Композиции и способы, включающие варианты сериновой протеазы

Изобретение относится к биотехнологии. Описан вариант субтилизина. Указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью и содержащую аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранную из T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R и T022A-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R. Положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN’ Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1, причем вариант субтилизина представляет собой вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2. Указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности с указанной протеазой субтилизин GG36 Bacillus lentus, имеющей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2. Изобретение может быть использовано для чистки ткани или изделия. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 13 табл., 2 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает варианты сериновой протеазы. В частности, настоящее изобретение предлагает варианты сериновой протеазы с одной или более заменами по сравнению с эталонной сериновой протеазой. Кроме того, настоящее изобретение предлагает композиции, включающие эти варианты сериновой протеазы. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает чистящие композиции, включающие по меньшей мере один из этих вариантов сериновой протеазы, в частности, варианты субтилизина.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Несмотря на то что сериновые протеазы давно известны в области техники промышленных ферментов, по-прежнему существует необходимость в сконструированных протеазах, которые подходят для определенных условий и применений.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечней 1-19, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' из Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мера на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2, и обладает протеолитической активностью, и включают аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из Перечней 1-19, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' из Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из Перечней 1-19, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' из Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет собой вектор экспрессии, клетку-хозяина или способ получения любого из вышеупомянутых вариантов.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2, и обладает протеолитической активностью, и включают аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из Перечней 1-19, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' из Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет собой вектор экспрессии, клетку-хозяина или способ получения любого из вышеупомянутых вариантов.

В каждом перечисленном выше варианте осуществления вариант может обладать улучшенной чистящей способностью по сравнению с протеазой GG36, имеющей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает любые вышеуказанные варианты или нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты, и где общий заряд варианта составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 относительно общего заряда протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает композиции, имеющие по меньшей мере один из вариантов, перечисленных выше, где указанная композиция не является тканью или продуктом бытового ухода. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет собой способ чистки с использованием вышеупомянутой композиции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 приведено выравнивание зрелых эталонных протеаз, включая: BPN' (SEQ ID №:1) и GG36 (SEQ ID №:2). Каждое положение аминокислоты каждого варианта протеазы, в частности, вариантов субтилизина, описанных в данном документе, включая каждый вариант протеазы для холодной воды, пронумеровано согласно нумерации соответствующего положения аминокислоты в аминокислотной последовательности протеазы субтилизин BPN' Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID №:1), как показано на ФИГ.1, как установлено путем выравнивания аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью протеазы субтилизин BPN' Bacillus amyloliquefaciens. Таким образом, если не указано иное в настоящем изобретении, положения замен даны по отношению к BPN'.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает варианты сериновой протеазы, в частности варианты субтилизина. А именно, настоящее изобретение предлагает варианты сериновой протеазы, в частности варианты субтилизина, с одной или более заменами по сравнению с эталонной сериновой протеазой. Кроме того, настоящее изобретение предлагает композиции, включающие данные варианты сериновой протеазы, в частности, варианты субтилизина. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает чистящие композиции, включающие по меньшей мере один из данных вариантов сериновой протеазы, в частности, вариантов субтилизина.

Определения

Если не указано иное, практическое осуществление настоящего изобретения включает общепринятые методики, традиционно применяемые в молекулярной биологии, белковой инженерии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, которые находятся в компетенции специалиста в данной области. Такие методики известны специалистам в данной области и описаны в многочисленных текстах и справочниках, хорошо известных специалистам в данной области. Все патенты, патентные заявки, статьи и публикации, упомянутые в настоящем изобретении, как выше, так и ниже, настоящим однозначно включены в данное изобретение ссылкой.

Если не определено иное в настоящем изобретении, все технические и научные термины, применяемые в настоящем изобретении, имеют то же значение, которое традиционно понимается рядовым специалистов в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Специалистам в данной области известно множество технических словарей. Хотя при практическом осуществлении настоящего изобретения находят применение любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем изобретении, в настоящем изобретении описываются некоторые подходящие способы и материалы. Соответственно, термины, определяемые непосредственно ниже, полнее описаны на основе Описания изобретения в целом. Также применяемая в настоящем изобретении форма единственного числа включает указание на множественное число, если контекст явно не указывает на иное. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты пишутся слева направо в 5'-3' ориентации; аминокислотные последовательности пишутся слева направо в амино-карбокси ориентации, соответственно. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описываемыми методологией, протоколами и реагентами, поскольку они могут варьировать в зависимости от того, в каком контексте применяют их специалисты в данной области.

Практическое осуществление настоящего изобретения включает, если не указано иное, общепринятые методики чистки белка, молекулярной биологии, микробиологии, методики рекомбинантных ДНК и секвенирования белка, все из которых находятся в компетенции специалистов данной области.

Кроме того, заглавия, приведенные в настоящем изобретении, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления настоящего изобретения, которые можно получить на основании описания в целом. Соответственно, термины, определяемые непосредственно ниже, полнее определяются на основании описания в целом. Тем не менее для того, чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, ряду терминов ниже приведены определения.

Применяемые в настоящем изобретении термины “протеаза” и “протеиназа” относятся к ферментному белку, который обладает способностью разрушать другие белки. Протеаза обладает способностью осуществлять “протеолиз”, который начинает катаболизм белка путем гидролиза пептидных связей, которые соединяют вместе аминокислоты в пептидной или полипептидной цепи, формирующей белок. Данную активность протеазы в качестве расщепляющего белок фермента называют “протеолитической активностью”. Существует множество хорошо известных процедур для измерения протеолитической активности (см., например, Kalisz, "Microbial Proteinases," In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, (1988)). Например, протеолитическую активность можно измерить с помощью сравнительных анализов, которые анализируют соответствующую способность протеазы гидролизовать промышленный субстрат. Иллюстративные субстраты, пригодные в анализе протеазы или протеолитической активности, включают, но без ограничений, диметилказеин (Sigma C-9801), бычий коллаген (Sigma C-9879), бычий эластин (Sigma E-1625) и бычий кератин (ICN Biomedical 902111). Колориметрические анализы с использованием данных субстратов хорошо известны в данной области (см., например, WO 99/34011 и патент США № 6376450, оба из которых включены в настоящее изобретение ссылкой). pNA-анализ (см., например, Del Mar et al., Anal. Biochem. 99:316-320 [1979]) также находит применение в определении концентрации активного фермента для фракций, собранных в ходе градиентного элюирования. С помощью данного анализа измеряют скорость, при которой п-нитроанилин высвобождается по мере того, как фермент гидролизует растворимый синтетический субстрат, сукцинил-аланин-аланин-пролин-фенилаланин-р-нитроанилид (suc-AAPF-pNA). Скорость появления желтого цвета в результате реакции гидролиза измеряют при 410 нм на спектрофотометре, и она пропорциональна концентрации активного фермента. Кроме того, измерения абсорбции при 280 нанометрах (нм) можно применять для определения концентрации общего белка. Соотношение активный фермент/общий белок дает чистоту фермента.

Применяемый в настоящем изобретении термин “субтилизин” относится к любому члену семейства сериновых протеаз S8, описываемому в MEROPS - базе данных пептидаз (см., Rawlings et al., MEROPS: the peptidase database, Nucl Acids Res, 34 Database issue, D270-272 [2006]). Описываемое в данном документе семейство пептидаз S8 содержит сериновую эндопептидазу субтилизин и ее гомологи (Rawlings and Barrett, Biochem J., 290:205-218, [1993]). Семейство S8, также известное как семейство субтилаз, является вторым самым большим семейством сериновых пептидаз. К настоящему моменту были определены третичные структуры для нескольких членов семейства S8. Структура типичного белка S8 состоит из трех слоев, при этом семицепочечный β-пласт находится между двумя слоями спиралей. Субтилизин (S08.001) представляет собой типовую структуру для рода SB (SB). Несмотря на различную структуру, активные участки субтилизина и химотрипсина (S01.001) могут совмещаться, что позволяет сделать предположение, что схожесть является результатом скорее конвергентной, чем дивергентной эволюции.

Применяемые в настоящем изобретении термины “вариант протеазы”, “вариантная протеаза”, “вариантная сериновая протеаза”, “вариант сериновой протеазы”, “вариант субтилизина”, “мутантная протеаза” применяют в отношении протеаз, которые подобны эталонной протеазе (которой может быть протеаза субтилизин дикого типа), особенно по их функции, но имеют мутации в их аминокислотной последовательности, что отличает их в отношении последовательности от протеазы дикого типа или любой изначальной эталонной протеазы (т.е. “исходной” протеазы), от которой получена вариантная протеаза. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет “варианты GG36” (или “варианты субтилизина GG36”), где присутствуют мутации в зрелой последовательности GG36, приведенной в SEQ ID №:2. Однако не подразумевается, что эталонная протеаза ограничена какой-либо конкретной аминокислотной последовательностью. Кроме того, подразумевается, что данный термин охватывает варианты исходной протеазы, где последовательность исходной протеазы по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID №:2.

Применяемый в настоящем изобретении термин “вариант протеазы для холодной воды” означает вариант протеазы, в частности, варианты субтилизина, исходной протеазы, где протеаза субтилизин GG36 B. lentus имеет аминокислотную последовательность SEQ ID №:2, где указанный вариант протеазы, в частности, варианты субтилизина, имеет одну или более из следующих характеристик: a) эффективность по методике испытания 2, равную по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до примерно 10, от 1,1 до примерно 8 или даже от 1,1 до примерно 5; b) эффективность по методике испытания 3, равную по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до примерно 10, от 1,1 до примерно 8 или даже от 1,1 до примерно 5; c) эффективность по методике испытания 4, равную по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до примерно 10, от 1,0 до примерно 8 или даже от 1,0 до примерно 5; и/или d) эффективность по методике испытания 6, равную по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до примерно 10, от 1,0 до примерно 8 или даже от 1,0 до примерно 5; и/или е) эффективность по методике испытания 7, равную по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до примерно 15, от 1,1 до примерно 10 или даже от 1,1 до примерно 7. Методика испытания 2, методика испытания 3, методика испытания 4, методика испытания 6 и методика испытания 7 подробно описаны далее в разделе Пример 1 под заголовком “Методики испытания”. Кроме того, подразумевается, что данный термин охватывает варианты исходной протеазы, где последовательность исходной протеазы по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID №:2.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения исходная протеаза (т.е. “эталонная” или “изначальная” протеаза) является коммерчески доступной протеазой, включая, но без ограничений, протеазы, продаваемые под торговыми названиями SAVINASE®, POLARZYME®, KANNASE®, LIQUINASE®, LIQUINASE ULTRA®, SAVINASE ULTRA®, OVOZYME®, (от Novozymes A/S); MAXACAL®, PROPERASE®, PURAFECT®, FN3®, FN4® и PURAFECT OXP®, PURAFAST™, PURAFECT® PRIME, PURAMAX® (от Danisco US, Genencor Division); и таковые, доступные от Henkel/Kemira, а именно BLAP (последовательность, показанная на Фигуре 29 US 5352604 со следующими мутациями S99D+S101R+S103A+V104I+G159S, в настоящем изобретении далее называемая BLAP) и BLAP X (BLAP с S3T+V4I+V205I).

Применяемый в настоящем изобретении термин “вариантный полипептид” относится к полипептиду, включающему аминокислотную последовательность, которая отличается по меньшей мере на один аминокислотный остаток от аминокислотной последовательности исходного или эталонного полипептида (включая, но без ограничений, полипептиды дикого типа).

Применяемое в настоящем изобретении “род Bacillus” включает все виды в пределах рода “Bacillus”, который известен специалистам в данной области, включая, но без ограничений, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus и B. thuringiensis. Понятно, что род Bacillus продолжает подвергаться таксономической реорганизации. Таким образом, подразумевается, что род включает виды, которые были переклассифицированы, включая, но без ограничений, такие организмы, как B. stearothermophilus, который сейчас называется “Geobacillus stearothermophilus”. Производство устойчивых эндоспор в присутствии кислорода рассматривают как определяющий признак рода Bacillus, хотя данная характеристика также распространяется на недавно названные Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus и Virgibacillus.

Термины “полинуклеотид” и “нуклеиновая кислота”, которые применяют взаимозаменяемо в настоящем изобретении, относятся к полимеру с любой длиной из нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в цепи. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), полинуклеотид, включающий дезоксирибонуклеотиды, и РНК (рибонуклеиновая кислота), полимер из рибонуклеотидов, являются примерами полинуклеотидов или нуклеиновых кислот с различной биологической функцией. Полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты включают, но без ограничений, одно-, двух- или трехцепочечную ДНК, геномную ДНК, кДНК, РНК, гибрид ДНК-РНК или полимер, включающий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически, биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания. Следующие являются неограничивающими примерами полинуклеотидов: гены, фрагменты генов, хромосомные фрагменты, метка(и) экспрессируемых последовательностей (EST), экзоны, интроны, информационная РНК (иРНК), транспортная РНК (тРНК), рибосомная РНК (рРНК), рибозимы, комплементарная ДНК (кДНК), рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК с любой последовательностью, выделенная РНК с любой последовательностью, зонды нуклеиновой кислоты и праймеры. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды включают модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги, урацил, другие сахара и соединяющие группы, такие как фторрибоза и тиоат, и нуклеотидные ответвления. В конкретном варианте осуществления последовательность нуклеотидов прерывают ненуклеотидными компонентами.

Применяемый в настоящем изобретении термин "мутация" относится к изменениям, сделанным в изначальной аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты. Подразумевается, что данный термин охватывает замены, вставки и делеции.

Применяемый в настоящем изобретении термин “вектор” относится к конструкту нуклеиновой кислоты или полинуклеотидному конструкту, применяемому для введения или переноса нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот) или полинуклеотида(ов) в целевую клетку или ткань. Вектор, как правило, применяют для введения чужеродной ДНК в другую клетку или ткань. Вектор, в целом, включает последовательность ДНК, которая представляет собой трансген, и большую полинуклеотидную последовательность, которая служит в качестве "остова" вектора. Вектор, как правило, служит для переноса генетической информация, такой как вставляемый трансген, в целевую клетку или ткань с тем, чтобы изолировать, размножить или экспрессировать вставку в целевой клетке или ткани. Векторы включают плазмиды, клонирующие векторы, бактериофаги, вирусы (например, вирусный вектор), космиды, векторы экспрессии, челночные векторы, кассеты и т.п. Вектор, как правило, включает точку начала репликации, сайт множественного клонирования и селектируемый маркер. Способ вставки вектора в целевую клетку, как правило, называют трансфекцией. Трансфекцию клетки при помощи вирусного вектора, как правило, называют трансдукцией. Настоящее изобретение включает в некоторых вариантах осуществления вектор, который включает последовательность ДНК, кодирующую вариантную протеазу (например, предшественник или зрелую вариантную протеазу), которая функционально связана с подходящей пропоследовательностью (например, секреторной, сигнальной пептидной последовательностью и т.д.), способной влиять на экспрессию последовательности ДНК у подходящего хозяина.

Применяемый в настоящем изобретении термин “кассета экспрессии”, “плазмида экспрессии” или “вектор экспрессии” относится к конструкту нуклеиновой кислоты или вектору, полученному рекомбинантно или синтетически для экспрессии представляющей интерес нуклеиновой кислоты (например, чужеродной нуклеиновой кислоты или трансгена) в целевой клетке. Представляющая интерес нуклеиновая кислота, как правило, экспрессирует представляющий интерес белок. Вектор экспрессии или кассета экспрессии, как правило, включает промоторную нуклеотидную последовательность, которая управляет или способствует экспрессии чужеродной нуклеиновой кислоты. Вектор или кассета экспрессии, как правило, также включает любые другие указанные элементы нуклеиновой кислоты, которые делают возможной транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в целевой клетке. Рекомбинантную кассету экспрессии можно встроить в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Некоторые векторы экспрессии обладают способностью к встраиванию и экспрессии гетерологичных ДНК-фрагментов в клетке-хозяине. Многие прокариотические и эукариотические векторы экспрессии коммерчески доступны. Выбор соответствующих векторов экспрессии известен специалистам в данной области. Выбор соответствующих векторов экспрессии для экспрессии белка с последовательности нуклеиновой кислоты, встроенной в вектор экспрессии, известен специалистам в данной области.

ДНК-конструкт является искусственно сконструированным сегментом нуклеиновой кислоты, который можно ввести в целевую клетку или ткань. ДНК-конструкт, как правило, включает ДНК-вставку, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, который был субклонирован в вектор. Вектор может содержать гены бактериальной устойчивости для роста в бактериях и промотор для экспрессии представляющего интерес белка в организме. ДНК можно создать in vitro с помощью ПЦР или любой другой подходящей методики (методик), известной специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления ДНК-конструкт включает представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления последовательность функционально связана с дополнительными элементами, такими как управляющие элементы (например, промоторы и т.д.). ДНК-конструкт может дополнительно включать селектируемый маркер и может дополнительно включать входную последовательность, фланкируемую гомологичными фрагментами. Конструкт может включать другие негомологичные последовательности, добавленные к концам (например, челночные последовательности или фланги). В некоторых вариантах осуществления концы последовательностей смыкаются так, чтобы ДНК-конструкт образовывал замкнутый круг. Представляющая интерес последовательность нуклеиновой кислоты, которая встроена в ДНК-конструкт с помощью методик, хорошо известных в области техники, может представлять собой нуклеиновую кислоту дикого типа, мутантную или модифицированную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления ДНК-конструкт включает одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, гомологичных хромосоме клетки-хозяина. В других вариантах осуществления ДНК-конструкт включает одну или более негомологичных нуклеотидных последовательностей. После сборки ДНК-конструкта in vitro, его можно применять, например, для: 1) вставки гетерологичных последовательностей в требуемую целевую последовательность клетки-хозяина; и/или 2) мутагенеза участка хромосомы клетки-хозяина (т.е., замены эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью); 3) удаления целевых генов; и/или 4) введения реплицирующейся плазмиды в хозяина. “ДНК-конструкт” применяют взаимозаменяемо в настоящем изобретении с “кассетой экспрессии”.

Применяемый в настоящем изобретении термин “плазмида” относится к внехромосомной молекуле ДНК, которая способна реплицироваться независимо от хромосомной ДНК. Плазмида является двуцепочечной (ds) и может быть кольцевой, и ее, как правило, применяют в качестве клонирующего вектора.

Применяемый в настоящем изобретении в контексте введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку термин "введенная" относится к способу, подходящему для переноса последовательности нуклеиновой кислоты в клетку. Такие способы введения включают, но без ограничений, слияние протопластов, трансфекцию, трансформацию, электропорацию, конъюгацию и трансдукцию (см., например, Ferrari et al., “Genetics,” in Hardwood et al. (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pp. 57-72 [1989]).

Трансформация относится к генетической перемене клетки, которая происходит в результате поглощения, встраивания в геном и экспрессии генетического материала (например, ДНК).

Применяемое в настоящем изобретении выражение нуклеиновая кислота является “функционально связанной” с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, если она помещена в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с нуклеотидной кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. Сайт связывания рибосом может быть функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы способствовать трансляции кодирующей последовательности. Как правило, “функционально связанные” последовательности ДНК являются смежными. Однако энхансеры не обязаны быть смежными. Связывание осуществляют путем сшивания в подходящих сайтах рестрикции. Если таких сайтов нет, можно применять синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с традиционной практикой.

Применяемый в настоящем изобретении термин “ген” относится к полинуклеотиду (например, сегменту ДНК), который кодирует полипептид и включает участки, предшествующие и последующие кодирующим участкам, а также вставочные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

Применяемый в настоящем изобретении термин “рекомбинантные” в случае применения по отношению к клетке, как правило, указывает на то, что клетка была модифицирована введением гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, или что клетка происходит от клетки, модифицированной подобным образом. Например, рекомбинантная клетка может включать ген, не обнаруживаемый в идентичной форме у нативной (нерекомбинантной) формы клетки, или рекомбинантная клетка может включать нативный ген (обнаруживаемый у нативной формы клетки), но который был модифицирован и повторно введен в клетку. Рекомбинантная клетка может включать нуклеиновую кислоту, эндогенную по отношению к клетке, которая была модифицирована без удаления нуклеиновой кислоты из клетки; такие модификации включают модификации, получаемые путем замещения гена, сайт-специфической мутации и смежных методик, известных рядовым специалистам в данном области. Технология рекомбинантной ДНК включает методики получения рекомбинантной ДНК in vitro и перенос рекомбинантной ДНК в клетки, где она может экспрессироваться или размножаться с получением, таким образом, рекомбинантного полипептида. “Рекомбинация”, ”рекомбинирование” и “рекомбинированный” у полинуклеотидов или нуклеиновых кислот относится в целом к сборке или объединению двух или более нуклеиновых кислот или полинуклеотидных цепей или фрагментов с образованием нового полинуклеотида или нуклеиновой кислоты. Рекомбинантный полинуклеотид или нуклеиновую кислоту иногда называют химерой. Нуклеиновая кислота или полипептид является “рекомбинантным”, если он является искусственным или сконструированным, или происходит от искусственного или сконструированного белка или нуклеиновой кислоты.

Применяемый в настоящем изобретении термин “амплификация” нуклеиновой кислоты или гена относится к процессу, посредством которого конкретные последовательности ДНК диспропорционально реплицируются так, что амплифицированная нуклеиновая кислота или ген становятся присутствующими в более высоком количестве копий, чем изначально присутствуют в геноме. В некоторых вариантах осуществления отбор клеток по росту в присутствии лекарственного средства (например, ингибитора ингибируемого фермента) приводит к амплификации любого эндогенного гена, кодирующего требуемый генный продукт для роста в присутствии лекарственного средства, или к амплификации экзогенных (т.е. введенных) последовательностей, кодирующих данную нуклеиновую кислоту или генный продукт, или к тому и другому.

“Амплификация” является особым случаем репликации нуклеиновой кислоты, вовлекающим матричную специфичность. Ее следует противопоставить неспецифичной матричной репликации (т.е. репликации, которая является матрично-зависимой, но не зависит от конкретной матрицы). Матричная специфичность в данном случае отличается от точности репликации (т.е. синтеза точной полинуклеотидной последовательности) и нуклеотидной (рибо- или дезоксирибо-) специфичности. Матричную специфичность часто описывают на основании "целевой" специфичности. Целевые последовательности являются “целями” в смысле того, что их считают отсортировываемыми от другой нуклеиновой кислоты. Методики амплификации разработаны главным образом для такой отсортировки.

Применяемый в настоящем изобретении термин “праймер” относится к олигонуклеотиду (полимеру из нуклеотидных остатков), который либо естественно встречается, как, например, очищенный фрагмент рестрикции, либо получен синтетически, и который способен выполнять роль точки инициации синтеза при размещении в условиях, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, который комплементарен цепи нуклеиновой кислоты (т.е. в присутствии нуклеотидов и индуцирующего средства, такого как ДНК-полимераза, и при подходящей температуре и pH). Праймер предпочтительно является одноцепочечным для максимальной эффективности при амплификации, но альтернативно может быть двухцепочечным. Если двухцепочечный, то праймер сначала подвергают обработке для разделения его цепей перед применением для получения продуктов удлинения. В некоторых вариантах осуществления праймером является олигодезоксирибонуклеотид. Праймер должен быть достаточно длинным для того, чтобы инициировать синтез продуктов удлинения в присутствии индуцирующего средства. Точная длина праймера зависит от ряда факторов, включая температуру, источник праймера и применения способа.

Применяемый в настоящем изобретении термин “зонд” относится к олигонуклеотиду, который либо встречается в природе, как, например, очищенный фрагмент рестрикции, либо получен синтетически, рекомбинантно или с помощью ПЦР-амплификации, и который, как правило, способен гибридизироваться с другим представляющим интерес олигонуклеотидом. Зонд может быть одноцепочечным или двухцепочечным. Зонды пригодны при детекции, идентификации и выделении конкретных генных последовательностей. Подразумевается, что любой зонд, применяемый в настоящем изобретении, будет помечен любой “репортерной группой” так, чтобы она была детектируема в любой системе детектирования, включая, но без ограничений, ферментную (например, ELISA, а также гистохимические анализы на основе ферментов), флуоресцентную, радиоактивную и люминесцентную системы. Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничено какой-либо конкретной системой детектирования или меткой.

Применяемый в настоящем изобретении термин “цель” при применении в отношении полимеразной цепной реакции относится к участку нуклеиновой кислоты, связываемому праймерами, применяемыми для полимеразной цепной реакции. Таким образом, “цель” стремятся отсортировать от других последовательностей нуклеиновой кислоты. Нуклеотидный “сегмент” представляет собой участок нуклеиновой кислоты в пределах целевой последовательности нуклеиновой кислоты.

Применяемый в настоящем изобретении термин "полимеразная цепная реакция" (ПЦР) относится к способам патентов США №№ 4683195, 4683202 и 4965188, настоящим включаемых ссылкой, которые включают способы повышения концентрации сегмента целевой последовательности в смеси геномной ДНК без клонирования или чистки. Данный способ амплификации целевой последовательности хорошо известен в данной области техники.

Применяемый в настоящем изобретении термин “реагенты для амплификации” относится к тем реагентам (например, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буфер и т.д.), которые необходимы для амплификации, за исключением праймеров, матрицы нуклеиновой кислоты и амплифицирующего фермента. Как правило, реагенты для амплификации наряду с другими компонентами реакции помещены и содержатся в реакционном сосуде (пробирка для теста, микролунка и т.д.).

Применяемый в настоящем изобретении термин “эндонуклеаза рестрикции” или “рестрикционный фермент” относится к ферменту (например, бактериальному ферменту), который способен разрезать двухцепочечную или одноцепочечную ДНК в или рядом со специфической последовательностью нуклеотидов, известной как сайт рестрикции. Нуклеотидная последовательность, включающая сайт рестрикции, распознается и расщепляется данной эндонуклеазой рестрикции или рестрикционным ферментом и зачастую является сайтом для вставки фрагментов ДНК. Сайт рестрикции можно встроить в вектор экспрессии или ДНК-конструкт.

“Гомологичная рекомбинация” относится к обмену фрагментами ДНК между двумя молекулами ДНК или спаренными хромосомами в сайте с идентичными или почти идентичными нуклеотидными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления хромосомная интеграция является гомологичной рекомбинацией.

Говорят, что нуклеиновая кислота или полинуклеотид “кодирует” полипептид, если в своем нативном состоянии или при воздействии на него способами, известными специалистам в данной области, он может транскрибироваться и/или транслироваться с получением полипептида или его фрагмента. Также говорят, что антисмысловая цепь такой нуклеиновой кислоты кодирует последовательность.

Как известно из уровня техники, последовательность ДНК может транскрибироваться РНК-полимеразой с получением последовательности РНК, но последовательность РНК может обратно транскрибироваться обратной транскриптазой с получением последовательности ДНК.

“Штамм-хозяин” или “клетка-хозяин” относится к подходящему хозяину для вектора экспрессии, включающего представляющую интерес последовательность ДНК. Представляющая интерес последовательность ДНК может экспрессировать представляющий интерес белок в штамме-хозяине или клетке-хозяине.

“Белок” или “полипептид” включает полимерную последовательность аминокислотных остатков. Термины “белок” и “полипептид” в настоящем изобретении применяют взаимозаменяемо. В ходе настоящего раскрытия применяют одно- и 3-буквенный код для аминокислот, как определено в соответствии с IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (Объединенная комиссия IUPAC-IUB по биохимической номенклатуре) (JCBN). Отдельная буква X относится к любой из двадцати аминокислот. Также понятно, что полипептид может кодироваться несколькими нуклеотидными последовательностями вследствие вырожденности генетического кода. Мутации названы с помощью однобуквенного кода для исходной аминокислоты с последующими тремя или двумя числовыми номерами положения и затем однобуквенным кодом для вариантной аминокислоты. Например, мутация глицина (G) в положении 87 на серин (S) представлена в виде “G087S” или “G87S”. Множественные мутации указаны при помощи вставки “-” между мутациями. Мутации в положениях 87 и 90 представлены в виде либо “G087S-A090Y”, либо “G87S-A90Y”, либо “G87S+A90Y”, либо “G087S+A090Y”. Для делеции применяют однобуквенный код "Z". Для вставки относительно исходной последовательности однобуквенный код "Z" расположен на левой стороне номера положения. Для делеции однобуквенный код "Z" расположен на правой стороне номера положения. Для вставок номер положения представляет собой номер положения перед вставленной аминокислотой(ами), плюс 0,01 для каждой аминокислоты. Например, вставка трех аминокислот аланин (A), серин (S) и тирозин (Y) между положением 87 и 88 показано как “Z087,01A-Z087,02S-Z087,03Y”. Таким образом, объединение всех вышеупомянутых мутаций плюс делеция в положении 100 представляет собой: “G087S-Z087,01A-Z087,02S-Z087,03Y-A090Y-A100Z”.

“Пропоследовательность” или “пропептидная последовательность” относится к аминокислотной последовательности между сигнальной пептидной последовательностью и зрелой последовательностью протеазы, которая необходима для секреции протеазы. Отщепление пропоследовательности или пропептидной последовательности дает в результате зрелую активную протеазу.

Термин “сигнальная последовательность” или “сигнальный пептид” относится к последовательности аминокислотных остатков, которая может принимать участие в секреции или непосредственном транспорте зрелой формы или формы-предшественника белка. Сигнальная последовательность, как правило, расположена на N-конце по отношению к последовательности белка-предшественника или последовательности зрелого белка. Сигнальная последовательность может быть эндогенной или экзогенной. Одна иллюстративная экзогенная сигнальная последовательность включает первые семь аминокислотных остатков сигнальной последовательности из субтилизина Bacillus subtilis, слитые с остатком сигнальной последовательности субтилизина из Bacillus lentus (ATCC 21536). Сигнальная последовательность в норме отсутствует у зрелого белка. Сигнальная последовательность, как правило, отщепляется от белка сигнальной пептидазой после транспортировки белка.

Термин “гибридная сигнальная последовательность” относится к сигнальным последовательностям, у которых часть последовательности получена от хозяина экспрессии и слита с сигнальной последовательностью подлежащего экспрессии гена. В некоторых вариантах осуществления используют синтетические последовательности.

Термин “зрелая” форма белка, полипептида или пептид относится к функциональной форме белка, полипептида или пептида без сигнальной пептидной последовательности и пропептидной последовательности.

Термин форма “предшественник” белка или пептида относится к зрелой форме белка с пропоследовательностью, функционально связанной с N- или С-концом белка. Предшественник может также иметь “сигнальную” последовательность, функционально связанную с N-концом пропоследовательности. Предшественник также может иметь дополнительные полинуклеотиды, которые вовлечены в посттрансляционную активность (например, полинуклеотиды, отщепляемые от него с тем, чтобы оставить зрелую форму белка или пептида).

Термин “дикого типа” в отношении аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты указывает на то, что аминокислотная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты является нативной или встречающейся в природе последовательностью. Применяемый в настоящем изобретении термин “встречающаяся в природе” относится к чему-либо (например, белкам, аминокислотам или последовательностям нуклеиновых кислот), которые обнаруживаются в природе (т.е. над ними не были произведены действия посредством рекомбинантных способов).

Применяемый в настоящем изобретении термин “не встречающаяся в природе” относится к чему-либо, что не обнаруживается в природе (например, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, получаемые в лаборатории).

Применяемые в настоящем изобретении в отношении положений аминокислотных остатков “соответствующий (чему-либо)”, или “соответствует (чему-либо)” или “соответствует” относится к аминокислотному остатку в пронумерованном положении в белке или пептиде или аминокислотному остатку, который аналогичен, гомологичен или эквивалентен пронумерованному остатку в белке или пептиде. Применяемое в настоящем изобретении выражение “соответствующий участок” в целом относится к аналогичному положению среди родственных белков или эталонного белка.

Термины “происходящая от” и “полученная от” относятся не только к протеазе, продуцированной или продуцируемой штаммом обсуждаемого организма, но также к протеазе, кодируемой последовательностью ДНК, выделенной из такого штамма и продуцируемой у организма-хозяина, содержащего такую последовательность ДНК. Кроме того, данный термин относится к протеазе, которая кодируется последовательностью ДНК синтетического и/или кДНК-происхождения и которая имеет отличительные характеристики обсуждаемой протеазы. Для примера, выражение “протеазы, происходящие от Bacillus” относится к таким ферментам, которые обладают протеолитической активностью и которые в природе продуцируются Bacillus, а также к серинпротеазам, наподобие тем, которые продуцируются источниками Bacillus, но которые благодаря применению методик генной инженерии продуцируются организмами, не относящимися к Bacillus, трансформированными нуклеиновой кислотой, кодирующей серинпротеазы.

Термин “идентичные” в контексте двух последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относится к остаткам у двух последовательностей, которые являются одинаковыми при выравнивании на максимальное соответствие, которое измеряют с помощью одного из следующих алгоритмов анализа или сравнения последовательностей.

Применяемое в настоящем изобретении “гомологичные гены” относится к паре генов от различных, но обычно родственных видов, которые соответствуют друг другу и которые идентичны или очень подобны друг другу. Термин охватывает гены, которые обособились в результате видообразования (т.е. развитие новых видов) (например, ортологичные гены), а также гены, которые были обособлены в результате генетической дупликацией (например, паралогичные гены).

Применяемое в настоящем изобретении “гомология” относится к подобию или идентичности последовательностей, при этом идентичность является предпочтительной. Гомологию можно определить с помощью стандартных методик, известных в области техники (см., например, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; компьютерную программу, такую как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Мэдисон, Висконсин); и Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387-395 [1984]). Одним примером пригодного алгоритма является PILEUP. PILEUP создает множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с помощью прогрессивных попарных выравниваний. Он также может построить древо, показывающее кластерные взаимосвязи, применяемые для создания выравнивания. В PILEUP применяют упрощение способа прогрессивного выравнивания Feng и Doolittle (см. Feng and Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 [1987]). Способ подобен таковому, описанному у Higgins и Sharp (см. Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]). Пригодные параметры PILEUP включают стандартный штраф за открытие гэпа 3,00, стандартный штраф за продолжение гэпа 0,10 и взвешенные конечные гэпы. Другим примером пригодного алгоритма является алгоритм BLAST, описанный у Altschul et al., (см. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 [1990]; и Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]). Особенно пригодной программой BLAST является программа WU-BLAST-2 (см. Altschul et al., Meth. Enzymol. 266:460-480 [1996]). В WU-BLAST-2 применяют несколько параметров поиска, большинство из которых выставлены как значения по умолчанию. Корректируемые параметры выставляют со следующими значениями: длина перекрывания =1, доля перекрывания =0,125, пороговая длина «слова» (T)=11. Параметры HSP S и HSP S2 являются динамическими значениями и устанавливаются самой программой в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретной базы данных, против которой проводят поиск представляющей интерес последовательности. Однако значения можно корректировать для увеличения чувствительности.

Процентная идентичность последовательностей между эталонной последовательностью и представляющей интерес тестовой последовательностью может быть легко определена специалистом в данной области. Процентную идентичность, общую для полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, определяют путем прямого сравнения информации последовательностей между молекулами с помощью выравнивания последовательностей и определения идентичности способами, известными в данной области техники. Примером алгоритма, который подходит для определения подобия последовательностей, является алгоритм BLAST (см. Altschul, et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 [1990]). Программное обеспечение для проведения анализов BLAST общедоступно благодаря Национальному центру биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information). Данный алгоритм включает сначала идентификацию пары последовательностей с наибольшим сходством (HSP) путем идентификации коротких "слов" с длиной W в последовательности запроса, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительному пороговому баллу T при выравнивании со "словом" такой же длины в последовательности из базы данных. Эти изначальные хиты соседних слов играют роль начальных точек для поиска более длинных HSP, которые их содержат. Хиты слов продлевают в обоих направлениях вдоль каждой из двух последовательностей, подвергаемых сравнению, до тех пор, пока можно повышать кумулятивный балл выравнивания. Продление хитов «слов» останавливают, если: кумулятивный балл выравнивания падает на количество X от максимального достигнутого значения; кумулятивный балл достигает нуля или ниже; или достигают конца любой из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, T и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLAST использует по умолчанию длину "слова" (W) 11, матрицу замен BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1992]) выравнивания (B) 50, параметр правдоподобия (E) 10, M'5, N'-4 и сравнение обеих цепей.

Затем алгоритм BLAST осуществляет статистический анализ подобия между двумя последовательностями (см., например, Karlin и Altschul, выше). Одной мерой подобия, предоставляемой алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая обеспечивает указание на вероятность, с которой могут случайно встречаться совпадения между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновую кислоту считают подобной нуклеиновой кислоте серинпротеазы по настоящему изобретению, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестовой нуклеиновой кислоты с нуклеиновой кислотой серинпротеазы составляет менее чем примерно 0,1, более предпочтительно менее чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно менее чем примерно 0,001. В случае, когда тестовая нуклеиновая кислота кодирует полипептид серинпротеазы, ее считают подобной указанной нуклеиновой кислоте серинпротеазы, если сравнение дает в результате наименьшую суммарную вероятность менее чем примерно 0,5 и более предпочтительно менее чем примерно 0,2.

“Идентичная” в процентах или процентная “идентичность” в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относится к двум или более последовательностям, которые являются одинаковыми или имеют указанный процент остатков нуклеиновой кислоты или аминокислотных остатков, соответственно, которые одинаковы при сравнении и выравнивании на максимальное подобие, которое определяют при помощи алгоритма сравнения последовательностей или визуального просмотра. “Процентная идентичность последовательностей”, или “% идентичность”, или “% идентичность последовательностей”, или “% идентичность аминокислотных последовательностей” рассматриваемой аминокислотной последовательности к эталонной (т.е. запроса) аминокислотной последовательности означает, что рассматриваемая аминокислотная последовательность является идентичной (т.е. на основании аминокислота-с-аминокислотой) на указанный процент с аминокислотной последовательностью запроса на длину сравнения при оптимальном выравнивании последовательностей. Таким образом, 80% идентичность аминокислотных последовательностей или 80% идентичность в отношении двух аминокислотных последовательностей означает, что 80% аминокислотных остатков в двух оптимально выровненных аминокислотных последовательностях являются идентичными.

“Процентная идентичность последовательностей”, или “% идентичность”, или “% идентичность последовательностей”, или “% идентичность нуклеотидных последовательностей” рассматриваемой последовательности нуклеиновой кислоты с эталонной (т.е. запроса) последовательностью нуклеиновой кислоты означает, что рассматриваемая последовательность нуклеиновой кислоты идентична (т.е. на основании нуклеотид-с-нуклеотидом для полинуклеотидной последовательности) на указанный процент с последовательностью запроса на длину сравнения при оптимальном выравнивании последовательностей. Таким образом, 80% идентичность нуклеотидных последовательностей или 80% идентичность в отношении двух последовательностей нуклеиновых кислот означает, что 80% нуклеотидных остатков в двух оптимально выровненных последовательностях нуклеиновых кислот являются идентичными.

В некоторых вариантах осуществления “процентная идентичность последовательностей” или “% идентичность последовательностей”, или “% идентичность” рассматриваемой последовательности с последовательностью запроса может быть рассчитана путем оптимального выравнивания двух последовательностей и сравнения двух оптимально выровненных последовательностей на длину сравнения. Определяют количество положений в оптимальном выравнивании, в которых у обеих последовательностей встречаются идентичные остатки, таким образом получая количество совпавших положений, и затем количество совпавших положений делят на общее количество положений длины сравнения (которая, если не указано иное, представляет собой длину последовательности запроса). Полученное число умножают на 100 с получением процентной идентичности последовательности для рассматриваемой последовательности к последовательности запроса.

“Оптимальное выравнивание” или “оптимально выровненные” относится к выравниванию двух (или более) последовательностей, дающему высокий балл процентной идентичности. Например, оптимального выравнивания двух белковых последовательностей можно достичь с помощью выравнивания вручную последовательностей так, чтобы были выровнены друг с другом максимальное количество идентичных аминокислотных остатков в каждой последовательности, или с помощью компьютерных программ, или процедур, описываемых в настоящем изобретении или известных из уровня техники. Оптимального выравнивания двух последовательностей нуклеиновых кислот можно достичь с помощью выравнивания вручную последовательностей так, чтобы были выровнены друг с другом максимальное количество идентичных нуклеотидных остатков в каждой последовательности, или с помощью компьютерных программ, или процедур, описываемых в настоящем изобретении или известных из уровня техники.

В некоторых вариантах осуществления две полипептидные последовательности считают "оптимально выровненными", если они выровнены с применением заданных параметров, таких как заданная матрица аминокислотных замен, штраф за наличие разрыва (также называемый штраф за открытие разрыва) и штраф за продление разрыва, так, чтобы достигать наиболее высокого балла подобия, который возможен для данной пары последовательностей. Матрицу замен BLOSUM62 (см. Henikoff и Henikoff выше) часто применяют в качестве матрицы оценки для замен по умолчанию в алгоритмах выравнивания полипептидных последовательностей (например, BLASTP). Штраф за наличие разрыва накладывают за введение разрыва из одной аминокислоты в одной из выравниваемых последовательностей, а штраф за продление разрыва накладывают за каждое положение остатка в разрыве. Иллюстративные параметры выравнивания представляют собой матрицу замен SUM62, штраф за наличие разрыва=11 и штраф за продление разрыва=1. Балл выравнивания определяют по аминокислотным положениям каждой последовательности, в которых начинается и заканчивается выравнивание (например, окно выравнивания) и необязательно по вставке разрыва или множественных разрывов в одну или обе последовательности так, чтобы достигался самый высокий возможный балл подобия.

Оптимальное выравнивание между двумя или более последовательностями можно определить вручную с помощью визуального просмотра или с помощью компьютера, такого как, но без ограничений, например, программы BLASTP для аминокислотных последовательностей и программы BLASTN для последовательностей нуклеиновых кислот (см., например, Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997); см. также сайт Национального центра биотехнологической информации (NCBI)).

Можно сказать, что представляющий интерес полипептид является “по сути идентичным” с эталонным полипептидом, если представляющий интерес полипептид содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с примерно 70%, по меньшей мере примерно с 75%, по меньшей мере примерно с 80%, по меньшей мере примерно с 85%, по меньшей мере примерно с 90%, по меньшей мере примерно с 91%, по меньшей мере примерно с 92%, по меньшей мере примерно с 93%, по меньшей мере примерно с 94%, по меньшей мере примерно с 95%, по меньшей мере примерно с 96%, по меньшей мере примерно с 97%, по меньшей мере примерно с 98%, по меньшей мере примерно с 99% или по меньшей мере примерно с 99,5% идентичностью последовательности к аминокислотной последовательности эталонного полипептида. Процентную идентичность между двумя такими полипептидами можно определить вручную путем просмотра двух оптимально выровненных полипептидных последовательностей или с помощью компьютерных программ или алгоритмов (например, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) с применением стандартных параметров. Одним показателем того, что два полипептида являются по сути идентичными, является то, что первый полипептид является иммунологически перекрестно-реактивным со вторым полипептидом. Как правило, полипептиды, которые отличаются по консервативным аминокислотным заменам, являются иммунологически перекрестно-реактивными. Таким образом, полипептид по сути идентичен второму полипептиду, например, если два пептида отличаются только по консервативной аминокислотной замене или одной или более консервативными аминокислотными заменами.

Можно сказать, что представляющая интерес нуклеиновая кислота является “по сути идентичной” с эталонной нуклеиновой кислотой, если представляющая интерес нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность по меньшей мере примерно с 70%, по меньшей мере с примерно 75%, по меньшей мере с примерно 80%, по меньшей мере с примерно 85%, по меньшей мере с примерно 90%, по меньшей мере с примерно 91%, по меньшей мере с примерно 92%, по меньшей мере с примерно 93%, по меньшей мере с примерно 94%, по меньшей мере с примерно 95%, по меньшей мере с примерно 96%, по меньшей мере с примерно 97%, по меньшей мере с примерно 98%, по меньшей мере с примерно 99% или по меньшей мере с примерно 99,5% идентичностью последовательности к нуклеотидной последовательности эталонной нуклеиновой кислоты. Процентную идентичность между двумя такими нуклеиновыми кислотами можно определить вручную путем просмотра двух оптимально выровненных последовательностей нуклеиновых кислот или с помощью компьютерных программ или алгоритмов (например, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) с применением стандартных параметров. Одним показателем того, что две последовательности нуклеиновых кислот являются по сути идентичными, является то, что две молекулы нуклеиновых кислот гибридизируются друг с другом в жестких условиях (например, в диапазоне от средней до высокой жесткости).

Нуклеиновая кислота или полинуклеотид является “выделенным”, если он частично или полностью отделен от других компонентов, включая, но без ограничений, например, другие белки, нуклеиновые кислоты, клетки и т.д. Аналогично, полипептид, белок или пептид является “выделенным”, если он частично или полностью отделен от других компонентов, включая, но без ограничений, например, другие белки, нуклеиновые кислоты, клетки и т.д. В молярном масштабе, выделенное частица является намного многочисленней других частиц в композиции. Например, выделенная частица может включать по меньшей мере примерно 50%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или примерно 100% (в молярном масштабе) всех присутствующих макромолекулярных частиц. Предпочтительно, представляющую интерес частицу чистят до необходимой гомогенности (т.е. посторонние частицы нельзя детектировать в композиции традиционными способами детектирования). Чистоту и гомогенность можно определить с помощью ряда методик, хорошо известных в области техники, таких как электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле образца белка или нуклеиновой кислоты, с последующей визуализацией после окрашивания. При необходимости, для чистки материала можно использовать методику с высокой разрешающей способностью, такую как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или подобные средства.

Термин “очищенный” при применении к нуклеиновым кислотам или полипептидам обычно означает нуклеиновую кислоту или полипептид, который в общем не содержит других компонентов при определении аналитическими методиками, хорошо известными в области техники (например, очищенный полипептид или полинуклеотид образует отдельную полосу в электрофоретическом геле, хроматографическом элюате и/или средах, подвергаемых центрифугированию в градиенте плотности). Например, нуклеиновая кислота или полипептид, который дает фактически одну полосу в электрофоретическом геле, является “очищенным”. Очищенная нуклеиновая кислота или полипептид имеет чистоту по меньшей мере примерно 50%, обычно чистоту по меньшей мере примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99%, примерно 99,5%, примерно 99,6%, примерно 99,7%, примерно 99,8% или более (например, весовой процент в молярном масштабе). Сходным образом, настоящее изобретение предоставляет способы обогащения композиций одной или более молекулами по настоящему изобретению, такими как один или более полипептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению. Композиция является обогащенной в отношении молекулы, если имеет место значительное увеличение концентрации молекулы после применения методики чистки или обогащения. По сути чистый полипептид или полинуклеотид по настоящему изобретению (например, по сути чистая вариантная протеаза или полинуклеотид, кодирующий вариантную протеазу по настоящему изобретению, соответственно), как правило, будут включать по меньшей мере примерно 55%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98, примерно 99%, примерно 99,5% или более от массы (в молярном масштабе) всех макромолекулярных частиц в конкретной композиции.

Сходным образом, настоящее изобретение предлагает способы обогащения композиций в отношении одной или более молекул по настоящему изобретению, как, например, один или более полипептидов по настоящему изобретению (например, одна или более вариантных протеаз по настоящему изобретению) или одна или более нуклеиновых кислот по настоящему изобретению (например, одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих одну или более вариантных протеаз по настоящему изобретению). Композиция является обогащенной в отношении молекулы, если имеет место значительное увеличение концентрации молекулы после применения методики чистки или обогащения. По сути чистый полипептид или полинуклеотид, как правило, будет включать по меньшей мере примерно 55%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98, примерно 99%, примерно 99,5% или более от массы (в молярном масштабе) всех макромолекулярных частиц в конкретной композиции.

Применяемый в настоящем изобретении термин “комбинаторный мутагенез” или “комбинаторный” относится к способам, в которых создают библиотеки вариантов нуклеиновых кислот эталонной последовательности нуклеиновой кислоты. В данных библиотеках варианты содержат одну или более мутаций, выбранных из заранее заданного набора мутаций. Способы также обеспечивают средства введения случайных мутаций, которые не являлись членами заранее заданного набора мутаций. Некоторые такие способы включают способы, изложенные в патенте США № 6582914, который настоящим включен при помощи ссылки. Некоторые такие способы комбинаторного мутагенеза включают и/или охватывают способы, практически осуществленные в коммерчески доступных наборах (например, набор для осуществления направленного на множество сайтов мутагенеза QUIKCHANGE® (Stratagene), ПЦР-слияние/ПЦР с удлинением).

Применяемое в настоящем изобретении “обладающая улучшенными свойствами”, которое применяют по отношению к вариантной протеазе, относится к вариантной протеазе с улучшенным или усиленным моющим или чистящим действием и/или улучшенной или усиленной стойкостью, необязательно с сохраненным моющим или чистящим действием относительно соответствующей эталонной протеазы (например, дикого типа или встречающейся в природе протеазы). Улучшенные свойства вариантной протеазы могут включать улучшенное моющее или чистящее действие и/или улучшенную стойкость. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает вариантные протеазы по настоящему изобретению, которые проявляют одно из нескольких из следующих свойств: улучшенное действие в отношении мытья рук, улучшенное действие в отношении мытья посуды вручную или руками, улучшенное действие в отношении автоматического мытья посуды, улучшенное действие в отношении стирки и/или улучшенная стойкость по сравнению с эталонной протеазой (например, протеаза дикого типа, такая как субтилизин дикого типа).

Применяемый в настоящем изобретении термин “функциональный анализ” относится к анализу, который приводит показатель активности белка. В некоторых вариантах осуществления данный термин относится к аналитическим системам, в которых белок анализируется на его способность функционировать в его обычной функциональной активности. Например, в случае ферментов, функциональный анализ включает определение эффективности фермента при катализе реакции.

Применяемый в настоящем изобретении термин “целевое свойство” относится к свойству изначального гена, которое подлежит перемене. Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо конкретным целевым свойством. Однако в некоторых вариантах осуществления целевым свойством является стойкость генного продукта (например, устойчивость к денатурации, протеолизу или другим разрушающим факторам), в то время как в других вариантах осуществления меняют уровень продуцирования у продуцирующего хозяина.

Применяемый в настоящем изобретении термин “свойство” или его грамматические эквиваленты в контексте нуклеиновой кислоты относится к любой характеристике или отличительной черте нуклеиновой кислоты, которую можно подвергнуть отбору или детектировать. Данные свойства включают, но без ограничений, свойство, влияющее на связывание полипептида, свойство, придаваемое клетке, включающей конкретную нуклеиновую кислоту, свойство, влияющее на транскрипцию гена (например, сила промотора, узнавание промотора, промоторная регуляция, энхансерная функция), свойство, влияющее на процессинг РНК (например, сплайсинг РНК, стойкость РНК, конформация РНК и посттранскрипционная модификация), свойство, влияющее на трансляцию (например, уровень, регуляция, связывание иРНК с рибосомальными белками, посттрансляционная модификация). Например, сайт связывания транскрипционного фактора, полимеразы, регуляторного фактора и т.д. у нуклеиновой кислоты можно подвергнуть переменам для получения необходимых характеристик или для идентификации нежелательных характеристик.

Применяемый в настоящем изобретении термин “свойство” или его грамматические эквиваленты в контексте полипептида (включая белки) относится к любой характеристике или отличительной черте полипептида, которую можно подвергнуть отбору или детектировать. Данные свойства включают, но без ограничений, стойкость к окислению, субстратную специфичность, каталитическую активность, ферментативную активность, термическую стойкость, стойкость к щелочной среде, профиль pH-активности, устойчивость к протеолитическому разрушению, KM, kкат, соотношение kкат/kM, фолдинг белка, индукцию иммунного ответа, способность связываться с лигандом, способность связываться с рецептором, способность секретироваться, способность выводиться на поверхности клетки, способность олигомеризироваться, способность к передаче сигнала, способность к стимуляции клеточной пролиферации, способность к ингибированию клеточной пролиферации, способность к индукции апоптоза, способность подвергаться модификации путем фосфорилирования или гликозилирования и/или способность лечить заболевание и т.д.

Применяемый в настоящем изобретении термин “скрининг” имеет свое обычное в области техники значение. В одном иллюстративном способе скрининга обеспечивают мутантную нуклеиновую кислоту или кодируемый ею вариантный полипептид и оценивают или определяют свойство мутантной нуклеиновой кислоты или вариантного полипептида, соответственно. Определенное свойство мутантной нуклеиновой кислоты или вариантного полипептида можно сравнить со свойством соответствующей нуклеиновой кислоты-предшественника (исходной) или со свойством соответствующего исходного полипептида, соответственно.

Специалисту в данной области будет понятно, что процедура скрининга для получения нуклеиновой кислоты или белка с измененным свойством зависит от свойства изначального материала, модификацией которого намереваются способствовать получению мутантной нуклеиновой кислоты. Таким образом, специалист в данной области признает, что настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным свойством, подлежащим скринингу, и что в последующем описании свойств приведены лишь иллюстративные примеры. Способы скрининга в отношении любого конкретного свойства в целом описаны в уровне техники. Например, можно измерять связывание, pH, специфичность и т.д., до и после мутации, где изменение указывает на перемену. Предпочтительно, скрининги проводят способом с высокой пропускной способностью, включая проведение одновременного скрининга множества образцов, включая, но без ограничений, анализы с использованием чипов, фагового дисплея и множественных субстратов и/или индикаторов.

Как применяется в настоящем изобретении, в некоторых вариантах осуществления способ скрининга включает один или более этапов отбора, при которых представляющие интерес варианты обогащают из популяции вариантов. Примеры данных вариантов осуществления включают отбор вариантов, которые придают преимущество в отношении роста организму-хозяину, а также фаговый дисплей или любой другой способ индикации, где варианты можно собирать из популяции вариантов на основании их связывающих или каталитических свойств. В некоторых вариантах осуществления библиотеку вариантов подвергают воздействию стресса (например, тепло, денатурация и т.д.) и затем варианты, которые все еще остаются интактными, идентифицируют в скрининге или обогащают с помощью отбора. Подразумевается, что данный термин охватывает любые подходящие средства отбора. Действительно, не подразумевается, что настоящее изобретение ограничено каким-либо конкретным способом скрининга.

Термины “модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты” и “модифицированный ген” применяют в настоящем изобретении взаимозаменяемо в отношении последовательности нуклеиновой кислоты, которая включает делецию, вставку или обрыв встречающейся в природе (т.е. дикого типа) последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления продукт экспрессии модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты является укороченным белком (например, если модификацией является делеция или обрыв последовательности). В некоторых вариантах осуществления укороченный белок сохраняет биологическую активность. В альтернативных вариантах осуществления продукт экспрессии модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты является удлиненным белком (например, модификации, включающие вставку в последовательность нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная вставка в последовательность нуклеиновой кислоты дает в результате укороченный белок (например, если вставка приводит к образованию стоп-кодона). Таким образом, вставка может привести либо к укороченному белку, либо к удлиненному белку в качестве продукта экспрессии.

“Мутантная” последовательность нуклеиновой кислоты, как правило, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая имеет изменение по меньшей мере в одном кодоне, встречающемся в последовательности дикого типа клетки-хозяина, так, что продукт экспрессии мутантной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой белок с измененной аминокислотной последовательностью относительно белка дикого типа. Продукт экспрессии может обладать измененной функциональной способностью (например, усиленная ферментативная активность).

Применяемая в настоящем изобретении фраза “изменение в субстратной специфичности” относится к изменениям в субстратной специфичности фермента. В некоторых вариантах осуществления изменение в субстратной специфичности определяют как изменение в kкат и/или Km для конкретного субстрата, возникающее в результате мутаций фермента или изменения условий реакции. Субстратную специфичность фермента определяют путем сравнения каталитических эффективностей, которые он проявляет с различными субстратами. Данные определения находят практическое применение при оценке эффективности мутантных ферментов, поскольку в целом желательно получать вариантные ферменты, которые проявляют большие соотношения kкат/Km в отношении представляющих интерес субстратов. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничено какой-либо конкретной субстратной композицией или субстратной специфичностью.

Применяемое в настоящем изобретении “поверхностное свойство” применяют в отношении электростатического заряда, а также таких свойств, как гидрофобность и гидрофильность, проявляемые поверхностью белка.

Применяемый в настоящем изобретении термин “суммарный заряд” определяют как сумму всех зарядов, присутствующих в молекуле. “Изменения суммарного заряда” осуществляют в отношении исходной белковой молекулы для получения варианта, который имеет суммарный заряд, отличающийся от исходной молекулы (т.е. вариант имеет суммарный заряд, который не является таким же, как заряд исходной молекулы). Например, замена нейтральной аминокислоты отрицательно заряженной аминокислотой или положительно заряженной аминокислоты нейтральной аминокислотой дает в результате суммарный заряд -1 относительно исходной молекулы. Замена положительно заряженной аминокислоты отрицательно заряженной аминокислотой дает в результате суммарный заряд -2 относительно исходного. Замена нейтральной аминокислоты положительно заряженной аминокислотой или отрицательно заряженной аминокислоты нейтральной аминокислотой дает в результате суммарный заряд +1 относительно исходного. Замена отрицательно заряженной аминокислоты положительно заряженной аминокислотой дает в результате суммарный заряд +2 относительно исходного. Суммарный заряд исходного белка также можно изменять путем делеции и/или вставки заряженных аминокислот.

Термины "термически стойкий" и “термостойкий”, и “термостойкость” относятся к протеазам, которые сохраняют указанное значение ферментативной активности после воздействия установленными температурами в течение заданного периода времени в условиях, преобладающих в ходе протеолитического, гидролитического, чистящего или другого процесса по настоящему изобретению, при воздействии измененными температурами. “Измененные температуры” охватывают повышенные или пониженные температуры. В некоторых вариантах осуществления протеазы сохраняют по меньшей мере примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 92%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% протеолитической активности после воздействия измененными температурами в течение заданного периода времени, например, по меньшей мере примерно 60 минут, примерно 120 минут, примерно 180 минут, примерно 240 минут, примерно 300 минут и т.д.

Термин “повышенная стойкость” в контексте стойкой к окислению, комплексону, термически стойкой и/или стойкой к pH протеазы относится к более высокой сохраняемой протеолитической активности с течением времени по сравнению с другими протеазами (например, субтилизиновыми протеазами) и/или ферментами дикого типа.

Термин “сниженная стойкость” в контексте стойкой к окислению, комплексону, термически стойкой и/или стойкой к pH протеазы относится к более низкой сохраняемой протеолитической активности с течением времени по сравнению с другими протеазами (например, субтилизиновые протеазы) и/или ферментами дикого типа.

Термин “чистящая активность” относится к чистящему действию, достигаемому с помощью вариантной протеазы или эталонной протеазы в условиях, преобладающих в ходе протеолитического, гидролитического, чистящего или другого процесса по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления чистящее действие вариантной протеазы или эталонной протеазы можно определить с помощью различных анализов в отношении чистки одного или более различных, чувствительных к ферментам загрязнений на предмете или поверхности (например, загрязнение, полученное от еды, травы, крови, чернила, молока, растительного масла и/или яичного белка). Чистящее действие вариантной или эталонной протеазы можно определить путем воздействия на загрязнение на предмете или поверхности стандартным моющим условием(ями) и оценки степени, до которой удаляется загрязнение, с помощью различных хроматографических, спектрофотометрических или других количественных методик. Иллюстративные анализы и способы по исследованию чистящего действия известны в области техники и включают, но без ограничений, описанные в WO 99/34011 и патенте США 6605458, обе из которых включены в настоящее изобретение ссылкой, а также анализы и способы по исследованию чистящего действия, включенные в Примеры, приведенные ниже.

Термин “эффективное чистящее количество” вариантной протеазы или эталонной протеазы относится к количеству протеазы, при котором достигается требуемый уровень ферментативной активности в конкретной чистящей композиции. Такие эффективные количества легко установит рядовой специалист в данной области, и они основываются на многих факторах, таких как конкретная применяемая протеаза, практическое чистящее применение, конкретная композиция чистящей композиции и того, нужна ли жидкая или сухая (например, гранулированная, таблетка, брусок) композиция и т.д.

Термин “чистящий вспомогательный материал” относится к любому жидкому, твердому или газообразному материалу, включенному в чистящую композицию, отличному от вариантной протеазы по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции настоящего изобретения включают один или более чистящих вспомогательных материалов. Каждый чистящий вспомогательный материал, как правило, выбирают в зависимости от конкретного типа и формы чистящей композиции (например, жидкость, гранула, порошок, брусок, паста, спрей, таблетка, гель, пена или другая композиция). Предпочтительно, каждый чистящий вспомогательный материал является совместимым с протеазным ферментом, применяемым в композиции.

Термин “усиленное действие” в контексте чистящей активности относится к увеличенной или большей чистящей активности с помощью фермента на определенных чувствительных к ферменту загрязнениях, таких как яйцо, молоко, трава, чернила, растительное масло и/или кровь, которая определяется путем обычного оценивания после стандартного цикла мытья и/или множественных циклов мытья.

