Композиция, включающая агонист рецептора glp-1 и агонист глюкагонового рецептора, и ее применение

Предложены фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения неалкогольной жировой болезни печени, похудения, снижения уровня сахара в крови, снижения уровня липидов, ингибирования аппетита у субъекта, снижения уровня общего холестерина в сыворотке и/или снижения содержания триглицеридов в печени, ее вариант, набор и применение указанных композиций. Указанная фармацевтическая композиция включает фармацевтически эффективное количество агониста рецептора GLP-1 и агониста глюкагонового рецептора. При этом агонист рецептора GLP-1 и агонист глюкагонового рецептора каждый независимо образуют конъюгат с гидрофильным полимером, молярное отношение конъюгата, включающего агонист рецептора GLP-1, к конъюгату, включающему агонист глюкагонового рецептора, составляет от 1:1 до 1:15. В указанной композиции агонист рецептора GLP-1 выбран из эксендина-4, эксендина-3 и GLP-1, а агонистом глюкагонового рецептора является глюкагон и гидрофильным полимером является полиэтиленгликоль. Вариант фармацевтической композиции включает средство, выбранное из группы, состоящей из: комбинации PB-721 и PB-119, комбинации PB-722 и PB-119 и комбинации PB-708 и PB-120, где PB-721 представляет собой мПЭГ-23KD-ppMAL-PB-740, где PB-740 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; PB-722 представляет собой мПЭГ-23KD-ppMAL-PB-741, где PB-741 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, в которой боковая цепь "-CO-NH₂" глутамина в 24 положении модифицирована в "-CO-NH-CH₂CH₂-SH"; PB-119 представляет собой мПЭГ-23KD-ppMAL-PB-105, где PB-105 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; PB-120 представляет собой мПЭГ-25KD-ppMAL-PB-105, где PB-105 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и PB-708 представляет собой мПЭГ-25KD-ppMAL-PB-703, где PB-703 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Предложен также набор для предупреждения или лечения неалкогольной жировой болезни печени, похудения, снижения уровня сахара в крови, снижения уровня липидов, ингибирования аппетита у субъекта, снижения уровня общего холестерина в сыворотке и/или снижения содержания триглицеридов в печени, включающий композицию. Композиция и ее вариант могут применяться для изготовления лекарственного средства для профилактики или лечения неалкогольной жировой болезни печени, похудения, снижения уровня липидов и/или снижения уровня сахара в крови, а также для изготовления лекарственного средства для подавления аппетита у субъекта, снижения уровня общего холестерина в сыворотке и/или снижения содержания триглицеридов в печени. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 40 ил., 3 табл., 21 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет китайской патентной завки № 201511017796.2, поданной 29 декабря 2015 года в Государственное ведомство по интеллектуальной собственности Китайской Народной Республики и озаглавленной ʺКомпозиция, включающая агонист рецептора GLP-1 и агонист глюкагонового рецептора, и ее применениеʺ, и раскрытие которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие относится к области медицины, в частности, относится к композиции, включающей агонист рецептора GLP-1 и агонист глюкагонового рецептора, и применению для снижения массы тела и/или снижения уровня липидов.

Предпосылки создания изобретения

В последние годы, когда экономическое развитие привело к изменениям в рационе питания и образе жизни, доля людей с ожирением увеличивается с каждым годом. Согласно последним статистическим данным Всемирной Организации Здравоохранения, число людей с ожирением и избыточным весом в мире выросло с 857 миллионов в 1980 году до 2,1 миллиарда в 2013 году, что составляет почти одну треть мирового населения. В 2014 году более 1,9 миллиарда взрослых в возрасте 18 лет и старше имели избыточный вес, из которых 600 миллионов страдали ожирением. В 2014 году 39% взрослых в возрасте 18 лет и старше имели избыточный вес, а 13% страдали ожирением. Избыточный вес и ожирение, которые когда-то считались проблемой для стран с высокими доходами, в настоящее время растут в странах с низким и средним уровнем доходов. Избыточный вес и ожирение повышают кровяное давление и уровень холестерина в крови, которые являются в перспективе основными факторами риска для некоторых заболеваний, включая диабет, сердечно-сосудистые заболевания и рак.

