Способ получения каллусной культуры змееголовника дланевидного (dracocephalum palmatum steph.) в условиях in vitro

Авторы патента:

C12N5/04 - клетки или ткани растений

Владельцы патента RU 2718253:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Восточный федеральный университет имени М.К.Аммосова" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры клеток дикорастущего растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян змееголовника раствором 3% перекиси водорода в течение 5 минут, 80% этиловым спиртом в течение 1 мин, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов следующего состава, мг/л: NH₄NO₃- 33000, KNO₃- 38000, CaCl₂×2H₂O - 8800, MgSO₄×7H₂O - 7400, KH₂PO₄ - 3400, KI - 166, Н₃ВО₃ - 1240, MnSO₄×4H₂O - 4460, ZnSO₄×7H₂O - 1720, Na₂MoO₄×2H₂O - 50, CuSO₄×5H₂O - 5, CoCl₂×6H₂O - 5, FeSO₄×7H₂O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 2500, вода - 1000 мл, агар - 7000. Далее, полученные из проростков листовые экспланты помещают в питательную среду следующего состава, мг/л: NH₄NO₃ - 33000, KNO₃ - 38000, CaCl₂×2H₂O - 8800, MgSO₄×7H₂O - 7400, KH₂PO₄ - 3400, KI - 166, Н₃ВО₃ - 1240, MnSO₄×4H₂O - 4460, ZnSO₄×7H₂O - 1720, Na₂MoO₄×2H₂O - 50, CuSO₄×5H₂O - 5, CoCl₂×6H₂O - 5, FeSO₄×7H₂O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 3000, гидролизат казеина - 500, кинетин - 1, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота - 1, вода - 1000 мл, агар - 12000. При этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели. Изобретение позволяет получить каллусную культуру змееголовника дланевидного в условиях in vitro (Dracocephalum palmatum Steph.), которая может быть использована в качестве источника флавоноидов терапевтического действия. 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения сырья, содержащего ценные биологически активные соединения (флавоноиды, фенольные соединения), а также при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за высокого содержания в своем составе летучих эфирных соединений.

Змееголовник дланевидный Dracocephalum palmatum Steph.– растение семейства Lamiaceae, многолетнее вечнозеленое растение с ползучими побегами, образует очень плотную дернину. Листья и побеги опушены. Цветоносы приподнимаются над дерниной на 10-15 см. Цветки фиолетовые в мутовках. Семена созревают в июле. Зимует с зелеными листьями. Встречается в северо-восточных районах Якутии. Растет на сухих каменисто-щебнистых склонах, скалах, в каменистых тундрах, гонных степях (см. Данилова Н.С., Борисова С.З., Иванова Н.С. Декоративные растения Якутии: Атлас-определитель. – М.: ЗАО «Фитон+», 2012. – 248 с).

Известно, что на основе химических и спектральных работ из частей змееголовника дланевидного было выделено 23 соединения (фенилпропаноиды, кумарины, флавоноиды и тритерпены), среди которых впервые в роду Dracocephalum было обнаружено восемь соединений: сальвианоловая кислота B, кафтаровая кислота, цихоровая кислота, умбеллиферон, эскулетин, апигенин-7-O-β-D-глюкуронопиранозид, изорхоифолин и лютеолин-4'-O-β-D-глюкопиранозид (см. Olennikov DN, Chirikova NK, Okhlopkova ZM, Zulfugarov IS. Chemical composition and antioxidant activity of Tánara Ótó (Dracocephalum palmatum Stephan), a medicinal plant used by the North-Yakutian nomads. Molecules.2013 Nov 14;18(11):14105-21.).

Змееголовник дланевидный используют в тибетской медицине, якутской народной медицине, настой из надземной части и цветков применяют при язвенной болезни желудка, а в Средней Азии - при сердечной недостаточности, астении, болезнях желудка и как потогонное средство.

Известен способ получения каллусной культуры представителя семейства Lamiaceaе шлемника андрахновидного (Scutellaria andrachnoides) (см. ЕА №020503, кл. C12N 5/04, A01H 4/00, опубл. 28.11.2014), включающий получение штамма культуры корня растения шлемника андрахновидного (Scutellaria andrachnoides), интенсивно растущего в условиях in vitro на безгормональных питательных средах, сохраняющего способность к синтезу фенольных соединений, характерных для корней целого растения, и обладающего генетической и биохимической стабильностью.

Авторами в открытых источниках технические решения по получению каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного не выявлено.

Задачей настоящего изобретения является получение каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro.

