, три или больше жирных кислот или жирных алкильных цепей и pH-титруемые аминокислотные концевые группы (например, алкиламино или диалкиламино концевую группу). Катионный липид, как правило, протонирован (т.е. положительно заряжен) при pH ниже pKα катионного липида и по существу нейтрален при pH выше pKα. Катионные липиды согласно изобретению также могут быть названы титруемыми катионными липидами.

Термин "соли" охватывает любой анионный и катионный комплекс, такой как комплекс, образованный между катионным липидом, описанным в настоящем документе, и одним или более анионом. Неограничивающие примеры анионов охватывают неорганические и органические анионы, например, гидрид, фторид, хлорид, бромид, иодид, оксалат (например, гемиоксалат), фосфат, фосфонат, гидрофосфат, дигидрофосфат, оксид, карбонат, бикарбонат, нитрат, нитрит, нитрид, бисульфит, сульфид, сульфит, бисульфат, сульфат, тиосульфат, гидросульфат, борат, формиат, ацетат, бензоат, цитрат, тартрат, лактат, акрилат, полиакрилат, фумарат, малеат, итаконат, гликолят, глюконат, малат, манделат, тиглат, аскорбиновая кислота, салицилат, полиметакрилат, перхлорат, хлорат, хлорит, гипохлорит, бромат, гипобромит, йодат, алкилсульфонат, арилсульфонат, арсенат, арсенит, хромат, бихромат, цианид, цианат, тиоцианат, гидроксид, пероксид, перманганат и их смеси. В конкретных вариантах реализации, соли катионных липидов, описанных в настоящем документе, являются кристаллическими солями. В конкретных вариантах реализации, "соли" являются "фармацевтически приемлемыми солями".

Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к фармацевтически приемлемым солям соединений, соли которых, полученные из различных органических и неорганических противоионов, хорошо известны в данной области техники. Фармацевтически приемлемые соли охватывают как металлические (неорганические) так и органические соли, в том числе перечисленные в Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, pg. 1418 (1985), но не ограничиваясь ими. Фармацевтически приемлемые соли охватывают, в качестве примера, соли неорганических кислот, такие как гидрохлорид, сульфат, фосфат, дифосфат, гидробромид и нитрат, или соли органических кислот, такие как малат, малеат, фумарат, тартрат, сукцинат, цитрат, ацетат, лактат, метансульфонат, п-толуолсульфонат или пальмоат, салицилат и стеарат. Аналогично фармацевтически приемлемые катионы охватывают натрий, калий, кальций, алюминий, литий и аммоний (особенно аммониевые соли с вторичными аминами), но не ограничиваются ими. Конкретные соли по данному изобретению по причинам, указанным выше, охватывают калий, натрий, кальций и аммониевые соли.

Термин "алкил" охватывает прямую или разветвленную цепь, нециклическую или циклическую, насыщенный алифатический углеводород, содержащий от 1 до 24 атомов углерода. Типичные насыщенные алкилы с прямой цепью охватывают метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил, и им подобные, но не ограничиваются ими, в то время как насыщенные разветвленные алкилы охватывают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и тому подобное, но не ограничиваются ими. Типичные насыщенные циклические алкилы охватывают C_3-8 циклоалкилы, но не ограничиваются ими, описанные в настоящем документе, в то время как ненасыщенные циклические алкилы охватывают C_3-8 циклоалкенилы, описанные в настоящем документе, но не ограничиваются ими.

Термин "гетероалкил" охватывает линейную или разветвленную цепь, нециклический, или циклический, насыщенный алифатический углеводород, как определено выше, содержащий от примерно 1 до примерно 5 гетероатомов (т.е. 1, 2, 3, 4 или 5 гетероатомов), таких как, например. O, N, Si и/или S, где атомы азота и серы могут быть окислены, и гетероатом азота может быть, необязательно, кватернизованным. Гетероалкильная группа может быть присоединена к остальной части молекулы через атом углерода или гетероатом.

Термин "циклический алкил" охватывает любой замещенный или незамещенный циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкенил, гетероциклоалкенил и группы, описанные ниже.

Термин "циклоалкил" охватывает замещенную или незамещенную циклическую алкильную группу, имеющую от примерно 3 до примерно 8 атомов углерода (например, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода) в качестве верхнего кольца. Предпочтительные циклоалкильные группы охватывают группы, имеющие от примерно 3 до примерно 6 атомов углерода в верхнем кольце. Примеры C_3-8 циклоалкильных групп включают циклопропил, метил-циклопропил, диметил-циклопропил, циклобутил, метил-циклобутил, циклопентил, метил-циклопентил, циклогексил, метил-циклогексил, диметил-циклогексил, циклогептил и циклооктил, а также другие замещенные C_3-8 циклоалкильные группы, но не ограничиваются ими.

Термин "гетероциклоалкил" охватывает замещенную или незамещенную циклическую алкильную группу, как определено выше, содержащую от примерно 1 до примерно 3 гетероатомов в качестве членов кольца, выбранных из группы, состоящей из O, N, Si и S, в котором атомы азота и серы необязательно могут быть окислены, и гетероатом азота может быть кватернизован. Гетероциклоалкильная группа может быть присоединена к остальной части молекулы через атом углерода или гетероатом.

Термин "циклоалкенил" охватывает замещенную или незамещенную циклическую алкенильную группу, содержащую от примерно 3 до примерно 8 атомов углерода (например, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода) в качестве верхнего кольца. Предпочтительными являются циклоалкенил группы, имеющие от примерно 3 до примерно 6 атомов углерода в верхнем кольце. Примеры C_3-8 циклоалкенильных групп охватывают циклопропенил, метил-циклопропенил, диметил-циклопропенил, циклобутенил, циклопентенил, циклогексенил, циклогептенил, циклооктенил, и так же как другие замещенные C_3-8 циклоалкенильные группы.

Термин "гетероциклоалкенил" охватывает замещенную или незамещенную циклическую алкенильную группу, как определено выше, содержащую от примерно 1 до примерно 3 гетероатомов в качестве членов кольца, выбранного из группы, состоящей из O, N, Si и S, где атом азота и серы атомы необязательно могут быть окислены, и гетероатом азота может быть кватернизован. Гетероциклоалкенильная группа может быть присоединена к остальной части молекулы через атом углерода или гетероатом.

Термин "алкокси" охватывает группу формулы алкил-O-, в которой, "алкил" имеет ранее указанное определение. Неограничивающие примеры алкоксигрупп включают метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изо-бутокси, втор-бутокси и трет-бутокси.

Термин "алкенил" охватывает алкил, как определено выше, содержащий, по меньшей мере, одну двойную связь между соседними атомами углерода. Алкенилы охватывают как цис, так и трансизомеры. Представленные прямой и разветвленными цепями алкенилы включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутенил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил и тому подобное, но не ограничиваются ими. Типичные циклические алкенилы описаны выше.

Термин "алкинил" охватывает любой алкил или алкенил, как определено выше, который дополнительно содержит по меньшей мере одну тройную связь между соседними атомами углерода. Представители прямой и разветвленной цепи, алкинилы охватывают, без ограничения, ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1 бутинил и тому подобное.

Термин "арил" охватывает, обычно полиненасыщенную ароматическую углеводородную группу, которая может быть одним кольцом или несколькими кольцами (до трех колец), которые соединяются вместе, или связанные ковалентно, и которые необязательно несут один или более заместителей, таких как, например, галоген, трифторметил, амино, алкил, алкокси, алкилкарбонил, циано, карбамоил, алкоксикарбамоил, метилендиокси, карбокси, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, гидрокси, нитро и тому подобное. Неограничивающие примеры незамещенных арильных групп охватывают фенил, нафтил и бифенил. Примеры замещенных арильных групп включают фенил, хлорфенил, трифторметилфенил, хлорфторфенил, и аминофенил, но не ограничиваются ими.

Термины "алкилтио", "алкилсульфонил", "алкилсульфинил" и "арилсульфонил" охватывают группы, имеющие формулу -S-Rⁱ, -S(O)₂-Rⁱ, -S(O)-Rⁱ и -S(O)₂R¹, соответственно, где Rⁱ представляет собой алкильную группу, как определено выше, и Rⁱ означает арильную группу, как определено ранее.

Термины "алкенилокси" и "алкинилокси" охватывают группы, имеющие формулу -O-Rⁱ, в которой Rⁱ представляет собой алкенильную или алкинильную группу, соответственно.

Термины "алкенилтио" и "алкинилтио" включают группы, имеющие формулу -S-R^k, где R^k является алкенилом или алкинилом, соответственно.

Термин "алкоксикарбонил" охватывает группу, имеющую формулу -C(O)O-Rⁱ, где Rⁱ представляет собой алкильную группу, как определено выше, и в которой общее число атомов углерода относится к объединенным алкильным и карбонильным фрагментам.

Термин "ацил" охватывает любой алкил, алкенил или алкинил, где углерод в точке присоединения замещен оксогруппой, как определено ниже. Ниже приведены не ограничивающие примеры ацильных групп: -C(=O)алкил, -C(=O)алкенил, и -C(=O)алкинил.

Термин "гетероцикл" охватывает 5-7-членное моноциклическое, или 7-10-членное бипиклическое гетероциклическое кольцо, которое является либо насыщенным, либо ненасыщенным, или ароматическим и которое содержит 1 или 2 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и где гетероатомы азота и серы могут быть, необязательно, окислены, а гетероатом азота может быть, необязательно, кватернизован, в том числе бициклическим кольцом, в котором любой из указанных выше гетероциклов слит с бензольным кольцом. Гетероцикл может быть присоединен через любой гетероатом или атом углерода. Гетероциклы охватывают гетероарилы, как определено выше, а также морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, пиперизинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридинил, тетрагидротиофенил, тетрагидропримидинил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил и т.п., но не ограничиваются ими.

Термин "гетероарил" охватывает ароматический 5-10-членный гетероцикл, который содержит один, два или более гетероатомов, выбранных из азота (N), кислорода (O) и серы (S). Гетероарил может быть замещен по одному или более атомам углерода заместителями, такими как, например, галоген, алкил, алкокси, пиано, галогеналкил (например, трифторметил), гетеропиклил (например, морфолинил или пирролидинил), и тому подобное. Неограничивающие примеры гетероарилов включают пиридинил и фуранил.

Термин "галоген" охватывает фтор, хлор, бром и иод.

Термины "необязательно замещенный алкил", "необязательно замещенный циклический алкил", "необязательно замещенный алкенил", "необязательно замещенный алкинил", "необязательно замещенный ацил" и "необязательно замещенный гетероцикл" означают, что по меньшей мере один атом водорода замещен заместителем. В случае "оксо" заместителя (=O), два атома водорода являются замещенными. Неограничивающие примеры заместителей охватывают галоген, оксо, гетероцикл, -CN, -OR^x, -NR^xR^y, -NR^xC(=O)R^y, -NR^xSO₂R^y, -C(=O)R^x, -C(=O)OR^x, -C(=O)NR^xR^y, -SO_nR^x, и -SO_nNR^xR^y, где n равно 0, 1, or 2, R^x и R^y могут быть одинаковыми или различными и независимо представленными водородом, алкилом или гетероциклом, каждый из алкильных и гетероциклических заместителей может быть дополнительно замещен одним или более из оксо, галогена, -OH, -CN, алкила, -OR^x, гетероцикла, -NR^xR^y, -NR^xC(=O)R^y, -NR^xSO₂R^y, -C(=O)R^x, -C(=O)OR^x, -C(=O)NR^xR^y, -SO_nR^x, и -SO_nNR^xR^y. Термин "необязательно замещенный", когда используется перед списком заместителей, означает, что каждый из заместителей в списке может быть необязательно замещен, как описано в настоящем документе.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к катионным липидам, имеющим структурную формулу (I):

или их солям, где:

X является алкиламиногруппой;

A является от C₁ до C₆ необязательно замещенным алкилом, где указанный необязательно замещенный C₁-C₆-алкил может быть насыщенным или ненасыщенным, и где A может присутствовать или может не присутствовать;

Y выбран из группы, состоящей из кеталя, сложного эфира, необязательно замещенного карбамата, эфира, и необязательно замещенного амида; и

Z является гидрофобным фрагментом, состоящим из трех алкильных цепей, где каждая из алкильных цепей имеет длину от C₈ до C₁₁, где каждая из трех алкильных цепей может быть насыщенной или ненасыщенной, и где каждая из трех алкильных цепей является необязательно замещенной.

В некоторых вариантах реализации липидов формулы (I), Z имеет формулу:

где, R₁, R₂, и R₃, каждый отдельно, выбраны из группы, состоящей из от C₈ до C₁₁ алкила, где каждый из R₁, R₂, и R₃ может независимо быть замещенным или незамещенным, и где каждый из R₁, R₂, и R₃ является необязательно замещенным.

В конкретных вариантах реализации, липид формулы (I) имеет одну из следующих структур:

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения катионный липид образует соль (например, кристаллическую соль) с одним или более анионом. В одном конкретном варианте реализации катионный липид является оксалатом (например, гемиоксалатом) соли, который предпочтительно представляет собой кристаллическую соль. В конкретных вариантах реализации катионный липид образует фармацевтически приемлемую соль с одним или более анионом.

Также включенными в объем данного изобретения являются кристаллические формы, гидраты и сольваты соединений, описанных в настоящем документе.

Соединения по изобретению могут быть получены с помощью известных органических способов синтеза, в том числе по способам, описанным в примерах. В некоторых вариантах реализации синтез катионных липидов по изобретению может потребовать использование защитных групп. Методология защитных групп хорошо известна специалистам в данной области (смотри, например, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et. al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Если коротко, то защитные группы в контексте настоящего изобретения являются любой группой, которая уменьшает или устраняет нежелательную реакционную способность функциональной группы. Защитная группа может быть добавлена к функциональной группе, чтобы замаскировать ее реакционную способность в ходе некоторых реакций, а затем удалена, чтобы показать исходную функциональную группу. В некоторых случаях используется "спиртовая защитная группа". "Спиртовая защитная группа" означает любую группу, которая уменьшает или устраняет нежелательную реактивность функциональной спиртовой группы. Защитные группы могут быть добавлены и удалены с помощью способов, хорошо известных в данной области техники.

В некоторых вариантах реализации катионные липиды по настоящему изобретению имеют, по меньшей мере, одну протонируемую или депротонируемую группу, такую, что липид положительно заряжен при pH на уровне или ниже физиологического значения pH (например, pH 7,4), и нейтрален на втором pH, предпочтительно на уровне или выше физиологического pH. Должно быть понятно любому специалисту в данной области техники, что добавление или удаление протонов находится в зависимости от pH равновесного процесса, и, что ссылка на заряженный или нейтральный липид относится к характеру преобладающего вида и не требует, чтобы все липиды присутствовали в заряженной или нейтральной форме. Липиды, которые имеют более одной протонируемой или депротонируемой группы, или которые являются цвиттер-ионами, не исключаются из использования в настоящем изобретении.

В некоторых других вариантах реализации, протонируемые липиды в соответствии с изобретением имеют pK_a протонируемых групп в диапазоне от примерно 4 до примерно 11. Наиболее предпочтительным является pK_a от примерно 4 до примерно 7, потому что эти липиды будут катионными при низком значении pH препарата, в то время как частицы будут в значительной степени (хотя и не полностью) поверхностно нейтрализованы при физиологическом значении pH примерно pH 7,4. Одним из преимуществ этой рК_а является то, что по меньшей мере часть нуклеиновой кислоты, связанная с внешней поверхностью частицы, будет терять свою электростатическую активность при физиологическом pH и будет удалена путем простого диализа, что значительно снижает восприимчивость частицы к очистке.

VI. Активные агенты

Активные агенты (например, терапевтические агенты) охватывают любую молекулу или соединение способные оказывать желаемый эффект на клетки, ткани, органы или субъекта. Такие эффекты могут быть, например, биологическими, физиологическими и/или косметическими. Активные агенты могут представлять собой любой тип молекулы или соединения, в том числе нуклеиновые кислоты, пептиды, полипептиды, малые молекулы, и их смеси, но не ограничиваясь ими. Неограничивающие примеры нуклеиновых кислот охватывают молекулы интерферирующих РНК (например, миРНК, дайсер-субстратные дсРНК, мшРНК, аиРНК, и/или микроРНК), антисмысловые олигонуклеотиды, плазмиды, рибозимы, иммуностимулирующие олигонуклеотиды и их смеси. Примеры пептидов или полипептидов содержат, без ограничения, антитела (например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, фрагменты антител; гуманизированные антитела, рекомбинантные антитела, рекомбинантные человеческие антитела, и/или антитела, Primatized™), цитокины, факторы роста, факторы апоптоза, индуцирующие дифференцировку факторы, рецепторы клеточной поверхности и их лиганды, гормоны, а также их смеси. Примеры малых молекул содержат небольшие органические молекулы или соединения, такие как любые обычные агенты или лекарственные средства, известные специалистам в данной области, но не ограничиваются ими.

В некоторых вариантах реализации активный агент представляет собой терапевтический агент, или его соль, или его производное. Производный терапевтический агент может быть терапевтически активным сам по себе или он может быть пролекарством, которые становятся активными при дальнейшей модификации. Таким образом, в одном варианте реализации производное терапевтического агента сохраняет всю или некоторую терапевтическую активность по сравнению с немодифицированным агентом, в то время как в другом варианте реализации, производное терапевтического агента представлено пролекарством, в которой отсутствует терапевтическая активность, но которое становится активным после дальнейшей модификации.

Нуклеиновые кислоты

В некоторых вариантах реализации, липидные частицы по настоящему изобретению связаны с нуклеиновой кислотой, в результате чего получают нуклеиновые кислотно-липидные частицы (например, LNP). В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота полностью заключена в липидную частицу. Как использовано в данном описании, термин "нуклеиновая кислота" охватывает в себя любой олигонуклеотид или полинуклеотид, с фрагментами, содержащими до 60 нуклеотидов, которые обычно называют олигонуклеотиды, и более длинные фрагменты, которые называют полинуклеотидами. В конкретных вариантах реализации, олигонуклеотиды по настоящему изобретению состоят из от примерно 15 до примерно 60 нуклеотидов в длину. Нуклеиновые кислоты могут быть введены отдельно в липидные частицы по настоящему изобретению, или в комбинации (например, совместно вводимые) с липидными частицами по изобретению, содержащими пептиды, полипептиды, или небольшие молекулы, такие как обычные лекарства.

В контексте настоящего изобретения, термин "полинуклеотид" и "олигонуклеотид" относятся к полимеру, или олигомеру нуклеотида или нуклеозидным мономерам, состоящим из встречающихся в природе оснований, сахаров и интерсахаров (оснований) линкеров. Термины "полинуклеотид" и "олигонуклеотид" также охватывают полимеры или олигомеры, содержащие невстречающиеся в природе мономеры, или их части, которые функционируют аналогичным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто предпочтительнее нативных форм из-за их свойств, таких как, например, повышенное клеточное поглощение, уменьшенная иммуногенность, и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.

Олигонуклеотиды обычно классифицируются как дезоксирибоолигонуклеотиды или рибоолигонуклеотиды. Дезоксирибоолигонуклеотиды состоят из 5-углеродного сахара, так называемого дезоксирибоза, присоединенного ковалентно к фосфату в 5' и 3' атомах углерода этого сахара с образованием переменного, неразветвленного полимера. Рибоолигонуклеотид состоит из подобной повторяющейся структуры, где 5-углеродный сахар является рибозой.

Нуклеиновая кислота, которая присутствует в нуклеиновой кислотно-липидной частице в соответствии с настоящим изобретением включает в себя любую форму известной нуклеиновой кислоты. Нуклеиновые кислоты, используемые в настоящем документе, могут быть одноцепочечной ДНК или РНК, или двухцепочечной ДНК или РНК, или ДНК-РНК гибридом. Примеры двухцепочечной ДНК описаны в настоящем документе и включают, например, структурные гены, гены, содержащие контрольные и терминальные гены, и самореплицирующиеся системы, такие как вирусная или плазмидная ДНК. Примеры двухцепочечной РНК описаны в настоящем документе, и включают, например, миРНК и другие агенты, такие как иРНК, дайсер-субстратные дсРНК, мшРНК, аиРНК, и пре-микроРНК. Одноцепочечные нуклеиновые кислоты содержат, например, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, зрелые микроРНК, и триплекс формирующие олигонуклеотиды.

Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть различной длины, что обычно зависит от конкретной формы нуклеиновой кислоты. Например, в конкретных вариантах реализации плазмиды или гены могут состоять из от примерно 1000 до примерно 100000 нуклеотидных остатков в длину. В конкретных вариантах реализации, олигонуклеотиды могут варьироваться от примерно 10 до примерно 100 нуклеотидов в длину. В различных вариантах реализации, связанных с олигонуклеотидами, как одноцепочечными, двухцепочечными, и трех-цепочечными, могут варьироваться по длине от примерно 10 до примерно 60 нуклеотидов, от примерно 15 до примерно 60 нуклеотидов, от примерно 20 до примерно 50 нуклеотидов, с от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов, или от примерно 20 до примерно 30 нуклеотидов в длину.

В конкретных вариантах реализации олигонуклеотид (или его цепь) по изобретению специфически гибридизуется с или является комплементарной последовательностью полинуклеотида-мишени. Термины "специфически гибридизуется" и "комплементарные", используемые в настоящем документе, показывают достаточную степень комплементарности, так что между ДНК или РНК мишени и олигонуклеотида происходит стабильное и специфическое связывание. Понятно, что олигонуклеотид может не быть на 100% комплементарным целевой последовательности нуклеиновой кислоты, чтобы специфически гибридизоваться. В предпочтительных вариантах реализации олигонуклеотид специфически гибридизуется, когда олигонуклеотид связывается с последовательностью-мишенью, что препятствует нормальной функции последовательности-мишени, чтобы вызвать потерю его полезности или экспрессии, и имеется достаточная степень комплементарности, чтобы избежать неспецифического связывания олигонуклеотида с последовательностью-немишенью в условиях, когда желательно специфическое связывание, то есть, в физиологических условиях в случае анализов in vivo или терапевтического лечения, или, в случае анализов in vitro, в условиях, в которых анализы проводятся. Таким образом, олигонуклеотид может включать в себя 1, 2, 3 или более базовых замен по сравнению с областью генной последовательности или мРНК, так что она поражает или с которой она специфически гибридизуется.

МиРНК

Компонент миРНК нуклеиновой кислотно-липидной частицы по настоящему изобретению способен выключать экспрессию целевого гена. Каждая нить дуплекса миРНК, как правило, имеет примерно от 15 до 60 нуклеотидов в длину, предпочтительно от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах реализации миРНК содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид. Модифицированные миРНК, как правило, менее иммуностимулирующие, чем соответствующие немодифицированные последовательности миРНК и сохраняют активность иРНК в отношении целевого гена. В некоторых вариантах реализации измененная миРНК содержит по меньшей мере один 2'OMe пуриновый или пиримидиновый нуклеотид, такой как 2'OMe-гуанозиновый, 2'OMe-уридиновый, 2'OMe-аденозиновый и/или 2'OMe-цитозиновый нуклеотид. Модифицированные нуклеотиды могут присутствовать в одной цепи (то есть, смысловые и антисмысловые) или в обеих цепях миРНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации один или более из уридинового и/или гуанозинового нуклеотида модифицированы (например, 2'OMe-модифицированный) в одной цепи (то есть, смысловой и антисмысловой) или обеих цепях миРНК. В этих вариантах реализации измененная миРНК может дополнительно содержать один или несколько модифицированных (например, 2'OMe-модифицированный аденозин) и/или измененных (например, 2'OMe-модифицированные нуклеотиды) цитозинов. В других предпочтительных вариантах реализации только уридиновые и/или гуанозиновые нуклеотиды модифицированы (например, 2'OMe-модифицированный) в одной цепи (то есть, смысловые и антисмысловые) или в обеих цепях миРНК. МиРНК последовательности могут иметь выступы (например, 3' или 5' выступы, как описано в Elbashir и др.. Genes Dev., 15: 188 (2001) или Nykanen и др.. Cell, 107: 309 (2001)), или могут иметь липкий конец (т.е. имеют тупые концы).

В конкретных вариантах реализации селективное введение модифицированных нуклеотидов, таких как 2'OMe-уридиновых и/или гуанозиновых нуклеотидов в двухцепочечные области одной или обеих цепей миРНК уменьшает или полностью отменяет иммунный ответ на эту миРНК молекулу. В некоторых случаях, иммуностимулирующие свойства специфических последовательностей миРНК и их способность выключать экспрессию гена может быть оптимизирована или уравновешена введением минимальных и селективных модификаций 2'OMe в двухцепочечную область дуплекса миРНК. Это может быть достигнуто при терапевтически жизнеспособных дозах миРНК без индукции цитокинов, токсичности, и во избежание нецелевых эффектов, связанных с использованием немодифицированной миРНК.

Модифицированная миРНК в общем содержат от примерно 1% до примерно 100% (например, от примерно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%) модифицированных нуклеотидов в двухцепочечной области дуплекса миРНК. В некоторых вариантах реализации один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК содержат модифицированные нуклеотиды. В некоторых других вариантах реализации некоторые или все модифицированные нуклеотиды в двухцепочечной области миРНК являются 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более нуклеотидами отдельно друг от друга. В одном из предпочтительных вариантов реализации, ни один из модифицированных нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК не являются смежными друг с другом (например, существует разрыв, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или немодифицированными нуклеотидами между каждым модифицированным нуклеотидом).

В некоторых вариантах реализации, менее чем примерно 50% (например, менее чем примерно 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37% или 36%, предпочтительно менее чем примерно 35%, 34%, 33%, 32%, 31% или 30%) нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК содержат модифицированные (например, 2'OMe) нуклеотиды. В одном из аспектов этих вариантов реализации, менее чем примерно 50% уридиновых и/или гуанозиновых нуклеотидов в двухцепочечной области одной или обеих цепей миРНК избирательно (например, только) изменены. В другом аспекте этих вариантов реализации, менее чем примерно 50% нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК содержат 2'OMe нуклеотиды, отличающиеся тем, что миРНК содержит 2'OMe нуклеотиды в обеих цепях миРНК, отличающийся тем, что миРНК содержит по меньшей мере один 2'OMe-гуанозиновый нуклеотид и по меньшей мере один 2'OMe-уридиновый нуклеотид, и где 2'OMe-гуанозиновый нуклеотид и 2'OMe-уридиновый нуклеотид являются единственными 2'OMe нуклеотидами, присутствующими в двухцепочечной области. В еще одном аспекте этих вариантов реализации, менее чем примерно 50% нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК содержат 2'OMe нуклеотиды, отличающиеся тем, что миРНК содержит 2'OMe нуклеотиды в обеих цепях модифицированной миРНК, в котором миРНК содержит 2'OMe нуклеотиды, выбранные из группы, состоящей из 2'OMe-гуанозиновых нуклеотидов, 2'OMe-уридиновых нуклеотидов, 2'OMe-аденозиновых нуклеотидов и их смесей, и где миРНК не содержит 2'OMe-цитозиновых нуклеотидов в двухцепочечной области. В еще одном аспекте этих вариантов реализации, менее чем примерно 50% нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК содержат 2'OMe нуклеотиды, отличающиеся тем, что миРНК включает в себя 2'OMe нуклеотиды в обеих цепях миРНК, в котором миРНК содержит по меньшей мере один 2'OMe-гуанозин нуклеотида и по меньшей мере один 2'OMe-уридин нуклеотидов, и где миРНК не содержит 2'OMe-цитозин нуклеотидов в области двухцепочечной области. В другом аспекте этих вариантов реализации, менее чем примерно 50% нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК содержат 2'OMe нуклеотиды, отличающиеся тем, что содержат миРНК 2'OMe нуклеотидов в обеих цепях модифицированной миРНК, в котором миРНК состоит из 2'OMe нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из 2'OMe-гуанозиновых нуклеотидов, 2'ОМе-уридиновых нуклеотидов, 2'OMe-аденозиновых нуклеотидов и их смесей, и где нуклеотиды 2'OMe в двухцепочечной области находятся не рядом друг с другом.

В других вариантах реализации, от примерно 1% до примерно 50% (например, от примерно 5%-50%, 10%-50%, 15%-50%, 20%-50%, 25%-50%, 30%-50%, 35%-50%, 40%-50%, 45%-50%, 5%-45%, 10%-45%, 15%-45%, 20%-45%, 25%-45%, 30%-45%, 35%-45%, 40%-45%, 5%-40%, 10%-40%, 15%-40%, 20%-40%, 25%-40%, 25%-39%, 25%-38%, 25%-37%, 25%-36%, 26%-39%, 26%-38%, 26%-37%, 26%-36%, 27%-39%, 27%-38%, 27%-37%, 27%-36%, 28%-39%, 28%-38%, 28%-37%, 28%-36%, 29%-39%, 29%-38%, 29%-37%, 29%-36%, 30%-40%, 30%-39%, 30%-38%, 30%-37%, 30%-36%, 31%-39%, 31%-38%, 31%-37%, 31%-36%, 32%-39%, 32%-38%, 32%-37%, 32%-36%, 33%-39%, 33%-38%, 33%-37%, 33%-36%, 34%-39%, 34%-38%, 34%-37%, 34%-36%, 35%-40%, 5%-35%, 10%-35%, 15%-35%, 20%-35%, 21%-35%, 22%-35%, 23%-35%, 24%-35%, 25%-35%, 26%-35%, 27%-35%, 28%-35%, 29%-35%, 30%-35%, 31%-35%, 32%-35%, 33%-35%, 34%-35%, 30%-34%, 31%-34%, 32%-34%, 33%-34%, 30%-33%, 31%-33%, 32%-33%, 30%-32%, 31%-32%, 25%-34%, 25%-33%, 25%-32%, 25%-31%, 26%-34%, 26%-33%, 26%-32%, 26%-31%, 27%-34%, 27%-33%, 27%-32%, 27%-31%, 28%-34%, 28%-33%, 28%-32%, 28%-31%, 29%-34%, 29%-33%, 29%-32%, 29%-31%, 5%-30%, 10%-30%, 15%-30%, 20%-34%, 20%-33%, 20%-32%, 20%-31%, 20%-30%, 21%-30%, 22%-30%, 23%-30%, 24%-30%, 25%-30%, 25%-29%, 25%-28%, 25%-27%, 25%-26%, 26%-30%, 26%-29%, 26%-28%, 26%-27%, 27%-30%, 27%-29%, 27%-28%, 28%-30%, 28%-29%, 29%-30%, 5%-25%, 10%-25%, 15%-25%, 20%-29%, 20%-28%, 20%-27%, 20%-26%, 20%-25%, 5%-20%, 10%-20%, 15%-20%, 5%-15%, 10%-15%, или 5%-10%) нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК содержат модифицированные нуклеотиды. В одном из аспектов этих вариантов реализации, от примерно 1% до примерно 50% уридиновых и/или гуанозиновых нуклеотидов в двухцепочечной области одной или обеих цепей миРНК избирательно (например, только) изменены. В другом аспекте этих вариантов реализации, от примерно 1% до примерно 50% нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК содержат 2'OMe нуклеотиды, отличающиеся тем, что миРНК включает в себя 2'OMe нуклеотиды в обеих цепях киРНК, отличающийся тем, что миРНК содержит, по меньшей мере один 2'OMe-гуанозиновый нуклеотид и по меньшей мере один 2'OMe-уридиновый нуклеотид, и где 2'OMe-гуанозиновый нуклеотид и 2'OMe-уридиновый нуклеотид являются единственными 2'OMe нуклеотидами, присутствующими в двухцепочечной области. В еще одном аспекте этих вариантов реализации, от примерно 1% до примерно 50% нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК содержат 2'OMe нуклеотиды, отличающиеся тем, что миРНК содержит 2'OMe нуклеотиды в обеих цепях модифицированной миРНК, где миРНК содержит 2'OMe нуклеотиды, выбранные из группы, состоящей из 2'OMe-гуанозиновых нуклеотидов, 2'OMe-уридиновых нуклеотидов, 2'OMe-аденозиновых нуклеотидов и их смесей, и где миРНК не содержит 2'OMe-цитозиновых нуклеотидов в двухцепочечной области. В еще одном аспекте этих вариантов реализации, от примерно 1% до примерно 50% нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК содержат 2'OMe нуклеотиды, отличающиеся тем, что миРНК содержит 2'OMe нуклеотиды в обеих цепях миРНК, в котором миРНК содержит по меньшей мере один 2'OMe-гуанозин нуклеотида и по меньшей мере один 2'OMe-уридин нуклеотидов, и где миРНК не содержит 2'OMe-цитозин нуклеотидов в двухцепочечной области. В другом аспекте этих вариантов реализации, от 1% до примерно 50% нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК содержат 2'OMe нуклеотиды, отличающиеся тем, что содержат миРНК 2'OMe нуклеотидов в обеих цепях модифицированной миРНК, где миРНК состоит из 2'OMe нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из 2'OMe-гуанозиновых нуклеотидов, 2'OMe-уридиновых нуклеотидов, 2'OMe-аденозиновых нуклеотидов и их смесей, и где нуклеотиды 2'OMe в двухцепочечной области находятся не рядом друг с другом.

Дополнительные диапазоны, проценты и образцы модификаций, которые могут быть введены в миРНК, описаны в заявке на патент США №2007/0135372, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Селекция последовательностей миРНК

Подходящие последовательности миРНК могут быть идентифицированы с использованием любых средств, известных в данной области. Как правило, способы, описанные в Elbashir и др., Nature, 411: 494-498 (2001) и Elbashir и др., EMBO J., 20: 6877-6888 (2001) сочетаются с алгоритмом конструктивного расчета, изложенными в Reynolds и др., Nature Biotech, 22 (3): 326-330 (2004).

Как неограничивающий пример, нуклеотидная последовательность 3' инициаторного AUG кодона транскрипта из интересующего гена-мишени может быть сканирована на динуклеотидные последовательности (например, AA, NA, CC, GG, или UU, где N=С, G или U) (см., например, Elbashir и др., EMBO J., 20: 6877-6888 (2001)). Нуклеотиды непосредственно 3' с динуклеотидными последовательностями определены в качестве потенциальных последовательностей миРНК (т.е. последовательностей-мишеней или цепей смысловых последовательностей). Как правило, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 или более нуклеотидов непосредственно 3' с динуклеотидными последовательностями определены в качестве потенциальных последовательностей миРНК. В некоторых вариантах реализации динуклеотидная последовательность является АА или последовательность NA и 19 нуклеотидов непосредственно 3' к АА или NA динуклеотидам идентифицированы в качестве потенциальных последовательностей миРНК. Последовательности миРНК, как правило, расположены в разных положениях вдоль длины гена-мишени. Для дальнейшего повышения эффективности выключения миРНК последовательностей, потенциальные последовательности миРНК могут быть проанализированы, чтобы определить участки, которые не содержат области гомологии с другими кодирующими последовательностями, например, в целевой клетке или организме. Например, подходящая последовательность миРНК имеет примерно 21 пар оснований, как правило, не более чем 16-17 смежных пар оснований, гомологичных с кодирующей последовательностью в клетке-мишени или организме. Если последовательности миРНК не должны быть экспрессированы от промотора РНК Pol III, последовательности миРНК не хватает на более чем 4 смежными А или Т, которые были выбраны.

После того, как потенциальные последовательности миРНК были идентифицированы, комплементарная последовательность (т.е. последовательность антисмысловой цепи) может быть разработана. Потенциальная последовательность миРНК также может быть проанализирована с использованием различных критериев, известных в данной области. Например, для повышения эффективности их выключения, миРНК последовательности могут быть проанализированы с помощью алгоритма конструктивного расчета для идентификации последовательностей, которые имеют один или более из следующих признаков: (1) содержание G/C от примерно 25% до примерно 60% G/C; (2) по меньшей мере, 3 A/U связанными в положениях 15-19 смысловой цепи; (3) не включая внутренние повторы; (4) в положении 19 смысловой цепи; (5) в положении 3 смысловой цепи; (6) U в положении 10 смысловой цепи; (7) G/C в положении 19 смысловой цепи; и (8) без G в положении 13 смысловой цепи. Конструкторские инструменты миРНК, которые содержат алгоритмы, которые присваивают соответствующие значения каждого из этих особенностей и полезных для отбора миРНК можно найти на, например, http://ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.htмл. Специалисту в данной области техники будет понятно, что последовательности с одним или несколькими из указанных выше характеристик, могут быть выбраны для дальнейшего анализа и испытаний в качестве потенциальных последовательностей миРНК.

Кроме того, потенциальные последовательности миРНК с одним или более из следующих критериев часто могут быть устранены, как миРНК: (1) последовательности, содержащие участок 4 или более одинаковых оснований в ряду; (2) последовательности, содержащие гомополимеры G (т.е., чтобы уменьшить возможные неспецифические эффекты, обусловленные структурными характеристиками этих полимеров; (3) последовательности, содержащие тройные базовые мотивы (например, GGG, ССС, AAA, или TTT); (4) последовательности, содержащие участки 7 или более G/C в строке, и (5), последовательности, содержащие прямые повторы из 4 или более базовых с кандидатами, результирующими в внутренние структуры загнутыми назад. Тем не менее, специалистам в данной области будет понятно, что последовательности с одним или несколькими из вышеуказанных характеристик все же могут быть выбраны для дальнейшего анализа и испытаний в качестве потенциальных последовательностей миРНК.

