Положительно заряженные липосомы в качестве липофильных молекул-носителей

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения положительно заряженных липосомальных везикул для применения в качестве носителей липофильных молекул, в соответствии с которым в смеси растворителей растворяют гидрогенизированные фосфолипиды, катионный эксципиент – октадециламин и липофильную молекулу, представляющую собой каротиноид, выбранный из лютеина и зеаксантина; полученную на предыдущей стадии композицию сушат для удаления растворителя; высушенную композицию гидратируют для формирования липосомальных везикул, которые затем гомогенизируют и стерилизуют. Также предложен способ доставки липофильной молекулы в глазные ткани, согласно которому полученные вышеуказанным способом липосомальные везикулы доставляют с использованием ионтофореза. Группа изобретений обеспечивает изготовление состава липосомальных везикул для эффективной внутриглазной доставки каротиноида (лютеина/зеаксантина) с использованием ионтофореза. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 12 табл., 13 ил., 1 пр.

 

Связанные заявки

По данной заявке испрашивают приоритет патентной заявки США с серийным № 62/295,253, поданной 15 февраля 2016 года, которая включена в настоящее описании в полном объеме посредством этой ссылки.

Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение в целом относится к биологически активным липосомам, подходящим для доставки в ткани, и к способу их получения и, более конкретно, к положительно заряженным липосомам, которые можно использовать в качестве носителей липофильных молекул и, в частности, для применения для доставки липофильных молекул, таких как каротиноиды, через ионтофорез в глазные ткани с использованием ионтофореза.

Лютеин связан со снижением риска развития AMD (возрастной дегенерации желтого пятна) и удаления катаракты из-за его антиоксидантного и фотозащитного эффектов и его исключительного распределения в желтом пятне глаза [Kijlstra A., Tian Y., Kelly E. R., Berendschot T. T. 2012. Lutein: more than just a filter for blue light. Prog Retin Eye Res. 31:303-315]. Лютеин широко использовали путем перорального восполнения, разумно объясняя это тем, что системная циркуляция может переносить лютеин в хориоидальную циркуляцию для захвата в желтом пятне, через ксантофил-связывающий белок [Yemelyanov A. Y., Katz N. B., Bernstein P. S. 2001. Ligand-binding characterization of xanthophyll carotenoids to solubilized membrane proteins derived from human retina. Exp Eye Res. 72:381-392]. Однако несколько отчетов говорят о том, что только небольшая процентная доля лютеина достигает желтого пятна [Bone R. A., Landrum J. T., Guerra L. H., Ruiz C. A. 2003. Пищевые добавки лютеин и зеаксантин повышают плотность пигментов желтого пятна и концентрации этих каротиноидов в сыворотке у человека. J Nutr. 133:992-998; Landrum J. T., Bone R. A., Joa H., Kilburn M. D., Moore L. L., Sprague K. E. 1997. A one year study of the macular pigment: the effect of 140 days of a lutein supplement. Exp Eye Res. 65:57-62; Ma L., Lin X. M. 2010. Effects of lutein and zeaxanthin on aspects of eye health. J Sci Food Agric. 90:2-12]. Кроме того, из-за ограничений глазного барьера, терапевтическое лечение в задней камере глаза является затруднительным. Поскольку глаз защищен барьерами слезной пленки, роговицы, стекловидного тела, гематоретинальным барьером и гематоводянистым барьером, очень сложно доставлять лекарственные средства в глаз, конкретно к сетчатке, в достаточных концентрациях и при минимальных побочных эффектах [Barar J., Javadzadeh A. R., Omidi Y. 2008. Ocular novel drug delivery: impacts of membranes and barriers. Expert Opin Drug Deliv. 5:567-581; de la Fuente M., Ravina M., Paolicelli P., Sanchez A., Seijo B., Alonso M. J. 2010. Chitosan-based nanostructures: a delivery platform for ocular therapeutics. Adv Drug Deliv Rev. 62:100-117]. Применение in situ использовали, чтобы преодолеть эту проблему; однако системы медленной доставки, такие как имплантаты, являются очень инвазивными и дорогостоящими. В последнее время использовали интравитреальные инъекции лютеина/зеаксантина для окрашивания специальных преретинальных мембран и других структур глаза [Sousa-Martins D., Maia M., Moraes M., Lima-Filho A. A., Rodrigues E. B., Chen J., Farah M. E., Santos L. B., Belfort R., Jr. 2012. Use of lutein and zeaxanthin alone or combined with Brilliant Blue to identify intraocular structures intraoperatively. Retina. 32:1328-1336; Rodrigues E. B., Costa E. F., Penha F. M., Melo G. B., Bottos J., Dib E., Furlani B., Lima V. C., Maia M., Meyer C. H., Hofling-Lima A. L., Farah M. E. 2009. The use of vital dyes in ocular surgery. Surv Ophthalmol. 54:576-617; Maia M., Furlani B. A., Souza-Lima A. A., Martins D. S., Navarro R. M., Belfort R., Jr. 2014. Lutein: a new dye for chromovitrectomy. Retina. 34:262-272; Badaro E., Furlani B., Prazeres J., Maia M., Lima A. A., Souza-Martins D., Muccioli C., Lucatto L. F., Belfort R., Jr. 2014. Soluble lutein in combination with brilliant blue as a new dye for chromovitrectomy. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 252:1071-1078]. Это были первые данные о доставке лютеина in situ в направлении желтого пятна с использованием присущего лютеину эффекта окрашивания. Потенциал лютеина/зеаксантина для задержки прогрессирования AMD и потенциальное нейропротективное действие, показанные в различных испытаниях, еще не доказаны через применение in situ после внутриглазной доставки. Интравитреальная инъекция лютеина с превентивной целью может представлять собой слишком инвазивный путь доставки лютеина к желтому пятну, который имеет недостаток плохого приятия пациентами.