Термин “сниженное действие” в контексте чистящей активности относится к пониженной или меньшей чистящей активности с помощью фермента на определенных чувствительных к ферменту загрязнениях, таких как яйцо, молоко, трава или кровь, которая определяется путем обычного оценивания после стандартного цикла мытья.

Термин “сравнительное действие” в контексте чистящей активности вариантной протеазы по настоящему изобретению относится по меньшей мере к примерно 60%, по меньшей мере к примерно 70%, по меньшей мере к примерно 75%, по меньшей мере к примерно 80%, по меньшей мере к примерно 85%, по меньшей мере к примерно 90%, по меньшей мере к примерно 91%, по меньшей мере к примерно 92%, по меньшей мере к примерно 93%, по меньшей мере к примерно 94%, по меньшей мере к примерно 95%, по меньшей мере к примерно 96%, по меньшей мере к примерно 97%, по меньшей мере к примерно 98%, по меньшей мере к примерно 99%, по меньшей мере к примерно 99,5% чистящей активности сравнительной или эталонной протеазы (например, коммерчески доступных протеаз), включая, но без ограничений, например, протеазу OPTIMASE™ (Genencor), протеазные продукты PURAFECT™ (Genencor), протеазу SAVINASE™ (Novozymes), BPN'-варианты (см., например, патент США № Re 34606), протеазу RELASE™, DURAZYME™, EVERLASE™, KANNASE™ (Novozymes), протеазы MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE™ (Genencor; см. также патент США № Re 34606 и патенты США №№ 5700676; 5955340; 6312936 и 6482628), и вариантные продукты протеазы B. lentus (например, описанные в WO 92/21760, WO 95/23221 и/или WO 97/07770). Чистящее действие можно определить путем сравнения вариантных протеаз по настоящему изобретению с эталонными субтилизиновыми протеазами в различных анализах по исследованию чистящего действия в отношении чувствительных к ферменту загрязнений, таких как трава, кровь, чернила, растительное масло и/или молоко, которое определяют с помощью обычных спектрофотометрических или аналитических методик после условий стандартного цикла мытья.

Применяемый в настоящем изобретении термин “потребительский продукт” означает продукт по уходу за тканью и по уходу за домом. Применяемый в настоящем изобретении термин “продукт по уходу за тканью и по уходу за домом” или “продукт по уходу за тканью и по уходу за домашним хозяйством” включает продукты, которые обычно задуманы для применения или потребления в форме, в которой они продаются, и которые предназначены для обработки тканей, твердых поверхностей и любых других поверхностей, и чистящие системы только для ухода и чистки неживых поверхностей, а также продукты-кондиционеры для тканей и другие продукты, специально разработанные для ухода и сбережения тканей, и ароматизаторы, включая: ароматизаторы, включающие освежители воздуха и системы доставки запаха, средство по уходу за салоном автомобиля, средство по уходу за домашними животными, средство по уходу за домашним скотом, средство личной гигиены, средство по уходу за драгоценностями, средство для мытья посуды, средство для кондиционирования ткани (включая смягчение и/или авиваж), моющее средство для стирки, добавку и/или средство по уходу для стирки и ополаскивания, чистящие композиции для предварительной обработки, средство для чистки и/или обработки твердых поверхностей, включая средства для чистки пола и унитаза, средства для чистки и/или обработки стекла, средства для чистки и/или обработки плитки, средства для чистки и/или обработки керамики и другие чистящие средства для потребительского применения или применения в учреждениях. В некоторых вариантах осуществления продукты по уходу за тканью и по уходу за домом являются подходящими для применения на ранах и/или коже. “Продукт по уходу за тканью и по уходу за домом” включает потребительские продукты и продукты для учреждений.

Применяемый в настоящем изобретении термин “не имеющий отношение к продуктам по уходу за тканью и по уходу за домом” относится к композициям, которые добавляют к другим композициям для получения конечного продукта, которым может быть продукт по уходу за тканью и по уходу за домом.

Применяемый в настоящем изобретении термин “чистящая композиция для учреждений” относится к продуктам, подходящим для применения в учреждениях, включая, но без ограничений, школы, больницы, фабрики, магазины, корпорации, здания, рестораны, офисные комплексы и здания, перерабатывающие и/или производственные предприятия, ветеринарные клиники, аграрно-промышленные фермы, крупные аграрно-промышленные фермы и т.д.

Применяемый в настоящем изобретении термин “чистящая композиция и/или композиция для обработки” является подклассом продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, который включает, если не указано иное, композиции, подходящие для чистки и/или обработки предметов. Такие продукты включают, но без ограничений, продукты для обработки тканей, твердых поверхностей и любых других поверхностей в области ухода за домом и ухода за тканью, включая: ароматизаторы, включая освежители воздуха и системы доставки запаха, средство по уходу за салоном автомобиля, средство для мытья посуды, средство для кондиционирования ткани (включая смягчение и/или авиваж), моющее средство для стирки, добавку и/или средство по уходу для стирки и ополаскивания, средство для чистки и/или обработки твердых поверхностей, включая средства для чистки пола и унитаза, гранулированные или порошковые универсальные или "с высокой моющей способностью" средства для мытья, особенно чистящие моющие средства; жидкие, гелеобразные или в форме пасты универсальные средства для мытья, особенно так называемые жидкие формы с высокой моющей способностью; жидкие моющие средства для тонкой легкой ткани; средства для ручного мытья посуды или средства для мытья посуды с низкой моющей способностью, особенно таковые сильно пенящегося типа; средства для машинного мытья посуды, включая различные типы таблеток, гранулированные, жидкие и вспомогательные ополаскивающие для домашнего применения и применения в учреждениях: шампуни для автомобилей или ковров, средства для чистки ванн, включая средства для чистки унитазов; а также в качестве чистящих вспомогательных средств, таких как отбеливающие добавки и "карандаш-пятновыводитель" или средства типа предварительной обработки, продукты, загруженные в субстрат, такие как салфетки с добавленной пропиткой мягчителем-антистатиком.

Действительно, применяемое в настоящем изобретении выражение “чистящая композиция” или “чистящий состав” по настоящему изобретению относится к любой композиции по настоящему изобретению, пригодной для удаления или устранения соединения (например, нежелательного соединения) с объекта, предмета или поверхности, подлежащей чистке, включая, но без ограничений, например, ткань, предмет из ткани, предмет столовой посуды, предмет столовой утвари, предмет стеклянной посуды, контактные линзы, другой твердый субстрат, волосы (шампунь) (включая волосы человека или волосяной покров животных), кожу (мыло или и крем), зубы (ополаскиватели для рта, зубные пасты), поверхность предмета или объекта (например, твердые поверхности, такие как твердая поверхность стола, столешницы, стены, предмета мебели, пола, потолка, предмета, не имеющего отношение к столовой посуде, предмета, не имеющего отношение к столовой утвари, и т.д.), фильтры, мембраны (например, фильтрующие мембраны, включая, но без ограничений, ультрафильтрующие мембраны) и т.д. Данный термин охватывает любой материал и/или добавляемое соединение, выбранное по конкретном типу требуемой чистящей композиции и форме продукта (например, жидкая, гелеобразная, гранулированная, в виде спрея или другая композиция), при условии, что композиция совместима с протеазой и другим ферментом(ами), применяемыми в данной композиции. Конкретный выбор материалов чистящей композиции легко осуществить, принимая во внимание поверхность, объект, предмет или ткань, подлежащие чистке, и требуемую форму композиции для условий чистки в ходе применения.

Чистящие композиции и чистящие составы включают любую композицию, которая подходит для чистки, отбеливания, дезинфекции и/или стерилизации любого объекта, предмета и/или поверхности. Такие композиции и составы включают, но без ограничений, например, жидкие и/или твердые композиции, включая чистящие или моющие композиции (например, чистящие или моющие композиции для белья и моющие композиции для тонкой легкой ткани в виде жидкости, таблетки, геля, бруска, гранулы и/или в твердом виде; чистящие композиции и составы для твердых поверхностей, как, например, для стеклянных, деревянных, керамических и металлических столешниц и окон; средства для чистки ковров; средства для чистки печей; освежители тканей; мягчители тканей; и чистящие или моющие композиции-усилители для белья и текстильного изделия, вспомогательные чистящие композиции для белья и пятновыводящие чистящие композиции для белья; композиции для мытья посуды, включая композиции для ручного мытья посуды или мытья посуды вручную (например, моющие средства для “ручного” мытья посуды или мытья посуды “вручную”) и композиции для автоматического мытья посуды (например, “моющие средства для автоматического мытья посуды”).

Чистящая композиция или чистящие составы, применяемые в настоящем изобретении, включают, если не указано иное, гранулированные или порошковые универсальные или с высокой моющей способностью средства для мытья, особенно чистящие моющие средства; универсальные средства для мытья в форме жидкости, гранулы, геля, твердой форме, таблетки или пасты, особенно так называемые типы жидких моющих средств с высокой моющей способностью (HDL) или порошковых моющих средств с высокой моющей способностью (HDD); жидкие моющие средства для тонкой легкой ткани; средства для ручного мытья посуды или мытья посуды вручную, включая средства сильно пенящегося типа; моющие средства для ручного мытья посуды или мытья посуды вручную, автоматического мытья посуды или для столовой посуды или столовой утвари, включая различные типы таблеток, порошков, твердые, гранулированные, жидкие, гелеобразные и вспомогательные для ополаскивания для домашнего применения и применения в учреждениях; жидкие чистящие и дезинфицирующие средства, включая антибактериальные типы для мытья рук, чистящие бруски, ополаскиватели для рта, средства для чистки протезов, шампуни для автомобилей, шампуни для ковров, средства для чистки ванн; шампуни для волос и/или ополаскиватели для волос для людей и других животных; гели для душа, и пены для ванн, и средства для чистки металлов; а также вспомогательные чистящие средства, такие как отбеливающие добавки и “карандаш-пятновыводитель” или средства типа предварительной обработки. В некоторых вариантах осуществления гранулированные композиции находятся в “плотной” форме; в некоторых вариантах осуществления жидкие композиции находятся в “концентрированной” форме.

Применяемые в настоящем изобретении "чистящие композиции для тканей" включают моющие композиции для ручной и автоматической стирки, включая вспомогательные композиции для стирки и композиции, подходящие для применения при замачивании и/или предварительной обработке загрязненных тканей (например, одежды, белья и других текстильных материалов).

Применяемые в настоящем изобретении “не относящиеся к чистящим композициям для тканей” включают чистящие композиции для нетекстильных (т.е. нетканевых) поверхностей, включая, но без ограничений, например, моющие композиции для ручного мытья, или для мытья вручную, или автоматического мытья посуды, чистящие композиции для рта, чистящие композиции для зубных протезов и композиции личной гигиены.

Применяемый в настоящем изобретении термин “композиция для чистки и/или обработки тканевой и/или твердой поверхности” является подклассом композиций для чистки и обработки, который включает, если не указано иное, гранулированные или порошковые универсальные или "с высокой моющей способностью" средства для мытья, особенно чистящие моющие средства; жидкие, гелеобразные или пастообразные универсальные средства для мытья, особенно так называемые жидкие типы с высокой моющей способностью; жидкие моющие средства для тонкой легкой ткани; средства для ручного мытья посуды или средства для мытья посуды с низкой моющей способностью, особенно средства сильно пенящегося типа; средства для мытья посуды в посудомоечной машине, включая различные типы таблеток, гранул, жидкостей и вспомогательные для ополаскивания для домашнего применения и применения в учреждениях; жидкие чистящие и дезинфицирующие средства, шампуни для автомобилей или ковров, средства для чистки ванн, включая средства для чистки унитазов; продукты для кондиционирования тканей, включая смягчение и/или авиваж, которые могут быть в жидкой, твердой форме и/или форме салфетки с пропиткой мягчителем-антистатиком; а также чистящие вспомогательные средства, такие как отбеливающие добавки и "карандаш-пятновыводитель" или средства типа предварительной обработки, продукты, загруженные в субстрат, такие как салфетки с добавленной пропиткой мягчителем-антистатиком. Все такие продукты, которые являются применимыми, могут находиться в стандартной, концентрированной или даже высококонцентрированной форме, даже настолько, чтобы такие продукты могли, в некотором аспекте, быть безводными.

Применяемый в настоящем изобретении термин “моющая композиция” или “моющий состав” применяют в отношении композиции, предназначенной для применения в моющей среде для чистки загрязненных или грязных объектов, включая конкретные тканевые и/или нетканевые объекты или предметы. Такие композиции по настоящему изобретению не ограничены конкретной моющей композицией или составом. Действительно, в некоторых вариантах осуществления моющие средства по настоящему изобретению включают по меньшей мере одну вариантную протеазу по настоящему изобретению и, кроме того, одно или более поверхностно-активных средств, трансферазу(ы), гидролитические ферменты, оксидоредуктазы, модифицирующие добавки (например, соль-модифицирующая добавка), отбеливающие средства, активаторы отбеливателя, разновидности синьки, флуоресцентные красители, средства, препятствующие слеживанию, дезодораторы, активаторы ферментов, антиоксиданты и/или солюбилизаторы. В некоторых случаях соль-модифицирующая добавка является смесью силикатной соли и фосфатной соли, предпочтительно с большим количеством силиката (например, метасиликат натрия), чем фосфата (например, триполифосфат натрия). Некоторые композиции по настоящему изобретению, такие как, но без ограничений, чистящие композиции или моющие композиции, не содержат какого-либо фосфата (например, фосфатной соли или фосфатной модифицирующей добавки).

Применяемый в настоящем изобретении термин “отбеливание” относится к обработке материала (например, ткани, белья, технической целлюлозы и т.д.) или поверхности в течение достаточно длительного времени и/или при соответствующем pH и/или температурных условиях до достижения эффекта осветления (т.е. беления) и/или чистки материала. Примеры химических веществ, подходящих для отбеливания, включают, но без ограничений, например, ClO2, H2O2, перкислоты, NO2 и т.д.

Применяемое в настоящем изобретении “моющее действие” протеазы (например, вариантной протеазы по настоящему изобретению) относится к вкладу вариантной протеазы в мытье, который обеспечивает дополнительное чистящее действие моющему средству по сравнению с моющим средством без добавления вариантной протеазы к композиции. Моющее действие сравнивают при соответствующих условиях мытья. В некоторых системах испытания другие соответствующие факторы, такие как моющая композиция, концентрация пены, жесткость воды, механика мытья, время, pH и/или температура, можно контролировать таким образом, чтобы подражать условию(ям), типичному для домашнего применения в определенном рыночном сегменте (например, ручное мытье посуды, автоматическое мытье посуды, чистка столовой посуды, чистка столовой утвари, чистка ткани и т.д.).

Термин "соответствующие условия мытья" применяют в настоящем изобретении для обозначения условий, в частности, температуры мытья, времени, механики мытья, концентрации пены, типа моющего средства и жесткости воды, в действительности применяемых в быту, в сегменте рынка, ориентированного на ручное мытье посуды, автоматическое мытье посуды или моющие средства для стирки.

Термин "улучшенное моющее действие" применяют для указания на то, что достигается лучший конечный результат при удалении загрязнений в соответствующих условиях мытья, или что необходимо меньше вариантной протеазы, от массы, для получения такого же конечного результата по отношению к соответствующей дикого типа или изначальной исходной протеазе.

Применяемый в настоящем изобретении термин “дезинфицирование” относится к удалению загрязняющих веществ с поверхностей, а также ингибированию или уничтожению микробов на поверхностях предметов. Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничено какой-либо конкретной поверхностью, предметом или подлежащим удалению загрязняющим веществом(ами) или микробами.

"Плотная" форма чистящих композиций в настоящем изобретении лучше всего отражается по плотности и, в пересчете на композицию, по количеству неорганической соли-наполнителя. Неорганические соли-наполнители являются традиционными ингредиентами моющих композиций в порошковой форме. В традиционных моющих композициях соли-наполнители присутствуют в значительных количествах, как правило, от примерно 17 до примерно 35% от массы общей композиции. Наоборот, в плотных композициях соль-наполнитель присутствует в количествах, не превышающих примерно 15% от общей композиции. В некоторых вариантах осуществления соль-наполнитель присутствует в количествах, не превышающих примерно 10% или более предпочтительно примерно 5% от массы композиции. В некоторых вариантах осуществления неорганические соли-наполнители выбирают из сульфатных и хлоридных солей щелочных и щелочноземельных металлов. В некоторых вариантах осуществления солью-наполнителем является сульфат натрия.

Положение аминокислотного остатка в данной аминокислотной последовательности, как правило, пронумеровано в настоящем изобретении с помощью нумерации положения соответствующего аминокислотного остатка аминокислотной последовательности субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1. Аминокислотная последовательность субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens из SEQ ID №:1, таким образом, служит в качестве эталонной последовательности. Данную аминокислотную последовательность, такую как аминокислотная последовательность вариантной протеазы, описываемая в настоящем изобретении, можно выровнять с последовательностью BPN' (SEQ ID №:1) с помощью алгоритма выравнивания, который описан в настоящем изобретении, и аминокислотный остаток в данной аминокислотной последовательности, который выравнивается (предпочтительно оптимально выравнивается) с аминокислотным остатком в последовательности BPN', можно условно пронумеровать исходя из соответствующего аминокислотного остатка в последовательности субтилизина BPN'. Альтернативно, если положения аминокислотных остатков последовательностей субтилизиновой вариантной протеазы пронумерованы с помощью действительной нумерации положений аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности GG36 (SEQ ID №:2), и не исходя из соответствующих аминокислотных положений в последовательности BPN' после выравнивания, то субтилизиновую вариантную протеазу можно описывать как вариантную протеазу от протеазы GG36, приведенной в SEQ ID №:2

В целом, номенклатура, применяемая в настоящем изобретении, и многие из лабораторных процедур клеточного культивирования, молекулярной генетики, молекулярной биологии, химии нуклеиновых кислот и химии белка, описываемые ниже, хорошо известны и обычно используются рядовыми специалистами в данной области. Способы получения и обращения со способами, в которых задействуют рекомбинантные нуклеиновые кислоты, синтез нуклеиновых кислот, способы клеточного культивирования и встраивание трансгена (например, трансфекция, электропорация) известны специалистам в данной области и описаны в многочисленных типовых текстах. Этапы синтеза и чистки олигонуклеотидов, как правило, осуществляют в соответствии с инструкциями. Методики и процедуры обычно осуществляют в соответствии с традиционными способами, хорошо известными в области техники и различных общих источниках, которые приведены по всему данному документу. Полагают, что процедуры, приведенные в них, хорошо известны рядовым специалистам в данной области, и они приведены для удобства читателя.

Полипептиды по настоящему изобретению

Настоящее изобретение предоставляет новые полипептиды, которые могут в целом называться “полипептиды по настоящему изобретению ”. Полипептиды по настоящему изобретению включают выделенные, рекомбинантные, по сути чистые или не встречающиеся в природе полипептиды вариантных протеаз, включая, например, полипептиды варианта субтилизина, обладающие ферментативной активностью (например, протеолитической активностью). В некоторых вариантах осуществления полипептиды по данному изобретению, такие как вариант субтилизина, или вариант GG36, имеющий последовательность SEQ ID №:2, обладает улучшенной чистящей эффективностью по сравнению с исходной, например, протеазой GG36, имеющей последовательность SEQ ID №:2. В некоторых вариантах осуществления по настоящему изобретению пригодны в применениях для чистки и могут быть включены в чистящие композиции, которые пригодны в способах чистки предмета или поверхности (например, поверхности предмета), нуждающихся в чистке.

В некоторых вариантах осуществления вариантная протеаза по настоящему изобретению включает “вариантный субтилизин”. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет “вариантную протеазу Bacillus sp.”. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет “вариантный субтилизин Bacillus sp.”. В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет выделенный вариант субтилизина. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предоставляет выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизина GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID №:2.

В любых вариантах осуществления настоящее изобретение включает выделенную, рекомбинантную, по сути чистую или не встречающуюся в природе вариантную протеазу, обладающую протеолитической активностью, полипептид которой включает полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 86%, по меньшей мере примерно 87%, по меньшей мере примерно 88%, по меньшей мере примерно 89%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 91%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 93%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98%, по меньшей мере примерно 99%, по меньшей мере примерно 99,5% или 100% идентичность последовательности с аминокислотными последовательностями, кодирующими вариантные протеазы, представленные в настоящем изобретении.

Как отмечалось выше, полипептиды вариантной протеазы по настоящему изобретению обладают ферментативными активностями (например, протеолитическими активностями) и, таким образом, пригодны в применениях для чистки, включая, но без ограничений, способы чистки предметов столовой посуды, предметов столовой утвари, тканей и предметов, имеющих твердые поверхности (например, твердая поверхность стола, столешницы, стены, предмета мебели, пола, потолка и т.д.). Иллюстративные чистящие композиции, включающие один или более полипептидов вариантных протеаз по настоящему изобретению, описаны ниже. Ферментативную активность (например, протеазную активность) полипептида вариантной протеазы по настоящему изобретению можно легко определить с помощью процедур, хорошо известных рядовому специалисту в данной области. Примеры, представленные ниже, описывают способы оценки ферментативной активности, чистящего действия и/или моющего действия. Действие вариантных протеаз по настоящему изобретению при удалении загрязнений (например, белковое загрязнение), чистке твердых поверхностей или чистке белья, предмета(ов) столовой посуды или предмета(ов) столовой утвари можно легко определить с помощью процедур, хорошо известных в данной области, и/или с помощью процедур, изложенных в Примерах.

Полипептид по настоящему изобретению может быть подвергнут различным изменениям, таким как одна или более аминокислотных вставок, делеций и/или замен, либо консервативных, либо неконсервативных, включая случаи, где такие изменения по сути не изменяют ферментативную активность полипептида. Аналогично, нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть подвергнута различным изменениям, таким как одна или более замен у одной или более нуклеиновых кислот в одном или более кодонах, так, чтобы конкретный кодон кодировал такую же или иную аминокислоту, приводя либо к молчащей вариации (например, мутация в нуклеотидной последовательности приводит к молчащей мутации в аминокислотной последовательности, например, когда кодируемая аминокислота не изменяется мутацией нуклеиновой кислоты), либо немолчащей вариации, одна или более делеций у одной или более нуклеиновых кислот (или кодонов) в последовательности, одно или более присоединений или вставок у одной или более нуклеиновых кислот (или кодонов) в последовательности, и/или расщепление или одно или более укорачиваний одной или более нуклеиновых кислот (или кодонов) в последовательности. Многие такие изменения в последовательности нуклеиновой кислоты могут по сути не изменять ферментативную активность получаемой в результате кодируемой вариантной протеазы по сравнению с вариантной протеазой, кодируемой первоначальной последовательностью нуклеиновой кислоты. Нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению также можно модифицировать для включения одного или более кодонов, которые обеспечивают оптимальную экспрессию в системе экспрессии (например, бактериальная система экспрессии), при этом, при необходимости, указанный один или более кодонов продолжают кодировать одинаковую аминокислоту (аминокислоты).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет класс полипептидов, включающий полипептиды вариантных протеаз, обладающие требуемой ферментативной активностью (например, протеазной активностью или активностью чистящего действия), которые включают последовательности с аминокислотными заменами, описанными в настоящем изобретении, а также, которые включают одну или более дополнительных аминокислотных замен, таких как консервативные или неконсервативные замены, где полипептид проявляет, поддерживает или примерно поддерживает требуемую ферментативную активность (например, протеазную активность или субтилизиновую активность, отражаемую в чистящей активности или чистящем действии вариантной протеазы). Аминокислотные замены в соответствии с настоящим изобретением могут включать, но без ограничений, одну или более неконсервативных замен и/или одну или более консервативных аминокислотных замен. Консервативная замена аминокислотных остатков, как правило, включает обмен члена в одном функциональном классе аминокислотных остатков на остаток, который принадлежит к тому же функциональному классу (идентичные аминокислотные остатки считаются функционально гомологичными или консервативными при вычислении процентной функциональной гомологи). Консервативная аминокислотная замена, как правило, включает замену аминокислоты в аминокислотной последовательности функционально сходной аминокислотой. Например, функционально сходны аланин, глицин, серин и треонин, и поэтому могут служить в качестве консервативных аминокислотных замен друг для друга. Аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота способны служить в качестве консервативных замен друг для друга. Аспарагин и глутамин способны служить в качестве консервативных замен друг для друга. Аргинин, лизин и гистидин способны служить в качестве консервативных замен друг для друга. Изолейцин, лейцин, метионин и валин способны служить в качестве консервативных замен друг для друга. Фенилаланин, тирозин и триптофан способны служить в качестве консервативных замен друг для друга.

Можно предположить другие группы консервативных аминокислотных замен. Например, аминокислоты могут быть сгруппированы по сходной функции или химической структуре или составу (например, кислотные, основные, алифатические, ароматические, серосодержащие). Например, алифатическая группировка может включать: глицин (G), аланин (A), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I). Другие группы, включающие аминокислоты, которые рассматривают в качестве консервативных замен друг для друга, включают: ароматические: фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); серосодержащие: метионин (M), цистеин (C); основные: аргинин (R), лизин (K), гистидин (H); кислотные: аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E); неполярные незаряженные остатки: цистеин (C), метионин (M) и пролин (P); гидрофильные незаряженные остатки: серин (S), треонин (T), аспарагин (N) и глутамин (Q). Дополнительные группировки аминокислот хорошо известны специалистам в данной области и описаны в различных стандартных учебниках. Перечень полипептидных последовательностей в настоящем изобретении вместе с вышеуказанными группами замен предоставляет недвусмысленный перечень всех полипептидных последовательностей с консервативными заменами.

В пределах описанных выше классов аминокислотных остатков существуют более консервативные замены, которые так или иначе могут быть пригодны. Консервативные группы для замен, которые представляют собой более консервативные, включают: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин. Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет выделенный или рекомбинантный полипептид вариантной протеазы (например, вариантный субтилизин), обладающий протеолитической активностью, причем указанный полипептид вариантной протеазы содержит аминокислотную последовательность с по меньшей мере примерно 90%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или примерно 99,5% идентичностью последовательности к аминокислотной последовательности SEQ ID №:2. Консервативная замена одной аминокислоты на другую в вариантной протеазе по настоящему изобретению, как ожидается, значительно не изменит ферментативную активность или активность чистящего действия вариантной протеазы. Ферментативная активность или активность чистящего действия полученной протеазы может быть легко определена с помощью стандартных проб и проб, описанных в настоящем изобретении.

Вариации с консервативными заменами полипептидной последовательности по настоящему изобретению (например, вариантные протеазы по настоящему изобретению) включают замены небольшого процента, иногда менее чем примерно 25%, примерно 20%, примерно 15%, примерно 14%, примерно 13%, примерно 12%, примерно 11%, примерно 10%, примерно 9%, примерно 8%, примерно 7% или примерно 6% аминокислот полипептидной последовательности или менее чем примерно 5%, примерно 4%, примерно 3%, примерно 2% или примерно 1% аминокислот полипептидной последовательности, выбранной по консервативности аминокислотой из той же группы консервативных замен.

Как более подробно описано в других разделах настоящего изобретения и в Примерах, представленных в настоящем изобретении, полипептиды по настоящему изобретению могут иметь чистящие способности, которые можно сравнить с известными протеазами, включая известные субтилизины. Иллюстративные известные субтилизиновые протеазы включают, но без ограничений, например, субтилизин GG36 B. lentus, субтилизин BPN' B. amyloliquefaciens, субтилизин BPN'-Y217L B. amyloliquefaciens и PB92 B. clausii. Аминокислотная последовательность зрелого белка субтилизина GG36 B. lentus представляет собой:

AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHL

KNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID №:2)

Аминокислотная последовательность зрелого белка BPN' субтилизина B. amyloliquefaciens представляет собой:

AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSL

ENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ (SEQ ID №:1)