В некоторых вариантах реализации потенциальные последовательности миРНК могут быть дополнительно проанализированы на основе дуплексной асимметрии миРНК, как описано, например, в Khvorova и др., Cell, 115: 209-216 (2003); и Schwarz и др., Cell, 115: 199-208 (2003). В других вариантах реализации потенциальные последовательности миРНК могут быть дополнительно проанализированы на основе вторичной структуры в сайте-мишени, как описано, например, в Luo и др., Biophys. Res. Commun., 318: 303-310 (2004). Например, вторичная структура в сайте-мишени может быть смоделирована с помощью алгоритма Mfold (доступен на http://mfold.burnet.edu.au/rna_form) чтобы выбрать миРНК последовательности, которые способствуют доступу на сайты-мишени, где меньше вторичной структуры присутствует в форме парных оснований и стволовых петель.

После того, как потенциальная последовательность миРНК была определена, последовательность может быть проанализирована на предмет наличия любых иммуностимулирующих свойств, например, с использованием in vitro цитокинового анализа или in vivo в животной модели. Мотивы в смысловых, и/или антисмысловых цепях последовательности миРНК, такие как GU-богатые мотивы (например, 5'-GU-3', 5'-UGU-3', 5'-GUGU-3', 5'-UGUGU-3', и т.д.) могут также обеспечивать индикацию если последовательность будет иммуностимулирующей. После того, как молекула миРНК оказывается иммуностимулирующей, она может быть изменена, чтобы уменьшить ее иммуностимулирующие свойства, как описано в настоящем документе. В качестве неограничивающего примера, последовательность миРНК может контактировать с клеткой-респондером млекопитающего в таких условиях, что клетка продуцирует обнаруживаемый иммунный ответ, чтобы определить, является ли миРНК иммуностимулирующей или неиммуностимулирующей миРНК. Клетка-респондер млекопитающего может быть от нативных млекопитающих (например, у млекопитающего, который ранее не был в контакте с генным продуктом последовательности миРНК). Клетка-респондер млекопитающего может быть, например, периферической мононуклеарной клеткой крови (РВМС), макрофагом и тому подобным. Обнаруживаемый иммунный ответ может включать выработки цитокинов или факторов роста, таких как, например, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-6, IL-12, или их комбинацией. Молекулы миРНК определены как иммуностимулирующие могут быть модифицированы, чтобы уменьшить ее иммуностимулирующие свойства путем замены по меньшей мере одного из нуклеотидов смысловой и/или антисмысловой цепи модифицированными нуклеотидами. Например, менее чем примерно 30% (например, менее чем примерно 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5%) нуклеотидов в двухцепочечной области дуплекса миРНК могут быть заменены модифицированными нуклеотидами, такими как 2'OMe нуклеотиды. Модифицированные миРНК могут затем вступить в контакт с клетками-респондерами млекопитающего, как описано выше, чтобы подтвердить, что их иммуностимулирующие свойства были уменьшены или отменены.

Подходящие in vitro тесты для определения иммунного ответа охватывают, но не ограничиваются ими, методику сэндвич-иммуноанализа двойного моноклонального антитела по David и др. (U.S. Patent No. 4,376,110); сэндвич-анализ моноклонально-поликлональных антител (Wide и др., in Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh (1970)); Метод "Вестерн-блоттинг" Gordon и др. (U.S. Patent No. 4,452,901); иммунопреципитация меченого лиганда (Brown и др., J. Biol. Chem., 255: 4980-4983 (1980)); энзим-связывающий иммуноферментный анализ (ELISA), как описано, например, в Raines и др., J. Biol. Chem., 257: 5154-5160 (1982);

иммуноцитохимические способы, в том числе использование фторохромов (Brooks и др., Clin. Exp. Immunol., 39: 477 (1980)); и нейтрализацию активности (Bowen-Pope и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 2396-2400 (1984)). В дополнение к описанным выше иммунологическим исследованиям, доступен ряд других иммунологических исследований, в том числе тех, которые описаны в патентах США №3817827; 3850752; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; и 4098876. Раскрытие этих ссылок включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Не ограничивающий пример in vivo модели для обнаружения иммунного ответа содержит in vivo исследование индукции цитокинов мышей, как описано, например. Judge и др., Mol. Ther., 13: 494-505 (2006). В некоторых вариантах реализации, анализ может быть выполнен следующим образом: (1) миРНК могут быть введены с помощью стандартной внутривенной инъекции в боковую хвостовую вену; (2) кровь может быть отобрана через сердечную пункцию через примерно 6 часов после введения и обработана, как плазма для анализа цитокинов; и (3) цитокины могут быть посчитаны с использованием сэндвич ELISA комплектов в соответствии с инструкциями изготовителя (например, мышиные и человеческие IFN-α (PBL Biomedical; Piscataway, NJ); человеческие IL-6 и TNF-α (eBioscience; San Diego, CA); и мышиные IL-6, TNF-α, и IFN-γ (BD Biosciences; San Diego, CA)).

Моноклональные антитела, которые специфически связывают цитокины и факторы роста, являются коммерчески доступными из различных источников и могут быть созданы с использованием способов, известных в данной области (смотри, например, Kohler и др., Nature, 256: 495-497 (1975) and Harlow and Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York (1999)). Генерирование моноклональных антител было описано ранее, и может быть выполнено любым способом, известным в данной области техники (Buhring и др., in Hybridoma, Vol. 10, No. 1, pp. 77-78 (1991)). В некоторых способах, моноклональное антитело метят (например, любой композицией, которая обнаруживается спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, электрическими, оптическими, или химическими средствами) для облегчения обнаружения.

Генерирующие молекулы миРНК

МиРНК могут быть представлены в различных формах, включая, например, в виде одного или более изолированных малых-интерферирующих РНК (миРНК) дуплексов, в виде длинных двухцепочечных РНК (дцРНК), или в виде транскрибированных миРНК или дцРНК от транскрипционной кассеты в плазмидной ДНК. В некоторых вариантах реализации, миРНК, могут быть получены ферментативно или частично/полностью органическим синтезом, и модифицированные рибонуклеотиды могут быть введены с помощью in vitro ферментативного или органического синтеза. В некоторых случаях, каждую цепь получают химическим путем. Способы синтеза молекул РНК, известны в данной области, например, методы химического синтеза, как описано в Verma and Eckstein (1998) или как описано в настоящем документе.

Популяция РНК может быть использована для обеспечения длинных РНК-предшественников, или длинных РНК-предшественников, которые имеют существенное или полное сходство с выбранной последовательностью-мишенью и могут быть использованы, чтобы получить миРНК. РНК может быть выделена из клеток или тканей, синтезирована, и/или клонирована в соответствии со способами, хорошо известными специалистам в данной области. РНК может быть в смешанной популяции (получена из клеток или тканей, транскрибированных из кДНК, замещена, выбрана, и т.д.), или может представлять собой единую последовательность-мишень. РНК может быть встречающейся в природе (например, выделена из образцов ткани или клеток), синтезирована in vitro (например, с использованием Т7 или SP6 полимеразы и PCR-продуктов или клонированной кДНК) или химически синтезированной.

Чтобы сформировать длинную дцРНК, для синтетических РНК, комплемент также транскрибируется в пробирку и гибридизуется с образованием дцРНК. При использовании встречающейся в природе популяции РНК, РНК комплемент также предусмотрен (например, для формирования дцРНК для расщепления Е. coli РНКазы III или Дайсер), например, путем транскрипции кДНК, соответствующей популяции РНК, или с помощью РНК-полимеразы. РНК-предшественники затем гибридизуют с образованием двухцепочечных РНК для расщепления. ДцРНК могут быть непосредственно введены субъекту или могут быть расщеплены in vitro перед введением.

Способы выделения РНК, синтез РНК, гибридизации нуклеиновых кислот, создание и скрининг библиотек кДНК, и постановка PCR, хорошо известны в данной области (смотри, например, Gubler and Hoffinan, Gene, 25: 263-269 (1983); Sambrook и др., supra; Ausubel и др., supra), как и PCR способы (см, патенты США №4683195 и 4683202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis и др., eds, 1990)). Библиотеки экспрессии также хорошо известны специалистам в данной области. Дополнительные базовые тексты, раскрывающие общие способы использования в данном изобретении, охватывают Sambrook и др., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); и Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel и др., eds., 1994). Раскрытие этих ссылок включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Предпочтительно, миРНК химически синтезированы. Олигонуклеотиды, которые содержат молекулы миРНК по изобретению, могут быть синтезированы с использованием любой из множества методик, известных в данной области, таких как те, которые описаны в Usman и др., J. Am. Chem. Soc., 109: 7845 (1987); Scaringe и др., Nucl. Acids Res., 18: 5433 (1990); Wincott и др., Nucl. Acids Res., 23: 2677-2684 (1995); и Wincott и др., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997). Синтез олигонуклеотидов использует распространенные нуклеиново-кислотные соединительные и защитные группы, такие как диметокситритил на 5'-конце и фосфорамидитов на 3'-конце. В качестве не ограничивающего примера, мелкомасштабный синтез может проводиться на синтезаторе Applied Biosystems с использованием протокола масштаба 0.2 мкмоль. Кроме того, синтез при масштабе шкалы 0,2 мкмоль может быть выполнен на синтезаторе 96-луночного планшета от Protogene (Palo Alto, CA). Тем не менее, больший или меньший масштаб синтеза также входит в объем настоящего изобретения. Подходящие реагенты для синтеза олигонуклеотидов, способов удаления РНК-защитных групп и способы очистки РНК известны специалистам в этой области техники.

Молекулы миРНК также могут быть синтезированы с помощью методики тандемного синтеза, в котором обе цепи синтезируются в виде одного непрерывного олигонуклеотидного фрагмента или цепи, разделенных расщепляемым линкером, который затем расщепляется, чтобы обеспечить отдельные фрагменты или цепи, которые гибридизуются с образованием дуплекса миРНК. Линкер может быть полинуклеотидным линкером или ненуклеотидным линкером. Тандемный синтез миРНК может быть легко адаптирован к обоим многолуночным/многодисковым платформам синтеза, а также платформам синтеза большого масштаба, использующим периодичные реакторы, колонны синтеза, и тому подобное. С другой стороны, молекулы миРНК могут быть собраны из двух отдельных олигонуклеотидов, в которых один олигонуклеотид содержит смысловую цепь, а другой содержит антисмысловую цепь миРНК. Например, каждая цепь может быть синтезирована отдельно и соединяться вместе с помощью гибридизации или лигирования после синтеза и/или снятия защиты. В некоторых других случаях, молекулы миРНК могут быть синтезированы в виде одного непрерывного олигонуклеотидного фрагмента, где самокомплементарная смысловая и антисмысловая области гибридизируют с образованием миРНК дуплекса, имеющего вторичную структуру шпильки.

Модифицированные последовательности миРНК

В некоторых аспектах, молекулы миРНК содержат дуплекс, имеющий две цепи и по меньшей мере один модифицированный нуклеотид в двухцепочечной области, в которой каждая цепь имеет от примерно 15 до примерно 60 нуклеотидов в длину. Предпочтительно, модифицированные миРНК являются менее иммуностимулирующими, чем соответствующие немодифицированные последовательности миРНК, но сохраняют способность выключать экспрессию последовательности-мишени. В предпочтительных вариантах реализации степень химической модификации введенной в молекулу миРНК нарушает баланс между уменьшением или отменой иммуностимулирующего свойства миРНК и удержанием активности иРНК. В качестве неограничивающего примера, молекула миРНК, которая нацелена на интересующий ген, может быть минимально модифицирована (например, менее чем на примерно 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% модифицирована) при селекции уридинового и/или гуанозинового нуклеотидов в пределах дуплекса миРНК для устранения иммунного ответа, сгенерированного миРНК, при сохранении своей способности выключать экспрессию гена-мишени.

Примеры модифицированных нуклеотидов, пригодных для использования в настоящем изобретении, охватывают рибонуклеотиды, имеющие 2'-O-метил-(2'OMe), 2'-дезокси-2'-фтор (2'F), 2'-дезокси, 5-C-метил, 2'-O-(2-метоксиэтил) (МОЭ), 4'-тио, 2'-амино или 2'-C-аллил, но не ограничиваются ими. Модифицированные нуклеотиды, имеющие Нозерн конформацию, такие как те, которые описаны, например, в Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag Ed. (1984), также подходят для использования в молекулах миРНК. Такие модифицированные нуклеотиды охватывают, без ограничения, замкнутые нуклеиновые кислоты (LNA) нуклеотидов (например, 2'-O, 4'-C-метилен-(D-рибофуранозил) нуклеотидов), 2'-O-(2-метоксиэтил) (МОЭ) нуклеотидов, 2'-метил-тио-этил нуклеотидов, 2'-дезокси-2'-фтор (2'E) нуклеотидов, 2'-дезокси-2'-хлор (2'С1) нуклеотидов и 2'-азидо нуклеотидов. В некоторых случаях, молекулы миРНК, описанные в настоящем документе, содержат один или более G-зажимных нуклеотидов. G-зажим относится к нуклеотидному модифицированному цитозиновому аналогу, в котором модификации придают способность к водородной связи как Уотсона-Крика, так и Хугстена сталкиваться с комплементарным гуаниновым нуклеотидом в дуплексе (см, например, Lin и др., J. Am. Chem. Soc., 120: 8531-8532 (1998)). Кроме того, нуклеотиды, имеющие нуклеотидный базовый аналог, такие как, например, С-фенил, С-нафтил, другие ароматические производные, инозин, азол карбоксамиды и нитроазол производные, такие как 3-нитропиррол, 4-нитроиндол, 5-нитроиндол, и 6-нитроиндол (см, например, Loakes, Nucl. Acids Res., 29: 2437-2447 (2001)) могут быть включены в молекулы миРНК.

В некоторых вариантах реализации молекулы миРНК могут дополнительно содержать один или несколько химических модификаций, таких как фрагменты терминального кэпа, фосфатные модификации скелета, и тому подобное. Примеры фрагментов концевых кэпов охватывают, без ограничения, инвертированные дезокси безосновные остатки, модификации глицерина, 4',5'-метилен нуклеотиды, 1-(β-D-эритрофуранозил) нуклеотиды, 4'-тио нуклеотиды, карбоциклические нуклеотиды, 1,5-ангидрогекситол нуклеотиды, L-нуклеотиды, α-нуклеотиды, модифицированные основания нуклеотидов, трео-пентафуранозил нуклеотиды, ациклические 3', 4'-втор нуклеотиды, ациклические 3,4-дигидроксибутил нуклеотиды, ациклические 3,5-дигидроксипентил нуклеотиды, 3'3'-инвертированные нуклеотидные фрагменты, 3'-3'-инвертированные безосновные фрагменты, 3'-2'-инвертированные нуклеотидные фрагменты, 3'-2'-инвертированные безосновные фрагменты, 5'-5'-инвертированные нуклеотидные фрагменты, 5'5'-инвертированные безосновные фрагменты, 3'-5'-дезокси инвертированные безосновные фрагменты, 5'-амино-алкил, фосфат, 1,3-диамино-2-пропил фосфат, 3-аминопропил фосфат, 6-аминогексил фосфат, 1,2-аминододецил фосфат, фосфат гидроксипропил, 1,4-бутандиол фосфат, 3'-фосфоновой кислоты, 5'-фосфорной кислоты, гексилфосфат, аминогексил фосфат, 3'-фосфат-, 5'-амино-, 3'-фосфоротиоат, 5'-фосфоротиоат, фосфородитиоат, и образование сшивки или необразование сшивки метилфосфонатными или 5'-меркапто фрагментами (см., например, патент США №5998203; Beaucage и др., Tetrahedron 49: 1925 (1993)). Неограничивающие примеры модификаций фосфатных скелетов (результирующие в модифицированные межнуклеотидные связи) охватывают фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, метилфосфонатные, фосфотриэфирные, морфолиновые, амидатные, карбаматные, карбоксиметилцеллюлозные, ацетомедиатные, полиамидные, сульфонатные, сульфонамидные, сульфаматные, формацетальные, тиоформацетальные, и алкилсилильные замены (см, например, Hunziker и др., Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417 (1995); Mesmaeker и др., Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994)). Такие химические модификации могут происходить на 5'-конце и/или 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепях миРНК. Раскрытие этих ссылок включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

В некоторых вариантах реализации, смысловая и/или антисмысловая цепь молекулы миРНК может дополнительно содержать 3'-концевой выступ, имеющий примерно от 1 до 4 (например, 1, 2, 3 или 4) 2'-дезокси рибонуклеотидов, модифицированного (например, 2'OMe) и/или немодифицированного уридинового рибонуклеотида, и/или любую другую комбинацию модификации (например, 2'OMe) и немодифицированных нуклеотидов.

Дополнительные примеры модифицированных нуклеотидов и типов химических модификаций, которые могут быть введены в молекулу миРНК, описаны, например, в патенте Великобритании GB 2397818 В и публикации заявки на патент США №2004/0192626, 2005/0282188 и 2007/0135372, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

Молекулы миРНК, описанные в настоящем документе, могут необязательно содержать один или несколько ненуклеотидов в одной или обоих цепях мпРНК. Как использовано в данном описании, термин "ненуклеотид" относится к любой группе или соединению, которые могут быть включены в цепь нуклеиновой кислоты по месту одного или нескольких нуклеотидных единиц, в том числе сахара и/или фосфатные замены, и позволяют оставшимся основаниям проявлять активность. Группа соединений является безосновной, если она не содержит общепризнанные нуклеотидные основания, такие как аденозин, гуанин, цитозин, урацил или тимин и, следовательно, не имеют основания в Г-положении.

В других вариантах реализации, химическая модификация миРНК содержит прикрепление конъюгата к молекуле миРНК. Конъюгат может быть прикреплен на 5' и/или 3'-конец смысловой и/или антисмысловой цепи миРНК через ковалентную связь такую как, например, биоразлагаемый линкер. Конъюгат может быть также прикреплен к миРНК, например, через карбаматную группу или другую связывающую группу (смотри, например, публикации заявки на патент США Nos. 2005/0074771, 2005/0043219 и 2005/0158727). В некоторых случаях, конъюгатом является молекула, которая облегчает доставку киРНК в клетку. Примеры конъюгатов молекул, подходящих для прикрепления к миРНК охватывают, без ограничения, стероиды, такие как холестерин, гликоли, такие как полиэтиленгликоль (PEG), человеческий сывороточный альбумин (HSA), жирные кислоты, каротиноиды, терпены, желчные кислоты, фолаты (например, фолиевые кислоты, аналоги фолиевой кислоты и их производные), сахара (например, галактоза, галактозамин, N-ацетил-галактозамин, глюкоза, манноза, фруктоза, фукоза и т.д.), фосфолипиды, пептиды, лиганды для клеточных рецепторов, способных опосредовать клеточное поглощение и их комбинации (см, например, публикацию заявки на патент США №№2003/0130186,2004/0110296, и 2004/0249178; патент США №6753423). Другие примеры охватывают липофильный фрагмент, витамины, полимеры, пептиды, белок, нуклеиновую кислоту, малую молекулу, олигосахарид, углеводный кластер, интеркалятор, белок, связывающийся с малой бороздой, расщепляющие агенты, и сшивающие агенты молекул конъюгата, описанного в публикации заявки на патент США №2005/0119470 и 2005/0107325. Тем не менее, другие примеры охватывают 2'-O-алкиламин, 2'-O-алкоксиалкил амин, полиамин, С5-катионный модифицированный пиримидин, катионный пептид, гуанидиновую группу, амидининиум группу, катионные аминокислотные молекулы конъюгата, описанного в заявке на патент США публикация №2005/0153337. Дополнительные примеры охватывают гидрофобные группы, мембранные активные соединения, клетка-проникающие соединения, сигналы клеточной ориентации, интеракционные модификаты, и пространственные стабилизаторы молекул конъюгата, описанные в заявке на патент США №2004/0167090. Дополнительные примеры охватывают молекулы конъюгата, описанного в заявке на патент США №2005/0239739. Тип используемого конъюгата и степень конъюгации с молекулой миРНК могут быть оценены для улучшения фармакокинетических профилей, биологической доступности и/или стабильности миРНК, сохраняя при этом активность иРНК. Таким образом, специалист в данной области может найти молекулы миРНК, имеющие различные конъюгаты, присоединенные к ней, чтобы идентифицировать те, которые имеют улучшенные свойства и полную иРНК активность, используя любую из множества хорошо известных in vitro клеточных культур или в in vivo животных моделях. Раскрытие описанных выше патентных документов включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

Гены-мишени

Компонент миРНК нуклеиновой кислотно-липидной частиц, описанных в настоящем документе, могут быть использованы для подавления или выключения трансляции (то есть, экспрессии) интересующего гена. Интересующие гены охватывают гены, ассоциированные с вирусной инфекцией и экспрессией, гены, связанные с метаболическими заболеваниями и расстройствами (например, заболевания печени и расстройства), гены, связанные с опухолями или трансформированными клетками (например, рака), ангиогенные гены, гены-иммуномодуляторы, такие как те, которые связаны с воспалительными и аутоиммунными реакциями, гены рецепторов лиганда и гены, ассоциированные с нейродегенеративными расстройствами, но не ограничиваются ими.

В конкретных вариантах реализации, данное изобретение обеспечивает смесь из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или больше молекул миРНК, которые выключают экспрессию нескольких генов, представляющих интерес. В некоторых вариантах реализации смесь из молекул миРНК, полностью заключенных в липидную частицу, такую как нуклеиновую кислотно-липидную частицу (например, LNP). Молекулы миРНК могут быть совместно заключены в ту же липидную частицу, или каждый вид миРНК, присутствующий в смеси, может быть приготовлен в виде отдельных частиц.

Гены, связанные с вирусной инфекцией и выживанием, охватывают те, что экспрессируются хозяином (например, фактор хозяина, например, тканевой фактор (TF)) или вирус связывается, включается, и реплицируется в клетке. Особый интерес представляют вирусные последовательности, ассоциированные с хроническими вирусными заболеваниями. Особо интересные вирусные последовательности содержат последовательности Филовирусов, таких как вирус Эбола и Марбург вирус (см., например, Geisbert и др., J. Infect. Dis., 193: 1650-1657 (2006)); Аренавирусов, таких как вирус Ласса, вирус Хунин, вирус Мачупо, вирус Гуанарито и вирус Сабиа (Buchmeier и др., Arenaviridae: the viruses and their replication, In: Fields Virology, Knipe и др. (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, (2001)); Вирусов гриппа, такие как грипп А, В, и С вирусы, (см, например, Steinhauer и др., Annu Rev Genet., 36: 305-332 (2002); и Neumann и др., J Gen Virol., 83: 2635-2662 (2002)); вирусы Гепатита (см, например, Hamasaki и др., FEBS Lett., 543: 51 (2003); Yokota и др., ЕМВО Rep., 4: 602 (2003); Schlomai и др., Hepatology, 37: 764 (2003); Wilson и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 2783 (2003); Kapadia и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 2014 (2003); и Fields Virology, Knipe и др. (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (2001)); Вирус Имунодефицита Человека (ВИЧ) (Banerjea и др., Mol. Ther., 8: 62 (2003); Song и др., J. Virol., 77:7174 (2003); Stephenson, JAMA, 289: 1494 (2003); Qin и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 183 (2003)); Герпес вирусы (Jia и др., J. Virol., 77: 3301 (2003)); и Вирус Папиломы Человека (HPV) (Hall и др., J. Virol., 77: 6066 (2003); Jiang и др., Oncogene, 21: 6041 (2002)).

Примерные филовирусные последовательности нуклеиновых кислот, которые можно выключить, содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие структурные белки (например, VP30, VP35, нуклеопротеин (NP), полимеразный белок (L-Pol)) и мембранно-связанные белки (например, VP40, гликопротеин (ГП), VP24), но не ограничиваются ими. Полные последовательности генома для вируса Эбола изложены, например, в ГенБанк, № NC_002549; AY769362; NC_006432; NC_004161; AY729654; AY354458; AY142960; АВ050936; AF522874; AF499101; AF272001; и AF086833. Последовательности Эбола вируса VP24 изложены, например, в ГенБанк, № U77385 и AY058897. Последовательности вируса Эбола L-Pol изложены в, например, ГенБанк № Х67110. Последовательности вируса Эбола VP40 изложены в, например, ГенБанк № AY058896. Последовательности вируса Эбола NP изложены, например, в ГенБанк № AY058895. Последовательности вируса Эбола GP изложены, например, в ГенБанк, № AY058898; Sanchez и др.. Virus Res., 29: 215-240 (1993); Will и др., J. Virol., 67: 1203-1210 (1993); Volchkov и др., FEBS Lett., 305: 181-184 (1992); и патенте США № 6713069. Дополнительные последовательности вируса Эбола изложены, например, в ГенБанк № L11365 и Х61274. Полные последовательности генома для вируса Марбурга изложены, например, в ГенБанк № NC_001608; AY430365; AY430366; и AY358025. GP последовательности вируса Марбурга изложены, например, в ГенБанк № AF005734; AF005733; и AF005732. Последовательности Марбург Вируса VP35 изложены в, например, ГенБанк № AF005731 и AF005730. Дополнительные последовательности Марбург вируса изложены, например, в ГенБанк № Х64406; Z29337; AF005735; и Z12132. Не ограничивающие примеры молекул миРНК поражающих последовательности нуклеиновой кислоты вируса Эбола и Марбург вируса включают те, которые описаны в заявке на патент США №2007/0135370 и предварительной заявки США №61/286741, поданной 15 декабря 2009, раскрытие которых включены в настоящий документе путем ссылки в полном объеме для всех целей.

Примерные последовательности нуклеиновых кислот ареновируса, которые могут быть выключены, содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеопротеин (NP), гликопротеин (GP), L-полимеразу (L), и Z белок (Z), но не ограничиваются ими. Полные последовательности генома для вируса лихорадки Ласса изложены, например, в ГенБанк № NC_004296 (LASV сегмент S) и NC_004297 (LASV сегмент L). Неограничивающие примеры молекул миРНК, направленных на последовательности нуклеиновых кислот вируса Ласса, включают те, которые описаны в предварительной заявке США №61/319855, поданной 31 марта 2010, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Примеры последовательностей нуклеиновых кислот хозяев, которые могут быть выключены, включают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих факторов, содержащих такие, как тканевой фактор (TF), который, как известно, играет важную роль в патеногенезе вирусов геморрагической лихорадки, но не ограничиваются ими. Последовательность мРНК TF изложено в ГенБанк № NM_001993. Специалистам в данной области техники будет понятно, что TF также известен как F3, фактор свертывания крови III, тромбопластин и CD 142. Неограничивающие примеры молекул миРНК, ориентированных на последовательности нуклеиновых кислот TF содержат те, которые описаны в предварительной заявке США №61/319855, поданной 31 марта 2010, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Примерные последовательности нуклеиновой кислоты вируса гриппа, которые могут быть выключены, охватывают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие нуклеопротеин (NP), матричные белки (M1 и М2), неструктурные белки (NS1 и NS2), РНК-полимеразу (PA, PB1, РВ2), нейраминидазу (NA) и гемагглютинин (НА), но не ограничиваются ими. Последовательности гриппа NP изложены, например, в ГенБанк № NC_004522; AY818138; АВ166863; АВ188817; АВ189046; АВ189054; АВ189062; AY646169; AY646177; AY651486; AY651493; AY651494; AY651495; AY651496; AY651497; AY651498; AY651499; AY651500; AY651501; AY651502; AY651503; AY651504; AY651505; AY651506; AY651507; AY651509; AY651528; AY770996; AY790308; AY818138; и AY818140. Последовательности гриппа РА изложены, например, в ГенБанк № AY818132; AY790280; AY646171; AY818132; AY818133; AY646179; AY818134; AY551934; AY651613; AY651610; AY651620; AY651617; AY651600; AY651611; AY651606; AY651618; AY651608; AY651607; AY651605; AY651609; AY651615; AY651616; AY651640; AY651614; AY651612; AY651621; AY651619; AY770995; и AY724786. Неограничивающие примеры молекул миРНК, направленных на последовательности нуклеиновых кислот вируса гриппа, охватывают те, которые описаны в заявке на патент США №2007/0218122, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Примеры последовательностей нуклеиновых кислот вируса гепатита, которые могут быть выключены, охватывают последовательности нуклеиновых кислот, участвующих в транскрипции и трансляции (например, En1, EN2, X, Р), и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие структурные белки (например, основные белки, включая С и С-родственные белки, капсидные и белки оболочки, включая S, М и/или L белки, или их фрагменты) (см, например, Fields Virology, supra) но не ограничиваются ими. Примерные последовательности нуклеиновых кислот вируса Гепатита С (ВГС), которые могут быть выключены, включают 5'-нетранслируемую область (5'-UTR), 3'-нетранслируемую область (3'-UTR), полипротеиновый кодон области инициации трансляции, последовательность внутреннего рибосомального сайга входа (IRES), и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие основной белок, белок Е1, Е2 белков, белок Р7, белок NS2, NS3 протеазу/геликазу, NS4A белок, белок, NS4B, NS5A белок, и/или NS5B РНК-зависимую РНК-полимеразу, но не ограничиваются ими. Последовательности генома ВГС, приведены в, например, ГенБанк № NC_004102 (ВГС генотипа 1a), AJ238799 (ВГС генотипа 1b), NC_009823 (ВГС генотипа 2), NC_009824 (ВГС генотипа 3), NC_009825 (ВГС генотипа 4), NC_009826 (ВГС генотипа 5), и NC_009827 (ВГС генотипа 6). Последовательности нуклеиновых кислот вируса гепатита А изложены, например, в ГенБанк № NC_001489; Последовательности нуклеиновых кислот вируса гепатита В, изложены, например, в ГенБанк № NC_003977; Последовательности нуклеиновой кислоты вируса Гепатита D, изложены в, например, ГенБанк № NC_001653; Последовательности нуклеиновой кислоты вируса Гепатита Е, изложены, например, в ГенБанк № NC_001434; и последовательности нуклеиновых кислот вируса гепатита G, изложены, например, в ГенБанк, № NC_001710. Выключение последовательностей, которые кодируют гены, ассоциированные с вирусной инфекцией и выживанием, удобно могут быть использованы в сочетании с введением обычных средств, используемых для лечения вирусного состояния. Неограничивающие примеры молекул миРНК, направленных на последовательности нуклеиновых кислот вируса гепатита, охватывают те, которые описаны в публикации патентной заявки США №2006/0281175, 2005/0058982, и 2007/0149470; в патенте США №7348314; и РСТ заявке РСТ/СА2010/000444, озаглавленной "Композиции и способы для подавления экспрессии вируса гепатита С", поданной 19 марта 2010, имеющей регистрационный номер №020801-008910РС, описания которых включены в настоящий документ в качестве ссылки для всех целей.

Гены, ассоциированные с метаболическими заболеваниями и расстройствами (например, расстройствами, в которых печень является мишенью, и заболеваниями и расстройствами печени), охватывают, но не ограничиваются ими, гены, экспрессирующиеся при дислипидемии, такие как, например, аполипопротеин В (АРОВ) (номер доступа в ГенБанк № NM_000384), аполипопротеин C-III (АРОС3) (ГенБанк регистрационные номера №№ NM_000040 и NG_008949 REGION:. 5001..8164), аполипопротеин Е (АРОЕ) (ГенБанк регистрационные номер а №№ NM_000041 и NG_007084 REGION:. 5001..8612), пропротеин конвертазы субтилизина / Кеникс тип 9 (PCSK9) (номер доступа в ГенБанк № NM_174936), диацилглицерин типа O-ацилтрансфераза 1 (DGAT1) (номер доступа в ГенБанк № NM_012079), диацилглицерол O-ацилтрансфераза тип 2 (DGAT2) (номер доступа в ГенБанк № NM_032564), рецепторы печени X, такие как LXRα и LXRβ (ГенБанк инвентарный номер № NM_007121), фарнесоидные рецепторы Х (FXR) (номер доступа в ГенБанк № NM_005123), стериновый-регуляторный элемент-связывающий белок (SREBP), сайт-1 протеазы (S1P), 3-гидрокси-3-метилглутарил кофермент-А-редуктазы (ГМГ-коэнзим А-редуктазы); и гены экспрессии диабета, такие как, например, глюкозо-6-фосфатазы, но не ограничиваясь ими (см, например, Forman и др., Cell, 81: 687 (1995); Seol и др., Mol. Endocrinol., 9: 72 (1995), Zavacki и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 7909 (1997); Sakai и др., Cell, 85: 1037-1046 (1996); Duncan и др., J. Biol. Chem., 272: 12778-12785 (1997); Willy и др., Genes Dev., 9: 1033-1045 (1995); Lehmann и др., J. Biol. Chem., 272: 3137-3140 (1997); Janowski и др., Nature. 383: 728-731 (1996); и Peet и др., Cell, 93: 693-704 (1998)).

Специалисту в данной области техники будет понятно, что гены, связанные с метаболическими заболеваниями и расстройствами (например, заболеваниями и расстройствами, в которых печень является мишенью и заболеваниями и расстройствами печени), охватывают гены, которые экспрессируются в самой печени, а также и гены экспрессии в других органах и тканях. Подавления последовательностей, которые кодируют гены, связанные с метаболическими заболеваниями и расстройствами удобно могут быть использованы в сочетании с введением обычных средств, используемых для лечения заболеваний или расстройств. Неограничивающие примеры молекул миРНК, поражающих ген АРОВ содержат те, которые описаны в публикации патентной заявки США №2006/0134189, 2006/0105976 и 2007/0135372 и РСТ публикации WO 04/091515, описания которых приведены в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме для всех целей. Неограничивающие примеры молекул миРНК, поражающих ген АРОС3 содержат те, которые описаны в РСТ заявке РСТ/СА2010/000120, поданной 26 января 2010, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Неограничивающие примеры молекул миРНК, поражающих ген PCSK9 содержат те, которые описаны в публикации заявки на патент США №2007/0173473, 2008/0113930 и 2008/0306015, описания которых включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Примеры молекул миРНК, поражающих ген DGAT1, могут быть сконструированы с использованием антисмысловых соединений, описанных в заявке на патент США №2004/0185559, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Примеры молекул миРНК, поражающих ген DGAT2 могут быть сконструированы с использованием антисмысловых соединений, описанных в заявке на патент США №2005/0043524, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Гены, ассоциированные с генезисом опухолей или клеточной трансформацией (например, рака или других неоплазий), охватывают, например, гены, участвующие в р53 убиквитинировании, c-Jun убиквитинировании, деацетилировании гистонов, регуляции клеточного цикла, регуляции транскрипции, и их комбинации. Неограничивающие примеры последовательностей генов, ассоциированных с онкогенезом или трансформацией клеток включают серин/треонин киназы, такие как polo-подобная киназа 1 (PLK-1) (ГенБанк, регистрационный номер № NM_005030; Barr- и др., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5: 429-440 (2004)) и циклин-зависимая киназы 4 (CDK4) (ГенБанк, инвентарный № NM_000075); убиквитин лигазы, такие как СОР1 (RFWD2; ГенБанк, №№ NM_022457 и NM_001001740) и ринг-бокс 1 (RBX1) (ROC1; номер доступа в ГенБанк № NM_014248); тирозинкиназы, такие как Weel (ГенБанк № NM_003390 и NM_001143976); митотические кинезины такие как EG5 (КСП, KIF11; номер доступа в ГенБанк № NM_004523); транскрипционные факторы, такие как форкхэд бокс M1 (FOXM1) (ГенБанк №№ NM_202002, NM_021953 и NM_202003) и RAM2 (R1 или CDCA7L; ГенБанк №№ NM_018719, NM_001127370 и NM_001127371); ингибиторы апоптоза, таких как XIAP (ГенБанк, инвентарный № NM_001167); COP9 подъединица сигналосомы, такие как CSN1, CSN2, CSN3, CSN4, CSN5 (JAB1; номер доступа в ГенБанк № NM_006837); CSN6, CSN7A, CSN7B, и CSN8; и гистондезацетилаз такие как HDAC1, HDAC2 (номер доступа в ГенБанк № NM_001527), HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9 и т.д.