Для решения поставленной задачи способ получения каллусной культуры клеток дикорастущего растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro включает стерилизацию семян змееголовника раствором перекиси водорода (3% раствор) в течение 5 минут, этиловым спиртом (80% раствор) в течение 1 мин, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов следующего состава, в мг/л: NH₄NO₃- 33000, KNO₃- 38000, CaCl₂×2H₂O - 8800, MgSO₄×7H₂O - 7400, KH₂PO₄ - 3400, KI - 166, Н₃ВО₃ - 1240, MnSO₄×4H₂O - 4460, ZnSO₄×7H₂O - 1720, Na₂MoO₄×2H₂O - 50, CuSO₄×5H₂O - 5, CoCl₂×6H₂O - 5, FeSO₄×7H₂O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 2500, вода - 1000 мл, агар - 7000. Далее, полученные из проростков листовые экспланты помещают в питательную среду следующего состава, в мг/л: NH₄NO₃ - 33000, KNO₃ - 38000, CaCl₂×2H₂O - 8800, MgSO₄×7H₂O - 7400, KH₂PO₄ - 3400, KI - 166, Н₃ВО₃ - 1240, MnSO₄×4H₂O - 4460, ZnSO₄×7H₂O - 1720, Na₂MoO₄×2H₂O - 50, CuSO₄×5H₂O - 5, CoCl₂×6H₂O - 5, FeSO₄×7H₂O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 3000, гидролизат казеина - 500, кинетин - 1, 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота - 1, вода - 1000 мл, агар - 12000. При этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», каллусная культура змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) впервые получена в условиях in vitro.

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение каллусной культуры змееголовника дланевидного(Dracocephalum palmatum Steph.).

Предлагаемое решение состоит в том, что за основу взяты стерильные свежие проростки, культивируемые в контролируемых условиях климатической камеры из семян интактного растения, фитомасса которого собрана во время стационарно-маршрутных работ на территории Оймяконского нагорья в Республике Саха (Якутия), известного как «Полюс холода – Оймякон», в фенофазах «конец цветения, начало плодоношения».

При этом отобранные семена стерилизовали раствором 3 % перекиси водорода в течение 5 минут, после чего, вторично 80 % спиртом в течение 1 мин. После стерилизации материал трехкратно ополаскивали стерильной дистиллированной водой. Стерилизованные семена помещали на твердую питательную среду без гормонов. Культивирование проростков проводили до третьего-пятого настоящих листьев в течение трех недель.

Питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования свежих проростков растения содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.

Из полученного проростка получали листовые экспланты, которые помещали в питательную среду с дополнительным добавлением гидролизата казеина, кинетина, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. При этом выявлено, что наиболее интенсивное каллусообразование получается при концентрации фитогормонов кинетин 1 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты 1 мг/л.

После образования каллусной ткани проводили его отделение и рассадку в культуральные сосуды (чашки Петри, конически колбы на 100 и 250 мл) со свежей питательной средой, того же состава.

Питательная среда Мурасиге-Скуга для получения каллусной ткани содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 2.

Культивирование проводили в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. При этом цикл субкультивирования составлял 4 недели. При пересеве использовали ¼ каллусной культуры.

Пересадку проводили каждые 30 дней, таким образом, сохраняя полученную каллусную культуру. В процессе культивирования определяли морфологические, цитологические характеристики, также отбирали для молекулярных исследований и химических анализов.

Описание способа получения каллусной культуры Dracocephalum palmatum Steph. в настоящее время нигде не зарегистрировано.

Полученная каллусная культура характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки: каллусные культуры рыхлые и зернистые, имеют желтовато-серую окраску.

Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по сырому и сухому весу биомассы. Для определения веса сырой биомассы каллусных культур отделяют от среды культивирования на бумажных фильтрах и взвешивают. Сухую биомассу каллусных культур получают после лиофильной сушки.

При анализе представленных кривых роста следует отметить замедление роста на 20 сутки культивирования, что позволяет использовать 4-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры (кроме индекса роста) рассчитывали по сырому весу биомассы. Результаты представлены в таблице 3 и свидетельствуют о наличии стабильных ростовых характеристик.

Таким образом, выявлен способ получения каллусных культур змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) из эксплантов проростков, полученных в лабораторных условиях.