Изменение образа жизни (соответствующие физические упражнения и здоровое питание) часто не полностью контролируют развитие ожирения. В этом случае лекарственное вмешательство считается целесообразным и необходимым. Орлистат в настоящее время является единственной в мире диетической OTC таблеткой. Более 40 миллионов человек во всем мире принимали Орлистат и успешно теряли вес. В настоящее время это самый продаваемый продукт для похудения. Орлистат является сильным долгодействующим и специфическим ингибитором липаз желудочно-кишечного тракта, который непосредственно блокирует абсорбцию организмом содержащегося в пище жира, при этом жировая масса тела будет уменьшаться, когда потребление энергии и жира меньше чем расход, чтобы достичь цели потери веса. Однако у Орлистата есть несколько недостатков, например, его эффект снижения веса не является значительным для некоторых людей, и его нужно принимать каждый день во время еды или после еды, таким образом, схема приема этого средства плохо соблюдается пациентами. Кроме того, Орлистат также имеет риски, связанные с безопасностью. В мае 2010 года Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США предупредило о том, что Орлистат может вызвать серьезное повреждение печени. Поэтому необходимо разработать новые препараты для снижения массы тела, действующие через другие механизмы.

Глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) представляет собой полипептидный гормон, секретируемый L-клетками кишечника после еды, который может стимулировать секрецию инсулина из панкреатических островковых β клеток, стабилизируя таким образом постпрандиальный уровень сахара в крови. Экзогенное введение GLP-1 нормализует уровни сахара в крови у пациентов с диабетом II типа. Эффект GLP-1 на снижение уровня сахара в крови зависит от концентрации глюкозы, таким образом, сильно снижая риск гипогликемии при регулировании уровня сахара в крови. Лекарственные средства на основе GLP-1, такие как Баета, Виктоза, Албиглутид и Дулаглутид, успешно продаются на рынке в последние годы и постепенно занимают важные позиции среди лекарственных средств от диабета.

Клиническое применение показало, что GLP-1 препараты влияют на снижение веса при снижении уровня сахара в крови. Механизм может заключаться в том, что GLP-1 может воздействовать на желудочно-кишечный тракт, чтобы задержать опорожнение желудка и перистальтику кишечника, и GLP-1 может воздействовать на центральную нервную систему для подавления аппетита, повышения чувства насыщения и т.д., для достижения таким образом цели, состоящей в снижении потребления пищи. В 2014 году препарат Виктоза от Novo Nordisk был даже одобрен для снижения веса в качестве дополнительного показания. Однако из-за того, что препарат Виктоза имеет короткий период полужизни, пациенты, которых лечили препаратом Виктоза, должны были принимать препарат один раз каждый день, что приводит к усилению болей у пациентов при длительном применении.

Глюкагон представляет собой пептид с 29 аминокислотами, которые соответствуют аминокислотам 53-81 препроглюкагона, и имеет следующую последовательность: His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 2). Оксинтомодулин (OXM) представляет собой пептид с 37 аминокислотами, который включает полную 29 аминокислотную последовательность глюкагона и карбокси-концевое удлинение октапептида (аминокислоты 82-89 препроглюкагона). Обе компании Merck и Zeland разрабатывают производные оксинтомодулина для применения для снижения массы тела и снижения уровня глюкозы. Проект на основе двойного пептидного агониста для снижения массы тела, разработанный Merck, находится в фазе I клинических испытаний, тогда как zp2929, разработанный Zeland, все еще находится в предклинической фазе.