Настоящее изобретение предлагает выделенный вариант, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из T022R+V104I+Q245R, G020R+S024R+S101A, T022R+S103A+V104I, T022R+V104I+A232V, T022R+S103A+Q245R, T022R+A232V+Q245R, T022R+S103A+A232V, T022R+S103A+V104I+A232V, T022R+V104I+A232V+Q245R, T022R+S103A+V104I+Q245R, T022R+S103A+A232V+Q245R, T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R, T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R, T022A+N076D+S103A+V104I+A232V, T022A+N076D+V104I+A232V+Q245R, T022A+N076D+S103A+A232V+Q245R, T022A+N076D+S103A+V104I+Q245R, T022A+N076D+V104I+Q245R, T022A+N076D+A232V+Q245R, T022A+N076D+V104I+A232V, T022A+N076D+S103A+Q245R, T022A+N076D+S103A+A232V, T022A+N076D+S103A+V104I, T022A+N076D+S103A, T022A+N076D+V104I, T022A+N076D+A232V, T022A+N076D+Q245R, G020R+S101A+T213A, G020R+R045T+S101A, G020R+S101A+G211Q, S024R+S101A+T213A, G020R+T022W+S101A, S024R+S101A+G211Q, N043R+S101A+T213A, N043R+R045T+S101A, S024R+N043R+S101A, S024R+R045T+S101A, S101A+G211Q+T213A, G020R+N043R+S101A, R045T+S101A+T213A, T022W+S024R+S101A, T022R+S101G+V104I, T022W+S101A+T213A, T022R+S101G+Q245R, T022W+S101A+G211Q, G020R+S024R+Q245R, T022R+S101G+V104I+Q245R, T022R+S101G+A232V, T022R+S101G+S103A, T022R+S101G+S103A+V104I, T022R+S101G+S103A+Q245R, T022R+S101G+A232V+Q245R, T022R+S101G+V104I+A232V, G020R+S024R+S101A+T213A, G020R+S024R+T213, AS101N+V104I+A232V, S101N+S103A+V104I, S101N+S103A+A232V, S101N+S103A+V104I+A232V, G020R+S103A+A232V, G020R+V104I+A232V, G020R+S103A+V104I+A232V, G020R+S103A+V104I, N018R+N076D+N116A, N018R+N076D+T213A, N018R+N076D+S101A, N018R+N076D+A215F или N018R+N076D+G211Q (Перечень 1), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R (Перечень 2), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R, T022A+N076D+S103A+V104I+A232V, T022A+N076D+V104I+A232V+Q245R, T022A+N076D+S103A+A232V+Q245R или T022A+N076D+S103A+V104I+Q245R (Перечень 3), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из T022R+S103A+V104I+A232V, T022R+V104I+A232V+Q245R, T022R+S103A+V104I+Q245R, T022R+S103A+A232V+Q245R, T022A+N076D+V104I+Q245R, T022A+N076D+A232V+Q245R, T022A+N076D+V104I+A232V, T022A+N076D+S103A+Q245R, T022A+N076D+S103A+A232V, T022A+N076D+S103A+V104I, T022R+S101G+V104I+Q245R, T022R+S101G+S103A+V104I, T022R+S101G+S103A+Q245R, T022R+S101G+A232V+Q245R, T022R+S101G+V104I+A232V, G020R+S024R+S101A+T213A, S101N+S103A+V104I+A232V или G020R+S103A+V104I+A232V (Перечень 4), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из T022R+V104I+Q245R, G020R+S024R+S101A, T022R+S103A+V104I, T022R+V104I+A232V, T022R+S103A+Q245R, T022R+A232V+Q245R, T022R+S103A+A232V, T022A+N076D+S103A, T022A+N076D+V104I, T022A+N076D+A232V, T022A+N076D+Q245R, G020R+S101A+T213A, G020R+R045T+S101A, G020R+S101A+G211Q, S024R+S101A+T213A, G020R+T022W+S101A, S024R+S101A+G211Q, N043R+S101A+T213A, N043R+R045T+S101A, S024R+N043R+S101A, S024R+R045T+S101A, S101A+G211Q+T213A, G020R+N043R+S101A, R045T+S101A+T213A, T022W+S024R+S101A, T022R+S101G+V104I, T022W+S101A+T213A, T022R+S101G+Q245R, T022W+S101A+G211Q, G020R+S024R+Q245R, T022R+S101G+A232V, T022R+S101G+S103A, G020R+S024R+T213A, S101N+V104I+A232V, S101N+S103A+V104I, S101N+S103A+A232V, G020R+S103A+A232V, G020R+V104I+A232V, G020R+S103A+V104I, N018R+N076D+N116A, N018R+N076D+T213A, N018R+N076D+S101A, N018R+N076D+A215F или N018R+N076D+G211Q (Перечень 5), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из S101N+V104I+A232V, S101N+S103A+V104I, S101N+S103A+A232V или S101N+S103A+V104I+A232V (Перечень 6), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из S101N+S103A+V104I+A232V (Перечень 7), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из S101N+V104I+A232V, S101N+S103A+V104I или S101N+S103A+A232V (Перечень 8), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из S103A+V104I+S188D, S188D+Q245R+N248D, S103A+S188D+Q245R, V104I+S188D+Q245R, S103A+V104I+S188D+Q245R, T022A+S103A+S188D, T022A+V104I+S188D, T022A+S103A+V104I+S188D, G159D+S188D+Q245R, S103A+S188D+A232V, S103A+G159D+S188D, V104I+S188D+A232V, V104I+G159D+S188D, S103A+V104I+S188D+A232V, S103A+V104I+G159D+S188D, S103A+S188D+N248D, V104I+S188D+N248D, S103A+V104I+S188D+N248D, G159D+S188D+N248D, S188D+A232V+Q245R, S103A+S188D+A232V+Q245R, V104I+S188D+A232V+Q245R, S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R, T022A+S188D+Q245R, T022A+S103A+S188D+Q245R, T022A+V104I+S188D+Q245R, S103A+S188D+E271F, V104I+S188D+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R, S103A+V104I+S188D+E271F, T022A+S188D+N248D, T022A+S103A+S188D+N248D, T022A+V104I+S188D+N248D, S103A+S188D+Q245R+N248D, T022A+S103A+V104I+S188D+N248D, V104I+S188D+Q245R+N248D, S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D, T022A+S188D+A232V, T022A+S103A+S188D+A232V, T022A+V104I+S188D+A232V, T022A+S103A+V104I+S188D+A232V, S188D+A232V+N248D, S188D+Q245R+E271F, T022A+S188D+E271F, T022A+S188D+Q245R+N248D, S103A+S188D+A232V+N248D, S103A+S188D+Q245R+E271F, S188D+N248D+E271F, V104I+S188D+A232V+N248D, V104I+S188D+Q245R+E271F, T022A+S103A+S188D+E271F, T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D, S103A+S188D+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+E271F, T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D, S103A+V104I+S188D+Q245R+E271F, S103A+V104I+S188D+A232V+N248D, V104I+S188D+N248D+E271F, S188D+A232V+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D, S103A+V104I+S188D+N248D+E271F, S103A+S188D+A232V+E271F, V104I+S188D+A232V+E271F, T022A+S188D+A232V+Q245R, T022A+S188D+Q245R+E271F, T022A+S188D+N248D+E271F, S103A+V104I+S188D+A232V+E271F, T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R, S188D+A232V+Q245R+N248D, S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+S188D+A232V+N248D, T022A+S103A+S188D+Q245R+E271F, T022A+S103A+S188D+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R, S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D, S103A+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+S103A+S188D+A232V+N248D, T022A+V104I+S188D+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+Q245R+E271F, S188D+A232V+Q245R+E271F, S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R, V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D, T022A+V104I+S188D+A232V+N248D, V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+S188D+A232V+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+N248D+E271F, T022A+S188D+Q245R+N248D+E271F, S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F, S103A+S188D+A232V+N248D+E271F, S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+N248D, S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D, T022A+S103A+S188D+A232V+E271F, V104I+S188D+A232V+N248D+E271F, V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F, T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+A232V+E271F, T022A+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D, S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F, S103A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F, S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F, T022A+S188D+A232V+Q245R+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+E271F, T022A+S103A+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D, S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D, T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F, T022A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F, V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F, G159D+S188D+Q245R+N248D, T022A+G159D+S188D, T022A+S103A+G159D+S188D, T022A+V104I+G159D+S188D, T022A+S103A+V104I+G159D+S188D, S103A+G159D+S188D+Q245R, V104I+G159D+S188D+Q245R, S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R, S103A+G159D+S188D+N248D, V104I+G159D+S188D+N248D, S103A+V104I+G159D+S188D+N248D, G159D+S188D+A232V, S103A+G159D+S188D+A232V, V104I+G159D+S188D+A232V, S103A+V104I+G159D+S188D+A232V, T022A+G159D+S188D+Q245R, G159D+S188D+E271F, T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R, S103A+G159D+S188D+E271F, T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R, V104I+G159D+S188D+E271F, T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R, S103A+V104I+G159D+S188D+E271F, T022A+G159D+S188D+N248D, T022A+S103A+G159D+S188D+N248D, T022A+V104I+G159D+S188D+N248D, S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D, T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+N248D, V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D, S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D, T022A+G159D+S188D+A232V, T022A+S103A+G159D+S188D+A232V, T022A+V104I+G159D+S188D+A232V, G159D+S188D+A232V+Q245R, T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+A232V, S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R, G159D+S188D+Q245R+E271F, V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R, G159D+S188D+A232V+N248D, T022A+G159D+S188D+E271F, S103A+G159D+S188D+Q245R+E271F, G159D+S188D+N248D+E271F, S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R, S103A+G159D+S188D+A232V+N248D, T022A+G159D+S188D+Q245R+N248D, T022A+S103A+G159D+S188D+E271F, V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F, T022A+V104I+G159D+S188D+E271F, V104I+G159D+S188D+A232V+N248D, S103A+G159D+S188D+N248D+E271F, T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D, S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F, V104I+G159D+S188D+N248D+E271F, G159D+S188D+A232V+E271F, T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+E271F, S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+N248D, T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D, S103A+V104I+G159D+S188D+N248D+E271F, S103A+G159D+S188D+A232V+E271F, V104I+G159D+S188D+A232V+E271F, T022A+G159D+S188D+N248D+E271F, T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R, T022A+G159D+S188D+Q245R+E271F, S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+E271F, G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R, T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R+E271F, T022A+S103A+G159D+S188D+N248D+E271F, T022A+G159D+S188D+A232V+N248D, G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D, T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F, T022A+V104I+G159D+S188D+N248D+E271F, T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R, S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F, G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F, G159D+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+N248D, V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F, S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D, T022A+G159D+S188D+A232V+E271F, T022A+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F, S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F, T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+N248D, V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D, S103A+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+E271F, V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F, V104I+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+E271F, G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F, T022A+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F, T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D, S101G+S103A+S188D, S101G+V104I+S188D, S101G+S103A+V104I+S188D (Перечень 9), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляют собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D, T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R, T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+N248D+E271F, S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+N248D, S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D, T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F, S103A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F, S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+E271F, T022A+S103A+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D, S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D, T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F, T022A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F, V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F, T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R, T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+N248D, S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D, T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+A232V, S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R, T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D, S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F, T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+E271F, S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+N248D, T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D, S103A+V104I+G159D+S188D+N248D+E271F, S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+E271F, T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R, T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R+E271F, T022A+S103A+G159D+S188D+N248D+E271F, T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F, T022A+V104I+G159D+S188D+N248D+E271F, T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R, S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+N248D, V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F, S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D, T022A+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F, S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F, T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+N248D, V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D, S103A+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+E271F, V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F, V104I+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+E271F, G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F, T022A+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F или T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D (Перечень 10), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляют собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R, T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R, T022A+S103A+V104I+S188D+N248D, S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D, T022A+S103A+V104I+S188D+A232V, T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D, T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D, S103A+V104I+S188D+Q245R+E271F, S103A+V104I+S188D+A232V+N248D, T022A+S103A+V104I+S188D+E271F, S103A+V104I+S188D+N248D+E271F, S103A+V104I+S188D+A232V+E271F, T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R, T022A+S103A+S188D+Q245R+E271F, T022A+S103A+S188D+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R, S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D, S103A+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+S103A+S188D+A232V+N248D, T022A+V104I+S188D+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+Q245R+E271F, V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D, T022A+V104I+S188D+A232V+N248D, V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+S188D+Q245R+N248D+E271F, S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F, S103A+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S103A+S188D+A232V+E271F, V104I+S188D+A232V+N248D+E271F, V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F, T022A+V104I+S188D+A232V+E271F, T022A+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D, S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F, T022A+S188D+A232V+Q245R+E271F, T022A+S103A+V104I+G159D+S188D, S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R, S103A+V104I+G159D+S188D+N248D, S103A+V104I+G159D+S188D+A232V, T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R, T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R, S103A+V104I+G159D+S188D+E271F, T022A+S103A+G159D+S188D+N248D, T022A+V104I+G159D+S188D+N248D, S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D, V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D, T022A+S103A+G159D+S188D+A232V, T022A+V104I+G159D+S188D+A232V, S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R, V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R, S103A+G159D+S188D+Q245R+E271F, S103A+G159D+S188D+A232V+N248D, T022A+G159D+S188D+Q245R+N248D, T022A+S103A+G159D+S188D+E271F, V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F, T022A+V104I+G159D+S188D+E271F, V104I+G159D+S188D+A232V+N248D, S103A+G159D+S188D+N248D+E271F, V104I+G159D+S188D+N248D+E271F, S103A+G159D+S188D+A232V+E271F, V104I+G159D+S188D+A232V+E271F, T022A+G159D+S188D+N248D+E271F, T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R, T022A+G159D+S188D+Q245R+E271F, G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+G159D+S188D+A232V+N248D, G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D, G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F, G159D+S188D+A232V+N248D+E271F или T022A+G159D+S188D+A232V+E271F (Перечень 11), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляют собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из S103A+V104I+S188D+Q245R, T022A+S103A+V104I+S188D, S103A+V104I+S188D+A232V, S103A+V104I+G159D+S188D, S103A+V104I+S188D+N248D, S103A+S188D+A232V+Q245R, V104I+S188D+A232V+Q245R, T022A+S103A+S188D+Q245R, T022A+V104I+S188D+Q245R, S103A+V104I+S188D+E271F, T022A+S103A+S188D+N248D, T022A+V104I+S188D+N248D, S103A+S188D+Q245R+N248D, V104I+S188D+Q245R+N248D, T022A+S103A+S188D+A232V, T022A+V104I+S188D+A232V, T022A+S188D+Q245R+N248D, S103A+S188D+A232V+N248D, S103A+S188D+Q245R+E271F, V104I+S188D+A232V+N248D, V104I+S188D+Q245R+E271F, T022A+S103A+S188D+E271F, S103A+S188D+N248D+E271F, T022A+V104I+S188D+E271F, V104I+S188D+N248D+E271F, S103A+S188D+A232V+E271F, V104I+S188D+A232V+E271F, T022A+S188D+A232V+Q245R, T022A+S188D+Q245R+E271F, T022A+S188D+N248D+E271F, S188D+A232V+Q245R+N248D, S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+S188D+A232V+N248D, S188D+A232V+Q245R+E271F, S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S188D+A232V+E271F, G159D+S188D+Q245R+N248D, T022A+S103A+G159D+S188D, T022A+V104I+G159D+S188D, S103A+G159D+S188D+Q245R, V104I+G159D+S188D+Q245R, S103A+G159D+S188D+N248D, V104I+G159D+S188D+N248D, S103A+G159D+S188D+A232V, V104I+G159D+S188D+A232V, T022A+G159D+S188D+Q245R, S103A+G159D+S188D+E271F, V104I+G159D+S188D+E271F, T022A+G159D+S188D+N248D, T022A+G159D+S188D+A232V, G159D+S188D+A232V+Q245R, G159D+S188D+Q245R+E271F, G159D+S188D+A232V+N248D, T022A+G159D+S188D+E271F, G159D+S188D+N248D+E271F, G159D+S188D+A232V+E271F или S101G+S103A+V104I+S188D (Перечень 12), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляют собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из S103A+V104I+S188D, S188D+Q245R+N248D, S103A+S188D+Q245R, V104I+S188D+Q245R, T022A+S103A+S188D, T022A+V104I+S188D, G159D+S188D+Q245R, S103A+S188D+A232V, S103A+G159D+S188D, V104I+S188D+A232V, V104I+G159D+S188D, S103A+S188D+N248D, V104I+S188D+N248D, G159D+S188D+N248D, S188D+A232V+Q245R, T022A+S188D+Q245R, S103A+S188D+E271F, V104I+S188D+E271F, T022A+S188D+N248D, T022A+S188D+A232V, S188D+A232V+N248D, S188D+Q245R+E271F, T022A+S188D+E271F, S188D+N248D+E271F, S188D+A232V+E271F, T022A+G159D+S188D, G159D+S188D+A232V, G159D+S188D+E271F, S101G+S103A+S188D или S101G+V104I+S188D (Перечень 13), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляют собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R -E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-N062E-S078G-G118S-S188D-N248D-H249R, S024R-N062E-G118R-A158E-S188D, T022A-S024R-T033S-G118R-S166D-S188D, S024R-N062E-S078G-G118S-S188D-Q245R-N248D, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, G020R-N062E-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D, S024R-N116L-A158E-S166D, G020R-N062E-S078G-G118S-G159D-S188D-H249R, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D, S024R-G118R-S166D, T022A-S024R-T033S-G118R-A158E-S166D-A273V, G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R, T022A-G118R-A158E-S166D, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D, T022A-S024R-G118R-S166D-S188D, N062E-S078G-G118S-G159D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248E-E271H, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-Q245R-N248D, S024R-T033S-N116L-A158E-S166D, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-Q245R, G020R-N062E-S078D-G118S-Q245R, T022A-S024R-N062E-N116L-A158E, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E, S024R-T033S-N062E-N116L-G118R-S188D, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-H249R, S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D, G020R-N062E-S078G-G118D-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248D-E271T, S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248H-E271T, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-H249R, G020R-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R, S024R-N062E-N116L-G118R, T022A-S024R-N116L-G118R-A158E-S188D, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-Q245R, S024R-N062E-G118R-A158E, G020R-N062E-S078G-G118S-G159D-S188D, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R, A098Q-S099T-G102A-S103G, T022A-G118R-S166D-S188D, S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-H249R, T022A-S024R-N116L-G118R-S166D-S188D, T022A-N062E-G118R-A158E, G020R-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R, S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248E-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245R-N248E-E271F, G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-N248D-H249R, S024R-N116L-G118R-S128I-S166D-S188D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-N248D, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D, S024R-N062E-S078D-G118S-S188D-H249R, T033S-N062E-G118R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248E-E271H, T033S-G118R-A158E-S166D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248H, G020R-S024R-S078D-G118D-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-N062E, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-G159D-S188D-R247L, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248E-E271T, G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245R-N248H, P014S-G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248E-E271L, G020R-S078D-G118D-G159D-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248D-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248E-E271L, S024R-N062E-S078D-G118S-S188D-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248E-E271H, G020R-S078D-G118S-P129E-G159D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248H-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248H-E271H, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-T213A-A232V, S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-G211Q-T213A-A232V, S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D, G020R-S024R-S078G-G118S-S188D-Q245R, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R, S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-H249R, G020R-S078G-G118S-G159D-S188D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-S188D-N248D, S078D-G118S-G159D-Q245R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-N248D-H249R, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-Q245R-N248D, G020R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D, S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-Q245R, G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-P210L-A232T-Q245T-N248D-E271T, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245V-N248D-E271L, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245T-N248H-E271H, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248E, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R, S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D, G020R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R, S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248H-E271H, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-G159D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-V244A-Q245R-N248H-E271H, S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248D-E271F, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R, T022A-S024R-N062E-S128I-A158E, G020R-S024R-S078G-G118D-N248D-H249R, S024R-S078G-G118D-P129E-Q245R-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q236K-Q245T-N248E, N062E-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D, T033S-G118R-S166D, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-S188D-N248D, G020R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-L111V, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248E-E271H, S024R-N116L-G118R-S128I-A158E-S188D-V199I, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245R-N248E-E271T, G020R-S024R-S078D-G118S-S188D-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248D-E271T, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-S188D-H249R, S024R-N062E-S078G-G118S-S188D-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248D-E271L, S024R-A048V-S078G-G118D-G159D-S188D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D, G102A-S103G-V104I, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-Q245R-N248D-H249R, T022A-T033S-G118R-A158E, T022A-S024R-N116L-S128I-S188D, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248E-E271F, S024R-N062E-S078G-G118S-S188D-Q245R, S024R-N062E-S078G-G118D-G159D, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248E-E271T, G020R-S078G-G118D-S188D-N248D-H249R, T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-A158E-S166D-S188D, S078G-G118S-G159D-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245V-N248H-E271F, G020R-S078G-G118S-P129E-G159D-S240F-N248D-H249R, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-G211Q-T213A-A232V, N062E-S078D-G118S-S188D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248D-E271T, G020R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248D-E271F, S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-Q245R, S024R-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R, N062E-S078G-G118S-S188D-Q245R-N248D-H249R, S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-H249R, G020R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-H249R, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245V-N248H-E271L, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-G211Q-T213A-A232V, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248D-E271H, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245V-N248E-E271L, G020K-T022L-S078G-G118S-P129E-G159D, S078G-G118S-S188D-Q245R-N248D, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-A232V, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-N248D, N062E-G118R-S166D-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248E-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248H-E271F, G020R-N062E-S078G-G118S-G159D-H249R, S024R-N062E-N116L-A158E, S024R-S078G-G118D-P129E-Q245R-N248D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R, S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248D-E271H, S024R-S078D-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248E-E271F, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248H-E271T, S024R-S078D-G118S-P129E-G159D, G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R, T022A-S024R-N116L-G118R-S128I-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248E-E271H, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248H-E271H, G020R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-H249R, G020R-S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248E-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248D-E271F, S024R-N062E-S078G-G118S-S188D-N248D-H249R, G020R-N062E-S078G-G118S-G159D-Q245R, S024R-N062E-G118R-A158E-S166D-S188D, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-N248D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-A158T-G159D-Q245R-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248E-E271L, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-S188D-H249R, S024R-S078G-G118S-S188D-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245V-N248E-E271H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248H-E271H, S099G-S101G, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245V-N248D-E271F, G020R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248H-E271H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248H-E271L, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248E-E271T, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248E-E271T, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245V-N248E-E271H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248H-E271L, G020R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-S188D-N248D, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-G211Q-A232V, S024R-S078G-G118D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-T213A-A232V, S024R-N062E-S078G-G118D-S188D-H249R, T022L-S078N-G118R-S166D-T213A-L217E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248E-E271H, S024R-S078G-G118D-G159D-N248D-H249R, S024R-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248H-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248H-E271H, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271L, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248H-E271F, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248H-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248E-E271F, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-H249R, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245R-N248D-E271H, G020R-S024R-S078D-G118S-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248E, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248D-E271H, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248H-E271F, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245T-N248H-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248H-E271T, N062E-S078G-G118D-G159D-N248D-H249R, G020R-S078G-G118S-S188D-N248D, S024R-S078D-G118S-P129E-S188D, G020R-S078G-G118D-P129E-S188D-H249R, G020R-N062E-S078D-G118D-G159D-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245T-N248D-E271L, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248H-E271T, G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R, A001E-G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248E-E271L, G020R-S078D-G118S-G159D-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245V-N248E-E271L, G020R-N062E-S078D-G118S-P129E-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248E-E271F, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-A232V, S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-A158E, S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245V-N248D-E271L, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248E-E271H, S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-N248D, G020R-S078G-G118S-P129E-S188D-H249R, S024R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R, S024R-N062E-S078D-G118D-G159D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248H-E271H, S024R-S078G-G118S-P129E-Q245R-N248D, S024R-T033S-G118R-A158E, G020R-S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R-N248D, G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245R-N248D-E271T, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248H-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248D-E271H, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248D-E271H, S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-S188D-N248D-H249R, S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-N062E-S078G-G118S-P129E, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248D-E271L, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022A-S024R-T033S-S188D, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-Q245R-N248D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-H249R, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248D-E271H, N062E-S078G-G118S-N248D, T022A-S024R-N062E-S128I, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-H249R, G020R-S024R-S078D-G118D-S188D-N248D-H249R, S024R-S078G-G118D-G159D-S188D, S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-G211Q-A232V, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248E-E271L, T022A-S024R-T033S-N062E-G118R-S188D, G020R-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248D-T255M-E271T, S024R-N062E-S078D-G118S-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248D-E271H, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245T-N248D-E271L, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248H-E271F, S024R-G118R-S128I-A158E-S188D, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248H, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248E-E271H, T022A-G118R-S128I-A158E-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248E-E271T, S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-H249R, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D, N116L-G118R-S128I-A158E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248H-E271T, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-G159D-Q245R-N248D, S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-H249R, S024R-N062E-S078D-G118D-G159D, S024R-T033S-G118R-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248H-E271L, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248E-E271L, S024R-S078G-G118D-P129E-S188D, S078G-G118D-G159D-S188D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248H-E271H, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245V-N248D-E271L, A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-S024R-N062E-N116L-S128I-A158E, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248H-E271F, S024R-G118R-S128I-S188D, G020R-S078G-G118D-G159D-Q245R-N248D-H249R, N062E-S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-A232V-Q245R, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, S024R-N062E-S078G-G118D-N248D-H249R, S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-S188D-N248D, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R, T022A-T033S-G118R-S166D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248E-E271T, S078G-G118D-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-G118R-S128I, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248E-E271L, G020R-N062E-S078D-G118S-S188D, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245V-N248H-E271T, S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-N248D-H249R, G020R-S078G-G118S-G159D-N248D-H249R, G020R-N062E-S078G-G118S-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248D-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248H, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D, G020R-N062E-S078D-G118S-G159D-Q245R, S024R-S128I-A158E, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248H-E271H, S024R-N062E-S078D-G118S-S188D-N248D-H249R, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-L217S-A232V, S003T-S024R-N062E-S078D-G118S-N248D, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245V-N248D-E271H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248D-E271H, G020R-N062E-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248D-S265G-E271H, G020R-S078G-G118D-P129E-G159D-Q245R-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245V-N248E-E271L, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-N248D, S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-N062E-S078D-G118S-G159D-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248H-E271H, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248E, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248D-E271L, G020K-T022L-S078N-S166D-T213A-L217E, G020R-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R, T022A-T033S-N116L-G118R-A158E, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R, A001G-T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248H-E271L, S024R-S078D-G118S-G159D-Q245R, G020K-T022L-S078N-G118R-S166D-T213A-L217E, S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248E, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245V-N248E-E271F, S024R-N062E-S078G-G118D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245T-N248H-E271L, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245V-N248E-E271F, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245T-N248H-E271L, S024R-S078D-G118D-P129E-S188D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245V-N248D-E271H, G020R-S078G-G118D-G159D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248D-E271L, T022A-N062E-G118R-S128I-S188D, T022A-N116L-G118R-A158E-S166D-S188D, S024R-N062E-N116L, T022A-S024R-N116L-S128I-S166D-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248D-E271F, N116L-A158E-S166D, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248D-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248E-E271H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248H, T022A-S024R-N062E-N116L-A158E-S166D, G020R-N062E-S078D-G118S-P129E, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-H120Q-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245V-N248E-E271F, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245T-N248H-E271L, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245R-N248E-E271F, N062E-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245R-N248H, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248E-E271L, S024R-N062E-N116L-G118R-S128I, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248H-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248E-E271H, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248E-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245T-N248E-E271H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248H-E271H, N062E-G118R-S128I-A158E, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248H-E271H, S078D-G118S-G159D-Q245R-H249R, S103A-V104I-S128N-L148I, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248H-E271H, S024R-G118R-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245V-N248E-E271F, T033S-N062E-G118R-A158E-S188D, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-G211Q-T213A-A232V, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-H249R, S078G-G118S-P129E-G159D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245V-N248E-E271H, N062E-N076D-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020K-S024F-S078N-L217E, S103A-S128N-L148I, S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-T213A-A232V, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-H249R, S078G-G118D-P129E-G159D-Q245R-H249R, G020R-N062E-S078D-G118S-G159D-Q245R-N248D-H249R, G020R-N062E-S078G-G118S-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248E-E271L, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-S188D, T033S-N116L-A158E, G020K-S024F-S166D-L217E, S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-H249R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245T-N248H-E271H, T022A-S024R-T033S-G118R-A158E-S166D, N062E-S078D-G118D-G159D-Q245R, S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-H249R, G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248H-E271F, S078D-G118S-G159D-H249R, S078G-G118D-P129E-G159D-H249R, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-S188D-N248D-H249R, S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-S188D-H249R, G020R-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R, G020R-N062E-S078D-G118S-G159D-S188D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-Q245R-N248D, G020R-N062E-S078G-G118D-S188D-Q245R-N248D, S024R-N062E-S078D-G118S-G159D-S188D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D, G020R-S078G-G118S-G159D-S188D-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248E-E271L, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248H, T022A-S024R-N116L-G118R-S128I-S166D-S188D, S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-G211Q-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245V-N248H-E271L, S024R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R, S024R-S078D-G118D-P129E-Q245R-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248D-E271F, G020K-S024F-S078N-G118R-S166D-L217E, S024F-G118R-S166D-T213A-L217E, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-T033S-S078N-S166D-S188D, G020R-S024R-S078G-G118D-Q245R, G020K-S024F-S078N-G118R-S166D-T213A-L217E, G020K-T022L-S078G-G118S-G159D-S188D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248D-E271L, S024R-T033S-G118R-A158E-S166D-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248D-E271L, T022V-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-T213A-A232V, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-S188D, S078N-G118R-S166D-L217E, S024R-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D, T022A-S024R-G118R-S128I-A158E-S166D-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248H-E271H, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248H-E271T, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245V-N248D-E271F, A016S-T022A-S101G-S103A-V104L-L148I, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-G159D-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248E-E271H, S078G-G118D-P129E-G159D-Q245R, S024R-S078G-G118S-S188D-Q245R-N248D, G020R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248H-E271H, T022A-S024R-T033S-S128I-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248D-E271H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248E-E271F, S024R-S078G-G118S-P129E-S188D-N248D, G020R-N062E-S078D-G118S-P129E-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245T-N248D-E271F, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245T-N248H, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245T-N248E-E271L, S101A-N116L-P210I-T213A, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248H-E271F, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-Q245R-N248D, T022A-S024R-N062E-A158E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248D-E271H, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-N062E-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D, N062E-S078G-G118S-S188D-H249R, A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, G020R-S078G-G118D-S188D-H249R, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-A232V, G020R-N062E-S078D-G118S-G159D-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245T-N248D-E271H, T022A-S024R-N116L-G118R-A158E-S166D-S188D, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, S024R-N062E-N076D-S101A-S103A-V104I-P210I-A232V-Q245R, N062E-S078D-G118S-G159D-Q245R-N248D-H249R, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248E-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245V-N248E-E271T, S024R-S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-A232V-Q245R, S024R-N062E-N116L-G118R-A158E, G020R-S078G-G118D-S188D-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245V-N248E-E271L, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248E-E271H, S024R-S166D-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245T-N248D-E271F, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-A232V, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248D-E271F, G020R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D, T022A-N062E-N116L-G118R-A158E, S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-S166D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248H, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248E-E271L, S024R-N062E-G118R-S128I-S188D, N062E-S078G-G118S-G159D-N248D-H249R, G020K-T022L-N062E-S078D-G118S-G159D-H249R, N062E-S078G-G118D-Q245R-N248D, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-G159D-S188D-H249R, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248D-E271L, S024R-N116L-G118R-S128I-A158E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248E-E271F, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245V-N248E-E271T, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248D-E271L, A016S-S101G-S103A-V104L-L148I, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248H-E271T, G020R-N062E-S078G-G118S-S188D-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248E-E271H, S024R-S078D-G118D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-Q245R-N248D, G020R-S078G-G118D-G159D-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248E-E271T, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-N248D-H249R, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248D-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248E, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248H-E271F, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248E-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248D-E271L, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-N248D, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-S212L-A232S-Q245V-N248D-E271T, S024R-S078G-G118D-G159D-H249R, T022A-N116L-G118R-S128I-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248D, N062E-S078G-G118D-S188D-Q245R, G020K-S078N-S166D-L217E, N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248E-E271F, N062E-N116L-G118R-S166D-S188D, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-N248D, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V, S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, G097P-S101A-S103G, S024R-N062E-S078D-G118S-S188D, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-S188D-H249R, S024R-N062E-S078G-G118S-G159D, A016S-T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-A232V, T022A-N116L-G118R-S128I-A158E-S166D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248D-E271T, S024R-G118R-S128I, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248E-E271L, S024R-N062E-A158E, S024R-S078D-G118S-P129E, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248H-E271F, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248H-E271F, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-G159D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248H-E271L, S024R-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D, N062E-S078G-G118S-S188D-Q245R-N248D, N062E-N116L-G118R-S128I-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248D-E271F, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248D-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248E-E271T, T022A-T033S-N116L-G118R-S188D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-N248D, G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-N248D, S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R, N062E-S078D-G118S-G159D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248D, T022A-S024R-T033S-N062E-N116L, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245T-N248E-E271T, N062E-S078D-G118S-H249R, T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-A158E, T022L-S078N-G118R-S166D-L217E, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245R-N248H-E271L, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245V-N248D-E271L, S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R, S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R-H249R, S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-H249R, S024F-T213A-L217E, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-G211Q-A232V, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248D-E271H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248E-E271T, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248H-E271H, G020R-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248D-E271T, N062E-S078G-G118S-P129E-Q245R, S078G-G118S-S188D-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103G-V104I-L148I, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248H-E271F, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245V-N248H-E271H, T022A-N116L-G118R-A158E, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-I107V-N116L-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245R-N248H-E271T, G020R-N062E-S078D-G118D-G159D, G020R-N062E-S078D-G118S, S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245V-N248E-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245V-N248D-E271H, S078G-G118S-G159D, S024F-G118R-T213A-L217E, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-Q245R-N248D, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R, S024R-S078D-G118D-G159D-H249R, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-A232V-Q245R, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-S188D-N248D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245T-N248E-E271H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245V-N248D-E271T, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-N248D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-N248D, N062E-S078G-G118D-P129E-H249R, G020K-T022L-S078N-G118R-T213A-L217E, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-H249R, T022A-S024R-T033S-N116L-S166D-S188D, S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-H249R, T033S-N116L-G118R-A158E-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248H, S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-A232V-Q245R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-S188D-Q245R, T022A-S024R-T033S-N062E-N116L-G118R-P129E-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245T-N248E, S024R-S078G-G118S, N062E-S101A-S103A-V104I-P210I-A232V-Q245R, N062E-S078G-G118D-G159D, T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-S166D-S188D, S024R-S078D-G118D-G159D-Q245R, G020R-N062E-S078G-G118S-G159D-S188D-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245R-N248E-E271H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-V244I-Q245R-N248H-E271L, S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-N248D, S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-H249R, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-A232V, A016S-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-G211Q-T213A-A232V, G020R-N062E-S078G-G118D-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248E-E271H, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245V-N248E-E271L, G020K-S166D-L217E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248E-E271T, G020R-N062E-S078D-G118D-Q245R, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-G211Q-A232V, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V, T033S-G118R-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248E-E271H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248D-E271T, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245T-N248H-E271F, G020R-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R, G020R-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D, S024R-S078G-G118D-P129E-N248D-H249R, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E, N062E-S078D-G118S-S188D-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245V-N248H-E271L, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245R-N248D-E271L, N062E-S078G-G118S-G159D-H249R, G020R-S078D-G118S-P129E-G159D-N248D, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248H, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-V244L-Q245R-N248D, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-A232V, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-A272D, N116L-G118R-S128I-A158E-S166D, S024R-S078D-G118S-P129E-H249R, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-N248D, G020R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-N248D-H249R, S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-T213A-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248H, N062E-S078G-G118S-N248D-H249R, G020R-N062E-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-T213A-A232V, N043F-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S078G-G118D-P129E-G159D, G020R-N062E-S078D-G118D-G159D-Q245R-N248D, S024R-S166D, S024R-S078G-G118S-P129E-N248D, N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-A232V-Q245R, G020K-L217E, G118R-S166D-S188D, S024R-S078D-G118S-G159D-S188D, S024R-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R, A016S-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-T213A-A232V, N116L-S166D, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-N248D-H249R, N062E-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245V-N248E-E271H, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-H249R, G118R-S166D-T213A, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D, G020R-S024R-S078D-G115W-G118D-G159D-N248D, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-A232V, S024R-N062E-N116L-S128I-A158E, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248D-E271L, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-H249R, S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-N248D-H249R, G020K-T022L-S024F-S078N-G118R-L217E, S101G-G102A-S103A, G020R-S078G-G118S-P129E-Q245R-N248D, G020K-S078N-S166D, T022A-G118R-A158E, G020K-T022L-S024F-S078N-S166D, T022A-T033S-N062E-N116L-G118R-A158E-S188D, S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-H249R, S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-A232V, A015D-A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-T213A-A232V, G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-S188D-H249R, G020K-S024F-S078N-S128D, T033S-N116L-S166D-S188D, G020R-S078G-G118S-P129E-G159D, T022A-S024R-T033S-L082I-G118R-S128I-A158E-S188D, G020R-S024R-S078D-G118S-S188D-N248D, G020R-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-H249R, N062E-S078G-G118D-Q245R, G020K-T022L-S078N-L217E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245V-N248E-E271L, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248E-E271H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248E-E271T, A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245K-N248H, N062E-S078D-G118D-Q245R, T022A-S024R-G118R-A158E-S166D, A016S-S101A-S103A-S128N-L148I, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248E, S024R-N062E-S078G-G118D, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D, S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248H, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271H, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-H249R, S078D-G118S-P129E-G159D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245T-N248D-E271H, S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R, T022L-T213A-L217E, G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248H-E271T, G020R-N062E-S078G-G118D-Q245R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248H-E271T, S024R-S078D-G118D-P129E-H249R, S024R-N062E-N116L-G118R-S188D, S024R-N062E-G118R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248E, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248H, S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245V-N248D-E271T, G020R-S078G-G118D-P129E-Q245R-N248D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D, A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-A232V, G097P-A098Q-S099G-V104L, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248D-E271F, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-N248D, A016S-S103A-S128N, S024R-S078G-G118D-P129E-Q245R, S078D-G118D-P129E-S188D-H249R, T022A-S024R-T033S-N062E-N116L-A158E, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-T213A-A232V, S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R, T033S-N062E-N116L-G118R-A158E-S188D, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-G159D-Q245R-A272V, G118R-S128I-A158E-S166D, G020K-T022L-S024F-S078N-S166D-D181E-L217E, N062E-G118R-S188D, S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-T213A-A232V, G020R-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-N248D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-N248D, T022A-V068A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R, S024R-S078G-G118S-P129E-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248H-E271L, T033S-N116L-G118R-S188D, N062E-S078G-G118S-S188D-N248D-H249R, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-L148I, G020R-S078G-G118S-S188D-N248D-H249R, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R-N248D, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-T213A-A232V, S024R-N062E-G118R-S128I-A158E, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-S188D, S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-Q245R-N248D-H249R, N062E-G118R-A158E-S166D, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-S188D, S078G-G118D-G159D, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, G020R-S078G-G118D-S188D-N248D, G020K-T022L-S078G-G118D-G159D-N248D-H249R, S103G-L148I-M175T, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248D-H249R-E271F, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-G211Q-A232V, T022A-S024R-N062E-S166D, G020R-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-A232V, T022A-S024R-N062E-N116L-A158E-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245T-N248E-E271L, S024R-T033S-N116L-G118R-A158E-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248H-E271H, G020R-N062E-S078D-G118S-G159D-N248D, T022A-S024R-N116L-G118R-A158E, G020K-T022L-S024F-G118R-L217E, S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-N248D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271L, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R, N062E-G118R-S166D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248D, G020R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245V-N248H-E271T, T022L-S024F-G118R-S166D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, G020K-S024F-S166D-T213A-L217E, N062E-S078G-G118S-G159D-S188D, S024R-N062E-S078D-G118D-Q245R-N248D, G020K-T022L-S024F-S078N-T213A-L217E, T022A-V068A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078G-G118S-P129E-G159D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-H249R, G020K-T022L-S024F-S078N-G118R-S166D-T213A-L217E, T022A-N062E-N116L-A158E, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245V-N248E-E271L, T022A-S024R-N062E-S128I-S166D, S024R-S078G-G118D-G159D-Q245R-N248D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-H249R, G020R-S078G-G118D-S188D-Q245R-N248D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R, S024R-S078G-G118S-G159D-Q245R, T022A-S024R-N062E-G118R-S128I-A158E, G020R-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R, S024R-S078G-G118S-Q245R-N248D-H249R, G118R-A158E-S188D, G020K-S024F-G118R-S166D-L217E, G020K-S024F-S078N-G118R-T213A-L217E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248D-E271L, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248D, S024R-N062E-S078G-G118S-H249R, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V, T033S-A158E-S166D, S024R-S078D-G118S-S188D-N248D-H249R, S024R-N062E-S078D-G118S-S188D-Q245R-N248D, N062E-S078G-G118D-G159D-Q245R-N248D, N062E-S078G-G118D-S188D-Q245R-N248D-H249R, S024R-N116L-G118R-S128I-A158E-S166D, G020R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D, S024R-N062E-S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-A232V-Q245R, N062E-S078D-G118S-P129E-H249R, S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D, A016S-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-T213A-A232V, G020K-T022L-S024F-S078N-S166D-T213A-L217E, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-S188D-N248D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-A272D, T022A-S024R-A158E, G020R-S078G-G118S-G159D-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248E-E271T, S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-G211Q-T213A-A232V, G020K-T022L-S024F-S166D-L217E, G020R-S024R-S078D-G118S-Q245R, G020R-S078D-G118D-P129E-S188D-Q245R, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-S188D-Q245R-N248D, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248H, G020R-S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R, G020R-N062E-S078D-G118D-S188D-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-H249R, T022A-S128I-A158E-S188D, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-T213A-A232V-V244G, T022L-S078N-T213A-L217E, S078D-G118S-P129E-H249R, G020K-T022L-S024F-S078N-G118R-T213A-L217E, N062E-S078D-G118S-G159D-Q245R, G020K-S024F-S166D, S024R-N062E-S078G-G118D-Q245R-N248D-H249R, G020K-S024F-S078N-G118R-L217E, T022L-S024F-S078N-G118R-S166D-L217E, T022A-S024R-T033S-A158E-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248D-E271H, S087R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245V-N248H, G020R-S078G-G118D-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R, S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D, S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R, G020R-S078G-G118S-P129E, S024R-N116L-G118R-S166D-S188D, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R, T022A-S101G-S103G-V104I, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248E-E271L, A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-M119V-Y209V-G211Q-A232V, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248H-E271L, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248D-E271T, T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-A232V, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-N248D-H249R, G020R-S078G-G118S-P129E-N248D-H249R, G020K-T022L-G118R-S128D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245V-N248D-E271L, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-T213A-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248E-E271T, S024R-N062E-S078D-G118D-G159D-Q245R-N248D-H249R, G020K-S024F-T213A-L217E, G118R-S128I-S188D, G020R-S078G-G118S-P129E-H249R, T022A-N062E-G118R-S188D, S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022A-S024R-N116L-A158E-S166D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248H-E271T, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248H-E271L, S024R-N062E-A158E-S188D, G020K-S024F-G118R-S166D-T213A-L217E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245T-N248H-E271T, S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R, S101A-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R, N062E-N116L-G118R-A158E, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-T213A-A232V, T022L-S024F-G118R-S128D-T213A, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-A232V, S078D-G118S-G159D-S188D-N248D-H249R, G020R-S078G-G118S-P129E-S188D, T022A-T033S-N116L-S166D, S024R-N062E-G118R-S188D, S024R-T033S-N116L-G118R-S128I-A158E, S101A-S103A-V104I-P210I-A232V-Q245R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-S188D-H249R, T022A-S024R-N116L-G118R-S128I-A158E-S166D-S188D, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248D-E271H, S078G-G118S-G159D-S188D-N248D-H249R, S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248E-E271F, G020R-N062E-S078D-G118D, S024R-T033S-N116L-G118R-S128I-A158E-S188D, T033S-N062E-N116L-G118R-S188D, T022A-T033S-N116L-G118R-A158E-S188D, S078N-G118R-S166D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248E-E271L, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248H-E271L, S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-G211Q-T213A-A232V, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G118R-A158E-S188D, S024R-S078D-G118S-G159D-H249R, S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248E-E271F, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-Q245R, G020K-S024F-S078N-T213A-L217E, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-H249R, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S078G-G118S-S188D-Q245R-N248D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-N248D-H249R, G020R-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245V-N248D-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248H, S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, S101G-S103A-L148I, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245T-N248D-E271L, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245T-N248D-S265G-E271L, V104I-L111V-L148I, T022A-G118R-S128I, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-N248D, G020K-T022L-G118R-S166D-T213A-L217E, G020R-S078D-G118D-P129E-Q245R-N248D, G097P-S099A-S101A-S103A, N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R, A016S-V104L-L111V, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245V-N248D-E271T, N062E-S078G-G118D-P129E-Q245R-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245V-N248E, T022A-S024R-T033S-G118R-A158E-S188D, S078N-G118R-T213A-L217E, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-A232V, G020R-S024R-S078G-G118D-S188D-Q245R-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-S128L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S078N-G118R-S128D-L217E, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248H-E271T, T022A-S024R-T033S-N116L-A158E-S188D, S024R-N062E-S128I-S188D, S024R-S078G-G118S-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248D-E271L, G020K-S024F-G118R-T213A-L217E, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, S103A-V104I-L111V-L148I, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248H-E271T, S078D-G118D-G159D-Q245R, G020K-T022L-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R-H249R, A016S-T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-S024R-T033S-S166D, S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-N248D-H249R, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-T213A-A232V, S024R-T033S-A158E, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245T-N248D-E271T, G020R-N062E-S078D-G118D-S188D-Q245R-N248D, S078G-G118D-S188D-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245T-N248D-E271L, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-N248D, S024R-N116L-S128I-S166D, S024R-S078D-G118D-G159D-Q245R-N248D, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, S078G-G118D-P129E-G159D-Q245V-N248E-E271F, G020K-S024F-S078N-G118R-S128D-T213A-L217E, T022L-S024F-T213A-L217E, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209A-A232V, N062E-S101A-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R, S024R-T033S-S128I-A158E-S188D, S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248D, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-H249R, S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-Q245R-H249R, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R, S024R-T033S-A158E-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-L148I, N116L-G118R-S128I-S166D, S024R-N062E-S078D-G118S-S188D-N248D, S078G-G118S-P129E-H249R, S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209V-T213A-A232V, G020K-T022L-S024F-S078N-G118R-S166D, T022A-G118R-S128I-S188D, G020R-N062E-S078G-G118S-N248D, G020R-S078D-G118D-S188D-H249R, N062E-S078G-G118D, G020K-T022L-G118R-S166D-T213A, G061E-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248E-E271L, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-T213A-A232V, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-N269D-A270V-E271F-A272V, T022A-V068A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245T-N248E-E271T, S078G-G118S-P129E-S188D-N248D-H249R, G020K-T022L-S166D-L217E, T213A-L217E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248D-E271T, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245V-N248H, G020R-S078D-G118S-G159D-Q245R-N248D-H249R, S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-A232V, T022L-S024F-G118R-S166D-L217E, S024R-T033S-S188D, G020R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-H249R-A272D, T033S-A158E-S188D, S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-A232V, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245T-N248E, G020R-S078D-G118D-G159D-Q245R, A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-A232V, N062E-S078G-G118S-S188D, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R, A016S-S101G-S128N-L148I, G118R-S128I-S166D-S188D, N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-H249R, T022A-T033S-N062E-N116L, N062E-S078G-G118D-P129E-Q245R, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245T-N248E-E271L, S078G-G118S-S188D-H249R, S024R-N062E-S078D-G118S-H249R, S078G-G118S-P129E-S188D-N248D, S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-T213A-A232V, T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-A158E-S188D, G020K-S024F-S078N-S166D-L217E, S024R-S078G-G118S-P129E-H249R, T022A-S024R-S128I-A158E-S166D, S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-A232V, G020R-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R, N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-N248D-H249R, A016S-V104I-S128N-L148I, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245V-N248E, T022A-G023A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022A-N116L-S188D, G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R, S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-H249R, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V, S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-N248D, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-G211Q-A232V, S024R-N062E-S166D-S188D, S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-T213A-A232V, T022A-S024R-G118R-A158E-S166D-S188D, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V, G020K-T022L-S024F-S078N-G118R-S128D, A016S-T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-T213A-A232V, S024R-N062E-N116L-S128I, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-T213A-A232V, T022A-V068A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-T033S-N062E-G118R-A158E, S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-Q245R-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248D, T022A-S024R-A158E-S188D, G020K-T022L-S078N-G118R-S166D-L217E, G020R-S078D-G118D-P129E, A016S-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-G211Q-A232V, G020K-T022L-S024F-G118R-S166D-T213A-L217E, G118R-T213A-L217E, T022L-S024F-S166D-T213A-L217E, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R, T022A-T033S-G118R-P129E, S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-S101A-S103G-V104I-S128N, T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-S166D, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-T213A-A232V, A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, S024F-G118R-S128D-T213A-L217E, T022L-S024F-G118R-T213A-L217E, N062E-S078D-G118S, S024R-G118R-A158E-S188D, S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-A232V, A088L, E271W, N062E-S078D-G118D-P129E-H249R, T022A-V104I-S128N-L148I, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A230V-A232V-Q245R-N248H, S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209A-T213A-A232V, S024R-S078G-G118D-G159D-Q245R-H249R, G097P-A098F-S099A-V104I, T022L-S024F-S078N-G118R-S166D-T213A, N062E-S078G-G118D-S188D-Q245R-N248D, T022A-S024R-T033S-S166D-S188D, T022A-T033S-R045C-G118R-A158E-S188D, T022A-S024R-N062E-S128I-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-S024R-N116L-S166D, S024R-N062E-S128I-A158E, S024R-G118R-A158E-S166D, G020K-T022L-S078N-T213A, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-Q245R-N248D, G020K-T022L-S078N-T213A-L217E, G020R-S078D-G118D-G159D-Q245R-H249R, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, S024R-S101A-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R, S024R-N116L-G118R-A158E-S166D-S188D, S024F-S166D-T213A, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S128I-S166D-S188D, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-N248D-H249R, T022A-S024R-T033S-N116L-G118R-A158E-S166D-S188D, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-T213A-A232V, T022L-S024F-L217E, G020R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, S099T-S103G, S024R-S078D-G118D-P129E-N248D-H249R, S024R-S078D-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R, S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R-H249R, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-A232V, S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G118R-S128L-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D, S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R, T022L-G118R-T213A-L217E, G020R-S024R-S078G-G118S-S188D-N248D-H249R, G118R-A158E-S166D-S188D, A016S-T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V, N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D, T022Q-A088S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245V-N248E, S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D, G020K-S024F-S128D-N204K, S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-A232V, S024R-S078D-G118S-S188D, S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-A232V, G020R-N062E-S078D-G118S-S188D-Q245R-N248D-H249R, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-A232V, S101G-S103A-V104L-L148I, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248D-E271L, S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-S188D-H249R, R010H-T022L-S024F-L217E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248D, S024R-N062E-S078G-G118D-S188D-Q245R, S024R-N116L-S128I-A158E-S166D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245T-N248H-E271F, G020R-S078D-G118S-P129E-G159D, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-Q245R-N248D, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-P210I-A232V-Q245R, S078D-G118D-S188D-Q245R, G020K-T022L-S024F-G118R-S166D-T213A, S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D-H249R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245R-N248E-E271F, S056R-G065P, S056K, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-A158E, S024R-S078G-G118S-P129E-S188D, G020R-N062E-S078D-G118D-G159D-N248D-H249R, S024R-S078G-G118S-G159D-N248D, S024R-N062E-S078G-G118D-S188D-N248D, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-Q245R, S024R-S078D-G118D-G159D, T022A-S024R-T033S-G118R-S128I-S166D-S188D, A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V, T022A-T033S-S188D, G097P-S103A-V104L, G020R-S078G-G118D-P129E, N062E-S101A-S103A-V104I-S188D-V203L-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D, G020R-S078D-G118D-G159D-S188D, G020R-S024R-S078G-G118D-S188D-Q245R-N248D, G020R-N062E-S078D-G118D-S188D, G020R-S101A-P210I-G211Q, T022A-T033S-N116L-S188D, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248E-E271L, S024R-N062E-S078D-G118D-N248D-H249R, T022A-S024R-N116L-A158E, N062E-N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118S-S188D-N248D-H249R, G020R-S078G-G118S-P129E-S188D-N248D-H249R, S024R-S078D-G118D-G159D-S188D, A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-A232V, S132D, N043K, G097P-V104L, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-G211Q-A232V, S024R-N062E-S078D-G118D-G159D-S188D-H249R, S024R-S078G-G118S-G159D-S188D, S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-N248D, S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-H249R, S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-T213A-A232V, G020K-S078N-S166D-T213A-L217E, S103A-L111V-L148I, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-T213A-A232V, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D, S024R-S078D-G118D-P129E-S188D-Q245R-H249R, T022A-G118R-S166D, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R, T022A-S024R-T033S-N116L-G118R-A158E-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245V-N248D-E271F, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-Q245R-N248D-H249R, A016S-T022A-V104I-S128N, S024R-N062E-N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-A232V-Q245R, T022L-G118R-S166D-T213A-L217E, S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-H249R, G195W-N269E, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-Q245V-N248E, N269W, T022A-T033S-G118R-A158E-S166D-S188D, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-Q245R-H249R, A016S-S101A-S103A, G097P-S099G-S103A-V104I, S024R-S078D-G118D-P129E-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248E, S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R, T033S-N062E-G118R-A158E, G020R-S078D-G118S-G159D-N248D, A016S-T022A-S103G-V104I-S128N-L148I, A016S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-A232V, S101A-S103A-V104I-S188D-M222S-A232V-Q245R, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-T213A-A232V, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-T213A-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-T213A-A232V, G020R-S078D-G118S-S188D, G020R-S078D-G118S-P129E-Q245R-N248D, T022L-S166D-T213A, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-N248D, S240G, S078G-G118S-P129E-Q245R-N248D, S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R-N248D, S024R-S078G-G118S-G159D, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R, S024F-S078N-G118R-S166D, S078G-G118S-P129E-N248D, N155W, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-G211Q-T213A-A232V, G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-Q245R-N248D, G020R-S078D-G118D-P129E-S188D-Q236R-N248D-H249R, T022A-S024R-N116L-A158E-S188D, S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-G211Q-T213A-A232V, S078D-G118S-S188D-Q245R-N248D, T022L-S024F-S078N-L217E, S099A-S101A-G102A, G020R-S078D-G118D-G159D-N248D-H249R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-N116L-G118R-S166D-S188D, S024R-G118R-S128I-A158E-S166D-S188D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R, N062E-S078G-G118D-N248D-H249R, N062E-S078R-P129E-S188D-Q245R-N248D, S024R-N062E-G159D-S188D-Q245R, G020R-N062E-G118R-S188D-N248D-H249R, N062E-S078R-P129E-G159D, G020R-S024R-N062E-P129E-S188D-N248D, N062E-S078R-G118R-G159D-S188D-P210L-N248D, N062E-S078R-Q245R-N248D, G020R-G159D-S188D-H249R, G020R-G118R-G159D-S188D-N248D, G118R-P129E-G159D-S188D-H249R, N062E-S078R-G118R-P129E-N248D, N062E-S078R-G159D, N062E-G118R-P129E-S188D-Q245R, G020R-S024R-P129E-G159D-S188D-N248D, S024R-N062E-S078R-G159D-N248D, G020R-P129E-S188D-H249R, G020R-P129E-G159D-S188D-Q245R, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-S188D-Y209V-T213A-A232V, G020R-G159D-S188D-Q245R-N248D, G118R-P129E-G159D-Q245R-N248D, G020R-N062E-S078R-P129E-S188D-N248D, G020R-P129E-S188D-Q245R, S024R-N062E-S188D-N248D, S078R-L111I-N185I-I198L-L217E, G020R-P129E-S188D-N248D-H249R, G020R-N062E-G118R-G159D-N248D, G020K-T022L-G118R-P129E-S188D, G020R-G118R-P129E-S188D, G020R-P129E-G159D-Q245R-N248D, G020R-S024R-P129E-G159D, G020R-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R, S024R-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-P129E-Q245R-N248D, N062E-S078R-G159D-N248D, S024R-G118R-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-G061W-P129E-G159D-S188D-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, N062E-G159D-S188D-H249R, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-S130D-Y209V-T213A-A232V, G020R-S024R-P129E-G159D-N248D-H249R, P129E-G159D-S188D-H249R, G118R-P129E-G159D-S188D-K237R-N248D-H249R, G020R-G159D-S188D-Q245R, G020R-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129S-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S078R-G118R-P129E-S188D-N248D, G020R-S024R-G118R-G159D-S188D-Q245R-N248D, G020R-G118R-P129E-G159D-S188D, G020R-G159D-S188D, G020R-G118R-P129E-S188D-N248D, A016S-S024R-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-T213A-A232V, G020K-N062E-S188D-T213A-M222S, A016S-S024F-S101D-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-T213A-A232V, S024G-S078N-S101N-Q109G-S128A-L217Q, T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-M222S-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-P129E-Q245R, S024R-P129E-G159D-Q245R-N248D, S024R-G118R-S188D-N248D, G020R-P129E-H249R, S024R-P129E-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S078R-P129E-G159D-S188D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-P129S-L217Q-A232V-Q245R, G118R-P129E-H249R, G020R-N062E-G118R, G020R-G118R-P129E-G159D-Q245R-N248D, T022A-S101Q-S103A-V104I-P129S-L217Q-A232V-Q245R, S024R-S078R-G118R-P129E-G159D-S188D, P129E-Q245R-N248D-H249R, S024G-G061S-S078N-S101N-Q109G-S128A-L217Q-N243V, S078R-V084A-P129E-Q245R, S024R-G118R-G159D-S188D-N248D, G020R-G118R-P129E-G159D-H249R, S078R-P129E-G159D, G061P-S078N-G097A-S101N-S128A-V203Y-L217Q, P086S-S087G-A088V-G097A-N117S-S128A-L217Q, S024R-S078R-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, S078R-G118R-P129E, S024G-S078N-S101N-S128A-L217Q-N243V, S024R-S078R-G159D-S188D, G020R-G118R-P129E, G020R-S024R-P129E-G159D-S188D-H249R, S024R-G118R-G159D-S188D, S024R-G118R-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, S024G-S078N-S101N-S128A-L217Q, S024R-G159D-S188D-Q245R, S024G-S078N-S101N-Q109G-L217Q-N243V-N248A, G020R-S078R-G159D-S188D-Q245R-N248D, S078R-G118R-P129E-S188D-N248D, S024R-S188D-Q245R-N248D, G020R-S024R-S101A-P210I-G211Q, G020R-G159D-N248D-H249R, G020R-P129E, G020K-N062E-N116L-T213A-M222S, S024G-S078N-A088T-S101N-Q109G-N116T-S128A-A158S-L217Q-N218S-L257G, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-S166D-Y209V-T213A-A232V, S024R-N062E-S078R-P129E-H249R, N018K-G020R-S024R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A, G020R-S024R-G118R-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R, G020R-S024R-P129E-H249R, G020R-G118R-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-Q245R, G020R-S024R-G118R-P129E-G159D-N248D, S024G-S078N-S101N-Q109G-S128A-L217Q-S256R, S024G-S078N-S101N-S128A-A158S-L217Q-L257G, G020R-S024R-G118R-S188D-N248D, G020R-G118R-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G159D-S188D-Q245R-N248D, S078N-G118R-S166D-L217E-M222S, G020R-G118R-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-S128A-P129S-A232V-Q245R, S024R-N062E-Q245R, S188D-Q245R-N248D, S024R-G118R-P129E-S188D-H249R, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-P129S-A232V-Q245R, G020R-G118R-S188D-Q245R-N248D, S024G-S078N-S101N-Q109G-N116T-S128A-L217Q-N243V-S256R, G020R-G118R, G020R-S024R-S188D, N062E-P129E-G159D-S188D-Q245R, G020R-G159D-Q245R-N248D, G020R-N043R-S101A-P210I-G211Q, G097A-S101N-S128A-L217Q, G020R-G118R-S188D-N248D, S024R-S188D-N248D, G020R-S024R-S188D-Q245R-N248D, G020R-S024R-G118R-P129E-G159D-N248D-H249R, G020R-P129E-N248D, G159D-S188D, P129E-G159D, G020R-S188D-H249R, P129E-G159D-Q245R-N248D, G020R-G118R-G159D-N248D-H249R, G118R-S188D-N248D-H249R, G020K-S101D-G102A-L217E-S240R, N043R-G102A-L217E, N062E-S078N-S101D-S240R, G102A-L217E, G020K-S128L-L217E-S240R, G020K-N062E-S078N-L217E-S240R, N043R-S101D-S128L-L217E-S240R, G020K-S078N-S101D-G102A-P210L, N043R-S101D-L217E, G020K-G100S-L217E-S240R, S078N-G100S, G020K-N043R-S101D-G102A-L217E, G100S-S240R, G020K-G102A-L217E, G020K-S024G-N062E-S078N-S101N-Q109N-N116L-S128A-S188D, G020K-L217E-S240R, N043R-S101D, N043R-S078N-S101D-S128L-S240R, N043R-S078N-S101D-L217E-S240R, G020K-S078N-S101D, N043R-S128L-S240R, G020K-N062E-N116L-N123G-T213A, G020K-N062E-G097S-S101G-Q109G-N116L-S128A, G020K-N062E-S078N-G097A-S101N-Q109N-N116L-S188D, N043R-S078N-S101D-G102A-L217E, G020K-S078N-S099G-S128L-L217E, G020K-N062E-S101D, G020K-S128L-L217E, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101G-Q109G-N116L-L217Q, N043R-G097A-S101D-S128L, G020K-S024G-N062E-S101Q-Q109N-N116L-S128A, G020K-S024G-N062E-S078N-S101N-N116L-S128A-L217Q, S078N-G102A-S240R, N043R-S078N-G100S-L217E-S240R, G020K-S078N-S128L-L217E-S240R, G020K-N062E-N116L-S128Q, G020K-S101G-L217E-S240R, G020K-S024G-N062E-S101N-Q109G-N116L-S128A-L217Q, G020K-N062E-S078N-G097S-S101N-N116L-L217Q, G020K-N062E-G097S-S101N-Q109G-N116L-L217Q, G020K-S024G-N062E-S078N-G097A-S101Q-Q109N-N116L-M222S, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101Q-Q109N-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-N062E-S078N-S101N-Q109G-N116L-S188D-L217Q или G020K-N062E-S105G-N116L-S128L-T213A (Перечень 14), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляют собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-N116L-A158E-S188D, G020K-S024F-S078N-G118R-T213A, T022A-S024R-T033S-N116L-G118R-S128I, G020R-S078D-G118D-S188D-Q245R, S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-T213A-A232V, S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D, T022A-N062E-N116L-G118R-A158E-S166D, G020K-T022L-S078N-S166D-L217E, G020R-S078D-G118D-G159D, T022A-S024R-T033S-N116L, G020R-S078D-G118D-P129E-G159D, G020R-S078D-G118D-G159D-H249R, S024R-N062E-S078G-G118S, S024R-S078D-G118D-S188D-Q245R-H249R, A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V, G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R, S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209V-G211Q-A232V, S024F-S166D-L217E, T022A-S024R-S166D, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-N248D, A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-A232V, S078D-G118S-G159D-N248D-H249R, S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D, T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-S188D, S103A-S128N, T022L-S078N-G118R-S166D-T213A, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-T213A-A232V, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, S024R-S078D-G118S-S128N-P129E, S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-H249R, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245T-N248D, S024R-T033S-N116L-A158E, S130E-N269K, S024R-T033S-N116L-S128I-A158E, A016V-G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-Q245R-N248D, S099G-S101A-G102A-S103G-V104I, A016S-T022A-S101A-V104L-S128N-L148I, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-S188D, S259W, S259H, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N018D-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-G211Q-T213A-A232V, G020K-S024F-S078N-S166D-T213A, N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R, S078D-G118D-P129E-G159D-H249R, S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-N248D, S024R-N062E-S101A-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R, E271R, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, G020R-N062E-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-H249R, Q012R-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V, G020R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G118R-S128L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020R-S078G-G118S-G159D-H249R, G020K-T022L-S024F-G118R-S128D-S166D, T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-A158E-S166D, A016S-S103G-V104L, A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-S188D-N248D, G020K-T022L-S078N-G118R-S166D, G020K-T213A-L217E, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, S078N-S166D-T213A-L217E, S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-H249R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, G020K-T022L-G118R-L217E, T022A-V104L-L111V, T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-N248D, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-N248D, T022L-S078N-L217E, G020R-S024R-S078G-G118S-S188D, S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-N116L-G118R-A158E-S166D, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-V104I-S128N, S024R-S078G-G118D-Q245R, N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R, T022A-T033S-G118R-A158E-S188D, T022A-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S166D-S188D, A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V, T022A-T033S-S128I-A158E, S024R-T033S-N116L-S188D, N062E-N076D-S101A-S103A-V104I-P210I-A232V-Q245R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, S130D, G020K-T022L-S024F-S078N-G118R-S166D-L217E, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248E, S024R-T033S-N116L-S166D-S188D, S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R-H249R, T022A-S024R-T033S-A158E-S166D-S188D, G020K-T022L-S024F-S166D-T213A-L217E, T022A-N062E-N116L-G118R-S188D, G020R-S078G-G118D-Q245R-N248D-H249R, T022A-N116L-G118R-S128I, T022L-S078N-S166D, T022L-G118R-S128D, G097P-S099A, T022L-S024F-G118R-S128D, S242K, N062E-S078D-G118S-G159D, A016S-S103G-S128N-L148I, G097P-A098Q-S101A, T022A-S103A-V104L-S128N-L148I, T022A-S101G-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, S099G-S101G-G102A, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248D, G100S-S101G-V104I, S078D-G118S-G159D-Q245R-N248D, A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-S024R-T033S-N116L-A158E, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024R-N116L-S128I-S166D, S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V, S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V, G020R-S078G-G118D-G159D-S188D-N248D, G020R-S078D-G118D-S188D-Q245R-N248D, S024F-S078N-G118R-S128D, T022L-S024F-S078N-G118R-S166D, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-H249R, S103A-V104L-S128N, T022A-S024R-N062E-N116L-S128I, T022A-N062E-N116L-G118R-A158E-S188D, T022A-S024G-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-H249R, N062E-S078D-G118S-S188D-Q245R-N248D, T022A-S103A-L148I, T022A-S024R-N116L-S128I-A158E-S188D, G097P-S099T-S101G-V104I, S166D-T213A-L217E, A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-A232V, N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-G211Q-A232V, G020K-T022L-S078N-G118R-S128D-S166D-L217E, T033S-S188D, T033S-N116L-G118R-A158E, T022A-S024G-N076D-V093I-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S078D-G118S-P129E-Q245R-H249R, T022A-S024R-A158E-S166D-S188D, G020K-T022L-S078N-G118R-S128D, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-S188D, S099T-G102A, S024R-N116L-G118R-A158E-S188D, T033S-N116L-G118R-S166D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245V-N248H, S078D-G118D-Q245R, G020K-S078N-G118R-S166D-T213A-L217E-A272D, A016S-T022A-V104L-L111V-L148I, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245V-N248H, N062E-N116L-G118R-S166D, N062E-S166D, T022A-S024R-N062E-G118R-A158E-S188D, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-A232V, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-Q245R, S024R-N116L-S128I-A158E-S188D, S024R-N062E-S101A-S103A-V104I-P210I-A232V-Q245R, A114T, T022L-S024F-S078N-G118R-S128D, S024R-N116L-G118R-S166D, N062E-S078G-G118D-P129E, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-A232V, G020K-T022L-S078N-S166D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103G, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-S212L-A232V, S024F-G118R-S166D-T213A, G100S-S101G, A016S-T022A-S103A-V104L-S128N, G020K-S024F-S078N-G118R-S166D, S099T-G102A-S103G, G020K-S024F-S128D-L217E, S078D-G118D-G159D-H249R, N062E-S078G-G118D-S188D, N076D-S101A-S103A-V104I-P210I-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118D-P129E-N248D, S078G-G118S-G159D-S188D, A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-G211Q-T213A-A232V, G020K-S078N-G118R-S166D-T213A-L217E, T022A-S101N-S103A-V104I-L124V-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S078D-G118D-P129E, G020K-S024F-S128D-T213A, T022A-T033S-A158E-S188D, G020K-S024F-S128D-S166D-T274A, S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-A158E-S166D-S188D, S078G-G118S-P129E-S188D, T022A-S024R-S128I-A158E-S188D, T022A-S024R-G118R-S128I-A158E, T022A-N116L-S166D, G020K-G118R-S128D-S166D, G020K-T022L-S024F-S078N-G118R-S128D-L217E, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-S188D-N248D, G020K-T022L-G118R-S128D-L217E, S024F-S078N-G118R-S128D-T213A, S024R-S078G-G118D-S188D-N248D, N062E-N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R, T033S-G118R-S128I-A158E-S166D, A016S-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-A232V, S101G-V104I-L111V-S128N, T022A-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245V-N248E, T022A-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S024F-G118R-S128D, T022A-N076D-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-P131L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248E, T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-T213A-A232V, T022A-S024R-T033S-N062E-G118R-A158E-S188D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N116L-G118R-S188D, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L124V-S128A-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V, T022A-S128I-S188D, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D, S024R-T033S-N116L-S128I-A158E-S188D, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-A232V, A016S-S101G-S103G-V104I-L148I, S024R-T033S-G118R-S166D-S188D, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V, T022A-N062E-N116L-S128I, A016S-S101G-S103G-V104L-L148I, T022A-N116L-S166D-S188D, G020K-T022L-S024F-S078N-S128D-T213A, S099G-G100S-V104L, S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-H249R-T253M, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245T-N248E, G020R-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R, G118R-S166D-T213A-L217E, G020K-S024F-S128D, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-G118R-S128D-T213A-L217E, S024F-G118R-S128D-T213A, T022A-S101A-S103A-V104I-S128N, S024R-N062E-N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R, T022A-S103A-S128N-L148I, G020R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-N248D, T022A-S024R-T033S-G118R-S128I-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-G211Q-A232V, T022A-S101Q-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-S166D-S188D, S078D-G118S-P129E-Q245R-N248D, G020K-S024F-S078N-G118R-S166D-T213A, S024R-N062E-N116L-G118R-S166D-S188D, G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-N248D-H249R, G020K-S078N-G118R-S128D, T022A-N062E-S166D, P014R, S240D, N155G, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-T213A-A232V, A016S-T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-A232V, A016S-T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-G211Q-A232V, G118R-S128I-S166D, T022A-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-A158E-S188D, T022A-S101N-S103A-V104I-L124V-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, N116L-G118R-S188D, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G118R-S128I-A158E, G097P-S101A-V104L, S103G-V104I-S128N-L148I, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D, V026W, G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-N123S-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, S103G-S128N-L148I, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-H249R, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022L-S078N, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V, G020K-T022L-S128D-T213A, N062E-G118R-S128I-S188D, S024R-N116L-S128I-S166D-S188D, T022A-S101N-S103A-V104I-S128A-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-T033S-N116L-G118R-A158E, T022A-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S024F-S166D-L217E, S024R-S078D-G118S-G159D-N248D-H249R, T022A-S101Q-S103A-V104I-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-A232V, S078G-G118D-P129E-Q245R-N248D, G020R-S078G-G118D-G159D-N248D, G020K-T022L-G118R-S128D-S166D, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248D, G020R-N062E-S078G-G118D-S188D-Q245R-H249R, S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-T213A-A232V, S024R-N062E-N076D-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S024R-N116L-G118R-S128I-A158E, A098Q-S099T-S101A-V104L, T022A-S024G-G097S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S099G-G102A, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F-T274A, A016S-V104I-L148I, G097P-S101A-S103A, G020K-T022L-S024F-G118R-S166D, T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-S166D, A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078G-G118S-P129E-N248D, G020R-S078D-G118S, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-S128A-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-S101G-S103A-V104I, G020K-T022L-S166D-T213A-L217E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-S101A-S103A-S128N, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098Q-S099T-G102A-S103A, T022A-N076D-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S078N-G118R-H120N-S128D-S166D, S101G-S103G-L148I, T022A-S024R-T033S-A158E-S166D, N116L-G118R-S166D, T022A-N062E-N116L-S166D, N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-M222S-A232V-Q245R, T022A-S101G-V104L-L148I, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-Q245V-N248D, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-M222S-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, N116L-G118R, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022L-G118R-S166D-T213A, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-A232V, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-S101G-S103G-V104L-L148I, S024R-S078G-G118D-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-S216G-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-N116L-S128I, P086T-G097P-S099T-S103A-V104I, A098F-G102A, T022A-S101Q-S103A-V104I-L126I-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078G-G118D-G159D-N248D, T022A-S024G-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-G211Q-A232V, G020R-S024R-S078D-G118S-H249R, G020K-S078N-G118R-S166D-T213A, G020K-T022L-S024F-G118R, S024R-S101A-S103A-V104I-P210I-A232V-Q245R, T022A-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098Q-S099G-S103A, T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-G118R-S128D-L217E, A098F-S099T-G102A-S103A, T022A-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S078D-G118S-Q245R, A098Q-S099T-S101A-S103A-V104L, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-S024F-S078N-S128D-T213A-L217E, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S078D-G118S-S188D-Q245R-H249R, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248E, T022A-S024G-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-G097S-A098E-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S078N-S166D-T213A, S101G-S103A-V104L-S128N, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-S128L-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245T-N248D, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S099G-G100S, T022A-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-Q245R-N248D-H249R, T022A-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N116L-A158E-S188D, S099A-G102A-V104L, T033S-N116L-A158E-A272D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248E, S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-G211Q-A232V, T022A-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-T033S-N116L-G118R-S166D-S188D, T022L-S024F-G118R-S166D-T213A, T022A-S103A-V104I-L111V-S128N, T022A-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-V244A-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022A-T033S-N116L-G118R-S128I, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S078G-G118S-T180N-Q245R-N248D, S099G-S103G-V104I, T022A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-N116L-A158E, T022A-S024G-N076D-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S024F-S078N-S166D-T213A-L217E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-A158E-S188D, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-A232V, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024G-N076D-G097A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N062Q-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-N062E-A158E-S166D-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248E, N062E-N116L-G118R-S128I, T033S-N062E-N116L-G118R-A158E-S166D, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-H249R, T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-S166D-T213A, T022A-S024G-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-N116L-G118R-A158E-S166D-S188D, S024R-S078D-G118S-P129E-S188D-N248D, S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-N248D, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124V-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S024F-S078N-S166D-T213A, G020R-S024R-S078G-G118D-S188D-H249R, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-V104I-L111V, T022A-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N062E-N116L-G118R, T022A-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S101G-V104I-L111V-L148I, S024R-N116L-S128I-A158E, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-A232V, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, N062E-S078D-G118S-G159D-S188D-K235R-Q245R, T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103G-V104I-S128N-L148I, T022A-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, N076D-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-S166D, T022A-S024G-S078N-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A114L, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-K237E-N248D-H249R, G020K-T022L-S024F-G118R-S128D-T213A-L217E, A016S-S101A-S103A-V104L-S128N-L148I, T022A-N076D-S078N-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124V-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-A232V, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-T033S-G118R-S188D, T022A-T033S-N116L-G118R-S128I-S188D, T022A-S024R-T033S-S128I-A158E-S188D, T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S103A-L148I, T022A-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N018S-T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T066V, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S099T-S101A-S103G, T253L, N076D-S101A-S103A-V104I-P210I-M222S-A232V-Q245R, S099G-S101A-G102A, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S078D-G118D-S188D-Q245R, T022A-S103G-V104L-S128N, S024R-N116L-G118R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-N123S-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-N076D-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024G-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-N062E, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, A098Q-S099A-G102A, G118R-S128I-A158E-S188D, T022A-S024G-N076D-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104L-S128N, T022A-S101N-S103A-V104I-S128A-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-T033S-A158E, S024R-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245V-N248H-E271T, S024R-T033S-N062E, S024R-T033S-S166D, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N062E-A158E-S166D-S188D, T022A-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-M222S-A232V-Q245R, T022A-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-G118R-S128D-T213A, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245V-N248E, T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-G097A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S056G, G020R-N062E-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R-H249R, T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-R275H, T022A-S024G-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-R045S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022A-S101G-S103A-V104I-L126I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N062D-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-Q245R-H249R, T022A-S101G-S103A-S128N, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-N248D-H249R, N116L-G118R-P129E-S188D, T022A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-L126I-S128A-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D, T022A-T033S-G118R-S166D-S188D, S078G-G118D-P129E-G159D-S188D, T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S103A-V104I-L111V, T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-A085T-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-E089G-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, S101G-S103A, L196S, T022A-S024G-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L124V-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, E271S, A098Q-S099T-G100S-S101A, T022A-S024G-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, R019H-T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S078N-S166D-T213A, G020R-S024R-S078D-G118D-Q245R-N248D, N269K, T022A-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-V139A, T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-G211Q-A232V, T022A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R-H249R, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R-H249R, T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S128I-S188D, T022A-S024G-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S166D-L217E, T022A-S024G-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098Q-S099G-S101A, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022A-V068A-S101G-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S128I-A158E-S166D, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-N062E-S078D-G118D, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L126I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024F-S078N-G118R-N204K-T213A-L217E, G020R-N062E-S078D-G118D-G159D-N248D, T022A-S024G-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L124V-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-S099G-S101G-V104I, S024R-N062E-S078D-G118D-N248D, T022A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-L124V-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S128D-T213A-L217E, G020K-G118R-S166D-T213A, A016S-T022A-L111V, S078D-G118D-P129E-N248D-H249R, S024R-S128I-A158E-S166D-A194T, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S078D-G118D-P129E-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-R186H-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-L124V-S128A-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-S024F-S078N-G118R-S128D-S166D-T213A, G020R-N062E-S078D-G118D-G159D-S188D, T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-N116L-G118R-S128I-S166D, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V, T022L-S024F-S078N-G118R-T213A-L217E, T022A-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078G-G118S-P129E-S188D, G020R-N062E-S078D-G118D-G159D-Q245R-H249R, T022A-G097S-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-T033S-N062E-N116L-S166D-S188D, G020R-S078G-G118S-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-N062E-S078G-G118D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-S101G-S103A-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S024F-S078N-S166D-T213A, A085T-G097P-A098Q, N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024G-N076S-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, Q012R-T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-T213A-A232V, T022A-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N116L-A158E-S166D-S188D, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-T033S-S128I-A158E, S024R-N116L-G118R-S128I-S188D, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078D-G118D-S188D-H249R, G020R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D, G020K-T022L-S078D-G118D-P129E-N248D-H249R, T022A-S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-G097A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124V-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245V-N248D, N062E-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R, S024R-N062E-G118R-S128I-A158E-S188D, T022A-S101N-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S078N-S128D-L217E, T022A-N062E-N116L-A158E-S188D, T022A-S101A-V104I-L111V, S166D-T213A, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S024F-S166D-T213A, T022A-N076D-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S128I-A158E-S166D, N062E-S078D-G118S-N248D-H249R, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S024F-S078N-S166D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, S078D-G118S-P129E-N243D-H249R, T022A-S024G-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N062E-G118R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S078G-G118S-Q245R, T022A-S024G-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272T, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-L124V-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S078N-S166D-L217E, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, Q236L, S078D-G118D-P129E-H249R, T022A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101A-S103A-V104I-L111V, T022L-S024F-S078N-S128D-T213A, T022A-S024G-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-S024F-S078N-G118R-S128D-L217E, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, G020K-S128D-T213A-L217E, S103A-V104I-L111V-S128N, T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, V104I-L111V, T022A-N062Q-S101Q-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-S101A-L111V-S128N, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245V-N248E, T022A-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-S128L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272D, T022A-S024G-N076D-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-G211Q-A232V, S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-H249R, T022A-S103G-S128N-L148I, T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-S078D-G118S-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245V-N248D-E271T, S078G-G118D-S188D-Q245R-N248D, T022A-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G118R-S128D-S166D-L217E, G020R-S078G-G118S-P129E-Q245R-H249R, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-T213A-A232V, T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-R145K-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L126I-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022L-S078N-T213A, T022A-N076D-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R-H249R, A016S-S101G-V104I-S128N-L148I, T022A-G118R-S188D, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-S024F-G118R-S128D-T213A, T022A-S101Q-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S024F-S078N-S128D-T213A-L217E, T022A-S024G-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-A232V, T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S099G-G100S-S103A, T022Q-S101G-S103A-V104I-S166D-S188E-A232T-Q245T-N248E, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098F-S099T-S103A-V104I, G020K-T022L-N062E-S078D-G118D-P129E-Q245R-N248D, T022L-S078N-G118R-S128D, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022A-S101Q-S103A-V104I-L126I-S128A-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G023A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-A232V, T022A-S024R-N116L-G118R-S166D, S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R, G020K-T022L-S024F-S078N-G118R-S128D-T213A, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-T274I, G097P-S099A-V104L, G097P-S099A-S103A, T022A-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-V104L-L148I, T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159S-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S078D-G118S-G159D-Q245R-H249R, T022W-N043R-R045T-S101A-P210I-T213A, S024G-N076D-S078N-S101N-H120Q-S128A-L217Q, G020R-S024R-G118R-P129E-G159D-H249R, G020R-S078R-G159D-S188D, P129E-S188D-Q245R-H249R, S078R-P129E-Q245R, S078R-P129E-N248D, T022A-S101Q-S103A-V104I-P129S-A232V-Q245R, S188D-N248D, S078R-G118R-G159D, G020R-S078G-G118S-Q245R-N248D-H249R, S024R-S078R-G118R-G159D, G020R-P129E-G159D-N248D, G020R-S024R-G159D-N248D, G097A-S128A-L217Q, S024R-P129E-G159D-N248D, T022K-S101A-S103N-V104L-A232T-Q245R, S078G-G118S-S188D-Q245R-H249R, S099T-S101G-G102A-S103A, G020R-G118R-G159D-Q245R, S024G-S078N-S101N-L217Q, S024G-S078N-S101N-S128A-L217Q-S256R, S078R-G118R-G159D-N248D, S078G-G118S-Q245R-H249R, G118R-P129E-N248D, G020K-T022L-Q245R, A098Q-S099T-S101G-S103A, G118R-H249R, S024R-G118R-N248D-H249R, G020R-S024R-S078G-G118S-Q245R-N248D-H249R, A098F-S099A-S101G-V104I, G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q, A098Q-S099G-S101G-V104L, G020K-N062E-G097A-S101Q-Q109G-N116L-S188D-L217Q, G020K-N062E-S078N-G097A-S101Q-Q109G-N116L, G020K-N062E-G097A-S101Q-Q109N-N116L-L217Q, N043R-S078N-G102A-S128L-L217E-S240R, S078N-G097S-S101Q, N043R-N062E-S078N-S101D-S128L-S240R, S128L-L217E-E271L, G020K-S024G-N062E-G097S-S101N-Q109N-N116L-S128A-L217Q, G020K-N062E-N116L-S128L-T213A, S078N-G097A-S101G-Q109G-S188D-L217Q, S101D-S128L-L217E-S240R, G020K-S024G-N062E-G097A-S101Q-Q109G-N116L-S128A, G020K-N062E-S078N-G097S-S101N-Q109N-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-N062E-G097S-S101Q-Q109G-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101N-Q109N-N116L-S128A, S024G-S078N-G097S-S101G-S128A-S188D-L217Q, S024G-S078N-G097A-S101N-Q109G-S128A-S188D-L217Q, G020K-N043R-G102A-S128L, G020K-S078N-S101D-G102A-L217E-S240R, G020K-N062E-G100S, S078N-S128L-L217E-E271L, S128Q-L217E-E271L, G020K-S024G-N062E-S078N-G097A-S101N-N116L-S128A-L217Q, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101G-N116L-S128A-L217Q, G020K-S078N-S101D-G102A-L217E, G020K-N062E-S128L, G020K-N062E-S078N-S101G-Q109N-N116L, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101Q-N116L-S128A-L217Q, S078N-S128L-L217E-S240R, S101D-S128Q-L217E-S240R-E271L, N043R-G102A-S240R, G020K-N062E-S078N-S101N-Q109N-N116L-M222S, G020K-N062E-S101N-Q109G-N116L-S128A-L217Q, G020K-S024G-N062E-S078N-G097A-S101G-N116L-L217Q, G020K-N062E-S101G-N116L-S188D, G020K-N062E-G097S-S101Q-Q109N-N116L-S128A-S188D, G020K-I035V-G100S-S128L-L217E, N043R-S101D-G102A-S240R, N062E-S078N-G100S, G020K-N043R-N062E-A215T, N062E-S240R, N043R-S128L-L217E-S240R, N062E-S101D-S240R, G020K-S101D-N116L-T213A, G020K-S101D-N116L-S128Q-P210S-T213A, G020K-S101D-T213A, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101Q-Q109N-N116L-S128A, G020K-N062E-S078N-G097S-S101Q-N116L-S128A-L217Q, S024G-G097S-S101N-Q109G-S188D-L217Q, G020K-S024G-N062E-S101N-Q109G-N116L-L217Q, L217E-S240R, S101D-L217E-S240R-E271L, N043R-N062E-S101D-S128L-S240R, G097A-S101N-S128A-S188D-L217Q, G020K-N062E-S078N-S101N-N116L-S128A-L217Q, G020K-N062E-S078N-G097S-S101G-Q109N-N116L-L217Q, G020K-S024G-N062E-G097S-S101N-Q109G-N116L-S128A-L217Q, G020K-S024G-N062E-G097S-S101G-Q109G-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-N062E-S101N-Q109N-N116L-S128A-S188D, S078N-G097S-S101N-Q109N-S128A-S188D-L217Q-W241L, G020K-N043R-N062E-S078N-S101D, G020K-N062E-S101D-S240R, G020K-S101D-S128Q, G020K-N116L-S128Q-Y209H-T213A, G020K-N043R-S078N-G100S-L217E-N218D, S024G-S101N-Q109G-S128A-S188D-L217Q, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101N-Q109G-N116L-S128A-S188D, S078N-S101N-Q109G-S188D-L217Q, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101N-Q109G-N116L-S188D-L217Q, G020K-N062E-S078N-S101Q-Q109N-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-N062E-S101G-Q109G-N116L, G020K-S024G-N062E-G097S-S101N-Q109G-N116L-S128A-S188D-M222S, S024G-G097A-S101G-S188D-L217Q, S024G-S078N-G097A-S101G-S128A-S188D, G097S-S101N-Q109G-S128A-S188D, G020K-S078N-S101D-I246T, N043R-S128L-L217E, G020K-S101D-L217E-S240R, S128L-L217E-T224A-E271L, G020K-S078N-S101D-S128Q-L217E-E271L, N062E-S078N-S101D-L217E-S240R, G020K-S101D-L217E-E271L, G020K-S078N-S128Q-L217E-S240R, G020K-N062E-S101D-N116L-T213A, G100S-S101D, S078N-G097S-S101G-S128A-L217Q, G020K-N062E-G097S-S101N-N116L-S128A-L217Q, G020K-N062E-G097S-S101N-N116L-L217Q, S101N-Q109G-S188D, G020K-S024G-N062E-G097S-S101Q-Q109N-N116L-S128A-L217Q, G020K-S024G-N062E-G097S-S101N-N116L, G020K-S024G-N062E-S101N-N116L-S128A, G020K-S024G-N062E-S078N-S101Q-Q109N-N116L-S128A, G020K-N062E-S078N-S101N-Q109G-N116L-S188D, G020K-N062E-S078N-S101N-Q109G-N116L-S128A, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101N-Q109G-N116L-S128A-M222S, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101G-N116L-S128A, S024G-S078N-G097S-S101Q-Q109G-S128A-S188D-L217Q, S024G-S078N-S101G-Q109N-S188D-L217Q, S024G-S078N-G097A-S101G-Q109G-S188D, S078N-S101D-S128Q-L217E-S240R-E271L, G020K-S128Q-L217E, S128Q-L217E-S240R-E271L, G020K-S078N-S101D-L217E, G020K-S078N-S101D-L217E-E271L, G020K-N116L-S128Q-T213A, G020K-N116L-N123G, S101G-S188D-L217Q, G020K-S024G-N062E-S078N-S101G-N116L-L217Q, S078N-G097A-S101G-Q109N-S128A-S188D, G020K-S078N-S128L-L217E-E271L, G020K-N062E-S101Q-Q109G-N116L, G020K-S101D-L217E, S024G-G097A-S101N-Q109N-S128A, G020K-S078N-S101D-S128L-L217E-S240R, G097A-S101G-L217Q, S024G-S101Q-Q109G-S128A-L217Q, G020K-S024G-N062E-T071A-S078N-G097S-S101G-N116L-L217Q, G020K-S024G-N062E-S078N-S101G-N116L-S128A, G020K-S024G-N062E-S078N-G097A-S101N-N116L, G020K-N062E-G097A-S101N-N116L, G020K-S024G-N062E-G097A-S101N-Q109G-N116L-S128A, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101G-Q109N-N116L, G020K-N062E-S078N-G097S-S101Q-Q109G-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-N062E-S101N-Q109G-N116L-L217Q, G020K-S024G-N062E-G097A-S101N-Q109G-N116L-S188D-L217Q, G020K-S024G-N062E-S101G-N116L, S078N-G097S-S101N-Q109G-G159D-L217Q, S024G-G097A-S101N-Q109G-S188D, S078N-S101G-S128A-L217Q, S078N-G097A-S101N-S128A-S188D-L217Q, S024G-G097S-S101G-S128A-S188D-L217Q, S024G-S078N-G097S-S101Q-Q109G-S128A-S188D-L217Q-V227A, G020K-N062E-S078N, S078N-S128L-L217E-S240R-E271L, G020K-N062E-I072N-S101D-N116L-S128Q, G020K-T057P-N062E-N116L-S128Q-T213A, G020K-N043R-S078N-S101D-S240R, S078N-G097S-S101N-Q109N-S128A-S188D-L217Q, S024G-S101N-Q109N-S128A-S188D, G020K-S024G-N062E-G097S-S101Q-N116L-S128A, S024G-S078N-G097S-S101N-Q109N-S128A-S188D, N043R-G100S, G020K-N062E-S078N-S101Q-Q109G-N116L-S128A, S078N-S101Q-Q109N-S188D-L217Q, G020K-N116L-S128L-T213A, G020K-S078N-S101D-L217E-S240R, G020K-N062E-S101N-Q109N-N116L-M222S, G020K-S024G-N062E-G097A-S101Q-Q109N-N116L-S128A, S078N-G097S-S101G-S128A-S188D, G097S-S101G-Q109N-S128A-M222S, S024G-S078N-G097A-S101Q-S128A-M222S, G097A-S101G-Q109N-L217Q, S024G-S078N-S101G-S128A-S188D-L217Q, S024G-G097A-S101N-Q109G-S128A-S188D, G097S-S101N-Q109G-S128A, S078N-G097A-S101Q-L217Q, G020K-N043R-S078N-S101D, G020K-N043R-E054D-N062E-S078N-S240R, G020K-S101D-S240R, S128Q-L217E-S240R, G020K-S128Q-L217E-V244A-E271L, G020K-L217E-E271L, G020K-S078N-S128L-L217E, S078N-S101D-S128Q-L217E-E271L, G020K-N062E-L217E-E271L, G020K-N062E-S101D-N116L-S128Q-T213A, G020K-N062E-S078N-N116L-S128I, G020K-N062E-S078N-S128Q-T213A, S024G-G097A-S101G-Q109G-S128A, S024G-G097S-S101N-Q109N-S128A-L217Q, G020K-S024G-N062E-S078N-S101N-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-S101D, G020K-N062E-S078N-G097S-S101Q-N116L-S128A, G020K-N062E-G097S-S101G-N116L-S188D, N043R-S078N-G100S-S128L-S240R, G097S-S101N-Q109N-S188D, G097S-S101Q-Q109N-S128A-L217Q, G020K-N062E-S101N-Q109G-N116L-S128A-S188D-M222S, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101Q-Q109G-N116L, G020K-N062E-M222S, G097S-S101Q-Q109G-S188D, G020K-S078N-L217E-S240R, G020K-N062E-S078N-G097A-S101N-Q109G-N116L-S188D, G020K-S024G-N062E-G097S-S101Q-Q109G-N116L-S188D, G020K-N062E-S078N-G097A-S101Q-N116L-S128A-M222S, G020K-N062E-S078N-S101N-N116L-S188D, G020K-S024G-N062E-S078N-S101G-N116L, G020K-N062E-S078N-S101N-N116L-S128A-S188D, G020K-S024G-N062E-G097S-S101N-Q109G-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-N062E-G097S-S101N-Q109N-N116L, G020K-N062E-S101G-N116L-S188D-L217Q, G097A-S101N-S128A, S101G-Q109N-S128A-M222S, S024G-G097S-S101Q-Q109G-S188D-L217Q, G097S-S101Q-Q109N-S128A-S188D, S024G-S078N-G097A-S101Q-S188D-L217Q, S024G-S078N-S101G-Q109G-S128A-L217Q, G020K-N062E-S128L-S240R, N062E-S078N-S128L-S240R, N043R-G102A-S128L-L217E-S240R, N062E-S078N-L217E-S240R-E271L, S078N-S128Q-L217E-N269S, G020K-N062E-N123G-T213A, G020K-N062E-S078N-S099G-N116L-S128Q-T213A-L217N, G020K-N062E-S078N-S128I-L217N, G097A-S101Q-S128A-S188D-L217Q, G020K-N062E-S078N-G097S-S101N-Q109G-N116L, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101N-Q109G-N116L-S188D, G020K-N043R-S128L-S240R, S024G-S078N-G097A-S101N-Q109N-S128A, G020K-N062E-G097S-S101Q-N116L-L217Q, G020K-N062E-S078N-S128I, G020K-S024G-N062E-L090V-G097A-S101Q-N116L-M222S, G020K-N062E-S078N-S101Q-Q109G-N116L-S188D-L217Q, G020K-S024G-N062E-G097A-S101G-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-N062E-G097S-S101N-Q109N-N116L-S188D-L217Q, G020K-S024G-A048V-N062E-S078N-G097A-S101N-N116L-S128A-L217Q, G020K-N062E-S078N-S101Q-Q109G-N116L, G020K-S024G-N062E-G097S-S101N-Q109N-N116L-S128A, G020K-N062E-S078N-G097A-S101Q-Q109G-N116L-S188D, G020K-N062E-S078N-G097A-S101N-Q109N-N116L-N218D, S024G-S101N-Q109G-S128A-S188D-M222S, S024G-G097A-S101Q-Q109N-S188D-L217Q, S024G-S078N-G097S-S101Q-Q109N-S128A-S188D, S101N-Q109G-M222S, S024G-I072V-G097S-S101N-S128A-L217Q, S101G-S128A, N043R-S078N-G102A-A215G, G020K-S101D-S128L-L217E-S240R, S078N-S101D-S128Q-L217E-S240R, G020K-N116L-S128L-M222S, G020K-N062E-S078N-N116L-T213A-M222S, G020K-N062E-S078N-N116L-S128Q, G020K-N062E-T213A