Неограничивающие примеры молекул миРНК, поражающих ген PLK-1, включают те, которые описаны в публикации заявки на патент США №2005/0107316 и 2007/0265438; и публикации РСТ № WO 09/082817, раскрытие которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей. Неограничивающие примеры молекул миРНК, поражающих гены EG5 и XIAP включают те, которые описаны в заявке на патент США №2009/0149403, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Неограничивающие примеры молекул миРНК, поражающих CSN5 ген, включают те, которые описаны в РСТ публикации WO 09/129319, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Не ограничивающие примеры молекул миРНК, поражающих СОР1, CSN5, RBX1, HDAC2, CDK4, Wee1, FOXM1, и RAM2 гены включают те, которые описаны в предварительной заявке США 61/245143, поданной 23 сентября 2009, описание которого в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

Дополнительные примеры последовательностей генов, связанных с генезисом опухолей или трансформацией клеток включают транслокационные последовательности, такие как гены MLL синтеза, BCR-ABL (Wilda и др., Oncogene, 21: 5716 (2002); Scherr и др., Blood, 101: 1566 (2003)), TEL-АМЛ1, EWS-FLI1, TLS-FUS, PAX3-FKHR, BCL-2, АМЛ1-ЕТО, и АМЛ1-MTG8 (Heidenreich и др., Blood, 101: 3157 (2003)); сверхэкспрессированные последовательности, такие как гены множественной лекарственной устойчивости (Nieth и др., FEBS Lett; 545: 144 (2003); Wu и др. Cancer Res. 63: 1515 (2003)), циклины (Li и др., Cancer Res., 63: 3593 (2003); Zou и др., Genes Dev., 16: 2923 (2002)), бета-катенины (Verma и др., Clin Cancer Res., 9: 1291 (2003)), гены теломеразы (Koscioiek и др., Mol Cancer Ther., 2: 209 (2003)), c-MYC, N-MYC, BCL-2, рецепторы факторов роста (см, EGFR/ErbB1 (ГенБанк регистрационные номера №№ NM_005228, NM_201282, NM_201283, и NM_201284; см также, Nagy и др. Exp. Cell Res., 285: 39-49 (2003)), ErbB2/HER-2 (ГенБанк регистрационные номера №№ NM_004448 и NM_001005862), ErbB3 (ГенБанк регистрационные номера №№ NM_001982 и NM_001005915), и ЕrbВ4 (ГенБанк регистрационные номера №№ NM_005235 и NM_001042599)), и мутантные последовательности, такие как RAS (Tuschi and Borkhardt, Mol. Interventions, 2: 158 (2002)). Неограничивающие примеры молекул миРНК, поражающих ген EGFR, включают те, которые описаны в заявке на патент США №2009/0149403, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Молекулы миРНК, которые нацелены на VEGFR гены изложены, например, в GB 2396864; Патентной заявке США №2004/0142895; и СА 2456444, раскрытие которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

Выключение последовательностей, что кодируют ДНК репарирующие энзимы, нашли применение в сочетании с введением химиотерапевтических агентов (Collis и др., Cancer Res., 63: 1550 (2003)). Гены, кодирующие белки, связанные с миграцией опухоли, также поражают последовательности, представляющие интерес, например, интегрины, селектины и металлопротеиназы. Приведенные примеры не являются исключительными. Специалистам в данной области техники будет понятно, что любая целая или частичная последовательность гена, который способствует или содействует генезису опухолей или трансформации клеток, росту опухоли или миграции опухоли, могут быть включены в качестве матричной последовательности.

Ангиогенные гены способны содействовать формированию новых сосудов. Ангиогенные гены, представляющие особый интерес, включают фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) (Reich и др., Mol. Vis., 9: 210 (2003)), плацентарный фактор роста (PGF), VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR/Flk-1), и тому подобное, но не ограничиваясь этим. Молекулы миРНК, которые нацелены на VEGFR гены изложены, например, в GB 2396864; патентной заявке США №2004/0142895; и СА 2456444, раскрытие которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

Гены иммуномодуляторы - это гены, которые модулируют одну или более иммунных реакций. Примеры генов-иммуномодуляторов включают, без ограничения, факторы роста (например, TGF-α, TGF-β, EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, CGF, GM-CSF, SCF, etc.), интерлейкины (например, IL-2, IL-4, IL-12 (Hill и др., J. Immunol., 171: 691 (2003)), IL-15, IL-18, IL-20, etc.), интерфероны (например, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, etc.), и TNF. Гены Fas и Fas-лиганда также являются иммуномодуляторами последовательностей-мишеней, представляющих интерес (Song и др., Nat. Med., 9: 347 (2003)). Гены, кодирующие молекулы вторичных сигналов в кроветворных и лимфоидных клетках, также включены в настоящее изобретение, например. Тес семейство киназ, таких как тирозинкиназы Брутона (Btk) (Heinonen и др., FEBS Lett., 527: 274 (2002)).

Гены лиганда клеточного рецептора включают лиганды, которые способны связываться с рецепторами клеточной поверхности (например, рецепторы цитокинов, рецепторы факторов роста, рецепторы с активностью тирозинкиназы, G-белками рецепторы, рецепторы инсулина, ЕРО-рецепторы, и т.д.), для модуляции (например, ингибирование) физиологического пути, в который включен рецептор (например, пролиферации клеток, канцерогенезе, трансформации клеток, митогенезе, и т.д.). Неограничивающие примеры лигандов генов клеточного рецептора охватывают цитокины (например, TNF-α, интерфероны, такие как IFN-α, IFN-β и ifn-γ, интерлейкины, такие как IL-1α, IL-1β, IL-2, IL -4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-23, IL-27, хемокины и т.д.), факторы роста (например, EGF, HB-EGF, VEGF, PEDF, SDGF, bFGF, HGF, TGF-α, TGF-β, BMP1-BMP15, PDGF, IGF, NGF, β-NGF, BDNF, NT3, NT4, GDF-9, CGF, G-CSF, GM-CSF, GDF-8, ЕРО, ТРО, и т.д.), инсулин, глюкагон, лиганды G-белка рецептора и т.д..

Шаблоны кодирования для расширения тринуклеотидных повторов (например, CAG повтора) находят применение в выключении патогенной последовательности при нейродегенеративных расстройствах, вызванных расширением тринуклеотидных повторов, таких как спинобулбулярной мышечной атрофии и болезни Хантингтона (Caplen и др., Hum. Mol. Genet., 11: 175 (2002)).

В дополнение к его полезности при выключении экспрессии любого из вышеописанных генов в терапевтических целях, миРНК, описанные в настоящем документе, также полезны в научно-исследовательских и опытных приложениях, а также диагностиках, профилактических, прогностических, клинических и других приложениях здравоохранения. В качестве не ограничивающего примера, миРНК может быть использована в проверочных исследованиях, направленных на целевую проверку, может ли интересующий ген иметь потенциал, чтобы быть терапевтической мишенью. МиРНК также могут быть использованы в идентификационных исследованиях мишеней, направленных на обнаружение генов, в качестве потенциальных терапевтических мишеней.

Примеры вариантов реализации миРНК

В некоторых вариантах реализации каждая цепь молекулы миРНК содержит от примерно 15 до примерно 60 нуклеотидов в длину (например, примерно 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, или 19-25 нуклеотидов в длину, или 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, или 25 нуклеотидов в длину). В одном конкретном варианте реализации миРНК химически синтезированы. Молекулы миРНК по изобретению способны выключать экспрессию последовательности-мишени in vitro и/или in vivo.

В других вариантах реализации миРНК содержит, по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах реализации миРНК содержит один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более модифицированных нуклеотидов в двухцепочечной области. В конкретных вариантах реализации, менее чем примерно 50% (например, менее чем примерно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5%) нуклеотидов в двухцепочечной область миРНК содержат модифицированные нуклеотиды. В предпочтительных вариантах реализации от примерно 1% до примерно 50% (например, от примерно 5%-50%, 10%-50%, 15%-50%, 20%-50%, 25%-50%, 30%-50%, 35%-50%, 40%-50%, 45%-50%, 5%-45%, 10%-45%, 15%-45%, 20%-45%, 25%-45%, 30%-45%, 35%-45%, 40%-45%, 5%-40%, 10%-40%, 15%-40%, 20%-40%, 25%-40%, 30%-40%, 35%-40%, 5%-35%, 10%-35%, 15%-35%, 20%-35%, 25%-35%, 30%-35%, 5%-30%, 10%-30%, 15%-30%, 20%-30%, 25%-30%, 5%-25%, 10%-25%, 15%-25%, 20%-25%, 5%-20%, 10%-20%, 15%-20%, 5%-15%, 10%-15% или 5%-10%) из нуклеотидов в двухцепочечной области миРНК содержать модифицированные нуклеотиды.

В других вариантах реализации, миРНК включает в себя модифицированные нуклеотиды, включая 2'-O-метил (2'OMe) нуклеотид, 2'-дезокси-2'-фтор (2'F) нуклеотид, 2'дезокси нуклеотид, 2'-O-(2-метоксиэтил) (MO) нуклеотид, замкнутые нуклеиновые кислоты (LNA) нуклеотиды и их смеси, но не ограничиваясь ими. В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения миРНК включает в себя 2'OMe нуклеотид (например, 2'OMe пуриновые и/или пиримидиновые нуклеотиды), такие как, например, 2'OMe-гуанозиновый нуклеотид, 2'OMe-уридиновый нуклеотид, 2'OMe-аденозиновый нуклеотид, 2'OMe-цитозиновый нуклеотид, или их смеси. В одном конкретном варианте реализации миРНК содержит, по меньшей мере, один 2'OMe-гуанозиновый нуклеотид, 2'OMe-уридиновый нуклеотид или их смеси. В некоторых случаях, миРНК не содержит 2'OMe-цитозиновый нуклеотид. В других вариантах реализации миРНК содержит структуру петли шпильки.

В некоторых вариантах реализации, миРНК включает в себя модифицированные одноцепочечные нуклеотиды (то есть, смысловые и антисмысловые) или двухцепочечные в двухцепочечной области молекулы миРНК. Предпочтительно, уридиновые и/или гуанозиновые нуклеотиды модифицированы в селективных позициях в двухцепочечной области дуплекса миРНК. Что касается модифицированных уридиновых нуклеотидов, по меньшей мере, один, два, три, четыре, пять, шесть или более из нуклеотидов уридина в смысловой и/или антисмысловой цепи могут быть модифицированными уридиновыми нуклеотидами, такими как 2'OMe-уридиновый нуклеотид. В некоторых вариантах реализации, каждый нуклеотид уридина в смысловой и/или антисмысловой цепи является 2'OMe-уридиновым нуклеотидом. Что касается модифицированных гуанозиновых нуклеотидов, по меньшей мере, один, два, три, четыре, пять, шесть или более из нуклеотидов гуанозина в смысловой и/или антисмысловой цепи могут быть модифицированными гуанозиновыми нуклеотидами, такими как гуанозин-2'OMe нуклеотид. В некоторых вариантах реализации, каждый гуанозиновый нуклеотид в смысловой и/или антисмысловой цепи представляет собой гуанозин-2'OMe нуклеотид.

В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере, один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, или больше 5'-GU-3' фрагментов в последовательности миРНК могут быть модифицированы, например, путем введения несовпадений для устранения 5'-GU-3' фрагментов и/или путем введения модифицированных нуклеотидов, таких как 2'OMe нуклеотиды. 5'-GU-3' фрагмент может быть в смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепях последовательности миРНК. 5'-GU-3' фрагменты могут быть рядом друг с другом или, альтернативно, они могут быть разделены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более нуклеотидами.

В некоторых вариантах реализации модифицированная молекула миРНК является менее иммуностимулирующей, чем соответствующая немодифицированная последовательность миРНК. В таких вариантах реализации модифицированная молекула миРНК с пониженными иммуностимулирующими свойствами предпочтительно сохраняет иРНК активность в отношении последовательности-мишени. В другом варианте реализации иммуностимулирующие свойства модифицированной молекулы миРНК и ее способность выключать экспрессию гена-мишени могут быть сбалансированы или оптимизированы путем введения минимальных и селективных модификаций 2'OMe в последовательности миРНК, такие как, например, в двухцепочечную область дуплекса миРНК. В некоторых случаях, модифицированная миРНК является по меньшей мере примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% менее иммуностимулирующей чем соответствующая немодифицированная миРНК. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что иммуностимулирующие свойства модифицированной молекулы миРНК и соответствующей немодифицированной молекулы миРНК, могут быть определены, например, измерениями уровней INF-α и/или IL-6 от примерно двух до примерно двенадцати часов после системного введения млекопитающему или трансфекции в клетки млекопитающих респондента с использованием соответствующей системы доставки на основе липида (например, LNP системы доставки, раскрытой в настоящем документе).

В других вариантах реализации модифицированная молекула миРНК имеет IC₅₀ (т.е. половина от максимальной ингибирующей концентрации) меньше или равно десятикратной соответствующей немодифицированной миРНК (то есть, модифицированная миРНК имеет IC₅₀ которое меньше или равно десятикратному IC₅₀ соответствующей немодифицированной миРНК). В других вариантах реализации модифицированная миРНК имеет IC₅₀ меньше или равную трехкратной соответствующей немодифицированной последовательности миРНК. В других вариантах реализации модифицированная миРНК имеет IC₅₀ меньше или равную двукратной соответствующей немодифицированной миРНК. Это будет очевидно специалистам в данной области техники, что кривая доза-ответ может быть сгенерирована и IC₅₀ для модифицированной миРНК и соответствующей немодифицированной миРНК могут быть легко определены с помощью методов, известных специалистам в данной области.

В другом варианте реализации немодифипированная или модифицированная молекулы миРНК способны выключать, по меньшей мере, примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%. 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% от экспрессии последовательности-мишени относительно отрицательного контроля (например, только буфер, последовательность миРНК, которая предназначается другому гену, зашифрованная последовательность миРНК и т.д.).

В еще одном варианте реализации модифицированная молекула миРНК способна выключать, по меньшей мере примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% от экспрессии последовательности-мишени относительно соответствующей немодифицированной последовательности миРНК.

В некоторых вариантах реализации молекула миРНК не содержит модифицированных скелетов фосфатов, например, в смысловой и/или антисмысловой цепи двухцепочечной области. В других вариантах, миРНК содержит один, два, три, четыре, или более модифицированных скелетов фосфатов, например, в смысловой и/или антисмысловой цепи двухцепочечной области. В предпочтительных вариантах реализации миРНК не содержит модифицированных скелетов фосфатов.

В других вариантах реализации миРНК не содержит 2'-дезокси нуклеотидов, например, в смысловой и/или антисмысловой цепи двухцепочечной области. В следующих вариантах реализации миРНК содержит один, два, три, четыре, или более 2'-дезокси нуклеотидов, например, в смысловой и/или антисмысловой цепи двухцепочечной области. В предпочтительных вариантах реализации миРНК не содержит 2'-дезокси нуклеотидов.

В некоторых случаях, нуклеотид на 3'-конце двухцепочечной области в смысловой и/или антисмысловой цепи не является модифицированным нуклеотидом. В некоторых других случаях, нуклеотиды вблизи 3'-конца (например, в одном, двух, трех или четырех нуклеотидов 3'-конца) двухцепочечной области в смысловой и/или антисмысловой цепи не является модифицированным нуклеотидом.

Молекулы миРНК, описанные в настоящем документе, могут иметь 3' выступы из одного, двух, трех, четырех или более нуклеотидов на одной или обеих сторонах двухцепочечной области, или могут не иметь выступов (т.е. имеют тупые концы) на одной или с обеих сторон двухцепочечной области. В некоторых вариантах реализации выступ 3' на смысловой и/или антисмысловой цепи, независимо содержит один, два, три, четыре или более модифицированных нуклеотидов, таких как 2'OMe нуклеотидов и/или любого другого модифицированного нуклеотида, описанных в настоящем документе, или известного в данной области.

В конкретных вариантах реализации, миРНК вводят с помощью системы носителя, такого как нуклеиновая кислотно-липидная частица. В предпочтительном варианте реализации нуклеиновая кислотно-липидная частица включает: (а) одну или более молекул миРНК; (б) катионный липид формулы I или его соль; и (с) некатионный липид (например, DPPC, DSPC, DSPE, и/или холестерин). В некоторых случаях, нуклеиновая кислотно-липидная частица может дополнительно содержать сопряженный липид, который предотвращает агрегацию частиц (например, PEG-DAA и/или POZ-DAA).

2. Дайсер-субстратные дсРНК

Как используется в настоящем документе, термин "Дайсер-субстратная дсРНК" или "молекула предшественника иРНК" предназначен для включения в себя любой молекулы-предшественника, которая обрабатывается in vivo дайсером с образованием активной миРНК, которая включается в комплекс RISC для РНК интерференции гена-мишени.

В одном варианте реализации дайсер-субстратная дсРНК имеет достаточную длину для того, чтобы она обрабатывалась с помощью дайсера для получения миРНК. Согласно этому варианту реализации, дайсер-субстратная дсРНК включает (i) первую последовательность олигонуклеотида (также называемую смысловой цепью), который находится между примерно 25 и примерно 60 нуклеотидов в длину (например, примерно 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, или 25-30 нуклеотидов в длину), предпочтительно между примерно 25 и примерно 30 нуклеотидов в длину (например, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов длина) и (ii) вторую последовательность олигонуклеотида (также называемую антисмысловой цепью), которая гибридизуется с первой последовательностью в биологических условиях, таких как условия, обнаруженные в цитоплазме клетки. Вторая последовательность олигонуклеотида может быть между примерно 25 и примерно 60 нуклеотидов в длину (например, примерно 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, или 25-30 нуклеотидов в длину), и, предпочтительно, между примерно 25 и примерно 30 нуклеотидов (например, 25, 26, 27, 28, 29, или 30 нуклеотидов в длину). Кроме того, область одной из последовательностей, в частности, антисмысловой цепи, дайсер-субстратная дсРНК имеет длину последовательности, равную, по меньшей мере, примерно 19 нуклеотидов, например, от примерно 19 до примерно 60 нуклеотидов (например, примерно 19-60, 19-55, 19-50, 19-45, 19-40, 19-35, 19-30, или 19-25 нуклеотидов), предпочтительно от примерно 19 до примерно 23 нуклеотидов (например, 19, 20, 21, 22 или 23 нуклеотидов), которые в достаточной степени комплементарные к нуклеотидной последовательности РНК, полученной из гена-мишени, чтобы вызвать реакцию иРНК.

Во втором варианте реализации, дайсер-субстратная дсРНК имеет несколько свойств, которые улучшают ее обработку с помощью дайсера. Согласно этому варианту реализации, дсРНК имеет длину, достаточную, чтобы она обрабатывалась дайсером для получения миРНК и имела, по меньшей мере, одно из следующих свойств: (i) дсРНК является асимметричной, например, имеет 3'-выступ на антисмысловой цепи; и/или (ii) дсРНК имеет модифицированный 3'-конец на смысловой цепи для прямой ориентации при связывании дайсера и обработанной дсРНК к активной миРНК. В соответствии с этим последним вариантом, смысловая цепь содержит от примерно 22 до примерно 28 нуклеотидов и антисмысловая цепь содержит от примерно 24 до примерно 30 нуклеотидов.

В одном варианте реализации дайсер-субстратная дсРНК имеет выступ на 3'-конце антисмысловой цепи. В другом варианте реализации изобретения смысловая цепь модифицирована для связывания дайсера и обработки с помощью соответствующих модификаторов, расположенных на 3'-конце смысловой цепи. Подходящие модификаторы включают нуклеотиды, такие как дезоксирибонуклеотиды, ациклонуклеотиды и тому подобное, и стерически затрудненные молекулы, такие как флуоресцентные молекулы и тому подобное. При использовании нуклеотидных модификаторов, они заменяют рибонуклеотиды в дсРНК таким образом, что длина дсРНК не изменяется. В другом варианте реализации дайсер-субстратная дсРНК имеет выступ на 3'-конце антисмысловой цепи и смысловая цепь модифицирована для обработки дайсера. В другом варианте реализации, 5'-конец смысловой цепи имеет фосфат. В другом варианте реализации, 5'-конец антисмысловой цепи имеет фосфат. В другом варианте реализации, антисмысловая цепь или смысловая цепь, или обе цепи имеют одну или несколько 2'-O-метил (2'OMe) модифицированных нуклеотидов. В другом варианте реализации, антисмысловая цепь содержит 2'OMe модифицированные нуклеотиды. В другом варианте реализации антисмысловая цепь содержит 3'-выступ, который состоит из 2'OMe модифицированных нуклеотидов. Антисмысловая цепь может также включать дополнительные 2'OMe модифицированные нуклеотиды. Смысловые и антисмысловые цепи отжигаются в биологических условиях, таких как условия, находящиеся в цитоплазме клетки. Кроме того, область одной из последовательностей, в частности, антисмысловой цепи, дайсер-субстратная дсРНК имеет длину последовательности, равную, по меньшей мере, примерно 19 нуклеотидов, причем эти нуклеотиды находятся в 21-нуклеотидной области, примыкающей к 3'-концу антисмысловой цепи и достаточно комплементарны нуклеотидной последовательности РНК, полученной из гена-мишени. Кроме того, в соответствии с этим вариантом, дайсер-субстратная дсРНК может также иметь одну или несколько из следующих дополнительных свойств: (а) антисмысловая цепь имеет сдвиг вправо от типичного 21-мера (т.е., антисмысловая цепь включает нуклеотиды на правой части молекулы по сравнению с типичным 21-мером); (б) цепи не могут быть полностью комплементарными, т.е. цепи могут содержать простые несоответствия спариваний; и (с) основные модификации, такие как блокировка нуклеиновой кислоты, могут быть включены в 5'-конец смысловой цепи.

В третьем варианте реализации, смысловая цепь включает в себя от примерно 25 до примерно 28 нуклеотидов (например, 25, 26, 27, или 28 нуклеотидов), в котором 2 нуклеотида на 3'-конце смысловой цепи являются дезоксирибонуклеотидами. Смысловая цепь содержит фосфат на 5'-конце. Антисмысловая цепь содержит от примерно 26 до примерно 30 нуклеотидов (например, 26, 27, 28, 29, или 30 нуклеотидов) и содержит 3'-выступ из 1-4 нуклеотидов. Нуклеотиды, содержащие 3'-выступ, модифицированы 2'OMe модифицированными рибонуклеотидами. Антисмысловая цепь содержит чередующиеся 2'OMe модифицированные нуклеотиды, начиная с первого мономера антисмысловой цепи, прилегающей к 3'-выступу, и расширение 15-19 нуклеотидов от первого мономера, прилегающей к 3'-выступу. Например, для 27-нуклеотидной антисмысловой цепи и подсчета первая основа на 5'-конце антисмысловой цепи в положении номер 1, 2'OMe модификации будет размещена на месте оснований 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 26, и 27. В одном варианте реализации дайсер-субстратная дсРНК имеет следующую структуру:

где "X"=РНК, "p"=фосфатная группа, "X"=2'OMe РНК, "Y" является выступом домена, который состоит из 1, 2, 3, 4 или РНК мономеров, которые являются необязательными 2'OMe РНК мономерами и "D"=ДНК. Верхняя цепь является смысловой цепью, а нижняя цепь является антисмысловой цепью.

В четвертом варианте реализации, дайсер-субстратная дсРНК имеет несколько свойств, которые повышают его обработку Дайсер. Согласно этому варианту реализации, дсРНК имеет длину, достаточную для того, чтобы она обрабатывалась дайсером для получения миРНК и, по меньшей мере, одно из следующих свойств: (i) дсРНК является асимметричной, например, имеет 3'-выступ на смысловой цепи; и (ii) дсРНК имеет модифицированный 3'-конец на антисмысловой цепи, чтобы направлять ориентацию связывания Дайсер и обработки дсРНК с активной миРНК. Согласно этому варианту реализации, смысловая цепь содержит от примерно 24 до примерно 30 нуклеотидов (например, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов) и антисмысловая цепь содержит от примерно 22 до примерно 28 нуклеотидов (например, 22, 23, 24, 25, 26, 27, или 28 нуклеотидов). В одном варианте реализации дайсер-субстратная дсРНК имеет выступ на 3'-конце смысловой цепи. В другом варианте реализации, антисмысловая цепь модифицирована для связывания дайсера и обработки с помощью соответствующих модификаторов, расположенных на 3'-конце антисмысловой цепи. Подходящие модификаторы включают нуклеотиды, такие как дезоксирибонуклеотиды, ациклонуклеотиды и тому подобное, и стерически затрудненные молекулы, такие как флуоресцентные молекулы и тому подобное. При использовании нуклеотидных модификаторов, они заменяют рибонуклеотиды в дсРНК таким образом, что длина дсРНК не изменяется. В другом варианте реализации изобретения дсРНК имеет выступ на 3'-конце смысловой цепи и антисмысловая цепь модифицирована для обработки дайсером. В одном варианте реализации, антисмысловая цепь имеет 5'-фосфат. Смысловые и антисмысловые цепи отжигаются в биологических условиях, таких как условия, находящиеся в цитоплазме клетки. Кроме того, область одной из последовательностей, в частности, антисмысловой цепи, дсРНК имеет длину последовательности, равную по меньшей мере 19 нуклеотидам, причем эти нуклеотиды примыкают к 3'-концу антисмысловой цепи и в достаточной степени комплементарны нуклеотидной последовательности РНК, полученной из гена-мишени. Кроме того, в соответствии с этим вариантом реализации, дайсер-субстратная дсРНК может также иметь одну или несколько следующих дополнительных свойств: (а) антисмысловая цепь имеет левый сдвиг от типичного 21-мера (т.е., антисмысловая цепь включает нуклеотиды по левой части молекулы по сравнению с типичным 21-мером); и (б) цепи могут не быть полностью комплементарными, т.е. цепи могут содержать простые несоответствия спаривания.

В предпочтительном варианте реализации, дайсер-субстратная дсРНК имеет асимметричную структуру, со смысловой цепью, имеющей длину 25 пар оснований, и антисмысловой цепью, имеющей длину 27 пар оснований с 2-мя основаниями на 3'-выступе. В некоторых случаях, эта дсРНК, имеющая асимметричную структуру дополнительно содержит 2 дезоксинуклеотида на 3'-конце смысловой цепи вместо двух рибонуклеотидов. В некоторых других случаях, эта дсРНК, имеющая асимметричную структуру дополнительно содержит 2'OMe модификации в положениях 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, и 25 антисмысловой цепи (в котором первое основание на 5'-конце антисмысловой цепи находится в позиции 1). В некоторых дополнительных случаях, эта дсРНК, имеющая асимметричную структуру дополнительно содержит 3'-выступ на антисмысловой цепи, содержащей 1, 2, 3 или 4 2'OMe нуклеотиды (например, 3'-выступ 2'OMe нуклеотидов в положениях 26 и 27 на антисмысловой цепи).

В другом варианте реализации, дайсер-субстратная дсРНК может быть разработана с помощью начального выбора миРНК последовательности антисмысловой цепи, имеющей длину по меньшей мере 19 нуклеотидов. В некоторых случаях, антисмысловая миРНК модифицирована, чтобы включать в себя от примерно 5 до примерно 11 рибонуклеотидов на 5'-конце, чтобы обеспечить длину примерно 24 до примерно 30 нуклеотидов. Когда антисмысловая цепь имеет длину 21 нуклеотидов, 3-9, предпочтительно 4-7, более предпочтительно 6 нуклеотидов могут быть добавлены на 5'-конец. Несмотря на это, добавление рибонуклеотидов может быть комплементарным последовательности гена-мишени, полная комплементарность между целевой последовательностью и антисмысловой миРНК не требуется. То есть, в результате антисмысловая миРНК является в достаточной степени комплементарной с последовательностью-мишенью. Смысловая цепь, которая затем производится, имеет от примерно 22 до примерно 28 нуклеотидов. Смысловая цепь, по существу, комплементарна антисмысловой цепи для отжига антисмысловой цепи в биологических условиях. В одном варианте реализации, смысловая цепь синтезирует содержащий модифицированный 3'-конец, чтобы направить дайсер обработку антисмысловой цепи. В другом варианте реализации, антисмысловая цепь дцРНК имеет 3'-выступ. В дополнительном варианте реализации, смысловая цепь синтезируется содержащей модифицированный 3'-конец для связывания и обработки дайсером и антисмысловая цепь дсРНК имеет 3'-выступ.

В родственном варианте реализации антисмысловая миРНК может быть модифицирована, чтобы включать в себя от примерно 1 до примерно 9 рибонуклеотидов на 5'-конце, чтобы обеспечить длину примерно 22 до примерно 28 нуклеотидов. Когда антисмысловая цепь имеет длину 21 нуклеотид, 1-7, предпочтительно 2-5, более предпочтительно 4 рибонуклеотидов могут быть добавлены на 3'-конце. Добавленные рибонуклеотиды могут иметь любую последовательность. Несмотря на то, добавленные рибонуклеотиды могут быть комплементарными последовательности гена-мишени, полная комплементарность между целевой последовательностью и антисмысловой миРНК не требуется. То есть, в результате антисмысловая миРНК является в достаточной степени комплементарной с последовательностью-мишенью. Смысловая цепь, которая затем производится, имеет от примерно 24 до примерно 30 нуклеотидов. Смысловая цепь, по существу, дополняет антисмысловую цепь для отжига антисмысловой цепи в биологических условиях. В одном варианте реализации антисмысловая цепь, которая синтезируется, чтобы содержать модифицированный 3'-конец, чтобы направить обработку дайсером. В другом варианте реализации смысловой цепи дцРНК имеет 3'-выступ. В еще одном варианте реализации синтезируют антисмысловую цепь, которая содержит модифицированный 3'-конец для связывания дайсера и обработки, и смысловая цепь дсРНК имеет 3'-выступ.

Подходящие дайсер-субстратные дсРНК последовательности могут быть определены, синтезированы и изменены с помощью любых средств, известных в данной области для проектирования, синтеза и модификации последовательностей миРНК. В конкретных вариантах реализации, дайсер-субстратную дсРНК вводят с помощью системы носителя, такого как нуклеиновая кислотно-липидная частица. В предпочтительном варианте реализации, нуклеиновая кислотно-липидная частица включает: (а) одну или более дайсер-субстратных молекул дсРНК; (б) катионный липид формулы I или его соль; и (с) некатионный липид (например, DPPC, DSPC, DSPE и/или холестерин). В некоторых случаях, нуклеиновая кислотно-липидная частица может дополнительно содержать сопряженный липид, который предотвращает агрегацию частиц (например, PEG-DAA и/или POZ-DAA).

Дополнительные варианты реализации, относящиеся к дайсер-субстратной дсРНК согласно изобретению, а также способам проектирования и синтеза таких дсРНК, описаны в публикациях патентных заявок США №№2005/0244858,2005/0277610 и 2007/0265220 и предварительной заявки США №61/184652, поданной 5 июня 2009 года, описание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

МшРНК

"Малая шпилька РНК" или "короткая шпилька РНК" или "мшРНК" включает в себя короткую последовательность РНК, которая делает крутой поворот в виде шпильки, которые могут быть использованы для подавления экспрессии гена с помощью РНК-интерференции. МшРНК по изобретению могут быть синтезированы химически или транскрибированы с транскрипционных кассет в плазмидную ДНК. Структура шпильки мшРНК расщепляется клеточными механизмами в миРНК, которая затем, связывается с РНК-индуцированным выключающим комплексом (RISC).

МшРНК по изобретению, как правило, имеют примерно 15-60, 15-50, 15-40 или (дуплекс) нуклеотидов, более обычно примерно 15-30, 15-25, 19-25 или (дуплекс) нуклеотидов в длину, и предпочтительно примерно 20-24, 21-22, 21-23 или (дуплекс) нуклеотидов в длину (например, каждая комплементарная последовательность в двухцепочечной мшРНК имеет 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, или 19-25 нуклеотидов в длину, предпочтительно примерно 20-24, 21-22, или 21-23 нуклеотидов в длину, и двухцепочечная мшРНК составляет примерно 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, или 19-25 пар оснований в длину, предпочтительно примерно 18-22, 19-20, или 19-21 пар оснований в длину). МшРНК дуплексы могут включать 3' выступы от примерно 1 до примерно 4 нуклеотидов или примерно 2 до примерно 3 нуклеотидов на антисмысловой цепи и/или 5'-фосфат-концы на смысловой цепи. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мшРНК содержит мшРНК последовательности смысловой цепи и/или антисмысловой цепи от примерно 15 до примерно 60 нуклеотидов в длину (например, примерно 15-60, 15-55, 15-50, 15-45, 15-40, 15-35, 15-30, или 15-25 нуклеотидов в длину), предпочтительно от примерно 19 до примерно 40 нуклеотидов в длину (например, примерно 19-40, 19-35, 19-30, или 19-25 нуклеотидов в длину), более предпочтительно от примерно 19 до примерно 23 нуклеотидов в длину (например, 19, 20, 21, 22, или 23 нуклеотидов в длину).

Неограничивающие примеры мшРНК включают двухцепочечную полинуклеотидную молекулу, собранную из одноцепочечной молекулы, где смысловая и антисмысловая области связаны посредством линкера на основе ненуклеиновой кислоты или на основе нуклеиновой кислоты; и двухцепочечная полинуклеотидная молекула с вторичной структурой в виде шпильки имеет смысловой и антисмысловой регионы. В предпочтительных вариантах реализации, смысловая и антисмысловая цепи в мшРНК связаны структурными петлями, содержащими от примерно 1 до примерно 25 нуклеотидов, от примерно 2 до примерно 20 нуклеотидов, от примерно 4 до примерно 15 нуклеотидов, от примерно 5 до примерно 12 нуклеотидов или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более нуклеотидов.

Подходящие последовательности мшРНК могут быть идентифицированы, синтезированы, и измены с помощью любых средств, известных в данной области для проектирования, синтеза и модификации последовательностей миРНК. В конкретных вариантах реализации, мшРНК вводят с помощью системы носителей, такой как нуклеиновая кислотно-липидная частица. В предпочтительном варианте реализации, нуклеиновая кислотно-липидная частица включает: (а) одну или более молекул мшРНК; (б) катионный липид формулы I или его соль; и (с) некатионный липид (например, DPPC, DSPC, DSPE, и/или холестерин). В некоторых случаях, нуклеиновая кислотно-липидная частица может дополнительно содержать сопряженный липид, который предотвращает агрегацию частиц (например, PEG-DAA и/или POZ-DAA).

Дополнительные варианты реализации мшРНК, относящиеся к изобретению, а также методы проектирования и синтеза таких мшРНК, описаны в предварительной заявке США 61/184652, поданной 5 июня 2009 года, описание которой включено в настоящее описание путем ссылки во всей полноте для всех целей.

АиРНК

Как миРНК, асимметричные интерферирующие РНК (аиРНК) может образовывать РНК-индуцированный выключенный комплекс (RISC) и привести к эффективному выключению различных генов в клетках млекопитающих путем опосредования последовательность-специфического расщепления последовательности-мишени между нуклеотидами 10 и 11 по отношению к 5'-конпу антисмысловой цепи (Sun и др., Nat. Biotech., 26: 1379-1382 (2008)). Как правило, молекулы аиРНК содержат короткий РНК дуплекс, имеющий смысловую цепь и антисмысловую цепь, где дуплекс содержит выступы на 3' и 5' концах антисмысловой цепи. АиРНК, как правило, асимметричные, так как смысловая цепь короче на обоих концах по сравнению с комплементарной антисмысловой цепью. В некоторых аспектах, аиРНК молекулы могут быть разработаны, синтезированы и отжигаться в условиях, аналогичных тем, которые используются для молекул миРНК. В качестве не ограничивающего примера, последовательности аиРНК могут быть выбраны и получены с использованием способов, описанных выше для выбора последовательности миРНК.

В другом варианте, аиРНК дуплексы различной длины (например, примерно 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, или 14-17 пар оснований, более типично 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20 пар оснований), могут быть разработаны с выступами на 3' и 5' концах антисмысловой цепи интересующей мРНК-мишени. В некоторых случаях, смысловая цепь молекулы аиРНК составляет примерно 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, или 14-17 нуклеотидов в длину, более типично 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20 нуклеотидов в длину. В некоторых других случаях, антисмысловая цепь молекулы аиРНК составляет примерно 15-60, 15-50, или 15-40 нуклеотидов в длину, более типично примерно 15-30, 15-25, или 19-25 нуклеотидов в длину, и предпочтительно примерно 20-24, 21-22, или 21-23 нуклеотидов в длину.

В некоторых вариантах реализации, 5' антисмысловой выступ содержит один, два, три, четыре, или более нуклеотида-немишени (например, "АА", "UU", "dTdT", и т.д.). В других вариантах, 3' антисмысловой выступ содержит один, два, три, четыре, или более нуклеотида-немишени (например, "АА", "UU", "dTdT", и т.д.). В некоторых аспектах, молекулы аиРНК описанные в настоящем документе, могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов, например, в двухцепочечной (дуплексной) области и/или в антисмысловых выступах. В качестве не ограничивающего примера, последовательности аиРНК могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов, описанных выше для последовательностей миРНК. В предпочтительном варианте молекула включает аиРНК 2'OMe нуклеотидов, таких как, например, 2'ОМе-гуанозиновых нуклеотидов, 2'OMe-уридиновых нуклеотидов или их смесей.

В некоторых вариантах, молекулы аиРНК могут содержать антисмысловую цепь, которая соответствует антисмысловой цепи молекулы миРНК, например, одной из молекул миРНК, описанных в настоящем документе. В конкретных вариантах реализации, аиРНК вводят с помощью системы носителя, такой как нуклеиновая кислотно-липидная частица. В предпочтительном варианте реализации, нуклеиновая кислотно-липидная частица включает: (а) одну или несколько молекул аиРНК; (б) катионный липид формулы I или его соль; и (с) некатионный липид (например, DPPC, DSPC, DSPE, и/или холестерин). В некоторых случаях, нуклеиновая кислотно-липидная частица может дополнительно содержать сопряженный липид, который предотвращает агрегацию частиц (например, PEG-DAA и/или POZ-DAA).