Хотя использование оксинтомодулина для снижения веса имеет привлекательную перспективу, оно все еще имеет свои недостатки. Например, период полужизни оксинтомодулина в плазме человека очень короткий (от 8 до 12 минут); как двойной агонист он имеет активность, которая является низкой, и способность активировать любой из рецепторов у него намного ниже, чем у исходного пептида, в результате чего доза, вводимая человеку, должна достигать уровня мг/кг. Кроме того, оксинтомодулин демонстрирует фиксированное соотношение агонистической активности в отношении обоих рецепторов, которое нельзя регулировать и которое может не быть наилучшим соотношением для проявления эффекта снижения веса. Поэтому главной сложностью для многих медицинских R&D работников стала оптимизация разработки лекарств для решения этих проблем.

Эксендин-4 представляет собой полипептид с 39 аминокислотами, выделенный из слюны мексиканской ящерицы, который показывает 53% гомологию с GLP-1. Исследования показали, что эксендин-4 также связывается с рецептором GLP-1 и демонстрирует агонистическую активность, фармакологически сходную с GLP-1.

Неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD) относится к патофизиологическому синдрому, который характеризуется избыточным отложением жира в клетках печени, вызванным определенными факторами повреждения печени, кроме алкоголя. Это приобретенное метаболическое стрессовое повреждение печени, и оно тесно связано с резистентностью к инсулину и генетической предрасположенностью. NAFLD включает неосложненное ожирение печени (SFL), неалкогольный стеатогепатит (NASH) и связанный с ним цирроз. С распространением ожирения и связанного с ним метаболического синдрома во всем мире безалкогольная жирная болезнь печени стала важной причиной долговременного заболевания печени в Европе, США и других развитых странах и богатых регионах Китая. У нормального взрослого населения распространенность NAFLD составляет от 10% до 30%, из которых от 10% до 20% составляет NASH, и в случае последнего частота цирроза достигла 25% за 10 лет. Неалкогольная жировая болезнь печени не только может непосредственно привести к компенсаторному циррозу печени, гепатоцеллюлярной карциноме и повторной трансплантации печени, но также может повлиять на прогрессирование других длительных заболеваний печени и участвовать в патогенезе диабета II типа и атеросклероза. Связанные с метаболическим синдромом злокачественные новообразования, артериосклеротические сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания и цирроз являются важными факторами, влияющими на качество жизни и продолжительность жизни пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени. По вышеуказанным причинам неалкогольная жировая болезнь печени является новой проблемой в области современной медицины, и в ближайшем будущем влияние неалкогольной жировой болезни печени на здоровье человека будет продолжать расти.

Сущность изобретения

В этом исследовании авторы настоящего изобретения к удивлению обнаружили, что одновременное введение модифицированного гидрофильным полимером агониста рецептора GLP-1 и модифицированного гидрофильным полимером агониста глюкагонового рецептора, либо связанных вместе, либо представленных отдельно, достигало значительно большего эффекта (например, снижения массы тела), чем использование агониста рецептора GLP-1 отдельно. Кроме того, при достижении более высокой активности, это также существенно продлевает период полужизни в организме и снижает частоту введения. В частности, техническое решение, предлагаемое в настоящем раскрытии, также может улучшить симптомы нарушений жирового обмена у страдающих ожирением животных, помимо снижения массы тела, и существенно снижает количество триглицеридов в сыворотке и печени, а также общий холестерин в сыворотке животных после длительного введения, что обеспечивает новую возможность для лечения неалкогольной жировой болезни печени.

В одном аспекте настоящее раскрытие обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую фармацевтически эффективное количество агониста рецептора GLP-1 и агониста глюкагонового рецептора, где агонист рецептора GLP-1 и агонист глюкагонового рецептора независимо образуют конъюгат с гидрофильным полимером, соответственно, или агонист рецептора GLP-1 и агонист глюкагонового рецептора образуют конъюгат через гидрофильный полимер. Необязательно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также включает фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для профилактики или лечения неалкогольной жировой болезни печени, для похудения и/или снижения уровня липидов. В других вариантах осуществления фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для подавления аппетита у субъекта, снижения общего холестерина в сыворотке и/или снижения содержания триглицеридов в печени.