или G020K-N062E-S078N-N116L-N123G-M222S (Перечень 15), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляют собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из T022A-S024G-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S078N-G118R-S128D-T213A, S024R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-H249R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-G118R-S128I-A158E, T022A-S103A-L111V-L148I, T022A-N076D-A085T-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S078N-S128D-T213A-L217E, T022A-T033S-P129E-S166D, T022A-S024G-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-S078N-S166D-T213A, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248D, A158E-S166D-S188D, L021S-T022A-S024G-N076D-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-T033S-N062E-N116L-S188D, T022A-S024G-S049N-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098Q-S099A-S103G-V104I, G020K-S024F-G118R-S128D-S166D, T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-T033S-G118R-S166D, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, N062E-S078D-G118S-P129E-N248D-H249R, T022A-S024G-V026I-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098Q-S099A-S101A, S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-H249R, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-Q236R-Q245R-N248D, T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-N076D-N077D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, S099G-S101A-G102A-S103A, T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-Q245R, S056C, S024R-T033S-N062E-N116L, T022A-S024G-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-T213A-A232V, A098Q-S099A-G100S-S101G-V104I, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-L090I-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R, A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-T213A-A232V, G020R-S078G-G118D-N248D-H249R, T022A-N062Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-N062E-N116L-A158E-S166D-S188D, T022A-S024G-N076D-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-N062Q-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N116L-G118R, T022A-S024R-T033S-N062E-N116L-G118R-S128I-A158E-S188D, T022A-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-T033S-N062E-N116L-S128I-S188D, T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S240V, N062E-G118R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248E, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D, A016S-S103A-V104I, A088P, T022A-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-L126I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098F-V104L, T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S128D, T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R, S024F-S078N-G118R-L217E, T022A-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-S188D, G118R-S128D-S166D-T213A, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-L126I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S078G-G118S-S188D-H249R, T022A-S024G-N076D-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101A-S103A, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S078D-G118D-S188D-N248D-H249R, S099A-V104I, T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S078G-G118D-G159D-N248D, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L124V-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L124V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S078G-G118D-P129E, S212W, T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-V104L, T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-N117S-Y209A-G211Q-T213A-A232V, S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209A-G211Q-A232V, T022A-N062E-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024F-T213A, T022A-S024G-N076D-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-G097A-S099G-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-N218S-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-S078D-G118D-Q245R, T022A-S078N-I079V-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N116L-G118R-S128I-A158E-S166D, S078G-G118D-S188D, G097P-A098Q-S099G-G102A, S099A-S103G, S078D-G118D-P129E-Q245R-N248D, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N116L-S128I-A158E-S166D-S188D, A016S-T022A-S101A-S103G-V104I, T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-R186H-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-L126I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101Q-S103A-V104I-L126I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024R-T033S-N062E-N116L-S128I-S188D, T022A-S024G-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S078N-G118R-S128D-T213A, T022A-N076D-G097A-A098T-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S103A-V104L, S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-N248D, T022A-S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-G061W-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-N062E-S078D-G118S-S188D-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G100S-V104I, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098F-S103A, T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024F-S078N-G118R-S128D-L217E, T022A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-T033S-N116L-S128I-A158E-S166D, T022L-S024F-S128D, T022A-S101G-S103A-V104L, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S024F-S078N, T022A-N062E-A158E-S188D, G020K-T022L-S166D-T213A, T022A-S024G-T071A-S078N-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-L148I, S078D-G118S-S188D-Q245R-N248D-H249R, G020K-T022L-S128D-S166D, T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N062E-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-Q245R-H249R, G020R-S078G-G118D-P129E-S188D-N248D, G020K-T022L-S024F-S078N-G118R-S128D-S166D, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101Q-S103A-V104I-L126I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T255G, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L126I-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, S024R-T033S-N062E-G118R-S166D-S188D, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-H249R, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098Q-G102A, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-N116L, T022A-S101G-S103A-V104I-L126I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-S078N-S128D, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-T213A-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-T033S-N062E-N116L-S166D, T022A-S024G-N076D-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-A232V, G020K-S024F-S078N-S128D-S166D, G025A, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, G097P-S099T-V104I, T022A-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, D041K, T022A-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S101A-V104I-L111V-L148I, A016S-T022A-S101A-V104L-L111V, T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S078G-G118S-S188D-N248D, G020K-T022L-S024F-S078N-S128D, G020K-T022L-S024F-G118R-S128D-T213A, T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024F-S128D, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022A-S101Q-S103A-V104I-L126I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V-T274A, T022A-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-N062E-S078D-G118S-N248D, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-T213A-A232V, T022A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N062E-N116L, T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-T213A-A232V, T022A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-L124V-S128A-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A270V, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L126I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098F-S099T-G102A, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248D, D041L, S024R-N062E-S128I-A158E-S188D, N062E-S078D-G118D-N248D-H249R, G020K-S024F-G118R-T213A, S101G-S103G-V104I-S128N, S078N-G118R-S128D-T213A-L217E, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-G097S-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S078G-G118S-G159D-N248D, T033S-A158E, T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024R-T033S-S128I-S166D-S188D, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, S024R-G118R-S128I-S166D, T033S-N116L-G118R-S128I-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024R-T033S-N116L-G118R-V139I-S188D, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N062Q-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-T213A-A232V, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L124V-S128A-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-S166D-S188D, T022A-S024R-T033S-N116L-G118R-S128I-A158E-S166D, A108V-S128D-T213A, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-A232V, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-I107V-N116A-Y209V-T213A-A232V, T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-T033S-N116L-S128I-S166D-S188D, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L126I-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098Q-S099G-G102A, T022A-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-G118R-S166D, V011M-S024R-T033S-S128I-S166D, G020K-S078N-S128D-L217E, V004M, N062E-N116L-G118R-S128I-S166D, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-T033S-N116L-S166D-S188D, T022A-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G118R-T213A, T022A-S101N-S103A-V104I-L126I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-N116L-S188D, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245V-N248E, T022A-S024G-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-S099T-S101A-V104L, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, L021F-T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D, A098Q-S101A-S103A-V104L, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-G118R-A158E-S166D-S188D, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, N116L-S128I, T022A-N062E-S128I, T022A-S024R-T033S-N116L-S128I-A158E-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-L124V-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-N116L-A158E-S166D-S188D, T022A-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S078N-G118R-S128D-T213A-L217E, A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-A232V, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S024F-G118R-S128D-S166D-L217E, N062E-G118R-S128I-A158E-S188D, T022A-S024F-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024G-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098Q-S099T-S103G, G097P-A098Q-S099T-S103A-V104I, N062E-S078D-G118S-S188D, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T134C, G020R-N062E-S078D-G118S-P129E-N248D, S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209A-G211Q-T213A-A232V, A016S-S101G-S103A, A016S-S103G-V104I-L111V, A098F-G100S, S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L126I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S078G-G118S-N248D-H249R, T022L-S078N-A122V-S128D, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L126I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024F-S078N, A016S-S101G-V104I-L111V-S128N, A016S-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209A-A232V, G097P-S099G-G100S, A098Q-S099G-G100S-V104L, S024R-S078D-G118S-L126I-P129E-N248D-H249R, T022A-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098Q-S103A, S099A-S101A-S103A, A016S-T022A-S101G-S103G-V104I-S128N, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-S024F-G118R-S166D-T213A, T022A-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, N116L-S128I-S166D, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S160P-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-N116L-G118R-S128I-A158E-S166D-S188D, T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, R019S-T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, G020K-S024F-S078N-S166D, T022A-N076D-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V, T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-A232V, G020K-T022L-S024F-G118R-S128D-S166D-T213A, T022A-S024G-N076D-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-L126I-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-T033S-S128I-S166D-S188D, A098Q-S099A-G100S, S024R-T033S-N062E-N116L-A158E-S188D, G020R-S078D-G118D-P129E-N248D-H249R, T022A-S024R-N062E-N116L-S128I-S166D-S188D, A098F-S099A-V104I, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245T-N248E-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, S024F-G118R-S128D-S166D-A272V, S099T-G100S-S103A-V104I, T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245T-N248E, S128D-T213A-L217E, T022A-T033S-N116L-S128I-S166D-S188D, T022L-S078N-G118R-S128D-S166D-T213A, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-S240F-Q245R-N248D-E271F, S078N-G118R-S128D-L217E, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S101G-S103A-V104I-L124V-S128A-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S024F-T213A, G097P-A098Q-S103A-V104L, T022A-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G118R-S128I-A158E-S166D-S188D, T022A-N116L-S128I-A158E, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V-A272D, T022A-G118R-A158E-S166D-S188D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, H039C, T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-A232V, A016S-V104L-S128N-L148I, A098F-S101G-V104I, T022A-S024G-N076D-S101G-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022A-S101G-S103A-V104I-L126I-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S078D-G118S-P129E, A098Q-S103G-V104I, A098F-S099T-S101G-G102A, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-N062E-S101N-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S078G-G118S-Q245R-N248D, S056H, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209A-G211Q-A232V, G097P-A098Q-S101A-S103A-V104L, T022A-N076D-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L126I-S128A-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-T033S-N062E-N116L-G118R-S166D-S188D, S024R-T033S-N062E-N116L-A158E-S166D, A098Q-S099T-V104L, S099T-G102A-S103A, T022A-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078D-G118D-G159D, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S078D-G118D-H249R, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097S-S101G-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124T-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N062E-N116L-G118R-S128I-S166D-S188D, T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S099G-S103A, T022A-N062E-G097A-S101N-S103A-V104I-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-S078G-G118D-N238D-N248D, T022A-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F-T274A, G097P-A098F-V104I, S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D, T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, F050S, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-S128N, S101A-V104I-L111V, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-A232V, A098Q-S099T-G102A-S103G-V104I, T022A-T033S-G118R-S128I-S188D, S024R-N062E-S078G-G118S-Q245R, T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S024F-S128D-T213A, T022A-S101G-S103A-V104I-L126I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, G020K-T022L-S078N-S128D-A133V-T213A, T022A-S024G-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G118R-S128I-S166D, T022A-T033S-A158E-S166D, T022A-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-S078D-G118D-N248D, A098F-S099A-S103G, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, G097P-S099T-S103A-V104L, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, S024F-S128D-T213A, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, S099A-G102A-V104I, T022A-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-I107V-N116A-Y209A-G211Q-T213A-A232V, G097P-S099A-S101A, T022A-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-Q245R-N248D-H249R, S078N-G118R-S128D-T213A, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101Q-S103A-V104I-L126I-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024R-N062E-S128I-A158E-S166D, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T033S-N116L-S128I-S188D, T022L-S024F-G118R-S128D-S166D-T213A-L217E, T022A-S024G-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-L126I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-S101G-S103A-L148I, S024R-S078G-G118D-N248D-H249R, T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, P055R, T022A-S024G-G025S-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-L124T-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S078G-G118D-G159D-Q245R, A016S-T022A-S101A-S103A-V104I-L111V, A016S-T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-N248D, A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-A133V-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S128D, T022A-T033S-N116L-G118R-S128I-A158E-S188D, T022L-G118R-S128D-T213A-L217E, T022A-N043R-N076D-S078P-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098F-S101A, Q002F, G097P-A098Q-S099A, S024R-T033S-N062E-S166D-S188D, G020K-S078N-S128D-T213A, T022A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-L126I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-N238S, G097P-S099T-S103G-V104I, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, D181C, G020K-G118R-S128D, T022A-S101G-S103A-V104I-L126I-S128A-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124T-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L126I-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S078N-S128D-T213A-L217E-A272D, S099T-G102A-V104I, S128I-S166D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, G020R-S078D-G118S-Q245R-H249R, G097P-S099T-G100S, G097P-S099G, G020K-S024F-S078N-S128D-S166D-T213A, A098Q-S101A-G102A-S103A, S024R-N116L-G118R-S128I, T022A-S101G-S103G-V104I-S128N, T022A-S024G-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-S153A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F, S024R-N062E-S078G-G118D-S188D-Q245R-H249R, T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S024F, G020K-T022L-S078N-S128D-T213A, S078G-G118D-P129E-S188D, T022A-N076D-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-S103G-V104L-S128N-L135I, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209V-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-S103G-V104I-S128N-L148I, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, G025S, G020R-S078D-G118D-G159D-S188D-N248D-H249R, T033S-N116L-S188D, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, G097P-A098Q-S103A-V104I, T022A-N062E-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-N116L-S128I-A158E, A016S-T022A-S103G-V104L, T022A-T033S-N116L-S128I, T022L-S024F-N043H-G118R-S128D-S166D, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103G-V104L, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, S099A-G100S-V104I, G097P-A098Q-S099G-S101A, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-H249R, A016S-S103G-V104I-S128N, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G118R-S128D-L217E, S132H, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-S078D-G118D-S188D, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A215V-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, S024F-S078N-G118R, T022A-S101G-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S101A-V104I, T022A-S166D-S188D, S078N-G118R-S128D-S166D-T213A, T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-G159D-S188D-N248D, G097P-S099T-S101A-S103G-V104I, T022A-S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S101A-S103G-V104L-S128N, G020R-N062E-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-H249R, G020R-S078G-G118D, G020R-S078G-G118S, Q012Y-N018G, T022A-S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-N062E-G118R-A158E-S166D, T022A-N076D-A088V-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-N062E-N116L-S128I-S166D-S188D, T022A-T033S-N116L-A158E, T022A-S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T033S-N062E-N116L-A158E, S024R-S078G-G118D-H249R, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101Q-S103A-V104I-L126I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S078D-G118D-Q245R-H249R, G097P-S099G-V104L, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S101G-V104I-S128N-L148I, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-A158E-S188D, T022A-N076D-S078N-S099R-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S103G-V104I-L148I, S024R-T033S-N116L-A158E-S166D-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-G118V-Y209A-T213A-A232V, G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-S188D-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S024F-S078N-G118R-S128D-S166D-T213A, T022A-S024R-T033S-N116L-S128I-S166D-S188D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-S128L-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-T033S-S128I-S166D, T022A-S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024R-G118R, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129S-V149I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098Q-S101G-G102A-S103A-V104I, S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D, G020K-S078N-S128D-S166D-T213A, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098Q-S099T-S103A, G020K-T022L-S024F-S128D-L217E, A098Q-G100S, A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-A232V, A016S-S101A-L148I, A016S-S101G-V104I, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, V030I-S099T-G100S, S078D-G118S-P129E-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-S128N-Y209V-A232V, T022A-S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S078D-G118S-P129E-S188D-N248D, T022A-S024R-N062E-G118R-S128I-A158E-S166D-S188D, T022A-T033S-N062E-G118R-S128I, T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-S101A-S103N-V104I-G118S-P129E-Q245R, S078D-G118D-P129E-Q245R-H249R, G020R-S078D-G118D-S188D-Q245R-H249R, T022A-S024G-N076D-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-S078D-G118D, N062E-S078D-G118S-N248D, T022A-S024R-T033S-N062E-G118R-S128I-S166D, T022A-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S056R, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, G097P-A098Q-S099T-V104M, T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-L126I-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098Q-S099T, S128D-T213A, T022A-V068A-S101G-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S024F-G118R-T213A, S099G-S101G-G102A-S103A-V104I, S099A-G100S-S101A, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, V104I-L111V-S128N-L148I, S024R-S078G-G118D-P129E-S188D-N248D, A016S-S101G-S103G-V104I-S128N, G102A-S103A, S024F-S078N-S128D-T213A, N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D, A232N, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-N248D-H249R, A016S-S101A-S103A-V104I-L111V, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098Q-S099G-G100S, S101A-V104L-S128N, T022A-S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S099A-G102A, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-T213A-A232V, A098Q-S099T-G100S, T033S-N062E-N116L-G118R-S128I-S188D, T022A-N062E-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-T033S-N062E-S128I-S166D, A098Q-S099T-S103A, T022A-S103G-L148I, G097P-S101A-G102A-V104I, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V-R275S, N062E-N116L-S128I, G025P, G097P-S099T-G102A, A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-T213A-A232V, S132V, T033S-S128I-A158E, S099T-S101A-G102A-V104L, T022A-S101A-V104L-L111V-S128N, T022L-S078N-G118R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, S024R-N116L-S128I-A158E-S166D-S188D, T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V, T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-S128I, G097P-S099T-S103A, T022L-S024F-S078N-G118R-S128D-S166D-T213A-L217E, S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D, N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-N248D-H249R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, S078G-G118S-S188D, F050R, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-T213A-L217S-A232V, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024F-G118R-S128D-S166D-T213A, G097P-S099A-S101G, G097P-S099A-G100S-V104I, G047I, S099T-G100S, G020K-T022L-S078N-G118R-S128D-S166D-T213A, T033S-N062E-N116L-H120N, S078D-G118D-S188D-Q245R-N248D, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A215V-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124T-S128A-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124T-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D-N248D, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101A-V104I-L111V-S128N, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D, A016S-V104I-S128N, S099A-S101G-V104I, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124T-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098M, G097P-A098Q-G102A, T022A-S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S101N-S103A-V104I-L124T-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-S101A-V104I-L111V-S128N, G020R-S024R-S078G-G118S-N248D, A016S-S101G-S103A-V104I-L111V-S128N, T022L-S078N-G118R-S128D-S166D, A098Q, S024F-G118R, N062E-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D, W113Y, G020R-S078G-G118S-N248D, G020K-T022L-S024F-S128D-S166D-T213A, G020R-S078D-G118D-N248D, S078D-G118D-Q245R-N248D, T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-T213A-A232V, V051M, I035T, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-L126I-S128A-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-N248D, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-G211Q-A232V, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L124T-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-G102A, N062E-S078D-G118S-S188D-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S101A-V104I-L148I, A016S-T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-G211Q-A232V, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-Q236R-Q245R-N248D, T022L-S024F-S078N-S128D-S166D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, V051C, A048T-N062E-G118R-A158E-S188D, T022A-T033S-N116L-G118R-S128I-S166D-S188D, T022A-S101G-V104L-L111V-S128N, S056V, G020K-T022L-S078N-S128D, G020K-T022L-S024F-S078N-S128D-S166D, T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-A232V, G097P-A098Q-S099T-S101A, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N, T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-T033S-N062E-N116L-G118R-S128I-A158E-S188D, S024R-T033S-N116L-G118R-S128I-A158E-S166D-S188D, G097P-A098F-S099T-S101A-S103A-V104I, A098Q-G102A-S103A-V104I, T033S-S128I-S188D, T033S-S128I, T022A-S024G-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, W006N, A098Q-S099A-S101A-V104I, T033S-N062E-G118R-S128I, G097S-A098Q-G100S, T022L-S078N-S128D-L217E, T022A-S024R-T033S-N116L-S128I-S188D, G020K-T022L-G118R-S128D-S166D-T213A-L217E, T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098F-V104L, A016S-S101G-V104I-S128N, A016S-T022A-V104L-L148I, T022A-S101A-L111V, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, A016S-T022A-S101A-S103A-V104I, A098Q-S099T-S101G-G102A, T022A-N062E-S101Q-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098Q-G100S-S101A-V104I, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, G097P-A098Q-S099A-S101A-S103A-V104I, T022L-S024F-S128D-S166D, T022A-S099R-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024F-S128D-S166D-T213A, G020K-T022L-S078N-S128D-S166D-T213A, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248E, G097P-S099G-G102A, A016S-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, A098Q-S099T-G102A, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-S188D-N248D, N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, A016S-T022A-S101A-S103G-V104I-L148I, G097P-A098F-S099T-S103A-V104I, G020K-T022L-S024F-S078N-S128D-S166D-T213A, G020K-T213A, S024R-T033S-N062E-A158E-S166D, G020K-T022L-S078N-G118R-T213A, S024F-G118R-S128D-S166D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, S078N-S128D-S166D-T213A, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128L-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F, S078D-G118S-P129E-G159D-N248D, G097P-G100S, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-N269S-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-L124T-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S024F-S078N-S128D-S166D-T213A, G097P-A098S-S099G-G102A, G020R-N062E-S078D-G118S-G159D-S188D-N248D, S078D-G118D-G159D-S188D, T033S-S128I-S166D, A016S-T022A-S101G-S103G-V104I-L148I, D041N, A098Q-S099T-G100S-S101A-A151V, A098Q-S099A-G100S-S101A, T022A-S128I-A158E-S166D-S188D, G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-N248D, A098Q-S099T-S101A-G102A, S024R-T033S-N062E-N116L-S128I-A158E, T022A-S024G-N076D-S101G-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024R-T033S-N062E-S128I-S188D, N062E-S078D-G118D-P129E-Q245R-N248D, S078D-G118D-G159D-Q245R-N248D, S024R-N062E-N116L-S128I-A158E-S188D, A098F-S099G, A098F-G100S-V104I, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-S128L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-T022L-S024F-S078N, A098F-S099T-G100S-V104L, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-M222S-A232V-Q245R, T022A-S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T274F, G118R-S128I-V139I-A158E-S166D-S188D, T022A-T033S-N062E-G118R-S166D-S188D, S024R-S078D-G118S-P129E-N248D, T022A-T033S-N116L-S128I-A158E, T022A-N062Q-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, N062E-N116L-S166D-S188D, T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, S099A-G100S-S103A-V104I, G020K-S024F-S078N, T022L-S024F-G118R-S128D-S166D-L217E, T022A-S101A-V104L, T022A-S101G-S103A-V104I-L126I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209V-G211Q-A232V, A133T-N269E, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-Q245R-H249R, T022A-S024R-T033S-N062E-S128I-A158E, T022A-T033S-N062E-S128I, R275S, S024R-S078D-G118D-P129E-S188D-N248D-H249R, T022A-T033S-G118R-S128I, T033S-N116L-G118R-S128I, T022L-S024F-S078N-G118R-T213A, L075G, S099T-G100S-V104I, T033S-N062E-N116L-S128I, A016S-T022A-S103A-V104I-L148I, G097P-G102A-S103A, G097P-S099T-G100S-S101A-S103A-V104I, T253Y, T022A-N062E-N116L-G118R-S128I-S166D, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, G097P-G102A-V104I, S078N-G118R-S128D-S166D-L217E, T022A-S024R-N076D-I079T-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022A-S101A-V104L-S128N, G097P-A098Q-S099T-G102A-V104I, T022A-G047V-S103A-L148I, T022A-N116L-S128I-S188D, G097P-A098Q-S099T-S103A-V104L, N116L-S128I-A158E-S188D, T022A-S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S101A-S103G-S128N-L148I, G097P-A098Q-S099T-S101A-V104I, L257N, G097P-S099T-S101G-S103A-V104L, A098Q-S099G-G100S-V104I, S056L, S099T-S101A-G102A-S103A-V104I, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103G-V104I, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-G211Q-T213A-A232V, S078N-S128D, R170T, A098F-S099G-G100S, G020K-T022L-S024F-S078N-T213A, S099T-S101A-S103A, G020R-S078G-G118S-G159D-Q245R-H249R, G097P-S099G-S101G, S078D-G118S-Q245R, T033S-N062E-N116L-S188D, G097P-S099G-S101A, G020R-N062E-S078D-G118D-S188D-Q245R-H249R, S087W, A098Q-S099T-S101G-G102A-V104L, A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V, G020K-T022L-S024F-S128D-T213A-L217E, T022A-S103A-V104I, G097P-A098Q-G100S, G020K-T022L-N062E-S078D-G118D-P129E-Q245R-H249R, G020K-S024F-S078N-T213A, A098F-S099A-S103A, S099T-G100S-S101G, N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-M222S-A232V-Q245R, S049W, G020K-T022L-S024F-S128D-S166D-L217E, S024F-G118R-S128D-S166D-L217E, T022A-S103A-V104I-L148I, T022A-S101A-S103A-V104I, F050Q, S101G-S103A-V104I-N116A-G118V-Y209V-G211Q-A232V, S078G-G118D-H120N-H249R, A016S-S103G-L148I, G097P-S101A, S099T-S103A-V104I, S078G-G118D-P129E-G159D, T022L-S128D-S166D-T213A, T022A-S024R-N116L-S128I, N076D-S101A-S103A-V104I-M222S-A232V-Q245R, G097P-S099T-S101A-V104I, A098Q-S099A-S101A-G102A, T022A-S024R-G025S-Q059K-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S132G, T022A-S101A-S103A-V104L-S128N, A098F-G100S-S101A, S024F-G118R-T213A, G097P-S099T-G102A-S103A, G097P-S099T-G102A-S103A-V104I, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209V-G211Q-T213A-A232V, S024R-T033S-N116L, A098Q-S099T, A016S-T022A-S101G-S103A-V104L-S128N-L148I, A098F-S099T-S101A, A098Q-G100S-S103A, T022A-N062E-N116L-S128I-S188D, Q012E-S259N, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209A-G211Q-T213A-A232V, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, T022A-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S101G-S103G-V104L-S128N, Q245D, G020K-T022L-S128D-S166D-T213A, S099T-V104I, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V, G020R-S078D-G118D-Q245R-N248D, S099G-S101A-V104L, G097P-S099T, S078G-G118D-Q245R, G097P-A098Q-S099A-S103A, A016S-T022A-S103A, G097P-A098Q-S101A-S103G-V104L, S078N-G118R-S128D-S166D, V026Q, G097P-A098F-S099T-S103A-V104L, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, S024R-T033S-G118R-S128I-S166D-S188D, G020K-T022L-S078N-G118R-S128D-S166D, A098F-S099T-G102A-S103G, M119L, N062E-S078G-G118D-P129E-S188D, T022L-G118R-S128D-S166D, T022A-T033S-N116L-S128I-S188D, A098F-S099T-S101G-V104L, T033S-N116L, V104L-L111V-S128N, S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-Q245R-H249R, G097P-S099A-G100S, A016S-T022A-S103A-L111V, G097P-S099A-G102A-V104I, G097P-A098Q-S099A-S103A-V104I, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124T-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S024F-S078N-S128D-T213A-L217E, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V, P055V, T022A-N062E-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098Q, S101G-S103A-V104I-L111V-S128N, A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-A232V, G020R-S078D-G118D, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124T-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T033S-G118R-S128I-S166D-S188D, N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-H249R, V051Y, G097P-G102A-S103A-V104I, V030N, S024R-T033S-G118R-S128I-A158E-S166D, N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245V-N248E-E271T, S024R-T033S-G118R-S128I-S166D, A016S-S101G-S103G-V104L, S078N-S128D-L217E, A016S-T022A-S101A-V104I-L111V, A016M, S099T-G102A-S103A-V104I, T022A-S101A-V104I-L111V-S128N, T022A-S024R-N043R-N076D-S078P-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S078N-S128D, V051E, N062E-S078D-G118S-P129E-G159D, T022A-S101N-S103A-V104I-L124T-P129S-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A015H, G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-H249R, G020K-S024F-G118R-S128D-S166D-T213A-L217E, A016S-T022A-S101G-S103G-V104I, P014N, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124T-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098Q-S101A-G102A, T033S-A158E-S166D-S188D, I035C, T033S-S128I-A158E-S188D, I008S, S078N-T213A, V028T-A215V, G020K-T022L-S078N-S128D-S166D-T213A-L217E, G146C-Q236L, S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-T213A-A232V, S024R-S078D-G118D-G159D-K237E, S024R-T033S-N116L-S128I, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, A048G, S212D, N062E-N116L-A158E-S188D, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209A-T213A-A232V, S024F-S078N-G118R-S128D-S166D-T213A-L217E, A098F-S101G, S132K, T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-G118V-Y209V-T213A-A232V, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-G211Q-A232V, G097P-A098Q-S099T-S101A-G102A-V104I, G097P-S099T-S101A-S103A, A016S-T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V, A098Q-S099T-S101G-V104I, G020K-T022L-S024F-G118R-S128D-S166D-T213A-L217E, G097P-A098Q-S099G-S101G, G097P-A098Q-S099A-G100S, T033S-N062E-G118R-S166D-S188D, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209V-T213A-A232V, N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-H249R, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-T213A-A232V, G097P-S099G-S101G-S103A, A098F-G102A-V104I, S078D-G118S-Q245R-N248D, G097P-A098Q-S099A-G102A, G097P-A098Q-G100S-S103A, T022A-S024R-N062E-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S078G-G118D-Q245R-H249R, G097P-S099A-G100S-S101A, G097P-S099G-S103G, G020K-S024F-S128D-S166D-T213A-L217E, I008N, N269A, A088T, T038S, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-G118V-Y209A-T213A-A232V, G097P-A098F-S103A-V104I, A098F-S099A, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V, A098Q-S099T-G100S-V104L, G097P-S099T-V104L, A098Q-S099T-S103A-V104I, A016S-T022A-S103G-S128N, T022A-T033S-S166D-S188D, G097P-G100S-S103A, T022L-S024F-S078N-T213A-A232T, A013S, G097P-S101A-G102A-S103A, A016S-T022A-S101A-V104L-L111V-S128N, G097P-A098Q-S099T-G102A, S024R-S078G-G118D-N248D, G020K-S078N-S128D-S166D-T213A-L217E, G020R-S078G-G118D-N248D, A085S, A016S-T022A-S128N, S024F-S078N-G118R-S128D-S166D-L217E, A098Q-S099A-G100S-V104L, S024R-S078D-G118D-G159D-N248D, A098Q-S103A, N062E-A158E-S166D, G020K-S024F-G118R-S128D-S166D-L217E, G097P-A098F, G080F, G097P-S099A-S103A-V104I, T022A-S101A-L111V-S128N-L148I, A016S-S101G-S103A-V104I, T022A-N062Q-S101Q-S103A-V104I-L124V-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-A098F-S099T-S101G-V104I, A073Q, K251C, A016S-T022A-S101A-S103A-V104L-L148I, G097P-A098Q-G102A-S103G, G020R-S078G-G118D-Q245R-N248D, S099A-G100S-S103A, T038A, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V, T022L-S078N-S128D-T213A-L217E, T022A-S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N116L-S128I-A158E-S166D, A016S-T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-P210Q-T213A-A232V, S049V-V199I, T022A-S103G-V104I-L148I, A016S-S101G-V104L, A098F-S099T-S101G-G102A-V104I, T022A-A158E-S166D-S188D, A016S-T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-G211Q-A232V, T022A-S024G-N076D-G097A-S101G-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-T213A-A232V, N062E-N116L-G118R-S128I-A158E-S188D, N062E-S128I-S188D, G097P, T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, S024R-S078G-G118S-P129E-Q245R-H249R, S049D, G097P-A098Q-S099T-G100S, T022A-S024R-T033S-N116L-G118R-S128I-S188D, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-T213A-A232V, T022L-S078N-G118R-S128D-S166D-L217E, S078G-G118D-P129E-N248D, S099A-V104L, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098Q-V104L, T022A-T033S-G118R-S128I-S166D-S188D, G097P-S099T-S101A, W006Y, S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-H249R, S024R-S078D-G118D-Q245R-N248D, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101N-S103A-V104I-L124V-L126I-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, B015T, G097P-S099T-S101G-G102A-S103A-V104I, A016S-V104L-L111V-S128N, G097P-A098F-S099T, S049I, A016S-S103G-V104L-L148I, N062E-S078G-G118D-S188D-N248D, G020R-N062E-S078D-G118S-G159D-S188D-K235R-N248D, T022A-S024R-N116L, S024R-T033S-S128I, N062E-S078D-G118D-Q245R-N248D-H249R, A098F-S099A-S103A-V104I, V004Y, T022L-S024F-S078N-T213A, A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209A-G211Q-A232V, G097P-A098Q-G102A-S103G-V104I, S078G-G118S-H249R, S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209V-A232V, G097P-V104I, S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-Y209A-T213A-A232V, A098Q-S099G-V104L, N062E-S078D-G118D-P129E, L196K, S078G-G118D-N248D-H249R, S087M, T022A-S101G-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F, S216N-T253C, G097P-A098Q-S101G-G102A-V104I, G020K-T022L-G118R, A016S-T022A-S101A-S103G-V104I-L111V, A098F-S099A-G102A, T033S-N062E-G118R-S128I-A158E, A098Q-S099T-S101A, G020R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D, V011L, A098F-S099A-S101A, F050K, N062E-S078G-G118S-G159D-S188D-N248D, V051A, T022A-T033S-G118R-S128I-A158E-S166D, V051A-S212D, P014W, Q012E, T022A-T033S-S128I-A158E-S188D, T022A-S024R-N062E-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-S103A, S078G-G118D, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-S188D-Q245R-H249R, G097P-A098Q-G102A-V104L, T022A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A098Q-S099T-S101A-G102A-S103A-V104I, A016S-L111V-S128N, T022A-N062E-N116L-S128I-A158E, G080C, S024R-S078D-G118S, G097P-A098F-S099G, A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-T213A-A232V, G097P-S099G-G100S-S103A, S212A, S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R, T022A-S103G-V104L-S128N-L148I, T022A-S101N-S103A-V104I-L124T-S128A-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-T022A-S103G-V104L-S128N-L148I, G097P-A098Q-S101A-V104I, A016S-S101A-V104I, V026D, G097P-S101A-G102A-S103A-V104I, A016S-T022A-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-T213A-A232V, T033S-A158E-S188D-A272D, A048V, G020K-T022L-S078N, G020K-G118R-T213A, T022A-S103A-V104L-L148I, T022A-N062E-S128I-A158E-S166D, G097P-A098Q-S099G-G100S-V104I, S049V, G097P-A098Q-S099T-S101A-S103G, G097P-A098F-S099A-S101A-V104I, S128I-A158E-S166D-S188D, S128D-S166D, S099G-G102A-V104I, T022A-S166D, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V, T022A-T033S-S101G-S103A-V104I-G118R-S128L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G097P-S099A-S103G, A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-G211Q-T213A-A232V, S078G-G118S, T033S-G118R-S128I-A158E-S166D-S188D, S024R-N062E-S101A-S103A-V104I-S188D-M222S-A232V-Q245R, S099T-S101A-G102A-S103A-V104L, S056F, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L124V-L126I-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-S024F-S128D-L217E, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-L126I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020R-S078G-G118S-H249R, P129E-G159D-N248D, G020R-N248D, G061E-G097A-S128A-P129E-G159K-L217Q, Q245R-N248D-H249R, P129E-G159D-S188D, S024G-N076D-S078N-S101N-S128A-L217Q-N218S, G020R-S024R-Q245R, N062E-P129E-G159D-N248D, S024G-S078N-G097A-S101N-Q109N-L217Q, G020K-G102A-S128L, G020K-S078N-S101D-S128Q, S024G-S078N-G097A-S101N-S128A, G020K-S024G-N062E-S101Q-Q109G-N116L-S188D, G020K-S078N-S101D-S240R, G020K-N043R-S128L-L217E-S240R, S078N-S101G-Q109N-L217Q, S024G-G097S-S101N-S128A-S188D, S078N-L217E-E271L, G097S-S101Q-Q109N-L217Q, G020K-N062E-N116L-M222S, G020K-N062E-S078N-N116L-S128Q-T213A, G020K-S024G-N062E-S101Q-Q109G-N116L-S188D-L217Q, S024G-S078N-G097A-S101Q-S128A-L217Q, S078N-S101D-S128L-E271L, G020K-N062E-S101N-N116L, G020K-N062E-S101Q-Q109N-N116L-M222S, G020K-N062E-S101Q-Q109G-N116L-M222S, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101G-Q109G-N116L-L217Q-M222S, G020K-S024G-N062E-S078N-S101N-N116L-S128A-M222S, G020K-N062E-S078N-S101N-Q109N-N116L-S188D-M222S, G020K-S024G-N062E-S101N-Q109N-N116L-S188D-M222S, G020K-S024G-N062E-G097S-S101Q-N116L-L217Q, G020K-N062E-G097S-S101N-Q109G-N116L-S128A-S188D, S078N-G097A-S101Q-Q109G-S128A, S024G-G097A-S101N, S024G-G097A-S101Q-Q109N-S128A-S188D, G097A-S101N-S128A-S188D, S024G-G097S-S101G-S128A-L217Q, S078N-G097A-S101G-Q109N-S128A-L217Q, S024G-G097S-S101Q-Q109N-S128A, G097A-S101N-Q109G-S128A, S024G-G097A-S101Q-Q109G-L217Q, S024G-S078N-A085G-G097A-S101N-S128A-S188D-M222S, S024G-S078N-G097S-S101Q-L217Q, S024G-S101D-S128Q-L217E, S078N-G097A-S101N-M222S, S024G-N076K-S078N-G097A-S101G-S128A-S188D-M222S, S024G-S101G-S128A-M222S, S024G-S078N-G097A-S101G-S188D, G102A-L217E-N218D, S078N-G100S-S101D, G020K-N043R-N062E-S078N-S128L-L217E, G020K-N043R-S101D-S128L, G020K-G100S-S101D-S128L-S240R, S078N-S128Q-L217E, G020K-S078N-L217E-E271L, N062E-S078N-L217E, N062E-L217E, G020K-S078N-S101D-S128Q-L217E, G020K-S078N-S101D-S128L-S240R, G020K-N123G, G020K-S128Q-T213A-M222S, S078N-L217E, G020K-N062E-S128I-L217N, G020K-N062E-S078N-S128Q-L217N, G097S-S101N-Q109G-S128A-S188D-M222S, G020K-S024G-N062E-S101Q-Q109N-N116L-S188D, G020K-N062E-S078N-N116L-S128I-L217N, S024G-S078N-G097A-S101N-Q109G-S188D, S024G-G097A-S101Q-Q109N-L217Q, G020K-S101D-S128L, S101N-Q109G-S128A, S078N-S101D-L217E, S024G-S078N-S101N-S128A-M222S, G020K-S024G-N062E-G097A-S101Q-N116L-S128A-S188D, S024G-S078N-G097A-S101N-Q109N-S128A-M222S, G020K-N062E-S078N-G097A-S101N-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101Q-N116L-S188D, G020K-N062E-S078N-G097S-S101G-N116L-M222S, G020K-S024G-N062E-S078N-S101N-N116L-M222S, G020K-S024G-N062E-G097S-S101Q-N116L, G020K-S024G-N062E-S101Q-Q109G-N116L-S128A-S188D, G020K-S024G-N062E-G097S-S101N-Q109N-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-N062E-S078N-G097S-S101N-N116L, S024G-S078N-S101G-Q109G-M222S, S078N-G097A-S101G-Q109G-S128A, S078N-G097S-S101N-Q109N-S128A, S078N-G097A-S101N-Q109N-S188D, S024G-S101N-S128A-S188D-M222S, S101Q-Q109N-S188D-M222S, S101D-G102A-L217E, G020K-N062E-S078N-S101D-L217E, G020K-S078N-S101D-I107T-S128L-S240R, G020K-S078N-G100S-L217E-N218D, G020K-N043R-S101D, N043R-G100S-S128L-L217E, G020K-S078N-S101D-S128L-L217E-E271L, G020K-S101D-S128L-E271L, G020K-S101D-N116L-S128L-T213A, G020K-N062E-S078N-T213A-L217N, G020K-N062E-N116L-L217N, G020K-N062E-S128I-T213A, N062E-S101D-S128L-S240R, G097S-S101N-S128A, G020K-N062E-S078N-N116L-T213A-L217N, G020K-S101D-M222S, S024G-S101G-Q109G, G097A-S101Q-Q109G, G097S-S101Q-Q109N-S188D, G020K-N062E-G097S-S101N-N116L-S128A-S188D-L217Q, S078N-S101Q-S128A-M222S, S078N-G097A-S101Q-Q109N, S024G-S078N-G097A-S101Q-S128A-S188D, S078N-S101D-G102A, G020K-N062E-S078N-G097S-S101Q-Q109G-N116L-S128A-S188D-M222S, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101N-Q109N-N116L-S188D-L217Q-M222S, G020K-N062E-G097S-S101Q-N116L-S128A, G020K-S024G-N062E-G097S-S101Q-N116L-S128A-S188D-L217Q, S024G-S101N-Q109N-S128A, S024G-G097S-S101Q-S128A-S188D, S024G-S101Q-L217Q, G097S-S101G-S128A, S024G-S078N-S101Q-S128A-L217Q, S024G-S078N-G097S-S101N-S188D, S024G-G097A-S101N-S128A-M222S, G097A-S101Q-Q109N-S188D-M222S, S024G-S078N-G097S-S101Q, G020K-S101D-S128L-S212P-L217E-S240R, G020K-S101D-S128L-L217E-N218S-S240R, S101D-S128Q, G020K-N062E-S078N-E271L, S101D-E271L, S101D-S240R-E271L, G020K-S101D-E271L, G020K-N116L-S128L-T213A-M222S, G020K-N116L-S128Q-M222S, G020K-N062E-V084A-S128Q-M222S, G020K-N062E-S078N-N116L, S078N-S101N-Q109G-S128A-M222S, S024G-G097S-S101Q-Q109G, G020K-N062E-T213A-L217N, G097S-S101G-S128A-S188D, G020K-S240R, N062E-S078N, G020K-S128Q-M222S, S078N-G097S-S101G-Q109G, G020R-S024G-N043R-S078N-S101Q, G097S-S101N-Q109G-S128A-M222S, S024G-G097S-S101G-Q109N, S024G-S078N-G097A-S101G-Q109N, G020K-N062E-S078N-S101N-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-N062E-S101Q-Q109G-N116L-S128A-M222S, G020K-S024G-N062E-S101Q-Q109N-N116L, S024G-S078N-S101Q-M222S, S024G-G097A-S101Q-Q109G-S128A, S101Q-Q109N-L217Q, S101Q-Q109G-S188D-L217Q, S024G-G097A-S101N-S188D-M222S, S024G-S078N-G097A-S101Q-Q109N, G097A-S101Q-S128A, G097A-S101Q-Q109G-S128A, S024G-G097S-S101Q-M222S, S078N-S101D-L217E-S240R, G020K-G100S-S128L, G020K-N043R-S078N-S128L-S240R, G020K-N043R-S101D-S240R, G020K-N043R-S078N-S128L, N062E-S128L, G020K-S078N-S101D-S128L, S078N-S101D, G020K-S101D-N116L-T213A-M222S, G020K-T213A-M222S, G020K-N116L-T213A, G020K-N116L, G020K-N062E-S128Q-L217N, S078N-G097S-S101G-Q109N-S128A, S078N-S101Q-Q109G, N062E-S078N-S128L, G020K-N062E-N116L-S128Q-T213A-L217N, G020K-N116L-T213A-M222S, G020K-S024G-N062E-S101Q-Q109H-N116L-M222S, G020K-N116L-S128Q-T213A-M222S, S024G-G097S-S101N, G020K-P055T-N062E-N116L-L217N, S024G-S101Q-S128A-S188D-M222S, G020K-M222S, G020K-N062E-S078N-G097A-S101N-N116L-S188D-L217Q, G097S-S101G-Q109N-M222S, G020K-S024G-N062E-S078N-G097A-S101N-N116L-S128A-L217Q-M222S, G020K-S024G-N062E-G097S-S101N-Q109N-N116L-S128A-S188D-L217Q-M222S, G020K-N062E-S078N-S101Q-N116L-S128A, S024G-S078N-S101N-Q109G-S188D-L217Q-M222S, S101N-Q109N-S128A-M222S, S101Q-Q109G-S128A-S188D, G097A-S101G-S188D-M222S, S078N-G097S-S101N-Q109G-S128A-S188D-L217Q-M222S, S024G-G097A-S101Q-M222S, S024G-G097S-S101N-Q109N-S128A-M222S, S024G-S078N-G097S-S101N-M222S, G020K-G102A-S240R, S078N-S128Q-E271L, G020K-N062E-S078N-S128Q, G020K-N062E-S078N-T213A-M222S, G020K-N062E-S078N-S128I-T213A-L217N, S078N-G097A-S101N, G020K-N062E-N116L-S128I-T213A-L217N, S024G-G097A-S101Q-S128A-S188D-M222S, S024G-S078N-G097A-S101N, S024G-S078N-G097S-S101G-M222S, G020K-N062E-S078N-N116L-S128Q-T213A-M222S, G020K-N062E-S128Q-M222S, G020K-N062E-S101Q-N116L, G020K-N062E-S101Q-Q109G-N116L-S188D-L217Q, G020K-S024G-N062E-G097A-S101N-N116L-S128A-S188D, G020K-S024G-N062E-S078N-S101Q-Q109G-N116L-S188D-M222S, S078N-G097S-S101N-Q109G-S128A-L217Q-M222S, S024G-S078N-S101N-Q109G-S128A-L217Q-M222S, G097A-S101Q-S128A-S188D, S024G-S078N-G097A-S101N-Q109N-S128A-S188D-L217Q-M222S, S024G-S078N-G097A-S101G-L217E-M222S, S078N-G097S-S101Q-Q109G-T274I, G097A-S101G-M222S, S101N-Q109N, G020K-L217E-S240R-E271L, S128Q-S240R-E271L, G020K-S101D-N116L-S128Q-M222S, G020K-P055L-N062E-N116L-S128I, G020K-N062E-S101G-N116L-S128A-M222S, G020K-S078N-S101D-S128L-S240R-E271L, G020K-N062E-S078N-G097S-S101Q-Q109N-N116L-L217Q-M222S, S078N-S101D-S240R-E271L, S024G-S078N-S101N-Q109G-L217Q-M222S, G097A-S101G-Q109G-L217Q-M222S, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101N-N116L-S128A-L217Q-M222S, G020K-S078N-S128L-E271L, G020K-N062E-S078N-N116L-L217N, G097A-S101G-Q109G-S188D-L217Q-M222S, S024G-S078N-G097S-S101N-Q109G-S128A, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101N-N116L-S188D-M222S, G020K-S024G-N062E-G097S-S101Q-N116L-S128A-M222S, G020K-N062E-S078N-G097A-S101G-Q109G-N116L-S128A-S188D-L217Q, G020K-N062E-S101G-N116L-S128A-L217Q-M222S, S024G-G097A-S101Q-S188D-M222S, S024G-S101G, I072V-S101Q-S128A, S078N-G097S-S101N-Q109N, S024G-G097A-S101N-Q109N-S188D-L217Q-M222S, S078N-S101Q-Q109N-S188D-L217Q-M222S, G020K-N043R-N062E-S128L-L217E, N043R-G102A-S128L-S240R, G020K-N116L-N123G-T213A-M222S, G020K-S101D-S128Q-T213A-M222S, S024G-G097A-S101Q-Q109G, G020K-S078N, G020K-N062E-S101Q-N116L-S188D, G020K-N062E-S078N-G097S-S101N-Q109G-N116L-S188D-L217Q-M222S, G020K-S024G-N062E-G097S-S101G-N116L-S128A-L217Q-M222S, G020K-N062E-G097A-S101N-N116L-S128A-L217Q-M222S, S078N-G097S-S101G-Q109N-M222S, S024G-G097A-S101Q-Q109N, S024G-G097S-S101N-Q109N-S128A-S188D-L217Q-M222S, S078N-S101N-Q109N-S188D-L217Q-M222S, S078N-S101D-S128L-L217E-S240R, G020K-N062E-S101D-N116L-S128L, G097S-S101N-S188D-M222S, G020K-S078N-S128L-S240R-E271L, G020K-N062E-N116L-S128I-T213A, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101Q-N116L-S188D-M222S, G020K-N062E-S101Q-Q109G-N116L-L217Q-M222S, G020K-S024G-N062E-G097A-S101Q-N116L-L217Q-M222S, G020K-N062E-S078N-G097S-S101Q-N116L-S128A-S188D-M222S-A232T, G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101Q-Q109N-N116L-S128A-L217Q-M222S, G020K-N062E-G097A-S101Q-N116L-S188D-M222S, S024G-S078N-G097S-S101N-Q109G-S128A-L217Q-M222S, S024G-G097A-S101Q-Q109N-S128A-S188D-L217Q-M222S, G020K-N043R, G020K-N043R-S078N-G102A-S128L, G097R-S101D, G020K-N062E-S078N-I107V-N123G-S128I, G020K-N062E-S078N-N116L-N123G-T213A, G020K-N062E-N116L-S128I-M222S, G020K-N043R-S240R, S078N-S101D-S128L, G020K-S078N-S128Q-E271L, S078N-S101G-S128A-S188D-L217Q-M222S, S078N-G097S-S101G-Q109N-S128A-L217Q-M222S или G020K-N062E-N116L-S128Q-T213A-M222S (Перечень 16), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляют собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-N204S-G211Q, T022W-S024R-S101A-P210I-T213A, G020R-S101A-G211Q, G020R-S024R-S101A-P210I-G211Q-T213A, G020R-S101A-P210I-T213A, T022W-S024R-N043R-S101A-P210I, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q, T022R-S101T-S103N-V104L-A232M-Q245R, G020R-T022A-S024R-R045T-S101A-T213A, T022R-S101G-S103N-V104I-A232M-Q245R, G020R-T022W-S024R-S101A-N116L-G211Q-T213A, G020R-T022W-N043R-S101A-N116L-G211Q, G020R-T022W-N043R-R045T-S101A, T022W-N043R-R045T-S101A-P210I-T213A, G020R-S024R-R045T-S101A-Q109R-P210I-G211Q-T213A, S024R-N043K-S101A-N204D-P210I, G020R-S024R-R045T-S101A-P210I, S024R-N043R-R045T-S101A-P210I-T213A, G020R-S024R-R045T-S101A-T213A, T022R-S101A-S103N-V104I-A232T-Q245R, G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-N204S-P210I-G211Q, T022W-N043R-S101A-P210I-G211Q, G020R-S024R-N043K-R045T-S101A-N116L-P210I, T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-L217Q-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A, T022R-S101A-S103G-V104I-A232M-Q245R, T022R-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118S-Q245R-N248D-H249R, S024R-N043R-S101A-P210I-T213A, T022K-S101N-S103A-V104I-A232T-Q245R, G020R-N043R-S101A-P210I-G211Q, T022R-S101T-S103A-V104I-A232M-Q245R, S024R-V026A-N043R-S101A-P210I-G211Q, T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022K-S101T-S103G-V104I-A232L-Q245R, G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q, G020R-S024R-S078G-G118D-Q245R, T022A-S101N-S103A-V104I-S128A-P129S-A232V-Q245R, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-N043R-S101A-G211Q-T213A, N018K-G020R-S024R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A, G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A, T022R-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245R, G020R-S024R-S101A-T213A, T022R-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S024R-S101A-G211Q-T213A, T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118D-P129E-Q245R-H249R, T022R-S101T-S103A-V104L-A232L-Q245R, G020R-S024R-S101A-G211Q-T213A, T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-N043R-V051A-S101A-P210I-G211Q, S024R-S078G-G118D-Q245R, N043R-S101A-P210I, T022Y-S101G-S103N-V104I-A232L-Q245R, G020R-T022W-N043R-S101A-T213A, G020R-S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R-H249R, T022Y-S101N-S103N-V104I-A232T-Q245R, G020R-T022W-S024R-F050L-S101A-G211Q-T213A, N018S-T022W-S024R-N043R-S101A-G211Q, T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-P129S-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, S101A-P210I-G211Q-T213A, G020R-N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A, T022R-S101A-S103N-V104I-A232M-Q245S, G020R-T022W-N043R-R045T-S101A-G211Q, G020R-T022W-N043R-R045T-S101A-N116L-P210I, G020R-S024R-S078D-G118S-Q245R, G020R-T022W-S024R-N043R-S101A-P210I-G211Q-T213A, G020R-S024R-N043R-R045T-V051A-S101A-P210I-G211Q, T022A-S101G-S103A-V104I-P129S-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S078G-G118D-Q245R-N248D-H249R, T022K-S101A-S103N-V104L-A232T-Q245R, T022A-N076D-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S101A-P210I, T022A-S024G-G061R-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022Q-S101T-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-G211Q, P014R, T022R-S101A-S103N-V104L-A232M-Q245R, T022K-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118D-Q245R, T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-S101A-P210I-T213A, T022K-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245R, T022Y-S101T-S103A-V104I-A232L-Q245R, T022A-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A, G020R-R045T-S101A-P210I-T213A, G020R-S078D-G118S-Q245R-H249R, G020R-T022W-R045T-V051A-S101A, T022R-S101T-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S101A, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A, T022R-S101G-S103G-V104I-A232L-Q245R, G020R-S101A-P210I, T022K-S101T-S103N-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-N043R-V051A-S101A, G020R-T022W-N043R-S101A, G020R-T022W-S024R-N043R-S101A-P210I, G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-P210I-T213A, G020R-N043R-R045T-S101A-T213A, T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022Y-S101N-S103N-V104L-A232T-Q245R, G020R-S101A-N116L-P210I-G211Q, T022R-S101A-S103N-V104L-A232L-Q245R, G020R-S024R-N043R-S101A, T022R-S101G-S103A-V104L-A232T-Q245R, G020R-S024R-S101A-G211Q, T022A-S101Q-S103A-V104I-P129S-A232V-Q245R, T022A-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022K-S101A-S103N-V104I-A232T-Q245R, G020R-T022W-S024R-R045T-S101A, T022Y-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116L-P210I-G211Q-T213A, T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-N043R-S101A-P210I, T022A-S024G-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101T-S103N-V104I-A232V-Q245R, P055R, T022A-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S024R-N043R-N076D-S101A-P210I-T213A, G020R-T022W-S101A-P210I-T213A, T022Q-S101G-S103A-V104L-A232L-Q245R, T022W-S024R-N043R-R045T-S101A, T022A-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022K-S101N-S103A-V104I-A232L-Q245R, T022R-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245R, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-P210I-T213A, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-G097S-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-Q245R, T022K-S101A-S103N-V104I-A232L-Q245R, G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-P210I-T213A, G020R-S024R-S078G-G118S-S188D-Q245R, T022R-S101T-S103A-V104I-A232V-Q245W, T022R-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022K-S101T-S103N-V104I-A232T-Q245R, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022Q-S101G-S103N-V104I-A232L-Q245R, T022A-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104L-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-N043R-R045T-S101A-P210I, T022R-S101N-S103N-V104I-A232T-Q245R, G020R-N043R-R045T-S101A-N116L-G211Q-T213A, T022Q-S101A-S103N-V104I-A232V-Q245R, T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-N116L-P210I, T022A-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S078D-G118D-Q245R-H249R, G020R-S024R-N043R-S101A-P210I-G211Q-T213A, T022R-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245W, T022A-S101T-S103N-V104L-A232L-Q245R, T022A-S024G-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101T-S103N-V104I-A232T-Q245R, G020R-N043R-S101A-P210I-T213A, G020R-S024R-N043R-S101A-N116L-G211Q-T213A, S024R-N043R-R045T-S101A-N116L-P210I-G211Q, T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, E271R, T022K-S101T-S103G-V104I-A232V-Q245R, N043R-S101A-P210I-G211Q, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R, T022R-S101T-S103A-V104I-A232T-Q245S, E271W, S024R-N043R-R045T-S101A-N116L-P210I-T213A, T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-E089G-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022R-S101T-S103A-V104I-A232L-Q245R, T022R-S101G-S103N-V104I-A232T-Q245S, T022A-S101G-S103A-V104I-A232M-Q245R, G020R-T022W-S024R-S101A-T213A, G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-P210I, G020R-T022W-S024R-N043R-S101A-T213A, T022A-S024G-G097S-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S101A-T213A, E271S, G020R-S078G-G118S-Q245R-N248D-H249R, N043K, T022A-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245R, T022Q-S101A-S103A-V104I-A232L-Q245R, G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-T213A, G020R-S024R-S078G-G118S-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024G-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S024R-S101A-N116L-P210I, G020R-T022W-N043R-R045T-S101A-T213A, T022A-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101N-S103G-V104L-A232V-Q245R, G020R-T022W-S024R-S101A-P210I-T213A, G020R-S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-Q245R, T022Y-S101T-S103A-V104I-A232M-Q245R, G020R-N043R-R045T-V051A-S101A-P210I-G211Q-T213A, G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-T213A, T022A-S024G-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-S101A-P210I-G211Q, T022Q-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245R, G020R-N043R-S101A-G211Q-T213A, T022A-S101Q-S103A-V104I-P129S-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S101T-S103N-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-Q245R-N248D-H249R, G020R-T022W-R045T-S101A-P210I-G211Q, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101T-S103N-V104I-S105G-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245R, T022Q-S101N-S103N-V104L-A232V-Q245R, T022R-S101N-S103N-V104L-A232M-Q245R, T022Q-S101G-S103N-V104I-A232T-Q245R, T022A-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022Q-S101A-S103A-V104L-A232L-Q245R, G020R-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-P129S-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-S101A-G211Q-T213A, T022A-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, G020R-T022W-N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A, T022R-S101N-S103N-V104I-A232L-Q245R, T022Y-S101G-S103A-V104I-A232M-Q245R, T022R-S101G-S103G-V104I-A232T-Q245R, T022A-S024G-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118D-N248D-H249R, T022A-S101A-S103N-V104L-A232V-Q245R, T022W-S024R-S101A-N116L-G211Q, G020R-S024R-S101A-T208A-P210I-G211Q, T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A, T022Y-S101G-S103N-V104I-A232M-Q245R, T022R-S101T-S103A-V104L-A232T-Q245S, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-Q245R-N248D, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A, T022W-S024R-N043R-S101A-P210I-G211Q, G020R-S024R-N043R-S101A-P210I-G211Q, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-H249R, G020R-S024R-G047C-S101A-G211Q, G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-Q245R-H249R, T022A-S101A-S103A-V104L-A232V-Q245R, T022A-S101T-S103N-V104L-A232M-Q245R, N018S-G020R-T022W-N043R-S101A-G211Q, T022Y-S101T-S103G-V104I-A232T-Q245R, T022K-S101A-S103A-V104I-A232M-Q245R, T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022Y-S101N-S103N-V104L-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-P129S-A232V-Q245R, G020R-S078G-G118S-P129E-Q245R-H249R, T022A-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022Y-S101A-S103G-V104I-A232M-Q245R, S024R-S101A-G211Q, T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R, T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, R045T-S101A-I107V-Q109R-P210I-G211Q-T213A, T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022K-S101T-S103A-V104I-A232T-Q245R, Q012R-T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-T213A-A232V, T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-P210I, T022A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D, T022Y-S101T-S103A-V104I-A232T-Q245R, T022Q-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245R, S024R-S101A-P210I-T213A, T022A-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103N-V104L-A232L-Q245R, T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-P129S-A232V-Q245R, T022A-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245R, S024R-S101A-P210I, T022Y-S101T-S103N-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-N043R-S101A-N116L, T022Q-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245R, S024R-S101A, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116L-G211Q-T213A, S212W, T022K-S101G-S103A-V104L-A232M-Q245R, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S101A, G020R-S101A, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-Q245R-N248D-H249R, T022R-S101T-S103N-V104I-A232M-Q245R, S056K, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A270V, T022R-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245S, G020R-T022W-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A, T022K-S101N-S103N-V104L-A232L-Q245R, T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-V147I-P210I-G211Q-T213A, T022A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R, T022A-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-Q245R-N248D-H249R, S078G-G118D-Q245R-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A232V-N238Y-Q245R-A272V, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S024R-N043R-S101A-P210I-T213A, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, S056R, T022Y-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245R, T022R-S101T-S103G-V104I-A232V-Q245S, T022W-S101A-P210I-G211Q, T022R-S101A-S103N-V104L-A232T-Q245S, T022Y-S101A-S103G-V104I-A232T-Q245R, T022R-S101T-S103A-V104L-A232T-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-A232T-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118D-S188D-Q245R-H249R, V030I-N043R-S101A-G211Q-T213A, T022A-S101T-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-A232V-N238Y-Q245R, G020R-S078G-G118D-P129E-G159D-Q245R-H249R, S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A270V, T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S101T-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-T213A, T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S101N-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R, T022Q-S101N-S103N-V104L-A232L-Q245R, N018S-G020R-S101A-P210I-G211Q, G020R-S078D-G118S-S188D-Q245R-H249R, T022A-S101G-S103N-V104I-A232L-Q245R, T022R-S101T-S103G-V104L-A232V-Q245R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A270V-A272V, T022Q-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245S, G020R-N043R-R045T-S101A-G211Q, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101A-S103A-V104L-A232V-Q245S, T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118S-T180N-Q245R-N248D, V004M, T022A-S101T-S103N-V104I-A232T-Q245R, T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-A230T-A232V-Q245R, T022Y-S101N-S103N-V104I-A232L-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-Q245R-N248D, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R, G020R-N043R-R045T-S101A-P210I-T213A, S024R-S078D-G118D-Q245R-H249R, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-Q109R-T213A, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043R-S101A-N204D-G211Q-T213A, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118S-N248D, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D, T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118D-G159D-Q245R-H249R, T022K-S101T-S103N-V104L-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118S-Q245R, T022A-S101A-S103G-V104I-A232L-Q245R, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078D-G118S-Q245R, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-N238Y-Q245R-A270V-A272V, S101A-P210I-T213A, T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-P129S-L217Q-A232V-Q245R, A114L, A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-T213A-A232V, T022A-S101N-S103A-V104I-S128A-P129S-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101A-S103N-V104I-A232L-Q245S, T022Q-S101N-S103A-V104I-A232M-Q245W, T022W-S024R-S101A-N204S-G211Q-T213A, T022A-S101N-S103A-V104L-A232M-Q245R, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R, G020R-S078D-G118S-P129E-Q245R-H249R, T022Q-S101T-S103A-V104I-A232T-Q245S, S024R-N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A, T022R-S101N-S103G-V104I-A232T-Q245R, S024R-S101A-P210I-G211Q-T213A, T022A-S024G-N076D-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118S-S188D-N248D-H249R, T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-S101A-P210I-T213A, T022A-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103N-V104I-A232T-Q245W, T022K-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022W-S024R-S101A-G211Q-T213A, S024R-N043R-S101A-P210I-G211Q, T022Q-S101T-S103G-V104I-A232T-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A272V, T022K-S101G-S103N-V104L-A232M-Q245R, T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, S078D-G118S-G159D-Q245R-H249R, G020R-T022W-S024R-A069T-S101A-P210I-T213A, T022A-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-H249R, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S078G-G118D-G159D-Q245R-N248D-H249R, T022W-R045T-S101A-T213A, G020R-S024R-S078N-G097A-S101A-Q109N-N116L-L217Q, T022R-S024F-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271H, G020R-S024R-S078N-G097S-S101Q-S128A-L217Q, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271H, G020R-S024R-S101G-N116L-S128A, G020R-S024R-S101A-Q109N-N116L-S128A, T022R-S024F-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-T260M, G020R-S024R-S078N-S101N-N116L-S128A, G020R-S024R-G097A-S101A-Q109G-N116L, G020R-S024R-S101N-S128A, G020R-S024R-S078N-S101G-S128A-L217Q, T022R-S024F-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-N116L-A232V-Q245R, G020R-S024R-G097A-S101A-Q109N-N116L-S128A, G020R-S024R-G097S-S101N-Q109N-S128A, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-P239G-Q245R, G020R-S024R-G097S-S101A-S128A, G020R-S024R-S101G-Q109N-N116L-A215V, G020R-S024R-S078N-G097S-S101Q-Q109G-N116L-S128A, G020R-S024R-S078N-G097S-S101N-Q109N, G020R-S024R-S101G-S128A, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-T260K-L267N, T022R-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022R-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S024F-S101G-S103A-V104I-V121F-A232V-Q245R, G020R-S024R-G097A-S101Q-N116L-S128A-L217Q, T022R-G097A-S101N-S103A-V104I-N116L-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078N-G097S-S101A-N116L-S128A, G020R-S024R-G097A-S101G-S128A-L217Q, T022R-S078N-S101G-S103A-V104I-N116L-A232V-Q245R, G020R-S024G-N043R-S078N-S101Q-Q109G-N116L-S128A-Q206R-L217Q, G020R-S024R-S078N-G097S-S101Q-N116L-S128A, G020R-S024R-S078N-G097S-S101N-Q109N-N116L-S128A, G020R-S024R-S101N-Q109G-N116L, G020R-S024R-S101Q-N116L-S128A-L217Q, G020R-N043R-S078N-S101G-Q109G-N116L, G020R-S024G-N043R-S078N-G097S-S101G-S128A, T022R-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022R-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-N116L-S128A-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-P239G-Q245R-E271I, G020R-S024R-S101Q-S128A, G020R-S024R-G097A-S101N-Q109G-N116L, G020R-S024G-N043R-S078N-G097A-S101G-Q109G-N116L, G020R-S024R-G097S-S101Q-Q109N-N116L-L217Q, T022R-S024G-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-G097A-S101G-Q109N-S128A, G020R-S024R-G097S-S101A-Q109N-S128A, T022R-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078N-G097A-S101N-S128A-L217Q, G020R-S024G-N043R-S078N-G097S-S101G-N116L, G020R-S024R-S078N-G097S-S101G-Q109N-N116L-L217Q, T022R-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-N116L-S128A-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078N-G097S-S101A-Q109N-S128A-L217Q, G020R-S024R-S078N-G097A-S101G-Q109N-N116L-L217Q, G020R-S024G-N043R-S078N-S101Q, G020R-S024R-S078N-G097A-S101Q-Q109G-N116L, G020R-N043R-G097A-S101N-N116L-S128A, G020R-S024R-S078N-S101G-Q109G-N116L-S128A-L217Q, G020R-S024R-S078N-S101Q-Q109G-N116L-S128A-L217Q, G020R-S024R-S078N-G097S-S101G-Q109N-N116L-S128A, G020R-S024R-S078N-G097S-S101N-Q109N-N116L, T022R-S101N-S103A-V104I-Q109N-N116L-S128A-A232V-Q245R, T022R-S024G-G097S-S101G-S103A-V104I-Q109G-N116L-S128A-A232V-Q245R, T022R-S024G-S078N-S101G-S103A-V104I-N116L-S128A-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078N-S101N-Q109N-N116L, G020R-S024R-S078N-S101A-Q109N-N116L-S128A, T022R-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-N116L-S128A-A232V-Q245R, T022R-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022R-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022R-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022R-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-N116L-S128A-A232V-Q245R, G020R-S024R-S101G-Q109G-N116L-L217Q, G020R-S024R-S078N-S101Q-Q109N-N116L, G020R-S024R-S101G-N116L-S128A-L217Q, G020R-S024R-S101A-Q109G-N116L-S128A, T022R-S024G-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-N116L-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-N116L-S128A-A232V-Q245R, G020R-N043R-G097A-S101N-S128A-L233I, T022R-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043R-G097S-S101Q-Q109G-N116L-S128A, T022R-S078N-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-G097S-S101N-Q109G-N116L, T022R-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022R-S024G-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-G097A-S101N-Q109G-S128A, G020R-N043R-S101Q-N116L-S128A-L217Q, G020R-S024R-S078N-G097A-S101Q-Q109N-S128A, G020R-S024R-E089D-S101A-Q109N-N116L, G020R-S024R-G097A-S101G-Q109G-S128A, G020R-S024G-N043R-S101G-N116L-S128A-L217Q, G020R-N043R-S078N-S101Q-Q109G-L217Q, G020R-S024G-N043R-G097A-S101N-Q109N-N116L-L217Q, G020R-S024R-S078N-G097A-S101G-N116L-S128A, G020R-S024R-G097S-S101A-Q109N-N116L, G020R-S024R-S078N-S101A-Q109G-S128A, G020R-S024R-G097A-S101A-Q109G-N116L-S128A, G020R-N043R-G097A-S101Q-N116L-S128A, G020R-N043R-G097S-S101Q-S128A-L217Q, G020R-S024R-S078N-G097A-S101G-Q109G-N116L-L217Q, G020R-N043R-G097A-S101G-Q109N-N116L-S128A, G020R-N043R-S078N-G097S-S101N-Q109N-L217Q, G020R-S024R-G097S-A098E-S101A-N116L-S128A, G020R-S024R-S078N-G097S-S101A-Q109G-S128A, T022R-S024G-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-Q109N-N116L-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078N-G097A-S101Q-Q109N-N116L-L217Q, T022R-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, G020R-S024R-S101A-Q109N-N116L-S128A-L217Q, G020R-S024R-S101G-Q109G-N116L-S128A-L217Q, T022R-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, G020R-S024G-N043R-S101N-N116L-S128A-L217Q, G020R-S024R-S078N-G097S-S101A-Q109N-N116L, G020R-S024R-S078N-G097A-S101N-Q109N-N116L-S128A, G020R-S024R-S078N-S101Q-Q109N-N116L-L217Q, T022R-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-N116L-S128A-A232V-Q245R, G020R-N043R-S101G-Q109N-N116L-S128A-L217Q, T022R-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022R-G097A-S101N-S103A-V104I-N116L-S128A-A232V-Q245R, G020R-S024R-G097A-S101A-S128A-L217Q, T022R-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078N-G097S-S101N-Q109G-N116L-S128A-L217Q, T022R-S024G-S101G-S103A-V104I-N116L-L217Q-A232V-Q245R, T022R-G097A-S101Q-S103A-V104I-N116L-S128A-A232V-Q245R, G020R-N043R-S101Q-S128A-L217Q, G020R-S024R-S078N-S101N-Q109G-S128A-L217Q, G020R-S024R-S078N-G097A-S101N-Q109N-N116L-S128A-L217Q, T022R-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-N116L-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078N-G097S-S101G-S128A-N204S-L217Q, T022R-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-N116L-S128A-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078N-G097S-S101Q-Q109N-N116L-L217Q, G020R-S024R-S078N-S099G-S101Q-Q109N-N116L-L217Q, T022R-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-Q109G-N116L-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-G097A-S101G-S103A-V104I-Q109G-N116L-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-G097A-S101N-Q109N-S128A-L217Q, T022R-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-K094R-S101N-N116L-S128A-L217Q, T022R-S024G-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-G097A-S101A-N116L-S128A-L217Q, G020R-S024R-S078N-G097W-S101Q-Q109N-N116L-L217Q, T022R-G097S-S101N-S103A-V104I-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101Q-S103A-V104I-N116L-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S024G-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-N043R-G097S-S101Q-Q109G-N116L-S128A-L217Q, T022R-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-G097S-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-N116L-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S024G-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101Q-S103A-V104I-Q109G-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S024G-T071A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-N116L-S128A-A232V-Q245R, T022R-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R, T022R-S024G-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109N-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271A, T022R-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-Q245R, G020R-N043R-E271A, G020R-S024R-I035T-S101A-N116L, G020R-N043R-P239G, G020R-N043R-S242L или G020R-N043R-V234F (Перечень 17), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляют собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из T022Y-S101N-S103A-V104I-A232T-Q245R, G020R-R045T-S101A-P210I-G211Q-L267F, T022Y-S101N-S103N-V104L-A232M-Q245R, T022A-P052T-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103N-V104L-A232T-Q245R, T022Y-S101A-S103N-V104L-A232V-Q245R, T022A-S101A-S103N-V104I-A232T-Q245R, T022Y-S101A-S103N-V104I-A232L-Q245R, T022Y-S101G-S103A-V104I-A232T-Q245R, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S101N-S103N-V104L-A232M-Q245R, T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-P129S-A232V-Q245R, T022A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, S024R-S078D-G118S-G159D-Q245R-H249R, T022K-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245R, T022R-S101T-S103N-V104I-A232T-Q245S, T022Q-S101N-S103N-V104I-A232M-Q245R, S024R-S078G-G118D-Q245R-H249R, T022R-S101N-S103N-V104L-A232V-Q245R, T022A-N076D-S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118D-S188D-Q245R-N248D, T022Y-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022Q-S101N-S103A-V104L-A232L-Q245R, T022Q-S101N-S103N-V104I-A232L-Q245R, T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101N-S103N-V104I-A232T-Q245S, G020R-S078D-G118D-G159D-Q245R-H249R, T022R-S101N-S103A-V104L-A232M-Q245R, T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103N-V104L-A232T-Q245S, G020R-T022W-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A, T022Q-S101T-S103N-V104I-A232T-Q245R, G020R-S024R-N043R-S101A-N204D-T213A, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118D-S188D-Q245R-N248D-H249R, S024R-N043R-S101A-P210I, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A270V, G020R-S024R-S078D-G118S-H249R, S024R-S078G-G118S, T022R-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245S, S024R-N043K-R045T-S101A, T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R-T274A, T022A-S024G-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022Q-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245W, S024R-S078G-G118S-P129E-Q245R-H249R, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V026W, T022R-S101G-S103N-V104I-A232L-Q245W, G020R-S024R-S078D-G118S-N248D, G020R-R045T-S101A-N204S-P210I, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-N248D-H249R, T022Y-S101A-S103N-V104I-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, S024R-S101A-P210I-G211Q, T022R-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245S, T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-S101Q-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, G020R-S078G-G118S-H249R, S078G-G118S-Q245R-H249R, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022Y-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245R, T022K-S101G-S103N-V104I-A232L-Q245R, T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R-H249R, T022Q-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-Q245R-N248D, T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104L-A232T-Q245R, T022Q-S101T-S103A-V104I-A232T-Q245R, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104L-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-S101A-G211Q-T213A, T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118S-Q245R-N248D, G020R-T022W-S024R-N043R-S101A-N204S-P210I-G211Q, T022A-S024G-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129S-A232V-Q245R, T022R-S101T-S103G-V104I-A232T-Q245S, T022A-S024G-I072V-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022K-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245W, G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-N116L-P210I, T022R-S101T-S103G-V104I-A232T-Q245W, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022Y-S101T-S103N-V104L-A232V-Q245R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-N248D, T022Q-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-S078N-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101N-S103A-V104I-A232L-Q245S, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245W, T022A-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-P129S-A232V-Q245R, T022A-S101T-S103A-V104I-A232L-Q245R, T022A-A085T-G097S-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S101T-S103N-V104L-S105G-A232M-Q245R, T022A-S101A-S103A-V104I-A232M-Q245S, T022Q-S101A-S103A-V104I-A232M-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104L-A232M-Q245R, T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-N076D-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-H120Q-S128A-A232V-Q245R, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-P129S-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-Q245R, T022K-S101G-S103G-V104I-A232V-Q245R, S078G-G118S-S188D-Q245R-H249R, T022W-N043R-S101A-G211Q-T213A, T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, T022Y-S101A-S103N-V104L-A232M-Q245R, G020R-T022W-S101A-N116L-G211Q-T213A, T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-T213A, N043R-S101A-G211Q-T213A, T022Y-S101N-S103N-V104L-A232L-Q245R, T255G, T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022W-S024R-N043R-S101A-P210I-T213A, N269K, T022R-S101T-S103A-V104I-A232L-Q245S, T022A-S024G-I072V-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022K-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245R, H017R-N043R-R045T-S101A-P210I-T213A, T022A-S024G-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S024G-V026A-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022Q-S101T-S103G-V104I-A232L-Q245R, T022W-S024R-S101A-P210I-G211Q-T213A, T022Q-S101N-S103A-V104I-A232M-Q245R, G020R-R045T-S101A, T022Y-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-A232L-Q245R, S024R-S078D-G118D-P129E-Q245R-H249R, T022R-S101A-S103A-V104I-A232M-Q245S, G020R-S101A-P210I-G211Q, T022W-N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q, T022R-S101G-S103A-V104I-A232M-Q245S, T022A-S024G-N076D-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022R-S101T-S103N-V104I-A232V-Q245S, T022Q-S101G-S103N-V104L-A232M-Q245R, T022K-T038I-S101G-S103A-V104I-A232T-Q245S, N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q, T022K-S101T-S103A-V104L-A232M-Q245R, T022Y-S101T-S103N-V104I-A232T-Q245R, G020R-S024R-N043R-S101A-P210I-T213A, S099G-S101G, T022A-S101N-S103N-V104L-A232T-Q245R, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245W, T022W-N043R-R045T-S101A-P210I, T022K-S101A-S103G-V104I-A232T-Q245R, T022Q-S101N-S103A-V104I-A232T-Q245S, T022A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-P129S-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118S-G159D-Q245R, T022K-S101N-S103N-V104I-A232T-Q245R, A098F-S099A-V104I, G020R-R045T-S101A-G211Q-T213A, T022A-N076D-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S078D-G118S-G159D-Q245R, T022A-S024G-N076D-S101N-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, T022K-S101T-S103N-V104I-A232M-Q245R, T022A-S024G-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022Q-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245S, A114T, T022Q-S101N-S103N-V104L-A232T-Q245R, T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, T022K-S101T-S103A-V104I-A232M-Q245R, T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-A232V, T022A-S101T-S103N-V104I-A232M-Q245W, G020R-T022W-S024R-S101A-N116L-G211Q, T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-R045T-S101A-G211Q, T022A-N076D-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, S024R-S101A-T213A, T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022Y-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245W, T022Y-S101A-S103G-V104I-A232V-Q245R, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-N238Y-Q245R, G020R-S078G-G118S-G159D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-A272V, T022R-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245S, G020R-S101A-P210I-G211Q-T213A, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R, S087R, G020R-S024R-R045T-A048T-S101A-G211Q, T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-G097S-S101G-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, L021S-T022A-S024G-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, S242K, T022K-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022K-S101N-S103A-V104L-A232L-Q245R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-N238Y-Q245R-A270V-A272V, T022R-S101T-S103A-V104I-A232V-Q245S, T022Y-S101N-S103G-V104I-A232L-Q245R, T022Q-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245W, T022R-S101A-S103A-V104I-A232L-Q245S, G020R-T022W-R045T-F050L-S101A-P210I-G211Q-T213A, T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S101A-G211Q-T213A, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A272V, T022A-S101G-S103A-V104I-A232V-N238Y-Q245R-A270V, T022A-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101A-T208P-P210I-G211Q, D181S, S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-A232V, T022Q-S101A-S103N-V104I-A232T-Q245R, T022A-S101G-S103N-V104L-G211S-A232T-Q245R, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S101T-S103N-V104I-A232M-Q245S, T022A-S101G-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, T022Q-S101A-S103G-V104I-A232M-Q245R, G020R-S078G-G118S-G159D-N248D-H249R, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R, T022Q-S101A-S103A-V104I-A232T-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-A232L-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238Y-V244I-Q245R-A270V-A272V, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-Q245R-N248D-H249R, T022R-S101A-S103N-V104I-A232V-Q245W, T022Q-S101A-S103N-V104I-A232M-Q245R, T022Q-S101A-S103N-V104L-A232L-Q245R, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022Q-S101G-S103G-V104I-A232M-Q245R, G020R-S078G-G118S-G159D-Q245R-H249R, T022R-S101A-S103N-V104L-A232V-Q245S, T022A-S024V-G097S-S101N-S103A-V104I-H120N-S128A-A232V-Q245R, T022A-A073V-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022Q-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245R-T274I, T022A-S101N-S103N-V104I-A232T-Q245R, T022W-S024R-R045P-S101A-P210I-G211Q-T213A, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-Q245R-N248D, T022Q-S101A-S103N-V104L-A232M-Q245R, T022Q-S101T-S103G-V104L-A232T-Q245R, T022R-S101G-S103N-A232L-Q245R, T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, S024R-S101A-G211Q-T213A, T022R-S101N-S103N-V104L-A232T-Q245S, G020R-R045T-S101A-P210I, T022R-S101A-S103A-V104I-A232M-Q245W, T022A-S101N-S103N-V104I-A232L-Q245R, T022A-S101G-S103G-V104I-A232M-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R-N248D, S099T-S103G, T022W-N043R-S101A-P210I, T022W-A029V-N043R-S101A-P210I, F050R, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103N-V104L-A232L-Q245R, T022A-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R, S024R-R045T-S101A, T022A-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022Q-S101G-S103A-V104I-A232M-Q245S, T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A, G020R-S078G-G118S, T022W-N043R-G046C-S101A-P210I-G211Q, S101A-G211Q-T213A, T022A-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129S-A232V-Q245R, T022R-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245W, T022A-S101G-S103A-V104I-A232V-N238Y-Q245R-A270V-A272V, S078G-G118D-Q245R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238Y-Q245R-A270V, T022A-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R, T022W-S024R-R045T-S101A-N116L-P210I-T213A, T022R-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245S, T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-S106L-P210I-G211Q, T022A-E089G-G097A-S101Q-S103A-V104I-P129S-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S101A-S103G-V104I-A232L-Q245S, N043R-S101A-P210I-T213A, N043R-R045T-S101A-T213A, S078G-G118D-H120N-H249R, T022Q-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245R-R275H, T022Y-S101A-S103A-V104I-A232T-Q245S, T022K-S101N-S103N-V104I-A232M-Q245R, T022R-S101T-S103N-V104L-A232V-Q245S, T022A-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, M119L, A098F-S099A-S101G-V104I, S078D-G118S-Q245R, T022Y-S101N-S103A-V104I-A232L-Q245S, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S078G-G118D-N248D-H249R, T022R-S101A-S103N-V104I-A232T-Q245S, T022R-S101G-S103N-V104I-A232L-Q245S, S024R-S078D-G118D-S188D-Q245R-H249R, S132H, A098Q-S099G-S101G-V104L, N043R-S101A-P210I-G211Q-T213A, T022Q-S101G-S103A-V104I-A232M-Q245W, T022A-S101Q-S103A-V104I-L126I-P129S-A232V-Q245R, T022K-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245S, T022W-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A, T022Q-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245W, D181T, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-H249R, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R, T022A-S101T-S103N-V104L-A232L-Q245S, T022A-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245S, T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022Y-S101T-S103A-V104L-A232M-Q245R, T022Q-S101T-S103N-V104L-A232T-Q245R, F050S, T022Y-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245R, G020R-R045T-S101A-T213A, T022K-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245W, S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-Q245R-H249R, T022Q-S101T-S103N-V104I-A232M-Q245W, S049W, T022A-S101A-S103N-V104L-A232L-Q245R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-P129G-A232V-Q245R-A270V, S099A-V104I, T022Q-S101A-S103G-V104I-A232V-Q245W, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-N238Y-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-L124V-L217Q-A232V-Q245R, T022R-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022R-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R, R010A-T022R-S024F-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-L267N-E271H, G020R-S024G-N043R-S078N-S101G-Q109N-N116L-L217Q-M222S, G020R-N043R-E271H, G020R-N043R-E271I, G020R-S024R-S101A-N116L-N269I, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271F, G020R-N043R-E271F, G020R-N043R-N269I, G020R-S024R-S101A-N116L-E271H, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271H, G020R-I035T-N043R, G020R-S024R-S101A-A114T-N116L, G020R-S024R-S101A-N116L-E271I, G020R-N043R-A114T, G020R-N043R-L267N, G020R-S024R-S101A-N116L-L267N, G020R-S024R-V028A-S101A-N116L, G020R-S024R-S101A-N116L-G258R, G020R-N043R-G258R, G020R-S024R-S101A-N116L-S242L, G020R-S024R-S101A-N116L-P239G, I008N-G020R-S024R-S101A-N116L, G020R-S024R-S101A-N116L-V234F, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V, G020R-S024R-S101A-N116L-E271A, R010A-G020R-N043R, G020R-S024R-S101A-N116L-E271F, G020R-V028A-N043R, I008N-G020R-N043R или G020R-S024F-S101A-N116L (Перечень 18), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляют собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот в положениях, выбранных из G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-H249R, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101T-S103G-V104I-A232T-Q245S, T022A-S101T-S103G-V104I-A232T-Q245R, T022Q-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245W, T022W-N043R-S101A-T213A, T022A-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022K-S101N-S103N-V104L-A232T-Q245R, T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, G020R-S024R-N062E-S078G-G118D, G020R-S078G-G118D, T022Y-S101T-S103G-V104L-A232T-Q245R, R010H-T022A-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A272V, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-A270V-A272V, T022A-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-Q245R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-N238Y-Q245R-A272V, T022K-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245W, T022Q-S101T-S103N-V104I-A232M-Q245S, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-L217Q-A232V-Q245R, W113Y, T022A-S101A-S103N-V104I-A232M-Q245S, T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-H249R, T022A-S101N-S103G-V104I-A232T-Q245R, T022K-S101G-S103G-V104I-A232L-Q245R, T022A-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022Q-S101T-S103N-V104I-A232V-Q245S, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V, T022A-S101N-S103G-V104L-A232T-Q245R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238Y-Q245R, T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R, S259W, A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-A232V, T022W-S101A-P210I-G211Q-T213A, T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, V028T-A215V, S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R, T022Q-S101T-S103A-V104I-A232V-Q245W, T022A-S101N-S103A-V104I-Q109G-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-T071A-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, H120P, G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-Q245R, T022A-N076D-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022Q-S101A-S103N-V104I-A232L-Q245W, T022Q-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245R, T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-N116L-P210I-G211Q, T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S078G-G118S-G159D-S188D-H249R, A013S, A232N, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, I035T, V051M, N123A, G020R-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D, T022Y-S101A-S103N-V104I-A232L-Q245W, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-A270V, G020R-S078D-G118S, T022R-S101N-S103N-V104L-A232M-Q245W, T022A-S024G-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245R, T022A-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-A232V-Q245R, S024R-R045T-S101A-P210I-G211Q, T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-H249R, G020R-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-H249R, P014W, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D, T022R-S101G-S103N-V104I-A232M-Q245W, T022R-A098V-S101G-S103N-V104L-A232T-Q245R, T022A-S101T-S103A-V104I-A232V-Q245W, G020R-T022W-R045T-S101A-T213A, N043R-R045T-S101A, T022K-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022K-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245S, S056V, G020R-T022W-R045T-S101A-G211Q, G020R-S024R-S078D-G118D-Q245R-N248D, G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-V244L-Q245R-N248D, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R, T022A-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-R045T-S101A-N116L-P210I, T022Q-S101N-S103N-V104I-A232M-Q245S, T022Y-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245W, A114V, S141C, T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, S056H, S078D-G118D-Q245R, S024R-N043R-R045T-S101A-T213A, T022Y-S101T-S103G-V104I-A232V-Q245S, T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, N269W, S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D-H249R, T022W-S024R-R045T-S101A, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238Y-Q245R-A270V-A272V, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R, T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-A232V-N238Y-Q245R-A270V-A272V, A122F, S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-H249R, T022K-S101T-S103G-V104I-A232V-Q245S, S009G-T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-L217Q-A232V-Q245R, A098Q, T022A-S101N-S103A-V104L-A232L-Q245R, T022A-S101A-S103N-V104I-A232T-Q245W, T022A-S024G-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118D-G159D-H249R, T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-S128A-P129S-A232V-Q245R, T022R-S101N-S103A-V104I-A232M-W241R-Q245W, R045T-S101A-P210I-G211Q, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-Q245V-N248E, T022Q-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245W, T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-L217Q-A223S-A232V-Q245R, T022K-S101T-S103A-V104I-A232T-Q245W, N043R-S101A-G211Q, T022A-S101G-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R, T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, G020R-S078G-G118S-P129E-H249R, S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R, N043R-R045T-S101A-N204S-P210I-T213A, T022R-S101N-S103A-V104L-A232V-Q245S, T022R-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245S, T022K-S101T-S103N-V104I-A232M-Q245S, T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R, G020R-T022W-R045T-S101A-P210I-T213A, T022A-N076D-G097A-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, T022W-S101A-P210I, T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129S-A232V-Q245R, T022A-S078D-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, Q236L, T022Y-S101T-S103N-V104I-A232V-Q245S, A200D, G020R-S078G-G118S-S188D-H249R, T022A-S101G-S103N-V104I-A232T-Q245W, T022A-S024G-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, G157I, G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R, T022Y-S101A-S103G-V104L-A232T-Q245R, S024R-S078G-G118D-H249R, T022Q-S101A-S103N-V104L-A232T-Q245S, T022Y-S101A-S103N-V104I-A232T-Q245W, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-Q109N-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103N-V104I-A232M-Q245S, T022A-S024G-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103N-V104I-A232M-Q245W, I008N, T022A-S101N-S103G-V104I-A232M-Q245S, V026A, T022R-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245W, T022A-S101A-S103N-V104I-A232L-Q245S, T022A-S101N-S103A-V104I-A232T-Q245R, N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A, T022A-S024G-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, A098F-S099T-S101A, A098F-S099T-S101G-V104L, P014N, A098Q-S103G-V104I, S099T-S103A-V104I, S087W, S024R-N062E-S078G-G118S-H249R, S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q, N043R-R045T-S101A-G211Q, G020R-S078G-G118S-N248D, T022Q-S101N-S103N-V104I-A232T-Q245W, S078D-G118S-P129E-Q245R-H249R, T022Q-S101T-S103G-V104I-A232T-Q245S, T022A-S024G-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R, S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-T213A-A232V, S101A-N116L-P210I-T213A, T022R-S101N-S103N-V104L-A232L-Q245S, B015T, T022A-S101G-S103A-V104I-L124V-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-Q245R, A114I, S212A, T022A-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245S, T022A-S024G-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-T143I-L217Q-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-H249R, T022K-S101A-S103N-V104L-A232L-Q245S, T022W-S101A-T213A, T022A-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, S132V, S024R-S078G-G118D-S188D-Q245R-N248D-H249R, A098Q-S101A-S103A-V104L, A098Q-S099T-S103A, T022R-S101T-S103N-V104L-A232T-Q245W, T022A-N076D-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, V051A-S101A-P210I-T213A, A098Q-S099T-S101A-V104L, T022R-S101N-S103N-V104I-A232M-Q245W, S099A-S101A-S103A, G020R-S078G-G118D-S188D-Q245R, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-H249R, T022A-N076D-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, S024R-S078G-G118D, T022Q-S101N-S103N-V104L-A232M-Q245R, T022A-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245S, A048G, T022Q-S099G-S101A-S103N-V104I-A232V-Q245R, S024R-R045T-S101A-G211Q-T213A, S024R-R045T-S101A-I107V-A114T-N116L-P210I-G211Q-T213A, T022R-S101T-S103G-V104I-A232L-Q245S, S099G-S103A, A098F-S099A, T022R-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245W, T022A-S103A-V104I-L124T-A232V-Q245R, T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-A232V, T022K-S101N-S103N-V104L-A232V-Q245S, T022K-S101A-S103A-V104L-A232M-Q245R, T022Q-S101G-S103N-V104I-A232T-Q245W, T022A-S101T-S103A-V104L-A232T-Q245W, T022A-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245S, T022A-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R, A098M, T022A-S101G-S103G-V104I-A232L-Q245R, G020R-S101A-S207G-P210I-T213A, T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R, G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D-H249R, G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R, T022Y-S101G-S103N-V104I-A232L-Q245S, V026Q, S240G, G020R-S024R-S078G-G118S-S188D, G020R-S024R-S078G-G118D-N238D-N248D, T022R-S101G-S103A-V104I-A232T-Q245S, T022W-S024R-R045T-S101A-P210I-G211Q, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022W-S024R-R045T-S101A-T213A, A200F, T022R-S101T-S103G-V104L-A232T-Q245S, T022A-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S101G-S103N-V104I-A232T-Q245S, T022A-S101T-S103N-V104I-A232T-Q245S, T022A-S101A-S103A-V104L-A232V-Q245S, S099G-S101A-V104L, H017R-T022A-S024V-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R, T022A-S101A-S103N-V104L-A232M-Q245S, T022A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, T022A-S024G-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-S212P-L217Q-A232V-Q245R, S056L, T253L, T022W-R045T-S101A-G211Q-T213A, T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R, T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R, G020R-T022W-R045T-S101A-G211Q-T213A, S101A-G211Q, N123D, T022R-S101A-S103N-V104I-A232M-Q245W, T022Y-S101T-S103N-V104L-A232T-Q245R, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V, G020R-S024R-S078D-G118D-N248D, A098Q-S099G-S101A, S099T-V104I, T022Q-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245S, T022R-S101A-S103G-V104I-A232T-Q245S, T022K-S101T-S103N-V104I-A232T-Q245W, A016M, T022A-S024G-N076D-S101N-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R, T022K-S101N-S103N-V104I-A232T-Q245S, G020R-N043R-R045T-S101A-N204D-P210I-G211Q, T022A-S101T-S103N-V104I-A232V-Q245S, T022Y-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245R, T022A-S101T-S103N-V104I-A232V-Q245W, T022A-S024G-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-L217Q-A232V-Q245R, A088T, T022Y-S101A-S103A-V104I-A232M-Q245S, T022W-S024R-R045T-S101A-N116L-P210I-G211Q, T022W-N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A, T038A, S078D-G118S-G159D-Q245R, T022K-S101T-S103A-V104L-A232V-Q245W, T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R, T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109N-L217Q-A232V-Q245R, G025S, G025T, A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-M119V-Y209V-G211Q-A232V, T022A-N076D-V084A-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V011L, T022Y-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245S, T022R-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245S, S240V, G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-S188D-H249R, T022W-S024R-R045T-S101A-G211Q-T213A, T022A-S024G-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R, V004Y, V051A, G195W-N269E, S024R-S078G-G118D-N248D-H249R, T022A-S099G-S101T-S103G-V104I-A232V-Q245S, T022Q-S101T-S103G-V104I-A232L-Q245W, T022Q-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245W, T022A-S101T-S103G-V104I-A232V-Q245W, T022K-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245R, T022Q-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245S, T022R-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-M222S-A232V-Q245R-E271H, G020R-S024R-S101N-Q109G-N116L-M222S, R010A-G020R-S024R-S101A-N116L или G020R-N043R-M222S (Перечень 19), и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает любые из вышеперечисленных выделенных вариантов субтилизина, где вариант субтилизина представляет собой вариант протеазы из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 1, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 2, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 3, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 4, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 5, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 6, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 7, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 8, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 9, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 10, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 11, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 12, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 13, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 14, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 15, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 16, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 17, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 18, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 19, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, как перечислено выше, где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 85% аминокислотной идентичности с указанной протеазой субтилизин GG36 Bacillus lentus, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, как перечислено выше, где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 90% аминокислотной идентичности с указанной протеазой субтилизин GG36 Bacillus lentus, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, как перечислено выше, где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 95% аминокислотной идентичности с указанной протеазой субтилизин GG36 Bacillus lentus, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, как перечислено выше, где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 98% аминокислотной идентичности с указанной протеазой субтилизин GG36 Bacillus lentus, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает выделенный вариант субтилизина из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, как перечислено выше, где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 99% аминокислотной идентичности с указанной протеазой субтилизин GG36 Bacillus lentus, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает любые выделенные варианты субтилизина, перечисленные выше, где общий заряд варианта составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых вариантах осуществления общий заряд получают в результате одной или нескольких замен, выбранных из: A001E, V004E, R010H/A, Q012E, A015D, N018D, R019H/S, V026D, K027E, N043D, R045C/T/S/P, S049D, V051E, G061E, N062D/E, N076D, N077D, S078D, S087D, A098E, S101D, S106E, G115E, G118D, N123D, S128D, P129E, S130D/E, S132D, A158E, G159D/E, S160D, S166D, R170T, N183D, N184D, N185E, R186H, S188D/E, A194E, A200D, Y209E, A215D, N204D, S212D, L217D/E, N218D, A230E, K235F, N237D, K237E, N238D, S240D, N243D, Q245D, R247L, N248D/E, K251C, N263D, N269D/E, A272D, A273E, R275H/S, A001R, V004R, Q012R, P014R, H017R, N018R/K, G020K/R, T022R/K, S024R/K, G025R, D032I, D041K/L/N, N043R/K, G046R, A048R, F050R/K, P055R, S056R/K, T057R, Q059K, G061R, N076K, S078R, P086R, S087R, E089G/P/I, G097R, S099R, Q109R, G115R, G118R, S132K, S144R, G159R/K, D181C/S/T, L196K, N204K, Q206R, K235R, Q236R/K, K237R, N238R, S240R, W241R, S242R/K, V244R, Q245R/K, N248R, H249R, N252R/K, S256R, G258R, T260K, N269R/K и/или E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V, где положения аминокислот варианта протеазы, в частности, варианта субтилизина, пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение также предлагает выделенные варианты протеазы, в частности, варианты субтилизина, где указанные варианты протеазы, в частности, варианты субтилизина, имеют не менее одной, или даже две или более заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из A001E, V004E, R010H/A, Q012E, A015D, N018D, R019H/S, V026D, K027E, N043D, R045C/T/S/P, S049D, V051E, G061E, N062D/E, N076D, N077D, S078D, S087D, A098E, S101D, S106E, G115E, G118D, N123D, S128D, P129E, S130D/E, S132D, A158E, G159D/E, S160D, S166D, R170T, N183D, N184D, N185E, R186H, S188D/E, A194E, A200D, Y209E, A215D, N204D, S212D, L217D/E, N218D, A230E, K235F, N237D, K237E, N238D, S240D, N243D, Q245D, R247L, N248D/E, K251C, N263D, N269D/E, A272D, A273E и/или R275H/S, предпочтительно имеющих заряд, равный 0, -1, -2, -3, -4 или -5, предпочтительно 0, -1, -2 или -3, наиболее предпочтительно -1 или -2 по отношению к ферменту с последовательностью SEQ ID №:1. Указанные варианты протеазы, в частности, варианты субтилизина, могут также включать любые из вариантов, перечисленных в данной заявке.