Подходящие последовательности аиРНК могут быть идентифицированы, синтезированы, и изменены с помощью любых средств, известных в данной области для проектирования, синтеза и модификации последовательностей миРНК. Дополнительные варианты реализации, связанные с молекулами аиРНК по изобретению описаны в заявке на патент США №2009/0291131 и РСТ публикации WO 09/127060, описания которых включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

МикроРНК

Как правило, микроРНК (микроРНК) являются одноцепочечными молекулами РНК состоящими из примерно 21-23 нуклеотидов в длину, которые регулируют экспрессию генов. МикроРНК кодируются генами от которых ДНК они транскрибируется, но микроРНК не транслируются в белок (некодирующие РНК); Вместо этого, каждый первичный транскрипт (при-микроРНК) превращается в течение короткую структуру петли на стебле под названием пре-микроРНК и, наконец, в функционально зрелую миРНК. Зрелые молекулы микроРНК являются частично или полностью комплементарными к одной или более РНК (мРНК) молекулам, и их основная функция заключается в подавлении экспрессии генов. Идентификация молекул микроРНК описывается, например, в Lagos-Quintana и др., Science, 294: 853-858; Lau и др., Science, 294: 858-862; and Lee и др., Science, 294: 862-864.

Гены, кодирующие микроРНК являются гораздо более длинными, чем обработанные молекулы зрелой микроРНК. МикроРНК сначала транскрибируется как первичный транскрипт или пер-микроРНК с кэпом и поли-А хвостом и превращается в короткую, ~70-нуклеотидов структуру петли на стебле, известную как пре-микроРНК в ядре клетки. Эта обработка выполняется в животных с помощью белкового комплекса, известного как комплекс Микропроцессор, состоящий из нуклеазы Дроша и двухцепочечного РНК-связывающего белка Паша (Denli и др., Nature, 432: 231-235 (2004)). Эти пре-микроРНК затем превращаются в зрелые микроРНК в цитоплазме путем взаимодействия с эндонуклеазой дайсера, которая также инициирует образование РНК-индуцированного выключения комплекса (RISC) (Bernstein и др., Nature, 409: 363-366 (2001). Обе смысловая цепь или антисмысловая цепь ДНК могут функционировать в качестве шаблонов для увеличения количества микроРНК.

Когда дайсер расщепляет петлю на стебле пре-микроРНК, образовываются две комплементарные молекулы РНК, но только одна интегрируется в комплекс RISC. Это цепь известна как направляющая цепь и выбирается аргонавт белка, каталитически активной РНКазы в комплексе RISC, на основании устойчивости 5'-конца (Preall и др., Curr. Biol., 16: 530-535 (2006)). Остальные цепи, известные как антипроводниковые или сопровождающие цепи разлагаются в качестве субстратного RISC комплекса (Gregory и др., Cell, 123: 631-640 (2005)). После интеграции в активный комплекс RISC, пары микроРНК оснований с комплементарными молекулами мРНК и вызывают деградацию мРНК-мишени и/или выключение трансляции.

Молекулы микроРНК млекопитающих, как правило, комплементарны сайту в 3' UTR последовательности мРНК-мишени. В некоторых случаях, отжиг микроРНК в мРНК-мишени ингибирует трансляцию белка путем блокирования организации трансляции белка. В некоторых других случаях, отжиг микроРНК в микроРНК-мишени облегчает расщепление и деградацию микроРНК-мишени посредством процесса, подобного интерференции РНК (иРНК). МикроРНК могут поражать метилирование геномных участков, которые соответствуют микроРНК-мишеням. Как правило, функция микроРНК в сочетании с комплементарным белков коллективно называют микроRNР.

В некоторых аспектах, молекулы микроРНК, описанные в настоящем документе, имеют примерно 15-100, 15-90, 15-80, 15-75, 15-70, 15-60, 15-50, или 15-40 нуклеотидов в длину, более типично примерно 15-30, 15-25, или 19-25 нуклеотидов в длину, и предпочтительно примерно 20-24, 21-22, или 21-23 нуклеотидов в длину. В некоторых других аспектах, молекулы микроРНК могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов. В качестве не ограничивающего примера, последовательности микроРНК могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов, описанных выше последовательностей миРНК. В предпочтительном варианте молекула миРНК содержит 2'OMe нуклеотиды, такие как, например, 2'OMe-гуанозиновый нуклеотид, 2'OMe-уридиновый нуклеотид или их смеси.

В конкретных вариантах реализации, микроРНК вводят с помощью системы носителей, такой как нуклеиновая кислотно-липидная частица. В предпочтительном варианте реализации, нуклеиновая кислотно-липидная частица включает: (а) одну или более молекул микроРНК; (б) катионный липид формулы I или его соль; и (с) некатионный липид (например, DPPC, DSPC, DSPE, и/или холестерин). В некоторых случаях, нуклеиновая кислотно-липидная частица может дополнительно содержать сопряженный липид, который предотвращает агрегацию частиц (например, PEG-DAA и/или POZ-DAA).

В других вариантах, одним или несколькими агентами, которые блокируют активность в микроРНК-мишенях интересующие мРНК вводят с использованием липидной частицы по изобретению (например, нуклеиновая кислотно-липидная частица, таких как LNP). Примеры блокирующих агентов включают стерические блокирующие олигонуклеотиды, закрытые олигонуклеотиды нуклеиновых кислот и морфолино олигонуклеотиды, но не ограничиваются ими. Такие блокирующие агенты могут связываться непосредственно с микроРНК или с сайтом связывания микроРНК на мРНК-мишени.

Дополнительные варианты реализации, связанные с молекулой микроРНК по изобретению, описаны в заявке на патент США №2009/0291131 и РСТ публикации WO 09/127060, раскрытие которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

Антисмысловые олигонуклеотиды

В одном варианте реализации нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловой олигонуклеотид поражающий ген-мишень или интересующую последовательность. Термины "антисмысловой олигонуклеотид" или "антисмысловой" включают олигонуклеотиды, комплементарные мишени-полинуклеотидной последовательности. Антисмысловые олигонуклеотиды являются одиноцепочечными ДНК или РНК, которые комплементарны к выбранной последовательности. Антисмысловые РНК олигонуклеотиды предотвратить трансляцию комплементарных цепей РНК путем связывания с РНК. Антисмысловые олигонуклеотиды ДНК могут использоваться для поражения специфической, комплементарной (кодирующей или некодирующей) РНК. Если происходит связывание, этот ДНК/РНК гибрид может быть деградирован с помощью фермента РНКазы Н. В конкретном варианте реализации, антисмысловые олигонуклеотиды содержат от примерно 10 до примерно 60 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов. Термин также включает антисмысловые нуклеотиды, которые не могут быть точно комплементарными желаемому гену-мишени. Таким образом, изобретение может быть использовано в тех случаях, когда неспецифическая активности мишеней найдены с антисмысловыми, или там, где антисмысловая последовательность, содержащая одну или несколько несовпадений с последовательностью-мишенью, является наиболее предпочтительным для конкретного использования.

Антисмысловые олигонуклеотиды были продемонстрированы, что они являются эффективным и поражающими ингибиторов синтеза белка, и, следовательно, могут быть использованы для специфического ингибирования синтеза белка гена-мишени. Эффективность антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования синтеза белка хорошо известна. Например, синтез полигалактоуроназы и ацетилхолинового рецептора мускарина типа 2 подавляются антисмысловыми олигонуклеотидами, направленными на их соответствующие последовательности мРНК (см, патенты США №№5739119 и 5759829). Кроме того, примеры антисмыслового ингибирования были продемонстрированы с ядерным белком циклином, геном множественной лекарственной устойчивости (MDR1), ICAM-1, Е-селекция, STK-1, рецептором стриарного GABAA, и человеческого EGF (см, Jaskulski и др.. Science, 240: 1544-6 (1988); Vasanthakumar и др., Cancer Commun., 1: 225-32 (1989); Peris и др., Brain Res Mol Brain Res., 15;57:310-20 (1998); и патенте США №№5801154; 5789573; 5718709 и 5610288). Кроме того, также были описаны антисмысловые конструкции, которые ингибируют и могут быть использованы для лечения различных патологических клеточных разрастаний, например, рака (см, патенты США №№5747470; 5591317 и 5783683). Раскрытие этих ссылок включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Способы получения антисмысловых олигонуклеотидов известны в данной области и могут быть легко адаптированы для получения антисмысловых олигонуклеотидов, которые поражают любую полинуклеотидную последовательность. Выбор антисмысловой олигонуклеотидной последовательности, специфичной для данной последовательности-мишени, основанный на анализе выбранной последовательности-мишени и определения вторичной структуры, T_m, энергии связывания и относительной стабильности. Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть выбраны на основе их относительной неспособности образовывать димеры, шпильки или другие вторичные структуры, которые позволили бы уменьшить или запрещать специфическое связывание с мРНК-мишенью в клетке-хозяине. Наиболее предпочтительные целевые области мРНК включают те области на или вблизи кодона инициации трансляции AUG и те последовательности, которые существенно комплементарны 5' области мРНК. Анализ этих вторичных структур и выбор сайта-мишени могут быть выполнены, например, с помощью v.4 программного обеспечения для анализа праймер OLIGO (Молекулярные Биологические Инсайты) и/или программное обеспечение алгоритма BLASTN 2.0.5 (Altschul и др., Nucleic Acids Res., 25: 3389-402 (1997)).

Рибозимы

В соответствии с другим вариантом реализации настоящего изобретения, нуклеиновые кислоты, липидные частицы связаны с рибозимами. Рибозимы являются РНК-белковыми комплексами, имеющими конкретные каталитические домены, которые обладают активностью эндонуклеаз (см, Kim и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84: 8788-92 (1987); и Forster и др., Cell, 49: 211-20 (1987)). Например, большое количество рибозимов ускоряют реакцию передачи фосфоэфиров с высокой степенью специфичности, часто расщепление только одного из нескольких фосфоэфиров в олигонуклеотидном субстрате (смотри, Cech и др., Cell, 27: 487-96 (1981); Michel и др., J. Mol. Biol., 216: 585-610 (1990); Reinhold-Hurek и др., Nature, 357: 173-6 (1992)). Эта специфика была приписана к требованию, что субстрат связываются через специфическое взаимодействие по спариванию оснований на внутренний ведущей последовательности ("IGS") рибозима предварительно к протеканию химической реакции.

По меньшей мере, шесть основных сортов в природе ферментативных молекул РНК известны в наше время. Каждая из них может катализировать гидролиз РНК фосфодиэфирных связей in trans (и, следовательно, может расщеплять другие молекулы РНК) в физиологических условиях. В общем, ферментные нуклеиновые кислоты действуют по средством первичного связывания с РНК-мишенью. Такое связывание происходит через мишень-связывающий участок ферментативной нуклеиновой кислоты, которая проходит в непосредственной близости от ферментативной части молекулы, которая действует по средством расщепления РНК-мишени. Таким образом, ферментативная нуклеиновая кислота первой признает, а затем связывает РНК-мишени посредством комплементарного спаривания оснований, и как только связана с правильным сайтом, действует по средством ферментативного расщепления РНК-мишени. Стратегическое расщепление такой РНК-мишени уничтожит ее способность направлять синтез закодированного белка. После того, как ферментативная нуклеиновая кислота связала и расщепила РНК-мишень, она освобождается от этой РНК и ищет другую цель и может неоднократно связывать и расщеплять новые цели.

Ферментативные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть сформированы в молот, шпильку, вируса гепатита δ, интрон группу I или RNазуP РНК (в сочетании с направляющей последовательностью РНК) или Нейроспора против РНК фрагмент, например. Конкретные примеры фрагментов молотка описаны, например, Rossi и др., Nucleic Acids Res., 20: 4559-65 (1992). Примеры фрагментов шпильки описаны, например, в ЕР 0360257, Hamper и др.. Biochemistry, 28:4929-33 (1989); Hamper и др., Nucleic Acids Res., 18: 299-304 (1990); и патенте США №5,631,359. Пример фрагмента вируса гепатита 5 описан, например, в Perrotta и др., Biochemistry, 31: 11843-52 (1992). Пример фрагмента RNазыP описан, например, в Guemer-Takada и др.. Cell, 35: 849-57 (1983). Примеры Нейроспора ВС РНК рибозимного фрагмента описаны в, например, Saville и др., Cell, 61: 685-96 (1990); Saville и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8826-30 (1991); Collins и др., Biochemistry, 32: 2795-9 (1993). Пример группы I интрона описан, например, в патенте США №4987071. Важными характеристиками ферментативных молекул нуклеиновых кислот, используемых в соответствии с настоящим изобретением является то, что они имеют специфический субстратный сайт связывания, комплементарный к одной или более областям гена-мишени ДНК или РНК, и что они имеют нуклеотидные последовательности, в пределах или окружающие сайт субстратного связывания, которые придает РНК расщепляющей активности молекуле. Таким образом, рибозимные конструкции не должны ограничиваться конкретными фрагментами, упомянутыми в данном документе. Раскрытие этих ссылок включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Способы получения рибозимов, поражающих любую полинуклеотидную последовательность известны в данной области. Рибозимы могут быть сконструированы, как описано, например, в публикации РСТ №№ WO 93/23569 и WO 94/02595, и синтезированы, чтобы быть испытанными in vitro и/или in vivo, как описано в нем. Раскрытие этих публикаций РСТ включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Активность рибозимов можно оптимизировать, изменяя длину рибозимовых участков связывания или химическим синтезом рибозимов с изменениями, которые предотвращают их деградацию в сыворотке рибонуклеаз (см, например, в публикации РСТ №№ WO 92/07065, WO 93/15187, WO 91/03162 и WO 94/13688, EP 92110298,4, и в патенте США №5334711, которые описывают различные химические модификации, которые могут быть сделаны с сахарными фрагментами ферментативных молекул РНК, раскрытие которых приведены в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме для всех целей), модификации, которые увеличивают их эффективность в клетках, и удаление стволовых оснований II для сокращения времени синтеза РНК и уменьшения потребности в химических веществах.

Иммуностимулирующие олигонуклиотиды

Нуклеиновые кислоты связанные с липидными частицами по настоящему изобретению, могут быть иммуностимулирующими, в том числе иммуностимулирующими олигонуклеотидами (ISS; одно- или двухцепочечными), способными индуцировать иммунный ответ при введении субъекту, который может быть, например, млекопитающее, такое как человек. ISS, включают, например, определенные палиндромы, ведущие к образованию шпильки вторичных структур (смотри, Yamamoto и др., J. Immunol., 148: 4072-6 (1992)), или CpG фрагменты, а также другие известные особенности ISS (такие как мульти-G домены, см; РСТ публикации WO 96/11266, раскрытие которого включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей).

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, как полагают, являются неспецифичные последовательность, когда не требуется, чтобы они специфически связывались с и снижали экспрессию последовательности-мишени, чтобы спровоцировать иммунную реакцию. Таким образом, определенные Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут содержать последовательности, соответствующие области с природным геном или мРНК, но они все же могут быть рассмотрены как неспецифические последовательности иммуностимулирующих нуклеиновых кислот.

В одном варианте реализации иммуностимулирующая нуклеиновая кислота или олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, один динуклеотид CpG. Олигонуклеотид или CpG динуклеотид может быть неметилированным или метилированным. В другом варианте реализации иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, один динуклеотид CpG, имеющий метилированный цитозин. В одном варианте реализации нуклеиновая кислота содержит один динуклеотид CpG, в котором цитозин в динуклеотиде CpG метилирован. В альтернативном варианте реализации нуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, два динуклеотида CpG, в котором, по меньшей мере, один цитозин в динуклеотиде CpG метилирован. В дополнительном варианте реализации каждый цитозин в динуклеотиде CpG, присутствующий в последовательности метилирован. В другом варианте реализации нуклеиновая кислота содержит множество CpG динуклеотидов, в котором по меньшей мере один из динуклеотидов CpG содержит метилированный цитозин. Примеры иммуностимулирующих олигонуклеотидов, пригодных для использования в композициях и способах по настоящему изобретению, описаны в публикации РСТ WO №№ 02/069369, WO 01/15726 и WO 09/086558; в патенте США №6406705; и в Raney и др., J. Pharm. Exper. Ther., 298: 1185-92 (2001), содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей. В некоторых вариантах реализации, олигонуклеотиды, используемые в композициях и способах по данному изобретению имеют фосфодиэфирную ("РО") основу или фосфортиоатную ("PS") основу, и/или по меньшей мере один метилированный цитозиновый остаток в фрагменте CpG.

Другие активные агенты

В некоторых вариантах реализации активный агент, связанный с липидными частицами согласно изобретению может содержать один или более терапевтических белков, полипептидов или малых органических молекул или соединений. Не ограничивающие примеры таких терапевтических эффективных агентов или лекарств охватывают онкологические препараты (например, химиотерапевтические препараты, гормональные терапевтические агенты, иммунотерапевтические агенты, рентгенотерапевтические агенты и т.д.), гиполипидемические средства, противовирусные препараты, противовоспалительные соединения, антидепрессанты, стимуляторы, анальгетики, антибиотики, противозачаточные препараты, жаропонижающие средства, сосудорасширяющие средства, анти-ангиогены, цитоваскулярные агенты, ингибиторы сигнальной трансдукции, сердечнососудистые препараты, такие как антиаритмические агенты, гормоны, сосудосуживающие и стероиды. Эти активные вещества могут быть введены отдельно в липидную частицу по настоящему изобретению, или в комбинации (например, совместно вводимый) с липидными частицами согласно изобретению, включающими нуклеиновую кислоту, такую как интерферирующая РНК.

Не ограничивающие примеры химиотерапевтических препаратов охватывают препараты на основе платины (например, оксалиплатин, цисплатин, карбоплатин, спироплатин, ипроплатин, сатраплатин и т.д.), алкилирующие агенты (например, циклофосфамид, ифосфамид, хлорамбуцил, бусульфан, мелфалан, мехлорэтамин, урамустин, тиотепа, нитрозомочевины, и т.д.), антиметаболиты (например, 5-фторурацил (5-ФУ), азатиоприн, метотрексат, лейковорин, капецитабин, цитарабин, флоксуридин, флударабин, гемцитабин, пеметрексед, ралтитрексед, и т.д.), растительные алкалоиды (например, винкристин, винбластин, винорелбин, виндезин, подофиллотоксин, паклитаксел (таксол), доцетаксел, и т.д.), ингибиторы топоизомеразы (например, иринотекан (СРТ-11; Камптосар), топотекан, амсакрин, этопозид (VP16), этопозид фосфат, тенипозид, и т.д.), противоопухолевые антибиотики (например, доксорубицин, адриамицин, даунорубицин, эпирубицин, актиномицин, блеомицин, митомицин, митоксантрон, пликамицин и т.д.), тирозин киназы (например, гефитиниб (Иресса^®), сунитиниба (Сутент^®; SU11248), эрлотиниб (Тарцева^®; OSI-1774), лапатиниб (GW572016; GW2016), канертиниб (CI 1033), семаксиниб (SU5416), ваталаниб (РТК787 / ZK222584), сорафениб (BAY 43-9006), иматиниб (Глиивец^®; STI571), дазатиниб (BMS-354825), лефлуномид (SU101), Вандетамиб (Зактима™; ZD6474), и т.д.), их фармацевтически приемлемые соли, их стереоизомеры, их производные, их аналоги, а также их комбинации.

Примеры традиционных гормональных терапевтических агентов включают, без ограничения, стероиды (например, дексаметазон), финастерид, ингибиторы ароматазы, тамоксифен, и гозерелина, а также другие агонисты гонадотропин-высвобождающего гормона (GnRH).

Примеры традиционных иммунотерапевтических агентов охватывают иммуностимуляторы (например. Bacillus Calmette-Guerin (БЦЖ), левамизол, интерлейкин-2, альфа-интерферон и т.д.), моноклональные антитела (например, анти-CD20, анти-HER2, анти-CD52, анти-HLA-DR, и анти-VEGF моноклональные антитела), иммунотоксины (например, анти-CD33 моноклональное антитело, конъюгат-калихеамицин, анти-CD22 моноклональное антитело-экзотоксин Pseudomonas конъюгат, и т.д.), и радиоиммунотерапия (например, анти-CD20 моноклональное антитело, конъюгированное с ¹¹¹In, ⁹⁰Y, или ¹³¹I, и т.д.), но не ограничиваясь ими).

Примеры традиционных радиотерапевтических агентов охватывают радионуклиды, такие как ⁴⁷Sc, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁸⁹Sr, ⁸⁶Y, ⁸⁷Y, ⁹⁰Y, ¹⁰⁵Rh, ¹¹¹Ag, ¹¹¹In, ^117mSn, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹¹At, и ²¹²Bi, возможно, конъюгированные с антителами, направленными против опухолевых антигенов, но не ограничиваются ими.

Дополнительные онкологические препараты, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, охватывают алкеран, аллопуринол, альтретамин, амифостин, анастрозол, AraC, триоксид мышьяка, бексаротен, биCNU, кармустин, CCNU, целекоксиб, кладрибин, циклоспорин, цитозинарабинозид, цитоксан, дексразоксан, DTIC, эстрамустин, эксеместан, FK-506, гемтузумаб-озогамицин, гедреа, гидроксиуреа, идарубицин, интерферон, летрозол, леустатин, леупролид, литретиноин, мегастрол, L-РАМ, месна, метокссален, митрамицин, азот горчицы, памидронат, пегадемаз, пентостатин, натрий порфимер, преднизолон, ритуксан, стрептозоцин, STI-571, таксотером, темозоламид, VM-26, торемифен, третиноин, ATRA, валрубицин, и велбан, но не ограничиваются ими. Другие примеры онкологических препаратов, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением являются эллиптицином и аналогами или производными эллиптицина, эпотилоном, внутриклеточными ингибиторами киназ, и камптотецином.

Неограничивающие примеры гиполипидемических агентов для лечения липидного заболевания или расстройства, связанного с повышенными триглицеридами, холестерином, и/или глюкозой, охватывают статины, фибраты, эзетимибы, тиазолидиндионы, ниацины, бета-блокаторы, нитроглицерины, антагонисты кальция, рыбий жир и их смеси.

Примеры противовирусных препаратов охватывают, но не ограничиваются, абакавир, ацикловир, ацикловир, адефовир, амантадин, ампренавир, арбидол, атазанавир, атрипла, сидофовир, комбивир, дарунавир, делавирдин, диданозин, дококанол, эдоксудин, эфавиренц, эмтрицитабин, энфувиртид, энтекавир, ингибиторы введения, фамцикловир, фиксированные дозы комбинированных препаратов, фомивирсен, фосампренавир, фоскарнет, фосфонет, ингибиторы слияния, ганцикловир, ибацитабин, имуновир, идоксуридин, имиквимод, индинавир, инозин, ингибиторы интегразы, интерферон тип III (например, IFN-λ молекулы, такие как IFN-λ1, IFN-λ2, и IFN-λ3), интерферон тип II (например, IFN-γ), интерферон тип I (например, IFN-α такой, как PEGлированный IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω, и IFN-ζ), интерферон, ламивудин, лопинавир, ловирид, МК-0518, маравирок, мороксидин, нелфинавир, невирапин, нексавир, аналоги нуклеозида, осельтамивир, пенпикловир, перамивир, плеконарил, подофиллотоксин, ингибиторы протеазы, ингибиторы обратной транскриптазы, рибавирин, римантадин, ритонавир, саквинавир, ставудин, синергетические усилители, тенофовир, дизопроксилфумарат, типранавир, трифлуридин, тризивир, тромантадин, трувада, валацикловир, валганцикловир, викривирок, видарабин, вирамидин, зальцитабин, занамивир, зидовудин, его фармацевтически приемлемые соли, их стереоизомеры, их производные, их аналоги и их смеси.

Липидные частицы

В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает липидные частицы, содержащие один или более из катионных (амино) липидов или их солей, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, липидные частицы по настоящему изобретению дополнительно содержат один или более некатионных липидов. В других вариантах реализации липидные частицы дополнительно содержат один или более конъюгированных липидов, способных снижать или ингибировать агрегацию частиц. В дополнительных вариантах реализации липидные частицы дополнительно содержат один или более активных агентов или терапевтических агентов, таких как терапевтические нуклеиновые кислоты (например, интерферирующие РНК, такие как миРНК).

Липидные частицы включают в себя липидные пузырьки, такие как липосомы, но не ограничиваются ими. Как используется в настоящем документе, липидные пузырьки включают структуру, содержащую липидные мембраны, ограждающие от водной среды. В конкретных вариантах реализации, липидные пузырьки, содержащие один или более из катионных липидов, описанных в данном документе, используются для инкапсуляции нуклеиновых кислот в пределах липидных везикул. В других вариантах реализации, липидные пузырьки, содержащие один или более из катионных липидов, описанных в данном документе, в комплексе с нуклеиновыми кислотами с образовывают липоплексы.

Липидные частицы по настоящему изобретению обычно содержат активное вещество или терапевтический агент, катионный липид, некатионный липид и сопряженный липид, который ингибирует агрегацию частиц. В некоторых вариантах реализации активное вещество или терапевтический агент полностью инкапсулируются в липидной части липидной частицы таким образом, что активный агент или терапевтическое средство в липидной частице устойчиво в водном растворе к ферментативному разложению, например, нуклеазой или протеазой. В других вариантах реализации липидные частицы, описанные в настоящем документе, являются, по существу нетоксичными для млекопитающих, таких как люди. Липидные частицы по настоящему изобретению обычно имеют средний диаметр от примерно 30 нм до примерно 150 нм, от примерно 40 нм до примерно 150 нм, от примерно 50 нм до примерно 150 нм, от примерно 60 нм до примерно 130 нм, от примерно 70 нм до примерно 110 нм, или от примерно 70 до примерно 90 нм. Липидные частицы по изобретению также обычно имеют соотношение липид: терапевтический агент (например, липид: нуклеиновая кислота) (масс./масс. соотношение) от примерно 1:1 до 100:1, от примерно 1:1 до примерно 50:1, примерно от 2:1 до 25:1, от примерно 3:1 до 20:1, от примерно 5:1 до 15:1, или примерно от 5:1 до примерно 10:1.

В предпочтительных вариантах реализации, липидные частицы по настоящему изобретению являются сыворотко-стабильными нуклеиновыми кислотно-липидными частицами (LNP), которые содержат интерферирующие РНК (например, миРНК, дайсер-субстратную дсРНК, мшРНК, аиРНК, и/или микроРНК), катионный липид (например, один или более катионный липид формулы I или их солей, изложенными в данном документе), некатионный липид (например, смеси одного или более фосфолипидов и холестерина), и конъюгированный липид, который ингибирует агрегацию частицы (например, один или более PEG-липидные и/или POZ-липидные конъюгаты). LNP может содержать, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более немодифицированных и/или модифицированных молекул интерферирующих РНК. Нуклеиновые кислотно-липидных частицы и способ их получения описаны, например, в патентах США №№5753613; 5785992; 5705385; 5976567; 5981501; 6110745; и 6320017 и публикации РСТ номер WO 96/40964, описания которых каждый включен сюда путем ссылки в полном объеме для всех целей.

В нуклеиновых кислотно-липидных частицах по настоящему изобретению, нуклеиновая кислота может быть полностью инкапсулирована в липидную часть частицы, тем самым защищая нуклеиновую кислоту от деградации нуклеазой. В предпочтительных вариантах реализации LNP, содержащего нуклеиновую кислоту, такую как интерферирующие РНК, полностью инкапсулирована в липидной части частицы, тем самым защищая нуклеиновую кислоту от деградации нуклеазой. В некоторых случаях, нуклеиновая кислота в LNP по существу не деградирует после воздействия на частицу нуклеазы при 37°C в течение по меньшей мере примерно 20, 30, 45 или 60 минут. В некоторых других случаях, нуклеиновая кислота в LNP по существу не деградирует после инкубации частицы в сыворотке при 37°C в течение по меньшей мере примерно 30, 45 или 60 минут или по меньшей мере примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 или 36 часов. В других вариантах реализации нуклеиновая кислота образует комплекс с липидной частью частицы. Одним из преимуществ композиций по настоящему изобретению является то, что нуклеиновые кислотно-липидные частицы, по существу, не токсичны для млекопитающих, таких как люди.

Термин «полностью инкапсулирована" указывает на то, что нуклеиновая кислота в нуклеиновой кислотно-липидной частице существенно не деградирует после анализа контакта с сывороткой или нуклеазой, что существенно деградирует свободные ДНК или РНК. В полностью инкапсулированные системы, предпочтительно менее чем примерно 25% от нуклеиновой кислоты в частице деградирует в лечении, что, как правило, деградирует 100% свободной нуклеиновой кислоты, более предпочтительно менее чем примерно 10%, и наиболее предпочтительно менее чем примерно 5% от нуклеиновой кислоты в частице деградируется. "Герметичное" также указывает на то, что нуклеиновые кислотно-липидные частицы в сыворотке крови являются стабильными, то есть, что они не быстро разлагаются на составные части при введении in vivo.

В контексте нуклеиновых кислот, полная инкапсуляция может быть определена выполнения анализа непроницаемости мембраны для флуоресцентного красителя, который использует краситель, который имеет повышенную флуоресценцию при связывании с нуклеиновой кислотой. Конкретные красители, такие как Олизеленый^® и Рибозеленый^® (Корпорация Инвитроген; Карлсбад, Калифорния) доступны для количественного определения ДНК плазмид, одноцепочечных дезоксирибонуклеотидов, и/или одно- или двухцепочечных рибонуклеотидов. Инкапсуляция определяется путем добавления красителя в липосомную композицию, измерения флуоресценции, и сравнения ее с наблюдаемой флуоресценцией при добавлении небольшого количества неионогенного детергента. Детергент-опосредованное нарушение липосомального бислоя освобождает инкапсулированную нуклеиновую кислоту, что позволяет ему взаимодействовать с мембраной, непроницаемой для краски. Инкапсуляция нуклеиновой кислоты может быть рассчитана как E=(I_o-I)/I_о, где I и I_о относятся к интенсивности флуоресценции до и после добавления детергента (см. Wheeler и др., Gene Ther., 6: 271-281 (1999)).

В других вариантах реализации настоящее изобретение относится к композиции нуклеиновой кислотно-липидной частицы (например, LNP), содержащей множество нуклеиновых кислотно-липидный частиц.

В некоторых случаях, LNP композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, полностью инкапсулирована в липидную часть частиц, таких, что от примерно 30% до примерно 100%, от примерно 40% до примерно 100%, от примерно 50% до примерно 100%, от примерно 60% до примерно 100%, от примерно 70% до примерно 100%, от примерно 80% до примерно 100%, от примерно 90% до примерно 100%, от примерно 30% до примерно 95%, от примерно 40% до примерно 95%, от примерно 50% до примерно 95%, от примерно 60% до примерно 95%, от примерно 70% до примерно 95%, от примерно 80% до примерно 95%, примерно от 85% до примерно 95%, от примерно 90% до примерно 95%, от примерно 30% до примерно 90%, от примерно 40% до примерно 90%, от примерно 50% до примерно 90%, от примерно 60% до примерно 90%, от примерно 70% до примерно 90%, от примерно 80% до примерно 90%, или по меньшей мере примерно 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (или любой их фракции или их диапазона) частиц имеют нуклеиновую кислоту, заключенные внутри них.

В других случаях, LNP композиция содержит нуклеиновую кислоту, полностью инкапсулированную в липидную часть частиц, такую, что от примерно 30% до примерно 100%, от примерно 40% до примерно 100%, от примерно 50% до примерно 100%, от примерно 60% до примерно 100%, от примерно 70% до примерно 100%, от примерно 80% до примерно 100%, от примерно 90% до примерно 100%, от примерно 30% до примерно 95%, от примерно 40% до примерно 95%, от примерно 50% до примерно 95%, от примерно 60% до примерно 95%, от примерно 70% до примерно 95%, от примерно 80% до примерно 95%, примерно от 85% до примерно 95%, от примерно 90% до примерно 95%, от примерно 30% до примерно 90%, от примерно 40% до примерно 90%, от примерно 50% до примерно 90%, от примерно 60% до примерно 90%, от примерно 70% до примерно 90%, от примерно 80% до примерно 90%, или по меньшей мере примерно 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (или любой их фракции или их диапазона) вносимой нуклеиновой кислоты инкапсулируется в частицах.

В зависимости от предполагаемого использования липидных частиц по настоящему изобретению, пропорции компонентов можно варьировать, и эффективность доставки конкретной композиции может быть измерена с помощью, например, анализа параметра эндосомального высвобождения (ERP).

В конкретных вариантах реализации настоящее изобретение относится к композиции липидной частицы (например, LNP), включающей в себя множество липидных частиц, описанных в настоящем документе и антиоксиданты. В некоторых случаях, антиоксиданты в составе липидных частиц уменьшают, предотвращают и/или ингибируют деградацию катионного липида, присутствующего в липидной частице. В случаях, отличающийся тем, что активный агент представляет собой терапевтическую нуклеиновую кислоту, такую как интерферирующие РНК (например, миРНК), антиоксидант в липидной частице композиции уменьшает, предотвращает и/или ингибирует деградацию полезной нагрузки нуклеиновой кислоты, например, за счет сокращения, предотвращения и/или ингибирования образования аддуктов между нуклеиновой кислотой и катионным липидом. Неограничивающие примеры антиоксидантов включают гидрофильные антиоксиданты, такие как хелатнрующие агенты (например, хелаты металлов, такие как этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), цитрат и т.п.), липофильные антиоксиданты (например, изомеры витамина Е, полифенолы, и тому подобное), их соли; и их смеси. Если необходимо, антиоксидант, как правило, присутствует в количестве, достаточном, чтобы предотвратить, ингибирование и/или уменьшить деградацию катионного липида и/или настоящего активного агента в частице, например, по меньшей мере, примерно 20 мМ EDTA, или ее соль, или, по меньшей мере, примерно 100 мМ цитрата, или его соли. Антиоксидант, такой как EDTA и/или цитрат может быть включен на любой стадии или в несколько этапов в процессе формирования частиц липидов, описанных в разделе VI (например, до, во время и/или после формирования липидной частицы).

Дополнительные варианты реализации, связанные с методами предотвращения деградации катионных липидов и/или активных агентов (например, терапевтических нуклеиновых кислот) присутствуют в липидных частицах, композициях, содержащих липидные частицы, стабилизированные с помощью этих способов, способов получения этих частиц липидов и способов доставки и/или введении этих липидных частиц описаны в международной заявке на патент РСТ/СА2010/001919, озаглавленной "SNALP композиции содержащие антиоксиданты", поданной 1 декабря 2010 года, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме в течение все цели.

Катионные липиды

Любой из новых катионных липидов формулы I или его соли, изложенные в настоящем документе, могут быть использованы в липидных частицах по настоящему изобретению (например, LNP), по отдельности или в комбинации с одним или несколькими другими видами катионных липидов или видами некатионных липидов.

Другие катионные липиды или их соли, которые также могут быть включены в липидные частицы по настоящему изобретению, включают, 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLenDMA), 1,2-ди-γ-линоленилокси-N,N-диметиламинопропан (γ-DLenDMA), 1,2-дилинолеилокси-(N,N-диметил)-бутил-4-амин (C2-DLinDMA), 1,2-дилинолеилокси-(N,N-диметил)-бутил-4-амин (C2-DLinDAP), 2,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксалан (DLin-K-C2-DMA; также известные как "ХТС2" или "C2K"), 2,2-дилинолеил-4-(3-диметиламинопропил)-[1,3]-диоксалан (DLin-K-C3-DMA; "C3K"), 2,2-дилинолеил-4-(4-диметиламинобутил)-[1,3]-диоксалан (DLin-K-C4-DMA; "C4K"), 2,2-дилинолеил-5-диметиламинометил-[1,3]-диоксан (DLin-K6-DMA), 2,2-дилинолеил-4-N-метилпепиазин-[1,3]-диоксалан (DLin-K-MPZ), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксалан (DLin-K-DMA), 2,2-диолеоил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксалан (DO-K-DMA), 2,2-дистеароил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксалан (DS-K-DMA), 2,2-дилинолеил-4-N-морфолино-[1,3]-диоксалан (DLin-K-MA), 2,2-Дилинолеил-4-триметиламино-[1,3]-диоксалан хлориде (DLin-K-TMA.Cl), 2,2-дилинолеил-4,5-бис(диметиламинометил)-[1,3]-диоксалан (DLin-K²-DMA), 2,2-дилинолеил-4-метилпепиазин-[1,3]-диоксалан (D-Lin-K-N-метилпепиазин), (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил 4-(диметиламино) бутаноат (DLin-M-C3-DMA; "МС3"), дилинолеилметил-3-диметиламинопропионат (DLin-M-C2-DMA; также известные как DLin-M-K-DMA или DLin-M-DMA), 1,2-диоеилкарбамоилокси-3-диметиламинопропан (DO-C-DAP), 1,2-димиристолеоил-3-диметиламинопропан (DMDAP), 1,2-диолеоил-3-триметиламинопропан хлорид (DOTAP.Cl), 1,2-дилинолеилкарбамоилокси-3-диметиламинопропан (DLin-C-DAP), 1,2-дилинолеиокси-3-(диметиламино)ацетоксипропан (DLin-DAC), 1,2-дилинолеиокси-3-морфолинопропан (DLin-MA), 1,2-дилинолеил-3-диметиламинопропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилтио-3-диметиламинопропан (DLin-S-DMA), 1-линолеоил-2-линолеоилоксу-3-диметиламинопропан (DLin-2-DMAP), 1,2-дилинолеилокси-3-триметиламинопропан хлоридная соль (DLin-TMA.Cl), 1,2-дилинолеоил-3-триметиламинопропан хлоридная соль (DLin-TAP.Cl), 1,2-дилинолеилокси-3-(N-метилпиперазино)пропан (DLin-MPZ), 3-(N,N-дилинолеиламино)-1,2-пропандиол (DLinAP), 3-(N,N-диолеиламино)-1,2-пропандио (DOAP), 1,2-дилинолеилоксо-3-(2-N,N-диметиламино)этоксипропан (DLin-EG-DMA), 3-диметиламино-2-(холест-5-ен-3-бэта-оксибутан-4-окси)-1-(цис,цис-9,12-октадиенокси)пропан (CLinDMA), 2-[5'-(холест-5-ен-3-бэта-окси)-3'-оксапентокси)-3-димети-1-(цис,цис-9',1-2'-октадекадиенокси)пропан (CpLinDMA), N,N-диметил-3,4-диолеилоксбензиламин (DMOBA), 1,2-N,N'-диолеилкарбамил-3-диметиламинопропан (DOкарбDAP), 1,2-N,N'-дилинолеилкарбамил-3-диметиламинопропан (DLinкарбDAP), N,N-диолеил-N,N-диметиламмоний хлорид (DODAC), 1,2-диолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DODMA), 1,2-дистеарилокси-N,N-диметиламинопропан (DSDMA), N-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмоний хлорид (DOTMA), N,N-диастерил-N,N-диметиламмоний бромид (DDAB), N-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмоний хлорид (DOTAP), 3-(N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карбамоил)холестерол (DC-Хол), N-(1,2-димиристилоксипроп-3-ил)-N,N-диметил-N-гидроксиэтил аммоний бромид (DMRIE), 2,3-диолеилокси-N-[2(спемин-карбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанаммониуйтрифлюороацетат (DOSPA), диоктадециламидоглицил спермин (DOGS), их аналоги, и их смеси, но не ограничиваются ими.