Ионтофорез представляет собой технологию, в которой используют электрическую энергию на контролируемом низком уровне, чтобы транспортировать ионизированные лекарственные средства через биологическую мембрану [Eljarrat-Binstock E., Domb A. J. 2006. Iontophoresis: a non-invasive ocular drug delivery. J Control Release. 110:479-489]. Созданы различные системы ионтофоретической доставки для офтальмологического применения, которые использовали для безопасной и эффективной доставки лекарства как в переднюю, так и заднюю камеры глаза человека [Eljarrat-Binstock E., Domb A. J. 2006. Iontophoresis: a non-invasive ocular drug delivery. J Control Release. 110:479-489]. С использованием этой технологии возможно доставлять значимые количества макромолекул через роговицу и склеру. Необходима новая стабильная форма лютеина/зеаксантина, которая заряжена, чтобы ионтофоретическое устройство могло проталкивать высокие концентрации заряженных частиц лютеина/зеаксантина транссклерально или/и транскорнеально. Другие липофильные вещества, такие как каротиноиды, противовоспалительные молекулы или антиангиогенные соединения, также можно доставлять в глаз посредством ионтофореза с использованием того же носителя, описанного в настоящем описании.

Сущность изобретения

Благодаря тому факту, что лютеин/зеаксантин представляют собой молекулы с большой молекулярной массой, липофильны и нерастворимы в воде, доставка этих каротиноидов через ионтофорез без модификаций почти невозможна. Для того чтобы преодолеть это, авторы изобретения разработали состав с положительно заряженными липосомальными везикулами, которые ведут себя в качестве носителей молекул лютеина/зеаксантина, с целью облегчения доставки лютеина в глаз. Этот новый продукт подлежит использованию в качестве активного ингредиента в офтальмологическом ионтофоретическом применении. Липосомную структуру формировали с использованием гидрогенизированного фосфатидилхолина в комбинации с катионным эксципиентом (октадециламином) и кристаллическим лютеином/зеаксантином, при этом создавая частицу, которая заряжена положительно, тем самым создавая структуру, способную транспортировать лютеин/зеаксантин или другие липофильные молекулы для прохождения через клетки роговицы и склеры.

Цель этой работы состояла в разработке нового состава заряженного липосомного лютеина (далее обозначаемого как Lipo+), который имеет высокую концентрацию лютеина. В частности, авторы изобретения анализировали стабильность и токсикологический профиль этого нового состава.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлено схематическое изображение получения липосом через гидратацию липидов, после чего следует гомогенизация и уменьшение размеров везикул; MLV - многослойные везикулы, LUV - большие однослойные везикулы, SUV - малые однослойные везикулы (по материалам Lopes et al. 13).

На фиг. 2 представлена диаграмма распределения размеров состава A1 после стерилизации; средний диаметр липосом в составе A1 составлял 222,2 нм, стандартное отклонение 180,9 нм (81,40%).

На фиг. 3 представлена диаграмма истории дзета-потенциала состава A1 после стерилизации; усредненный дзета-потенциал состава A1 составлял -8,10 мВ, усредненный фазовый сдвиг составлял 6,74 рад/с и усредненная подвижность составляла -0,60 M.U.

На фиг. 4 представлена диаграмма распределения размеров состава A2 после стерилизации; средний диаметр липосом в составе A2 составлял 622,1 нм, стандартное отклонение 424,3 нм (68,20%).

На фиг. 5 представлена диаграмма истории дзета-потенциала состава A2 после стерилизации; усредненный дзета-потенциал состава A2 составлял -6,34 мВ, усредненный фазовый сдвиг составлял 5,21 рад/с и усредненная подвижность составляла -0,47 M.U.

На фиг. 6 представлена диаграмма распределения размеров состава B1 после стерилизации; средний диаметр липосом в составе B1 составлял 194,4 нм, стандартное отклонение 142,5 нм (73,30%).

На фиг. 7 представлена диаграмма истории дзета-потенциала состава B1 после стерилизации; усредненный дзета-потенциал состава B1 составлял +36,93 мВ, усредненный фазовый сдвиг составлял -37,87 рад/с и усредненная подвижность составляла 2,75 M.U.

На фиг. 8 представлена диаграмма распределения размеров состава B2 после стерилизации; средний диаметр липосом в составе B2 составлял 2481,7 нм, стандартное отклонение 1516,3 нм (61,10%).

На фиг. 9 представлена диаграмма истории дзета-потенциала состава B2 после стерилизации; усредненный дзета-потенциал состава B2 составлял +3,64 мВ, усредненный фазовый сдвиг составлял -3,16 рад/с и усредненная подвижность составляла 0,27 M.U.

На фиг. 10A и 10B представлены диаграммы вариации pH и осмоляльности, соответственно, образцов Lipo+ в течение 6 месяцев при комнатной температуре; стандартные ошибки для двух повторений представлены в виде величин ошибки.

На фиг. 11A и 11B представлены диаграммы вариаций pH и осмоляльности, соответственно, образцов Lipo+ в течение 6 месяцев при комнатной температуре; стандартные ошибки для двух повторений представлены в виде величин ошибки.