Настоящее изобретение также предлагает выделенные варианты протеазы, в частности, варианты субтилизина, где указанные варианты протеазы, в частности, варианты субтилизина, имеют не менее одной, или даже две или более заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из A001R, V004R, Q012R, P014R, H017R, N018R/K, G020K/R, T022R/K, S024R/K, G025R, D032I, D041K/L/N, N043R/K, G046R, A048R, F050R/K, P055R, S056R/K, T057R, Q059K, G061R, N076K, S078R, P086R, S087R, E089G/P/I, G097R, S099R, Q109R, G115R, G118R, S132K, S144R, G159R/K, D181C/S/T, L196K, N204K, Q206R, K235R, Q236R/K, K237R, N238R, S240R, W241R, S242R/K, V244R, Q245R/K, N248R, H249R, N252R/K, S256R, G258R, T260K, N269R/K и/или E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V, предпочтительно имеющих заряд, равный, 0, +1, +2, +3, +4 или +5, предпочтительно +1, +2 или +3, наиболее предпочтительно +2 по отношению к ферменту с последовательностью SEQ ID №:1. Указанные варианты протеазы, в частности, варианты субтилизина, могут также включать любые из вариантов, перечисленных в данной заявке.

В некоторых вариантах осуществления любые из перечисленных выше выделенных вариантов субтилизина могут быть включены в моющую композицию, пригодную для внесения в воду для получения моющего раствора, имеющего низкую ионную силу или низкую концентрацию моющего средства. Таким образом, в предпочтительном аспекте данного изобретения эти варианты будут образовывать часть моющей композиции, которую вносят в воду либо для процесса ручной мойки, либо для процесса машинной мойки, обычно внутри моечной машины, с образованием моющего раствора, чья электропроводность составляет от примерно 0,1 мСм/см до примерно 3 мСм/см, от примерно 0,3 мСм/см до примерно 2,5 мСм/см, или даже от примерно 0,5 мСм/см до примерно 2 мСм/см. Предпочтительные варианты для применения с низкой ионной силой или с низкой концентрацией моющего средства выбирают из вариантов в любом из перечней 9, 14, 15 или 16, предпочтительно, в перечнях 14 или 15, наиболее предпочтительно, в перечне 15 выше.

Не желая ограничиваться теорией, предполагается, что эти мутации, для того, чтобы достигнуть желаемого заряда, обеспечивают повышенную общую эффективность протеаз путем обеспечения оптимального заряда молекулы для условий с низкой ионной силой, или моющих растворов, содержащих низкие концентрации моющего средства - только путем тщательной комбинации определенных мутаций, из которых упомянутые являются предпочтительными, можно получить такие предпочтительные протеазы.

В некоторых вариантах осуществления любые из перечисленных выше выделенных вариантов субтилизина могут быть включены в моющую композицию, пригодную для внесения в воду для получения моющего раствора, имеющего высокую ионную силу или высокую концентрацию моющего средства. Таким образом, в предпочтительном аспекте данного изобретения эти варианты будут образовывать часть моющей композиции, которую вносят в воду либо в ручном, либо в машинном процессе мойки, обычно внутри моечной машины, с образованием моющего раствора, чья электропроводность составляет от свыше примерно 3 мСм/см до примерно 30 мСм/см, от примерно 3,5 мСм/см до примерно 20 мСм/см, или даже от примерно 4 мСм/см до примерно 10 мСм/см. Предпочтительные варианты для применения с высокой ионной силой или с высокой концентрацией моющего средства выбирают из вариантов в любом из перечней 1 или 17, 18 или 19, предпочтительно, в перечнях 17 или 18, наиболее предпочтительно, в перечне 17 выше.

Не желая ограничиваться теорией, предполагается, что эти мутации, для того, чтобы достигнуть желаемого заряда, обеспечивают повышенную общую эффективность протеаз путем обеспечения оптимального заряда молекулы для условий с высокой ионной силой, или моющих растворов, содержащих высокие концентрации моющего средства - только путем тщательной комбинации определенных мутаций, из которых упомянутые являются предпочтительными, можно получить такие предпочтительные протеазы.

Предпочтительно эти протеазы образуют часть моющей композиции, которую вносят в воду либо в ручном, либо в машинном процессе мойки, обычно внутри моечной машины, с образованием моющего раствора, чья электропроводность составляет от свыше примерно 3 мСм/см до примерно 30 мСм/см, от примерно 3,5 мСм/см до примерно 20 мСм/см, или даже от примерно 4 мСм/см до примерно 10 мСм/см.

Не желая ограничиваться теорией, предполагается, что эти мутации, для того, чтобы достигнуть желаемого заряда, обеспечивают повышенную общую эффективность протеаз для условий с высокой ионной силой, или моющих растворов, содержащих высокие концентрации моющего средства - только путем тщательной комбинации определенных мутаций, из которых упомянутые являются предпочтительными, можно получить такие предпочтительные протеазы.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает любые из выделенных вариантов субтилизина, перечисленных выше и имеющих следующие характеристики: a) эффективность по методике испытания 2, равную по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до примерно 10, от 1,1 до примерно 8 или даже от 1,1 до примерно 5; b) эффективность по методике испытания 3, равную по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до примерно 10, от 1,1 до примерно 8 или даже от 1,1 до примерно 5; c) эффективность по методике испытания 4, равную по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до примерно 10, от 1,0 до примерно 8 или даже от 1,0 до примерно 5; и/или d) эффективность по методике испытания 6, равную по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до примерно 10, от 1,0 до примерно 8 или даже от 1,0 до примерно 5; и/или е) эффективность по методике испытания 7, равную по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до примерно 15, от 1,1 до примерно 10 или даже от 1,1 до примерно 7. Методика испытания 2, методика испытания 3, методика испытания 4, методика испытания 6 и методика испытания 7 подробно описаны далее в разделе Пример 1 под заголовком “Методики испытания”.

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению

Настоящее изобретение предоставляет выделенные, не встречающиеся в природе или рекомбинантные нуклеиновые кислоты (также называемые в настоящем изобретении как “полинуклеотиды”), которые собирательно могут называться “нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению” или “полинуклеотиды по настоящему изобретению”, которые кодируют полипептиды по настоящему изобретению. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, включая все описанные ниже, пригодны при рекомбинантном получении (например, экспрессии) полипептидов по настоящему изобретению, как правило, посредством экспрессии плазмидных векторов экспрессии, включающих последовательность, кодирующую представляющий интерес полипептид или его фрагмент. Как обсуждалось выше, полипептиды включают полипептиды вариантной протеазы, включая полипептиды вариантного субтилизина, обладающие ферментативной активностью (например, протеолитической активностью), которые пригодны в применениях, связанных к чисткой, и чистящих композициях для чистки предмета или поверхности (например, поверхности предмета), нуждающегося в чистке.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет выделенную, рекомбинантную, по сути чистую или не встречающуюся в природе нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую любой полипептид (включая любой гибридный белок и т.д.) по настоящему изобретению, описанный выше в разделе под заголовком "Полипептиды по настоящему изобретению" и в других разделах в настоящем изобретении. Настоящее изобретение также предоставляет выделенную, рекомбинантную, по сути чистую или не встречающуюся в природе нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую комбинацию из двух или более любых полипептидов по настоящему изобретению, описанных выше и в других разделах в настоящем изобретении.

Также представлена выделенная, рекомбинантная, по сути чистая или не встречающаяся в природе нуклеиновая кислота, включающая полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вариантную протеазу, обладающую протеолитической активностью, причем указанная вариантная протеаза (например, вариантный субтилизин) содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 не более чем по 50, не более чем по 40, не более чем по 30, не более чем по 35, не более чем по 25, не более чем по 20, не более чем по 19, не более чем по 18, не более чем по 17, не более чем по 16, не более чем по 15, не более чем по 14, не более чем по 13, не более чем по 12, не более чем по 11, не более чем по 10, не более чем по 9, не более чем по 8, не более чем по 7, не более чем по 6, не более чем по 5, не более чем по 4, не более чем по 3, не более чем по 2 аминокислотным остаткам или не более чем по 1 аминокислотному остатку, где положения аминокислот вариантного субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1, как установлено путем выравнивания аминокислотной последовательности вариантной протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 1, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 2, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 3, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 4, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 5, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 6, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 7, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 8, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 9, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 10, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 11, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 12, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 13, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 14, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 15, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 16, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 17, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 18, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечня 19, где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие любые из перечисленных выше выделенных вариантов субтилизина, где вариант субтилизина представляет собой вариант протеазы из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 1, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 2, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 3, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 4, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 5, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 6, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 7, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 8, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 9, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 10, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 11, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 12, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 13, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 14, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 15, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 16, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 17, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 18, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность субтилизина, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID №:2 и обладает протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию замен аминокислот, выбранных из Перечня 19, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующей аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, как перечислено выше, где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 85% аминокислотной идентичности с указанной протеазой субтилизин GG36 Bacillus lentus, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

Настоящее изобретение нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, как перечислено выше, где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 90% аминокислотной идентичности с указанной протеазой субтилизин GG36 Bacillus lentus, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

Настоящее изобретение нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, как перечислено выше, где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 95% аминокислотной идентичности с указанной протеазой субтилизин GG36 Bacillus lentus, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

Настоящее изобретение нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, как перечислено выше, где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 98% аминокислотной идентичности с указанной протеазой субтилизин GG36 Bacillus lentus, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

Настоящее изобретение нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, как перечислено выше, где указанный вариант субтилизина имеет по меньшей мере 99% аминокислотной идентичности с указанной протеазой субтилизин GG36 Bacillus lentus, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие любые варианты субтилизина, перечисленные выше, где общий заряд варианта составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых вариантах осуществления общий заряд получают в результате одной или нескольких замен, выбранных из: A001E, V004E, R010H/A, Q012E, A015D, N018D, R019H/S, V026D, K027E, N043D, R045C/T/S/P, S049D, V051E, G061E, N062D/E, N076D, N077D, S078D, S087D, A098E, S101D, S106E, G115E, G118D, N123D, S128D, P129E, S130D/E, S132D, A158E, G159D/E, S160D, S166D, R170T, N183D, N184D, N185E, R186H, S188D/E, A194E, A200D, Y209E, A215D, N204D, S212D, L217D/E, N218D, A230E, K235F, N237D, K237E, N238D, S240D, N243D, Q245D, R247L, N248D/E, K251C, N263D, N269D/E, A272D, A273E, R275H/S, A001R, V004R, Q012R, P014R, H017R, N018R/K, G020K/R, T022R/K, S024R/K, G025R, D032I, D041K/L/N, N043R/K, G046R, A048R, F050R/K, P055R, S056R/K, T057R, Q059K, G061R, N076K, S078R, P086R, S087R, E089G/P/I, G097R, S099R, Q109R, G115R, G118R, S132K, S144R, G159R/K, D181C/S/T, L196K, N204K, Q206R, K235R, Q236R/K, K237R, N238R, S240R, W241R, S242R/K, V244R, Q245R/K, N248R, H249R, N252R/K, S256R, G258R, T260K, N269R/K или E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V, где положения аминокислот варианта протеазы пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение также предлагает выделенные варианты протеазы, в частности, варианты субтилизина, где указанные варианты протеазы имеют не менее одной, или даже две или более заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из A001E, V004E, R010H/A, Q012E, A015D, N018D, R019H/S, V026D, K027E, N043D, R045C/T/S/P, S049D, V051E, G061E, N062D/E, N076D, N077D, S078D, S087D, A098E, S101D, S106E, G115E, G118D, N123D, S128D, P129E, S130D/E, S132D, A158E, G159D/E, S160D, S166D, R170T, N183D, N184D, N185E, R186H, S188D/E, A194E, A200D, Y209E, A215D, N204D, S212D, L217D/E, N218D, A230E, K235F, N237D, K237E, N238D, S240D, N243D, Q245D, R247L, N248D/E, K251C, N263D, N269D/E, A272D, A273E и/или R275H/S, предпочтительно имеющих заряд, равный 0, -1, -2, -3, -4 или -5, предпочтительно 0, -1, -2 или -3, наиболее предпочтительно -1 или -2 по отношению к ферменту с последовательностью SEQ ID №:1. Указанные варианты протеазы, в частности, варианты субтилизина, могут также включать любые из вариантов, перечисленных в данной заявке.

Настоящее изобретение предлагает выделенные варианты протеазы, в частности, варианты субтилизина, где указанные варианты протеазы имеют не менее одной, или даже две или более заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из A001R, V004R, Q012R, P014R, H017R, N018R/K, G020K/R, T022R/K, S024R/K, G025R, D032I, D041K/L/N, N043R/K, G046R, A048R, F050R/K, P055R, S056R/K, T057R, Q059K, G061R, N076K, S078R, P086R, S087R, E089G/P/I, G097R, S099R, Q109R, G115R, G118R, S132K, S144R, G159R/K, D181C/S/T, L196K, N204K, Q206R, K235R, Q236R/K, K237R, N238R, S240R, W241R, S242R/K, V244R, Q245R/K, N248R, H249R, N252R/K, S256R, G258R, T260K, N269R/K и/или E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V и/или N269R, предпочтительно имеющих заряд, равный 0, +1, +2, +3, +4 или +5, предпочтительно +1, +2 или +3, наиболее предпочтительно +2 по отношению к ферменту с последовательностью SEQ ID №:1. Указанные варианты протеазы, в частности, варианты субтилизина, могут также включать любые из вариантов, перечисленных в данной заявке.

Как указано в данном документе, подходящие для холодной воды варианты протеазы, или варианты субтилизина, представляют собой варианты исходной протеазы, причем последовательность указанной исходной протезы по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 100% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID №:1, при этом указанный вариант протеазы имеет одну или несколько из следующих характеристик:

а) эффективность по методике испытания 2, равную по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до примерно 10, от 1,1 до примерно 8 или даже от 1,1 до примерно 5; b) эффективность по методике испытания 3, равную по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до примерно 10, от 1,1 до примерно 8 или даже от 1,1 до примерно 5; c) эффективность по методике испытания 4, равную по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до примерно 10, от 1,0 до примерно 8 или даже от 1,0 до примерно 5; и/или d) эффективность по методике испытания 6, равную по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до примерно 10, от 1,0 до примерно 8 или даже от 1,0 до примерно 5; и/или е) эффективность по методике испытания 7, равную по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до примерно 15, от 1,1 до примерно 10 или даже от 1,1 до примерно 7. Методика испытания 2, методика испытания 3, методика испытания 4, методика испытания 6 и методика испытания 7 подробно описаны далее в разделе Пример 1 под заголовком “Методики испытания”. Все мутации, на которые ссылаются в данном документе, используют схему нумерации BPN', как показано на Фигуре 1. В некоторых вариантах осуществления варианты, на которые ссылаются в данном документе, относятся к вариантам, имеющим аминокислотные последовательности, сравниваемые с аминокислотной последовательностью в SEQ ID NO:2, используя схему нумерации BPN'.

В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутые варианты протеазы высокой ионной силы для холодной воды, в частности, варианты субтилизина, составляют часть моющей композиции, которую разводят в воде, обычно внутри стиральной машины, с образованием моющего раствора, чья электропроводность составляет от примерно 3 мСм/см до примерно 30 мСм/см, от примерно 3,5 мСм/см до примерно 20 мСм/см, или даже от примерно 4 мСм/см до примерно 10 мСм/см.

Заряд вариантов протеазы для холодной воды, в частности, варианты субтилизина, выражают относительно протеазы субтилизин GG36 дикого типа B. lentus с аминокислотной последовательностью SEQ ID №:2. Аминокислотами, которые придают единичный отрицательный заряд, являются D и E, а аминокислотами, которые придают единичный положительный заряд, являются R, H и K. Для расчета заряда варианта протеазы для холодной воды используют любое изменение аминокислоты по сравнению SEQ ID №:2, которое изменяет заряд. Например, введение мутации с отрицательным зарядом за счет нейтрального положения дикого типа будет добавлять суммарный заряд -1 к варианту протеазы для холодной воды, в то время как введение мутации с отрицательным зарядом (D или E) за счет положительного аминокислотного остатка дикого типа (R, H или K) будет добавлять суммарный заряд -2. Суммирование изменений зарядов от всех аминокислотных остатков, которые являются отличными для варианта протеазы для холодной воды по сравнению с протеазой субтилизин GG36 дикого типа B. lentus с аминокислотной последовательностью SEQ ID №:2, дает изменение заряда варианта протеазы для холодной воды. Не желая быть связанным теорией, полагают, что: предпочтительный диапазон заряда для протеаз для холодной воды для применения в растворах моющих средств для белья с низкой электропроводностью составляет -5, -4, -3, -2, -1, 0, в частности, -2, -1; предпочтительный диапазон заряда для протеаз для холодной воды для применения в растворах моющих средств для белья с высокой электропроводностью составляет +5, +4, +3, +2, +1, 0, в частности, +2, +1. Путем соответствующего подбора заряда можно получить неожиданно повышенные уровни чистящего действия в холодной воде. “Растворы моющих средств для белья с низкой электропроводностью” определяют как обладающие электропроводностью от примерно 0,1 мСм/см до примерно 3 мСм/см, от примерно 0,3 мСм/см до примерно 2,5 мСм/см или даже от примерно 0,5 мСм/см до примерно 2 мСм/см. “Растворы моющих средств для белья с высокой электропроводностью “определяют как обладающие электропроводностью от примерно 3 мСм/см до примерно 30 мСм/см, от примерно 3,5 мСм/см до примерно 20 мСм/см или даже от примерно 4 мСм/см до примерно 10 мСм/см. Подразумевают, что вышеприведенные примеры являются неограничивающими. После комбинирования мутаций для оптимизации действия в холодной воде заряд фермента также можно уравновесить с помощью мутаций в дополнительных положениях.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет выделенную, рекомбинантную, по сути чистую или не встречающуюся в природе вариантную протеазу (например, вариантный субтилизин), обладающую протеолитической активностью, причем указанная вариантная протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID №:2, не более чем по 50, не более чем по 45, не более чем по 40, не более чем по 35, не более чем по 30, не более чем по 25, не более чем по 20, не более чем по 19, не более чем по 18, не более чем по 17, не более чем по 16, не более чем по 15, не более чем по 14, не более чем по 13, не более чем по 12, не более чем по 11, не более чем по 10, не более чем по 9 или не более чем по 8 аминокислотным остаткам, где положения аминокислот пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1, как определено с помощью выравнивания аминокислотной последовательности вариантной протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению можно получить с помощью любых подходящих методик синтеза, обращения и/или выделения или их комбинаций. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению можно получить с помощью стандартных методик синтеза нуклеиновых кислот, таких как методики твердофазного синтеза, которые хорошо известны специалистам в данной области. В таких методиках, как правило, синтезируют фрагменты длиной до 50 или более нуклеотидных оснований, затем соединяют (например, с помощью способов ферментного или химического сшивания или способов с применением рекомбинации, опосредованной полимеразой) с образованием фактически любой требуемой непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты. Синтез нуклеиновых кислот по настоящему изобретению также можно облегчить (или, альтернативно, совершить) с помощью любого подходящего способа, известного из уровня техники, включая, но без ограничений, химический синтез с применением классического фосфорамидитного способа (см., например, Beaucage et al. Tetrahedron Letters 22:1859-69 [1981]); или способ, описанный у Matthes et al. (см., Matthes et al., EMBO J. 3:801-805 [1984]), который, как правило, применяют на практике в автоматических способах синтеза. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению также можно получить с применением автоматического ДНК-синтезатора. Нуклеиновые кислоты с учетом конкретных особенностей можно заказать у ряда коммерческих источников (например, The Midland Certified Reagent Company, the Great American Gene Company, Operon Technologies Inc. и DNA2.0). Другие методики синтеза нуклеиновых кислот и связанные с ними подходы известны из уровня техники (см., например, Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323 [1984]; и Itakura et al., Science 198:1056 [1984]).

Как указано выше, методики с применением рекомбинантных ДНК, пригодные в модификации нуклеиновых кислот, хорошо известны из уровня техники. Например, такие методики, как расщепление эндонуклеазами рестрикции, сшивание, обратная транскрипция и получение кДНК, и полимеразная цепная реакция (например, ПЦР) известны и легко используются специалистами в данной области. Нуклеотиды по настоящему изобретению также можно получить путем скрининга библиотек кДНК (например, библиотек кДНК, созданных с помощью методик мутагенеза, традиционно применяемых в данной области, включая описанные в настоящем изобретении) с применением одного или более олигонуклеотидных зондов, которые могут гибридизироваться с полинуклеотидами, которые кодируют полипептид(ы) вариантной протеазы по настоящему изобретению, или ПЦР-амплифицировать их. Процедуры скрининга и выделения кДНК-клонов и процедуры ПЦР-амплификации хорошо известны специалистам в данной области и описаны в стандартных справочниках, известных специалистам в данной области. Некоторые нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению можно получить путем изменения встречающегося в природе полинуклеотидного остова (например, который кодирует фермент или исходную протеазу), например, с помощью известной процедуры мутагенеза (например, сайт-направленный мутагенез, сайт-насыщающий мутагенез и рекомбинация in vitro).

Способы получения модифицированных вариантных протеаз по данному изобретению

В области техники известен ряд способов, которые подходят для получения модифицированных полинуклеотидов по настоящему изобретению, кодирующих вариантные протеазы по настоящему изобретению, включая, но без ограничений, например, сайт-насыщающий мутагенез, сканирующий мутагенез, мутагенез методом микроинъекций, делеционный мутагенез, неспецифический мутагенез, сайт-направленный мутагенез и направленная эволюция, а также различные другие рекомбинаторные подходы. Способы получения модифицированных полинуклеотидов и белков (например, вариантных протеаз) включают методики перестановки в ДНК, способы на основе негомологичной рекомбинации генов, такие как ITCHY (см. Ostermeier et al., Bioorg. Med. Chem. 7:2139-44 [1999]), SCRACHY (см. Lutz et al. 98:11248-53 [2001]), SHIPREC (см. Sieber et al., Nat. Biotechnol. 19:456-60 [2001]) и NRR (см. Bittker et al., Nat. Biotechnol. 20:1024-9 [2001]; Bittker et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 101:7011-6 [2004]), и способы, которые основаны на применении олигонуклеотидов для вставки неспецифичных и нацеленных мутаций, делеций и/или вставок (см. Ness et al., 20:1251-5 [2002]; Coco et al., Nat. Biotechnol. 20:1246-50 [2002]; Zha et al., Chembiochem. 4:34-9 [2003]; Glaser et al., J. Immune 149:3903-13 [1992]).