Дополнительные катионные липиды или их соли, которые могут присутствовать в липидных частицах, описанных в настоящем документе, включают в себя новые катионные липиды, такие как CP-LenMC3, CP-γ-LenMC3, CP-MC3, CP-DLen-C2K-DMA, CP-γDLen-C2K-DMA, CP-C2K-DMA, CP-DODMA, CP-DPetroDMA, CP-DLinDMA, CP-DLenDMA, CP-γDLenDMA, их аналоги, а также их комбинации. Дополнительные катионные липиды или их соли, которые могут присутствовать в липидных частицах, описанных в настоящем документе, включают МС3 аналоги, такие как LenMC3, γ-LenMC3, МС3МС, МС2С, МС2МС, МС3 тиоэфир, МС3 эфир, МС4 эфир, МС3 алкин, МС3 амид, Пан-МС3, Пан-МС4, Пан-МС5, а также их комбинации. Дополнительные катионные липиды или их соли, которые могут присутствовать в липидных частицах, описанных в настоящем документе, включают новые катионные липиды, описанные в международной заявке на патент РСТ/СА2010/001029, озаглавленной "Улучшенные катионные липиды и методы для доставки нуклеиновых кислот", поданной 30 июня 2010 г. Дополнительные катионные липиды или их соли, которые могут присутствовать в липидных частицах, описанных в настоящем документе, включают катионные липиды, описанные в заявке на патент США №2009/0023673. Раскрытие каждого из этих патентных документов включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

В некоторых вариантах реализации дополнительный катионный липид образует соль (предпочтительно кристаллическую соль) с одним или более анионом. В одном конкретном варианте реализации дополнительный катионный липид является оксалатовой (например, гемиоксалат) солью, который предпочтительно представляет собой кристаллическую соль.

Синтез катионных липидов, таких как DLinDMA и DLenDMA, а также дополнительных катионных липидов описан в заявке на патент США №2006/0083780, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Синтез катионных липидов, таких как γ-DLenDMA, C2-DLinDMA и C2-DLinDAP, a также дополнительных катионных липидов описаны в международной заявке на патент РСТ/СА2010/001029, озаглавленной "Улучшенные катионные липиды и методы для доставки нуклеиновых кислот", поданной 30 июня 2010 года, описание которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Синтез катионных липидов, таких как DLIN-K-DMA, а также дополнительных катионных липидов описан в РСТ публикации WO 09/086558, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Синтез катионных липидов, таких как DLin-K-C2-DMA, DLin-K-C3-DMA, DLin-K-C4-DMA, DLin-K6-DMA, DLin-K-MPZ, DO-K-DMA, DS-K-DMA, DLin-K-MA, DLin-K-TMA.Cl, DLin-K²-DMA, D-Lin-K-N-метилпинерзин, DLin-M-C2-DMA, DO-C-DAP, DMDAP, и DOTAP.Cl, а также дополнительных катионных липидов описан в публикации РСТ WO 2010/042877, под названием "Улучшенные аминолипиды и методы для доставки нуклеиновых кислот», поданной 9 октября 2009 года, раскрытие который включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Синтез DLin-M-C3-DMA, а также дополнительных катионных липидов, описан например, в предварительной заявке США 61/384050, поданной 17 сентября 2010 года, озаглавленной "Новые катионные липиды и методы их применения", раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Синтез катионных липидов, таких как DLin-C-DAP, DLinDAC, DLinMA, DLinDAP, DLin-S-DMA, DLin-2-DMAP, DLinTMA.C1, DLinTAP.C1, DLinMPZ, DLinAP, DOAP, и DLin-EG-DMA, а также дополнительных катионных липидов описаны в РСТ публикации WO 09/086558, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Синтез катионных липидов, таких как CLinDMA, а также дополнительных катионных липидов описаны в заявке на патент США №2006/0240554, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Синтез ряда других катионных липидов и родственных аналогов были описаны в патентах США №5208036; 5264618; 5279833; 5283185; 5753613 и 5785992; и публикации РСТ № WO 96/10390, описания каждого включено в настоящий документ путем ссылки в полном объеме для всех целей. Кроме того, ряд коммерческих препаратов катионных липидов могут быть использованы, такие как, например LIPOFECTIN^® (в том числе DOTMA и DOPE, доступный от GIBCO/BRL); LIPOFECTAMINE^® (в том числе DOSPA и DOPE, доступный от GIBCO/BRL); и TRANSFECTAM^® (в том числе DOGS, доступный от Promega Corp.).

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения катионный липид содержит от примерно 50 моль % до примерно 90 моль %, от примерно 50 моль % до примерно 85 моль %, от примерно 50 моль % до примерно 80 моль %, от примерно 50 моль %, чтобы примерно 75 моль %, от примерно 50 моль % до примерно 70 моль %, от примерно 50 моль % до примерно 65 моль %, от примерно 50 моль % до примерно 60 моль %, от примерно 55 моль % до примерно 65 моль %, или от примерно 55 моль % до примерно 70 моль % (или любой их фракции или их диапазона) от общего числа липидов, присутствующих в частице. В конкретных вариантах реализации катионный липид содержит примерно 50 моль %, 51 моль %, 52 моль %, 53 моль %, 54 моль %, 55 моль %, 56 моль %, 57 моль %, 58 моль %, 59 моль %, 60 моль %, 61 моль %, 62 моль %, 63 моль %, 64 моль % или 65 моль % (или любой их фракции) от общего числа липидов, присутствующих в частице.

В других вариантах реализации катионный липид содержит от примерно 2 моль % до примерно 60 моль %, от примерно 5 моль % до примерно 50 моль %, от примерно 10 моль % до примерно 50 моль %, от примерно 20 моль %, чтобы примерно 50 моль %, от примерно 20 моль % до примерно 40 моль %, от примерно 30 моль % до примерно 40 моль %, или примерно 40 моль % (или любой их фракции или их диапазона) от общего числа липидов, присутствующих в частице.

Дополнительные проценты и диапазоны катионных липидов, пригодных для использования в липидных частицах по настоящему изобретению, описаны, например, в РСТ публикации WO 09/127060, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме в течение всех целей.

Следует понимать, что процент катионного липида, присутствующего в липидных частицах, по настоящему изобретению, представляют собой количество мишеней, и что фактическое количество катионного липида, присутствующего в композиции, может варьировать, например, в пределах ±5 моль %. Например, в 1:57 препарате липидной частицы (например, LNP), количество мишеней катионного липида составляет 57,1 моль %, но фактическое количество катионного липида может быть ±5 моль %, ±4 моль %, ±3 моль %, ±2 моль %, ±1 моль %, ±0,75 моль %, ±0,5 моль %, ±0,25 моль % или ±0,1 моль % этого количества мишеней, причем остаток препарата составлен из других липидных компонентов (добавленных до 100 моль % общих липидов, присутствующих в частице).

Некатионные липиды

Некатионные липиды, используемые в липидных частицах по настоящему изобретению (например, LNP) могут быть любыми из множества нейтральных незаряженных, цвиттер-ионных или анионных липидов, способных образовывать стабильный комплекс.

Неограничивающие примеры не катионных липидов включают фосфолипиды, такие как лецитин, лизолецитин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, лизофосфотидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, сфингомиелин, яичный сфингомиелин (ESM), цефалин, кардиолипин, фосфатидную кислоту, цереброзид, дицетилфосфат, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфотидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфотидилглицерол (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерол (DPPG), диолеоилфосфотидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоил-фосфатидилхолин (РОРС), palmitoyloleoyl-фосфатидилэтаноламина (POPE), пальмитоилолеоил-фосфатидилглицерин (POPG), диолеоилфосфотидилэтаноламин 4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (DOPE-MAL), дипальмитоил-фосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоил-фосфатидилэтаноламин (DMPE), дистеароил-фосфатидилэтаноламин (DSPE), монометиловый-фосфатидилэтаноламин, диметил-фосфатидилэтаноламин, диелаидоил-фосфатидилэтаноламин (DEPE), стеароилолеоил-фосфатидилэтаноламин (SOPE), лизофосфатидилхолин, дилинолеоилфосфотидилхолин и их смеси. Другие диацилфосфотидилхолин и диацилфосфотидилэтаноламин фосфолипиды также могут быть использованы. В ацильных группах в этих липидах, предпочтительно ацильные группы, производные жирных кислот, имеющих C₁₀-C₂₄ углеродных цепей, например, лаурил, миристоил, пальмитоил, стеароил или олеоил.

Дополнительные примеры некатионных липидов включают стерины, такие как холестерин и его производные. Неограничивающие примеры производных холестерина включают полярные аналоги, такие как 5α-холестанол, 5β-копростанол, холестерил-(2'-гидрокси) этил эфир, холестерил-(4'-гидрокси) бутил эфир, и 6-кетохолестанол; неполярные аналоги, такие как 5α-холестан, холестенон, 5α-холестанон, 5β-холестанон и холестерил деканоат; и их смеси. В предпочтительных вариантах реализации производное холестерина представляет собой полярный аналог, такой как холестерил-(4'-гидрокси) бутил эфир. Синтез холестерил-(2'-гидрокси) этил эфира описан в РСТ публикации WO 09/127060, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

В некоторых вариантах реализации, некатионный липид, присутствующий в липидной частице (например, LNP), содержит или состоит из смеси одного или более фосфолипидов и холестерина или его производного. В других вариантах реализации, некатионный липид, присутствующий в липидной частице (например, LNP), содержит или состоит из одного или более фосфолипидов, например, композиция без холестерина с липидной частицей. В других вариантах реализации, некатионный липид, присутствующий в липидной частице (например, LNP), содержит или состоит из холестерина или его производного, например, препарата без фосфолипида с липидной частицей.

Другие примеры некатионных липидов, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают безфосфорные липиды, такие как, например, стеариламин, додециламин, гексадециламин, ацетил пальмитат, глицеролрицинолеат, гексадецил стеарат, изопропилмиристат, амфотерные акриловые полимеры, триэтаноламин лаурил-сульфат, алкил-арил сульфат, полиэтилоксилатный амид жирных кислот, диоктадецилдиметил бромид, керамиды, сфингомиелина, и тому подобное.

В некоторых вариантах реализации, некатионный липид содержит от примерно 10 моль % до примерно 60 моль %, от примерно 20 моль % до примерно 55 моль %, от примерно 20 моль % до примерно 45 моль %, от примерно 20 моль % до примерно 40 моль %, от примерно 25 моль % до примерно 50 моль %, от примерно 25 моль % до примерно 45 моль %, от примерно 30 моль % до примерно 50 моль %, от примерно 30 моль % до примерно 45 моль %, от примерно 30 моль % до примерно 40 моль %, от примерно 35 моль % до примерно 45 моль %, от примерно 37 моль % до примерно 42 моль %, или примерно 35 моль %, 36 моль %, 37 моль %, 38 моль %, 39 моль %, 40 моль %, 41 моль %, 42 моль %, 43 моль %, 44 моль % или 45 моль % (или любой их фракции или их диапазона) от общего числа липидов, присутствующих в частице.

В вариантах реализации, где липидные частицы содержат смесь фосфолипидов и холестерина или производные холестерина, смесь может содержать вплоть до примерно 40 моль %, 45 моль %, 50 моль %, 55 моль % или 60 моль % от общего числа липидов, присутствующих в частице.

В некоторых вариантах реализации, фосфолипидный компонент в смеси может составлять от примерно 2 моль % до примерно 20 моль %, от примерно 2 моль % до примерно 15 моль %, от примерно 2 моль % до примерно 12 моль %, от примерно 4 моль % до примерно 15 моль %, или от примерно 4 моль % до примерно 10 моль % (или любой их фракции или их диапазона) от общего числа липидов, присутствующих в частице. В некоторых предпочтительных вариантах реализации компонент фосфолипида в смеси составляет от примерно 5 моль % до примерно 10 моль %, от примерно 5 моль % до примерно 9 моль %, от примерно 5 моль % до примерно 8 моль %, от примерно 6 моль % до примерно 9 моль %, от примерно 6 моль % до примерно 8 моль % или от примерно 5 моль %, 6 моль %, 7 моль %, 8 моль %, 9 моль %, или 10 моль % (или любой их фракции или их диапазона) от общего числа липидов, присутствующих в частице. В качестве неограничивающего примера, 1:57 липидная композиция частиц, содержащая смесь фосфолипидов и холестерина может содержать фосфолипид, такой как DPPC или DSPC примерно 7 моль % (или любой их фракции), например, в смеси с холестерином или производным холестерина при примерно 34 моль % (или любой их фракции) от общего числа липидов, присутствующих в частице. В другом неограничивающем примере, 7:54 липидная композиция частиц, содержащая смесь фосфолипидов и холестерина может содержать фосфолипид, такой как DPPC или DSPC примерно 7 моль % (или любой их фракции), например, в смеси с холестерином или производным холестерина при примерно 32 моль % (или любой их фракции) от общего числа липидов, присутствующих в частице.

В других вариантах реализации компонент холестерина в смеси может составлять от примерно 25 моль % до примерно 45 моль %, от примерно 25 моль % до примерно 40 моль %, от примерно 30 моль % до примерно 45 моль %, от примерно 30 моль % до примерно 40 моль %, от примерно 27 моль % до примерно 37 моль %, от примерно 25 моль % до примерно 30 моль %, или от примерно 35 моль % до примерно 40 моль % (или любой их фракции или диапазон нем) от общего числа липидов, присутствующих в частице. В некоторых предпочтительных вариантах реализации компонент холестерина в смеси составляет от примерно 25 моль % до примерно 35 моль %, от примерно 27 моль % до примерно 35 моль %, от примерно 29 моль % до примерно 35 моль %, от примерно 30 моль % до примерно 35 моль %, от примерно 30 моль % до примерно 34 моль %, от примерно 31 моль % до примерно 33 моль %, или примерно 30 моль %, 31 моль %, 32 моль %, 33 моль %, 34 моль %, или 35 моль % (или любой их фракции или их диапазона) от общего числа липидов, присутствующих в частице. Как правило, 1:57 липидная композиция частиц, содержащая смесь фосфолипидов и холестерина может содержать холестерин или производное холестерина в примерно 34 моль % (или любой их фракции), например, в смеси с фосфолипидом, таким как DPPC или DSPC при примерно 7 моль % (или любой их фракции) от общего числа липидов, присутствующих в частице. Как правило, 7:54 липидная композиция частиц, содержащая смесь фосфолипидов и холестерина может содержать холестерин или производное холестерина в примерно 32 моль % (или любой их фракции), например, в смеси с фосфолипидом, таким как DPPC или DSPC при примерно 7 моль % (или любой их фракции) от общего числа липида, присутствующих в частице.

В вариантах реализации, где липидные частицы являются безфосфолипидными, холестерин или его производное могут содержать до примерно 25 моль %, 30 моль %, 35 моль %, 40 моль %, 45 моль %, 50 моль %, 55 моль %, или 60 моль % от общего липидов, присутствующих в частице.

В некоторых вариантах реализации, холестерин или его производное фосфолипида в безлипидной частице может составлять от примерно 25 моль % до примерно 45 моль %, от примерно 25 моль % до примерно 40 моль %, от примерно 30 моль %, чтобы примерно 45 моль %, от примерно 30 моль % до примерно 40 моль %, от примерно 31 моль % до примерно 39 моль %, от примерно 32 моль % до примерно 38 моль %, от примерно 33 моль % до примерно 37 моль %, от примерно 35 моль % до примерно 45 моль %, от примерно 30 моль % до примерно 35 моль %, от примерно 35 моль % до примерно 40 моль %, или примерно 30 моль %, 31 моль %, 32 моль %, 33 моль %, 34 моль %, 35 моль %, 36 моль %, 37 моль %, 38 моль %, 39 моль % или 40 моль % (или любой их фракции или их диапазона) от общего числа липидов, присутствующих в частице. В качестве не ограничивающего примера, композиция частиц липидов 1:62 может включать холестерин при примерно 37 моль % (или любой их фракции) от общего числа липидов, присутствующих в частице. В другом неограничивающем примере, композиция частиц липидов 7:58 может включать холестерин при примерно 35 моль % (или любой их фракции) от общего числа липидов, находящихся в частице.

В других вариантах реализации, не-катионный липид содержит от примерно 5 моль % до примерно 90 моль %, от примерно 10 моль % до примерно 85 моль %, от примерно 20 моль % до примерно 80 моль %, примерно 10 моль % (например, только фосфолипид), или примерно 60 моль % (например, фосфолипид и холестерин или его производное) (или любую их фракции или их диапазон) от общего числа липидов, присутствующих в частице.

Дополнительные проценты и диапазоны некатионных липидов, пригодные для использования в липидных частицах по настоящему изобретению, описаны, например, в РСТ публикации WO 09/127060, раскрытие которой включено в настоящее описание в качестве ссылки для всех целей.

Следует понимать, что процент некатионных липидов, присутствующих в липидных частицах по настоящему изобретению, представляет собой количество мишеней, и что фактическое количество присутствующих некатионных липидов в композиции может варьировать, например, на ±5 моль %. Например, в 1:57 препарат липидной частицы (например, LNP), имеет количество мишеней фосфолипида, которое составляет 7,1 моль % и количество мишеней холестерина 34,3 моль %, но фактическое количество фосфолипидов может быть ±2 моль %, ±1,5 моль %, ±1 моль %, ±0,75 моль %, ±0,5 моль %, ±0,25 моль %, или ±0,1 моль % этой суммы мишеней, а фактическое количество холестерина может быть ±3 моль %, ±2 моль %, ±1 моль %, ±0,75 моль %, ±0,5 моль %, ±0,25 моль % или ±0,1 моль% этой суммы мишеней, причем остаток препарата составлен из других липидных компонентов (до добавления 100 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице). Аналогичным образом, в 7:54 препарате липидных частиц (например, LNP), количество мишеней фосфолипида составляет 6.75 моль% и количество мишеней холестерина составляет 32,43 моль %, но фактическое количество фосфолипида может быть ±2 моль %, ±1,5 моль %, ±1 моль %, ±0,75 моль %, ±0,5 моль %, ±0,25 моль % или ±0,1 моль % этого количества мишеней, и фактическое количество холестерина может быть ±3 моль %, ±2 моль %, ±1 моль %, ±0,75 моль %, ±0,5 моль %, ±0,25 моль % или ±0,1 моль % этого количества мишеней, причем остаток препарата составлен из других липидных компонентов (добавление до 100 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице).

Липидные конъюгаты

В дополнение к катионным и некатионным липидам, липидные частицы по настоящему изобретению (например, LNP) могут дополнительно содержать липидный конъюгат.Конъюгированный липид является полезным в том, что он предотвращает агрегацию частиц. Подходящие липидный конъюгаты включают PEG-конъюгаты липидов, POZ-липидные конъюгаты, АТТА-липидные конъюгаты, катионно-полимерно-липидные конъюгаты (CPL), а также их смеси, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации частицы содержат либо PEG-конъюгаты липидов или АТТА-липидные конъюгаты вместе с CPL.

В предпочтительном варианте реализации липидный конъюгат является PEG-липидом. Примеры PEG-липидов, охватывают PEG соединенный с диалкилоксипропилами (PEG-DAA), как описано, например, в РСТ публикации WO 05/026372, PEG соединенный с диацилглицеринами (PEG-DAG), как описано в, например, публикации заявки на патент США №№2003/0077829 и 2005/008689, PEG соединенный с фосфолипидами, такими как фосфатидилэтаноламин (PEG-PE), конъюгированный с PEG церамид, как описано, например, в патенте США №5885613, конъюгированный с PEG холестерин или его производным, а также их смеси, но не ограничиваются ими. Раскрытие этих патентных документов включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

Дополнительные PEG-липиды, пригодные для использования в настоящем изобретении включают, без ограничения, mРЕС2000-1,2-ди-O-алкил-sn3-карбомоилглицерид (PEG-C-DOMG). Синтез PEG-C-DOMG описано в РСТ публикации WO 09/086558, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Тем не менее, дополнительные подходящие PEG-конъюгаты липидов включают, без ограничения, 1-[8'-(1,2-димиристоил-3-пропанокси)-карбоксамидо-3',6'-диоксаоктанил]корбомоил-(ω-метил-поли(этиленгликоль) (2KPEG-DMG). Синтез 2KPEG-DMG описан в патенте США №7404969, описание которого включено в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

PEG является линейным, водорастворимым полимером этилена PEG повторяющихся звеньев с двум концевыми гидроксильными группами. PEG классифицируют по их молекулярной массе; например, PEG 2000 имеет среднюю молекулярную массу примерно 2000 дальтон, и PEG 5000 имеет среднюю молекулярную массу примерно 5000 дальтон. PEG коммерчески доступны у Корпорации Сигма Кэмикал и других компаний, и включают в себя следующие: монометоксиполиэтиленгликоль (MePEG-OH), монометоксиполиэтиленгликоля-сукцинат (MePEG-S), монометоксиполиэтиленгликоля-сукцинимидил сукцинат (MePEG-S-NHS), монометоксиполиэтиленгликоля-амин (MePEG-NH 2), монометоксиполиэтиленгликоля-трезилат (MePEG-TRES), монометоксиполиэтиленгликоля-имидазолил-карбонил (MePEG-IM), но не ограничиваются ими, а также такие соединения, содержащие концевую гидроксильную группу вместо терминальной метокси группы (например, НО-PEG-S, HO-PEG-S-NHS, HO-PEG-NH₂, и т.д.). Другие PEG, такие как описанные в патентах №№ США 6774180 и 7053150 (например, MPEG(20 кДа)амин) также могут быть использованы для получения PEG-конъюгатов липидов для реализации настоящего изобретения. Описание этих патентов включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Кроме того, монометоксиполиэтиленгликоль уксусной кислоты (MePEG-CH₂COOH) особенно полезен для получения PEG-конъюгатов липидов, в том числе, например, PEG-конъюгатов DAA.

PEG фрагмент из PEG-липидных конъюгатов, описанных в настоящем документе, может содержать среднюю молекулярную массу в диапазоне от примерно 550 дальтон до примерно 10000 дальтон. В некоторых случаях, фрагмент PEG имеет среднюю молекулярную массу от примерно 750 дальтон до примерно 5000 дальтон (например, от примерно 1000 дальтон до примерно 5000 дальтон, примерно от 1500 дальтон до примерно 3000 дальтон, примерно от 750 дальтон до примерно 3000 дальтон, от примерно 750 дальтон до примерно 2000 дальтон, и т.д.). В предпочтительных вариантах реализации изобретения фрагмент PEG имеет среднюю молекулярную массу примерно 2000 дальтон или примерно 750 дальтон.

В некоторых случаях, PEG может быть необязательно замещен алкильной, алкокси, ацил, или арильной группой. PEG может быть конъюгирован непосредственно с липидом или может быть связан с липидами посредством линкерной части молекулы. Любой связующий фрагмент предназначен для соединения PEG к липиду мог быть использован в том числе, например, не-эфир, содержащий линкерные фрагменты и сложные эфиры, содержащие линкерные фрагменты. В предпочтительном варианте реализации связующий фрагмент представляет собой не-эфир, содержащий линкерную группу. Как использовано в данном описании, термин "не-эфир, содержащий связующий фрагмент" относится к линкеру, который не содержит карбоксильную эфирную связь (OC(O)-). Подходящие не-эфиры, содержащие линкерные фрагменты включают амидо (C(O)NH-), амино (-NR-), карбонил (C(O)-), карбамат (-NHC(O)O-), мочевины (-NHC(O)NH-), дисульфид (-SS-), эфир (-O-), сукцинил (-(O)CCH₂CH₂C(O)-), сукцинамидил (-NHC(O)CH₂CH₂C(O)NH-), эфир, дисульфид, а также их комбинации (например, линкеры, содержащие как карбамат линкерный фрагмент, так и амидо-линкер). В предпочтительном варианте реализации, карбаматный линкер используется для соединения PEG с липидом.

В других вариантах реализации, сложный эфир, содержащий связующий фрагмент используется для соединения PEG к липиду. Подходящие сложные эфиры, содержащие линкерные группы, включают, например, карбонат (OC(O)O-), сукциноил, фосфатные эфиры (-O-(O)-O-POH), сульфонатные сложные эфиры и их комбинации.

Фосфатидилэтаноламины, имеющие различные группы ациловых цепей различной длины цепи и степени насыщения могут быть конъюгированы с PEG с получением липидного конъюгата. Такие фосфатидилэтаноламины являются коммерчески доступными, или могут быть изолированы или синтезированы с использованием обычных методов, известных специалистам в данной области. Предпочтительные фосфатидилэтаноламины содержат насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты с длиной углеродной цепи в интервале от C10 до C20. Фосфатидилэтаноламины с одноатомными или диненасыщенными жирными кислотами и смеси насыщенных и ненасыщенных жирных кислот также могут быть использованы. Подходящие фосфатидилэтаноламины включают димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дипальмитоил-фосфатидилэтаноламин (DPPE), диолеоилфосфотидилэтаноламин (DOPE) и дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), но не ограничиваются ими.

Термин «АТТА» или «полиамид» включает в себя, без ограничения, соединения описанные в патентах США №№6320017 и 6586559, описания которых включены в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме для всех целей. Эти соединения включают соединения, имеющее формулу:

где R представляет собой член, выбранный из группы, состоящей из водорода, алкила и ацила; R¹ представляет собой член, выбранный из группы, состоящей из водорода и алкила; или необязательно, R и R¹ и атомом азота, к которому они присоединены, образуют азидо фрагмент; R² представляет собой член группы, выбранной из водорода, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного арила и боковой цепи аминокислоты; R³ представляет собой член, выбранный из группы, состоящей из водорода, галогена, гидрокси, алкокси, меркапто, гидразино, амино и NR⁴R⁵, где R⁴ и R⁵ независимо представляют собой водород или алкил; n принимает значения 4 до 80; m принимает значения 2 до 6; p принимает значения 1 o 4; и q принимает значения 0 или 1. Специалистам в данной области очевидно, что и другие полиамиды могут быть использованы в соединениях для реализации настоящего изобретения.

Термин "диацилглицерин" или "DAG" включает в себя соединение, имеющее 2 жирные ацильные цепи, R¹ и R², оба из которых независимо друг от друга имеют от 2 до 30 атомов углерода, соединенных с глицерином в 1 и 2-положении с помощью эфирной связи. Ацильные группы могут быть насыщенными или иметь разную степень ненасыщенности. Подходящие ацильные группы включаю лауроил (C12), миристоил (C14), пальмитоил (C16), стеароил (C18) и икозоил (C20)т, но не ограничиваются ими. В предпочтительных вариантах реализации, R¹ и R² являются одинаковыми, то есть R¹ и R² оба являются миристоилом (то есть, димиристоилом), R¹ и R² оба являются стеароилом (то есть, дистеароилом) и т.д. Диацилглицерины имеют следующую общую формулу:

Термин "диалкилоксипропил" или "DAA" включает в себя соединение, имеющие 2 алкильные цепи, R¹ и R², оба из которых независимо друг от друга имеют от 2 до 30 атомов углерода. Алкильные группы могут быть насыщенными или иметь разную степень ненасыщенности. Диалкилоксипропилы имеют следующую общую формулу:

В предпочтительном варианте реализации изобретения PEG-липид представляет собой конъюгат PEG-DAA, имеющий следующую формулу:

где R¹ и R² независимо выбраны и являются длинноцепочечными алкильными группами, имеющими от примерно 10 до примерно 22 атомов углерода; PEG является полиэтиленгликолем; и L представляет собой неэфир, содержащий линкерную часть, или сложный эфир, содержащий линкер, как описано выше. Алкильные группы с длинной цепью могут быть насыщенными или ненасыщенными. Подходящие алкильные группы включают депил (C10), лаурил (C12), миристил (C14), пальмитил (C16), стеарил (C18), и икозил (C20), но не ограничиваются ими. В предпочтительных вариантах реализации, R¹ и R² являются одинаковыми, то есть, R¹ и R² являются оба миристилом (то есть, димиристилом), R¹ и R² являются оба стеарилом (то есть, дистеарилом), и т.д.

В формуле V выше, PEG имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от примерно 550 дальтон до примерно 10000 дальтон. В некоторых случаях, PEG имеет среднюю молекулярную массу от примерно 750 дальтон до примерно 5000 дальтон (например, от примерно 1000 дальтон до примерно 5000 дальтон, примерно от 1500 дальтон до примерно 3000 дальтон, примерно от 750 дальтон до примерно 3000 дальтон, примерно от 750 дальтон до примерно 2000 дальтон, и т.д.). В предпочтительных вариантах реализации изобретения PEG имеет среднюю молекулярную массу примерно 2000 дальтон или примерно 750 дальтон. PEG может быть, необязательно замещенным алкильной, алкокси, ацильной, или арильной группами. В некоторых вариантах реализации, терминальная гидроксильная группа замещена метокси или метальной.

В предпочтительном варианте реализации, "L" не является сложным эфиром, содержащим линкерную группу. Подходящие несложные эфиры, содержащие линкеры, включают в себя линкерный фрагмент, амидо, амино линкерный фрагмент, карбонильный линкерный фрагмент, карбаматный линкер, уриновый линкер, простой эфирный линкер, дисульфидный линкер, сукцинамидил связующий фрагмент, а также их комбинации, но не ограничиваются ими. В предпочтительном варианте реализации не-эфир, содержащий связующий фрагмент, представляет собой связующий фрагмент карбаминовой кислоты (т.е., конъюгат PEG-C-DAA). В другом предпочтительном варианте реализации не-эфир, содержащий связующий фрагмент, представляет собой фрагмент амидо линкер (т.е., конъюгат PEG-A-DAA). В еще одном предпочтительном варианте реализации не-эфир, содержащий связующий фрагмент, представляет собой фрагмент сукциниламидил линкер (т.е., конъюгат PEG-S-DAA).

В некоторых вариантах реализации, PEG-липидные конъюгаты выбраны из:

Конъюгаты PEG-DAA синтезированы с использованием стандартных методик и реагентов, известных специалистам в данной области. Следует иметь в виду, что конъюгаты PEG-DAA будут содержать различные амиды, амины, эфирные, тио, карбаматы, и уретановые линкеры. Специалистам в данной области техники будет понятно, что способы и реагенты для образования этих связей хорошо известны и легко доступны. Смотри, например, March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wiley 1992); Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989); и Furniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 5th ed. (Longman 1989). Кроме того, следует понимать, что присутствие любых функциональных групп может потребовать защиты и снятия защиты в различных точках при синтезе конъюгатов PEG-DAA. Специалистам в данной области техники будет понятно, что такие методы хорошо известны. Смотри, например. Green and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley 1991).

Предпочтительно, PEG-DAA конъюгат является PEG-дидецилоксилпропил (C₁₀) конъюгатом, PEG-дилаурилоксипропил (C₁₂) конъюгатом, PEG-димиристилоксипропил (C₁₄) конъюгатом, PEG-дипалмитилоксипропил (C₁₆) конъюгатом, или PEG-дистеарилоксипропил (C₁₈) конъюгатом. В этих вариантах реализации, PEG предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу от примерно 750 или примерно 2000 дальтон. В одном особенно предпочтительном варианте реализации изобретения PEG-липидный конъюгат содержит PEG2000-C-DMA, отличающийся тем, что "2000" обозначает среднюю молекулярную массу PEG, "С" обозначает карбаматный линкерный фрагмент, и "DMA" обозначает димиристилоксипропил. В другом, особенно предпочтительном варианте реализации изобретения PEG-липидный конъюгат содержит PEG750-C-DMA, отличающийся тем, что "750" обозначает среднюю молекулярную массу PEG, "С" обозначает карбаматный линкерный фрагмент, и "DMA" обозначает димиристилоксипропил. В конкретных вариантах реализации, терминальная гидроксильная группа PEG замещена метильной группой. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что другие диалкилоксипропилы могут быть использованы в PEG-DAA конъюгатах реализации настоящего изобретения.

В дополнение к вышеизложенному, специалистам в данной области техники очевидно, что другие гидрофильные полимеры могут быть использованы вместо PEG. Примеры подходящих полимеров, которые могут быть использованы вместо PEG, охватывают поливинилпирролидон, полиметилоксазолин, полиэтилоксазолин, полигидроксипропил, метакриламид, полиметакриламид и полидиметилакриламид, полимолочная кислота, полигликолевая кислота, и производные целлюлозы, такие как гидроксиэтилцеллюлоза или гидроксиметилцеллюлоза.

В дополнение к указанным выше компонентам, липидные частицы (например, LNP) по настоящему изобретению могут дополнительно содержать катионный поли(этиленгликоль) (PEG) липиды или CPL (см., например, Chen и др., Bioconj. Chem., 11: 433-437 (2000); патент США №6852334; РСТ публикация WO 00/62813, описания которых включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей).

Подходящие CPL включают соединения формулы VI:

где A, W, и Y писаны ниже.

Со ссылкой на Формулу VI, "А" является фрагментом липида таким, как амфипатический липид, нейтральный липид, или гидрофобный липид, который действует как липид-фиксатор. Подходящие примеры липидов охватывают диацилглицеролы, диалкилглицеролы, N-N-диалкиламины, 1,2-диацилокси-3-аминопропаны, и 1,2-диалкил-3-аминопропаны, но не ограничиваясь ими.

"W" представляет собой полимер или олигомер, такой как гидрофильный полимер или олигомер. Предпочтительно, гидрофильный полимер представляет собой биосовместимым полимером, который является неиммуногенным или обладает низкой иммуногенностью. Альтернативно, гидрофильный полимер может быть слабоантигенным при использовании с соответствующими адъювантами. Подходящие полимеры включают неиммуногенные PEG, полиамиды, полимолочную кислоту, полигликолевую кислоту, полигликолевую кислоту, сополимеры полимолочной кислоты / и их комбинации, но не ограничиваются ими. В предпочтительном варианте реализации полимер имеет молекулярную массу от примерно 250 до примерно 7000 дальтон.

"Y" является поликатионным фрагментом. Термин поликатионный фрагмент относится к соединению, производному или функциональной группой, имеющей положительный заряд, предпочтительно, по меньшей мере, 2 положительных заряда в выбранном pH, предпочтительно физиологическом pH. Подходящие поликатионные фрагменты включают основные аминокислоты и их производные, такие как аргинин, аспарагин, глутамин, лизин, гистидин и спермин; спермидин; катионные дендримеры; полиамины; полиаминовые сахара и полисахариды аминокислоты. Поликатионные фрагменты могут быть линейными, такими как линейный тетрализин, разветвленными или дендритными по структуре. Поликатионные фрагменты имеют от примерно 2 до примерно 15 положительных зарядов, предпочтительно от примерно 2 до примерно 12 положительных зарядов, а более предпочтительно от примерно 2 до примерно 8 положительных зарядов в выбранных значениях pH. Выбор поликатионных фрагментов может быть определен с помощью типа приложения частиц, которые требуется.

Связи поликатионных фрагментов могут быть либо распределены по всему фрагменту частицы, или в качестве альтернативы, они могут быть дискретно концентрированы по плотности заряда в одном конкретном районе фрагмента частицы, например, заряда спайка. Если плотность заряда распространяется по частице, плотность заряда может быть равномерно распределена или неравномерно распределена. Все вариации распределения заряда поликатионного фрагмента входят в объем настоящего изобретения.

Липид "А" и неиммуногенный полимер "W" могут быть присоединены различными способами и предпочтительно за счет ковалентного присоединения. Методы, известные специалистам в данной области, могут быть использованы для ковалентного присоединения "А" и "W". Подходящие связи включают в себя амидные, аминные, карбоксильные, карбонатные, карбаматные, сложноэфирные, и гидразоновые связи, но не ограничиваются ими. Специалистам в данной области техники очевидно, что "А" и "W" должны иметь дополнительные функциональные группы для осуществления связи. Реакционные из этих двух групп, одной у липида, а другая у полимера, будут обеспечивать желаемую связь. Например, когда липид представляет собой диацилглицерин и концевые гидроксильные группы активируется, например, с помощью NHS и DCC, с образованием активного сложного эфира, и затем подвергаются взаимодействию с полимером, который содержит аминогруппу, например, с помощью полиамида (см, например, патенты США №№6320017 и 6586559, раскрытие которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей), между двумя группами образуется амидная связь.