Таблица 1

Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для культивирования проростков к получению стерильных эксплантов, в мг/л

Компоненты	Содержание
NH₄NO₃	33000
KNO₃	38000
CaCl₂x2H₂O	8800
MgSO₄x7H₂O	7400
KH₂PO₄	3400
KI	166
H₃BO₃	1240
MnSO₄x4H₂O	4460
ZnSO₄x7H₂O	1720
Na₂MoO₄x2H₂O	50
CuSO₄x5H₂O	5
CoCl₂x6H₂O	5
FeSO₄x7H₂O	5560
Na-ЭДТА	7460
Мезоинозит	100
Тиамин	100
Пиридоксин	100
Никотиновая кислота	100
Сахароза	2500
Вода	1000 мл
Агар	7000

Таблица 2

Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для получения каллусной культуры клеток

Компоненты	Содержание, в мг/л
NH₄NO₃	33000
KNO₃	38000
CaCl₂x2H₂O	8800
MgSO₄x7H₂O	7400
KH₂PO₄	3400
KI	166
H₃BO₃	1240
MnSO₄x4H₂O	4460
ZnSO₄x7H₂O	1720
Na₂MoO₄x2H₂O	50
CuSO₄x5H₂O	5
CoCl₂x6H₂O	5
FeSO₄x7H₂O	5560
Na-ЭДТА	7460
Мезоинозит	100
Гидролизат казеина	500
Тиамин	100
Пиридоксин	100
Никотиновая кислота	100
Сахароза	30000
Кинетин	1
2,4-Д	1
Вода	1000 мл
Агар	12000

Таблица 3

Ростовые параметры каллусных культур змееголовника дланевидного

Показатели	Значения, г
Индексы роста по: весу сырой биомассы	0,0867
Удельный рост по весу сырой биомассы, сут -1	0,0043

Способ получения каллусной культуры змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян змееголовника перекисью водорода в течение 10 мин и этиловым спиртом в течение 1 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава:

NH₄NO₃	33000 мг
KNO₃	38000 мг
CaCl₂x2H₂O	8800 мг
MgSO₄x7H₂O	7400 мг
KH₂PO₄	3400 мг
KI	166 мг
H₃BO₃	1240 мг
MnSO₄x4H₂O	4460 мг
ZnSO₄x7H₂O	1720 мг
Na₂MoO₄x2H₂O	50 мг
CuSO₄x5H₂O	5 мг
CoCl₂x6H₂O	5 мг
FeSO₄x7H₂O	5560 мг
Na-ЭДТА	7460 мг
Мезоинозит	100 мг
Тиамин	100 мг
Пиридоксин	100 мг
Никотиновая кислота	100 мг
Сахароза	2500 мг
Вода	1000 мл
Агар	7000 мг

дальнейшее помещение эксплантов растений, полученных in vitro, в питательную среду следующего состава:

NH₄NO₃	33000 мг
KNO₃	38000 мг
CaCl₂x2H₂O	8800 мг
MgSO₄x7H₂O	7400 мг
KH₂PO₄	3400 мг
KI	166 мг
H₃BO₃	1240 мг
MnSO₄x4H₂O	4460 мг
ZnSO₄x7H₂O	1720 мг
Na₂MoO₄x2H₂O	50 мг
CuSO₄x5H₂O	5 мг
CoCl₂x6H₂O	5 мг
FeSO₄x7H₂O	5560 мг
Na-ЭДТА	7460 мг
Мезоинозит	100 мг
Гидролизат казеина	500 мг
Тиамин	100 мг
Пиридоксин	100 мг
Никотиновая кислота	100 мг
Сахароза	30000 мг
Кинетин	1 мг
2,4 Д	1 мг
Вода	1000 мл
Агар	12000 мг

при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют ¼ каллусных биомасс, полученные каллусные культуры сохраняют пересадкой каждые 30 суток.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выделения суммы фурокумаринов из клеточной культуры болиголова пятнистого (Conium maculatum L.), характеризующийся тем, что собранную биомассу высушивают при температуре 25°С в темном защищенном от действия света месте, затем 100 г каллусной культуры болиголова пятнистого обезжиривают последовательно тремя порциями по 250 мл петролейного эфира, настаивают с добавлением 500 мл 70%-ного водного раствора ацетона и поэтапно обрабатывают 30 мл 10%-ного спиртового раствора калия гидроксида, 100 мл 10%-ного водного раствора калия гидроксида, 100 мл 10%-ного раствора кислоты хлористоводородной, добавляют 150 мл хлороформа, хлороформный слой отделяют и высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре.

Способ культивирования каллусной ткани vaccinium myrtillus l. // 2709175

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ культивирования каллусной ткани Vaccinium myrtillus L.