На фиг. 12A и 12B представлены диаграммы вариаций pH и осмоляльности, соответственно, после эксперимента на фотостабильность; pH и осмоляльность Lipo+ не менялись после световой экспозиции, когда эмульсию держали в янтарных и не прозрачных флаконах; стандартные ошибки для двух повторений представлены в виде величин ошибки.

На фиг. 13 представлена диаграмма жизнеспособности клеток после 30 и 120 мин инкубации с разведениями Lipo+; среду с 0,02% SDS и 100 мМ PBS использовали в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно; стандартные ошибки из экспериментов в трех повторениях представлены в виде величин ошибки.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Термин «липофильная молекула», как используют в настоящем описании, относится к соединениям, которые растворяются в липидах, жирах, маслах и неполярных растворителях. Липофильная молекула может представлять собой фармацевтически активное средство, лекарственное средство, визуализирующее средство, терапевтическое средство, диагностическое средство, соединение или композицию. Неограничивающим примером липофильной молекулы является лютеин. Липофильная молекула может содержать между приблизительно 0,001% и 10% по массе липосомной композиции. Другими словами, липофильная молекула может содержать между приблизительно b.cde% и ab% по массе липосомной композиции, где a равно 0 или 1 и b, c, d и e выбирают из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, за исключением того, что все из b, c, d и e равны 0, когда a равно 1, и не все из a, b, c, d и e равны 0.

Термин «липосомы», как используют в настоящем описании, относится к одному или нескольким концентрическим липидным бислоям, инкапсулирующим водный компартмент. Липосома может содержать природные и/или синтетические липиды и поверхностно-активные средства. Липосомы удерживают липофильную молекулу в липидной мембране. Размер этих почти сферических липидных везикул по настоящему изобретению может находиться в диапазоне между 50 и 450 нм. Другими словами, размер липосом по настоящему изобретению находится в диапазоне между приблизительно ab нм и приблизительно cde нм, где a выбирают из 5, 6, 7, 8 и 9, b выбирают из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, c выбирают из 0, 1, 2, 3 и 4, d выбирают из 0, 1, 2, 3, 4 и 5 и e выбирают из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, за исключением случая, когда c равно 4 и d равно 5, и тогда оно равно 0. Конечно не все из a, b, c, d и e могут равняться 0.

Термин «формирующая липидную пленку жидкость», как используют в настоящем описании, относится к любым липид-содержащим жидкостям, которые образуют пленку при сушке. Неограничивающие примеры формирующих липидную пленку жидкостей включают солюбилизированные фосфолипиды, в том числе лецитин и лизолецитин.

Термин «растворитель», как используют в настоящем описании, относится к растворителям, в которых растворима липофильная молекула и которые можно удалять посредством испарения. Неограничивающими примерами растворителей являются хлороформ, метанол и тетрагидрофуран.

Термин «катионные эксципиенты», как используют в настоящем описании, относится к катионным липидам с углеводородными цепями, имеющими длину между приблизительно 8 и 18 углеродами, насыщенными или мононенасыщенными и одновалентными или поливалентными. Неограничивающим примером катионных эксципиентов является октадециламин.

ПРИМЕР

Материалы и способы

Химические соединения и реактивы. Липидную пленку получали с использованием Phospholipon 90H (Lipoid GmbH), октадециламина (Sigma-Aldrich) и кристаллического лютеина (Kemin Health, кристаллический лютеин FloraGLO®), растворенных в хлороформе (CHCl3) (Sigma-Aldrich) и метаноле (MeOH) (Sigma-Aldrich). Гидратацию липидов осуществляли посредством добавления i) дистиллированной воды (Water Ultrapure - MilliQ-by AquaMax - проводимость 0,054 мкСм/см); ii) раствора фосфатного буфера, состоящего из дигидрата одноосновного фосфата натрия (Sigma-Aldrich) и дигидрата двухосновного фосфата натрия (Sigma-Aldrich) или iii) этих растворов с добавлением Tween 80 (Sigma-Aldrich).

Состав лютеиновых липосом. В этой работе получали пять различных составов лютеина, инкапсулированных в липосомы (перечислены в таблицах 1, 2 и 3). Липидную пленку получали с использованием Phospholipon 90H, октадециламина и лютеина, растворенных в CHCl3/MeOH (2:1 об./об.). Растворители удаляли под вакуумом посредством роторного испарения; раствор сушили под вакуумом при 40°C с помощью роторного испарителя Heidolph. Скорость роторного испарителя модулировали для того, чтобы снижать образование пузырьков и струй, которые могут вызывать потерю продукта, и получали сухую тонкую пленку после 1-2 часов. Для того чтобы удалять любые следы растворителей, тонкую пленку оставляли под вакуумом в течение по меньшей мере 16 часов при комнатной температуре. Гидратацию липидной пленки осуществляли посредством добавления различных растворителей (воды, фосфатного буфера или фосфатного буфера с Tween 80) при 40-45°C к липидной пленке для того, чтобы формировать большие липосомальные везикулы. Гомогенизации этих крупных липосомальных везикул достигали с использованием Ika Works ULTRA-TURRAX T 25 Digital Homogenizer (Staufen, Germany), и уменьшение липосомальных везикул до наноразмерного диапазона выполняли посредством экструзии с использованием крупномасштабного устройства обработки текучих веществ с большим сдвигом Microfluidizer® M-110EH при 50-60°C и 1200 бар. Этот процесс повторяли 5 раз. Стерилизацию эмульсии осуществляли при 121°C в течение 20 минут и 1 атм. Различные стадии процесса получения липосом представлены на фиг. 1. После стерилизации регистрировали характеристики различных липосомных везикул: pH (с использованием прибора Mettler Toledo S20); осмоляльность (с использованием Osmomat 3000); размер частицы и дзета-потенциал (с использованием динамического рассеяния света (DLS), также известного как способ фотонно-корреляционной спектроскопии - Nicomp 380 DLS).