В некоторых вариантах осуществления агонист рецептора GLP-1 и агонист глюкагонового рецептора в фармацевтической композиции по настоящему изобретению ковалентно связаны через гидрофильный полимер с образованием конъюгата.

В некоторых вариантах осуществления гидрофильный полимер в фармацевтической композиции по настоящему изобретению имеет молекулярную массу 2 кДа - 60 кДа, 5 кДа - 50 кДа, предпочтительно 10 кДа - 40 кДа, более предпочтительно 20 кДа - 40 кДа, в частности, 15 кДа - 30 кДа, более конкретно 21 кДа - 29 кДа. В частности, полимер (например, ПЭГ) имеет молекулярную массу около 2 кДа - около 50 кДа, предпочтительно около 3 кДа - около 40 кДа, более предпочтительно около 4 кДа - около 35 кДа, еще более предпочтительно около 5 кДа - около 30 кДа, например, около 5 кДа, около 10 кДа, около 15 кДа, около 20 кДа, 21 кДа, 22 кДа, 23 кДа, 24 кДа, около 25 кДа, 26 кДа, 27 кДа, 28 кДа, 29 кДа, около 30 кДа, около 35 кДа, около 40 кДа и около 45 кДа, или соответствующую любому значению в пределах указанных выше значений молекулярной массы.

В некоторых вариантах осуществления агонист рецептора GLP-1 выбран из группы, состоящей из Эксендина-4, Эксендина-3 и GLP-1. В частности, агонист рецептора GLP-1 выбран из PB-105 (например, он имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1).

В некоторых вариантах осуществления агонист глюкагонового рецептора представляет собой глюкагон. В частности, глюкагон представляет собой PB-702 (например, он имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, где амино группа в боковой цепи лизина в положении 12 последовательности связана с цистеиновой группой через амидную связь), PB-703 (например, он имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4, где глутамин в положении 24 последовательности заменен цистеином), PB-740 (например, он имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5, где цистеиновый остаток добавлен после 29^-й аминокислоты) или PB-741 (например, он имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, где боковая цепь "-CO-NH₂" глутамина в положении 24 модифицирована следующим образом "-CO-NH-CH₂CH₂-SH").

В некоторых вариантах осуществления последовательность глюкагона модифицирована по одному или нескольким положениям относительно последовательности глюкагона дикого типа. В частности, модификация представляет собой введение функциональной группы для связывания с боковой цепью лизина, глутаминовой кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты или аспарагина (например, сульфгидрила, азида, малеимида, амино группы, алкинила, винилсульфона, галогена или альдегидной группы). Например, модификации включают добавление цистеина к боковой цепи лизина в положении 12 SEQ ID NO: 2, добавление тиогликолевой кислоты к боковой цепи лизина в положении 12 SEQ ID NO: 2, добавление меркаптопропионовой кислоты к боковой цепи лизина в положении 12 SEQ ID NO: 2, добавление меркаптоэтила к боковой цепи глутамина в положении 24 SEQ ID NO: 2, добавление меркаптопропила к боковой цепи глутамина в положении 24 SEQ ID NO: 2 и добавление меркаптопропионовой кислоты к боковой цепи глутамина в положении 24 SEQ ID NO: 2.

Дополнительно или альтернативно, модификация представляет собой добавление или замену цистеином, например, глутамин в положении 24 SEQ ID NO: 2 заменен цистеином, лизин в положении 12 SEQ ID NO: 2 заменен цистеином, и/или цистеин добавлен после 29^-го положения SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления гидрофильный полимер выбран из группы, состоящей из полисахарида, полипептида, полиалкиленгликоля, поливинилпирролидона, полиакрилата, полиметакрилата, полиоксазолина, поливинилового спирта, полиакриламида, полиметакриламида, coполимера малеиновой и акриловой кислоты, полиэфира, полиацеталя, полиортоэфира, поликарбоната, полииминокарбоната, полиамида, сополимера винилового эфира и малеинового ангидрида, сополимера стирола и малеинового ангидрида и сополимера указанных выше полимеров. В частности, гидрофильный полимер выбран из полиалкиленгликолей, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ).