В некоторых случаях, поликатионный фрагмент может быть присоединен к лиганду, такому как лиганду-мишени или к хелатирующему фрагменту для образования комплекса с кальцием. Предпочтительно, после того, как лиганд присоединен, катионный фрагмент сохраняет положительный заряд. В некоторых случаях, лиганд, который присоединен, имеет положительный заряд. Подходящие лиганды включают соединения или устройства с реакционноспособной функциональной группой, но не ограничиваются ими, и включают липиды, амфипатические липиды, несущее соединения, биоаффинные соединения, биоматериалы, биополимеры, биомедицинские устройства, аналитически обнаруживаемые соединения, терапевтически активное соединения, ферменты, пептиды, белки, антитела, иммунные стимуляторы, радиоактивные метки, флюорогены, биотин, лекарственные средства, гаптены, ДНК, РНК, полисахариды, липосомы, мицеллы, виросомы, иммуноглобулины, функциональные группы, иные фрагменты-мишени или токсины.

В некоторых вариантах реализации липидный конъюгат (например, PEG-липид) содержит от примерно 0,1 моль % до примерно 2 моль %, от примерно 0,5 моль % до примерно 2 моль %, от примерно 1 моль % до примерно 2 моль %, от примерно 0,6 моль % до примерно 1,9 моль %, от примерно 0,7 моль % до примерно 1,8 моль %, от примерно 0,8 моль % до примерно 1,7 моль %, от примерно 0,9 моль % до примерно 1,6 моль %, от примерно 0,9 моль % до примерно 1,8 моль %, примерно от 1 моль % до примерно 1,8 моль %, примерно от 1 моль % до примерно 1,7 моль %, от примерно 1,2 моль % до примерно 1,8 моль %, от примерно 1,2 моль % до примерно 1,7 моль %, от примерно 1,3 моль % до примерно 1,6 моль %, или от примерно 1,4 моль % до примерно 1,5 моль % (или любой их фракции или их диапазона) от общего числа липидов, присутствующих в частице.

В других вариантах реализации липидный конъюгат (например, PEG-липид) содержит от примерно 0 моль % до примерно 20 моль %, от примерно 0,5 моль % до примерно 20 моль %, от примерно 2 моль % до примерно 20 % мол, от примерно 1,5 моль % до примерно 18 моль %, от примерно 2 моль % до примерно 15 моль %, от примерно 4 моль % до примерно 15 моль %, от примерно 2 моль % до примерно 12 моль %, от примерно 5 моль % до примерно 12 моль %, или примерно 2 моль % (или любой их фракции или их диапазона) от общего числа липидов, присутствующих в частице.

В других вариантах реализации липидный конъюгат (например, PEG-липид) содержит от примерно 4 моль % до примерно 10 моль %, от примерно 5 моль % до примерно 10 моль %, от примерно 5 моль % до примерно 9 моль %, от примерно 5 моль % до примерно 8 моль %, от примерно 6 моль % до примерно 9 моль %, от примерно 6 моль % до примерно 8 моль % или от примерно 5 моль %, 6 моль %, 7 моль %, 8 моль %, 9 моль % или 10 моль % (или любой их фракции или их диапазона) от общего числа липиднов, присутствующих в частице.

Дополнительные примеры, проценты и/или диапазоны липидных конъюгатов, пригодных для использования в липидных частицах по настоящему изобретению, описаны, например, в публикации РСТ № WO 09/127060 и публикации РСТ № WO 2010/006282, раскрытие которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

Следует понимать, что процент липидных конъюгатов (например, PEG-липидов), присутствующих в липидных частицах по настоящему изобретению, представляет собой количество мишеней, и это фактическое количество липидных конъюгатов, присутствующих в композиции, может варьировать, например, в пределах ±2 моль %. Например, в 1:57 препарате липидной частицы (например, LNP), целевое количество липидных конъюгатов составляет 1,4 моль %, но фактическое количество липидных конъюгатов может быть ±0,5 моль %, ±0,4 моль %, ±0,3 моль %, ±0,2 моль %, ±0,1 моль %, или ±0,05 моль % этого количества мишеней, причем остальной препарат может быть составлен из других липидных компонентов (добавление до 100 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице). Аналогичным образом, в 7:54 препарате липидной частицы (например, LNP), количество мишеней липидных конъюгатов составляет 6,76 моль %, но фактическое количество липидных конъюгатов может быть ±2 моль %, ±1,5 моль %, ±1 моль %, ±0,75 моль %, ±0,5 моль %, ±0,25 моль % или ±0,1 моль % этого количества мишеней, причем остальной препарат может быть составлен из других липидных компонентов (добавление до 100 моль % от общего количества липидов, присутствующих в частице).

Специалисту в данной области техники будет понятно, что концентрация липидных конъюгатов может изменяться в зависимости от применяемого липидного конъюгата и скорости, с которой липидная частица должна сливаться.

Контролируя состав и концентрацию липидного конъюгата, можно контролировать скорость, с которой липидные конъюгаты образуются из липидных частиц и, в свою очередь, скорость, с которой липидная частица сливается. Например, когда конъюгат PEG-DAA используется в качестве липидного конъюгата, скорость, с которой липидная частица сливается, можно варьировать, например, путем изменения концентрации липидного конъюгата, путем изменения молекулярной массы PEG, или путем изменения длины цепи и степени насыщения алкильных групп конъюгата PEG-DAA. Кроме того, другие переменные, в том числе, например, pH, температура, ионная сила и т.д., могут быть использованы для изменения и/или контролирования скорости, с которой липидная частица сливается. Другие методы, которые могут быть использованы, чтобы контролировать скорость, с которой липидная частица сливается, станут очевидными специалистам в данной области техники после прочтения этого раскрытия. Кроме того, путем регулирования состава и концентрации липидного конъюгата, можно контролировать размер липидной частицы (например, LNP).

Подготовка липидных частиц

Липидные частицы по настоящему изобретению, например, LNP, в которых активный агент или терапевтическое средство, такое как интерферирующие РНК (например, миРНК) являются заключенными в липидную часть частицы и защищенными от деградации, могут быть образованы любым способом, известным в данной области, включая способом непрерывного смешивания, процессом прямого разбавления, и процессом разбавления в режиме реального времени, но не ограничиваясь ими.

В конкретных вариантах реализации катионные липиды могут содержать липиды формулы I или их соли, отдельно или в комбинации с другими катионными липидами. В других вариантах реализации некатионные липиды являются яичным сфингомиелином (ESM), дистеароилфосфатидилхолином (DSPC), диолеоилфосфотидилхолином (DOPC), 1-пальмитоил-2-олеоил-фосфатидилхолином (РОРС), дипальмитоил-фосфатидилхолином (DPPC), монометиловый-фосфатидилэтаноламином, диметил-фосфатидилэтаноламином, 14:0 РЕ (1,2-димиристоил-фосфатидилэтаноламин (DMPE)), 16:0 РЕ (1,2-дипальмитоил-фосфатидилэтаноламин (DPPE)), 18:0 РЕ (1,2-дистеароил-фосфатидилэтаноламином (DSPE)), 18:1 РЕ (1,2-диолеоил-фосфатидилэтаноламином (DOPE)), 18:1 транс-РЕ (1,2-диелаидоил-фосфатидилэтаноламином (DEPE)), 18:0-18:1 РЕ (1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламина (SOPE)), 16:0-18:1 РЕ (1-пальмитоил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламин (POPE)), полимеры полиэтиленгликоль-основных (например, PEG 2000, PEG 5000, PEG-модифицированные диацилглицерины, или PEG-модифнцированные диалкилоксипропилы), холестерин, их производные или их комбинации.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотно-липидным частицам (например, LNP), полученным с помощью способа непрерывного смешивания, например, процесса, который включает получение водного раствора, содержащего нуклеиновую кислоту (например, интерферирующую РНК) в первом резервуаре, получение органического раствора липидов во втором резервуаре (где липиды присутствуют в органическом липидном растворе, растворенном в органическом растворителе, например, низшем алканоле, таком как этанол), и смешивание водного раствора с органическим раствором, таким образом, что органический липидный раствор смешивается с водным раствором так, чтобы по существу мгновенно производить липидные пузырьки (например, липосомы) инкапсулирующие нуклеиновую кислоту в липидных пузырьках. Этот способ и устройство для реализации этого способа подробно описаны в заявке на патент США №2004/0142025, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Действие непрерывного введения липидов и буферных растворов в среду смешивания, например, в смесительную камеру, вызывает непрерывное разбавление липидного раствора с буферным раствором, в результате чего получают липидные пузырьки по существу мгновенно при смешивании. Как использовано в данном описании, фраза "непрерывное разбавление раствора липидов с буферным раствором" (и вариации) в общем случае означает, что липидный раствор разбавляют достаточно быстро в процессе гидратации с достаточной силой для реализации генерации пузырьков. При смешивании водного раствора, содержащего нуклеиновую кислоту, с органическим раствором липидов, органический раствор липидов претерпевает ступенчатое непрерывное разбавление в присутствии буферного раствора (то есть, водного раствора) с получением нуклеиновых кислотно-липидных частиц.

Нуклеиновые кислотно-липидные частицы, сформированные методом непрерывного смешивания, как правило, имеют размер от примерно 30 нм до примерно 150 нм, от примерно 40 нм до примерно 150 нм, от примерно 50 нм до примерно 150 нм, от примерно 60 нм до примерно 130 нм, от примерно 70 нм до примерно 110 нм, от примерно 70 нм до примерно 100 нм, от примерно 80 нм до примерно 100 нм, от примерно 90 нм до примерно 100 нм, от примерно 70 до примерно 90 нм, от примерно 80 нм до примерно 90 нм, от примерно 70 нм до примерно 80 нм, менее чем примерно 120 нм, 110 нм, 100 нм, 90 нм или 80 нм или примерно 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 55 нм, 60 нм, 65 нм, 70 нм, 75 нм, 80 нм, 85 нм, 90 нм, 95 нм, 100 нм, 105 нм, 110 нм, 115 нм, 120 нм, 125 нм, 130 нм, 135 нм, 140 нм, 145 нм, или 150 нм (любой их фракции или диапазона в ней). Частицы таким образом, не агрегируют и, необязательно, такой размер позволяет достичь однородного размера частиц.

В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислотно-липидной частице (например, LNP), полученной путем процесса прямого разбавления, что включает формирование раствора липидных пузырьков (например, липосом) и немедленного и непосредственного введения раствора липидных пузырьков в сборный резервуар, содержащий регулируемое количество буфера для разведения. В предпочтительных аспектах, сборный резервуар включает в себя один или более элементов, сконфигурированных для перемешивания содержимого этого резервуара, чтобы облегчить растворение. В одном аспекте, количество буфера для разведения, присутствующего в сборном резервуаре по существу равна объему липидных пузырьков раствора, введенного в него. В качестве неограничивающего примера, липидные пузырьки раствора в 45% этаноле при введении в накопительный резервуар, содержащий равный объем буфера для разведения, будут преимущественно получены в виде мелких частиц.

В еще одном варианте реализации настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотно-липидным частицам (например, LNP), полученным с помощью процесса линейного разбавления, в котором третий резервуар, содержащий буфер для разведения гидравлически соединен со вторым участком смешения. В этом варианте реализации, раствор липидных пузырьков (например, липосом), образованный в первой смесительной области сразу же смешивали с буфером для разведения во второй зоне смешения. В предпочтительных аспектах, вторая область смешивания включает в себя Т-образный элемент, расположенный таким образом, что потоки раствора липидных пузырьков и буфера соединяются как 180° потоки; однако, соединительные элементы, обеспечивающие малый угол скольжения, могут быть использованы, например, от примерно 27° до 180° (например, примерно 90°). Насосный механизм обеспечивает контролируемый поток буфера ко второй области смешивания. В одном аспекте, скорость потока буфера разведения, подаваемого во вторую зону смешения контролируется так, чтобы быть по существу равной скорости потока раствора липидных пузырьков, введенного в него из первого смесительного области. Этот вариант предпочтительно обеспечивает больший контроль потока буфера разведения для смешивания с раствором липидных пузырьков во второй области смешивания, а следовательно, и концентрацию раствора липидных пузырьков в буфере в течение второго процесса смешивания. Такой контроль расхода буфера разведения преимущественно обеспечивает формирование частиц малого размера при пониженных концентрациях.

Эти процессы и аппараты для проведения этих прямых линейных разведении и процессы разведения подробно описаны в заявке на патент США №2007/0042031, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Нуклеиновые кислотно-липидные частицы формируется с использованием прямого разбавления и процессы линейного разбавления, как правило, имеют размер от примерно 30 нм до примерно 150 нм, от примерно 40 нм до примерно 150 нм, от примерно 50 нм до примерно 150 нм, от примерно 60 нм до примерно 130 нм, от примерно 70 нм до примерно 110 нм, от примерно 70 нм до примерно 100 нм, от примерно 80 нм до примерно 100 нм, от примерно 90 нм до примерно 100 нм, от примерно 70 до примерно 90 нм, от примерно 80 нм до примерно 90 нм, от примерно 70 нм до примерно 80 нм, менее чем примерно 120 нм, 110 нм, 100 нм, 90 нм или 80 нм или примерно 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 55 нм, 60 нм, 65 нм, 70 нм, 75 нм, 80 нм, 85 нм, 90 нм, 95 нм, 100 нм, 105 нм, 110 нм, 115 нм, 120 нм, 125 нм, 130 нм, 135 нм, 140 нм, 145 нм, или 150 нм (или любую их фракцию или диапазон в нем). Частицы таким образом, не агрегируют, и, необязательно, формируются такого размера, чтобы достичь однородного размера частиц.

При необходимости, размер липидных частиц по настоящему изобретению (например, LNP) может быть рассчитан с помощью любого из методов, доступных для формирования размера липосом. Изменение размеров может быть осуществлено для того, чтобы достичь желаемого размера и относительно узкого распределения частиц по размерам.

Некоторые методы доступны для определения размера частиц до нужного размера. Один из способов калибровки, используемый для липосом и в равной степени применимый к настоящей частице, описан в патенте США №4737323, описание которого включено в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме для всех целей. Ультразвуковая обработка суспензии частиц либо в емкости, либо в зонде, ультразвуковая обработка производит постепенное уменьшение размеров частиц до менее чем примерно 50 нм в размере. Гомогенизация является еще один методом, который основывается на разделении энергии фрагментов больших частиц на более мелкие. В типичной процедуре гомогенизации, частицы рециркулируют через стандартный эмульсионный гомогенизатор до выбранных размеров частиц, которые будут наблюдаться, как правило, между примерно 60 и примерно 80 нм. В обоих способах, распределение частиц по размерам можно контролировать с помощью обычного лазерного луча дискриминации частиц по размерам, или QELS.

Экструзия частиц через небольшие поры поликарбонатной мембраны или асимметричной керамической мембраны является также эффективным методом снижения размеров частиц в относительно хорошо определенном распределении по размерам. Как правило, суспензию циклически пропускают через мембрану один или несколько раз до тех пор, пока желаемое распределение частиц по размерам не будет достигнуто. Частицы могут быть последовательно экструдированы через меньшие поры мембраны, чтобы достигнуть постепенного уменьшение размера.

В некоторых вариантах реализации, нуклеиновые кислоты, присутствующие в частицах, ресуспендированны, как описано, например, в заявке на патент США 09/744103, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

В других вариантах реализации способы могут дополнительно включать добавление нелипидных поликатионов, которые полезны для реализации липофекапию клеток с использованием настоящих композиций. Примеры подходящих нелипидными поликатионов включают, гексадиметрин бромид (продается под торговой маркой POLYBRENE®, от Aldrich Chemical Co., Milwakee, Wisconsin, USA) или других солей гексадиметрина. Другие подходящие поликатионы, охватывают, например, соли поли-L-орнитина, поли-L-аргинина, поли-L-лизина, поли-D-лизина, полиаллиламина и полиэтиленимина. Добавление этих солей происходит, предпочтительно, после того, как частицы были сформированы.

В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота в соотношении с липидом (масс./масс. соотношение) образует нуклеиновую кислотно-липидную частицу (например, LNP), которая находится в интервале от примерно 0,01 до примерно 0,2, от примерно 0,05 до примерно 0,2, от примерно 0,02 до примерно 0,1, от примерно 0,03 до примерно 0,1 или от примерно 0,01 до примерно 0,08. Отношение исходных материалов (вносимых) также попадает в указанный диапазон. В других вариантах реализации препарат частиц использует примерно 400 мкг нуклеиновой кислоты на 10 мг общего липида или массовое соотношение нуклеиновой кислоты к липиду составляет от примерно 0,01 до примерно 0,08 и, более предпочтительно, примерно 0,04, что соответствует 1,25 мг общего липида на 50 мкг нуклеиновой кислоты. В других предпочтительных вариантах реализации частица имеет массовое соотношение нуклеиновая кислота: липид примерно 0,08.

В других вариантах реализации соотношение липида к нуклеиновой кислоте (масс./масс. отношение) в образованной нуклеиновой кислотно-липидной частице (например, LNP) будет варьироваться от примерно 1 (1:1) до примерно 100 (100:1), от примерно 5 (5:1) до примерно 100 (100:1), от примерно 1 (1:1) до примерно 50 (50:1), примерно от 2 (2:1) до примерно 50 (50:1), от примерно 3 (3:1) до примерно 50 (50:1), от примерно 4 (4:1) до примерно 50 (50:1), от примерно 5 (5:1) до примерно 50 (50:1), от примерно 1 (1:1) до примерно 25 (25:1), примерно от 2 (2:1) до примерно 25 (25:1), от примерно 3 (3:1) до примерно 25 (25:1), от примерно 4 (4:1) до примерно 25 (25:1), от примерно 5 (5:1) до примерно 25 (25:1), от примерно 5 (5:1) до примерно 20 (20:1), от примерно 5 (5:1) до примерно 15 (15:1), от примерно 5 (5:1) до примерно 10 (10:1), или примерно 5 (5:1), 6 (6:1), 7 (7:1), 8 (8:1), 9 (9:1), 10 (10:1), 11 (11:1), 12 (12:1), 13 (13:1), 14 (14:1), 15 (15:1), 16 (16:1), 17 (17:1), 18 (18:1), 19 (19:1), 20 (20:1), 21 (21:1), 22 (22:1), 23 (23:1), 24 (24:1), или 25 (25:1), или любой их фракции или диапазона в нем. Отношение исходных материалов (вносимых) также попадает в указанный диапазон.

Как описано выше, конъюгированный липид может дополнительно включать в себя CPL. Разнообразие общих способов получения LNP-CPL (CPL-содержащих LNP) обсуждаются в настоящем документе. Два общих способа включают в себя технику "после вставки", то есть вставку CPL в, например, заранее сформированный LNP и "стандартный" метод, в котором CPL включают в липидную смесь в течение, например, шагов формирования LNP. Пост-вставочный способ приводит к LNP, содержащей CPLS в основном на наружной поверхности двухслойной мембраны LNP, в то время как стандартные способы обеспечивают LNP, содержащие CPLS на внутренних и внешних поверхностях. Этот способ особенно полезен для пузырьков, изготовленных из фосфолипидов (которые могут содержать холестерин), а также для пузырьков, содержащих PEG-липиды (например, PEG-Daas и PEG-DAG). Способы получения LNP-CPLS раскрыты, например, в патентах США №№5705385; 6586410; 5981501; 6534484 и 6852334; патентной заявке США №2002/0072121; и публикации РСТ № WO 00/62813, раскрытие которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

Наборы

Настоящее изобретение также предоставляет липидные частицы (например, LNP) в форме набора. В некоторых вариантах реализации набор содержит контейнер, который разделен для содержания различных элементов липидных частиц (например, активных агентов или терапевтических агентов, таких как нуклеиновые кислоты и отдельные липидные компоненты частиц). Предпочтительно, чтобы набор включал контейнер (например, флакон или ампула), который содержит липидные частицы по настоящему изобретению (например, LNP), отличающийся тем, что частицы получают по одному из способов, изложенных в данном документе. В некоторых вариантах реализации набор может дополнительно содержать дестабилизаторы эндосомальных мембран (например, ионы кальция). Набор обычно содержит частицы композиции по настоящему изобретению, либо в виде суспензии в фармацевтически приемлемом носителе либо в дегидратированной форме, с инструкциями по их регидратации (в случае лиофилизированных) и введения.

Липидные частицы по настоящему изобретению могут быть приспособлены преимущественно для поражения конкретной ткани, органу или опухоли, представляющими интерес. В некоторых случаях, 1:57 липидная частица (например, LNP) композиция может быть использована для поражения преимущественно печени (например, нормальной ткани печени). В других случаях, 7:54 липидная частица (например, LNP) композиция может быть использована для поражения преимущественно твердых опухолей, таких как опухоли печени и опухоли за пределами печени. В предпочтительных вариантах реализации наборы настоящего изобретения включают такие печень-поражающие частицы липидов и/или опухоль-поражающие, в которых частицы присутствуют в контейнере в виде суспензии или в дегидратированной форме.

В некоторых других случаях, может быть желательно, иметь фрагмент-мишень, прикрепленный к поверхности липидной частицы для дальнейшего повышения поражающей способности частицы. Методы крепления фрагмента-мишени (например, антитела, белка и т.д.), к липидам (таким, как те, которые используются в настоящем частице) известны специалистам в этой области техники.

Введение липидных частиц

После формирования, липидные частицы по настоящему изобретению (например, LNP) могут быть использованы для введения активных агентов или терапевтических агентов (например, нуклеиновых кислот, таких как интерферирующие РНК) в клетки. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам введения активного вещества или терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота (например, интерферирующая РНК) в клетку. В некоторых случаях, клетка представляет собой клетку печени, такую как, например, гепатоцит, который присутствует в ткани печени. В других случаях, клетка представляет собой опухолевую клетку, такую как, например, опухолевая клетка, присутствующая в твердой опухоли. Способы осуществляются in vitro или in vivo, сначала происходит образование частицы, как описано выше, и затем контактирование частиц с клетками в течение периода времени, достаточного для того, чтобы произошла доставка активного агента или терапевтического агента к клеткам.

Липидные частицы по настоящему изобретению (например, LNP) могут быть адсорбированы на почти любом типе клеток, с которьми они смешиваются или вступают в контакт. После адсорбции, частицы могут быть подвержены либо эндоцитозу частью клеток, обмену липидами с клеточными мембранами, или слитию с клетками. Передача или введение активного агента или терапевтического агента (например, нуклеиновой кислоты) порции частиц может проходить через любой один из этих путей. В частности, когда происходит слияние, мембрана частиц является интегрированной в клеточную мембрану и содержать частицу в сочетании с внутриклеточной жидкостью.

Липидные частицы по настоящему изобретению (например, LNP) могут быть введены либо отдельно, либо в смеси с фармацевтически приемлемым носителем (например, физиологическим раствором или фосфатным буфером), выбранным в соответствии с путем введения и стандартной фармацевтической практикой. Как правило, нормальный солевой буфер (например, 135-150 мМ NaCl), будет использован в качестве фармацевтически приемлемого носителя. Другие подходящие носители включают, например, воду, буферную воду, 0,4% солевой раствор, 0,3% глицин и т.п., в том числе гликопротеины для повышения стабильности, такие как альбумин, липопротеин, глобулин и т.д. Дополнительные подходящие носители описаны, например, в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985). Как использовано в настоящем документе, "носитель" включает любой и все растворители, дисперсионные среды, транспортные средства, покрытия, растворители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты, буферы, растворы, суспензии носителя, коллоиды, и тому подобное. Фраза "фармацевтически приемлемый" относится к молекулярным частицам и композициям, которые не продуцируют аллергическую или подобную неблагоприятную реакцию при введении человеку.

Фармацевтически приемлемый носитель обычно добавляют после образования липидной частицы. Таким образом, после того, как липидная частица (например, LNP) формируется, частица может быть разбавлена в фармацевтически приемлемом носителе, таком как нормальный солевой буферный раствор.

Концентрация частиц в фармацевтических препаратах может широко варьировать, т.е. от менее чем примерно 0,05%, как правило, на уровне или, по меньшей мере примерно от 2 до 5%, до примерно от 10 до 90% по весу, и будут выбраны, прежде всего, по объему жидкости, вязкости и т.п., в соответствии с конкретным способом введения. Например, концентрация может быть увеличена, чтобы снизить нагрузку жидкости, связанную с лечением. Это может быть особенно желательно у пациентов, имеющих атеросклероз ассоциированный с застойной сердечной недостаточностью или тяжелой гипертензией. С другой стороны, частицы, состоящие из вызывающих раздражение липидов, могут быть разбавлены до низких концентрациях, чтобы уменьшить воспаление в месте введения.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть стерилизованы с помощью обычных, хорошо известных способов стерилизации. Водные растворы могут быть упакованы для использования или профильтрованы в асептических условиях и лиофилизированы, лиофилизированный препарат объединяют со стерильным водным раствором перед введением. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, таким как корректоры pH и буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия и хлорида кальция. Кроме того, суспензии частиц может включать липидные защитные агенты, которые защищают липиды от свободных радикалов и липид-перекисных повреждений при хранении. Липофильные безрадикальные гасители, такие как альфатокоферол, и растворимые в воде железо-специфицные хелаторы, такие как ферриоксамин, являются подходящими.

В некоторых вариантах реализации, липидные частицы по настоящему изобретению (например, LNP) являются особенно полезными в способах терапевтической доставки одного или нескольких нуклеиновых кислот, содержащих последовательность интерферирующей РНК (например, миРНК). В частности, задачей настоящего изобретения является обеспечение способов in vitro и in vivo лечения заболеваний или расстройств у млекопитающего (например, грызунов, таких как мыши, или приматов, таких как человек, шимпанзе, или обезьяна) посредством выключения или глушения транскрипции и/или трансляции одной или более целевой последовательности нуклеиновых кислот или генов, представляющих интерес.В качестве неограничивающего примера, способы по изобретению могут быть использованы для доставки in vivo интерферирующих РНК (например, миРНК) в печень и/или в опухоль у млекопитающего. В конкретном варианте реализации, заболевание или расстройство является ассоциированным с экспрессией и/или сверхэкспрессией гена и экспрессией или сверхэкспрессией гена, которая снижена интерферирующей РНК (например, миРНК). В конкретном варианте реализации, терапевтически эффективное количество лишздной частицы может быть введено млекопитающему. В некоторых случаях, интерферирующая РНК (например, миРНК) помещена в LNP, и частицы вводятся пациенту, который требует такого лечения. В других случаях, клетки изымают у пациента, интерферирующие РНК доставляются in vitro (например, с использованием LNP описанных в настоящем документе), и клетки обратно вводятся пациенту.

Введение in vivo

Системная доставка для терапии in vivo, например, доставка терапевтической нуклеиновой кислоты в дистальную клетку-мишень посредством систем организма, таких как циркуляция, была достигнута с использованием частиц нуклеиновых кислот, липидов, таких как те, которые описаны в публикации РСТ №№ WO 05/007196, WO 05/121348, WO 05/120152 и WO 04/002453, раскрытие которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей. Настоящее изобретение также предоставляет полностью инкапсулированные частицы липидов, которые защищают нуклеиновую кислоту от деградации нуклеазой в сыворотке, которые неиммуногенны, небольшие по размеру, и которые подходят для повторной дозы.

Для введения в естественных условиях, введение может быть любым способом, известным в данной области, например, с помощью инъекции, перорального введения, ингаляции (например, интраназальной или интратрахеальной), трансдермального применения, или ректального введения. Введение может быть осуществлено с помощью одной или нескольких доз. Фармацевтические композиции могут быть введены парентерально, т.е., интраартикулярно, внутривенно, внутрибрюпшнно, подкожно или внутримышечно. В некоторых вариантах реализации, фармацевтические композиции вводят внутривенно или внутрибрюпшнно с помощью инъекции ударной дозы (смотри, например, патент США №5286634). Внутриклеточная доставка нуклеиновой кислоты также обсуждалась в Straubringer и др., Methods Enzymol., 101: 512 (1983); Mannino и др., Biotechniques, 6: 682 (1988); Nicolau и др., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6: 239 (1989); и Behr, Асе. Chem. Res., 26: 274 (1993). Тем не менее другие способы введения липидов на основе терапевтических средств описаны, например, в патентах США №3993754; 4145410; 4235871; 4224179; 4522803; и 4588578. Частицы липидов могут быть введены путем прямой инъекции в месте болезни или в виде инъекций в узле дистальном от места заболевания (см, например. Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp. 70-71 (1994)). Раскрытие описанных выше ссылок включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

В вариантах реализации, где липидные частицы по настоящему изобретению (например, LNP) вводят внутривенно, по меньшей мере, примерно 5%, 10%, 15%, 20%, или 25% от общего объема инъекции дозы частиц присутствует в плазме примерно через 8, 12, 24, 36, или 48 ч после инъекции. В других вариантах реализации, более чем примерно 20%, 30%, 40% и до порядка 60%, 70% или 80% от общей введенной дозы липидных частиц присутствовали в плазме крови примерно через 8, 12, 24, 36, или 48 ч после инъекции. В некоторых случаях, более чем примерно 10% от множества частиц присутствовали в плазме млекопитающего примерно через 1 час после введения. В некоторых других случаях, присутствие частиц липидов можно обнаружить по меньшей мере примерно через 1 час после введения частиц. В некоторых вариантах реализации, наличие терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота можно обнаружить в клетках легких, печени, опухоли, или в месте воспаления примерно через 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 или 96 часов после введения. В других вариантах реализации, выключение экспрессии последовательности-мишени с помощью интерферирующих РНК (например, миРНК) можно обнаружить примерно через 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 или 96 часов после введения. В других вариантах реализации, подавление экспрессии последовательности-мишени с помощью интерферирующих РНК (например, миРНК) происходит преимущественно в клетках печени (например, гепатоциты), опухолевых клетках, или в клетках в области воспаления. В других вариантах реализации, наличие или эффект интерферирующих РНК (например, миРНК) можно обнаружить в клетках на месте проксимальном или дистальном к месту введения или в клетках легких, печени или опухоли примерно через 12, 24, 48, 72 или 96 часов, или примерно через 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26 или 28 дней после введения. В дополнительных вариантах реализации липидные частицы (например, LNP) по настоящему изобретению вводят парентерально или внутрибрюшинно.

Композиции по настоящему изобретению либо отдельно, либо в комбинации с другими подходящими компонентами, могут быть превращены в аэрозольные препараты (например, они могут быть "распыляемыми") для введения посредством ингаляции (например, интраназально или внутритрахеально) (см, Brigham и др.. Am. J. Sci., 298: 278 (1989)). Аэрозольные препараты могут быть помещены под давлением в приемлемые пропелленты, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и тому подобное.

В некоторых вариантах реализации, фармацевтические композиции могут быть доставлены с помощью интраназальных спреев, ингаляций, и/или других транспортных средств аэрозольной доставки. Способы доставки композиции нуклеиновых кислот непосредственно в легкие через носовые аэрозоли были описаны, например, в патенте США №№5756353 и 5804212. Точно так же, доставка лекарственных средств с использованием интраназальных микрочастиц смолы и лизофосфатидил-глицериновых соединений (патент США 5725871) также хорошо известны в фармацевтической области. Кроме того, доставка лекарственного средства через слизистую в форме опорной политетрафторэтеиленовой матрицы описана в патенте США №5780045. Раскрытия описанных выше патентов включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Композиции, пригодные для парентерального введения, такие как, например, путем внутрисуставного (в суставы), внутривенного, внутримышечного, внутрикожного, внутрибрюшинного, и подкожного, включают водные и неводные изотонические растворы, стерильные инъекционные, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические факторы, и растворенные вещества, которые придают композиции изотоничность с кровью предполагаемого реципиента, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. В практическом применении настоящего изобретения, композиции предпочтительно вводят, например, путем внутривенной инфузии, перорально, местно, внутрибрюшинно, внутрь мочевого пузыря, или интратекально.

Как правило, при внутривенном введении, композиции липидных частиц скомпонованы с подходящим фармацевтическим носителем. Многие фармацевтически приемлемые носители могут быть использованы в композициях и способах по настоящему изобретению. Подходящие композиции для использования в настоящем изобретении, можно найти, например, в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985). Могут быть использованы различные водные носители, например, вода, забуференная вода, 0,4% солевой раствор, 0,3% глицин и т.п., а также могут включать в себя гликопротеины для повышения стабильности, такие как альбумин, липопротеин, глобулин и т.д. Как правило, нормальный буферный солевой раствор (135-150 мМ NaCl), будет использован в качестве фармацевтически приемлемого носителя, но достаточно и других подходящих носителей. Эти композиции могут быть стерилизованы методами обычной липосомальной стерилизации, например, фильтрацией. Эти композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как корректирующие pH и буферные агенты, агенты, корректирующие концентрацию, смачивающие агенты и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, монолаурат сорбита, олеат триэтаноламина и т.д. Эти композиции могут быть стерилизованы с использованием методов, указанных выше, или, альтернативно, они могут быть изготовлены в стерильных условиях. Полученные водные растворы могут быть упакованы для использования или профильтрованы в асептических условиях и лиофилизированы, лиофилизированный препарат объединяют со стерильным водным раствором перед введением.

В некоторых случаях, липидные частицы, описанные в настоящем документе, могут быть доставлены с помощью перорального введения индивидууму. Частицы могут быть объединены с эксципиентами и использованы в виде таблеток для приема внутрь, буккальных таблеток, пастилок, капсул, пилюль, лепешек, эликсиров, жидкости для полоскания рта, суспензии, спрея, сиропов, вафель и т.п. (смотри, например, патенты США №№5641515, 5580579, и 5792451, раскрытие которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей). Эти пероральные лекарственные формы могут также содержать: связующие вещества, желатин; наполнители, смазывающие вещества и/или ароматизаторы. Когда единичная дозированная форма представляет собой капсулу, она может содержать, в дополнение к материалам, описанным выше, жидкий носитель. Различные другие материалы могут присутствовать в виде покрытия или для модификации физической формы дозированной единицы. Конечно, любой материал, используемый для приготовления любой лекарственной формы, должны быть фармацевтически чистым и по существу нетоксичным в используемых количествах.

Как правило, эти оральные препараты могут содержать, по меньшей мере, примерно 0,1% липидных частиц или более, хотя доля частиц может, конечно, варьироваться и может составлять от примерно 1% или 2% до примерно 60% или 70% или более по весу или объему от общего объема композиции. Естественно, что количество частиц в каждой терапевтически полезной композиции, которая может быть приготовлена, такое, что подходящая доза будет получена в любой момент из единичной дозы соединения. Такие факторы, как растворимость, биодоступность, биологический период полураспада, пути введения, срок годности продукта, а также другие фармакологические соображения будут понятны специалисту в данной области получения таких фармацевтических композиций, и, как таковые, различные дозировки и схемы лечения могут быть желательным.

Композиции, пригодные для перорального введения, могут включать: (a) жидкие растворы, такие как эффективное количество упакованного терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота (например, интерферирующяя РНК), суспендированные в растворителях, таких как вода, солевой раствор, или PEG 400; (b) капсулы, саше или таблетки, каждая из которых содержит заранее определенное количество терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота (например, интерферирующяя РНК), в виде жидкостей, твердых веществ, гранул, или желатина; (c) суспензии в соответствующей жидкости; и (d) подходящие эмульсии. Таблетированные формы могут включать в себя один или более компонентов из лактозы, сахарозы, маннита, сорбита, фосфата кальция, кукурузного крахмала, картофельного крахмала, микрокристаллическую целлюлозу, желатин, коллоидный диоксид кремния, тальк, стеарат магния, стеариновую кислоту и другие вспомогательные вещества, красители, наполнители, связующие вещества, разбавители, буферные агенты, увлажняющие агенты, консерванты, отдушки, красители, разрыхлители и их фармацевтически совместимые носители. Таблетированные формы могут включать терапевтический агент, такой как нуклеиновая кислота (например, интерферирующяя РНК) с ароматизатором, например, сахарозой, а также пастилки, содержащие терапевтический агент в инертной основе, такой как эмульсия, гель и тому подобное, содержащее желатин и глицерин, или сахарозу и гуммиарабик, содержащий, в дополнение к терапевтическому агенту, носители, известные в данной области.

В другом примере их использования, липидные частицы могут быть включен широкий диапазон актуальных лекарственных форм. Например, суспензия, содержащая частицы нуклеиновых кислот, липидов, такие как LNP могут быть изготовлены и введены в виде гелей, масел, эмульсий, кремов, паст, мазей, лосьонов, пен, муссы, и тому подобного.

При приготовлении фармацевтических препаратов из липидных частиц по настоящему изобретению, предпочтительно использовать количество частиц, которые были очищены, чтобы уменьшить или устранить пустые частицы или частицы с терапевтическими агентами, например, нуклеиновыми кислотами, связанными с наружной поверхностью.

Способы по настоящему изобретению могут быть реализованы в различных хозяевах. Предпочтительные хозяева включают виды млекопитающих, таких как приматы (например, человека и шимпанзе, а также других приматов), псовые, животные из семейства кошачьи, лошади, коровы, овцы, козы, грызуны (например, крыс и мышей), зайцеобразные и свиньи.