Таблица 1. Композиция эмульсий лютеиновых липосом (с использованием 0,001% октадециламина).

Композиция % масс./масс.
A1 Phospholipon 90H 1,000
Октадециламин 0,001
Кристаллы лютеина 0,050
Дигидрат одноосновного фосфата натрия 0,225
Дигидрат двухосновного фосфата натрия 0,685
Дистиллированная вода до 100 г
A2 Phospholipon 90H 1,000
Октадециламин 0,001
Кристаллы лютеина 0,050
Дегидрат одноосновного фосфата натрия 0,225
Дигидрат двухосновного фосфата натрия 0,685
Tween 80 0,020
Дистиллированная вода до 100 г

Таблица 2. Композиция эмульсий лютеиновых липосом (с использованием 0,005% октадециламина).

Композиция % масс./масс.
B1 Phospholipon 90H 1,000
Октадециламин 0,005
Кристаллы лютеина 0,050
Дистиллированная вода до 100 г
B2 Phospholipon 90H 1,000
Октадециламин 0,005
Кристаллы лютеина 0,050
Дегидрат одноосновного фосфата натрия 0,225
Дигидрат двухосновного фосфата натрия 0,685
Дистиллированная вода до 100 г

Таблица 3. Композиция эмульсии лютеиновых липосом (с использованием 0,007% октадециламин).

Композиция % масс./масс.
C1 Phospholipon 90H 2,000
Октадециламин 0,007
Кристаллический лютеин 0,200
Дистиллированная вода до 100 г

Исследование термостабильности. Термостабильность состава определяют некоторые параметры: внешний вид, цвет, запах, осмоляльность и pH. Все эти параметры оценивали для эмульсии, полученной в двух исследованиях: 6-месячное исследование стабильности, которое выполняли при комнатной температуре (21°C±2), с 3 различными моментами времени: 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев; и 6-месячное ускоренное исследование при 52°C с 2 различными моментами времени: 3 месяца и 6 месяцев. Это ускоренное исследование реализовали при завышенных условиях хранения, чтобы имитировать хранение в течение периода, значительно превышающего 6 месяцев.

Исследования фотостабильности. Цель этого исследования состояла в том, чтобы определять, чувствительна ли эмульсия Lipo+ к дневному свету, посредством оценки тех же параметров, используемых в тесте на термостабильность (внешний вид, цвет, запах, осмоляльность и pH) в соответствии с ICH Q1B Guideline [ICH HARMONISED TRIPARTITE GUIDELINE. 1996. STABILITY TESTING: PHOTOSTABILITY TESTING OF NEW DRUG SUBSTANCES AND PRODUCTS]. В этом исследовании разрушение дневным светом имитировали посредством облучения образцов с использованием UV и видимого света в течение 48 ч, используя не облученный образец в качестве контроля. Состав Lipo+ экспонировали, как в янтарных, так и в прозрачных стеклянных флаконах, в трех повторениях, для UV/видимого света в течение 48 ч в камере фотостабильности (Industrial Laborum, Ibérica) (суммарное освещение≥1,2 клюкс/ч). В соответствии с руководством, образцы следует экспонировать бок о бок с валидированной химической актинометрической системой, чтобы гарантировать, что достигают минимальной световой экспозиции, или в течение подходящей длительности времени, когда мониторинг условий с использованием калиброванных радиометров/люксметров. В качестве актинометрических контролей использовали два 2% (масс./об.) раствора хинина-HCl (Acros Organics, партия A0311764), которые экспонировали для условий со светом и без света, в последнем случае оборачивали алюминиевой фольгой. В этом тесте можно определять, было ли время экспозиции достаточным, чтобы вызывать любое возможное разрушение посредством измерения Abs400нм. Статистический анализ осуществляли с использованием Microsoft Excel и стандартное отклонение вычисляли для каждого условия.

Исследования цитотоксичности. Используя модель in vitro, авторы изобретения оценивали профиль безопасности эмульсии Lipo+. Эксперименты по цитотоксичности in vitro осуществляли с использованием клеточной линии пигментного эпителия сетчатки человека (ARPE-19, CRL-2302, ATCC, Manassas, VA), поскольку она представляет собой стабильную клеточную линию, соответствующую клеткам-мишеням того типа, в контакте с которыми будет конечный продукт. Клеточную токсичность оценивали с использованием колориметрического анализа WST-1 (Cell Proliferation Reagent WST-1, Roche Applied Science, Mannheim, Germany) в соответствии с рекомендациями производителя. Клетки ARPE-19 высевали по 12×103 клеток/см2 в 96-луночные планшеты. После 12 ч роста, применяли 4 разведения Lipo+ (1/15; 1/30; 1/60; 1/120) в течение 30 и 120 мин. После этого клетки промывали с использованием минимальной среды и инкубировали в течение 24, 48 и 72 ч. После этого периода восстановления, клеточные культуры промывали 4 раза с использованием минимальной среды и добавляли свежую полную среду, содержащую 10% реактив (WST-1). После 3-4 ч инкубации измеряли поглощение при 450 нм с использованием считывателя планшетов TECAN. Клеточную культуру, содержащую 0,02% SDS, использовали в качестве положительного контроля цитотоксичности и полную среду для культивирования с 100 мМ PBS использовали в качестве отрицательного контроля. Для тестовых образцов эксперименты осуществляли в трех повторениях и для контролей тестировали 6 повторений. Статистический анализ осуществляли с использованием Microsoft Excel и стандартное отклонение вычисляли для каждого тестового условия.