Устройство для биопечати одиночными тканевыми сфероидами и используемая в нем печатающая головка // 2701330

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена печатающая головка и устройство печати тканевыми сфероидами.

Способ получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и применение трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека // 2698397

Изобретение относится к биотехнологии и решает задачу способа получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и его применения для профилактики нарушений микрофлоры желудочно-кишечного тракта и ее восстановления при токсических и стрессовых воздействиях, а также для его применения для профилактики нарушений иммунной системы организма, связанных с нарушениями микрофлоры кишечника и барьерной функции кишечника, и восстановления иммунной системы при ее нарушениях в качестве иммуностимулирующего средства.

Универсальная донорная система для направленного воздействия на гены // 2687369

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к области точной трансформации растений, направленной геномной интеграции и экспрессии белка у растений. Предложена полинуклеотидная донорная кассета для трансформации растения, которая содержит связывающий домен сайт-специфической нуклеазы, аналитический домен, включающий полинуклеотидную последовательность с по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 142, и плазмидный домен.

Способ получения панкреатических эндокринных клеток (варианты) и способ увеличения выхода бета-клеток // 2684215

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, а именно к получению клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток и увеличению выхода β-клеток.

Трансформант для экспрессии цис-пренилтрансферазы и рецептора nogo-b // 2682047

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к трансформированной клетке для экспрессии цис-пренилтрансферазы и рецептора Nogo-B, полученной посредством введения в клетку кодирующего гена, кодирующего цис-пренилтрансферазу, и гена, кодирующего рецептор Nogo-B.

Носитель для культивирования клеток человека и животных // 2663131

Изобретение относится к области биохимии. Предложен носитель для культивирования клеток человека и животных.

Способ получения экстрактов из рода panax, включая дикий женьшень или женьшень, либо камбиальных меристематических клеток, происходящих из рода panax, или их экстрактов, содержащих редкие гинсенозиды в большом количестве // 2662953

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение относится к способу повышения содержания гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, в камбиальных меристематических клетках (CMCs) из рода Panax, который включает тепловую обработку культивируемых камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax при температуре от 85°C до 160°C, камбиальным меристематическим клеткам (CMCs) из рода Panax, в которых содержание гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, повышено по сравнению с их содержанием до тепловой обработки с помощью способа по п.

Использование лигандов эпинефрина для дифференцирования клеток панкреатической эндодермы // 2650813

Изобретение относится к области клеточной биологии, конкретно к получению клеток, экспрессирующих инсулин и индукции экспрессии инсулина в клетках панкреатической энтодермы.

Способ культивирования каллусной культуры полыни обыкновенной (artemisia vulgaris l.) // 2718254

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры дикорастущего растения полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян полыни растворами перекиси водорода (3% раствор) в течение 10 минут, этилового спирта (70% раствор) в течение 1 минуты, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде в течение 5 минут, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава, мг: NH4NO3 – 33000, KNO3 – 38000, CaCl2x2H2O – 8800, MgSO4x7H2O – 7400, KH2PO4 – 3400, KI – 166, H3BO3 – 1240, MnSO4x4H2O – 4460, ZnSO4x7H2O – 1720, Na2MoO4x2H2O – 50, CuSO4x5H2O – 5, CoCl2x6H2O – 5, FeSO4x7H2O – 5560, Na-ЭДТА – 7460, мезоинозит – 100, тиамин – 100, пиридоксин – 100, никотиновая кислота – 100, сахароза – 2500, вода – 1000 мл, агар – 7000, дальнейшее помещение листовых эксплантов, полученных из проростков, в питательную среду следующего состава, мг: NH4NO3 – 33000, KNO3 – 38000, CaCl2x2H2O – 8800, MgSO4x7H2O – 7400, KH2PO4 – 3400, KI – 166, H3BO3 – 1240, MnSO4x4H2O – 4460, ZnSO4x7H2O – 1720, Na2MoO4x2H2O – 50, CuSO4x5H2O – 5, CoCl2x6H2O – 5, FeSO4x7H2O – 5560, Na-ЭДТА – 7460, мезоинозит – 100, гидролизат казеина – 500, тиамин – 100, пиридоксин – 100, никотиновая кислота – 100, сахароза – 30000, 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота – 1, 6-бензиламинопурин - 1, нафтилуксусная кислота – 1, вода - 1000 мл, агар – 12000; при этом культивирование растений проводят в темноте при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 3 недели. Изобретение позволяет получить каллусную культуру полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) в условиях in vitro. 3 табл.