Количество вводимых частиц будет зависеть от соотношения терапевтического агента (например, нуклеиновых кислот) к липидам, особенно от используемого терапевтического агента (например, нуклеиновой кислоты), заболевание или расстройство, которое лечат, возраста, массы и состояния больного, и решения врача, но обычно составляет от примерно 0,01 до примерно 50 мг на килограмм веса тела, предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 5 мг/кг массы тела, или примерно 10⁸-10¹⁰ частиц на введение (например, инъекции).

Введение in vitro

Для применения in vitro, доставка терапевтических агентов, таких как нуклеиновые кислоты (например, интерферирующие РНК) может быть произведена в любую клетку, выращенную в культуре, будь она растительного или животного происхождения, позвоночных и беспозвоночных, и из любой ткани или типа. В предпочтительных вариантах реализации клетки представляют собой клетки животных, более предпочтительно клетки млекопитающих, и наиболее предпочтительно клетки человека (например, опухолевые клетки или гепатоциты).

Контакт между клетками и липидными частицами, когда осуществляется в условиях in vitro, происходит в биологически совместимом носителе. Концентрация частиц варьируется в широких пределах в зависимости от конкретного применения, но обычно составляет от примерно 1 мкмоль до примерно 10 ммоль. Лечение клеток липидными частицами обычно проводят при физиологических температурах (примерно 37°C) в течение периода времени от примерно 1 до 48 часов, предпочтительно от примерно 2 до 4 часов.

В одной группе предпочтительных вариантов реализации в суспензию липидных частиц добавляется 60-80% соединенных покрывающих клеток, имеющих плотность клеток от примерно 10³ до примерно 10⁵ клеток/мл, более предпочтительно примерно 2×10⁴ клеток/мл. Концентрация добавленной к клеткам суспензии составляет, предпочтительно, от примерно 0,01 до 0,2 мкг/мл, более предпочтительно примерно 0,1 мкг/мл.

Случаи, когда тканевые культуры клеток могут быть необходимыми, хорошо известны в данной области техники. Например, Freshney, Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3rd Ed., Wiley-Liss, New York (1994), Kuchler и др., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1977), и приведенные там ссылки дают общее руководство по культуре клеток. Культивируемые клеточные системы часто будут в виде монослоев клеток, хотя также используются клеточные суспензии.

Использование анализа Эндосомального параметра высвобождения (ERP) может оптимизировать эффективность доставки LNP или других липидных частиц по настоящему изобретению. ЕRР-анализ подробно описан в заявке на патент США №2003/0077829, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Более конкретно, цель ERP анализа состоит в возможности различать влияние различных катионных липидов и вспомогательных липидных компонентов LNP или других липидных частиц на основе их относительного влияния на связывание/поглощения или слияния с/дестабилизацию эндосомной мембраны. Этот анализ позволяет определить количественно, как каждый компонент LNP или других липидных частиц влияет на эффективность доставки, таким образом, оптимизировать LNP или другие липидные частицы. Как правило, ERP-анализ измеряет экспрессию репортерного белка (например, люциферазы, β-галактозидазы, зеленого флуоресцентного белка (GFP), и т.д.), а в некоторых случаях, LNP препарат, оптимизированный для экспрессии плазмиды, также может быть целесообразным для инкапсуляции интерферирующих РНК. В других случаях, ERP-анализ может быть выполнен с возможностью измерения понижающей регуляции транскрипции или трансляции последовательности-мишени в присутствии или в отсутствие интерферирующих РНК (например, миРНК). При сравнении ERP для каждого из различных LNP или других липидных частиц, можно легко определить оптимизированную систему, например, LNP или других липидных частиц, которая имеет наибольшее поглощение в клетке.

Клетки для доставки липидных частиц

Композиции и способы по настоящему изобретению используются для лечения широкого спектра типов клеток, in vivo и in vitro. Подходящие клетки включают гепатоциты, ретикуло-эндотелиальные клетки (например, моноциты, макрофаги и т.д.), фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки тромбоцитов, другие типы клеток, инфицированные и/или чувствительные к инфекции вирусами, гемопоэтические предшественники (стволовые) клетки, кератинопиты, скелетные и гладкие мышечные клетки, остеобласты, нейроны, покоящиеся лимфоциты, терминально дифференцированные клетки, медленные или нецикличные первичные клетки, паренхимные клетки, лимфоидные клетки, эпителиальные клетки, костные клетки, и тому подобное, но не ограничиваются ими.

В конкретных вариантах реализации активный агент или терапевтическое средство, такое как нуклеиновая кислота (например, интерферирующая РНК) поступает в раковые клетки (например, клетки твердой опухоли), включая клетки рака печени, клетки рака легких, рака толстой кишки, клетки рака прямой кишки, анальные раковые клетки, раковые клетки желчных протоков, клетки рака малой кишки, раковые клетки живота (желудка), раковые клетки пищевода, раковые клетки желчного пузыря, раковые клетки поджелудочной железы, раковые клетки аппендикса, раковые клетки груди, раковые клетки яичников, раковые клетки шейки матки, раковые клетки простаты, раковые клетки почки, раковые клетки центральной нервной системы, опухолевые клетки глиобластомы, раковые клетки кожи, клетки лимфомы, клетки хориокарпиномы, рак головы и шеи, раковые клетки остеогенной саркомы, и раковые клетки крови, но не ограничиваясь ими.

In vivo доставка липидных частиц, таких как LNP инкапсулированная нуклеиновая кислота (например, интерферирующая РНК) подходит для поражения клеток любого типа клеток. Способы и композиции могут быть использованы с клетками широкого спектра позвоночных, в том числе млекопитающих, таких как, например, псовые, животные семейства кошачьих, лошади, коровы, овцы, козы, грызуны (например, мыши, крысы и морские свинки), зайцеобразные, свиньи, и приматы (например, обезьяны, шимпанзе и люди).

Обнаружение липидных частиц

В некоторых вариантах реализации, липидные частицы по настоящему изобретению (например, LNP) могут быть обнаружены в субъекте через примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более часов. В других вариантах реализации, липидные частицы по настоящему изобретению (например, LNP) могут быть обнаружены у субъекта через примерно 8, 12, 24, 48, 60, 72 или 96 часов, или примерно 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 22, 24, 25, или 28 дней после введения частиц. Наличие частиц может быть обнаружено в клетке, ткани или других биологических образцах субъекта. Частицы могут быть обнаружены, например, путем прямого обнаружения частиц, обнаружением терапевтической нуклеиновой кислоты, такой как интерферирующие РНК (например, миРНК) последовательности, обнаружением интересующих последовательностей-мишеней (например, путем определения экспрессии или снижения экспрессии интересующей последовательности), или их комбинации.

Обнаружение частиц

Липидные частицы по настоящему изобретению, такие как LNP могут быть обнаружены с помощью любого способа, известного в данной области. Например, метка может быть присоединена непосредственно или опосредованно к компоненту липидной частицы с использованием способов, хорошо известных в данной области. Можно использовать широкий выбор меток. Выбор метки зависит от требуемой чувствительности, простоты сопряжения с компонентом липидной частицы, требований по устойчивости и доступных положений приборов и утилизации. Подходящие метки включают в себя спектральные метки, такие как флуоресцентные красители (например, флуоресцеин и его производные, такие как флуоресцеин изотиоцианат (FITC) и Зеленый орегон™; родамин и его производные, такие Техасский красный, тетрародимин изотиоцианат (TRITC), и т.д., дигоксигенин, биотин, фикоэритрин, АМСА, CyDyes™, и тому подобное; радиоактивные метки, такие как ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, ³²P, ³³P, и т.д.; ферменты, такие как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, и т.д.; спектральные колориметрические метки, такие как коллоидное золото или цветное стекло или пластиковые шарики, таких как полистирол, полипропилен, латекс и т.п., но не ограничиваются ими. Метки могут быть обнаружены с помощью любых средств, известных в данной области.

Обнаружение нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты (например, интерферирующие РНК) обнаружены и определены количественно в настоящем описание посредством любого из множества способов, хорошо известных специалистам в данной области. Обнаружение нуклеиновых кислот может происходить с помощью хорошо известных способов, таких как Саузерн-блоттинг, Нозерн-блоттинг, гель-электрофорез, PCR, радиомечения, сцинтилляционного подсчета и аффинной хроматографии. Также могут быть использованы дополнительные аналитические биохимические методы, такие как спектрофотометрия, рентгенография, электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ), и гипердиффузионная хроматография.

Выбор формата гибридизации нуклеиновых кислот не является критическим. Различные форматы гибридизации нуклеиновых кислот известны специалистам в данной области техники. Например, распространенные форматы включают сэндвич-анализ и конкурентный анализ или анализ замещения. Методы гибридизации, как правило, описаны, например, "Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach," Eds. Hames and Higgins, IRL Press (1985).

Чувствительность гибридизации может быть повышена за счет использования системы амплификации нуклеиновой кислоты, которая мультиплицирует нуклеиновую кислоту-мишень для обнаружения. Известны in vitro методы амплификации, пригодные для амплификации последовательностей для использования в качестве молекулярных зондов или для генерации фрагментов нуклеиновых кислот для последующего субклонирование. Примеры методов, достаточные для специалиста в данной области, такие как методы in vitro, в том числе амплификацию полимеразной цепной реакции (PCR), в лигазную цепную реакции (LCR), амплификацию Qβ-репликазы и другие РНК-полимераза опосредованные способы (например, NASBA™) находятся в Sambrook и др., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000); и Ausubel и др., Short Protocols in Molecular Biology, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, hie. (2002); а также патент США №4683202; PCR протоколы, Руководство по методам и применению (Innis и др. eds.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990); Amheim & Levinson (October 1, 1990), C&EN36; The Journal Of NIH Research, 3: 81 (1991); Kwoh и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173 (1989); Guatelli и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990); Lomell и др., J. Clin. Chem., 35: 1826 (1989); Landegren и др., Science, 241: 1077 (1988); Van Brunt, Biotechnology, 8: 291 (1990); Wu and Wallace, Gene, 4:560 (1989); Barringer и др., Gene, 89: 117 (1990); and Sooknanan and Malek, Biotechnology, 13: 563 (1995). Усовершенствованные методы клонирования in vitro амплифицированной нуклеиновой кислоты описаны в патенте США №5426039. Другие способы, описанные в данной области техники на основе амплифицированной последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA™, Cangene, Mississauga, Ontario) и Qβ-репликазные системы. Эти системы могут быть использованы для точного выявления мутантов, где PCR или LCR праймеры предназначены для продления или лигирования только тогда, когда выбранная последовательность присутствует. Альтернативно, выбранная последовательность может быть как правило, амплифицирована с использованием, например, неспецифических праймеров PCR и амплифицированная область-мишень позже зондируется на предмет определенной последовательности, указывающий на мутации. Раскрытие описанных выше ссылок включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Нуклеиновые кислоты для использования в качестве зондов, например, в in vitro способах амплификации, используют в качестве генных зондов или в качестве ингибитора компонентов, как правило, химически синтезированные в соответствии с твердой фазой фосфорамидитного триэфирного метода, описанного Beaucage и др.. Tetrahedron Letts., 22: 1859 1862 (1981), например, с использованием автоматического синтезатора, как описано в Needham VanDevanter и др., Nucleic Acids Res., 12: 6159 (1984). Очистка полинуклеотидов, в случае необходимости, как правило, выполняется либо нативным акриламидным гель-электрофорезом или анионообменной ЖХВР, как описано в Pearson и др., J. Chrom., 255: 137 149 (1983). Последовательность синтетических полинуклеотидов может быть проверена с помощью метода химической деградации в Махаm и Gilbert (1980) в Grossman и Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65: 499.

В качестве альтернативного средства для определения уровня транскрипции in situ выступает гибридизация. In situ гибридизационный анализ хорошо известен и, как правило, описан в Angerer и др., Methods Enzymol., 152: 649 (1987). В in situ гибридизации, клетки фиксируют на твердом носителе, обычно предметном стекле. Если проверяют ДНК, клетки денатурируют при нагревании или щелочи. Затем клетки вводят в контакт с раствором для гибридизации при умеренной температуре, чтобы произвести отжиг специфических зондов, которые помечены. Зонды предпочтительно помечены радиоактивными изотопами или люминесцентными репортерами.

Примеры

Настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью конкретных примеров. Следующие примеры представлены с целью иллюстрации, и не предназначены для ограничения изобретения никоим образом. Специалисты в данной области техники легко поймут множество некритических параметров, которые могут быть изменены или модифицированы с получением, по существу, тех же результатов.

Общие способы: Все реакции проводили при комнатной температуре при положительном давлении азота, если не указано иное. Все реагенты были приобретены из коммерческих источников и использовались без дополнительной очистки. Ход реакции контролировали с помощью TLC на силикагеле 60 F254 (0,25 мм, Е. Merck). Пятна были обнаружены в УФ-излучении или обугливания пятен анисовым альдегидом или сульфатом меди. Все хроматографии на колонке проводили на силикагеле 60 (40-60 мкМ). Соотношение между силикагелем и сырым продуктом находилось в диапазоне от 100 до 50:1. ¹Н NMR спектры регистрировали при 300 МГц или 400 МГц и химические сдвиги были внутренне привязаны к остаточному протонированному растворителю (7,27 промилле CHCl₃). Органические растворы концентрировали в вакууме при <40°C.

Пример 1

В этом примере описан синтез примерных, триалкиловых, катионных липидов по настоящему изобретению.

К охлажденному раствору (0°C) (Z)-дек-4-ен-1-ол 9 (20 г, 128.0 ммоль) и триэтиламин (26.7 мл, 191.9 ммоль) в безводном дихлорметане (200 мл) медленно добавили метансульфонилхлорид (14.9 мл, 191.9 ммоль). Раствор перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, затем разбавляли дихлорметаном (100 мл). Раствор промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия (3×150 мл) и затем объединенные водные фракции экстрагируют дихлорметаном (150 мл). Объединенные экстракты дихлорметана сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме досуха. Остаток фильтруют через слой силикагеля (100% дихлорметан) с получением (Z)-дек-4-енил метансульфоната 2 в виде желтого масла (28.5 г, 95%). Rf 0.5 (100% CH₂Cl₂).

К раствору (Z)-дек-4-енил метансульфоната 2 (28,5 г, 121,1 ммоль) в 2-метилтетрагидрофурана (280 мл) добавляли бромид тетрабутиламмония (48,8 г, 151,4 ммоль). Раствор перемешивали при 80°C в течение 30 минут в атмосфере азота, затем разбавляли эфиром (150 мл) и промывали водой (75 мл) и насыщенным раствором соли (75 мл). Эфирный раствор сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме досуха. Бледно-желтое масло фильтруют через слой двуокиси кремния (100% гексан) с получением (Z)-1-бромодек-4-ен 3 в виде бесцветного масла (23.0 г, 87%). Rf 0.9 (10% Этил ацетат-гексановый).

К суспензии магниевой стружки (1,4 г, 55,1 ммоль) в безводном THF (6 мл) в атмосфере азота медленно добавляли раствор (Z)-1-бромодек-4-ен 3 (11,5 г, 52,5 ммоль) в THF (12 мл). Реакционную смесь перемешивали при 45°C в течение 30 минут в атмосфере азота. Раствор охлаждают до 0°C и добавляют раствор этилового эфира муравьиной кислоты (4,1 г, 55,1 ммоль) в THF (12 мл) по каплям в течение 5 минут. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, затем охлаждали до -15°C и гасили медленно водой (10 мл), затем 5 М хлористоводородной кислотой (15 мл). После того, как магний полностью растворится, раствор разбавляют водой (50 мл) и экстрагируют гексаном (3×75 мл). Объединенные экстракты сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме досуха. Полученный остаток растворяют в этаноле (40 мл) и добавляют раствор гидроксида калия (4,4 г, 78,7 ммоль)) в воде (10 мл). Реакционную смесь энергично перемешивают в течение 30 мин, затем концентрируют в вакууме, удаляя этанол. Затем раствор подкисляют 5 М хлористоводородной кислотой (15 мл) и экстрагируют гексаном (3×75 мл). Объединенные гексановые экстракты сушат сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме досуха. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии (100% гексан к 2,5% этилацетату в гексане) с получением (6Z,15Z)-хеникоза 6,15-диен-11-ол 4 в виде бледно-желтого масла (5.6 г, 35%). Rf 0.4 (10% Этил ацетат-гексановый).

К охлажденному раствору (0°C) of 6Z,15Z)-хеникоза-6,15-диен-11-ол 4 (5.6 г, 18,2 ммоль) и триэтиламина (3,8 мл, 27,2 ммоль) в безводном дихлорметане (50 мл) медленно добавляют метансульфонилхлорид (2,1 мл, 27,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре, затем разбавляют дихлорметаном (50 мл). Раствор промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия (3×25 мл), затем объединенные водные фракции экстрагируют дихлорметаном (50 мл). Объединенные экстракты дихлорметана сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме досуха. Бледно-желтое масло фильтруют через слой двуокиси кремния (100% DCM) с получением (6Z,15Z)-хеникоза 6,15-диен-11-ил метансульфоната 5 в виде неочищенного бесцветного масла (7.6 г). Rf 0.8 (100% CH₂Cl₂).

Раствор (6Z,15Z)-хеникозы 6,15-диен-11-ил метансульфоната 5 (7,6 г, 19,6 ммоль) и цианида натрия (4,8 г, 98,1 ммоль) в безводном DMF (60 мл) нагревают до 60°С в течение ночи. По окончании, реакционную смесь выливают в воду (200 мл) и экстрагируют этилацетатом (3×100 мл). Комбинированные этилацетатные экстракты промывают насыщенным раствором соли (3×100 мл), сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме досуха. Полученный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии (100% гексан к 1% этилацетату в гексане) с получением (Z)-2-((Z)-дек-4-енил)додец-6-ененитрил 6 в виде бесцветного масла (6.6 г, 97%). Rf 0.75 (10% Этил ацетат-гексановый).

К охлажденному раствору (-78°C) (Z)-2-((Z)-дек-4-енил)додец-6-ененитрил 6 (4,0 г, 12,6 ммоль) в безводном дихлорметане (125 мл) медленно добавляют 1М раствор гидрида диизобутилалюминия в гексане (5,6 мл, 31,5 ммоль). Раствор нагревают до -15°C и перемешивают в течение 1 часа. После завершения реакции реакционную смесь гасят 5% хлористоводородной кислотой (30 мл) и перемешивают при -15°C пока выделение водорода не прекратилось. Затем раствор разбавляют дихлорметаном (75 мл) и органический слой промывают 5М хлористоводородной кислотой (100 мл). Дихлорметановые экстракты сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме досуха. Остаток очищают с помощью колоночной хроматографии (100% гексан к 2% этилацетату в гексане) с получением (Z)-2-((Z)-дек-4-енил)додец-6-аля 7 в виде бесцветного масла (3.9 г, 97%). Rf 0.65 (5% Этил ацетат-гексановый).

К суспензии магниевой стружки (0,6 г, 23,9 ммоль) в тетрагидрофуране (5 мл) медленно добавляют раствор (Z)-1-бромодек-4-ена 3 (4,5 г, 20,5 ммоль) в тетрагидрофуране (5 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре, затем добавляют раствор (Z)-2-((Z)-дек-4-енил)додец-6-аля 7 в тетрагидрофуране (5 мл). Раствор перемешивают в течение 15 минут при комнатной температуре, затем выливают в 5% хлористоводородную кислоту (50 мл) и лед (100 мл). Раствор экстрагируют эфиром (2×150 мл). Комбинированные эфирные экстракты сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме досуха. Остаток очищают с помощью колоночной хроматографии (1% этилацетат в гексане) с получением (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ола 8, как бесцветного масла (4.8 г, 76%). Rf 0.45 (10% Этил ацетат-гексановый).

К раствору (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ола 8 (0,4 г, 0,9 ммоль), 4-(диметиламино) бутановой кислоты гидрохлорида (0,2 г, 1,3 ммоль), гидрохлорида EDCI (0,25 г, 1,3 ммоль), диизопропилэтиламина (0,4 мл, 2,6 ммоль) в безводном дихлорметане (10 мл) добавляют диметиламинопиридин (5 мг). Раствор нагревают с обратным холодильником в течение 2 часов, затем перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов. Смесь концентрируют в вакууме досуха и очищают колоночной хроматографией (100% этилацетат) с получением 6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ил 4-(диметиламино) бутановой кислоты 9 в виде бледно-желтого масла. ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.36 (м, 6Н), 4.93 (м, 1Н), 2.30 (м, 4Н), 2.22 (с, 6Н), 2.03 (м, 12Н), 1.88 (м, 2Н), 1.66-1.18 (м, 31Н), 0.90 (м, 9Н). Rf 0.3 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

К раствору (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ола 8 (2,4 г, 5,2 ммоль), 6-бромгексановой кислоты (1,5 г, 7,8 ммоль), EDCI гидрохлорида (1,5 г, 7,8 ммоль), диизопропилэтиламина (2,0 г, 15,6 ммоль) в безводном дихлорметане (25 мл) добавляют диметиламинопиридин (15 мг). Раствор нагревают с обратным холодильником в течение 2 часов, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в вакууме досуха. Реакционную смесь очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле 60 (2" Ш ×10" Д; элюирование смесью 5% Этилацетат/гексан) с получением (6Z, 16Z)-12-((Z)-декабрь-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ил-6 бромогексаноата 10 в виде бесцветного масла (3.1 г, 94%). Rf 0.5 (10% Этил ацетат-гексановый).

К (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енилового) докоса-6,16-диен-11-ил 6-бомогексаноату 10 (3,1 г, 4,9 ммоль) в тефлоновом запечатаном сосуде высокого давления был добавлен 5,6 М диметиламин в этаноле (20 мл) и реакционную смесь нагревали до 70°C и перемешивали в течение ночи. После завершения реакционную смесь концентрировали в вакууме досуха. Остаток растворяли в этилацетате (100 мл) и промывали раствором бикарбоната натрия (2×50 мл). Этилацетатный слой сушили сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме досуха. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (100% Этилацетат) с получением (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ил 6-(диметиламино) гексановой кислоты 11 в виде бледно-желтого масла (2.0 г, 69%), ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.36 (м, 6Н), 4.93 (м, 1Н), 2.27 (м, 10Н), 2.00 (м, 12Н), 1.63 (м, 6Н), 1.51 (м, 6Н), 1.28 (м, 25Н), 0.90 (м, 9Н). Rf 0.3 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ил-6 бромогексаноата 10, (6Z, 16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ил-5 бромопентаноат 12 получают в виде бесцветного масла (3,3 г, 61%) из (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ола 8 (4,0 г, 8,7 ммоль), 6-бром-N-валериановой кислоты (2,4 г, 13,0 ммоль), EDCI гидрохлорида (2,5 г, 13,0 ммоль), диизопропилэтиламина (3,4 г, 26,0 ммоль) и диметиламинопиридина (10 мг). Rf 0.5 (10% Этил ацетат-гексановый).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-декабрь-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ил 6-(диметиламино)гексановой кислоты 11, (6Z, 16Z)-12-((Z)-декабрь-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ил 5-(диметиламино) пентановой кислоты 13 в виде бледно-желтого масла (1,9 г, 62%) с 5,6 М диметиламина в этаноле (20 мл). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.45-5.28 (м, 6Н), 4.95-4.90 (м, 1Н), 2.34-2.23 (м, 4Н), 2.23-2.20 (с, 6Н), 2.06-1.92 (м, 12Н), 1.70-1.58 (м, 5Н), 1.58-1.44 (м, 5Н), 1.44-1.15 (м, 25Н), 0.92-0.87 (м, 9Н). Rf 0.4 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

В колбу, содержащую (6Z, 16Z)-12-((Z)-нон-4-ен-1-ил)-трикоза 6,16-диен-11-ил 5-(диметиламино) пентановой кислоты 13 (200 мг, 0,34 ммоль) откачивали и обратно заполняли азотом (дважды), затем обрабатывали Pd/C (150 мг, 10% вес / вес), а затем суспендируют в ЕtOАс (10 мл). Реакционную колбу затем откачивают и обратно заполняют H₂ (3х) и смесь энергично перемешивают (18h). H₂ затем откачивают и колбу снова наполняют N₂. Реакционную смесь фильтруют через Целит, промывая фильтровальную лепешку этилацетатом, и фильтрат концентрируют. Сырой продукт подвергают хроматографии (этилацетат) с получением 12-нонилтрикозан-11-ил 5-(диметиламино) пентановой кислоты 14 (100 мг, 50%) в виде бесцветного масла. Rf 0.35 (10% CH₃OH-CH₂Cl₂); ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃, δ_н) 4.95-4.90 (м, 1Н), 2.31 (т, 2Н), 2.27 (т, 2Н), 2.21 (с, 6Н), 1.68-1.60 (м, 3Н), 1.58-1.42 (м, 5Н), 1.38-1.16 (м, 54Н), 0.88 (т, 6Н).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза (Z)-дек-4-енил метансульфоната 2, (Z)-нон-3-енил метансульфонат 15 получали в виде желтого масла (28,5 г, 92%) из (Z)-нон-3-ен-1-ол (20,0 г, 128,0 ммоль), триэтиламина (26,7 мл, 191,9 ммоль) и метансульфонилхлорида (14,9 мл, 191,9 ммоль). Rf 0.15 (30% Этил ацетат-гексановый).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза (Z)-1-бромодек-4-ена 3, (Z)-l-бромонон-3-ен 16 получали в виде бесцветного масла (27.0 г, количественно) из (Z)-дек-4-енил метансульфоната 15 (28.5 г, 129 ммоль) и тетрабутиламоний бромида (52.0 г, 161.4 ммоль). Rf 0.6 (10% Этил ацетат-гексановый).

В 100-мл круглодонную колбу помещают магниевую стружку (0,6 г, 25,7 ммоль) и мешалку. Колбу высушивают с использованием фена в течение 5 минут. В колбу загружают THF (5 мл) и одно зерно йода. Добавляют раствор (Z)-1-бромонон-3-ена (4,5 г, 22,0 ммоль) в THF (5 мл) медленно к смеси и реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 30 минут в атмосфере азота. Раствор охлаждают до комнатной температуры и раствор (Z)-2-((Z)-дек-4-енил) додец-6-аль 7 (4,7 г, 14,7 ммоль) был добавлен в THF (5 мл). Раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре и по окончании смесь выливают в 5% HCl (50 мл) и льда (100 мл). Раствор экстрагируют эфиром (2×150 мл) и объединенные эфирные экстракты сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме досуха. Остаток очищают с помощью колоночной хроматографии (колонка: 2 "W" ×8 л; с элюированием 100% гексаном к 5% этилацетата в гексане) с получением (6Z,15Z)-11-((Z)-4-дек-4-енил)-хеникоза 6,15-диен-10-ола 17 в виде бесцветного масла (5.4 г, 82%). Rf 0.5 (10% Этил ацетат-гексановый).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ил-6 бромогексаноат 10, (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-енил)-хеникоза 6,15-диен-10-ил-5 бромопентаноат 18 получают в виде бесцветного масла (0,9 г, 66%) из (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-енил)-хеникоза 6,15-диен-10-ола 17 (0,35 г, 0,7 ммоль), 5-бpoм-N-валериановой кислоты (0,60 г, 3,4 ммоль), EDCI (0,60 г, 3,4 ммоль), диизопропилэтиламин (0,90 г, 6,7 ммоль) и DMAP (5 мг, катализатор). Rf 0.5 (10% Этил ацетат-гексановый).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ил 6-(диметиламино)гексаноат 11, (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-енил)хеникоза-6,15-диен-10-ил 5-(диметиламино)пентаноат 19 получают в виде бесцветного масла (0.2 г, 24%) из 5.6 М диметиламина в этаноле (10 мл) и (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-енил)хеникоза-6,15-диен-10-ол 17 (0.35 г, 0.7 ммоль). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.40-5.28 (м, 6Н), 4.97-4.88 (м, 1Н), 2.35-2.24 (м, 4Н), 2.24-2.19 (м, 6Н), 2.08-1.93 (м, 12Н), 1.70-1.55 (м, 3Н), 1.55-1.45 (м, 5Н), 1.45-1.13 (м, 25Н), 0.93-0.82 (м, 9Н). Rf 0.4 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ил 6-бромогексаноат 10, (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-енил)хеникоза-6,15-диен-10-ил 6-бромогексаноат 20 получают в виде бесцветного масла (1.4 г, 99%) из (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-енил)хеникоза-6,15-диен-10-ол 17 (0.35 г, 0.7 ммоль), 6-Бромо-н-капроновой кислоты (0.70 г, 3.4 ммоль), EDCI (0.60 г, 3.4 ммоль), диизопропилэтиламин (0.90 г, 6.7 ммоль) и DMAP (5 мг, катазизатор). Rf 0.6 (10% Этил ацетат-гексановый).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ил 6-(диметиламино)гексаноат 11, (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-енил)хеникоза-6,15-диен-10-ил 6-(диметиламино) гексаноат 21 получают в виде бесцветного масла (1.2 г, 92%) из 5.6 М диметиамина в этаноле (15 мл). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.44-5.28 (м, 6Н), 4.95-4.88 (м, 1Н), 2.33-2.19 (м, 10Н), 2.08-1.90 (м, 12Н), 1.70-1.23 (м, 9Н), 1.23-1.14 (м, 26Н), 0.93-0.85 (м, 9Н). Rf 0.15 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

К раствору (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-енил)-хеникоза 6,15-диен-10-ола 17 (0,5 г, 1,1 ммоль), 4-(диметиламино) бутановой кислоты гидрохлорида (0,3 г, 1,7 ммоль), EDCI гидрохлорида (0,3 г, 1,7 ммоль), добавляли DIPEA (0,4 г, 3,4 ммоль) в безводном дихлорметане (10 мл) добавляют DMAP (5 мг). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи в атмосфере азота. Смесь концентрируют в вакууме досуха, затем помещали в DCM (150 мл) и экстрагировали насыщенным раствором бикарбоната натрия. Реакционную смесь очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле 60 (1:1 этилацетат/гексан) с получением (6Z,15Z)-11-((Z)-дек4-енил)-хеникоза 6,15-диен-10-ил 4-(диметиламино) бутановой кислоты 22 в виде бесцветного масла (0,4 г, 67%). 1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 5.40-5.28 (м, 6Н), 4.97-4.90 (м, 1Н), 2.36-2.25 (м, 4Н), 2.25-2.19 (м, 6Н), 2,07-1,95 (м, 12Н), 1.85-1.73 (м, 2Н), 1.58-1.45 (м, 3Н), 1.45-1.10 (м, 24Н), 0.93-0.85 (м, 9Н). Rf 0.4 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

Раствор (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енилового) докоса-6,16-диен-11-ола 8 (0,5 г, 1,1 ммоль) в безводном диэтиловом эфире (10 мл) медленно добавляли раствор дифосгена (0,2 мл, 1,8 ммоль) в безводном диэтиловом эфире, охлаждают примерно до -15°C. Раствор перемешивают в течение 1 часа, затем N,N,N'-триметил-1,3-пропандиамина (1.3 мл, 8.7 ммоль) добавляли при -15°C. Раствор нагревают до комнатной температуры, перемешивают в течение 1 часа, а затем фильтруют, чтобы удалить соли аммония и мочевины. Фильтрат диэтилового эфира упаривают в вакууме досуха. Остаток очищают с помощью колоночной хроматографии (100% этилацетат) с получением (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ил 3-(диметиламино) пропил (метил) карбамат 23 в виде бесцветного масла (0,15 г, 23%), 1Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 5.41-5.29 (м, 6Н), 4.85-4.77 (м, 1Н), 3.35-3.21 (м, 2Н), 2.93-2.81 (м, 3Н), 2.31-2.17 (м, 8Н), 2.08-1.92 (м, 12Н), 1.75-1.64 (м, 2Н), 1.64-1.15 (м, 31Н), 0,92-0,85 (м, 9Н). Rf 0.45 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ил 3-(диметиламино)пропил(метил)карбамат 23, (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ил 3-(диметиламино)пропилкарбамат 24 получают в виде бесцветного масла (0.1 г, 17%) из (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ол 8 (0.5 г, 1.1 ммоль), дифосген (0.2 мл, 1.8 ммоль), пиридин, и 3-(Диметиламино)-1-пропиламин (0.9 г, 8.7 ммоль). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.44-5.28 (м, 6Н), 4.81-4.72 (бс, 1Н), 4.55-4.45 (бс, 1Н), 3.34-3.15 (м, 3Н), 2.45-2.13 (м, 7Н), 2.10-1.86 (м, 12Н), 1.75-1.57 (м, 3Н), 1.57-1.03 (м, 30Н), 0.93-0.85 (м, 9Н). Rf 0.2 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ил 3-(диметиламино)пропил(метил)карбамат 23, (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ил 2-(диметиламино)пропилкарбамат 25 получают в виде бесцветного масла (0.20 г, 33%) из (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ол 8 (0.5 г, 1.1 ммоль), дифосген (0.2 мл, 1.8 ммоль) и N,N-диметилэтилендиамин (0.8 г, 8.7 ммоль). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.40-5.28 (м, 6Н), 5.08-5.01 (6с, 1Н), 4.82-4.73 (6с, 1Н), 3.30-3.18 (м, 2Н), 2.44-2.35 (м, 2Н), 2.30-2.20 (m, 6Н), 2.07-1.91 (м, 12Н), 1.65-1.11 (м, 31Н), 0.93-0.85 (м, 9Н). Rf 0.4 (10% MeOH-DCM).

Раствор (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-ен-1-ил)-докоса 6,15-диен-10-ола 17 (2,25 г, 5.036 ммоль) и пиридина (611 мкл, 7,6 ммоль) в безводном этилацетате (15 мл) добавляют к охлажденному (0°C) раствору дифосгена (910 мкл, 7,6 ммоль) в этилацетате (15 мл). После перемешивания (10 мин) реакционную смесь фильтруют и концентрируют, чтобы удалить растворитель и оставшийся газ фосген. Треть этой хлормуравьиной кислоты (0.879 г, 1.679 ммоль) растворяют в этилацетате (5 мл) и добавляют к охлажденному (0°C) раствору из N,N диметилэтилендиамин (367 мкл, 3,4 ммоль) в безводном этилацетате (5 мл). После перемешивания (20 минут), смесь фильтровали, концентрировали и подвергали хроматографии (100% этилацетат) с получением (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-ен-1-ил)-6 докоса, 15-диен-10-ил(2-(диметиламино)этил)карбаминовой кислоты 26 (603 мг, 64%) в виде прозрачного бесцветного масла. Rf 0,28 (10% MeOH/CH₂Cl₂); ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃,; H) 5.45-5.36 (м, 6Н), 5,30 (с, 1Н), 4.89-4.78 (м, 1Н), 3.32-3.21 (м, 2Н), 2,42 (т, 2Н), 2,25 (с, 6Н), 2.16-1.94 (м, 12Н), 1.63-1.19 (м, 29Н), 0.92 (т, 9Н).

К охлажденному (0°C) раствору эфира хлормуравьиной кислоты (0,88 г, 1,7 ммоль) (полученного в синтезе (6Z,15Z)-11-((Z)-декабрь-4-ен-1-ил)докоса-6,15-диен-10-ил(2-(диметиламино)этил)карбаминовой кислоты 26) растворяли в безводном этилацетате (5 мл) и добавляли к раствору в N,N диметилэтилендиамин (422 мкл, 3,4 ммоль) в безводном этилацетате (5 мл). По завершении (20 мин), раствор фильтровали, концентрировали и неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии (100% этилацетат) с получением (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-ен-1-ил)-докоса 6,15-диен-10-ил(3-(диметиламино)пропил)карбаминовой кислоты 27 (675 мг, 70%) в виде прозрачного бесцветного масла. Rf 0.32 (10% MeOH/CH₂Cl₂); ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃, δ_н) 5.44-5.33 (м, 6H), 4.86-4.78 (м, 1Н), 3.32-3.21 (м, 2Н), 2,36 (т, 2Н), 2,24 (с, 6Н), 2.14-1.97 (м, 12Н), 1,69 (приложение, п, 2Н), 1,61-1,50 (м, 3Н), 1,50-1,20 (м, 27Н), 0,91 (т, 9Н).

К охлажденному (0°C) раствору эфира хлормуравьиной кислоты (0,88 г, 1,7 ммоль) (полученного в синтезе (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-ен-1-ил)докоса-6,15-диен-10-ил(2-(диметиламино)этил)карбаминовой кислоты 26) растворяли в безводном этилацетате (5 мл) и добавили к раствору N,N,N' диметилэтилендиамин (492 мкл, 3,4 ммоль) в безводного этилацетате (5 мл). По завершении (20 мин), раствор фильтровали, концентрировали и неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии (100% этилацетат) с получением (6Z,15Z)-11-((Z)-дек-4-ен-1-ил)-хеникоза 6,15-диен-10-ил(3-(диметиламино)пропил)(метил)карбамат 28 (672 мг, 68%) в виде прозрачного бесцветного масла. Rf 0.44 (10% MeOH/CH₂Cl₂); ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃, δ_н) 5.43-5.32 (м, 6H), 4,85 (шир. С, 1Н), 3.38-3.27 (м, 2Н), 2.95-2.87 (м, 3Н), 2,28 (т, 2Н), 2,24 (с, 6H), 2.14-1.96 (м, 12Н), 1,72 (приложение, п, 2Н), 1.67-1.49 (м, 3Н), 1.49-1.20 (м, 26Н), 0,91 (т, 9Н).