Результаты

Состав A1. После стерилизации изучали профиль состава A1. Анализировали размер частицы, и средний диаметр липосом в этом составе составлял 222,2 нм (фиг. 2). Усредненный дзета-потенциал, который представляет собой заряд, который возникает в области контакта между твердой поверхностью и ее жидкой средой, составлял -8,10 мВ, что обозначает, что состав A1 представляет собой анионную эмульсию (фиг. 3). В таблицу 4 сведены характеристики этого состав.

Таблица 4. Сводка характеристик состава A1 после стерилизации.

pH Осмоляльность (мОсМ/кг) Средний диаметр (нм) Дзета-потенциал (мВ)
7,21 133 222 -8,10

Состав A2. В таблицу 5 сведены характеристики состава A2 после стерилизации. Анализировали размер частицы, и средний диаметр липосом в этом составе составлял 622,1 нм (фиг. 4). Анализ дзета-потенциала обнаруживал, что состав A2 представляет собой анионную эмульсию (-6,34 мВ) (фиг. 5).

Таблица 5. Сводка характеристик состава A2 после стерилизации.

pH Осмоляльность (мОсМ/кг) Средний диаметр (нм) Дзета-потенциал (мВ)
7,20 136 622 -6,34

Состав B1. Признаки состава B1 также анализировали после стерилизации. Средний диаметр липосом в этом составе составлял 194,4 нм (фиг. 6). На фиг. 7 представлен анализ дзета-потенциала, в котором выявляли, что состав B1 представляет собой катионную эмульсию (+36,93 мВ). В таблице 6 рассмотрен профиль состава B1.

Таблица 6. Сводка характеристик состава B1 после стерилизации.

pH Осмоляльность (мОсМ/кг) Средний диаметр (нм) Дзета-потенциал (мВ)
6,84 15 194 +36,93

Состав B2. В таблицу 7 сведены характеристики состава B2 после стерилизации. На фиг. 8 представлен средний диаметр липосом; этот состав представлял собой состав с более крупным размером частиц, усредненно 2481,7 нм. Анализ дзета-потенциала обнаруживал, что состав B2, аналогично составу B1, также представляет собой катионную эмульсию (+3,64 мВ) (фиг. 9).

Таблица 7. Сводка характеристик состава B2 после стерилизации.

pH Осмоляльность (мОсМ/кг) Средний диаметр (нм) Дзета-потенциал (мВ)
7,35 140 2482 +3,64

Состав C1. После стерилизации определяли характеристики профиля Lipo+. Анализировали размер частицы, и средний диаметр липосом в составе составлял 337 нм. Усредненный дзета-потенциал, который представляет собой заряд, который возникает в области контакта между твердой поверхностью и ее жидкой средой, составлял +3,45 мВ, что обозначает, что это катионная эмульсия. В таблицу 8 сведены характеристики состава

Таблица 8. Сводка характеристик состава C1 после стерилизации.

pH Осмоляльность (мОсМ/кг) Средний диаметр (нм) Дзета-потенциал (мВ)
4,3 15 337 +3,45

В таблице 9 рассмотрены характеристики после стерилизации всех 4 составов.

Таблица 9. Сводка характеристик всех липосомных составов после стерилизации.

Состав pH Осмоляльность (мОсМ/кг) Средний диаметр (нм) Дзета-потенциал (мВ)
A1 7,21 133 222 -8,10
A2 7,20 136 622 -6,34
B1 6,84 15 194 +36,93
B2 7,35 140 2482 +3,64
C1 4,30 15 337 +3,45

Исследования термостабильности. В исследованиях стабильности оценивали, менялись ли характеристики эмульсии с течением времени при воздействии различных температурных условий. Характеристики Lipo+, такие как внешний вид, цвет, запах, pH и осмоляльность, оценивали в течение 6 месяцев в двух независимых исследованиях, которые проводили при комнатной температуре (≈20°C) и 52°C (ускоренное исследование).

Характеристики Lipo+ после 1, 3 и 6 месяцев при комнатной температуре сведены в таблицу 10 и на фиг. 10. В течение первых 3 месяцев сохранялся начальный pH и небольшие изменения обнаруживали после 6 месяцев. Для осмоляльности, изменения более выражены, что указывает на возможную необходимость усовершенствования состава, чтобы стабилизировать осмоляльность.

Таблица 10. Характеристики Lipo+ в начале исследования (время 0) и после 1, 3 и 6 месяцев при комнатной температуре.

Тест Время=0 Время=1 месяц Время=3 месяца Время=6 месяцев
1 2 1 2 1 2 1 2
Внешний вид вязкий раствор вязкий раствор вязкий раствор вязкий раствор вязкий раствор вязкий раствор вязкий раствор вязкий раствор
Цвет оранжевый оранжевый оранжевый оранжевый оранжевый оранжевый оранжевый оранжевый
Запах растительный растительный растительный растительный растительный растительный растительный растительный

Для исследования стабильности при 52°C результаты представлены в таблице 11 и на фиг. 11, для моментов времени 3 и 6 месяцев. В этом исследовании состав демонстрировал нестабильность при более высоких температурах, поскольку цвет и внешний вид менялись после 3 месяцев при 52°C. Снова pH демонстрировал меньшие отклонения с течением времени, чем осмоляльность, что указывает на то, что этот параметр должен быть усовершенствован.