Векторы, клетки и способы получения вариантных протеаз по настоящему изобретению

Настоящее изобретение предоставляет выделенные или рекомбинантные векторы, включающие по меньшей мере один полинуклеотид по настоящему изобретению, описываемый в настоящем изобретении (например, полинуклеотид, кодирующий вариантную протеазу по настоящему изобретению, описываемую в настоящем изобретении), выделенные или рекомбинантные векторы экспрессии или кассеты экспрессии, включающие по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или полинуклеотид по настоящему изобретению, выделенные, по сути чистые или рекомбинантные ДНК-конструкты, включающие по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или полинуклеотид по настоящему изобретению, выделенные или рекомбинантные клетки, включающие по меньшей мере один полинуклеотид по настоящему изобретению, культуры клеток, включающие клетки, которые включают по меньшей мере один полинуклеотид по настоящему изобретению, культуры клеток, включающие по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или полинуклеотид по настоящему изобретению, и композиции, включающие один или более таких векторов, нуклеиновых кислот, векторов экспрессии, кассет экспрессии, ДНК-конструктов, клеток, культур клеток или любую их комбинацию или смеси.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет рекомбинантные клетки, включающий по меньшей мере один вектор (например, вектор экспрессии или ДНК-конструкт) настоящего изобретения, который включает по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или полинуклеотид настоящего изобретения. Некоторые такие рекомбинантные клетки трансформированы или трансфицированы по меньшей мере одним таким вектором. Такие клетки, как правило, называют клетками-хозяевами. Некоторые такие клетки включают бактериальные клетки, включая, но без ограничений, клетки Bacillus sp., такие как, клетки B. subtilis. Настоящее изобретение также предоставляет рекомбинантные клетки (например, рекомбинантные клетки-хозяева), включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет вектор, включающий нуклеиновую кислоту или полинуклеотид по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления данным вектором является вектор экспрессии или кассета экспрессии, у которых полинуклеотидная последовательность по настоящему изобретению, которая кодирует вариантную протеазу по настоящему изобретению, функционально связана с одним сегментом или дополнительными сегментами нуклеиновой кислоты, необходимыми для эффективной экспрессии гена (например, промотором, функционально связанным с полинуклеотидом по настоящему изобретению, который кодирует вариантную протеазу по настоящему изобретению). Вектор может включать терминатор транскрипции и/или ген для отбора, такой как ген устойчивости к антибиотику, который делает возможным непрерывное поддержание культуры инфицированных плазмидой клеток-хозяев путем выращивания в средах, содержащих противомикробное средство.

Вектор экспрессии может происходить от плазмидной или вирусной ДНК или, в альтернативных вариантах осуществления, содержит элементы их обеих. Иллюстративные векторы включают, но без ограничений, pXX, pC194, pJH101, pE194, pHP13 (см. Harwood and Cutting [eds.], Chapter 3, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons [1990]; подходящие реплицирующиеся плазмиды для B. subtilis включают таковые, перечисленные на странице 92; смотри также Pegero,egrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis, in Sonenshein et al., [eds.] Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics, American Society for Microbiology, Washington, D.C. [1993], pp. 615-624).

Для экспрессии и продуцирования представляющего интерес белка (например, вариантной протеазы) в клетке по меньшей мере один вектор экспрессии, включающий по меньшей мере одну копию полинуклеотида, кодирующего модифицированную протеазу, и предпочтительно включающий множество копий, трансфицируют в клетку в условиях, подходящих для экспрессии протеазы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариантную протеазу (а также другие последовательности, включенные в вектор), встраивают в геном клетки-хозяина, в то время как в других вариантах осуществления плазмидный вектор, включающий полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариантную протеазу, остается в качестве автономного внехромосомного элемента в клетке. Настоящее изобретение предоставляет как внехромосомные элементы нуклеиновой кислоты, так и входящие нуклеотидные последовательности, которые встроены в геном клетки-хозяина. Векторы, описанные в настоящем изобретении, пригодны для продуцирования вариантных протеаз по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный конструкт, кодирующий вариантную протеазу, присутствует на встраивающемся векторе, что делает возможным встраивание и, необязательно, амплификацию полинуклеотида, кодирующего вариантную протеазу, в бактериальную хромосому. Примеры сайтов для встраивания хорошо известны специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления транскрипция полинуклеотида, кодирующего вариантную протеазу по настоящему изобретению, запускается промотором, который является промотором дикого типа для выбранной протеазы-предшественника. В некоторых других вариантах осуществления промотор является гетерологичным по отношению к протеазе-предшественнику, но функционален в клетке-хозяине. В частности, примеры подходящих промоторов для применения в бактериальных клетках-хозяевах включают, но без ограничений, например, промоторы amyE, amyQ, amyL, pstS, sacB, pSPAC, pAprE, pVeg, pHpaII, промотор гена мальтогенной амилазы B. stearothermophilus, гена амилазы B. amyloliquefaciens (BAN), гена щелочной протеазы B. subtilis, гена щелочной протеазы B. clausii, гена ксилозидазы B. pumilis, cryIIIA B. thuringiensis и гена альфа-амилазы B. licheniformis. Дополнительные промоторы включают, но без ограничений, промотор A4, а также промоторы фага лямбда PR или PL и промоторы lac, trp или tac E. coli.

Вариантные протеазы по настоящему изобретению можно получать в клетках-хозяевах любого подходящего грамположительного микроорганизма, включая бактерии и грибы. Например, в некоторых вариантах осуществления вариантная протеазу получают в клетках-хозяевах грибного и/или бактериального происхождения. В некоторых вариантах осуществления клетками-хозяевами являются Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia sp. или Aspergillus sp. В некоторых вариантах осуществления вариантные протеазы продуцируются клетками-хозяевами Bacillus sp. Примерами клеток-хозяев Bacillus sp., которые находят применение в получении вариантных протеаз по настоящему изобретению, включают, но без ограничений, B. licheniformis, B. lentus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. coagulans, B. circulans, B. pumilis, B. thuringiensis, B. clausii и B. megaterium, а также другие организмы рода Bacillus. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева B. subtilis применяют для получения вариантных протеаз. Патенты США 5264366 и 4760025 (RE 34606) описывают различные штаммы-хозяева Bacillus, которые можно применять для получения вариантных протеаз по настоящему изобретению, хотя можно применять другие подходящие штаммы.

Несколько промышленных бактериальных штаммов, которые можно применять для получения вариантных протеаз по настоящему изобретению, включают нерекомбинантные (т.е. дикого типа) штаммы Bacillus sp., а также варианты встречающихся в природе штаммов и/или рекомбинантных штаммов. В некоторых вариантах осуществления штамм-хозяин представляет собой рекомбинантный штамм, где в хозяина был введен полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид. В некоторых вариантах осуществления штамм-хозяин представляет собой штамм-хозяин B. subtilis и, в частности, рекомбинантный штамм-хозяин Bacillus subtilis. Известны многочисленные штаммы B. subtilis, включая, но без ограничений, например, штамм 1A6 (ATCC 39085), 168 (1A01), SB19, W23, Ts85, B637, PB1753-PB1758, PB3360, JH642, 1A243 (ATCC 39,087), ATCC 21332, ATCC 6051, MI113, DE100 (ATCC 39,094), GX4931, PBT 110 и PEP 211 (см., например, Hoch et al., Genetics 73:215-228 [1973]; см. также патенты США №№ 4450235 и 4302544, и EP 0134048, каждый из которых включен при помощи ссылки в своем полном объеме). Применение B. subtilis в качестве клеток-хозяев для экспрессии хорошо известно в области техники (см., например, Palva et al., Gene 19:81-87 [1982]; Fahnestock and Fischer, J. Bacteriol., 165:796-804 [1986]; и Wang et al., Gene 69:39-47 [1988]).

В некоторых вариантах осуществления клеткой-хозяином Bacillus является Bacillus sp., которая включает мутацию или делецию по меньшей мере в одном из следующих генов: degU, degS, degR и degQ. Предпочтительно мутация находится в гене degU, и более предпочтительно мутацией является degU(Hy)32 (см., например, Msadek et al., J. Bacteriol. 172:824-834 [1990]; и Olmos et al., Mol. Gen. Genet. 253:562-567 [1997]). Одним подходящим штаммом-хозяином является Bacillus subtilis, несущий мутацию degU32(Hy). В некоторых вариантах осуществления хозяин Bacillus включает мутацию или делецию в scoC4 (см., например, Caldwell et al., J. Bacteriol. 183:7329-7340 [2001]); spoIIE (см., например, Arigoni et al., Mol. Microbiol. 31:1407-1415 [1999]); и/или oppA или других генах оперона opp (см., например, Perego et al., Mol. Microbiol. 5:173-185 [1991]). Действительно, предполагается, что любая мутация в опероне opp, которая обуславливает такой же фенотип, что и мутация в гене oppA, будет находить применение в некоторых вариантах осуществления измененного штамма Bacillus по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления эти мутации встречаются поодиночке, в то время как в других вариантах осуществления присутствуют комбинации мутаций. В некоторых вариантах осуществления измененным штаммом клеток-хозяев Bacillus, который можно применять для получения вариантной протеазы по настоящему изобретению, является штамм-хозяин Bacillus, который уже включает мутацию в одном или более вышеупомянутых генах. Кроме того, находят применение клетки-хозяева Bacillus sp., которые включают мутацию(и) и/или делеции эндогенных генов протеазы. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин Bacillus включает делецию генов aprE и nprE. В других вариантах осуществления клетка-хозяин Bacillus sp. включает делецию 5 генов протеазы, в то время как в других вариантах осуществления клетка-хозяин Bacillus sp. включает делецию 9 генов протеаз (см., например, заявку на патент США с номером публикации 2005/0202535, включенную в настоящее изобретении при помощи ссылки).

Клетки-хозяева трансформируют по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере одну вариантную протеазу по настоящему изобретению, с помощью любого подходящего способа, известного из уровня техники. Независимо от того, встроена ли нуклеиновая кислота в вектор или применяется без наличия плазмидной ДНК, ее, как правило, вводят в микроорганизм, в некоторых вариантах осуществления, предпочтительно в клетку E. coli или компетентную клетку Bacillus. Способы введения нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетки Bacillus или клетки E. coli с использованием плазмидных ДНК-конструктов или векторов и трансформации таких плазмидных ДНК-конструктов или векторов в такие клетки являются хорошо известными. В некоторых вариантах осуществления плазмиды затем выделяют из клеток E. coli и трансформируют в клетки Bacillus. Однако применение промежуточных микроорганизмов, таких как E. coli, не является обязательным, и в некоторых вариантах осуществления ДНК-конструкт или вектор непосредственно вводят в хозяина Bacillus.

Специалисты в данной области хорошо осведомлены о подходящих способах введения последовательностей нуклеиновых кислот или полинуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению в клетки Bacillus (см., например, Ferrari et al., “Genetics,” in Harwood et al. [eds.], Bacillus, Plenum Publishing Corp. [1989], pp. 57-72; Saunders et al., J. Bacteriol. 157:718-726 [1984]; Hoch et al., J. Bacteriol. 93:1925-1937 [1967]; Mann et al., Current Microbiol. 13:131-135 [1986]; Holubova, Folia Microbiol. 30:97 [1985]; Chang et al., Mol. Gen. Genet. 168:11-115 [1979]; Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Lett. 7:261-263 [1980]; Smith et al., Appl. Env. Microbiol. 51:634 [1986]; Fisher et al., Arch. Microbiol. 139:213-217 [1981]; и McDonald, J. Gen. Microbiol. 130:203 [1984]). Действительно, такие способы, как трансформация, включая протопластную трансформацию и конгрессию, трансдукция и слияние протопластов хорошо известны и подходят для применения в настоящем изобретении. Способы трансформации применяют для введения ДНК-конструкта или вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантную протеазу по настоящему изобретению, в клетку-хозяина. Известные в данной области способы трансформации клеток Bacillus включают такие способы, как плазмидная трансформация со спасением маркера, которая включает поглощение донорной плазмиды компетентными клетками, несущими частично гомологичную резидентную плазмиду (см. Contente et al., Plasmid 2:555-571 [1979]; Haima et al., Mol. Gen. Genet. 223:185-191 [1990]; Weinrauch et al., J. Bacteriol. 154:1077-1087 [1983]; и Weinrauch et al., J. Bacteriol. 169:1205-1211 [1987]). В данном способе входящая донорная плазмида рекомбинируется с гомологичным участком резидентной “хелперной” плазмиды в процессе, который имитирует хромосомную трансформацию.

В дополнение к традиционно применяемым способам в некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева непосредственно трансформируют ДНК-конструктом или вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантную протеазу по настоящему изобретению (т.е. не используют промежуточную клетку для амплификации, или иного процесса, ДНК-конструкта или вектора перед введением в клетку-хозяина). Введение ДНК-конструкта или вектора по настоящему изобретению в клетку-хозяина включает такие физические и химические способы, которые известны из уровня техники для введения последовательности нуклеиновой кислоты (например, последовательности ДНК) в клетку-хозяина без вставки в плазмиду или вектор. Такие способы включают, но без ограничений, осаждение при добавлении хлорида кальция, электропорацию, "голую" ДНК, липосомы и т.п. В дополнительных вариантах осуществления ДНК-конструкты или вектор совместно трансформируют с плазмидой, без вставки в плазмиду. В дополнительных вариантах осуществления селектируемый маркер удаляют из измененного штамма Bacillus при помощи способов, известных в области техники (см. Stahl et al., J. Bacteriol. 158:411-418 [1984]; и Palmeros et al., Gene 247:255-264 [2000]).

В некоторых вариантах осуществления трансформированные клетки по настоящему изобретению культивируют в традиционных питательных средах. Подходящие конкретные условия культивирования, такие как температура, pH и т.п., известны специалистам в данной области и хорошо раскрыты в научной литературе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет культуру (например, культуру клеток), включающую по меньшей мере одну вариантную протеазу или по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению Также представлены композиции, включающие по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, вектор или ДНК-конструкт по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева, трансформированные по меньшей мере одной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей по меньшей мере одну вариантную протеазу по настоящему изобретению, культивируют в подходящей питательной среде в условиях, допускающих экспрессию настоящей протеазы, после чего полученную протеазу выделяют из культуры. Среда, применяемая для культивирования клеток, включает любую традиционную среду, подходящую для выращивания клеток-хозяев, такую как минимальная или комплексная среды, содержащие соответствующие дополнения. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или их можно приготовить в соответствии с опубликованными прописями (см., например, каталоги Американской коллекции типовых культур). В некоторых вариантах осуществления протеазу, продуцируемую данными клетками, выделяют из культуральной среды при помощи традиционных процедур, включая, но без ограничений, например, отделение клеток-хозяев от среды центрифугированием или фильтрацией, осаждение белковых компонентов супернатанта или фильтрата посредством соли (например, сульфата аммония), хроматографической очистки (например, ионообмен, гель-фильтрация, аффинность и т.д.). В настоящем изобретении находит применение любой способ, подходящий для выделения или очистки вариантной протеазы.

В некоторых вариантах осуществления вариантная протеаза, продуцируемая рекомбинантной клеткой-хозяином, секретируется в культуральную среду. Для облегчения чистки растворимых белков можно применять последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует домен, облегчающий чистку. Вектор или ДНК-конструкт, включающий полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариантную протеазу, могут дополнительно включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую домен, облегчающий очистку, для облегчения очистки вариантной протеазы (см., например, Kroll et al., DNA Cell Biol. 12:441-53 [1993]). Такие домены, облегчающие очистку, включают, но без ограничений, например, металлхелатирующие пептиды, такие как модули гистидин-триптофан, которые делают возможной очистку на иммобилизированных металлах (смотри, Porath, Protein Expr. Purif. 3:263-281 [1992]), домены белка A, которые делают возможной очистку на иммобилизированном иммуноглобулине, и домен, используемый в системах очистки с FLAGS-достройкой/аффинностью (например, домены белка A, доступные от Immunex Corp., Сиэтл, Вашингтон). Для облегчения очистки также находит применение включение расщепляемой линкерной последовательности, такой как для фактора XA или энтерокиназы (например, последовательности, доступные от Invitrogen, Сан Диего, Калифорния), между доменом для очистки и гетерологичным белком.

Хорошо известны анализы для определения и измерения ферментативной активности фермента, такого как вариантная протеаза по настоящему изобретению. Рядовым специалистам в данной области также известны различные анализы для определения и измерения активности протеаз (например, вариантных протеаз по настоящему изобретению). В частности, доступны анализы для измерения активности протеазы, которые основаны на высвобождении растворимых в кислоте пептидов из казеина или гемоглобина, измеряемом в виде поглощения при 280 нм или колориметрически с помощью способа Фолина, хорошо известного специалистам в данной области. Одни иллюстративные анализы включают солюбилизацию хромогенных субстратов (см., например, Ward, “Proteinases,” in Fogarty (ed.)., Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science, London, [1983], pp. 251-317). Другие иллюстративные анализы включают, но без ограничений, анализ с применением сукцинил-Ala-Ala-Pro-Phe-паранитроанилида (suc-AAPF-pNA) и анализ с применением натриевой соли 2,4,6-тринитробензолсульфата (анализ TNBS). Многочисленные дополнительные источники, известные специалистам в данной области, приводят подходящие способы (см., например, Wells et al., Nucleic Acids Res. 11:7911-7925 [1983]; Christianson et al., Anal. Biochem. 223:119-129 [1994]; и Hsia et al., Anal Biochem. 242:221-227 [1999]).

Для определения уровня продуцирования зрелой протеазы (например, зрелых вариантных протеаз по настоящему изобретению) в клетке-хозяине можно применять ряд способов. Такие способы включают, но без ограничений, например, способы, в которых используют либо поликлональные, либо моноклональные антитела, специфичные к протеазе. Иллюстративные способы включают, но без ограничений, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммуноанализы (RIA), флуоресцентные иммуноанализы (FIA) и сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Эти и другие анализы хорошо известны в данной области техники (см., например, Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211 [1983]).

В некоторых других вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способы получения или продуцирования зрелой вариантной протеазы по настоящему изобретению. Зрелая вариантная протеаза не включает сигнальный пептид или пропептидную последовательность. Некоторые способы включают получение или продуцирование вариантной протеазы по настоящему изобретению в рекомбинантной бактериальной клетке-хозяине, такой как, например, клетка Bacillus sp. (например, клетка B. subtilis). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способ получения вариантной протеазы по настоящему изобретению, при этом способ включает культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, включающей рекомбинантный вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантную протеазу по настоящему изобретению, в условиях, благоприятствующих продуцированию вариантной протеазы. Некоторые такие способы дополнительно включают выделение вариантной протеазы из культуры.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способы получения вариантной протеазы по настоящему изобретению, при этом способы включают: (a) введение рекомбинантного вектора экспрессии, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантную протеазу по настоящему изобретению, в популяцию клеток (например, бактериальных клеток, таких как клетки B. subtilis); и (b) культивирование клеток в культуральной среде в условиях, благоприятствующих продуцированию вариантной протеазы, кодируемой вектором экспрессии. Некоторые такие способы дополнительно включают: (c) выделение вариантной протеазы из клеток или из культуральной среды.

Продукты по уходу за тканью и по уходу за домом

В некоторых вариантах осуществления варианты протеазы, в частности, варианты субтилизина, по настоящему изобретению могут быть применены в композициях, включающих вспомогательный материал и вариант протеазы, где композиция представляет собой продукт по уходу за тканью и по уходу за домом.

В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечней 1-19, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает любые из вышеуказанных выделенных вариантов субтилизина, где вариант субтилизина представляет собой вариант протеазы из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2.

В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей один вариант субтилизина протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где указанная протеаза субтилизина GG36 Bacillus lentus содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID №:2, и где указанная протеаза субтилизина GG36 Bacillus lentus представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и содержит аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Перечней 1-19, и где положения аминокислот варианта субтилизина пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают любые выделенные варианты субтилизина, перечисленные выше, общий заряд варианта составляет заряд 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых вариантах осуществления общий заряд получен путем одной или нескольких замен, выбранных из: A001E, V004E, R010H/A, Q012E, A015D, N018D, R019H/S, V026D, K027E, N043D, R045C/T/S/P, S049D, V051E, G061E, N062D/E, N076D, N077D, S078D, S087D, A098E, S101D, S106E, G115E, G118D, N123D, S128D, P129E, S130D/E, S132D, A158E, G159D/E, S160D, S166D, R170T, N183D, N184D, N185E, R186H, S188D/E, A194E, A200D, Y209E, A215D, N204D, S212D, L217D/E, N218D, A230E, K235F, N237D, K237E, N238D, S240D, N243D, Q245D, R247L, N248D/E, K251C, N263D, N269D/E, A272D, A273E, R275H/S, A001R, V004R, Q012R, P014R, H017R, N018R/K, G020K/R, T022R/K, S024R/K, G025R, D032I, D041K/L/N, N043R/K, G046R, A048R, F050R/K, P055R, S056R/K, T057R, Q059K, G061R, N076K, S078R, P086R, S087R, E089G/P/I, G097R, S099R, Q109R, G115R, G118R, S132K, S144R, G159R/K, D181C/S/T, L196K, N204K, Q206R, K235R, Q236R/K, K237R, N238R, S240R, W241R, S242R/K, V244R, Q245R/K, N248R, H249R, N252R/K, S256R, G258R, T260K, N269R/K или E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V, и где положения аминокислот варианта протеазы пронумерованы согласно нумерации соответствующих положений аминокислот в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1.

В некоторых вариантах осуществления вариант(ы) субтилизина композиций продукта для ухода за тканью и домом получены из исходной протеазы, которая является коммерчески доступной (например, SAVINASE®, POLARZYME®, KANNASE®, LIQUINASE®, LIQUINASE ULTRA®, SAVINASE ULTRA® или OVOZYME® от Novozymes A/S); MAXACAL®, PROPERASE®, PURAFECT®, FN3®, FN4® и PURAFECT OXP®, PURAFAST™, PURAFECT® PRIME или PURAMAX® от Genencor International), и из протеаз, которые доступны от Henkel/Kemira, а именно BLAP (последовательность, показанная на Фигуре 29 US 5352604 со следующими мутациями: S99D+S101R+S103A+V104I+G159S, далее в настоящем изобретении именуемая как BLAP) и BLAP X (BLAP с S3T+V4I+V205I).

В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, исходник которого обладает протеолитической активностью, где вариантная протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID №:2, не более чем по 50, не более чем по 40, не более чем по 35, не более чем по 30, не более чем по 25, не более чем по 20, не более чем по 19, не более чем по 18, не более чем по 17, не более чем по 16, не более чем по 15, не более чем по 14, не более чем по 13, не более чем по 12, не более чем по 11, не более чем по 10, не более чем по 9 или не более чем по 8 аминокислотным остаткам, где аминокислотные положения пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID №:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности вариантной протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.

Композиции для чистки и/или обработки

В некоторых вариантах осуществления товарный продукт, который содержит композицию для чистки и/или обработки, такую, как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, включает по меньшей мере один вариант протеазы, в частности, вариант субтилизина, и по меньшей мере один вспомогательный материал. В некоторых вариантах осуществления эти вспомогательные материалы включены для того, чтобы, например, способствовать или усиливать чистящую эффективность, для обработки субстрата, предназначенного для чистки, или для изменения эстетических свойств чистящей композиции, как в случае использования отдушек, окрашивающих веществ, красителей и т.п. Следует понимать, что такие вспомогательные материалы являются дополнением к вариантным протеазам по настоящему изобретению. Точная природа этих дополнительных компонентов и количественный уровень их внесения будут зависеть от физического состояния композиции и характера чистящей операции, в которой предполагается их использовать. Вспомогательные материалы для чистки и/или обработки можно выбирать из одного или нескольких из перечня, включающего, но не ограничивающегося ими, ПАВ, основной компонент, отбеливатели, активаторы отбеливания, катализаторы отбеливания, другие ферменты, системы, стабилизирующие ферменты, хелатообразующие агенты, полимеры, высвобождающие грязь, агенты переноса красителя, диспергаторы, пеногасители, красители, отдушки, окрашивающие вещества, соли-наполнители, гидротропы, фотоактиваторы, люминофоры, кондиционеры для ткани, мягчители ткани, гидролизуемые ПАВ, консерванты, антиоксиданты, противоусадочные агенты, антисминающие агенты, бактерициды, фунгициды, цветные вкрапления, средства по уходу за серебром, агенты против потускнения или коррозии, источники щелочи, агенты, способствующие растворению, носители, технологические добавки, пигменты и агенты регулирования рН, инкапсулированную форму, содержащую отдушку, оттеночное средство, поверхностно-активные вещества, модифицирующие добавки, хелатообразующие средства, средства, ингибирующие перенос красителя, диспергирующие средства, дополнительные ферменты, стабилизаторы ферментов, каталитические материалы, активаторы отбеливателя, перекись водорода, источники перекиси водорода, предварительно полученные перкислоты, полимерные диспергирующие средства, средства для удаления/средства, препятствующие вторичному осаждению глинистой грязи, оптические отбеливатели, подавители пенообразования, красители, отдушки, средства, придающие пластичность структуре, мягчители ткани, носители, гидротропы, вспомогательные вещества, растворители, пигменты и их смеси (см., например, патенты США №№ 6610642, 6605458, 5705464, 5710115, 5698504, 5695679, 5686014 и 5646101, все из которых включены в настоящее изобретение с помощью ссылки). Варианты осуществления конкретных материалов чистящих композиций проиллюстрированы детально ниже. В вариантах осуществления, в которых чистящие вспомогательные материалы не совместимы с вариантными протеазами по настоящему изобретению в чистящих композициях, в таком случае применяют подходящие способы хранения вспомогательных чистящих материалов и протеазы (протеаз) раздельно (т.е. не в контакте друг с другом) до момента, когда уместно объединение данных двух компонентов. Такие способы разделения включают любой подходящий способ, известный из уровня техники (например, желатиновые капсулы, инкапсуляция, таблетки, физическое разделение и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, включает по меньшей мере один вариант протеазы и дополнительно включает по меньшей мере одну дополнительную неиммуноэквивалентную протеазу, выбранную из субтилизинов (EC 3.4.21.62); трипсиноподобных или химотрипсиноподобных протеаз; металлопротеаз; и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, включает по меньшей мере один вариант протеазы и дополнительно включает по меньшей мере одну дополнительную неиммуноэквивалентную протеазу, выбранную из: субтилизинов (EC 3.4.21.62), полученных из B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus и B. gibsonii; трипсиновых протеаз и/или химотрипсиновых протеаз, полученных из Cellulomonas; металлопротеаз, полученных из Bacillus amyloliquefaciens; и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, включает по меньшей мере один вариант протеазы и дополнительно включает по меньшей мере один дополнительный фермент, выбранный из гемицеллюлаз, пероксидаз, протеаз, целлюлаз, целлобиозных дегидрогеназ, ксилоглюканаз, ксиланаз, липаз, фосфолипаз, эстераз, кутиназ, пектиназ, маннаназ, пектатлиаз, кератиназ, редуктаз, оксидаз, фенолоксидаз, липоксигеназ, лигниназ, пуллуланаз, танназ, пентозаназ, лихеназ, глюканаз, арабинозидаз, гиалуронидаз, хондроитиназ, лакказ, амилаз и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, включает по меньшей мере один вариант протеазы и дополнительно включает по меньшей мере один дополнительный фермент, выбранный из липаз для первого мытья; альфа-амилаз; бактериальных чистящих целлюлаз; и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, включает по меньшей мере один вариант протеазы и дополнительно включает по меньшей мере одно из следующих: инкапсулированная форма, содержащая отдушку, включающую микрокапсулу с отдушкой; оттеночное средство, включающее материал, выбранный из основных, кислотных, гидрофобных, прямых и полимерных красителей и конъюгаты с красителями с длиной волны при пиковом поглощении от 550 нм до 650 нм и их смеси; моющее поверхностно-активное вещество, включающее материал, выбранный из анионных моющих поверхностно-активных веществ, неионного моющего поверхностно-активного вещества, катионных моющих поверхностно-активных веществ, цвиттерионных моющих поверхностно-активных веществ и амфотерных моющих поверхностно-активных веществ и их смесей; модифицирующая добавка, включающая материал, выбранный из цеолитов, фосфатов и их смесей; силикатная соль, включающая материал, выбранный из силиката натрия, силиката калия и их смесей; оптический отбеливатель, включающий материал, выбранный из растворимых в холодной воле оптических отбеливателей и их смесей; карбоксилатный полимер, включающий материал, выбранный из статистического сополимера малеата/акрилата или полиакрилатного гомополимера и их смесей; грязеудаляющий полимер, включающий материал, выбранный из терефталатных сополимеров и их смесей; целлюлозный полимер, включающий материал, выбранный из алкилцеллюлозы, алкилалкоксиалкилцеллюлозы, карбоксиалкилцеллюлозы, алкилкарбоксиалкилцеллюлозы и их смесей; катализатора отбеливателя, включающего материал, выбранный из иминиевых катионов, иминиевых полиинов; иминиевых цвиттерионов; модифицированных аминов; модифицированных аминоксидов; N-сульфонилиминов; N-фосфонилиминов; N-ацилиминов; тиадиазолдиоксидов; перфториминов; кетонов циклического сахара и их смесей; активатор отбеливателя, включающий материал, выбранный из додеканоилоксибензолсульфоната, деканоилоксибензолсульфоната, деканоилоксибензойной кислоты или ее солей, 3,5,5-триметилгексаноилоксибензолсульфоната, тетраацетилэтилендиамина (TAED), нонаноилоксибензолсульфоната (NOBS) и их смесей; источник перекиси водорода, включающий материал, выбранный из неорганических пергидратных солей, включая соли щелочных металлов, такие как натриевые соли пербората (обычно моно- или тетрагидратат), перкарбоната, персульфата, перфосфата, персиликатные соли и их смеси; хелатирующее средство, включающее материал, выбранный из DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота), HEDP (гидроксиэтандифосфоновая кислота), DTPMP (диэтилентриаминпента(метиленфосфоновая кислота)), этилендиаминдиянтарной кислоты (EDDS), 1,2-дигидроксибензол-3,5-дисульфокислоты, гидрата динатриевой соли, производных указанных хелатирующих средств; и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, включает по меньшей мере один вариант протеазы, а также включает оттеночное средство для ткани, выбранное из группы, состоящей из красителей; конъюгатов краситель-глина, включающих по меньшей мере один катионно-основный краситель и сукновальную глину; и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, включает по меньшей мере один вариант протеазы, а также включает по меньшей мере одно оттеночное средство для ткани, выбранное из красителей с малыми молекулами; полимерных красителей и их смесей, необязательно, с сукновальной глиной.

В некоторых вариантах осуществления композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, включает по меньшей мере один вариант протеазы и представлена в единичных стандартных дозах или многокамерных стандартных дозах. В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой многокамерную стандартную дозу, где вариант протеазы находится в камере, отдельной от любого источника перекиси водорода и/или хелатирующего средства и/или дополнительного фермента.

В некоторых вариантах осуществления композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, включает по меньшей мере один вариант протеазы, включают один или более из следующих ингредиентов (на основе общей массы композиции): от примерно 0,0005 масс.% до примерно 0,1 масс.%, от примерно 0,001 масс.% до примерно 0,05 масс.% или даже от примерно 0,002 масс % до примерно 0,03 масс.% указанного варианта протеазы для холодной воды; и один или более из следующих: от примерно 0,00003 масс.% до примерно 0,1 масс.% оттеночного средства для ткани; от примерно 0,001 масс.% до примерно 5 масс.% капсул с отдушкой; от примерно 0,001 масс.% до примерно 1 масс.% растворимых в холодной воде оптических отбеливателей; от примерно 0,00003 масс.% до примерно 0,1 масс.% катализаторов отбеливателя; от примерно 0,00003 масс.% до примерно 0,1 масс.% липаз первичного мытья; от примерно 0,00003 масс.% до примерно 0,1 масс.% бактериальных чистящих целлюлаз; и/или от примерно 0,05 масс.% до примерно 20 масс.% неионогенных поверхностно-активных веществ Герберта.

В некоторых вариантах осуществления композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, представляет собой жидкое моющее средство для белья, моющее средство для мытья посуды.

Предполагается, что композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, предоставлена в любой подходящей форме, включая жидкую или твердую. Композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, может быть в форме мешочка со стандартной дозой, особенно, когда находится в форме жидкости, и, как правило, продукт по уходу за тканью и по уходу за домом по меньшей мере частично, или даже полностью, заключена в водорастворимый мешочек. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления композиции для чистки и/или обработки, такой как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, включающей по меньшей мере один вариант протеазы, композиция для чистки и/или обработки, такая как продукт по уходу за тканью и по уходу за домом, может иметь любую комбинацию параметров и/или характеристик, подробно описанных выше. Если не указано иное, все уровни компонентов или композиций, представленных в настоящем изобретении, даны по отношению к эффективному уровню такого компонента или композиции и не включают примеси, например, остаточные растворители или побочные продукты, которые могут присутствовать в коммерчески доступных источниках. Массы ферментных компонентов основываются на совокупном активном белке. Все процентные доли и соотношения рассчитаны от массы, если не указано иное. Все процентные доли и соотношения рассчитаны на основе совокупной композиции, если не указано иное. В иллюстративных моющих композициях уровни ферментов выражены посредством чистого фермента от массы совокупной композиции, и, если не указано иное, моющие ингредиенты выражены относительно общих масс композиций.

Чистящие композиции по настоящему изобретению преимущественно задействуют, например, в областях применения, связанных с бельем, областях применения, связанных с чисткой твердых поверхностей, мытье посуды, а также косметических применениях, таких как протезы, зубы, волосы и кожа. Дополнительно, в связи с уникальными преимуществами повышенной эффективности в низкотемпературных растворах, ферменты по настоящему изобретению идеально подходят для областей применения, связанных с бельем. Кроме того, ферменты по настоящему изобретению находят применение в гранулированных и жидких композициях.

Вариантные протеазы по настоящему изобретению также находят применение в чистящих продуктах-добавках. В некоторых вариантах осуществления находят применение в областях применения, связанных с чисткой в низкотемпературном растворе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет чистящие продукты-добавки, включающие по меньшей мере один фермент по настоящему изобретению, который идеально подходит для включения в моющий процесс при необходимости дополнительной отбеливающей эффективности. Такие примеры включают, но без ограничений, области применения, связанные с чисткой в низкотемпературном растворе. В некоторых вариантах осуществления продукт-добавка в своей простейшей форме представляет собой одну или более протеаз. В некоторых вариантах осуществления добавку упаковывают в дозированную форму для добавления в процессе чистки. В некоторых вариантах осуществления добавку упаковывают в дозированную форму для добавления в процессе чистки, где используется источник пероксигена и требуется повышенная отбеливающая эффективность. Любая подходящая форма с однократной единицей дозирования находит применение с настоящим изобретением, включая, но без ограничений, пилюли, таблетки, желатиновые капсулы или другие однократные единицы дозирования, такие как предварительно отмеренные порошки или жидкости. В некоторых вариантах осуществления включены наполнитель(и) или материал-носитель(и) для увеличения объема таких композиций. Подходящий(ие) наполнитель или материалы-носители включают, но без ограничений, различные соли из сульфата, карбоната и силиката, а также тальк, глину и т.п. Подходящий(ие) наполнитель или материалы-носители для жидких композиций включают, но без ограничений, воду или низкомолекулярные первичные и вторичные спирты, включая полиолы и диолы. Примеры таких спиртов включают, но без ограничений, метанол, этанол, пропанол и изопропанол. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат от примерно 5% до примерно 90% таких материалов. Для снижения рН находят применение кислотные наполнители. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления чистящая добавка включает вспомогательные ингредиенты, которые детальнее описаны ниже.

Настоящие чистящие композиции и чистящие добавки требуют эффективного количества по меньшей мере одного из вариантов протеазы, в частности, вариантов субтилизина, представленных в настоящем изобретении, отдельно или в комбинации с другими протеазами и/или дополнительными ферментами. Требуемый уровень фермента достигают путем добавления одного или более вариантов протеазы по настоящему изобретению. Как правило, настоящие чистящие композиции включают по меньшей мере примерно 0,0001 массовый процент, от примерно 0,0001 до примерно 10, от примерно 0,001 до примерно 1 или даже от примерно 0,01 до примерно 0,1 массового процента по меньшей мере одной из вариантных протеаз по настоящему изобретению.

Чистящие композиции в настоящем изобретении, как правило, составляют так, чтобы в ходе применения в водных чистящих операциях вода для мытья имела pH от примерно 5,0 до примерно 11,5 или даже от примерно 7,5 до примерно 10,5. Жидкие составы продукта, как правило, составляют так, чтобы они имели в чистом виде pH от примерно 3,0 до примерно 9,0 или даже от примерно 3 до примерно 5. Гранулированные продукты для белья, как правило, составляют так, чтобы они имели pH от примерно 9 до примерно 11. Методики контроля pH на рекомендуемых для применения уровнях включают применение буферов, щелочных металлов, кислот и т.д. и хорошо известны специалистам в данной области.

Подходящие “чистящие композиции с низким рН”, как правило, имеют в чистом виде pH от примерно 3 до примерно 5 и, как правило, не содержат поверхностно-активные вещества, которые гидролизуются в такой pH-среде. Такие поверхностно-активные вещества включают поверхностно-активные вещества на основе алкилсульфата натрия, которые включают по меньшей мере один этиленоксидный фрагмент или даже от примерно 1 до примерно 16 молей этиленоксида. Такие чистящие композиции, как правило, включают достаточное количество pH-модификатора, такого как гидроксид натрия, моноэтаноламин или соляная кислота, с получением такой чистящей композиции с pH в чистом виде от примерно 3 до примерно 5. Такие композиции, как правило, включают по меньшей мере один устойчивый к кислоте фермент. В некоторых вариантах осуществления композициями являются жидкости, в то время как в других вариантах осуществления они являются твердыми веществами. pH таких жидких композиций, как правило, измеряют как pH в чистом виде. pH таких твердых композиций измеряют как 10% раствор твердых веществ указанной композиции, где растворителем является дистиллированная вода. В данных вариантах осуществления все измерения pH проводят при 20°C, если не указано иное.

В некоторых вариантах осуществления при использовании вариантной протеазы (протеаз) в гранулированной композиции или жидкости желательно, чтобы вариантная протеаза была в форме инкапсулированной частицы с тем, чтобы защитить вариантную протеазу от других компонентов гранулированной композиции при хранении. Кроме того, инкапсуляция также является средством контроля доступности вариантной протеазы в ходе процесса чистки. В некоторых вариантах осуществления инкапсуляция усиливает действие вариантной протеазы (протеаз) и/или дополнительных ферментов. В связи с этим вариантные протеазы по настоящему изобретению инкапсулируют любым подходящим инкапсулирующим материалом, известным из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующий материал, как правило, инкапсулирует по меньшей мере часть катализатора для вариантной протеазы (протеаз) по настоящему изобретению. Как правило, инкапсулирующий материал является водорастворимым и/или вододиспергируемым. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующий материал имеет температуру стеклования (Tg) 0°C или выше. Температура стеклования подробнее описана в WO 97/11151. Инкапсулирующий материал, как правило, выбирают из группы, состоящей из углеводов, природных или синтетических камедей, хитина, хитозана, целлюлозы и производных целлюлозы, силикатов, фосфатов, боратов, поливинилового спирта, полиэтиленгликоля, разновидностей парафинового воска и их комбинаций. Если инкапсулирующим материалом является углевод, то его, как правило, выбирают из моносахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и их комбинаций. В некоторых типичных вариантах осуществления инкапсулирующим материалом является крахмал (см., например, EP 0922499; US 4977252; US 5354559 и US 5935826). В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующим материалом является микросфера, выполненная из пластика, как, например, термопластик, акрилонитрил, метакрилонитрил, полиакрилонитрил, полиметакрилонитрил и их смеси; коммерчески доступные микросферы, которые находят применение, включают, но без ограничений, поставляемые EXPANCEL® (Стоквиксверкен, Швеция) и PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL® и SPHERICEL® (PQ Corp., Вэлли Фордж, Пенсильвания).

Как описано в настоящем изобретении, вариантные протеазы по настоящему изобретению находят конкретное применение в индустрии чистоты, включая, но без ограничений, моющие средства для посуды и белья. Данные применения помещают ферменты в различные условия внешней нагрузки. Вариантные протеазы по настоящему изобретению обеспечивают преимущества над многими применяемыми в настоящее время ферментами благодаря своей стойкости в различных условиях.

Действительно, существует ряд условий мытья, включая различные моющие составы, объемы воды для мытья, температуры воды для мытья и длительности времени мытья, которым подвергаются протеазы, вовлеченные в мытье. Кроме того, моющие составы, применяемые в различных географических областях, имеют различные концентрации их соответствующих компонентов, присутствующих в воде для мытья. Например, европейские моющие средства, как правило, имеют примерно 4500-5000 м.д. моющих компонентов в воде для мытья, в то время как японские моющие средства, как правило, имеют примерно 667 м.д. моющих компонентов в воде для мытья. В Серверной Америке, в частности в Соединенных Штатах, моющие средства, как правило, имеют примерно 975 м.д. моющих компонентов, присутствующих в воде для мытья.

Система с низкой концентрацией моющих средств включает моющие средства, где в воде для мытья присутствует менее чем примерно 800 м.д. моющих компонентов. Японские моющие средства, как правило, считаются системой с низкой концентрацией моющих средств, поскольку они имеют примерно 667 м.д. моющих компонентов, присутствующих в воде для мытья.

Средняя концентрация моющих средств включает моющие средства, где в воде для мытья присутствуют от примерно 800 м.д. до примерно 2000 м.д. моющих компонентов. Североамериканские моющие средства обычно рассматривают как системы со средней концентрацией моющих средств, поскольку они имеют примерно 975 м.д. моющих компонентов, присутствующих в воде для мытья. Бразильские, как правило, имеют примерно 1500 м.д. моющих компонентов, присутствующих в воде для мытья.

Система с высокой концентрацией моющих средств включает моющие средства, где в воде для мытья присутствуют более чем примерно 2000 м.д. моющих компонентов. Европейские моющие средства обычно рассматривают как системы с высокой концентрацией моющих средств, поскольку они имеют примерно 4500-5000 м.д. моющих компонентов в воде для мытья.

Латиноамериканские моющие средства в целом представляют собой моющие средства с высоким содержанием фосфатных модифицирующих добавок для пенообразования, и диапазон моющих средств, применяемых в Латинской Америке, может охватывать как средние, так и высокие концентрации моющих средств, поскольку они варьируют от 1500 м.д. до 6000 м.д. моющих компонентов в воде для мытья. Как упомянуто выше, бразильское средство, как правило, имеет примерно 1500 м.д. моющих компонентов, присутствующих в воде для мытья. Однако в других регионах моющих средств с высоким содержанием фосфатных модифицирующих добавок для пенообразования, не ограничиваясь другими странами Латинской Америки, могут быть системы с высокой концентрацией моющих средств с до примерно 6000 м.д. моющих компонентов, присутствующих в воде для мытья.

В свете вышесказанного, очевидно, что концентрации моющих композиций в типичных растворах для мытья по всему миру варьируют от менее чем примерно 800 м.д. моющей композиции ("регионы с низкой концентрацией моющих средств"), например, примерно 667 м.д. в Японии, до примерно 800 м.д. - примерно 2000 м.д. ("регионы со средней концентрацией моющих средств"), например, примерно 975 м.д. в США и примерно 1500 м.д. в Бразилии, до более чем примерно 2000 м.д. ("регионы с высокой концентрацией моющих средств"), например, примерно 4500 м.д. - примерно 5000 м.д. в Европе и примерно 6000 м.д. в регионах с высоким содержанием фосфатных модифицирующих добавок для пенообразования.

Концентрации типичных растворов для мытья определяют эмпирически. Например, в США, типичные моющие машины удерживают объем примерно 64,4 л моющего раствора. Соответственно, для того, чтобы получить концентрацию примерно 975 м.д. моющего средства в растворе для мытья, нужно добавить примерно 62,79 г моющей композиции к 64,4 л раствора для мытья. Данное количество является типичным количеством, отмеряемым в воду для мытья потребителем при помощи мерного стаканчика, поставляемого с моющим средством.

В качестве дополнительного примера можно привести то, что в различных регионах используют различные температуры для мытья. Температура воды для мытья в Японии, как правило, ниже температуры, используемой в Европе. Например, температура воды для мытья в Северной Америке и Японии составляет, как правило, от примерно 10 до примерно 30°C (например, примерно 20°C), в то время как температура воды для мытья в Европе составляет, как правило, от примерно 30 до примерно 60°C (например, примерно 40°C). Однако, в интересах сбережения энергии, многие потребители переключаются на использование мытья в холодной воде. Кроме того, в некоторых более отдаленных странах холодную воду, как правило, применяют для белья, а также применений, связанных с мытьем посуды. В некоторых вариантах осуществления при “мытье в холодной воде” по настоящему изобретению˚ используют “моющее средство для мытья в холодной воде”, подходящее для мытья при температурах от примерно 10°C до примерно 40°C, или от примерно 20°C до примерно 30°C, или от примерно 15°C до примерно 25°C, а также всех других комбинаций в пределах диапазона от примерно 15°C до примерно 35°C и всех диапазонах в пределах 10°C-40°C.

В качестве дополнительного примера можно привести то, что в различных регионах, как правило, разная жесткость воды. Жесткость воды, как правило, описывают на основании гран на галлон смешанных Ca2+/Mg2+. Жесткость представляет собой меру количества кальция (Ca2+) и магния (Mg2+) в воде. Большая часть воды в Соединенных Штатах является жесткой, но степень жесткости воды варьируется. Умеренно жесткая (60-120 м.д.) - жесткая (121-181 м.д.) вода имеет от 60 до 181 миллионных долей (миллионных долей, преобразованные в гран на галлон США, представляют собой количество м.д., деленное на 17,1, равно гран на галлон) минералов жесткости.

Вода Гран на галлон Миллионные доли
Мягкая менее 1,0 менее 17
Слегка жесткая 1,0-3,5 17-60
Умеренно жесткая 3,5-7,0 60-120
Жесткая 7,0-10,5 120-180
Очень жесткая более 10,5 более 180

Жесткость европейской воды, как правило, составляет более чем примерно 10,5 (например, от примерно 10,5 до примерно 20,0) гран на галлон смешанных Ca2+/Mg2+ (например, примерно 15 гран на галлон смешанных Ca2+/Mg2+). Жесткость североамериканской воды, как правило, больше жесткости японской воды, но меньше жесткости европейской воды. Например, жесткость североамериканской воды может составлять от примерно 3 до примерно 10 гран, от примерно 3 до примерно 8 гран или примерно 6 гран. Жесткость японской воды, как правило, ниже жесткости североамериканской воды, обычно менее чем примерно 4, например, примерно 3 грана на галлон смешанных Ca2+/Mg2+.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет вариантные протеазы, которые демонстрируют неожиданное моющее действие по меньшей мере в одной группе условий мытья (например, температура воды, жесткость воды и/или концентрация моющего средства). В некоторых вариантах осуществления вариантные протеазы по настоящему изобретению сравнимы в моющем действии с другими субтилизиновыми протеазами. В некоторых вариантах осуществления вариантные протеазы по настоящему изобретению проявляют усиленное моющее действие по сравнению с субтилизиновыми протеазами, коммерчески доступными в настоящий момент. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариантные протеазы, представленные в настоящем изобретении, проявляют усиленную стойкость к окислению, усиленную термическую стойкость, усиленные чистящие свойства в различных условиях и/или усиленную стойкость комплексонов. Кроме того, вариантные протеазы по настоящему изобретению находят применение в чистящих композициях, которые не включают моющие средства, опять-таки либо отдельно, либо в комбинации с модифицирующими добавками и стабилизаторами.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения чистящие композиции включают по меньшей мере одну вариантную протеазу по настоящему изобретению на уровне от примерно 0,00001% до примерно 10% от массы композиции, и при этом остальная часть (например, от примерно 99,999% до примерно 90,0%) включает вспомогательные чистящие материалы от массы композиции. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению включают по меньшей мере одну вариантную протеазу на уровне от примерно 0,0001% до примерно 10%, от примерно 0,001% до примерно 5%, от примерно 0,001% до примерно 2%, от примерно 0,005% до примерно 0,5% от массы композиции, и при этом остальная часть чистящей композиции (например, от примерно 99,9999% до примерно 90,0%, от примерно 99,999% до примерно 98%, от примерно 99,995% до примерно 99,5% по массе) включает вспомогательные чистящие материалы.

В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции по настоящему изобретению включают один или более дополнительных моющих ферментов, которые обеспечивают преимущества чистящего действия, и/или ухода за тканью, и/или мытья посуды. Примеры подходящих ферментов включают, но без ограничений, гемицеллюлазы, целлюлазы, пероксидазы, протеазы, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, эстеразы, кутиназы, пектиназы, пектатлиазы, маннаназы, кератиназы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, липоксигеназы, лигниназы, пуллуланазы, танназы, пентозаназы, маланазы, β-глюканазы, арабинозидазы, гиалуронидазы, хондроитиназы, лакказы и амилазы, или любые их комбинации или смеси. В некоторых вариантах осуществления применяют комбинацию ферментов (т.е. “коктейль”), включающую традиционные применяемые ферменты, например, протеазу, липазу, кутиназу и/или целлюлазу применяют совместно с амилазой.

В дополнение к вариантам протеазы, в частности вариантам субтилизина, представленным в настоящем изобретении, в композициях по настоящему изобретению находит применение любая другая подходящая протеаза. Подходящие протеазы включают протеазы животного, растительного или микробного происхождения. В некоторых вариантах осуществления применяют микробные протеазы. В некоторых вариантах осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. В некоторых вариантах осуществления протеазой является сериновая протеаза, предпочтительно микробная щелочная протеаза или трипсин-подобная протеаза. Примеры щелочных протеаз включают субтилизины, особенно субтилизины, происходящие от Bacillus (например, субтилизин, lentus, amyloliquefaciens, субтилизин Carlsberg, субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168). Дополнительные примеры включают те мутантные протеазы, которые описаны в патентах США №№ RE 34606, 5955340, 5700676, 6312936 и 6482628, все из которых включены в настоящее изобретение с помощью ссылки. Дополнительные примеры протеаз включают, но без ограничений, трипсин (например, свиного или бычьего происхождения) и протеазу Fusarium, описанную в WO 89/06270. В некоторых вариантах осуществления коммерчески доступные ферменты протеаз, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, но без ограничений, MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT® OXP, PURAMAX™, EXCELLASE™ и PURAFAST™ (Genencor); ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, POLARZYME®, OVOZYME®, KANNASE®, LIQUANASE®, NEUTRASE®, RELASE® и ESPERASE® (Novozymes); BLAP™ и варианты BLAP™ (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Дюссельдорф, Германия), и KAP (субтилизин B. alkalophilus; Kao Corp., Токио, Япония). Различные протеазы описаны в WO95/23221, WO 92/21760, публикации патента США № 2008/0090747, и патентах США №№ 5801039, 5340735, 5500364, 5855625, US RE 34606, 5955340, 5700676, 6312936 и 6482628, и различных других патентах. В некоторых дополнительных вариантах осуществления в настоящем изобретении находят применение металлопротеазы, включая, но без ограничений, нейтральную металлопротеазу, описанную в WO 07/044993.

Кроме того, в настоящем изобретении находит применение любая подходящая липаза. Подходящие липазы включают, но без ограничений, липазы бактериального или грибного происхождения. Настоящим изобретением охватываются химически или генетически модифицированные мутанты. Примеры пригодных липаз включают липазу Humicola lanuginosa (см., например, EP 258068 и EP 305216), липазу Rhizomucor miehei (см., например, EP 238023), липазу Candida, такую как липазу C. antarctica (например, липазу A или B C. antarctica; см., например, EP 214761), липазы Pseudomonas, такие как липаза P. alcaligenes и липаза P. pseudoalcaligenes (см., например, EP 218272), липаза P. cepacia (см., например, EP 331376), липаза P. stutzeri (см., например, GB 1372034), липаза P. fluorescens, липазу Bacillus (например, липаза B. subtilis [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); липазу B. stearothermophilus [см., например, JP 64/744992]; и липазу B. pumilus [см., например, WO 91/16422]).

Кроме того, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения находят применение ряд клонированных липаз, включая, но без ограничений, липазу Penicillium camembertii (см. Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 [1991]), липазу Geotricum candidum (см. Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388 [1989]) и различные липазы Rhizopus, такие как липаза R. delemar (см. Hass et al., Gene 109:117-113 [1991]), липаза R. niveus (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) и липаза R. oryzae.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также находят применение другие типы липолитических ферментов, такие как кутиназы, включая, но без ограничений, кутиназу, происходящую от Pseudomonas mendocina (см., WO 88/09367), и кутиназу, происходящую от Fusarium solani pisi (см. WO 90/09446).

Дополнительные подходящие липазы включают коммерчески доступные липазы, такие как M1 LIPASE™, LUMA FAST™ и LIPOMAX™ (Genencor); LIPEX®, LIPOLASE® и LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); и LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Япония).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению дополнительно включают липазы на уровне от примерно 0,00001% до примерно 10% дополнительной липазы от массы композиции и остальную часть вспомогательных чистящих материалов от массы композиции. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению также включают липазы на уровне от примерно 0,0001% до примерно 10%, от примерно 0,001% до примерно 5%, от примерно 0,001% до примерно 2%, от примерно 0,005% до примерно 0,5% липазы от массы композиции.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения любая подходящая амилаза находит применение в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления также находит применение любая амилаза (например, альфа и/или бета), подходящая для применения в щелочных растворах. Подходящие амилазы включают, но без ограничений, амилазы бактериального или грибного происхождения. В некоторых вариантах осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. Амилазы, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, но без ограничений, α-амилазы, полученные от B. licheniformis (см., например, GB 1296839). Коммерчески доступные амилазы, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, но без ограничений, DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME ULTRA® и BAN™ (Novozymes), а также POWERASE™, RAPIDASE® и MAXAMYL® P (Genencor).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению дополнительно включают амилазы на уровне от примерно 0,00001% до примерно 10% дополнительной амилазы от массы композиции и остальную часть из вспомогательных чистящих материалов от массы композиции. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению также включают амилазы на уровне от примерно 0,0001% до примерно 10%, от примерно 0,001% до примерно 5%, от примерно 0,001% до примерно 2%, от примерно 0,005% до примерно 0,5% амилазы от массы композиции.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления в чистящих композициях по настоящему изобретению находит применение любая подходящая целлюлаза. Подходящие целлюлазы включают, но без ограничений, целлюлазы бактериального или грибного происхождения. В некоторых вариантах осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. Подходящие целлюлазы включают, но без ограничений, целлюлазы Humicola insolens (см., например, патент США № 4435307). Особенно подходящими целлюлазами являются целлюлазы с преимуществом ухода за цветом (см., например, EP 0495257). Коммерчески доступные целлюлазы, которые находят применение в настоящем, включают, но без ограничений, CELLUZYME®, CAREZYME® (Novozymes) и KAC-500(B)™ (Kao Corporation). В некоторых вариантах осуществления целлюлазы включены в качестве сегментов или фрагментов зрелой целлюлазы дикого типа или вариантных целлюлаз, у которых удален сегмент N-конца (см., например, патент США № 5874276). В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции по настоящему изобретению дополнительно включают целлюлазы на уровне от примерно 0,00001% до примерно 10% дополнительной целлюлазы от массы композиции и остальную часть из вспомогательных чистящих материалов от массы композиции. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению также включают целлюлазы на уровне от примерно 0,0001% до примерно 10%, от примерно 0,001% до примерно 5%, от примерно 0,001% до примерно 2%, от примерно 0,005% до примерно 0,5% целлюлазы от массы композиции.

В настоящем изобретении также находит применение любая маннаназа, подходящая для применения в моющих композициях. Подходящие маннаназы включают, но без ограничений, маннаназы бактериального или грибкового происхождения. В некоторых вариантах осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. Известны различные маннаназы, которые находят применение в настоящем изобретении (см., например, патент США № 6566114, патент США № 6602842 и патент США № 6440991, все из которых включены в настоящее изобретение с помощью ссылки). В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции по настоящему изобретению дополнительно включают маннаназы на уровне от примерно 0,00001% до примерно 10% дополнительной маннаназы от массы композиции и остальную часть из вспомогательных чистящих материалов от массы композиции. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению также включают маннаназы на уровне от примерно 0,0001% до примерно 10%, от примерно 0,001% до примерно 5%, от примерно 0,001% до примерно 2%, от примерно 0,005% до примерно 0,5% маннаназы от массы композиции.

В некоторых вариантах осуществления пероксидазы применяют в комбинации с перекисью водорода или ее источником (например, перкарбонатом, перборатом или персульфатом) в композициях по настоящему изобретению. В некоторых альтернативных вариантах осуществления оксидазы применяют в комбинации с кислородом. Оба типа ферментов применяют для "отбеливания в растворе" (т.е. для предупреждения переноса тканевого красителя с окрашенной ткани на другую ткань при мытье тканей вместе в моющем растворе), предпочтительно вместе с усиливающим средством (см., например, WO 94/12621 и WO 95/01426). Подходящие пероксидазы/оксидазы включают, но без ограничений, таковые растительного, бактериального или грибного происхождения. В некоторых вариантах осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции по настоящему изобретению дополнительно включают пероксидазные и/или оксидазные ферменты на уровне от примерно 0,00001% до примерно 10% дополнительной пероксидазы и/или оксидазы от массы композиции и остальную часть из вспомогательных чистящих материалов от массы композиции. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению также включают пероксидазные и/или оксидазные ферменты на уровне от примерно 0,0001% до примерно 10%, от примерно 0,001% до примерно 5%, от примерно 0,001% до примерно 2%, от примерно 0,005% до примерно 0,5% пероксидазных и/или оксидазных ферментов от массы композиции.

В некоторых вариантах осуществления находят применение дополнительные ферменты, включая, но без ограничений, пергидролазы (см., например, WO 05/056782). Кроме того, в некоторых вариантах осуществления в данном изобретении охвачены смеси вышеупомянутых ферментов, в частности, одна или более дополнительных протеаз, амилаз, липаз, маннаназ и/или по меньшей мере одна целлюлаза. Действительно, подразумевается, что в настоящем изобретении найдут применение различные смеси. Также подразумевается, что варьирующие уровни как вариантной протеазы (протеаз), так и одного или более дополнительных ферментов могут независимо изменяться в диапазоне до примерно 10%, при этом остальной частью чистящей композиции являются вспомогательные материалы. Конкретный выбор вспомогательных чистящих материалов легко осуществить, принимая во внимание поверхность, предмет или ткань, подлежащие чистке, и требуемую при применении форму композиции для условий чистки (например, путем применения моющего средства для мытья).

В некоторых вариантах осуществления эффективное количество одной вариантной протеазы или более вариантных протеаз, представленных в настоящем изобретении, включено в композиции, пригодные для чистки ряда поверхностей, нуждающихся в удалении белкового загрязнения. Такие чистящие композиции включают чистящие композиции для таких применений, как чистка твердых поверхностей, тканей и посуды. Действительно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет чистящие композиции для тканей, в то время как в других вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет чистящие композиции для материалов, отличных от тканей. В особенности, настоящее изобретение также предоставляет чистящие композиции, подходящие для личной гигиены, включая гигиену полости рта (включая средства для чистки зубов, зубные пасты, ополаскиватели для рта и т.д., а также чистящие композиции для зубов и полости рта), чистящие композиции для кожи и волос. Подразумевается, что настоящее изобретение охватывает моющие композиции в любой форме (т.е. жидкая, гранулированная, брусковая, полутвердая, гели, эмульсии, таблетки, капсулы и т.д.).

Как пример, несколько чистящих композиций, где находят применение вариантные протеазы по настоящему изобретению, описаны более детально ниже. В некоторых вариантах осуществления, в которых чистящие композиции по настоящему изобретению составлены в виде композиций, пригодных для применения в способе(ах) мытья в стиральной машине, композиции по настоящему изобретению предпочтительно содержат по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество и по меньшей мере одно соединение - модифицирующую добавку, а также один или более вспомогательных чистящих материалов, предпочтительно выбранных из органических полимерных соединений, отбеливающих средств, дополнительных ферментов, подавителей пенообразования, диспергирующих средств, кальциевых мыльных диспергирующих средств, средств, суспендирующих грязь и препятствующих ее повторному осаждению, и ингибиторов коррозии. В некоторых вариантах осуществления композиции для белья также содержат мягчители (т.е. в качестве дополнительных вспомогательных чистящих материалов). В композициях по настоящему изобретению также находят применение моющие продукты-добавки в твердой или жидкой форме. Такие продукты-добавки предназначены для дополнения и/или усиления действия традиционных моющих композиций, и их можно добавлять на любой стадии процесса чистки. В некоторых вариантах осуществления плотность моющих композиций для белья в настоящем изобретении варьирует от примерно 400 до примерно 1200 г/литр, в то время как в других вариантах осуществления она варьирует в диапазоне от примерно 500 до примерно 950 г/литр композиции, измеряемой при 20°C.

В вариантах осуществления, составленных в виде композиций для применения в способах мытья посуды вручную, композиции по настоящему изобретению предпочтительно содержат по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество и предпочтительно по меньшей мере один дополнительный вспомогательный чистящий материал, выбранный из органических полимерных соединений, средств, усиливающих пенообразование, ионов металлов II группы, растворителей, гидротропов и дополнительных ферментов.