В 100-мл круглодонную колбу добавляли магниевую стружку (263 мг, 10,9 ммоль) и магнитную мешалку. Колбу высушивают с использованием фена в течение 5 мин, охлаждают в атмосфере азота до THF (5 мл) и добавляли небольшое зерно йода. Был добавлен раствор (Z)-1-бромодек-4-ен 3 (2 г, 9,1 ммоль) в THF (5 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, затем добавляли этиловый глиоксалат (0,375 мл, 1,82 ммоль, 50% раствор в толуоле). По окончании раствор гасили насыщенным раствором хлорида аммония (5 мл) и перемешивали до тех пор, пока не растворится избыток магния. Раствор разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом (3×50 мл). Объединенные экстракты сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме досуха. Остаток очищают с помощью колоночной хроматографии (100% гексан к 20% этилацетата в гексане) с получением (6Z,16Z)-11-((Z)-дек-4-енил) докоса-6,16-диен-11,12 диол 29 в виде бесцветного масла (700 мг, 48%).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ил 4-(диметиламино)бутановой кислоты 9, (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-12-гидроксидокоса-6,16-диен-11-ил 4-(диметиламино)бутановой кислоты 30 в виде бесцветного масла (0,10 г, 25%) из (6Z,16Z)-11-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11,12-диола (0,35 г, 0,7 ммоль), 4-(диметиламино) бутановой кислоты гидрохлорид (0,20 г, 1,1 ммоль), EDCI (0,20 г, 1,1 ммоль), диизопропилэтиламин (0,3 г, 2,2 ммоль) и DMAP (5 мг, катализатор). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.44-5.28 (м, 6Н), 5.03-4.95 (м, 1Н), 2.25-2.17 (м, 6Н), 2.14-1.65 (м, 14Н), 1.65-1.10 (м, 33Н), 0.93-0.82 (м, 9Н). Rf 0.2 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил) докоса-6,16-диен-11-ил 4-(диметиламино)бутановой кислоты 9, (6Z,16Z)-12-((Z)-декабрь-4-енил)-12-гидроксидокоса-6,16-диен-11-ил 3-(диметиламино)пропаноат 31 получают в виде бесцветного масла (0,4 г, 33%) из (6Z,16Z)-11-((Z)-дек-4-енил) докоса-6,16-диен-11,12-диола (1,0 г, 2,1 ммоль), 4-(диметиламино) бутановой кислоты гидрохлорид (0,50 г, 3,1 ммоль), EDCI (0,60 г, 3,1 ммоль), диизопропилэтиламин (0,80 г, 6,3 ммоль) и DMAP (5 мг, катализатор). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.40-5.28 (м, 6Н), 5.12-5.07 (м, 1Н), 4.75-4.55 (шс, 1Н), 2.77-2.65 (м, 1Н), 2.65-2.41 (м, 3Н), 2.28-2.15 (м, 6Н), 2.15-1.92 (м, 12Н), 1.67-1.10 (м, 30Н), 0.93-0.82 (м, 9Н). Rf 0.5 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 2, (Z)-нон-3-енил метансульфонат 33 получают в виде масла желтого цвета (33 г, 85%) из (Z)-нон-3-ен 1-ола 32 (25,0 г, 176 ммоль), триэтиламина (25,0 мл) и метансульфонилхлорид (27,2 мл, 352 ммоль). Rf 0.68 (CH₂Cl₂).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 3, (Z)-нон-3-енил бромида 34 получали в виде желтого масла (20,2 г, 85%) из (Z)-нон-3-енил метансульфонат (25,7 г, 117 ммоль) и бромид тетрабутиламмония (52,6 г, 163 ммоль). Rf 0,73 (гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 4, (6Z, 13Z)-нондека 6,13-диен-10-ола 35 (9,11 г, 85%) получают в виде бесцветного масла из (Z) нон-3-енил бромид (15,8 г, 76,8 ммоль), магниевой стружки (2,0 г, 82 ммоль), этилформиата (6,36 мл, 79,1 ммоль) и гидроксида калия (3,88 г, 69,1 ммоль). Rf 0,43 (10% этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 5, (6Z,13Z)-нондека 6,13-диен-10-ил метансульфоната 36 (11,6 г, 99%) получают в виде бесцветного масла из (6Z,13Z)-нондека 6,13-диен-10-ол (9,11 г, 32,5 ммоль), триэтиламин (10 мл) и метансульфонилхлорид (5,0 мл, 65 ммоль). Rf 0.73 (CH₂Cl₂).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 6, (Z)-2-((Z)-нон-3-ен-1-ил)ундец-5-еннитрила 37 (7,2 г, 77%) получают в виде бесцветного масла из (6Z,13Z)-нондека-6,13-диен-10-ил метансульфонат (11,6 г, 32,3 ммоль) и цианида натрия (3,96 г, 80,9 ммоль). Rf 0,75 (10% этилацетат-гексан).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 7, (Z)-2-((Z)-нон-3-ен-1-ил) ундец-5-аля 38 (5,0 г, 69%) получают в виде бесцветного масла из (Z)-2-((Z)-нон-3-ен-1-ил)ундец-5-еннитрил (7,2 г, 24,9 ммоль) и DIBAL (49,7 мл, а 1 М раствора в гексан, 49,7 ммоль). Rf 0,69 (10 этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 8, (6Z,14Z)-11-((Z)-нон-3-ен-1-ил)-икоса 6,14-диен-10-ола 39 (1,64 г, 76%) получают в виде бесцветного масла из (Z)-2-((Z)-нон-3-ен-1-ил)ундец-5-аль (1,5 г, 5,1 ммоль), (Z) нон-3-енил бромид (1,58 г, 7,7 ммоль) и магниевой стружки (206 мг, 8,5 ммоль). Rf 0,46 (10% этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 9, (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-ен-1-ил) докоса-6,16-диен-11-ил 4-(диметиламино)бутановой кислоты 40 (483 мг, 76%) получают в виде бесцветного масла из (6Z,14Z)-11-((Z)-нон-3-ен-1-ил)-икоса 6,14-диен-10-ола (500 мг, 1,19 ммоль), EDC (686 мг, 3,58 ммоль), основание Хюнига (726 мкл, 4.17 ммоль) и гидрохлорид N,N-диметиламинобутировой кислоты (600 мг, 3,58 ммоль). Rf 0.43 (10% CH₃OH-CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 10, (6Z,14Z)-11-((Z)-нон-3-ен-1-ил)-икоса 6,14-диен-10-ил 5-бромопентаноата 41 (655 мг, 95%) получают в виде бесцветного масла из (6Z,14Z)-11-((Z)-нон-3-ен-1-ил)-икоса 6,14-диен-10 ол (500 мг, 1,19 ммоль), EDC (686 мг, 3.58 ммоль) и 5-бромвалериановой кислоты (649 мг, 3.58 ммоль). Rf 0,54 (5% этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 11, (6Z,14Z)-11-((Z)-нон-3-ен-1-ил)-икоса 6,14-диен-10-ил 5-(диметиламино) пентановой кислоты 42 (421 мг, 68%) получают в виде бесцветного масла из (6Z,14Z)-11-((Z)-нон-3-ен-1-ил)-икоса 6,14- диен-10-ил-5 бромопентаноат (655 мг, 1.13 ммоль) и диметиламина (25 мл в виде раствора в 5,6 М EtOH). Rf 0.4 (10% CH₃O-CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 4, хеникозан-11-ола 44 (7,06 г, 99%) получают в виде бесцветного масла из бромдекана (9,4 мл, 45.2 ммоль), стружка магния (1,18 г, 48.4 ммоль), этилформиат (3,74 мл, 46.6 ммоль) и гидроксид калия (2,28 г, 40.7 ммоль). Rf 0,36 (10% этилацетат-гексан), FW 312.57, C₂₁H₄₄O.

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 5, хеникозан-11-илметансульфонат 45 (6,87 г, 78%) получают в виде бесцветного масла из хеникозан-11-ола (7,06 г, 22.6 ммоль), триэтиламина (22 мл) и метансульфонилхлорид (3,5 мл, 45 ммоль). Rf 0.86 (CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 6, 2-децилдодеканенитрил 46 (2,25 г, 40%) получают в виде бесцветного масла из хеникозан-11-ил метансульфонат (6,87 г, 17.6 ммоль) и цианида натрия (4,31 г, 87.9 ммоль). Rf 0,84 (10% этилацетат-гексан).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 7, 2-децилдодеканал 47 (1,91 г, 84%) получают в виде бесцветного масла из 2-децилдодеканенитрила (2,25 г, 7.0 ммоль) и DIBAL (14 мл, в виде раствора 1 М в гексане, 14 ммоль). Rf 0,51 (5% этилацетат-гексан).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 8, (Z)-12-децилдокос-6-ен-11-ола 48 (1,08 г, 40%) получают в виде бесцветного масла из 2-децилдодеканала (1,91 г, 5.87 ммоль), (Z)-дек-4-енил бромид (1,45 г, 7.05 ммоль) и магниевых стружек (183 мг, 7.54 ммоль). Rf 0,26 (10% этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 10, (Z)-12-децилдокос-6-ен-11-ил-5 бромопентаноат 49 (916 мг, 63%) получают в виде бесцветного масла из от (Z)-12-децилдокос-6-ен-11-ол (1,08 г, 2.33 ммоль), EDC (804 мг, 4.19 ммоль) и 5-бромвалериановой кислоты (1,27 г, 6.99 ммоль). Rf 0,29 (5% этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 11 (Z)-12-децилдокос-6-ен-11-ил 5-(диметиламино) пентановой кислоты 50 (662 мг, 80%) получают в виде бесцветного масла из (2)-12-децилдокос-6-ен-11-ил-5 бромопентаноата (916 мг, 1.16 ммоль) и диметиламина (27 мл в виде раствора 5,6 М EtOH). Rf 0.51 (10% CH₃OH-CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 8 (Z)-12-((Z)-дек-4-ен-1-ил)докос-16-ен-11-ола 51 (3,37 г, 65%) получают в виде бесцветного масла из (Z)-2-((Z)-дек-4-енил) додец-6-аль 7 (3,6 г, 11.2 ммоль), 1-бромдекан (3,5 мл, 16,9 ммол) и магниевой стружки (438 мг, 18.0 ммоль). Rf 0,31 (5% этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 10 (Z)-12-((Z)-дек-4-ен-1-ил)докос-16-ен-11-ил-5 бромопентаноат 52 (4,69 г, 99%) получают в виде бесцветного масла из от (Z)-12-((Z)-дек4-ен-1-ил) докос-16-ен-11-ол (3,37 г, 7,29 ммоль), EDC (2,51 г, 13.1 ммоль) и 5-бромвалериановой кислоты (3,96 г, 21.8 ммоль). Rf 0,56 (5% этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 11 (Z)-12-децилдокос-6-ен-11-ил 5-(диметиламино) пентановой кислоты 53 (943 мг, 99%) получают в виде бесцветного масла из (Z)-12-децилдокос-6-ен-11-ил-5 бромопентаноат (1,0 г, 1,6 ммоль) и диметиламина (30 мл в виде раствора 5,6 М EtOH). Rf 0.50 (10% CH₃OH-CH₂Cl₂).

Пример 2

Этот пример сравнивает эффективность, в мышиной модели активности АроВ миРНК, триалкиламин липидов коротких цепей по настоящему изобретению с липидами, имеющими более длинные алкильные цепи, но которые в противном случае конструктивно идентичны с короткой цепью триалкиламин липидов.

Композиции нуклеиновых кислотно-липидных частиц содержащие катионные липиды оценивали по их способности останавливать экспрессию АроВ в печени от 7 до 9-недельных самок BALB/c мышей. Мышам вводили внутривенно (в хвостовую вену) в группах по три на каждую 0,02, 0,03 или 0,05 мг/кг. Остановка АроВ (нормализованный конститутивный ген GAPDH) было измерено по отношению к PBS в качестве отрицательного контроля. Каждый эксперимент был прекращен через 48 часов после приема препарата.

Для сравнения в качестве положительного контроля, производительность короткой цепи триалкиламин липидов по настоящему изобретению сравнивали с высококатионным липидом, называют C2K, который, как известно, облегчает доставку нуклеиновых кислот in vivo, в нуклеиновые кислотно-липидные частицы (Nature Biotech., Vol 28(2), 172 (2010)). C2K имеет следующую структуру:

Как показано в таблице 1, при введении дозы от 0,02 мг/кг, 10 из 11 катионных липидов по настоящему изобретению (соединения 9, 13, 14, 19, 22, 27, 40, 42, 50 и 53) отображают большую активность, чем C2K.

Как показано в таблице 2, В отдельном эксперименте, при введении дозы 0,03 мг/кг, 5 из 7 катионных липидов по настоящему изобретению (соединения 11, 13, 19, 23, и 25) отображают большую активность, чем C2K.

Активность катионных липидов по настоящему изобретению также сравнивали с соответствующими триалкилзамещенными катионными липидами, которые структурно идентичны липидам по настоящему изобретению, за исключением того, что алкильные цепи длиннее. Структуры этих удлиненных цепей триалкиламин катионные липиды (определены как соединения 54, 55, 56, 57, 58, 59 и 60) приведены в таблице 3.

Соединения 54, 55, 56, 57, 58, 59 и 60 были получены в соответствии с процедурами, описанными в заявке на патент США №13/235253, поданной 16 сентября 2011, которая включена в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

Как показано в таблице 4, более длинные цепи липидов 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 вводили в количестве 0,05 мг/кг (2,5 раза дозу, описанную в таблице 1), и отображаются АроВ нокдаун охватывая от +25% до -69% по сравнению с 60% в C2K (то есть, некоторые соединения отображают умеренное улучшение по сравнению C2K).

В целом, активность более короткой цепи (C9-C10) триалкиловых катионных липидов настоящего изобретения была существенно улучшена по сравнению с соответствующей длинной цепью, трилинолеил (C18) соответствующего липида. Например, непосредственное сравнение соединения 13 с его трилинолеил вариантом 54 показало, что усовершенствование от -6% (0,05 мг/кг) до -80% (0,02 мг/кг) в АроВ нокдауне, несмотря на то, что соединение 13 вводили 2,5 раза меньше. Та же тенденция наблюдается при сравнении соединений 55 до 11, 56 до 24 и 57 до 25.

Пример 3

Дополнительные эксперименты в мышиной модели АроВ использовали другой катионный липид в качестве положительного контроля; DLIN-MP-DMA. DLIN-MP-ДМА описан в заявке на патент WO 2011/141705, и имеет структуру:

DLin-MP-DMA

Как показано в таблице 5, в той же мышиной модели АроВ, было показано, что DLIN-MP-ДМА более эффективен, чем C2K в трех отдельных экспериментах, и, следовательно, выбран положительным контролем:

В другом эксперименте, еще два липида по настоящему изобретению (соединения 62 и 71) были заключены в липидные наночастицы с миРНК для поражения АроВ. Мышам вводили дозы внутривенно (в хвостовую вену) и умерщвляли через 48 ч после приема препарата. Печень собирали и гомогенизировали, а уровень выключения АроВ (нормализованный конститутивный ген GAPDH), измеряли с помощью Quantigene Assay. Результаты показаны в Таблице 6 и выражены в виде процента по отношению к PBS-обработанному отрицательному контролю. МиРНК последовательности, используемые в этом эксперименте, были отличными и менее мощными, чем используемые в примере 2. Сравнения между экспериментами поэтому невозможно.

Соединение 71 имело схожую активность с контролем DLIN-MP-DMA. Соединение 62 было значительно более активным. Синтез этих и других соединений описан в примере 4.

Пример 4

Этот пример описывает синтез дополнительных соединений настоящего изобретения.

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 5, (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-ен-1-ил)докоса-6,16-диен-11-ил метансульфонат 61 (1,18 г, 90%) получают в виде бесцветного масла из (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-ен-1-ил)докоса-6,16-диен-11-ол 8 (1,12 г, 2.43 ммоль), триэтиламина (8 мл) и метансульфонилхлорид (0,38 мл, 4,9 ммоль). Rf 0.91 (CH₂Cl₂).

Раствор мезилата 61 (1,09 г, 2.01 ммоль) в толуоле (30 мл) последовательно обрабатывали N,N-диметиламинобутанолом (1.34 мл, 10.1 ммоль) и NaH (442 мг в виде 60% дисперсии в масле, 11,1 ммоль). После прекращения выделения газа реакционную смесь нагревали с обратным холодильником (115°C темп. ванны) и перемешивали (50 часов). Реакционную смесь затем охлаждали (RT) и выливали в холодную воду, и затем экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали водой и солевым раствором, сушат (Na₂SO₄), фильтруют, концентрируют и очищают с помощью хроматографии (100% этилацетат) с получением 4-(((6Z,16Z)-12-((Z)-4-декен-1-ил)докоса-6,16-диен-11-ил)окси-N,N-диметилбутан-1-амин 62 (143 мг, 13%) в виде бледно-желтого масла. ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.41-5.30 (м, 6Н), 3.46-3.35 (м, 2Н), 3.19-3.14 (м, 1Н), 2,34 (т, 2Н), 2,24 (с, 6Н), 2.10-1.93 (м, 12Н), 1.60-1.09 (м, 35Н), 0,90 (т, 9Н). Rf 0.54 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 5, 3,7-диметилоктил метансульфонат 63 (7,47 г, >99%) получают в виде бесцветного масла из 3,7-диметилоктан-1-ола (5,0 г, 31.6 ммоль), триэтиламина (8 мл) и метансульфонилхлорида (4,89 мл, 63.2 ммоль). Rf 0.69 (CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 3, 1-бром-3,7-диметилоктан 64 получают в виде бесцветного масла (6,0 г, 86%) из 3,7-Диметилоктил метансульфоната 63 (7,47 г, 31,6 ммоль) и тетрабутиламмоний бромид (13,2 г, 41,1 ммоль). Rf 0,92 (гексан).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 4, 2,6,12,16-тетраметилгептадекан-9-ола 65 (7,0 г, выход количественный) получали в виде бесцветного масла из 1-бром-3,7-диметилоктана 64 (10 г, 45,2 ммоль), магниевых стружек (1,21 г, 49,8 ммоль), этилформиат (3,8 мл, 47,5 ммоль) и гидроксид калия (3,8 г, 67,8 ммоль). Rf0,38 (10% этилацетат-гексан).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 5, 2,6,12,16-тетраметилгептадекан-9-ил метансульфонат 66 (1,56 г, 87%) получают в виде бесцветного масла из 2,6,12,16-тетраметилгептадекан-9-ола 65 (1,39 г, 5,14 ммоль), триэтиламин (3 мл) и метансульфонилхлорид (0,8 мл, 10.3 ммоль). Rf 0.8 (CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 6, 2-(3,7-диметилоктил) -5,9-диметилдеканенитрил 67 (0,8 г, 56%) получают в виде бесцветного масла из 2,6,12,16-тетраметилгептадекан-9-ил метансульфоната 66 (1,56 г, 4,48 ммоль) и цианид натрия (0,55 г, 11,2 ммоль). Rf 0,8 (10% этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 7, 2 (3,7-диметилоктил)-5,9-диметилдеканал 68 (0,63 г, 78%) получают в виде бесцветного масла из 2-(3,7-диметилоктил)-5,9-диметилдеканенитрила 67 (0,8 г, 2,49 ммоль) и DIBAL (5,74 мл виде 1М раствора в гексане, 5,74 ммоль). Rf 0.6 (10% этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 8, 10 (3,7-диметилоктил)-2,6,13,17-тетраметилоктадекан-9-ола 69 (0,53 г, 62%) получают в виде бесцветного масла из 2-(3,7-диметилоктил)-5,9-диметилдеканала 68 (0,6 г, 1,85 ммоль), 1-бром-3,7-диметилоктана 64 (2,0 г, 9,0 ммоль) и магниевой стружки (232 мг, 9,67 ммоль). Rf 0,37 (10% этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 10, 10 (3,7-диметилоктил)-2,6,13,17-тетраметилоктадекан-9-ил-5 бромопентаноат 68 (450 мг, неочищенный) в виде желтого масла из 10-(3,7-диметилоктил)-2,6,13,17-тетраметилоктадекан-9-ола 69 (200 мг, 0,43 ммоль), EDC (246 мг, 1,28 ммоль) и 5-бромвалериановой кислоты (246 мг, 1,28 ммоль). Rf 0,49 (5% EtOAc-гексан).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 11, 10 (3,7-диметилоктил)-2,6,13,17-тетраметилоктадекан-9-ил 5-(диметиламино) пентановой кислоты 71 (184 мг, 72% 2 шагов) получали в виде бесцветного масла из 10-(3,7-диметилоктил) -2,6,13,17-тетраметилоктадекан-9-ил-5 бромопентаноат 68 (450 мг сырого) и диметиламина (10 мл 2,0 М в качестве раствора EtOH). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 4.95-4.87 (м, 1Н), 2.33 (т, 2Н), 2.28 (т, 2Н), 2.23 (с, 6Н), 1.74-1.60 (м, 4Н), 1.58-0.99 (м, 37Н), 0.93-0.79 (м, 27Н). Rf 0.43 (10% CH₃OH-CH₂Cl₂).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 8, (Z)-10-((Z)-дек-4-ен-1-ил)-2,6-диметиликоз-14-ен-9-ол 72 (0,62 г, 72%) получают в виде бесцветного масла из (Z)-2-((Z)-дек-4-енил)додец-6-аля 7 (0,6 г, 1,87 ммоль), 1-бром-3,7-диметилоктана 64 (3,9 г, 17,5 ммоль) и магниевой стружки (454 мг, 18,7 ммоль). Rf 0,61 (10% этилацетат-гексан).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 10, (Z)-10-((Z)-дек-4-ен-1-ил)-2,6-диметиликоз-14-ен-9-ил 5-бромопентаноат 73 (900 мг, неочищенный) в виде желтого масла из (Z)-10-((Z)-дек-4-ен-1-ил)-2,6-диметиликоз-14-ен-9-ола 72 (620 мг, 1.34 ммоль), EDC (500 мг, 2,6 ммоль) и 5-бромвалериановой кислоты (500 мг, 2.56 ммоль). Rf 0,72 (10% этилацетат-гексан).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза 11, (Z)-10-((Z)-дек-4-ен-1-ил)-2,6-диметиликоз-14-ен-9-ил 5-(диметиламино) пентановой кислоты 74 (466 мг, 58% 2 стадии) получали в виде бесцветного масла из (Z)-10-((Z)-декабрь-4-ен-1-ил)-2,6-диметиликоз-14 ен-9-ил-5 бромопентаноат 73 (900 мг, сырого) и диметиламина (15 мл в виде раствора 2,0 М EtOH). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.43-5.29 (м, 4Н), 4.94-4.88 (м, 1Н), 2.32 (t, 2Н), 2.26 (т, 2Н), 2.15 (с, 6Н), 2.08-1.93 (м, 8Н), 1.70-1.00 (м, 43Н), 0.95-0.83 (м, 15Н). Rf 0.42 (10% CH₃OH-CH₂Cl₂).

Раствор 5-бромпентан-1-ола (1,0 г, 5.99 ммоль) был подготовлен с диметиламином (10 мл, в 2 М раствора в этаноле) в герметичном сосуде и нагревали (80°C). После перемешивания (16 ч) диметиламин и этанол удаляли при пониженном давлении с получением 5-(диметиламино) пентан-1-ола 75 (1,26 г, количественный выход) в виде желто-оранжевого твердого вещества. Rf 0.25 (10% CH₃OH-CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, описанной для синтеза 62, 5-(((6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-ен-1-ил)докоса-6,16-диен-11-ил)окси)-N,N-диметилпентан-1-амин 76 (864 мг, 37%) получают в виде бледно-желтого масла из (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-ен-1-ил)докоса-6,16-диен-11-илметансульфонат 61 (1,86 г, 3.45 ммоль), 5-(диметиламино) пентан-1-ола 75 (1,26 г, 5.99 ммоль) и NaH (288 мг в виде 60% дисперсия в масле, 7,2 ммоль). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.43-5.32 (м, 6Н), 3.46-3.33 (м, 2Н), 3.18-3.12 (м, 1Н), 2.30-2.18 (м, 8Н), 2.07-1.93 (м, 12Н), 1.61-1.04 (м, 37Н), 0.89 (т, 9Н). Rf 0.47 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

К охлажденному раствору (-15°C) (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ол 8 (5 г, 10,9 ммоль) в был добавлен безводный дихлорметан (125 мл) в атмосфере азота, по каплям, диэтиловый цинк (1 М в гексане, 82 мл, 81,8 ммоль) в течение 20 минут. Раствор перемешивали в течение 70 минут при 0°C, затем дийодметаном (6,6 мл, 81,8 ммоль) осторожно добавляли. Раствор перемешивают в течение ночи, позволяя ему нагреться до комнатной температуры. По окончании этого, раствор выливают в ледяную воду (350 мл) и разбавляют этилацетатом (450 мл). Затем добавляют 5% HCl (350 мл), чтобы помочь смягчить эмульсию, которая была создана. Органический слой промывали насыщенным NaHCO₃ (СБ водн. 500 мл), водой (500 мл) и солевым раствором (500 мл). Объединенные водные слои снова экстрагируют этилацетатом. Объединенные органические экстракты сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме досуха. Остаток очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (2,5% этилацетата в гексане) с получением розового цвета масла. Чтобы удалить цвет (b), очищенный продукт растворяют в дихлорметане (150 мл) и промывают Na₂S₂O₃ (сат. вод. 2×40 мл) с получением 1,8-бис(2-пентилциклопропил-5(3-(2-пентилциклопропил)пропил)октан-4-ола 77 в виде бледно-желтого масла (5,54 г, 96.5%).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ил 6 бромогексаноат 10, 1,8-бис(2-пентилциклопропил)-5(3-(2-пентилциклопропил)пропил)октан-4-ил-6 бромогексаноат был получен в виде неочищенного масла из 1,8-бис (2-пентилциклопропил)-5(3-(2-пентилциклопропил)пропил)октан-4-ил 6-(диметиламино)гексановой кислоты (0,75 г, 1,5 ммоль), безводный дихлорметан (5.2 мл), 6-бромгексановой кислоты (0,88 г, 4,5 ммоль), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид (0,87 г, 4,5 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (5 мг). Продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

В соответствии с процедурой, что описана для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ил 6-(диметиламино) гексаноат 11, получают в виде масла (0,56 г, 59%) из 1,8-бис(2-пентилциклопропил)-5(3-(2-пентилциклопропил)пропил)октан-4-ил-6 бромогексаноата (1,0 г, 1,5 ммоль) и 2,0 М раствора диметиламина в этаноле (3,5 мл). Rf 0.50 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

К раствору 2-октилдодекан-1-ола (20 г, 67,0 ммоль) в безводном дихлорметане (500 мл) добавляли пиридинийхлорхромат (43,2 г, 200 ммоль). Раствор перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре, затем фильтруют через слой двуокиси кремния, элюируя смесью дихлорметана с получением 2-октилдодеканал 80 в виде бесцветного масла (10,5 г, 50%).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза (6Z,15Z)-хеникоза 6,15-диен-11-ол 4, (Z)-12-октилдокос-6-ен-11-ола 81 получают в виде бесцветного масла (0,67 г, 92%) из 2-октилдодеканала 80 (0,5 г, 1,6 ммоль), (Z)-1-бромодек-4-ена (0,7 г, 3,1 ммоль), магния (80 мг, 3,4 ммоль), безводного тетрагидрофурана (0,5 мл), воды (2 мл), этанола (2 мл) и КОН (0,2 г, 2,8 ммоль).

Использовав процедуру, аналогичную той, что описана для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил) докоса-6,16-диен-11-ил 6 бромогексаноат 10, (2)-12-октилдокос-6-ен-11-ил-6 бромогексаноат 82 получают в виде бесцветного масла (0,78 г, 85%) из (Z)-12-октилдокос-6-ен-11-ола 81 (0,67 г, 1,5 ммоль), безводного дихлорметана (5 мл), 6-бромгексановой кислоты (0,80 г, 4,4 ммоль), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорида (0,85 г, 4,4 ммоль) и 4-диметиламинопиридина (5 мг). Продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

В соответствии с процедурой, что описана для синтеза (6Z, 16Z)-12-((Z)-neK-4-енил)докоса-б,1б-диен-11-ил 6-(диметиламино) гексаноат 11, (Z)-12-октилдокос-6-ен-11-ил 6-(диметиламино)гексаноат 83 был получен в виде масла (103 мг, 14%) из (Z)-12-октилдокос-6-ен-11-ил 6-бромогексаноата 82 (0,78 г, 1,3 ммоль) и 2,0 М раствора диметиламина в этаноле (3 мл). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.43-5.26 (м, 2Н), 4.96-4.91 (м, 1Н), 2.33 (т, 4Н), 2.26 (с, 6Н), 2.08-1.93 (м, 4Н), 1.70-1.60 (м, 2Н), 1.57-1.43 (м, 4Н), 1.40-1.15 (м, 43Н), 0.94-0.85 (м, 9Н).

К охлажденному раствору (0°C) (Е)-этил дек-4-еноата (20 г, 101 ммоль) в безводном диэтиловом эфире (350 мл) добавляли гидрид лития (8,9 г, 212 ммоль) в атмосфере азота. Раствор перемешивают в течение 1 часа при комнатной, затем охлаждают до 0°C и гасят медленно, с помощью 5М NaOH (30 мл), и разбавляют диэтиловым эфиром (100 мл). Раствор перемешивают в течение 30 мин и сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме досуха с получением (Е)-дек-4-ен-1-ола 84, как масла (16,1 г, количественный).

В соответствии с процедурой, что описана что для синтеза (Z)-дек-4-енил метансульфоната 2, (Е)-дек-4-енил метансульфонат 85 был получен в виде оранжевого масла (32,7 г) из (Е)-дек-4-ен-1-ола (16,1 г, 94,7 ммоль), триэтиламина (15,5 мл, 111,7 ммоль) и метансульфонилхлорида (15,6 мл, 201,7 ммоль). Rf 0.65 (100% CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, что описана что для синтеза (Z)-1-бромодек-4-ена 3, (Е)-1-бромодек-4-ен 86 получают в виде масла (17,9 г, 81%) из (Е)-дек-4-енил метансульфоната 85 (23,5 г, 94,7 ммоль) и бромида тетрабутиламмония (40,0 г, 124,1 ммоль). Rf 0,85 (10% этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, что описана для синтеза с получением (6Z,15Z)-хеникоза 6,15-диен-11-ола 4, (6Е,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил) докоса-6,16-диен-11-ола 87 в виде масла (1,28 г, 71%) из (Е)-1-бромодек-4-ена 86 (1,7 г, 7,8 ммоль), магниевых стружек (0,19 г, 7,8 ммоль), (Z)-2-((Z)-дек-4-енил) додец-6-аля 7 (1,25 г, 3,9 ммоль) и гидроксида калия (0,66 г, 11,7 ммоль). Rf 0,43 (10% этилацетат-гексан).

В соответствии с процедурой, что описана для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)докоса-6,16-диен-11-ил 6-бромогексаноата 10, (6Е,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ил-5 бромопентаноат 88 получают в виде масла (1,36 г, 78%) из (6Е,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ола 87 (1,28 г, 2,8 ммоль) и 5-бром-N-валериановой кислоты (1,00 г, 5,6 ммоль), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (1,06 г, 5,6 ммоль), диизопропилэтиламина (1,1 г, 83,0 ммоль) и диметиламинопиридина (10 мг).

В соответствии с процедурой, что описана для синтеза (6Z,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ил 6-(диметиламино)гексаноат 11, (6Е,16Z)-12-((Z)-дек-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ил 5-(диметиламино)пентановой кислоты 89 получают в виде масла (0,45 г, 35%) из (6е,16Z)-12-((Z)-дец-4-енил)-докоса 6,16-диен-11-ил-5 бромопентаноата 88 (1,36 г, 2,2 ммоль) и 2 М диметиламина в этаноле (5 мл). ¹H NMR (400 МГц, CDCl₃) δ 5.45-5.28 (м, 6Н), 4.96-4.91 (м, 1Н), 2.34-2.25 (м, 2Н), 2.06-1.90 (м, 12Н), 1.68-1.61 (м, 2Н), 1.55-1.45 (м, 5Н), 1.45-1.16 (м, 28Н), 0.95-0.84 (м, 9Н). Rf 0.46 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

В соответствии с процедурой, что описана что для синтеза 5, 1,8-бис(2-пентилциклопропил)-5-(3-(2-пентилциклопропил)пропил)октан-4-ил метансульфонат 89 получают в виде бесцветного масла.

В соответствии с процедурой, что описана что для синтеза 62, В соответствии с процедурой, что описана что для синтеза 62, 5-((1,8-бис(2-пентилциклопропил)-5-(3-(2-пентилциклопропил)пропил)октан-4-ил)окси)-N,N-диметилпентан-1-амин 90 (580 мг) получали в виде бледно-желтого масла. Rf 0.48 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

Следует понимать, что приведенное выше описание предназначено для иллюстрации, а не ограничения. Многие варианты будут очевидны специалистам в данной области техники после прочтения приведенного выше описания. Объем настоящего изобретения должен, следовательно, быть определен не со ссылкой на вышеприведенное описание, а вместо этого должен быть определен со ссылкой на прилагаемую формулу изобретения вместе с полным объемом эквивалентов, к которым такие требования могут быть предъявлены. Раскрытие всех статей и ссылок, в том числе патентных заявок, патентов, публикаций РСТ, и образцов из ГенБанк и последовательностей, описанных в нем, включено в данное описание путем ссылки для всех целей.

1. Липид, имеющий структурную формулу (I):

X-A-Y-Z,

(I)

или его соль, где

X является диалкиламиногруппой;

A является C₁-C₆ алкилом;

Y выбран из группы, состоящей из карбамата, сложного эфира, необязательно замещенного алкилом карбамата и простого эфира;

Z является гидрофобным фрагментом и имеет формулу:

,

где R₁, R₂ и R₃ - каждый независимо выбран из группы, состоящей из C₈-C₁₁ алкила, причем каждый из R₁, R₂ и R₃ независимо может быть насыщенным или ненасыщенным.

2. Липид по п.1, в котором Y представляет собой группу сложного эфира.

3. Липид по п.1, в котором каждая из алкильных цепей R₁, R₂ и R₃ во фрагменте Z имеет длину от C₉ до C₁₀.

4. Липид по п.1, в котором по меньшей мере одна алкильная цепь из R₁, R₂ и R₃ имеет двойную связь.

5. Липид по п.1, в котором X выбран из группы, состоящей из диметиламино-, диэтиламино- и этилметиламиногруппы.

6. Липид, выбранный из группы, состоящей из:

Соединение 9,

Соединение 11,

Соединение 13,

Соединение 14,

Соединение 19,

Соединение 21,

Соединение 22,

Соединение 23,

Соединение 24,

Соединение 25,

Соединение 26,

Соединение 27,

Соединение 28,

Соединение 40,

Соединение 42,

Соединение 50,

Соединение 53,

Соединение 62,

Соединение 71,

Соединение 74,

Соединение 76,

Соединение 83 и

Соединение 89,

или его соль.

7. Липидная частица для доставки терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота, в клетку, содержащая липид по любому из пп.1-5.

8. Липидная частица для доставки терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота, в клетку, содержащая липид по п.6.

9. Липидная частица по п.7 или 8, которая дополнительно содержит некатионный липид.

10. Липидная частица по п.9, в которой некатионный липид выбран из группы, состоящей из фосфолипида, холестерина или смеси фосфолипида и холестерина.

11. Липидная частица по п.10, в которой фосфолипид содержит дипалмитоилфосфотидилхолин (DPPC), дистеароилфосфотидилхолин (DSPC) или их смесь.

12. Липидная частица по п.7 или 8, дополнительно содержащая конъюгированный липид, который ингибирует агрегацию частиц.

13. Липидная частица по п.12, в которой конъюгированный липид, ингибирующий агрегацию частиц, содержит полиэтиленгликоль (PEG)-липидный конъюгат.

14. Липидная частица по п.7 или 8, в которой терапевтический агент является нуклеиновой кислотой, представляющей собой мРНК.

15. Липидная частица по п.7 или 8, в которой терапевтический агент представляет собой интерферирующую РНК, которая выбрана из группы, состоящей из малой интерферирующей РНК (миРНК), асимметричной интерферирующей РНК (аиРНК), микроРНК (микроРНК), дайсер-субстратной РНК (дсРНК), малой шпильки РНК (мшРНК) и их смесей.

16. Липидная частица по п.14, в которой частица имеет массовое соотношение липид : терапевтический агент от примерно 5:1 до примерно 15:1.

17. Фармацевтическая композиция для доставки терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота, в клетку, содержащая липидную частицу по п.7 или 8 и фармацевтически приемлемый носитель.

18. Способ введения терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота, в клетку, включающий контактирование клетки с липидной частицей по п.7 или 8.

19. Способ для доставки in vivo терапевтического агента, такого как нуклеиновая кислота, в клетку, включающий введение млекопитающему липидной частицы по п.7 или 8.

20. Липид по п.1, где A, Y, R₁, R₂ и R₃ являются незамещенными.