Таблица 11. Характеристики Lipo+ в начале исследования (время 0) и после 3 и 6 месяцев при 52°C.

Тест Время=0 Время=3 месяца Время=6 месяцев
1 2 1 2 1 2
Внешний вид вязкий раствор вязкий раствор раствор с осадком раствор с осадком раствор с осадком раствор с осадком
Цвет оранжевый оранжевый белый Белый светло-оранжевый светло-оранжевый
Запах растительный растительный растительный Растительный растительный растительный

Исследования фотостабильности. Lipo+ и контрольные образцы подвергали воздействию света (UV/видимого) в камере фотостабильности. После 48 часов экспозиции разрушение хинина-HCl оценивали через измерение Abs400нм. Этот параметр составлял выше 0,5 (Abs400нм=0,596), что указывает на то, что время экспозиции было достаточным для того, чтобы вызывать разрушение в образцах, экспонированных для тех же условий, что и актинометрический контроль.

Оценивали внешний вид, цвет и запах Lipo+, и обнаруживали, что состав стабилен после экспозиции, сохраняя начальные характеристики (внешний вид: вязкий гомогенный раствор; цвет: оранжевый, запах: растительный), при хранении в янтарных или прозрачных флаконах (таблица 12). Аналогичным образом, значения pH не менялись значительно для прозрачных флаконов, экспонированных или не экспонированных для света. Для янтарных флаконов изменение pH наблюдали между экспонированными флаконами и не экспонированными флаконами. Относительно значений осмоляльности, изменения более заметны между флаконами со световой экспозицией и без световой экспозиции, для янтарных или прозрачных. Результаты приведены на фиг. 12.

Таблица 12. Характеристики Lipo+ после исследования фотостабильности: сравнение образцов, которые экспонировали для света и не экспонировали для света, в янтарных или прозрачных стеклянных флаконах.

Тест Со световой экспозицией Без световой экспозиции
Янтарные флаконы Прозрачные флаконы Янтарные флаконы Прозрачные флаконы
Внешний вид вязкий раствор вязкий раствор вязкий раствор вязкий раствор
Цвет оранжевый оранжевый оранжевый оранжевый
Запах растительный растительный растительный растительный

Исследования цитотоксичности. Тестирование цитотоксичности in vitro осуществляли на Lipo+ с использованием способа непосредственного контакта в линиях клеточных культур пигментного эпителия сетчатки человека (ARPE-19). Цитотоксичность измеряли с использованием способа WST-1. В этом анализе идентифицируют изменения клеточного метаболического ответа в соответствии с митохондриальной активностью, тем самым давая очень приблизительную оценку цитотоксичности in vitro для растворов этого типа. Клетки промывали и оставляли восстанавливаться в течение 24, 48 и 72 часов после контакта с разведениями Lipo+ в течение 30 и 120 мин, а также с положительными и отрицательными контролями. Используемые разведения выбирали, принимая во внимание объем жидкости внутри глаза (4 мл) и предполагая количество раствора, которое проникнет в глаз пациента после ионтофоретического применения [Molokhia S. A., Jeong E. K., Higuchi W. I., Li S. K. 2009. Transscleral iontophoretic and intravitreal delivery of a macromolecule: study of ocular distribution in vivo and postmortem with MRI. Exp Eye Res. 88:418-425].

Как изображено на фиг. 13, результаты не обнаруживают цитотоксического эффекта Lipo+, поскольку жизнеспособность клеток не снижали при любом из разведений, тестируемых в непосредственном контакте с клетками, по сравнению с контролями. Тестируемые образцы представляли собой разведения конечной стерилизованной эмульсии, которую планировали использовать для последующих экспериментов в ионтофоретическом проекте.

Обсуждение

Цель авторов изобретения состоит в том, чтобы разработать новый путь доставки высокой концентрации лютеина/зеаксантина в сетчатку с тем, чтобы можно было значительно увеличивать их присутствие в желтом пятне с целью предотвращения начала и/или прогрессирования AMD, а также для того, чтобы защищать клетки эндотелия сетчатки. Для этого авторы изобретения будут использовать глазной ионтофорез, который представляет собой способ, основанный на базовом принципе, что схожие заряды отталкиваются друг от друга и различные заряды притягиваются друг к другу.

Эмульсию Lipo+ получали с учетом того, что продемонстрировано, что положительные частицы являются более хорошими кандидатами для ионтофоретического применения в качестве носителя лекарственного средства, чем отрицательно заряженные частицы из-за более высокого проникновения в глазные ткани [Eljarrat-Binstock E., Orucov F., Aldouby Y., Frucht-Pery J., Domb A. J. 2008. Charged nanoparticles delivery to the eye using hydrogel iontophoresis. J Control Release. 126:156-161]. Кроме того, электрическое поле толкает положительно заряженные молекулы для перемещения в глазные мембраны, которые заряжены отрицательно [Nicoli S., Ferrari G., Quarta M., Macaluso C., Santi P. 2009. In vitro transscleral iontophoresis of high molecular weight neutral compounds. Eur J Pharm Sci. 36:486-492]. Для того чтобы преодолеть эту сложность доставки лютеина через ионтофорез (поскольку эта молекула не имеет заряда), авторы изобретения получали положительно заряженные липосомные (дзета-потенциал=+3,45 мВ) везикулы, которые ведут себя как носители молекул лютеина. Предыдущие исследования показали, что при pH 3 транспорт в направлении от катода к аноду значительно выше, чем таковой от анода к катоду [Gungor S., Delgado-Charro M. B., Ruiz-Perez B., Schubert W., Isom P., Moslemy P., Patane M. A., Guy R. H. 2010. Trans-scleral iontophoretic delivery of low molecular weight therapeutics. J Control Release. 147:225-231], что подсказывает, что Lipo+ (pH=4,3) имеет указанные характеристики, чтобы использовать его в ионтофоретической доставке лютеина.