В некоторых вариантах осуществления различные чистящие композиции, такие как представленные в патенте США № 6605458, находят применение с вариантными протеазами по настоящему изобретению. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиции, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу по настоящему изобретению, представляют собой плотную гранулированную чистящую композицию для ткани, в то время как в других вариантах осуществления композиция представляет собой гранулированную чистящую композицию для ткани, пригодную при стирке окрашенных тканей, в дополнительных вариантах осуществления композиция представляет собой гранулированную чистящую композицию для тканей, которая обеспечивает мягкость благодаря моющей способности, в дополнительных вариантах осуществления данная композиция является жидкой чистящей композицией с высокой моющей способностью для ткани. В некоторых вариантах осуществления композиции, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу по настоящему изобретению, представляют собой чистящие композиции для тканей, такие как те, что описаны в патентах США №№ 6610642 и 6376450. Кроме того, вариантные протеазы по настоящему изобретению находят применение в гранулированных моющих композициях для белья с особой полезностью в европейских или японских условиях мытья (см., например, патент США № 6610642).

В некоторых альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет чистящие композиции для твердых поверхностей, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу, представленную в настоящем изобретении. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиции, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу по настоящему изобретению, представляют собой чистящую композицию для твердых поверхностей, такие как те, что описаны в патентах США №№ 6610642, 6376450 и 6376450.

В еще дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет композиции для мытья посуды, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу, представленную в настоящем изобретении. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиции, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу по настоящему изобретению, представляют собой чистящую композицию для твердых поверхностей, такие как те, которые в патентах США №№ 6610642 и 6376450. В еще одних некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет композиции для мытья посуды, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу, представленную в настоящем изобретении. В некоторых дополнительных вариантах осуществления композиции, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу по настоящему изобретению, включают композиции для гигиены полости рта, такие как те, которые в патентах США № 6376450 и 6376450. Составы и описания содержащихся соединений и вспомогательных чистящих материалов в вышеупомянутых патентах США №№ 6376450, 6605458, 6605458 и 6610642 находят применение с вариантными протеазами, представленными в настоящем изобретении.

Чистящие композиции по настоящему изобретению составляют в любую подходящую форму и готовят с помощью любого способа, выбираемого специалистом, занимающимся составлением, неограничивающие примеры чего описаны в патентах США №№ 5879584, 5691297, 5574005, 5569645, 5565422, 5516448, 5489392 и 5486303, все из которых включены в настоящее изобретение с помощью ссылки. Если необходима чистящая композиция с низким рН, то pH такой композиции доводят путем добавления такого материала, как моноэтаноламин, или кислотного материала, такого как HCl.

Чистящие композиции, раскрытые в настоящем изобретении, находят применение при чистке места действия (например, поверхности, предмета столовой посуды или ткани). Как правило, по меньшей мере, сегмент места действия приводят в контакт с вариантом осуществления настоящей чистящей композиции, в чистой форме или разведенной в моющем растворе, и затем место действия необязательно моют и/или ополаскивают. Для целей настоящего изобретения “мытье” включает, но без ограничений, промывание и механическое перемешивание. В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции, как правило, используют в концентрациях от примерно 500 м.д. до примерно 15000 м.д. в растворе. Если растворителем для мытья является вода, то температура воды, как правило, варьирует в диапазоне от примерно 5°C до примерно 90°C, и, если место действия включает ткань, то массовое соотношение воды к ткани, как правило, составляет от примерно 1:1 до примерно 30:1.

Более подробно вспомогательные материалы, пригодные для чистки и/или обработки, описаны ниже.

Оттеночные средства для ткани

Несмотря на то, что включение дополнительных оттеночных красителей для ткани не является предпочтительным, в дополнение к тиофеновому азокрасителю композиция может содержать один или несколько дополнительных оттеночных средств для ткани. Пригодные оттеночные средства для ткани включают красители, коньюгаты краситель-глина и пигменты. Пригодные красители включают те, которые осаждаются в большей степени на хлопчатобумажных тканях по сравнению с осаждением на синтетических тканях, таких как полиэфир и/или нейлон. Дополнительные пригодные красители включают те, которые осаждаются в большей степени на синтетических волокнах, таких как полиэфир и/или нейлон, по сравнению с хлопчатобумажными. Пригодные красители включают красители с малыми молекулами и полимерные красители. Пригодные красители с малыми молекулами включают красители с малыми молекулами, выбранные из группы, состоящей из красителей, подпадающих под классификации Указателя красителей (Colour Index - C.I.) прямой синий, прямой красный, прямой фиолетовый, кислотный синий, кислотный красный, кислотный фиолетовый, основный синий, основный фиолетовый и основный красный или их смеси. Примеры красителей с малыми молекулами включают выбранные из группы, состоящей из номеров по Указателю красителей (Society of Dyers and Colourists, Брэдфорд, Великобритания) прямой фиолетовый 9, прямой фиолетовый 35, прямой фиолетовый 48, прямой фиолетовый 51, прямой фиолетовый 66, прямой фиолетовый 99, прямой синий 1, прямой синий 71, прямой синий 80, прямой синий 279, кислотный красный 17, кислотный красный 73, кислотный красный 88, кислотный красный 150, кислотный фиолетовый 15, кислотный фиолетовый 17, кислотный фиолетовый 24, кислотный фиолетовый 43, кислотный красный 52, кислотный фиолетовый 49, кислотный фиолетовый 50, кислотный синий 15, кислотный синий 17, кислотный синий 25, кислотный синий 29, кислотный синий 40, кислотный синий 45, кислотный синий 75, кислотный синий 80, кислотный синий 83, кислотный синий 90 и кислотный синий 113, кислотный черный 1, основный фиолетовый 1, основный фиолетовый 3, основный фиолетовый 4, основный фиолетовый 10, основный фиолетовый 35, основный синий 3, основный синий 16, основный синий 22, основный синий 47, основный синий 66, основный синий 75, основный синий 159, красителей с малыми молекулами, которые включают выбранные из группы, состоящей из номеров по Указателю красителей (Society of Dyers and Colourists, Брэдфорд, Великобритания) кислотный фиолетовый 17, кислотный фиолетовый 43, кислотный красный 52, кислотный красный 73, кислотный красный 88, кислотный красный 150, кислотный синий 25, кислотный синий 29, кислотный синий 45, кислотный синий 113, кислотный черный 1, прямой синий 1, прямой синий 71. Прямые фиолетовые красители с малыми молекулами могут быть предпочтительными. Красители, выбранные из группы, содержащей кислотный фиолетовый 17, прямой синий 71, прямой фиолетовый 51, прямой синий 1, кислотный красный 88, кислотный красный 150, кислотный синий 29, кислотный синий 113 и их смеси, могут быть предпочтительными.

Пригодные полимерные красители включают полимерные красители из группы, включающей полимеры, содержащие ковалентно связанные хромогены (коньюгаты краситель-полимер) и полимеры с хромогенами, сополимеризованные с образованием основной цепи полимера и их смесей, а также полимерные красители, выбранные из группы, включающей физические красители, продаваемые под названием Liquitint® (Milliken, Spartanburg, Южная Калифорния, США), коньюгаты краситель-полимер, сформированные из по меньшей мере одного активного красителя и полимера, выбранного из группы, состоящей из полимеров, содержащих фрагмент, выбранный из группы, состоящей из гидроксильного фрагмента, первичного аминного фрагмента, вторичного аминного фрагмента, тиольного фрагмента и их смесей. В еще одном аспекте пригодные полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из фиолетоовго СТ марки Liquitint® (Milliken, Spartanburg, Южная Калифорния, США), карбоксиметилцеллюлозы (СМС), коньюгированной с активным синим, активным фиолетовым или активным красным красителями, такими как СМС, коньюгированной с C.I. активным синим 19, продаваемым компанией Megazyme, Виклоу, Ирландия под названием продукта AZO-CM-CELLULOSE, код продукта S-ACMC, алкоксилированные трифенилметановые полимерные красители, алкоксилированные тиофеновые полимерные красители и их смеси. Предпочтительные дополнительные оттеночные красители включают отбеливающие агенты, которые можно найти в патенте WO 08/87497 A1. Эти оттеночные средства могут характеризоваться следующей структурой (I):

,

где R1 и R2 можно независимо выбирать из:

a) [(CH2CR'HO)x(CH2CR"HO)yH], где R' выбран из группы, состоящей из H, CH3, CH2O(CH2CH2O)zH и их смесей; где R” выбран из группы, состоящей из H, CH2O(CH2CH2O)zH, и их смесей; где x+y5; где y≥1; и где z=0-5;

b) R1 = алкил, арил или арилалкил, и R2 = [(CH2CR'HO)x(CH2CR"HO)yH],

где R' выбран из группы, состоящей из H, CH3, CH2O(CH2CH2O)zH и их смесей; где R” выбран из группы, состоящей из H, CH2O(CH2CH2O)zH и их смесей; где x+y≤10; где y≥1; и где z=0-5;

c) R1 = [CH2CH (OR3)CH2OR4], и R2 = [CH2CH (O R3)CH2O R4],

где R3 выбран из группы, состоящей из H, (CH2CH2O)zH и их смесей; и где z=0-10;

где R4 выбран из группы, состоящей из (C1-C16)алкила, группы арила и их смесей; и

d) где R1 и R2 можно независимо выбирать из продукта присоединения аминогруппы к стиролоксиду, глицидил метиловому эфиру, изобутил глицидиловому эфиру, изопропил глицидиловому эфиру, трет-бутилглицидиловому эфиру, 2-этилгексил глицидиловому эфиру и глицидил гексадециловому эфиру с последующим присоединением от 1 до 10 звеньев алкиленоксида.

Предпочтительное дополнительное оттеночное средство, которое может быть включено в композиции по данному изобретению, может характеризоваться следующей структурой (II):

,

где R' выбран из группы, состоящей из H, CH3, CH2O(CH2CH2O)zH и их смесей; где R” выбран из группы, состоящей из H, CH2O(CH2CH2O)zH и их смесей; где x+y5; где y≥1; и где z=0-5.

Еще одно предпочтительное дополнительное оттеночное средство, которое может быть включено в композиции по данному изобретению, может характеризоваться следующей структурой (III):

.

Этот краситель обычно представляет собой смесь соединений, имеющих в среднем 3-10 ЭО звеньев, предпочтительно 5 ЭО звеньев в каждой молекуле.

Еще дополнительными оттеночными красителями являются красители, описанные в USPN 2008 34511 A1 (Unilever). Предпочтительным средством является “Solvent Violet 13”.

Пригодные коньюгаты краситель-глина включают коньюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из по меньшей мере одного катионного/основного красителя и сукновальной глины и их смесей. В другом аспекте пригодные коньюгаты краситель-глина включают коньюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из C.I. основного желтого 1-108, C.I. основного оранжевого 1-69, C.I. основного красного 1-118, C.I. основного фиолетового 1-51, C.I. основного синего 1-164, C.I. основного зеленого 1-14, C.I. основного коричневого 1-23, C.I. основного черного 1-11, и глины, выбранной из группы, состоящей из монтмориллонитовой глины, гекторитовой глины, сапонитовой глины и их смесей. В еще одном аспекте пригодные коньюгаты краситель-глина включают коньюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из: коньюгата монтмориллонит-основный синий B7 C.I. 42595, коньюгата монтмориллонит-основный синий B9 C.I. 52015, коньюгата монтмориллонит-основный фиолетовый V3 C.I. 42555, коньюгата монтмориллонит-основный зеленый G1 C.I. 42040, коньюгата монтмориллонит-основный красный R1 C.I. 45160, коньюгата монтмориллонит-C.I. основный черный 2, коньюгата гекторит-основный синий B7 C.I. 42595, коньюгата гекторит-основный синий B9 C.I. 52015, коньюгата гекторит-основный фиолетовый V3 C.I. 42555, коньюгата гекторит-основный зеленый G1 C.I. 42040, коньюгата гекторит-основный красный R1 C.I. 45160, гекторит- C.I. основный черный 2, коньюгата сапонит-основный черный B7 C.I. 42595, коньюгата сапонит-основный синий B9 C.I. 52015, коньюгата сапонит-основный фиолетовый V3 C.I. 42555, коньюгата сапонит-основный зеленый G1 C.I. 42040, коньюгата сапонит-основный красный R1 C.I. 45160, коньюгата сапонит-C.I. основный черный 2 и их смесей.

Пригодные пигменты включают пигменты, выбранные из группы, состоящей из флавантрона, индантрона, хлорированного индантрона, содержащего от 1 до 4 атомов хлора, пирантрона, дихлор-пирантрона, монобром-дихлор-пирантрона, дибром-дихлор-пирантрона, тетрабром-пирантрона, диимида перилин-3,4,9,10-тетракарбоновой кислоты, где имидные группы могут быть незамещенными или замещены на C1-C3-алкил, или фенил, или гетероциклический радикал, и где фенильный и гетероциклический радикалы могут дополнительно содержать в себе заместители, которые не способствуют растворимости в воде, амидов антрапиримидинкарбоновой кислоты, виолантрона, изовиолантрона, диоксазина, диоксазиновых пигментов, медь-фталоцианина, который может содержать вплоть до 2 атомов хлора в каждой молекуле, полихлорированного медь-фталоцианина или полибромхлорированного медь-фталоцианина, содержащего вплоть до 14 атомов брома в каждой молекуле, и их смесей. Особенно предпочтительными являются пигменты синий 15-20, особенно пигмент синий 15 и/или 16. Другие пригодные пигменты включают те, которые выбраны из группы, состоящей из ультрамаринового синего (C.I. Pigment Blue 29), ультрамаринового фиолетового (C.I. Pigment Blue 15) и их смесей. Пригодные оттеночные красители более подробно описаны в патенте US 7208459 B2.

Инкапсулированные формы. Композиция может включать инкапсулированную форму. В одном аспекте инкапсулированная форма включает сердцевину, оболочку, имеющую внутреннюю и внешнюю поверхности, причем указанная оболочка заключает в себе сердцевину. Сердцевина может содержать любой вспомогательный материал для ухода за бельем, хотя обычно сердцевина может содержать материал, выбранный из группы, состоящей из отдушек; оптических отбеливателей; красителей; средств от насекомых, силиконов; восков; вкусовых добавок; витаминов; средств для смягчения ткани; средств по уходу за кожей, в одном аспекте - парафинов; ферментов; антибактериальных средств; отбеливателей; органолептических средств; и их смесей; и указанная оболочка может содержать материал, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленов; полиамидов; поливиниловых спиртов, необязательно содержащих другие со-мономеры; полистиролы, полиизопрены, поликарбонаты, полиэфиры, полиакрилы, аминопласты, в одном аспекте указанный аминопласт может включать полимочевины, полиуретаны и/или полимочевино-уретаны; полиолефины; полисахариды, в одном аспекте указанный полисахарид может включать альгинат и/или хитозан; желатин; шеллак; эпоксидные смолы; виниловые полимеры; водонерастворимые неорганические вещества; силиконовых смол; и их смесей. Предпочтительные инкапсулированные формы содержат отдушку. Предпочтительные инкапсулированные формы включают оболочку, которая может содержать меламинформальдегид и/или сшитый меламинформальдедгид. Предпочтительные инкапсулированные формы включают материал сердцевины и оболочку, причем указанная оболочка, по меньшей мере частично, окружает указанный материал сердцевины, как раскрыто в данном документе. По меньшей мере 75%, 85% или даже 90% указанной инкапсулированной формы может иметь прочность при разрушении, равную от 0,2 МПа до 10 МПа, и утечку полезного вещества, равную от 0% до 20% или даже менее чем 10% или 5% от общего изначально инкапсулированного полезного агента. Предпочтительными являются те, в которых по меньшей мере 75%, 85% или даже 90% указанной инкапсулированной формы могут иметь (i) размер частиц, равный от 1 микрона до 80 микрон, от 5 микрон до 60 микрон, от 10 микрон до 50 микрон или даже от 15 микрон до 40 микрон, и/или (ii) по меньшей мере 75%, 85% или даже 90% указанной инкапсулированной формы могут иметь толщину стенки частиц, равную от 30 нм до 250 нм, от 80 нм до 180 нм или даже от 100 нм до 160 нм. Поглотители формальдегида могут применяться вместе инкапсулированной формой, например, в капсульной пасте, и/или вводятся в композицию до, во время или после добавления инкапсулированной формы к такой композиции. Пригодными капсулами являются те, которые могут быть изготовлены, следуя информации из USPA 2008/0305982 A1; и/или USPA 2009/0247449 A1. Альтернативно, пригодные капсулы можно приобрести у компании Appleton Papers Inc. из Appleton, Висконсин, США.

В предпочтительном аспекте композиция может включать средство, способствующее осаждению, предпочтительно в дополнение к инкапсулированным формам. Предпочтительные средства, способствующие осаждению, выбирают из группы, состоящей из катионных и неионных полимеров. Пригодные полимеры включают катионные крахмалы, катионную гидроксиэтилцеллюлозу, поливинилформальдегид, камедь плодов рожкового дерева, маннаны, ксилоглюканы, тамариндовую камедь, полиэтилентерефталат и полимеры, содержащие диметиламиноэтилметакрилат, необязательно, с одним или несколькими мономерами, выбранными из группы, включающей акриловую кислоту и акриламид.

Отдушка. Предпочтительные композиции по данному изобретению включают отдушку. Обычно композиция включает отдушку, которая содержит один или несколько исходных материалов отдушки, выбранных из группы, как описана в WO08/87497. Однако может быть использована любая отдушка, пригодная в композиции для ухода за бельем. Предпочтительный способ включения отдушки в композиции по данному изобретению представляет собой включение путем инкапсулированной частиц отдушки, содержащей либо водорастворимое гидроксильное соединение, либо меланинформальдегид или модифицированный поливиниловый спирт. В одном аспекте инкапсулированная форма включает (а) по меньшей мере частично водорастворимую твердую матрицу, содержащую одно или несколько водорастворимых гидроксильных соединений, предпочтительно крахмал; и (b) ароматическое масло, инкапсулированное твердой матрицей. В дополнительном аспекте отдушка может быть предварительно введена в комплекс с полиамином, предпочтительно полиэтиленимином, с образованием основания Шиффа.

Полимеры. Композиция может включать один или несколько полимеров. Примерами являются необязательно модифицированная карбоксиметилцеллюлоза, поли(винил-пирролидон), поли(этиленгликоль), поли(виниловый спирт), поли(винилпиридин-оксид), поли(винилимидазол), поликарбоксилаты, такие как полиакрилаты, сополимеры малеиновой/акриловой кислот и сополимеры лаурилметакрилата/акриловой кислоты.

Композиция может включать один или несколько амфифильных чистящих полимеров, таких как соединения, имеющие следующую общую структуру: бис((C2H5O)(C2H4O)n)(CH3)-N+-CxH2x-N+-(CH3)-бис((C2H5O)(C2H4O)n), где n=20-30 и x=3-8, или их сульфатированные или сульфонированные варианты. В одном аспекте этот полимер является сульфатированным или сульфонированным, для того, чтобы предоставить цвиттерионный полимер, удаляющий грязь.

Композиция предпочтительно включает амфифильные алкоксилированные полимеры, удаляющие жир, которые обладают сбалансированными гидрофильными и гидрофобными свойствами таким образом, что они удаляют жирные частицы с тканей и поверхностей. Предпочтительные амфифильные алкоксилированные полимеры, удаляющие жир, содержат основную структуру и множество алкоксильных групп, присоединенных к этой основной структуре. Это может включать алкоксилированные полиалкиленимины, предпочтительно имеющие внутренний блок из полиэтиленоксида и внешний блок из полипропиленоксида. Обычно они могут быть включены в композиции данного изобретения в количествах, равных 0,005-10% (вес.), в основном 0,5-8% (вес.).

Алкоксилированные поликарбоксилаты, например, полученные из полиакрилатов, полезны в данном изобретении для того, чтобы обеспечить дополнительную эффективность по удалению жира. Такие материалы описаны в патенте WO 91/08281 и патентной заявке PCT 90/01815. С химической точки зрения эти материалы включают полиакрилаты, содержащие по одной эпоксидной боковой цепи на каждые 7-8 акрилатных звеньев. Боковые цепи имеют формулу -(CH2CH2O)m(CH2)nCH3, где m равно 2-3 и n равно 6-12. Боковые цепи связаны через сложноэфирную связь в полиакрилатной основной цепи с образованием полимерной структуры типа «расчески». Молекулярный вес может меняться, но обычно находится в пределах от примерно 2000 до примерно 50000. Такие алкоксилированные поликарбоксилаты могут составлять от примерно 0,05% до примерно 10%, по весу, от композиций в данном документе.

Смеси вспомогательных ПАВ и других вспомогательных ингредиентов особенно пригодны для применения с амфифильным привитым сополимером. Предпочтительный амфифильный(е) привитый(е) сополимер(ы) включает (i) полиэтиленгликолевую основную цепь полиэтиленгликоля; и (ii) по меньшей мере один подвешенный фрагмент, выбранный из поливинилацетата, поливинилового спирта и их смесей. Предпочтительный амфифильный привитой сополимер представляет собой Sokalan HP22, поставляемый компанией BASF. Пригодные полимеры включают статистические привитые сополимеры, предпочтительно полиэтиленоксидный сополимер, привитый поливинилацетатом, имеющий полиэтиленоксидную основную цепь и множество поливинилацетатных боковых цепей. Молекулярный вес полиэтиленоксидной основной цепи предпочтительно составляет примерно 6000, а соотношение веса полиэтиленоксида к поливинилацетату составляет примерно 40-60 и не более 1 точки прививки на 50 звеньев этиленоксида. Обычно их включают в композицию по данному изобретению в количествах от 0,005 до 10%, более типично от 0,05 до 8%. Предпочтительно композиция включает один или несколько карбоксилатных полимеров, таких как статистический сополимер малеата/акрилата или полиакрилатный гомополимер. В одном аспекте карбоксилатный полимер представляет собой полиакрилатный гомополимер, имеющий молекулярный вес от 4000 Да до 9000 Да или от 6000 Да до 9000 Да. Обычно они включены в композиции по данному изобретению в количествах от 0,005 до 10% или от 0,05 до 8%.

Предпочтительно композиция включает один или несколько полимеров, высвобождающих грязь. Примеры включают полимеры, высвобождающие грязь, со структурой, определенной одной из следующих Формул (IV), (V) или (VI):

(IV)-[(OCHR1-CHR2)a-O-OC-Ar-CO-]d;

(V)-[(OCHR3-CHR4)b-O-OC-sAr-CO-]e;

(VI)-[(OCHR5-CHR6)c-OR7]f;

где:

a, b и c имеют значения от 1 до 200;

d, e и f имеют значения от 1 до 50;

Ar является 1,4-замещенным фениленом;

sAr является 1,3-замещенным фениленом, замещенным SO3Me в положении 5;

Me является Li, K, Mg/2, Ca/2, Al/3, аммонием, моно-, ди-, три- или тетраалкиламмонием, где алкильные группы представляют собой C1-C18 алкил или C2-C10 гидроксиалкил или их смеси;

R1, R2, R3, R4, R5 и R6 независимо выбраны из H или C1-C18 н- или изоалкила;

R7 является линейным или разветвленным C1-C18 алкилом или линейным или разветвленным C2-C30 алкенилом, или группой циклоалкила с 5-9 атомами углерода, или группой C8-C30 арила, или группой C6-C30 арилалкила.

Пригодными полимерами, высвобождающими грязь, являются полимеры, высвобождающие грязь, такие как полимеры Repel-o-tex, включая Repel-o-tex SF, SF-2 и SRP6, поставляемые компанией Rhodia. Другие полимеры, высвобождающие грязь, включают полимеры Texcare, включая Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 и SRN325, поставляемые компанией Clariant. Другими полимерами, высвобождающими грязь, являются полимеры Marloquest, такие как Marloquest SL, поставляемые компанией Sasol.

Предпочтительно композиция включает один или несколько целлюлозных полимеров, включая выбранные из алкилцеллюлозы, алкилалкоксиалкилцеллюлозы, карбоксиалкилцеллюлозы, алкилкарбоксиалкилцеллюлозы. Предпочтительными целлюлозными полимерами являются выбранные из группы, включающей карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, метилгидроксиэтилцеллюлозу, метилкарбоксиметилцеллюлозу и их смеси. В одном аспекте карбоксиметилцеллюлоза имеет степень замещения карбоксиметила от 0,5 до 0,9 и молекулярный вес от 100000 Да до 300000 Да.

Ферменты. Предпочтительно композиция включает один или несколько ферментов. Предпочтительные ферменты обеспечивают эффективность чистки и/или преимущества в уходе за тканями. Примеры пригодных ферментов включают, но не ограничиваются ими, гемицеллюлазы, пероксидазы, протеазы, целлюлазы, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, эстеразы, кутиназы, пектиназы, маннаназы, пектатлиазы, каратиназы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, липоксигеназы, лигниназы, пуллуланазы, танназы, пентосаназы, маланазы, β-глюканазы, арабиносидазы, гиалуронидазы, хондроитиназы, лакказы и амилазы или их смеси. Типичной комбинацией является ферментный коктейль, который может включать, например, протезу и липазу в сочетании с амилазой. Если вышеупомянутые ферменты включены в композицию, то они могут присутствовать в количествах от примерно 0,00001% до примерно 2%, от примерно 0,0001% до примерно 1% или даже от примерно 0,001% до примерно 0,5% белка фермента от веса композиции.

Протеазы. Предпочтительно, композиция включает одну или несколько протеаз. Пригодные протеазы включают металлопротеазы и сериновые протеазы, включая нейтральные или щелочные сериновые протеазы, такие как субтилизины (EC 3.4.21.62). Пригодные протеазы включают протеазы животного, овощного или микробного происхождения. В одном аспекте такие пригодные протеазы могут быть микробного происхождения. Пригодные протеазы включают химически или генетически модифицированные мутанты вышеупомянутых пригодных протеаз. В одном аспекте пригодная протеаза может быть сериновой протеазой, такой как щелочная микробная протеаза или/и протеаза трипсинового типа. Примеры пригодных нейтральных или щелочных протеаз включают:

(a) субтилизины (EC 3.4.21.62), включая полученные из Bacillus, таких как Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus и Bacillus gibsonii, описанные в патентах US 6312936 B1, US 5679630, US 4760025, US7262042 и WO09/021867;

(b) протеазы трипсинового типа или хемотрипсинового типа, такие как трипсин (например, свиного или бычьего происхождения), включая протеазу Fusarium, описанную в WO 89/06270, и химотрипсиновые протеазы, полученные из Cellumonas, описанные в WO 05/052161 и WO 05/052146;

(c) металлопротеазы, включая полученные из Bacillus amyloliquefaciens, описанные в WO 07/044993A2.

Предпочтительные протеазы включают протеазы, полученные из Bacillus gibsonii или Bacillus Lentus.

Пригодные коммерчески доступные ферменты протеаз включают те, которые продаются под торговыми названиями Alcalase®, Savinase®, Primase®, Durazym®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase Ultra®, Savinase Ultra®, Ovozyme®, Neutrase®, Everlase® и Esperase® компанией Novozymes A/S (Дания), те, которые продаются под торговыми марками Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Properase®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect Ox®, FN3®, FN4®, Excellase® и Purafect OXP® компанией Genencor International, те, которые продаются под торговыми марками Opticlean® и Optimase® компанией Solvay Enzymes, те, которые можно приобрести у компаний Henkel/Kemira, а именно, BLAP (последовательность показана на Фигуре 29 в патенте US 5352604 со следующими мутациями S99D+S101 R+S103A+V104I+G159S, здесь и далее называемая BLAP), BLAP R (BLAP с S3T+V4I+V199M+V205I+L217D), BLAP X (BLAP с S3T+V4I+V205I) и BLAP F49 (BLAP с S3T+V4I+A194P+V199M+V205I+L217D) - все производятся компаниями Henkel/Kemira; и KAP (Bacillus alkalophilus subtilisin с мутациями A230V+S256G+S259N) от компании Kao.

Амилазы. Предпочтительно композиция может включать амилазу. Пригодные альфа-амилазы включают амилазы бактериального или грибкового происхождения. Химически или генетически модифицированные мутанты (варианты) также включены. Предпочтительная щелочная альфа-амилаза получена из штамма Bacillus, такого как Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или других Bacillus sp., таких как Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513, DSM 9375 (USP 7153818) DSM 12368, DSMZ № 12649, KSM AP1378 (WO 97/00324), KSM K36 или KSM K38 (EP 1022334). Предпочтительные амилазы включают:

(a) варианты, описанные в патентах WO 94/02597, WO 94/18314, WO96/23874 и WO 97/43424, особенно варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений относительно фермента, приведенного в последовательности SEQ ID №2 в WO 96/23874: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 и 444;

(b) варианты, описанные в патентах USP 5856164 и WO99/23211, WO 96/23873, WO00/60060 и WO 06/002643, особенно варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений относительно фермента AA560, приведенного в последовательности SEQ ID № 12 в WO 06/002643:

26, 30, 33, 82, 37, 106, 118, 128, 133, 149, 150, 160, 178, 182, 186, 193, 203, 214, 231, 256, 257, 258, 269, 270, 272, 283, 295, 296, 298, 299, 303, 304, 305, 311, 314, 315, 318, 319, 339, 345, 361, 378, 383, 419, 421, 437, 441, 444, 445, 446, 447, 450, 461, 471, 482, 484, предпочтительно также включены делеции D183* и G184*;

(c) варианты, демонстрирующие по меньшей мере 90% идентичности с последовательностью SEQ ID №4 в WO06/002643, ферменты дикого типа из Bacillus SP722, особенно вариантами с делециями в положениях 183 и 184, и варианты, описанные в WO 00/60060, которые включены в данный документ путем ссылки;

(d) варианты, демонстрирующие по меньшей мере 95% идентичности с ферментом дикого типа из Bacillus sp.707 (SEQ ID №:7 в US 6093562), особенно с теми, которые содержат одну или несколько из следующих мутаций M202, M208, S255, R172 и/или M261. Предпочтительно указанная амилаза содержит одну или несколько из следующих: M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, M202W, S255N и/или R172Q. Особенно предпочтительными являются те, которые содержат мутации M202L или M202T;

(e) варианты, описанные в WO 09/149130, предпочтительно те, которые демонстрируют по меньшей мере 90% идентичности с последовательностью SEQ ID №:1 или SEQ ID №:2 в WO 09/149130, ферменты дикого типа из Geobacillus Stearophermophilus или его усеченной версией.

Пригодные продаваемые коммерчески альфа-амилазы включают DURAMYL®, LIQUEZYME®, TERMAMYL®, TERMAMYL ULTRA®, NATALASE®, SUPRAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, FUNGAMYL® и BAN® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Дания), KEMZYM® AT 9000 Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A-1200 Вена, Австрия, RAPIDASE®, PURASTAR®, ENZYSIZE®, OPTISIZE HT PLUS®, POWERASE® и PURASTAR OXAM® (Genencor International Inc., Пало Альто, Калифорния) и KAM® (Kao, 14-10 Nihonbashi Kayabacho, 1-chome, Chuo-ku Tokyo 103-8210, Япония). В одном аспекте пригодные амилазы включают NATALASE®, STAINZYME® и STAINZYME PLUS® и их смеси.

Липазы. Предпочтительно изобретение включает одну или несколько липаз, включая «липазы первого цикла», такие как описаны в патенте США 6939702 B1 и патентной заявке US 2009/0217464. Предпочтительными липазами являются липазы для первой стирки. В одном осуществлении данного изобретения композиция включает липазу для первой стирки. Липазы для первой стирки включают липазу, которая представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая: (а) имеет по меньшей мере 90% идентичности с липазой дикого типа, полученной из штамма Humicola lanuginosa DSM 4109; (b) по сравнению с указанной липазой дикого типа содержит замену электрически нейтральной или отрицательно заряженной аминокислоты на поверхности трехмерной структуры в пределах 15A в E1 или Q249 на положительно заряженную аминокислоту; и (с) содержит пептидное присоединение на С-конце; и/или (d) содержит пептидное присоединение на N-конце; и/или (е) отвечает следующим ограничениям: i) содержит отрицательно заряженную аминокислоту в положении Е210 указанной липазы дикого типа; ii) содержит отрицательно заряженную аминокислоту в области, соответствующей положениям 90-101 указанной липазы дикого типа; и iii) содержит нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту в положении, соответствующем N94 указанной липазы дикого типа, и/или имеет отрицательный или нейтральный общий электрический заряд в области, соответствующей положениям 90-101 указанной липазы дикого типа. Предпочтительными являются варианты липазы дикого типа из Thermomyces lanuginosus, содержащие одну или несколько мутаций T231R и N233R. Последовательность дикого типа представляет собой 269 аминокислот (аминокислоты 23-291) последовательности с инвентарным номером Swiss-Prot O59952 базы данных Swissprot (полученной из Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa)). Предпочтительные липазы включают те, которые продаются под торговыми названиями Lipex® и Lipolex® и Lipoclean®.

Эндоглюканазы. Другие предпочтительные ферменты включают полученные из микробов эндоглюканазы, обладающие активностью в отношении эндо-бета-1,4-глюканазы (E.C. 3.2.1.4), включая бактериальный полипептид, эндогенного для члена рода Bacillus, который имеет последовательность, по меньшей мере на 90%, 94%, 97% и даже 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID №:2 в патенте US 7141403 B2), и их смеси. Пригодные эндоглюканазы продаются под торговыми названиями Celluclean® и Whitezyme® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Дания).

Пектатлиазы. Другие предпочтительные ферменты включают пектатлиазы, продаваемые под торговыми названиями Pectawash®, Pectaway®, Xpect®, и маннаназы, продаваемые под торговыми названиями Mannaway® (все от компании Novozymes A/S, Bagsvaerd, Дания), и Purabrite® (Genencor International Inc., Пало Альто, Калифорния).

Отбеливатели. Может быть предпочтительным, чтобы композиция включала один или несколько отбеливателей. Пригодные отбеливатели, отличные от катализаторов отбеливателя, включают фотоотбеливатели, активаторы отбеливателя, пероксид водорода, источники пероксида водорода, предварительно образованные перкислоты и их смеси. В общем, при использовании отбеливателя, композиции по настоящему изобретению могут включать от примерно 0,1% до примерно 50% или даже от примерно 0,1 до примерно 25% отбеливателя или смесей отбеливателей от веса композиции по изобретению. Примеры пригодных отбеливателей включают:

(1) фотоотбеливатели, например, сульфированный фталоцианин цинка, сульфированные фталоцианины алюминия, ксантеновые красители и их смеси;

(2) предварительно образованные перкислоты: пригодные предварительно образованные перкислоты включают, но не ограничиваются ими, соединения, выбранные из группы, состоящей из предварительно образованных перкислот или их солей, обычно перкарбоновых кислот и солей, перугольных кислот и солей, перимидокислот и солей, пероскимоносерных кислот и солей, например, Oxone ®, и их смесей. Пригодные примеры включают перкарбоновые кислоты или их соли, или пероксисульфокислоты или их соли. Типичные соли пероксикарбоновой кислоты, пригодные для применения в данном изобретении, имеют химическую структуру, соответствующую следующей химической формуле:

,

где R14 выбран из алкила, аралкила, циклоалкила, арила или гетероциклических групп; группа R14 может быть линейной или разветвленной, замещенной или незамещенной; причем, если перкислота является гидрофобной, иметь от 6 до 14 атомов углерода, или от 8 до 12 атомов углерода и, если перкислота является гидрофильной, менее чем 6 атомов углерода или даже менее чем 4 атома углерода, и Y является любым пригодным противоионом, который позволяет достичь нейтрального электрического заряда, предпочтительно Y выбран из водорода, натрия или калия. Предпочтительно, чтобы R14 являлся линейным или разветвленным, замещенным или незамещенным C6-9 алкилом. Предпочтительно, пероксикислоту или ее соль выбирают из пероксигексановой кислоты, пероксигептановой кислоты, пероксиоктановой кислоты, пероксинонановой кислоты, пероксидекановой кислоты, любой их соли или любой их комбинации. Особенно предпочтительными пероксикислотами являются фталимидо-пероксиалкановые кислоты, в частности, ε-фталимидо-пероксигексановая кислота (PAP). Предпочтительно, чтобы пероксикислота или ее соль имели точку плавления в интервале от 30°C до 60°C.

Предварительно образованная перкислота или ее соль может также быть пероксисульфокислотой или ее солью, причем в общем случае иметь химическую структуру, соответствующую следующей химической формуле:

,

где R15 выбран из алкила, аралкила, циклоалкила, арила или гетероциклических групп; группа R15 может быть линейной или разветвленной, замещенной или незамещенной; и Z является любым пригодным противоионом, который позволяет достичь нейтрального электрического заряда, предпочтительно Z выбран из водорода, натрия или калия. Предпочтительно, чтобы R15 являлся линейным или разветвленным, замещенным или незамещенным C4-14, предпочтительно C6-14 алкилом. Предпочтительно такие отбеливающие компоненты могут присутствовать в композициях данного изобретения в количествах от 0,01 до 50%, более предпочтительно от 0,1% до 20%.

(3) Источники пероксида водорода, например, неорганические пергидратные соли, включая соли щелочных металлов, таких как натриевые соли, перборатной (обычно моно- или тетрагидраты), перкарбоновой, персульфатной, перфосфатной, персиликатной солей и их смеси. В одном аспекте данного изобретения неорганические пергидратные соли выбирают из группы, состоящей из натриевых солей пербората, перкарбоната и их смесей. В случае их использования, неорганические пергидратные соли обычно присутствуют в количествах от 0,05 до 40% (вес.) или от 1 до 30% (вес.) от всей чистящей и/или обрабатывающей композиции, такой как продукт для ухода за тканью или домом, и обычно включены в такую чистящую и/или обрабатывающую композицию, такую как продукты для ухода за тканью или домом, в виде кристаллического твердого вещества, которое может иметь покрытие. Пригодные покрытия включают неорганические соли, такие как силикат щелочного металла, карбонатные или боратные соли или их смеси, или органические материалы, такие как водорастворимые или диспергируемые полимеры, воски, масла или жирные мыла; и

(4) активаторы отбеливателя, имеющие формулу R-(C=O)-L, где R является алкильной группой, необязательно разветвленной, имеющей, в случае гидрофобного активатора отбеливателя, от 6 до 14 атомов углерода или от 8 до 12 атомов углерода, и в случае гидрофильного активатора отбеливателя - менее чем 6 атомов углерода или даже менее чем 4 атомов углерода; и L является уходящей группой. Примерами пригодных уходящих групп являются бензойная кислота и ее производные - особенно алкилбензолсульфонат. Пригодные активаторы отбеливателя включают додеканоил оксибензолсульфонат, деканоил оксибензолсульфонат, деканоил оксибензойную кислоту или ее соли, 3,5,5-триметил гексаноил оксибензолсульфонат, тетраацетил этилендиамин (TAED) и нонаноил оксибензолсульфонат (NOBS). Пригодные активаторы отбеливателя также раскрыты в WO 98/17767. В то время как можно применить любой активатор отбеливателя, в одном аспекте изобретения композиция по изобретению может содержать NOBS, TAED или их смесь.

(5) Катализаторы отбеливателя. Композиции по настоящему изобретению могут также включать один или несколько катализаторов отбеливателя, способных принимать атом кислорода из пероксикислоты и/или ее соли и переносить атом кислорода к окисляемому субстрату. Пригодные катализаторы отбеливателя включают, но не ограничиваются ими: иминиевые катионы и полиионы; иминиевые цвиттерионы; модифицированные аминоксиды; N-сульфонилимины; N-фосфонилимины; N-ацилимины; тиадиазолдиоксиды; перфторимины; кетоны циклических сахаров и альфа-аминокетоны и их смеси. Пригодные альфа-аминокетоны описаны, например, в WO 2012/000846 A1, WO 2008/015443 A1 и WO 2008/014965 A1. Пригодные смеси описаны, например, в патентной заявке US 2007/0173430 A1.

Не желая быть связанными какой-либо определенной теорией, заявители считают, что регулирование электрофильности и гидрофобности в этой вышеупомянутой манере позволяет ингредиентам отбеливателя быть доставленными в основном только к областям ткани, которые являются гидрофобными и которые содержат насыщенную электронами грязь, включая видимые хромофоры, которые склонны подвергаться отбеливанию сильными электрофильными окислителями.

В одном аспекте катализатор отбеливателя имеет структуру, соответствующую общей формуле ниже:

,

где R13 выбран из группы, состоящей из 2-этилгексила, 2-пропилгептила, 2-бутилоктила, 2-пентилнонила, 2-гексилдецила, н-додецила, н-тетрадецила, н-гексадецила, н-октадецила, изононила, изодецила, изотридецила и изопентадецила;

(6) композиция может предпочтительно содержать каталитические металлические комплексы. Одним предпочтительным типом содержащего металл катализатора отбеливателя является каталитическая система, содержащая катион переходного металла с определенной каталитической активностью отбеливания, такой как катионы меди, железа, титана, рутения, вольфрама, молибдена или марганца, вспомогательные катионы металла, обладающие низкой каталитической активностью отбеливания или вовсе не обладающие этой активностью, такие как катионы цинка или алюминия, и секвестрант, обладающий определенными константами устойчивости для каталитических и вспомогательных катионов, особенно этилендиаминтетрауксусная кислота, этилендиаминтетра(метиленфосфоновая кислота) и их водорастворимые соли. Такие катализаторы раскрыты в патенте US 4430243.

Если необходимо, композиции по данному изобретению могут быть катализированы с помощью соединения марганца. Такие соединения и уровни их применения хорошо известны в данном уровне техники и включают, например, катализаторы на основе марганца, раскрытые в патенте US 5576282.

Кобальтовые катализаторы отбеливателя, используемые в данном изобретении, известны и описаны, например, в US 5597936; US 5595967. Такие кобальтовые катализаторы легко получить с помощью известных методик, таких, как описаны, например, в патентах US 5597936 и US 5595967.

Композиции по данному изобретению могут также подходящим образом включать комплексы переходных металлов с такими лигандами, как биспидоны (WO 05/042532 A1) и/или макрополициклические жесткие лиганды - сокращенные как “MRL”. С практической, а не с ограничительной точки зрения, композиции и способы по данному изобретению могут быть подобраны так, чтобы обеспечить при содержании на уровне по меньшей мере одной части на сто миллионов активные частицы MRL в водной моющей среде, и обычно обеспечивают от примерно 0,05 м.д. до примерно 25 м.д., от примерно 0,05 м.д. до примерно 10 м.д., или даже от примерно 0,1 м.д. до примерно 5 м.д. MRL в моющем растворе.

Пригодные переходные металлы в растворимом содержащем переходной металл катализаторе отбеливателя включают, например, марганец, железо и хром. Пригодные MRL включают 5,12-диэтил-1,5,8,12-тетраазабицикло[6.6.2]гексадекан.

Пригодные MRL переходных металлов легко получить с помощью известных методик, таких, как раскрыты, например, в WO 00/32601 и US 6225464.

При их наличии, источник пероксида водорода/перкислоты и/или активатор отбеливателя обычно присутствуют в композиции в количестве от примерно 0,1 до примерно 60% (вес.), от примерно 0,5 до примерно 40% (вес.), от примерно 0,6 до примерно 10% (вес.) от чистящей и/или обрабатывающей композиции, такой как продукт для ухода за тканями и домом. Один или несколько гидрофобных перкислот или их предшественников могут быть использованы в комбинации с одной или несколькими гидрофильными перкислотами или их предшественниками.

Обычно источник пероксида водорода и активатор отбеливателя включают вместе. Количества источника пероксида водорода и перкислоты или активатора отбеливания можно выбирать так, чтобы молярное отношение доступного кислорода (из источника пероксида) к перкислоте составляло от 1:1 до 35:1 или даже 2:1 до 10:1.

Поверхностно-активное вещество (ПАВ). Предпочтительно композиция включает ПАВ или поверхностно-активную систему. ПАВ можно выбирать из неионных, анионных, катионных, амфотерных, амфолитных, амфифильных, цвиттерионных, полуполярных ПАВ и их смесей. Предпочтительные композиции включают смесь ПАВ/поверхностно-активной системы. Предпочтительные поверхностно-активные системы содержат один или несколько анионных ПАВ, особенно предпочтительно в комбинации с вспомогательным ПАВ, особенно предпочтительно неионным и/или амфотерным и/или цвиттерионным ПАВ. Предпочтительные поверхностно-активные системы содержат как анионный, так и неионный ПАВ, предпочтительно в весовом соотношении от 90:1 до 1:90. В некоторых случаях предпочтительным является весовое соотношение анионного к неионному ПАВ, составляющее не менее 1:1. Однако весовое соотношение меньше 10:1 может быть предпочтительным. При его наличии общий уровень содержания ПАВ предпочтительно составляет от 0,1% до 60%, от 1% до 50% или даже от 5% до 40% от веса композиции по изобретению.

Предпочтительно, композиция включает анионное моющее ПАВ, предпочтительно сульфатные и/или сульфонатные ПАВ. Предпочтительные примеры включают алкилбензолсульфонаты, алкилсульфаты и алкоксилированные алкилсульфаты. Предпочтительными сульфонатами являются C10-13-алкилбензолсульфонат. Пригодный аликилбензолсульфонат (LAS) может быть получен путем сульфирования коммерчески доступных линейного алкилбензола (LAB); пригодные LAB включают низшие 2-фенил LAB, такие, как поставляются компанией Sasol под торговым названием Isochem®, или те, которые поставляются компанией Petresa под торговым названием Petrelab®, другие пригодные LAB включают высшие 2-фенил LAB, такие, как поставляемые компанией Sasol под торговым названием Hyblene®. Пригодный анионный моющий ПАВ представляет собой алкилбензолсульфонат, который получают в каталитическом процессе DETAL, хотя другие пути синтеза, такие как HF, также могут быть пригодны. В одном аспекте используется магниевая соль LAS.

Предпочтительные сульфатные моющие ПАВ включают алкилсульфаты, обычно C8-18-алкилсульфаты, или в основном C12-алкилсульфат. Дополнительным предпочтительным алкилсульфатом является алкоксилированный алкилсульфат, предпочтительно алкоксилированный C8-18-алкилсульфат. Предпочтительно, алкоксилирующей группой является этоксилирующая группа. Обычно алкоксилированный алкилсульфат имеет среднюю степень алкоксилирования, равную от 0,5 до 30 или 20, или от 0,5 до 10. Особенно предпочтительными являются этоксилированные C8-18-алкилсульфонаты, имеющие среднюю степень этоксилирования, равную от 0,5 до 10, от 0,5 до 7, от 0,5 до 5 или даже от 0,5 до3.

Алкилсульфаты, алкоксилированные алкилсульфаты и алкилбензолсульфонаты могут быть линейными или разветвленными, замещенными или незамещенными. Если ПАВ является разветвленным, то предпочтительно, чтобы ПАВ содержал разветвленный в середине цепи сульфатный или сульфонатный ПАВ. Предпочтительно разветвленные группы включают C1-4-алкильные группы, обычно метиловые и/или этиловые группы.

Предпочтительно, композиция включает неионные моющие ПАВ. Пригодные неионные ПАВ выбирают из группы, содержащей: C8-C18-алкилэтоксилаты, такиекак неионные ПАВ NEODOL® от компании Shell; C6-C12-алкилфенолалкоксилаты, где алкоксилатные звенья могут быть этиленоксидными звеньями, пропиленоксидными звеньями или их смесями; C12-C18-спирты и C6-C12-алкилфенольные конденсаты с этиленоксидным/пропиленоксидным блоксополимерами, такими как Pluronic® от компании BASF; разветвленные в середине цепи C14-C22-спирты; разветвленные в середине цепи C14-C22-алкилалкоксилаты, обычно имеющие среднюю степень алкоксилирования, равную от 1 до 30; алкоксиполисахариды, в одном аспекте алкилполигликозиды; амиды полигидроксижирных кислот; ПАВ на основе защищенных эфиром поли(оксиалкилированные)спиртов и их смеси.

Пригодные неионные моющие ПАВ включают алкил полиглюкозид и/или алкилалкоксилированный спирт.

В одном аспекте неионные моющие ПАВ включают алкилалкоксилированные спирты, в одном аспекте C8-18-алкилалкоксилированный спирт, например, C8-18-алкилэтоксилированный спирт, алкилалкоксилированный спирт может иметь среднюю степень алкоксилирования, равную от 1 до 80, предпочтительно от 1 до 50, особенно предпочтительно от 1 до 30, от 1 до 20 или от 1 до 10. В одном аспекте алкилалкоксилированный спирт может быть C8-18-алкилалкоксилированным спиртом, имеющим степень алкоксилирования, равную от 1 до 10, от 1 до 7, скорее 1-5 или от 3-7, или даже ниже 3 или 2.

Алкилалкоксилированный спирт может быть линейным или разветвленным, замещенным или незамещенным.

Пригодные неионные ПАВ включают таковые с торговым названием Lutensol® от компании BASF.

Пригодные катионные моющие ПАВ включают соединения алкилпиридиния, алкил четвертичные аммониевые соединения, алкил четвертичные фосфониевые соединения, алкил третичные сульфониевые соединения и их смеси.

Пригодными катионными моющими ПАВ являются алкил четвертичные аммониевые соединения, имеющими общую формулу:

(R)(R1)(R2)(R3)N+ X-,

где R является линейным или разветвленным, замещенным или незамещенным C6-18-алкильным или алкенильным фрагментом, R1 и R2 независимо выбраны из метильного или этильного фрагментов, R3 является гидроксильным, гидроксиметильным или гидроксиэтильным фрагментом, X является анионом, который обеспечивает нейтральный заряд, пригодные анионы включают галогениды, например, хлорид, сульфат и сульфонат. Пригодными катионными моющими ПАВ являются хлориды моно-C6-18-алкил моно-гидроксиэтил ди-метил четвертичного аммония. Особенно пригодными катионными моющими ПАВ являются хлорид моно-C8-10-алкил моно-гидроксиэтил ди-метил четвертичного аммония, хлорид моно-C10-12 алкил моно-гидроксиэтил ди-метил четвертичного аммония. и хлорид моно-C10-алкил моно-гидроксиэтил ди-метил четвертичного аммония.

Пригодные амфотерные/цвиттерионные ПАВ включают аминоксиды и бетаины.

Нейтрализованные амином анионные ПАВ - анионные ПАВ по настоящему изобретению и дополнительные анионные вспомогательные ПАВ могут существовать в кислотной форме, и указанная кислотная форма может быть нейтрализована с образованием соли ПАВ, которая желательна для применения в настоящих моющих композициях. Типичные агенты для нейтрализации включают противоион металла основания, такого как гидроксиды, например, NaOH или KOH. Дополнительные предпочтительные агенты для нейтрализации анионных ПАВ по настоящему изобретению и вспомогательные анионные ПАВ или противоионы в их кислотных формах включают аммоний, амины или алканоламины. Предпочтение отдается алканоламинам. Пригодные неограничивающие примеры включают моноэтаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин и другие линейные или разветвленные алканоламины, известные в данном уровне техники; например, особенно предпочтительные алканоламины включают 2-амино-1-пропанол, 1-аминопропанол, моноизопропаноламин или 1-амино-3-пропанол. Нейтрализацию амином можно проводить полностью или частично, например, часть смеси анионного ПАВ может быть нейтрализована натрием или калием, а часть смеси анионного ПАВ может быть нейтрализована аминами или аканоламинами.

Основные компоненты. Предпочтительно композиция содержит один или несколько основных компонентов или систему основного компонента. При использовании основного компонента композиция по данному изобретению обычно включает не менее 1%, от 2% до 60% основного компонента. Может быть предпочтительным, чтобы композиция включала фосфатную соль и/или цеолит с содержанием на низком уровне, например, от 1 до 10 или 5%. Композиция даже может в основном не содержать сильных основных компонентов; «в основном не содержит сильных основных компонентов» означает, что «нет специально введенного» цеолита и/или фосфата. Типичные цеолитные основные компоненты включают цеолит А, цеолит Р и цеолит МАР. Типичный фосфатный основной компонент представляет собой три-полифосфат натрия.

Хелатообразователь. Предпочтительно композиция содержит хелатообразователи и/или ингибитор роста кристаллов. Пригодные молекулы включают медные, железные и/или марганцевые хелатообразователи и их смеси. Пригодные молекулы включают аминокарбоксилаты, аминофосфонаты, сукцинаты, их соли и их смеси. Неограничивающие примеры пригодных хелатообразователей для применения в данном изобретении включают этилендиаминтетраацетаты, N-(гидроксиэтил)этилендиаминтетраацетаты, нитрилотриацетаты, этилендиаминтетрапроприонаты, триэтилентетраамингексаацетаты, диэтилентриаминпентаацетаты, этанолдиглицины, этилендиаминтетракис(метиленфосфонаты), диэтилентриамин пента(метиленфосфоновая кислота) (DTPMP), этилендиамин дисукцинат (EDDS), гидроксиэтандиметиленфосфоновая кислота (HEDP), метилглициндиуксусная кислота (MGDA), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), их соли и их смеси. Другие неограничивающие примеры хелантов для применения в данном изобретении можно найти в патентах США №№ 7445644, 7585376 и 2009/0176684A1. Другими пригодными хелатообразователями для использования в данном изобретении являются коммерческая линейка продуктов DEQUEST и хеланты от компаний Monsanto, DuPont, и Nalco, Inc.

Ингибиторы переноса красителя (DTI). Композиция может включать один или несколько ингибиторов переноса красителя. В одном варианте осуществления изобретения заявители неожиданно обнаружили, что композиции, содержащие полимерные ингибирующие перенос красителя агенты, в дополнение к определенным красителям, дают улучшенную эффективность. Это было неожиданно, поскольку эти полимеры предотвращают осаждение красителя. Пригодные ингибиторы переноса красителя включают, но не ограничиваются ими, поливинилпирролидоновые полимеры, полиамин N-оксидные полимеры, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и поливинилимидазолы или их смеси. Пригодные примеры включают PVP-K15, PVP-K30, ChromaBond S-400, ChromaBond S-403E и Chromabond S-100 от компании Ashland Aqualon, и Sokalan HP165, Sokalan HP50, Sokalan HP53, Sokalan HP59, Sokalan® HP 56K, Sokalan® HP 66 от компании BASF. Другими пригодными DTI являются те, что описаны в WO2012/004134. При их наличии в композиции по данному изобретению, ингибирующие перенос красителя агенты могут присутствовать в количествах от примерно 0,0001% до примерно 10%, от примерно 0,01% до примерно 5% или даже от примерно 0,1% до примерно 3% от веса композиции.

Флуоресцентный оптический отбеливатель. Предпочтительно композиция включает один или несколько флуоресцентных оптических отбеливателей. Коммерческие оптические отбеливатели, которые могут быть полезными в настоящем изобретении, можно классифицировать в подгруппы, которые включают, но не ограничиваются ими, производные стильбена, пиразолина, кумарина, карбоновых кислот, метиленцианинов, дибензотиофен-5,5-диоксида, азолей, 5- и 6-членных гетероциклов и другие разнообразные агенты. Особенно предпочтительные оптические отбеливатели выбирают из 2(4-стирил-3-сульфофенил)-2H-нафтол[1,2-d]триазола натрия, 4,4'-бис{[(4-анилино-6-(N-метил-N-2гидроксиэтил)амино-1,3,5-триазин-2-ил)]амино}стильбен-2-2-дисульфоната ди-натрия, 4,4'-бис{[(4-анилино-6-морфолино-l,3,5-триазин-2-ил)]амино}-стильбен-2-2'-дисульфонат ди-натрия и 4,4'-бис(2-сульфостирил)-бифенил ди-натрия. Другие примеры таких оптических отбеливателей раскрыты в публикации "The Production and Application of Fluorescent Brightening Agents", M. Zahradnik, опубликованные John Wiley & Sons, New York (1982). Определенными неограничивающими примерами оптических отбеливателей, которые полезны в данных композициях, являются те, которые определены в патентах США №№ 4790856 и 3646015.

Предпочтительный оптический отбеливатель имеет структуру, приведенную ниже:

.

Пригодные уровни содержания флуоресцентных оптических отбеливателей включают нижние уровни от примерно 0,01, от примерно 0,05, от примерно 0,1 или даже от примерно 0,2% (вес.) до верхних уровней, равных 0,5 или даже 0,75% (вес.).

В одном аспекте оптический отбеливатель может быть нанесен на глину с образованием частицы.

Предпочтительные оптические отбеливатели целиком или в основном (обычно не менее 50% (вес.), не менее 75% (вес.), не менее 90% (вес.), не менее 99% (вес.)) имеют альфа-кристаллическую форму. Особенно предпочтительный оптический отбеливатель включает C.I. флуоресцентный оптический отбеливатель 260, предпочтительно имеющий следующую структуру:

.

Он может быть особенно полезным, поскольку он хорошо растворяется в холодной воде, например, ниже 30 или 25 или даже 20°С.

Предпочтительно оптические отбеливатели включены в композицию в форме микронизированных частиц, особенно предпочтительно, чтобы они имели средневзвешенный размер первичных частиц, равный от 3 до 30 микрометров, от 3 микрометров до 20 микрометров или от 3 микрометров до 10 микрометров.

Композиция может включать C.I. флуоресцентный оптический отбеливатель 260 в альфа-кристаллической форме, и в весовом соотношении, равном: (i) C.I. флуоресцентный оптический отбеливатель 260 в альфа-кристаллической форме к (ii) C.I. флуоресцентному оптическому отбеливателю 260 в бета-кристаллической форме он может быть не менее 0,1 или не менее 0,6.

BE680847 относится к процессу изготовления C.I. флуоресцентного оптического отбеливателя 260 в альфа-кристаллической форме.

Силикатные соли. Композиция может предпочтительно также содержать силикатные соли, такие как силикаты натрия или калия. Композиция может содержать от 0% (вес.) до менее 10% (вес.) силикатной соли, до 9% (вес.), или до 8% (вес.), или до 7% (вес.), или до 6% (вес.), или до 5% (вес.), или до 4% (вес.), или до 3% (вес.), или даже до 2% (вес.), и предпочтительно от выше 0% (вес.), или от 0,5% (вес.), или даже от 1% (вес.) силикатной соли. Пригодной силикатной солью является силикат натрия.

Диспергаторы. Композиция может предпочтительно также содержать диспергаторы. Пригодные водорастворимые органические материалы включают гомо- или сополимерные кислоты или их соли, в которых поликарбоновая кислота включает по меньшей мере два карбоксильных радикала, отделенных друг от друга не более чем двумя атомами углерода.

Стабилизаторы фермента. Композиция может предпочтительно включать стабилизаторы фермента. Может быть использован любой традиционный стабилизатор фермента, например, путем присутствия водорастворимого источника ионов кальция и/или магния в конечных продуктах по уходу за тканями и домом, которые обеспечивают такие ионы для фермента. В случае, если водные композиции включают протеазу, то для дополнительного улучшения стабильности вводят обратимый ингибитор протеазы, такой как соединение бора, включая борат или, предпочтительно, 4-формилфенилбороновую кислоту, фенилбороновую кислоту и их производные, или соединения, такие как формиат кальция, формиат натрия и 1,2-пропандиол.

Система растворителя. Система растворителя в настоящих композициях может быть системой растворителя, содержащей только воду или смеси органических растворителей либо без воды, либо предпочтительно с водой. Предпочтительные органические растворители включают 1,2-пропандиол, этанол, глицерин, дипропиленгликоль, метилпропандиол и их смеси. Другие низшие спирты, С14 алканоламины, такие как моноэтаноламин и триэтаноламин, также могут быть использованы. Системы растворителей могут отсутствовать, например, в безводных твердых осуществлениях данного изобретения, но более типично они присутствуют в количествах в интервале от примерно 0,1% до примерно 98%, предпочтительно не менее примерно 1% до примерно 50%, более типично от примерно 5% до примерно 25%.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения композиция находится в форме структурированной жидкости. Такие структурированные жидкости могут быть либо внутренне структурированными, когда структура образуется первичными ингредиентами (например, материалом ПАВ) и/либо внешне структурированными путем предоставления структуры трехмерной матрицы, используя вторичные ингредиенты (например, полимеры, глину и/или силикатный материал), для применения, например, в виде загустителей. Композиция может включать структурирующий агент, предпочтительно от 0,01% (вес.) до 5% (вес.), от 0,1% (вес.) до 2,0% (вес.) структурирующего агента. Примеры пригодных структурирующих агентов приведены в US2006/0205631A1, US2005/0203213A1, US7294611, US6855680. Структурирующий агент обычно выбирают из группы, состоящей из диглицеридов и триглицеридов, дистеарата этиленгликоля, микрокристаллической целлюлозы, материалов на основе целлюлозы, целлюлозного микроволокна, гидроксифункционального кристаллического материала, длинноцепочечных жирных спиртов, гидрофобно модифицированных набухающих в щелочи эмульсий, таких как Polygel W30 (3VSigma), биополимеров, ксантановой камеди, геллановой камеди, гидрогенизированного касторового масла, производных гидрогенизированного касторового масла, таких как его неэтоксилированные производные, и их смесей, в частности, те, которые выбраны из группы гидрогенизированного касторового масла, производных гидрогенизированного касторового масла, целлюлозного микроволокна, гидроксифункционального кристаллического материала, длинноцепочечных жирных спиртов, 12-гидроксистеариновых кислот, глин и их смесей. Предпочтительный структурирующий агент описан в патенте США № 6855680, который детально описывает пригодные гидрофункциональные кристаллические материалы. Предпочтительным является гидрогенизированное касторовое масло. Неограничивающие примеры полезных структурирующих агентов включают. Такие структурирующие агенты имеют волоконо-подобную структурирующую систему, имеющую различные соотношения пропорций. Другие пригодные структурирующие агенты и способ их изготовления описаны в WO2010/034736.