Для того, чтобы лучше понимать характеристики нового состава, а также чтобы делать вывод о сроке хранения продукта, осуществляли два исследования стабильности в течение 6 месяцев. Кроме того, осуществляли исследование фотостабильности конечного состава также. Среди всех исследуемых характеристик только осмоляльность показывала, что на нее значительно влияет температура и/или свет. Эти результаты указывают на необходимость стабилизации осмоляльности этого состава.

Поскольку этот новый состав будут использовать в качестве активного ингредиента в офтальмологических ионтофоретических применениях, очень важно оценивать профиль безопасности Lipo+, когда в контакте с клетками-мишенями глаза человека. эксперименты по цитотоксичности in vitro осуществляли in vitro, используя клеточную линию пигментного эпителия сетчатки человека, которую инкубировали с различными разведениями Lipo+. Результаты показывали отсутствие цитотоксического эффекта, оказываемого на клеточную линию, которую исследовали для различных времен инкубации и разведений, демонстрируя, что Lipo+ имеет безопасный профиль в моделях клеточных культур. Эти результаты показывают, что этот состав Lipo+ является перспективным кандидатом на использование для внутриглазной доставки лютеина/зеаксантина.

Вышеуказанное описание и рисунки содержат иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения. Вышеуказанные варианты осуществления и способы, описанные в настоящем описании, можно варьировать на основании способностей, опыта и предпочтении специалистов в данной области. Просто перечисление стадий способа в определенном порядке не составляет какого-либо ограничения на порядок стадий способа. Вышеуказанное описание и рисунки просто объясняют и иллюстрируют изобретение, и изобретение не ограничено этим, за исключением случаев, когда так ограничена формула изобретения. Специалисты в данной области, которые имеют раскрытие перед ними, будут способны создавать модификации и вариации в нем, не отступая от объема изобретения.

1. Способ получения положительно заряженных липосомальных везикул для применения в качестве носителей липофильных молекул, включающий стадии, согласно которым:

(a) растворяют гидрогенизированные фосфолипиды, катионный эксципиент и липофильную молекулу в смеси растворителей для того, чтобы формировать композицию, где катионный эксципиент представляет собой октадециламин и липофильная молекула представляет собой каротиноид выбранный из группы, состоящей из лютеина и зеаксантина;

(b) сушат композицию для того, чтобы удалить растворитель;

(c) гидратируют высушенную композицию для того, чтобы сформировать липосомальные везикулы, и гомогенизируют липосомальные везикулы; и

(d) стерилизуют липосомальные везикулы.

2. Способ доставки липофильной молекулы в глазные ткани, согласно которому липосомальные везикулы, полученные способом по п.1, доставляют с использованием ионтофореза.

3. Способ по п.2, в котором лютеин представляет собой кристаллический лютеин и в котором везикулы транспортируют через клетки роговицы и склеры.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и касается терапевтического или профилактического средства для заболевания, нарушения или состояния эндотелия роговицы, включающего по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, состоящей из ламининов и их функциональных фрагментов, где ламинины включают α5-цепь и γ1-цепь и заболевание представляет собой буллезную кератопатию, где функциональные фрагменты обладают способностью к клеточной адгезии эндотелиальной клетки роговицы.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначена для лечения миоцилиновой (MYOC) глаукомы у млекопитающего. Способ лечения MYOC-глаукомы включает введение в глаз млекопитающего частицы рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащего вектор, кодирующий RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, усеченный RSPO1, усеченный RSPO2, усеченный RSPO3 или усеченный RSPO4.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к белково-пептидному комплексу и фармакологической композиции для профилактики и лечения ретинальных заболеваний глаза человека и сельскохозяйственных животных.
Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для лечения рецидивирующей эрозии роговицы различного генеза. Для этого осуществляют установку мягкой контактной линзы (МКЛ) с первого дня лечения, с последующей заменой ее каждые 6-7 дней, инстилляцию пиклоксидина гидрохлорида 0,05%, вводят декспантенол 5% и Баларпан-Н 0,01% по 2 капли 4 раза в день каждого препарата, с интервалом 5-7 минут.

Заявленная группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики и представляет собой применение композиции, содержащей более 90 мас.% норбиксина, полученного путем очистки из экстракта семян Bixa orellana, для фотозащиты клеток пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) у млекопитающих путем введения этому млекопитающему указанной композиции в количестве от 0,48 мг/кг массы тела до 48 мг/кг массы тела в сутки, и композицию, содержащую более 95 мас.% норбиксина, полученного путем очистки из экстракта семян Bixa orellana, для использования с целью фотозащиты клеток пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) у млекопитающих.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для лечения воспалительных или дистрофических заболеваний глаз. Для этого пациенту через 2-4 недели после проведения противовоспалительной или противодистрофической терапии вводят в пораженный глаз 0,6-0,8 мл аутологичного лизата тромбоцитов субконъюнктивально или 0,8-1,0 мл параэкваториально, курсом 4-6 инъекций, с интервалом в 48-72 часа.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначена для лечения офтальмологических заболеваний путем субконъюнктивального инъекционного введения.
Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может быть использовано при хирургическом лечении идиопатических макулярных разрывов сетчатки.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложена фармацевтическая композиция для предотвращения и лечения вызванного неоваскуляризацией заболевания глаз, содержащая белок слияния, в котором проникающий в ткань пептид слит с анти-VEGF.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначена для поддержания стабильности дибутилгидрокситолуола в жидком препарате.

Изобретение относится к медицине, а именно к профпатологии, и может быть использовано для реабилитации работников с хроническими производственно обусловленными заболеваниями органов дыхания, а именно ринофарингитом, трахеобронхитом, обусловленными воздействием вредных факторов титаномагниевого производства.

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии и рефлексотерапии, и может быть использовано для лечения задержки развития у пациентов с расстройствами аутистического спектра.

Группа изобретений относится к медицинской технике, а именно к средствам для обработки кератиновой ткани человека с помощью электрического тока. Устройство по первому варианту содержит емкость, содержащую подлежащий нанесению на кератиновую ткань состав (Р), такой как косметический или дерматологический состав; и концевой элемент для нанесения состава, содержащегося в емкости, содержащий аппликаторы и электропроводящий распределитель, причем распределитель содержит по меньшей мере одну накопительную полость для состава и питающие отверстия для обеспечения прохождения состава из накопительной полости или полостей к аппликаторам, причем концевой элемент содержит диффузор, непосредственно контактирующий с распределителем, обеспечивая возможность подачи состава в полость или полости распределителя.

Группа изобретений относится к медицинской технике, а именно к устройствам для обработки кератиновой ткани человека, в частности, с помощью электрического тока. Устройство по первому варианту выполнения содержит по меньшей мере емкость, содержащую подлежащий нанесению на кератиновую ткань состав (Р), такой как косметический или дерматологический состав, дозирующий элемент для подачи состава, содержащегося в емкости, в частности насос, концевой элемент для нанесения состава, содержащегося в емкости, содержащий по меньшей мере один аппликатор, при этом аппликатор вставлен в гнездо, в которое посредством дозирующего элемента выполняется подача состава из емкости, при этом аппликатор выполнен с возможностью перемещения в гнезде под давлением состава между первым положением и вторым положением, основание гнезда и аппликатор ограничивают по меньшей мере одну промежуточную накопительную камеру для состава, а при переходе аппликатора из первого положения во второе положение происходит изменение объема промежуточной камеры, причем устройство дополнительно включает систему электропитания, содержащую электрод, расположенный на расстоянии от кератиновой ткани и расположенный внутри концевого элемента.

Изобретение относится к медицинской технике и предназначено для ионизации и ионофореза слизистых покровов ионами серебра без использования внешних источников электрического тока.
Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии, физиотерапии и медицинской реабилитации, и может быть использовано для лечения ревматоидного артрита. Для этого на область поражённых суставов проводят лекарственный электрофорез по поперечной методике.

Изобретение имеет отношение к способу отложения лютеина и/или зеаксантина в глазных тканях, а также к способу лечения, облегчения или профилактики глазного заболевания или нарушения функции.

Изобретение относится к медицинской технике. Ручное электрическое устройство для ухода за кожей содержит корпус, выполненный для захвата рукой, первый и второй (20) внешние электроды и расположенный в корпусе источник электроэнергии.

Изобретение относится к медицине. Термоэлектрическое устройство для проведения электрофоретических лечебных процедур содержит электропроводную пластину, электрически связанную с источником постоянного тока, приведенную в контакт с участком тела через пористое вещество, пропитанное лекарственным средством.

Изобретение относится к медицинской технике. Устройство для электропорации бактериальных клеток, присутствующих на поверхности рогового слоя кожи человека, содержит электроды, размещаемые с зазором от упомянутой поверхности, прокладку для разнесения электродов от поверхности рогового слоя и генератор для регулирования и подачи заданного напряжения на электроды для создания электрического поля с напряженностью 10-50 кВ/см на упомянутой поверхности для инактивации бактериальных клеток.

Изобретение относится к способу получения везикул с трансмембранным градиентом рН. Указанный способ характеризуется следующими стадиями: a) получения везикул, состоящих из по меньшей мере одного матричного вещества в водной среде, имеющей осмолярность не более чем 200 мОсм/л, где матричное вещество выбирают из группы, состоящей из амфифильных липидов, образующих липосомы, b) смешивания везикул с основным или кислым буфером, имеющим осмолярность, составляющую по меньшей мере на 200 мОсм/л выше, чем осмолярность водной среды стадии a), для применения осмотического шока к везикулам и для получения везикул, наполненных буфером, и c) разведения смеси водной среды и основного или кислого буфера, содержащего везикулы, наполненные буфером, путем добавления нейтрализующего раствора для получения везикул с трансмембранным градиентом рН, суспендированных в суспензионном буфере, где суспензионный буфер отличается от основного или кислого буфера по значению рН.

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения положительно заряженных липосомальных везикул для применения в качестве носителей липофильных молекул, в соответствии с которым в смеси растворителей растворяют гидрогенизированные фосфолипиды, катионный эксципиент – октадециламин и липофильную молекулу, представляющую собой каротиноид, выбранный из лютеина и зеаксантина; полученную на предыдущей стадии композицию сушат для удаления растворителя; высушенную композицию гидратируют для формирования липосомальных везикул, которые затем гомогенизируют и стерилизуют. Также предложен способ доставки липофильной молекулы в глазные ткани, согласно которому полученные вышеуказанным способом липосомальные везикулы доставляют с использованием ионтофореза. Группа изобретений обеспечивает изготовление состава липосомальных везикул для эффективной внутриглазной доставки каротиноида с использованием ионтофореза. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 12 табл., 13 ил., 1 пр.

Наверх