Композиция по данному изобретению может включать жирные соединения с высокой точкой плавления. Полезное в данном изобретении жирное соединение с высокой точкой плавления имеет температуру плавления, равную 25°С и выше, и его выбирают из группы, состоящей из жирных спиртов, жирных кислот, производных жирных спиртов, производных жирных кислот и их смесей. Такие соединения с низкой точкой плавления не предназначены для включения в данный раздел. Неограничивающие примеры соединений с высокой точкой плавления можно найти в Cosmetic Ingredient Dictionary, Fifth Edition, 1993, and CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition, 1992. При его наличии, жирное соединение с высокой точкой плавления предпочтительно включено в композицию в количестве, равном от 0,1% до 40%, предпочтительно от 1% до 30%, более предпочтительно от 1,5% до 16% от веса композиции, от 1,5% до 8% с целью обеспечения улучшенных кондиционирующих преимуществ, таких как ощущение скольжения во время нанесения на влажные волосы, мягкость и ощущения увлажнения на сухих волосах.

Катионный полимер. Композиция по настоящему изобретению может содержать катионный полимер. Концентрации катионного полимера в композиции обычно изменяются от 0,05% до 3%, в другом варианте осуществления - от 0,075% до 2,0%, и в еще одном варианте осуществления - от 0,1% до 1,0%. Пригодные катионные полимеры будут иметь плотности катионного заряда не менее 0,5 мэкв/гм, в другом варианте осуществления - не менее 0,9 мэкв/гм, в другом варианте осуществления - не менее 1,2 мэкв/гм, в еще одном варианте осуществления - не менее 1,5 мэкв/гм, но в одном варианте осуществления также менее чем 7 мэкв/гм, в другом варианте осуществления также менее чем 5 мэкв/гм, при рН, установленном для использования композиции, который с основном будет изменяться от рН 3 до рН 9, в одном варианте осуществления - в промежутке между рН 4 и рН 8. В данном контексте выражение «плотность катионного заряда» полимера относится к отношению числа положительных зарядов на полимере к молекулярному весу полимера. Средний молекулярный вес таких пригодных катионных полимеров будет, в основном, находиться в промежутке между 10000 и 10 миллионами, в одном варианте осуществления - между 50000 и 5 миллионами, и в другом варианте осуществления - между 100000 и 3 миллионами.

Катионные полимеры, пригодные для использования в композиции по настоящему изобретению, содержат катионные азотсодержащие фрагменты, такие как четвертичные аммонийные или катионные протонированные аминофрагменты. Любые анионные противоионы могут быть использованы в сочетании с катионными полимерами при условии, что полимеры будут оставаться водорастворимыми в композиции или в фазе коацервата композиции, и при условии, что противоионы физически и химически совместимы с основными компонентами композиции или другим образом отрицательно не влияют на эффективность, стабильность или эстетический вид продукта. Неограничивающие примеры таких противоионов включают галогениды (например, хлорид, фторид, бромид, йодид), сульфат и метилсульфат.

Неограничивающие примеры таких полимеров описаны в CTFA Cosmetic Ingredient Dictionary, 3rd edition, edited by Estrin, Crosley, and Haynes, (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D.C. (1982)).

Другие пригодные катионные полимеры для использования в композиции включают полисахаридные полимеры, катионные производные гуаровой камеди, четвертичные содержащие азот эфиры целлюлозы, синтетические полимеры, сополимеры этерифицированной целлюлозы, гуар и крахмал. При их наличии, катионные полимеры в данном документе либо являются растворимыми в композиции, либо растворимыми в фазе комплексного коацервата в композиции, образованной катионным полимером и анионным, амфотерным или цвиттерионным ПАВ компонентом, описанным выше. Комплексные коацерваты катионного полимера могут быть образованы с другими заряженными материалами в композиции.

Пригодные катионные полимеры описаны в патентах США №№ 3962418; 3958581; и публикации заявки США № 2007/0207109A1.

Неионный полимер. Композиция по настоящему изобретению может включать неионный полимер в качестве кондиционирующего агента. Полиалкиленгликоли, имеющие молекулярный вес более чем 1000, полезны в данном изобретении. Полезны неионные полимеры, которые имеют следующую общую формулу:

,

где R95 выбран из группы, состоящей из H, метила и их смесей. Кондиционирующие агенты, и в частности силиконы, могут быть включены в композицию. Кондиционирующие агенты, пригодные для композиций по данному изобретению, обычно включают водонерастворимую, вододиспергируемую, нелетучую жидкость, которая образует эмульгированные жидкие частицы. Кондиционирующие агенты, пригодные для использования в композиции, являются теми кондиционирующими агентами, которые в основном характеризуются как силиконовые (например, силиконовые масла, катионные силиконы, силиконовые камеди, силиконы с высоким коэффициентом отражения и силиконовые смолы), органические кондиционирующие масла (например, углеводородные масла, полиолефины и жирные сложные эфиры) или их комбинации, или теми кондиционирующими агентами, которые иным образом образуют жидкость, диспергированные частицы в водной ПАВ матрице по данному изобретению. Такие кондиционирующие агенты должны быть физически и химически совместимы с основными компонентами композиции, и не должны другим образом отрицательно влиять на стабильность, эстетический вид или эффективность продукта.

Концентрация кондиционирующего агента в композиции должна быть достаточной для обеспечения желаемых кондиционирующих преимуществ. Такая концентрация может изменяться в зависимости от кондиционирующего агента, желаемой эффективности кондиционирования, среднего размера частиц кондиционирующего агента, типа и концентрации других компонентов и других подобных факторов.

Концентрация силиконового кондиционирующего агента обычно изменяется от примерно 0,01% до примерно 10%. Неограничивающие примеры пригодных силиконовых кондиционирующих агентов, и необязательных суспензионных агентов для силикона, описаны в вновь выданном патенте США № 34584, патентах США №№ 5104646; 5106609; 4152416; 2826551; 3964500; 4364837; 6607717; 6482969; 5807956; 5981681; 6207782; 7465439; 7041767; 7217777; патентных заявках США №№ 2007/0286837A1; 2005/0048549A1; 2007/0041929A1; патенте Великобритании № 849433; немецком патенте № DE 10036533, все из которых включены в данный документ путем ссылки; Chemistry and Technology of Silicones, New York: Academic Press (1968); General Electric Silicone Rubber Product Data Sheets SE 30, SE 33, SE 54 and SE 76; Silicon Compounds, Petrarch Systems, Inc. (1984); и в Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, vol. 15, 2d ed., pp 204-308, John Wiley & Sons, Inc. (1989).

Органическое кондиционирующее масло. Композиция по настоящему изобретению может также включать от примерно 0,05% до примерно 3% по меньшей мере одного органического кондиционирующего масла в качестве кондиционирующего агента, либо само по себе, либо в комбинации с другими кондиционирующими агентами, такими как силиконы (описанные здесь). Пригодные кондиционирующие масла включают углеводородные масла, полиолефины и жирные сложные эфиры. Также пригодными для использования в композициях по данному изобретению являются кондиционирующие агенты, описанные компанией Procter & Gamble Company в патентах США №№ 5674478 и 5750122. Также пригодными для использования здесь являются те кондиционирующие агенты, которые описаны в патентах США №№ 4529586, 4507280, 4663158, 4197865, 4217914, 4381919 и 4422853.

Агент для гигиены. Композиция по настоящему изобретению может также включать компоненты для обеспечения гигиены и/или борьбы с неприятным запахом, такие как один или несколько из следующего: рицинолеата цинка, тимола, солей четвертичного аммония, таких как Bardac®, полиэтилениминов (таких как Lupasol® от компании BASF) и их цинковых комплексов, серебра и соединений серебра, особенно тех, которые разработаны для медленного высвобождения Ag+ или нано-серебряных дисперсий.

Пробиотики. Композиция может включать пробиотики, такие, как описаны в WO2009/043709.

Усилители пенообразования. Композиция может предпочтительно включать усилители пенообразования, если желательно сильное пенообразование. Пригодными примерами являются С10-С16 алканоламиды или С10-С14 алкилсульфаты, содержание которых предпочтительно составляет 1%-10%. С10-С14 моноэтанол и диэтанол амиды представляют типичный класс таких усилителей пенообразования. Использование таких усилителей пенообразования с сильно пенообразующими вспомогательными ПАВ, такими как аминоксиды, бетаины и сультаины, отмеченными выше, также создает преимущества. Если необходимо, водорастворимые соли магния и/или кальция, такие как MgCl2, MgSO4, CaCl2, CaSO4 и подобные, могут быть введены в количестве обычно 0,1%-2%, чтобы обеспечить дополнительное пенообразование и увеличить эффективность удаления жира.

Подавители пенообразования. Соединения для снижения или подавления пенообразования могут быть включены в композиции по настоящему изобретению. Подавление пенообразования может иметь определенную важность в так называемых «способах чистки при высоких концентрациях», как описано в патентах США №№ 4489455 и 4489574, или в стиральных машинах с фронтальной загрузкой. В качестве подавителей пенообразования может быть использован широкий набор материалов, и подавители пенообразования хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Third Edition, Volume 7, pages 430-447 (John Wiley & Sons, Inc., 1979). Примеры подавителей пенообразования включают монокарбоновые жирные кислоты и их растворимые соли, высокомолекулярные углеводороды, такие как парафин, эфиры жирных кислот (например, триглицериды жирной кислоты), эфиры жирных кислот одноатомных спиртов, алифатические С1840 кетоны (например, стеарон), N-алкилированные аминотриазины, воскообразные углеводороды, предпочтительно имеющие точку плавления ниже примерно 100°C, силиконовые подавители пенообразования и двухатомные спирты. Подавители пенообразования описаны в патентах США №№ 2954347; 4265779; 4265779; 3455839; 3933672; 4652392; 4978471; 4983316; 5288431; 4639489; 4749740 и 4798679; 4075118; европейской патентной заявке № 89307851.9; EP 150872; и DOS 2124526.

Для любой моющей композиции, предназначенной для применения в автоматической стиральной машине для белья, пенообразование не должно происходить до уровня, на котором будет происходить утечка из стиральной машины. Подавители пенообразования, при их наличии, предпочтительно присутствуют в «пеноподавляющем количестве». Под «пеноподавляющим количеством» понимают, что составитель композиции может выбрать количество регулирующего пенообразование агента, которое будет удовлетворительно регулировать пенообразование, давая в результате моющее средство для белья с низким пенообразованием для применения в автоматических стиральных машинах для белья. Композиции по данному изобретению в общем случае будут включать от 0% до 10% подавителя пенообразования. При их использовании в качестве подавителей пенообразования, монокарбоновые жирные кислоты и их соли будут присутствовать обычно в количестве вплоть до 5% от веса моющей композиции. Предпочтительно используется от 0,5% до 3% жирного монокарбоксилатного подавителя пенообразования. Силиконовые подавители пенообразования обычно используются в количествах вплоть до 2,0% от веса моющей композиции, однако, они могут использоваться и в больших количествах. Моностеарилфосфатные подавители пенообразования обычно используются в количествах в диапазоне от 0,1% до 2,0% от веса моющей композиции. Углеводородные подавители пенообразования обычно используются в количествах в диапазоне от 0,1% до 2,0%, однако, можно использовать и более высокие уровни внесения. Спиртовые подавители пенообразования обычно используются в количестве 0,2%-3% от веса моющей композиции.

Перламутровые агенты. Перламутровые агенты, как описано в WO2011/163457, могут входить в композиции по данному изобретению.

Отдушка. Предпочтительно композиция включает отдушку, предпочтительно в количестве от 0,001 до 3%, наиболее предпочтительно от 0,1 до 1%. Многие пригодные примеры отдушек приведены в CTFA (Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association) 1992 International Buyers Guide, опубликованном CFTA Publications, и OPD 1993 Chemicals Buyers Directory 80th Annual Edition, опубликованном Schnell Publishing Co. Присутствие нескольких компонентов отдушки является обычным в композициях по данному изобретению, например, четырех, пяти, шести, семи и более. В смесях отдушек предпочтительно 15-25% (вес.) составляют верхние ноты. Верхние ноты определены в Poucher (Journal of the Society of Cosmetic Chemists 6(2):80 [1995]). Предпочтительные верхние ноты включают оксид розы, цитрусовые масла, ацетат линалила, лаванду, линалоол, серый цитрус и цис-3-гексанол.

Способы изготовления и применения чистящих композиций

Настоящее изобретение также предлагает способ изготовления композиции, как описано выше, включающий получение по меньшей мере одного из вариантов, описанных выше, и смешивание его со вспомогательным материалом или их смесью.

Чистящие композиции по настоящему изобретению составляют в любую подходящую форму, такую как твердая, порошковая, жидкая, таблетированная или гелеобразная, а смешивание варианта и вспомогательного материала может быть проведено с помощью любого способа, выбираемого специалистом, который занимается составлением, (см., например, патенты США №№ 5879584, 5691297, 5574005, 5569645, 5565422, 5516448, 5489392, 5486303, 4515705, 4537706, 4515707, 4550862, 4561998, 4597898, 4968451, 5565145, 5929022, 6294514 и 6376445).

В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции по настоящему изобретению представлены в форме стандартной дозы, включая таблетки, капсулы, саше, пакеты и многокамерные пакеты. В некоторых вариантах осуществления формат стандартной дозы разработан для обеспечения контролируемого высвобождения ингредиентов в многокамерном пакете (или другом формате стандартной дозы). Подходящие форматы со стандартной дозой и контролируемым высвобождением известны из уровня техники (см., например, EP 2100949, WO 02/102955, патенты США №№ 4765916 и 4972017 и WO 04/111178 для материалов, подходящих для применения в форматах стандартной дозы и с контролируемым высвобождением). В некоторых вариантах осуществления форма стандартной дозы представлена таблетками, упакованными в водорастворимую пленку или водорастворимые мешочки. Различные форматы для стандартных доз представлены в EP 2100947 и известны из уровня техники. В предпочтительном многокамерном мешочке вариант протеазы находится в отсеке, отделенном от одного или нескольких дополнительных ферментов протеазы, фермента липазы первой стирки, фермента целлюлазы, фермента амилазы, компонента отбеливателя, модификатора рН, оттеночного красителя ткани, оптического отбеливателя и неионного ПАВ или их смесей.

Способы применения

Настоящее изобретение также предлагает способ обработки поверхности, в частности, ткани, включающий приведение в контакт поверхности с водным раствором, содержащим по меньшей мере один из вариантов, перечисленных выше, и вспомогательный материал. Обычно вариант протеазы и вспомогательный материал вносят в воду с образованием моющего раствора путем внесения композиции по изобретению в воду. Поверхность, предназначенная к обработке в способе по данному изобретению, может представлять собой любую ткань или поверхность для чистки при уходе за домом, такую как столовая посуда, белье, твердые поверхности, контактные линзы и т.д. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, сегмент поверхности приводят в контакт по меньшей мере с одним вариантом осуществления чистящих композиций по настоящему изобретению, в чистой форме или разведенной в моющем растворе, и затем поверхность необязательно моют и/или ополаскивают. Для целей настоящего изобретения “мытье” включает, но без ограничений, промывание и механическое мытье. В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции по настоящему изобретению применяют в концентрациях от примерно 500 м.д. до примерно 15000 м.д. в растворе. В некоторых вариантах осуществления, в которых растворителем для мытья является вода, температура воды, как правило, варьируется в диапазоне от примерно 5°C до примерно 90°C.

Настоящее изобретение предоставляет способы чистки или мытья предмета или поверхности (например, твердой поверхности), нуждающейся в чистке, включая, но без ограничений, способы чистки или мытья предмета столовой посуды, предмета столовой утвари, тканевого предмета, предмета белья, предмета личной гигиены и т.д. или подобного, и способы чистки или мытья твердой или мягкой поверхности (например, твердой поверхности предмета).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способ чистки предмета, объекта или поверхности, нуждающихся в чистке, при этом способ включает приведение в контакт предмета или поверхности (или сегмента предмета или поверхности, которые необходимо очистить) по меньшей мере с одной вариантной субтилизиновой протеазой по настоящему изобретению или композицией по настоящему изобретению в течение достаточного времени и/или в условиях, подходящих и/или эффективных для чистки предмета, объекта или поверхности до требуемой степени. Некоторые такие способы дополнительно включают ополаскивание предмета, объекта или поверхности водой. Для других таких способов чистящая композиция представляет собой моющую композицию для мытья посуды, а предмет или объект, подлежащий чистке, представляет собой предмет столовой посуды или предмет столовой утвари. Применяемый в настоящем изобретении “предмет столовой посуды” представляет собой предмет, обычно применяемый для сервировки или приема пищи. Предметом столовой посуды может быть, но без ограничений, например, блюдо, тарелка, чашка, миска и т.д. и т.п. Применяемая в настоящем изобретении “столовая утварь” является более широким термином, который включает, но без ограничений, например, блюда, кухонные ножи, ножи, вилки, ложки, палочки для еды, стеклянную посуду, кувшины, соусницы, емкости для напитков, сервировочные предметы и т.д. Подразумевается, что “предмет столовой утвари” включает любой из этих или подобных предметов для сервировки или приема пищи. Для некоторых таких способов чистящая композиция представляет собой моющую композицию для автоматического мытья посуды или моющую композицию для ручного мытья посуды, а подлежащий чистке предмет или объект представляет собой предмет столовой посуды или столовой утвари. Для некоторых таких способов чистящей композицией является моющая композиция для белья (например, порошковая моющая композиция для белья или жидкая моющая композиция для белья), а подлежащий чистке предмет представляет собой тканевой предмет. В некоторых других вариантах осуществления чистящая композиция представляет собой композицию для предварительной обработки белья. Чистящая композиция может включать чистящее средство для твердой поверхности.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способы чистки или мытья тканевого предмета, необязательно нуждающегося в чистке или мытье, соответственно. В некоторых вариантах осуществления способы включают обеспечение композиции, включающей вариантную протеазу, включая, но без ограничений, чистящую композицию для белья или ткани, и тканевого предмета или предмета белья, нуждающегося в чистке, и приведение в контакт тканевого предмета или предмета белья (или сегмента предмета, требующего чистки) с композицией в условиях, достаточных или эффективных для чистки или мытья тканевого предмета или предмета белья до требуемой степени.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способ чистки или мытья предмета или поверхности (например, твердой поверхности), необязательно нуждающейся в чистке, при этом способ включает обеспечение предмета или поверхности, подлежащих чистке или мытью, и приведение в контакт предмета или поверхности (или сегмента предмета или поверхности, подлежащих чистке или мытью) по меньшей мере с одним вариантом субтилизина по настоящему изобретению или композицией по настоящему изобретению, включающей по меньшей мере один такой вариант субтилизина, в течение достаточного времени и/или в условиях, достаточных или эффективных для чистки или мытья предмета или поверхности до требуемой степени. Такие композиции включают, но без ограничений, например, чистящую композицию или моющую композицию по настоящему изобретению (например, моющую композицию для ручного мытья посуды, чистящую композицию для ручного мытья посуды, моющее средство для белья или моющее средство для ткани или чистящую композицию для белья или ткани, жидкое моющее средство для белья, жидкую чистящую композицию для белья, порошковую моющую композицию для белья, порошковую чистящую композицию для белья, моющую композицию для автоматического мытья посуды, чистящую или моющую композицию-усилитель для белья, чистящую добавку для белья и композицию для предварительного замачивания белья и т.д.). В некоторых вариантах осуществления данный способ повторяют один или более раз, особенно если необходима дополнительная чистка или дополнительное мытье. Например, в некотором случае, данный способ необязательно дополнительно включает предоставление возможности предмету или поверхности оставаться в контакте по меньшей мере с одной вариантной протеазой или композицией в течение периода времени, достаточного или эффективного для чистки или мытья предмета или поверхности до требуемой степени. В некоторых вариантах осуществления данные способы дополнительно включают ополаскивание предмета или поверхности водой и/или другой жидкостью. В некоторых вариантах осуществления данные способы дополнительно включают приведение в контакт предмета или поверхности по меньшей мере с одной вариантной протеазой по настоящему изобретению или композицией по настоящему изобретению еще раз и предоставление возможности предмету или поверхности оставаться в контакте по меньшей мере с одной вариантной протеазой или композицией в течение периода времени, достаточного для чистки или мытья предмета или поверхности до требуемой степени. В некоторых вариантах осуществления чистящая композиция представляет собой моющую композицию для мытья посуды, а предмет, подлежащий чистке, представляет собой предмет столовой посуды или столовой утвари. В некоторых вариантах осуществления настоящих способов чистящая композиция представляет собой моющую композицию для автоматического мытья посуды или моющую композицию для ручного мытья посуды, а предмет, подлежащий чистке, представляет собой предмет столовой посуды или столовой утвари. В некоторых вариантах осуществления данных способов чистящая композиция представляет собой моющую композицию для белья, а предмет, подлежащий чистке, представляет собой тканевой предмет.

Настоящее изобретение также предоставляет способы чистки предмета столовой утвари или предмета столовой посуды в машине для автоматического мытья посуды, при этом способ включает обеспечение машины для автоматического мытья посуды, размещение некоторого количества композиции для автоматического мытья посуды, включающей по меньшей мере один вариант субтилизина по настоящему изобретению или композиции по настоящему изобретению, достаточного для чистки предмета столовой утвари или предмета столовой посуды в машине (например, путем размещения композиции в соответствующей или предоставленной камере или диспенсере для моющего средства в машине), расстановку предмета столовой посуды или столовой утвари в машине и эксплуатирование машины так, чтобы чистить предмет столовой утвари или предмет столовой посуды (например, согласно инструкциям производителя). В некоторых вариантах осуществления способы включают любую композицию для автоматического мытья посуды, описанную в настоящем изобретении, которая включает, но без ограничений, по меньшей мере один вариант субтилизина, представленный в настоящем изобретении. Количество композиции для автоматического мытья посуды, которое нужно применять, можно легко определить в соответствии с инструкциями или рекомендациями производителя и можно использовать любую форму композиции для автоматического мытья посуды, включающей по меньшей мере одну вариантную протеазу по настоящему изобретению (например, жидкую, порошковую, твердую, гелеобразную, таблетированную и т.д.), включая любую описанную в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение также предоставляет способы чистки поверхности, предмета или объекта, необязательно нуждающегося в чистке, при этом способ включает приведение в контакт предмета или поверхности (или сегмента предмета или поверхности, требующего чистки) по меньшей мере с одним вариантным субтилизином по настоящему изобретению или чистящей композицией по настоящему изобретению в чистой форме, или разведенной в жидкости для мытья, в течение достаточного времени и/или в условиях, достаточных или эффективных для чистки или мытья предмета или поверхности до требуемой степени. Поверхность, предмет или объект затем, при необходимости, можно (необязательно) мыть и/или полоскать. Для целей настоящего изобретения “мытье” включает, но без ограничения, например, промывание и механическое перемешивание. В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции используют в концентрациях от примерно 500 м.д. до примерно 15000 м.д. в растворе (например, водном растворе). Если растворителем для мытья является вода, то температура воды, как правило, варьирует в диапазоне от примерно 5°C до примерно 90°C, и если поверхность, предмет или объект включает ткань, то массовое соотношение воды к ткани, как правило, составляет от примерно 1:1 до примерно 30:1.

Настоящее изобретение также предоставляет способы чистки предмета белья или тканевого предмета в моющей машине, при этом способ включает обеспечение моющей машины, размещение некоторого количества моющей композиции для белья, включающей по меньшей мере один вариантный субтилизин по настоящему изобретению, достаточного для чистки предмета белья или тканевого предмета в машине (например, путем размещения композиции в соответствующей или предоставленной камере или диспенсере для моющего средства в машине), помещение предмета белья или тканевого предмета в машине и эксплуатирование машины так, чтобы очистить предмет белья или тканевой предмет (например, согласно инструкциям производителя). Способы по настоящему изобретению включают любую моющую композицию для мытья белья, описанную в настоящем изобретении, включающую, но без ограничений, по меньшей мере один любой вариантный субтилизин, представленный в настоящем изобретении. Количество моющей композиции для белья, которое нужно применять, можно легко определить в соответствии с инструкциями или рекомендациями производителя и можно использовать любую форму моющей композиции для белья, включающей по меньшей мере одну вариантную протеазу по настоящему изобретению (например, твердую, порошковую, жидкую, таблетированную, гелеобразную и т.д.), включая любую описанную в настоящем изобретении.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Настоящее изобретение дополнительно подробно описано в следующих примерах, которые не предназначены каким-либо образом для ограничения заявляемого объема настоящего изобретения.

В экспериментальном раскрытии, следующем далее, употребляются следующие сокращения: PI (эффективность), м.д. (миллионные доли); M (молярный); мМ (миллимолярный); мкМ (микромолярный); нМ (наномолярный); моль (моли); ммоль (миллимоли); мкмоль (микромоли); нмоль (наномоли); г (граммы); мг (миллиграммы); мкг (микрограммы); пг (пикограммы); л (литры); мл и млитр (миллилитры); мкл и мклитр (микролитр); см (сантиметры); мм (миллиметры); мкм (микрометры); нм (нанометры); Е (единицы); В (Вольты); МВ (молекулярный вес); с (секунды); мин(ы) (минута/минуты); ч(ы) (час/часы); °C (градусы Цельсия); QS (количество достаточное); ND (не выполнено); об/мин (оборотов в минуту); GH (германские градусы жесткости); H2O (вода); dH2O (деионизированная вода); HCl (соляная кислота); АК (аминокислота); по (пара оснований); тпо (тысяча пар оснований); кДа (килоДальтоны); кДНК (копийная или комплементарная ДНК); ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота); оцДНК (одноцепочечная ДНК); дцДНК (двухцепочечная ДНК); dNTP (дезоксирибонуклеотидфосфат); РНК (рибонуклеиновая кислота); MgCl2 (хлорид магния); NaCl (хлорид натрия); вес./об. (вес к объему); об./об. (объем к объему); вес./вес. (вес к весу); g (ускорение свободного падения); OD (оптическая плотность); м.д. (миллионные доли); фосфатный буферный раствор Дульбекко (DPBS); SOC (2% Bacto-триптон, 0,5% Bacto-дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl); Terrific Broth (TB; 12 г/л Bacto-триптон, 24 г/л глицерин, 2,31 г/л KH2PO4, и 12,54 г/л K2HPO4); OD280 (оптическая плотность при 280 нм); OD600 (оптическая плотность при 600 нм); A405 (поглощение при 405 нм); Vmax (максимальная начальная скорость реакции, катализируемой ферментом); PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле); PBS (фосфатно-солевой буферный раствор [150 мМ NaCl, 10 мМ буфер из фосфата натрия, pH 7,2]); PBST (PBS+0,25% TWEEN®-20); PEG (полиэтиленгликоль); PCR (полимеразная цепная реакция); RT-PCR (ПЦР с обратной транскрипцией); SDS (додецилсульфат натрия); Tris (трис(гидроксиметил)аминометан); HEPES (N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N-[2-этансульфоновая кислота]); HBS (HEPES-буферный солевой раствор); Tris-HCl (трис[гидроксиметил]аминометан-гидрохлорид); трицин (N-[трис-(гидроксиметил)-метил]-глицин); CHES (2-(N-циклогексиламино) этансульфоновая кислота); TAPS (3-{[трис-(гидроксиметил)-метил]-амино}-пропансульфоновая кислота); CAPS (3-(циклогексиламино)-пропансульфоновая кислота; DMSO (диметилсульфоксид); DTT (1,4-дитио-DL-треитол); SA (синапиновая кислота (s,5-диметокси-4-гидроксифенилакриловая кислота); TCA (трихлоруксусная кислота); Glut и GSH (восстановленный глутатион); GSSG (окисленный глутатион); TCEP (трис[2-карбоксиэтил]фосфин); Ки (Кюри); мКи (миллиКюри); мкКи (микроКюри); ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография); ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография); ТСХ (тонкослойная хроматография); MALDI-TOF (времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы); Ts (тозил); Bn (бензил); Ph (фенил); Ms (мезил); Et (этил), Me (метил); Taq (ДНК-полимераза Thermus aquaticus); Кленова (большой (Кленова) фрагмент ДНК-полимеразы I); EGTA (этиленгликоль-бис(β-аминоэтилэфир) N,N,N',N'-тетрауксусная кислота); EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); bla (β-лактамазный ген или ген устойчивости к ампициллину); MJ Research (MJ Research, Рино, Невада); Baseclear (Baseclear BV, Inc., Лейден, Нидерланды); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Фрамингэм, Массачусетс); ThermoFinnigan (ThermoFinnigan, Сан-Хосе, Калифорния); Argo (Argo BioAnalytica, Морис Плэйнс, Нью-Джерси);Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Бад-Кройцнах, Германия); Pall (Pall Corp., Ист-Хиллс, Нью-Йорк и Бад-Кройцнах, Германия); Spectrum (Spectrum Laboratories, Домингез Ранчо, Калифорния); Molecular Structure (Molecular Structure Corp., Вудлендс, Техас); Accelrys (Accelrys, Inc., Сан Диего, Калифорния); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Монреаль, Канада); New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Эдисон, Нью-Джерси); CFT (Центр тестируемых материалов, Влаардинген, Нидерланды); P&G и Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Цинциннати, Огайо); GE Healthcare (GE Healthcare, Чалфонт Сант-Джайлс, Соединенное Королевство); DNA2.0 (DNA2.0, Менло-Парк, Калифорния); OXOID (Oxoid, Бейзингсток, Гэмпшир, Великобритания); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Виклоу, Ирландия); Finnzymes (Finnzymes Oy, Эспо, Финляндия); Kelco (CP Kelco, Уилмингтон, Делавер); Corning (Corning Life Sciences, Корнинг, Нью-Йорк); (NEN (NEN Life Science Products, Бостон, Массачусетс); Pharma AS (Pharma AS, Осло, Норвегия); Dynal (Dynal, Осло, Норвегия); Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Левисвилл, Техас); ATCC (Американская коллекция типовых культур, Роквилл, Мэриленд); Gibco/BRL (Gibco/BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк); Sigma (Sigma Chemical Co., Сант-Луис, Миссури); Pharmacia (Pharmacia Biotech, Пискатавэй, Нью-Джерси); NCBI (Национальный центр биотехнологической информации); Applied Biosystems (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния); BD Biosciences и/или Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Пало Альто, Калифорния); Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Аламеда, Калифорния); MWG Biotech (MWG Biotech, Хай-Пойнт, Северная Каролина); Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Вилсонвилл, Орегон); Bachem (Bachem Bioscience, Inc., Кинг-оф-Пруссия, Пенсильвания); Difco (Difco Laboratories, Детройт, Мичиган); Mediatech (Mediatech, Херндон, Виржиния; Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Санта-Круз, Калифорния); Oxoid (Oxoid Inc., Огденбург, Нью-Йорк); Worthington (Worthington Biochemical Corp., Фрихолд, Нью-Джерси); GIBCO BRL или Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Гейтерсберг, Мэриленд); Millipore (Millipore, Биллерика, Массачусетс); Bio-Rad (Bio-Rad, Херкулес, Калифорния); Invitrogen (Invitrogen Corp., Сан-Диего, Калифорния); NEB (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс); Sigma (Sigma Chemical Co., Сант-Луис, Миссури); Pierce (Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс); Takara (Takara Bio Inc. Отсу, Япония); Roche (Hoffmann-La Roche, Базель, Швейцария); EM Science (EM Science, Гиббстаун, Нью-Джерси); Qiagen (Qiagen, Inc., Валенсия, Калифорния); Biodesign (Biodesign Intl., Сако, Мэйн); Aptagen (Aptagen, Inc., Херндон, Виржиния); Sorvall (Sorvall brand, из Kendro Laboratory Products, Ашвилл, Северная Каролина); Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Саннивейл, Калифорния); R&D Systems (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота); Siegfried Handel (Siegfried Handel AG, Зофинген, Швейцария); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, Ла-Хойя, Калифорния); Marsh (Marsh Biosciences, Рочестер, Нью-Йорк); Geneart (Geneart GmbH, Регенсбург, Германия); Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Винуски, Вермонт); (Biacore (Biacore, Inc., Пискатавэй, Нью-Джерси); PeproTech (PeproTech, Роки-Хилл, Нью-Джерси); SynPep (SynPep, Дублин, Калифорния); New Objective (New Objective brand; Scientific Instrument Services, Inc., Рингоуз, Нью-Джерси); Waters (Waters, Inc., Милфорд, Массачусетс); Matrix Science (Matrix Science, Бостон, Массачусетс); Dionex (Dionex, Corp., Саннивейл, Калифорния); Monsanto (Monsanto Co., Сант-Луис, Миссури); Wintershall (Wintershall AG, Кассель, Германия); BASF (BASF Co., Флорхэм-Парк, Нью-Джерси); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Солт-Лейк-Сити, Юта); Shell Chemicals (Shell Chemicals, Inc., Лондон, Великобритания); Stepan (Stepan, Норфилд, Иллинойс); Clariant (Clariant, Шульцбах, Германия); Industrial Zeolite (Industrial Zeolite Ltd., Грэйз, Эссекс, Великобритания); Jungbunzlauer (Jungbunzlauer, Базель, Швейцария); Solvay (Solvay, Брюссель, Бельгия); 3V Sigma (3V Sigma, Бергамо, Италия); Innospec (Innospec, Эллесмер-Порт, Великобритания); Thermphos (Thermphos, Влиссигген-Ост, Нидерланды); Ciba Specialty (Ciba Specialty Chemicals, Базель, Швейцария); Dow Corning (Dow Corning, Барри, Великобритания); Enichem (Enichem Iberica, Барселона, Испания); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Букс, Швейцария); Gist-Brocades (Gist-Brocades, Невада, Делфт, Нидерланды); Dow Corning (Dow Corning Corp., Мидленд, Мичиган); Mettler-Toledo (Mettler-Toledo Inc, Колумбус, Огайо); RB (Reckitt-Benckiser, Слау, Великобритания); и Microsoft (Microsoft, Inc., Редмонд, Вашингтон).

Применяемый в настоящем изобретении в некоторых перечнях предшествующий “0” указан для того, чтобы привести трехцифровое обозначение для каждого сайта (например, “001” является тем же “1,” таким образом “A001C” является тем же “A1C”). В некоторых перечнях предшествующий “0” не включен. Кроме того, применяемый в настоящем изобретении “X” означает любую аминокислоту.

В иллюстративных моющих композициях, представленных в настоящем изобретении, уровни ферментов выражены посредством чистого фермента от массы совокупной композиции и, если не указано иное, моющие ингредиенты выражены от массы от совокупных композиций. Сокращенные обозначения компонентов в настоящем изобретении имеют следующие значения:

Сокращение Ингредиент
LAS : Линейный C11-13 алкилбензолсульфонат натрия.
NaC16-17HSAS : Хорошо растворимый C16-17 алкилсульфат натрия
TAS : Таллоуалкилсульфат натрия.
CxyAS : C1x-C1y алкилсульфат натрия.
CxyEz : C1x-C1y преимущественно линейный первичный спирт, конденсированный со средним z молей этиленоксида.
CxyAEzS : C1x-C1y алкилсульфат натрия, конденсированный со средним z молей этиленоксида. В примерах добавлено название молекулы.

Сокращение Ингредиент
Неионный : Смешанный этоксилированный/пропоксилированный жирный спирт, например, Plurafac LF404, являющийся спиртом со средней степенью этоксилирования 3,8 и средней степенью пропоксилирования 4,5.
QAS : R2.N+(CH3)2(C2H4OH) с R2=C12-C14.
Силикат : Аморфный силикат натрия (соотношение SiO2:Na2O=1,6-3,2:1).
Метасиликат : Метасиликат натрия (соотношение SiO2:Na2O= 1,0).
Цеолит A : Гидратированный алюмосиликат с формулой Na12(A1O2SiO2)12. 27H2O
SKS-6 : Кристаллический слоистый силикат с формулой δ-Na2Si2O5.
Сульфат : Безводный сульфат натрия.
STPP : Триполифосфат натрия.
MA/AA : Статистический сополимер 4:1 акрилат/малеат, средняя молекулярная масса примерно 70000-80000.
AA : Полимер полиакрилат натрия со средней молекулярной массой 4500.

Сокращение Ингредиент
Поликарбоксилат : Сополимер, включающий смесь карбоксилированных мономеров, таких как акрилат, малеат и метилакрилат с MW, варьирующим от 2000 до 80000, как, например, Sokolan, коммерчески доступный от BASF, являющийся сополимером акриловой кислоты, MW4500.
BB1 : 3-(3,4-дигидроизохинолиния)пропансульфонат
BB2 1-(3,4-дигидроизохинолиния)декан-2-сульфат
PB1 : Перборат моногидрат натрия.
PB4 : Перборат тетрагидрат натрия с условной формулой NaBO3.4H2O.
Перкарбонат : Натрия перкарбонат с условной формулой 2Na2CO3.3H2O2.
TAED : Тетраацетилэтилдиамин.
NOBS : Нонаноилоксибензолсульфонат в форме натриевой соли.
DTPA : Диэтилентриаминпентауксусная кислота.
HEDP : 1,1-гидроксиэтандифосфоновая кислота.
DETPMP : Диэтилтриаминпента(метилен)фосфонат, поставляемый на рынок Monsanto под торговым названием Dequest 2060.
EDDS : Этилендиамин-N,N'-диянтарная кислота, (S,S) изомер в форме его натриевой соли

Сокращение Ингредиент
Диамин : Диметиламинопропиламин; 1,6-гександиамин; 1,3-пропандиамин; 2-метил-1,5-пентандиамин; 1,3-пентандиамин; 1-метил-диаминопропан.
DETBCHD 5,12-диэтил-1,5,8,12-тетраазабицикло[6,6,2]гексадекан, дихлорид, соль Mn(II)
PAAC : Пентааминацетатная соль кобальта(III).
Парафин : Парафиновое масло, продаваемое под торговым названием Winog 70 от Wintershall.
Парафинсульфонат : Парафиновое масло или воск, в котором несколько атомов водорода замещены сульфонатными группами.
Альдозоксидаза : Оксидазный фермент, продаваемый под торговым названием альдозоксидаза от Novozymes A/S
Галактозоксидаза : Галактозоксидаза от Sigma
nprE : Рекомбинантная форма нейтральной металлопротеазы, экспрессируемой у Bacillus subtilis (см., например, WO 07/044993)
PMN : Очищенная нейтральная металлопротеаза от Bacillus amyloliquefacients.

Сокращение Ингредиент
Амилаза : Подходящий амилолитический фермент, такой как те, которые продаются под торговыми названиями PURAFECT ® Ox, описанные в WO 94/18314, WO96/05295, продаваемые от Genencor; NATALASE®, TERMAMYL, FUNGAMYl и DURAMYL™, все доступны от Novozymes A/S.
Липаза : Подходящий липолитический фермент, такой как те, которые продаются под торговыми названиями LIPEX®, LIPOLASE®, LIPOLASE® Ultra от Novozymes A/S и Lipomax™ от Gist-Brocades.
Целлюлаза : Подходящий целлюлозолитический фермент, такой как те, что продаются под торговыми названиями CAREZYME®, CELLUZYME® и/или ENDOLASE® от Novozymes A/S.
Пектинлиаза : Подходящая пектинлиаза, такая как продаваемые под торговыми названиями PECTAWAY® и PECTAWASH®, доступные от Novozymes A/S.
PVP : Поливинилпирролидон со средней молекулярной массой 60000
PV№ : Поливинилпиридин-N-оксид со средней молекулярной массой 50000.

Сокращение Ингредиент
PVPVI : Сополимер винилимидазола и винилпирролидона со средней молекулярной массой 20000.
Оптический отбеливатель 1 : Динатрия 4,4'-бис(2-сульфостирил)бифенил.
Силиконовый пеногаситель : Полидиметилсилоксановый регулятор пенообразования с силоксан-оксиалкиленовым сополимером в качестве диспергирующего средства с соотношением указанного регулятора пенообразования к указанному диспергирующему средству от 10:1 к 100:1.
Подавитель пенообразования : 12% Силикон/диоксид кремния, 18% стеариловый спирт, 70% крахмал в гранулированной форме.
SRP 1 : Сложные полиэфиры с анионоблокированной концевой группой.
PEG X : Полиэтиленгликоль с молекулярной массой x.
PVP K60 ® : Винилпирролидоновый гомополимер (средняя MW 160000)
Jeffamine ® ED-2001 : Блокированный полиэтиленгликоль от Huntsman
Isachem ® AS : Разветвленный алкилсульфат спирта от Enichem
MME PEG (2000) : Монометиловый эфир полиэтиленгликоля (MW 2000) от Fluka Chemie AG.

Сокращение Ингредиент
DC3225C : Силиконовый подавитель пенообразования, смесь силиконового масла и диоксида кремния от Dow Corning.
TEPAE : Тетраэтиленпентааминэтоксилат.
BTA : Бензотриазол.
Бетаин : (CH3)3N+CH2COO-
Сахар : Промышленная D-глюкоза или пищевой сахар
CFAA : C12-C14 алкил N-метилглюкамид
TPKFA : C12-C14 отогнанные цельные фракции жирных кислот.
Глина : Гидратированный силикат алюминия с общей формулой Al2O3SiO2∙xH2O. Типы: каолинит, монтмориллонит, атапульгит, иллит, бентонит, галлуазит.
pH : Измеренный как 1% раствор в дистиллированной воде при 20°C.

Для североамериканских (NA) и западноевропейских (WE) жидких моющих средств с высокой моющей способностью (HDL) для белья тепловую инактивацию ферментов, присутствующих в коммерчески доступных моющих средствах, выполняют путем помещения предварительно взвешенного жидкого моющего средства (в стеклянной бутылке) в воду при 95°C на 2 часа. Время инкубации для тепловой инкубации NA и WE моющих средств для автоматического мытья посуды (ADW) составляет 8 часов. Как обработанные, так и необработанные теплом моющие средства оценивают в течение 5 минут после растворения моющего средства для точного определения процента дезактивации. Ферментную активность тестируют с помощью AAPF-анализа.

Для испытания ферментной активности в инактивированных теплом моющих средствах рабочие растворы моющих средств делают из инактивированных теплом исходных растворов. Соответствующие количества ионов жесткости воды (например, 6 гран/галлон или 12 гран/галлон) и буфера добавляют к моющим растворам для приведения в соответствие с требуемыми условиями. Растворы смешивают путем интенсивного перемешивания или переворачивания бутылок. Следующая таблица А предоставляет информацию относительно некоторых моющих композиций. В некоторых экспериментах дополнительные и/или другие коммерчески доступные моющие средства находят применение в следующих Примерах.

Таблица А приводит гранулированные моющие композиции для белья, получаемые в соответствии с данным изобретением, пригодные для стирки тканей.

Таблица А
Гранулированные моющие композиции для белья и их компоненты
Компонент Моющие композиции
1 2 3 4 5 6
Линейный алкилбензолсульфонат с длиной алифатической углеродной цепи C11-C12 15 12 20 10 12 13
Другие поверхностно- 1,6 1,2 1,9 3,2 0,5 1,2

активные вещества
Фосфатная модифицирующая добавка(добавки) 2 3 4
Цеолит 1 1 4 1
Силикат 4 5 2 3 3 5
Карбонат натрия 2 5 5 4 0 3
Полиакрилат (MW 4500) 1 0,6 1 1 1,5 1
Карбоксиметилцеллюлоза
(Finnfix BDA, ранее - CPKelco)
1 - 0,3 - 1,1 -
Celluclean® (15,6 мгран/галлон) 0,23 0,17 0,5 0,2 0,2 0,6
Протеаза для холодной воды* 0,23 0,17 0,05 0,2 0,03 0,1
Stainzyme Plus® (14 мгран/галлон) 0,23 0,17 0,5 0,2 0,2 0,6
Mannaway 4.0T (4 мгран/галлон) 0,1 0,1 0,1
Lipex 100T (18,6 мгран/галлон) 0,2 0,1 0,3
Флуоресцентный оптический отбеливатель(и) 0,16 0,06 0,16 0,18 0,16 0,16
Диэтилентриамин пентауксуная кислота 0,6 0,6 0,25 0,6 0,6

или этилендиамин-тетрауксусная кислота
MgSO4 1 1 1 0,5 1 1
Отбеливатель(и) и активатор(ы) отбеливателя 6,88 6,12 2,09 1,17 4,66
Этоксилированный тиофен окрашивающий краситель5 0,002 0,001 0,003 0,003 - -
Прямой фиолетовый 9 быв. Ciba Specialty Chemicals 0,0006 0,0004 0,0006
Сульфат/уксусная кислота/бикарбонат натрия/влага/отдушка Остальная часть до 100%
1Статистический привитой сополимер представляет собой сополимер поливинилацетата, привитого на полиэтиленоксид, имеющий полиэтиленоксидный остов и множество поливинилацетатных боковых цепей. Молекулярная масса полиэтиленоксидного остова составляет примерно 6000, и массовое соотношение полиэтиленоксида к поливинилацетату составляет примерно 40 к 60 и не более чем по 1 точке прививки на 50 этиленоксидных элементарных звеньев.
2Полиэтиленимин (MW=600) с 20 этоксилатными группами на -NH.
3Амфифильный, алкоксилированный, чистящий от жира полимер представляет собой полиэтиленимин (MW=600) с 24 этоксилатными

группами на -NH и 16 пропоксилатными группами на –NH.
4Обратимо действующий ингибитор протеазы со структурой:

5Этоксилированный тиофен окрашивающий краситель является таким, как описано в US 7208459 B2.

В таблице А все уровни ферментов выражены как % ферментного сырья, за исключением протеазы для холодной воды (по настоящему изобретению), которая выражена как % активного белка, добавляемого к продукту.

Таблица В приводит гранулированные моющие композиции для белья, подходящие для автоматических моющих машин с верхней загрузкой (моющие композиции 7-9) и моющих машин с фронтальной загрузкой (моющие композиции 10-11). Испытываемый вариант протеазы GG36 и/или протеазу для холодной воды по настоящему изобретению в данные составы добавляют отдельно.

Таблица В
Гранулированные моющие композиции для белья и их компоненты
Компонент Моющая композиция
7 8 9 10 11
Поверхностно-активные вещества
C16-17 Разветвленный алкилсульфат 3,55 15,8

C12-14 алкилсульфат 1,5
Линейный алкилбензолсульфонат натрия с длиной алифатической цепи C11-C12 9,6 10,6 7,5 9
Натрия этокси-3-сульфат C14/15 спирта 1,15 2,88
Натрия C14/15 алкилсульфат 2,37
Этоксилат C14/15 спирта с в среднем 7 молями этоксилирования 1,17 1
Четвертичный хлорид моно-C8-10алкил-моно-гидроксилэтил диметиламмония 0,45
Диметилгидроксилэтиллауриламмония хлорид 0,18
Цеолит A 13,9 4,7 0,01 2,9 1,8
Силикат натрия с соотношением 1,6 4 0,2 4 4
Силикат натрия с соотношением 2,35 8
Уксусная кислота 2,5 1,4
Триполифосфат натрия 5
Карбонат натрия 24,1 30 16,9 24,4 21

Нонаноилоксибензол-сульфонат 5,78 2,81 0,96
Усилитель отбеливателя на основе оксазиридиния 0,03 0,017
Тетранатрия S,S,-этилендиаминдисукцинат 0,2
Диэтилентриаминпента
(метиленфосфоновая кислота), гептанатриевая соль
0,61 0,33
Гидроксиэтандиметилен-фосфоновая кислота 0,29 0,45
Этилендиаминтетраацетат 0,27
MgSO4 0,47 0,5994 0,782
Перкарбонат натрия 7 4,4 15,9 19,1
Тетраацетилэтилендиамин 3,3 4,6
Моногидрат пербората натрия 1,2
Карбоксиметилцеллюлоза
(например,. Finnfix BDA, ранее CPKelco)
0,1 0,17 1,69 0,23
Натриевая соль сополимера акриловой кислоты и малеиновой кислоты (70/30) 0,0236 3,8 2 2,5
Полиакрилат натрия (Sokalan PA30 CL) 4 0,84

Терефталатный полимер 0,23
Статистический привитый сополимер полиэтилен-гликоля и винилацетата 0,89 0,89 0,91
Фотоотбеливатель- тетрасульфонат фталоцианина цинка 0,005 0,001 0,002
C.I.Флуоресцентный оптический отбеливатель 260 0,11 0,15 0,04 0,23 0,15
C.I.Флуоресцентный оптический отбеливатель 351 (Tinopal ® CBS) 0,1
Подавитель пенообразования, гранулированный 0,25 0,07 0,04
Гидрофобно модифицированная карбоксиметилцеллюлоза (Finnifix ® SH-1) 0,019 0,028
Бентонит 8,35
Разное (красители, отдушки, технологические добавки, влага и сульфат натрия) Осталь-ное Осталь-ное Осталь-ное Осталь-ное Осталь-ное

В таблице В ингредиенты-поверхностно-активные вещества можно получить от различных поставщиков, включая, но не ограничивая, BASF (например, LUTENSOL®), Shell Chemicals, Stepan, Huntsman и Clariant (например, PRAEPAGEN®). Цеолит можно получить от таких источников, как Industrial Zeolite. Лимонную кислоту и цитрат натрия можно получить от таких источников, как Jungbunzlauer. Перкарбонат натрия, карбонат натрия, бикарбонат натрия и сесквикарбонат натрия можно получить от таких источников, как Solvay. Сополимеры акрилата и малеата можно получить от таких источников, как BASF. Карбоксиметилцеллюлозу и гидрофобно модифицированную карбоксиметилцеллюлозу можно получить от таких источников, как CPKelco. C.I. флуоресцентный оптический отбеливатель 260 можно получить от 3V Sigma (например, OPTIBLANC®, OPTIBLANC® 2M/G, OPTIBLANC® 2MG/LT Extra или OPTIBLANC® Ecobright. S,S-этилендиаминдисукцинат тетранатрия можно получить от таких источников, как In№spec. Терефталатный сополимер можно получить от Clariant (например, REPELOTEX SF 2). Кроме того, 1-гидроксиэтан-1,1-дифосфоновую кислоту можно получить от Thermphos. Усилитель отбеливателя на основе оксазиридиния имеет следующую структуру, где R1 = 2-бутилоктил, и был получен в соответствии с US 2006/0089284A1.

Ферменты NATALASE®, TERMAMYL®, STAINZYME PLUS®, CELLUCLEAN® и MANNAWAY®, можно получить от Novozymes. Тетрасульфонат фталоцианина цинка можно получить от Ciba Specialty Chemicals (например, TI№LUX® BMC). Подавитель пенообразования в гранулах можно получить от Dow Corning. В этих моющих композициях статистический привитой сополимер представляет собой сополимер поливинилацетата, привитого на полиэтиленоксид, имеющий полиэтиленоксидный остов и множество поливинилацетатных боковых цепей. Молекулярная масса полиэтиленоксидного остова составляет примерно 6000, и массовое соотношение полиэтиленоксида к поливинилацетату составляет примерно 40 к 60 и не более чем по 1 точке прививки на 50 этиленоксидных элементарных звеньев.

Таблицы С-E приводят дополнительные гранулированные моющие композиции, подходящие для моющих машин (моющие средства 36a-n). Испытываемый вариант протеазы GG36 или протеазу для холодной воды по настоящему изобретению в данные составы добавляют отдельно.

Таблица С
Дополнительные гранулированные моющие композиции для белья и их компоненты
Моющая композиция
Компонент 36a 36b 36c 36d 36e
Поверхностно-активные вещества
C10 неионный 0,1843
C16-17 разветвленный алкилсульфат 3,53 3,53 3,53
C12-14 алкилсульфат
Линейный алкилбензолсульфонат 8,98 8,98 8,98 13,58 14,75

натрия с длиной алифатической цепи C11-C12
Натрия этокси-3-сульфат C14/15 спирта 1,28 1,28 1,28
Натрия C14/15 алкилсульфат 2,36 2,36 2,36
Этоксилат C14/15 спирта с в среднем 7 молями этоксилирования
Четвертичный моно-C8-10 алкил-моно-гидроксил-этилдиметиламмония хлорид
Диметилгидроксилэтиллауриламмония хлорид 0,1803
Цеолит A 15,31 15,31 15,31 4,47
Бентонит 8,35
Силикат натрия с соотношением 1,6 0,16
Силикат натрия с соотношением 2,0 3,72 3,72 3,72 8,41
Силикат натрия с соотношением 2,35
Лимонная кислота 0,0066
Триполифосфат натрия 5,06
Карбонат натрия 26,1 26,18 26,1 15,9 29,0
Нонаноилоксибензол-
сульфонат
5,78 5,78 5,78 1,17 1,86

Усилитель отбеливателя на основе оксазиридиния 0,037 0,037 0,037
Тетранатрия S,S,-этилендиаминдисукцинат
Диэтилентриаминпента
(метиленфосфоновая кислота), гептанатриевая соль
0,62 0,62 0,62
Гидроксиэтандиметилен-осфоновая кислота
Этилендиаминтетраацетат 0,2701
MgSO4 0,056 0,056 0,056 0,47
Перкарбонат натрия 7,06 7,06 3,64
Тетраацетилэтилендиамин
Моногидрат пербората натрия 1,47
Карбоксиметилцеллюлоза
(например, Finnfix BDA, ранее CPKelco)
0,38 0,38 0,38 0,173
Натриевая соль сополимера акриловой кислоты и малеиновой кислоты(70/30) 3,79 3,78 3,79 3,64
Полиакрилат натрия (Sokalan PA30 CL) 3,78 3,78 3,78 0,842
Терефталатный полимер
Статистический привитой 0,89

сополимер полиэтилен-гликоля и винилацетата
Фотоотбеливатель- тетрасульфонат фталоцианина цинка
C.I.Флуоресцентный оптический отбеливатель 260 0,1125 0,1125 0,1125 0,043 0,15
C.I.Флуоресцентный оптический отбеливатель 351 (Tinopal® CBS) 0,0952
Подавитель пенообразования в гранулах 0,015 0,015 0,015 0,031
Гидрофобно модифицированная карбоксиметилцеллюлоза (Finnifix® SH-1)
Бентонит
Разное (красители, отдушки, технологические добавки, влага и сульфат натрия) Осталь-ное Осталь-ное Осталь-ное Осталь-ное Осталь-ное

Таблица D
Дополнительные гранулированные моющие композиции для белья и их компоненты
Моющая композиция
Компонент 36f 36g 36h 36i 36j
Поверхностно-активные вещества
C10 неионный 0,1142 0,2894 0,1885 0,1846 0,1885
C16-17 разветвленный алкилсульфат
C12-14 алкилсульфат
Линейный алкилбензол-сульфонат натрия с длиной алифатической цепи C11-C12 12,94 15,69 9,01 8,42 9,51
Натрия этокси - 3 - сульфат C14/15 спирта
Натрия C14/15 алкилсульфат
Этоксилат C12/14 спирта с в среднем 7 молями этоксилирования 2,9
Этоксилат C12/14 спирта с в среднем 3 молями этоксилирования 2,44

Этоксилат C14/15 спирта с в среднем 7 молями этоксилирования 0,97 1,17 0,97
Четвертичный моно-C8-10 алкил-моно-гидроксил-этилдиметиламмония хлорид 0,45
Диметилгидроксилэтил-лауриламмония хлорид 0,195 0,45
Цеолит A 2,01 0,39 1,83 2,58 0,59
Силикат натрия с соотношением 1,6 4,53 5,62 4,53
Силикат натрия с соотношением 2,0 10,1
Силикат натрия с соотношением 2,35 7,05
Лимонная кислота 1,4 1,84 1,0
Триполифосфат натрия 5,73
Карбонат натрия 12,65 15,93 21,0 27,31 20,2
Нонаноилоксибензол-сульфонат 1,73
Усилитель отбеливателя на основе оксазиридиния 0,0168 0,0333 0,024
Тетранатрия S,S,-этилендиаминдисукцинат

Диэтилентриаминпента(ме-тиленфосфоновая кисло-та), гептанатриевая соль 0,327 0,3272
Гидроксиэтандиметилен-фосфоновая кислота 0,45 0,2911 0,45
Этилендиаминтетраацетат 0,28 0,1957
MgSO4 0,54 0,79 0,6494 0,793
Перкарбонат натрия 19,1 15,85 22,5
Тетраацетилэтилендиамин 4,554 3,71 5,24
Моногидрат пербората натрия 5,55
Карбоксиметилцеллюлоза
(например, Finnfix BDA, ранее CPKelco)
0,62 0,21 0,23 1,07 0,2622
Натриевая соль сополимера акриловой кислоты и малеиновой кислоты(70/30) 0,40 2,61 2,5 2,00 1,75
Полиакрилат натрия(Sokalan PA30 CL) 0,0055 0,011 0,008
Терефталатный полимер 0,231
Статистический привитой сополимер полиэтилен-гликоля и винилацетата 0,55 1,40 0,911 0,8924 0,911

Фотоотбеливатель- тетрасульфонат фталоцианина цинка
C.I.Флуоресцентный оптический отбеливатель 260 0,1174 0,048 0,1455 0,2252 0,1455
C.I.Флуоресцентный оптический отбеливатель 351 (Tinopal® CBS) 0,1049
Подавитель пенообразования в гранулах 0,04 0,0658 0,04
Гидрофобно модифицированная карбоксиметилцеллюлоза (Finnifix® SH-1)
Бентонит
Разное (красители, отдушки, технологические добавки, влага и сульфат натрия) Осталь-ное Осталь-ное Осталь-ное Осталь-ное Осталь-
ное

Таблица Е
Дополнительные гранулированные моющие композиции для белья и их компоненты
Моющая композиция
Компонент 36k 36l 36m 36n
Поверхностно-активные вещества
C10 неионный 0,1979 0,1979 0,1979 0,1979
C16-17 разветвленный алкилсульфат
C12-14 алкилсульфат
Линейный алкилбензол-сульфонат натрия с длиной алифатической цепи C11-C12 8,92 8,92 11,5 11,5
Натрия этокси - 3 - сульфат C14/15 спирта 1,62 1,62 1,125 1,125
Натрия C14/15 алкилсульфат
Этоксилат C14/15 спирта с в среднем 7 молями этоксилирования 1,0 1,0 1,5 1,5
Четвертичный моно-C8-10 алкил-моно-гидроксиэтил-диметиламмония хлорид
Диметилгидроксилэтил-лауриламмония хлорид
Цеолит A 1,63 1,63 2,0 2,0

Силикат натрия с соотношением 1,6 4,75 4,75 4,75 4,75
Силикат натрия с соотношением 2,0 0,06 0,06
Силикат натрия с соотношением 2,35
Лимонная кислота 1,10 1,10 1,1 1,1
Триполифосфат натрия
Карбонат натрия 23,3 23,3 23,3 23,3
Нонаноилоксибензол-сульфонат
Усилитель отбеливателя на основе оксазиридиния 0,021 0,021 0,015 0,015
Тетранатрия S,S,-этилендиаминдисукцинат 0,26 0,26 0,26 0,26
Диэтилентриаминпента(мети-ленфосфоновая кислота), гептанатриевая соль
Гидроксиэтандиметилен-
фосфоновая кислота
0,47 0,47 0,47 0,47
Этилендиаминтетраацетат
MgSO4 0,83 0,83 0,82 0,82
Перкарбонат натрия 19,35 19,35 19,35 19,35
Тетраацетилэтилендиамин 4,51 4,51 4,51 4,51
Моногидрат пербората натрия

Карбоксиметилцеллюлоза
(например, Finnfix BDA, ранее CPKelco)
1,01 1,01 1,01 1,01
Натриевая соль сополимера акриловой кислоты и малеиновой кислоты (70/30) 1,84 1,84 1,84 1,84
Полиакрилат натрия(Sokalan PA30 CL) 0,007 0,007 0,005 0,005
Терефталатный полимер 0,179 0,179 0,179 0,179
Статистический привитый сополимер полиэтиленгликоля и винилацетата 0,96 0,96 0,96 0,96
Фотоотбеливатель- тетрасульфонат фталоцианина цинка
C.I.Флуоресцентный оптический отбеливатель 260 0,153 0,153 0,171 0,171
C.I.Флуоресцентный оптический отбеливатель 351 (Tinopal ® CBS)
Подавитель пенообразования в гранулах 0,042 0,042 0,042 0,042
Гидрофобно модифицированная