В некоторых вариантах осуществления молярное отношение агониста рецептора GLP-1 к агонисту глюкагонового рецептора составляет от 1:0,001 до 1:1000, предпочтительно от 1:0,01 до 1:100, более предпочтительно от 1:0,03 до 1:50, наиболее предпочтительно от 1:0,1 до 1:30, в частности, от 1:0,5 до 1:20, более конкретно от 1:1 до 1:10, такое как 1:0,1, 1:0,2, 1:0,3, 1:0,4, 1:0,5, 1:0,6, 1:0,7, 1:0,8, 1:0,9, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30 и любое отношение в указанных выше пределах.

В другом аспекте настоящее раскрытие обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую ПЭГилированный агонист рецептора GLP-1 и ПЭГилированный агонист глюкагонового рецептора. В частности, ПЭГилированный агонист рецептора GLP-1 выбран из группы, состоящей из PB-119, PB-120 и PB-107; ПЭГилированный агонист глюкагонового рецептора выбран из группы, состоящей из: PB-707, PB-708, PB-709, PB-713, PB-721 и PB-722.

В другом аспекте настоящее раскрытие обеспечивает конъюгат, включающий агонист рецептора GLP-1 и агонист глюкагонового рецептора, где агонист рецептора GLP-1 и агонист глюкагонового рецептора образуют конъюгат через гидрофильный полимер.

В конъюгате по настоящему изобретению агонист рецептора GLP-1 и/или агонист глюкагонового рецептора конъюгированы с гидрофильными полимерами непосредственно или через линкер, предпочтительно через сульфгидрил цистеина или другой аминокислоты.

В другом аспекте настоящее раскрытие обеспечивает конъюгат, имеющий общую формулу X₁-Z₁-Y-Z₂-X₂, где X₁ представляет собой агонист рецептора GLP-1, X₂ представляет собой агонист глюкагонового рецептора, Y представляет собой гидрофильный полимер, Z₁ представляет собой первый линкер, и Z₂ представляет собой второй линкер. В частности, настоящее раскрытие обеспечивает конъюгат, имеющий формулу Эксендин-4-Z₁-ПЭГ-Z₂-глюкагон, например, конъюгат, имеющий формулу PB105-ПЭГ-PB703 (например, PB-716, PB-717, PB-718, PB-719, PB-720).

В настоящем раскрытии линкер, первый линкер и/или второй линкер каждый независимо содержит группу, образованную путем активации реакционноспособной группы (например, малеимида, галогена, винилсульфона, дисульфидной связи, сульфгидрила, альдегида, карбонила, O-замещенного гидроксиламина, активного сложного эфира, алкенила, алкинила, азида или других групп с высокой химической реактивностью). Более предпочтительно, реакционноспособная группа выбрана из группы, состоящей из малеимида, галогена, винилсульфона и дисульфидной связи.

В настоящем раскрытии линкер, первый линкер и/или второй линкер каждый независимо включает активированную реакционноспособную группу (например, малеимид, галоген, винилсульфон, дисульфидную связь, тиол, альдегид, карбонил, O-замещенный гидроксиламин, активный сложный эфир, алкенил, алкинил, азид или другую группу с высокой химической реактивностью). Более предпочтительно, реакционноспособная группа выбрана из группы, состоящей из малеимида, галогена, винилсульфона и дисульфидной связи.

В некоторых вариантах осуществления гидрофильный полимер активируют для конъюгации с агонистом рецептора GLP-1 и агонистом глюкагонового рецептора. Предпочтительно, полимер представляет собой модифицированный полимер, содержащий реакционноспособную группу, для конъюгации полимера с агонистом рецептора GLP-1 и агонистом глюкагонового рецептора через активацию реакционноспособной группы. Более предпочтительно, реакционноспособная группа выбрана из группы, состоящей из малеимида, галогена, винилсульфона, дисульфиднной связи, тиола, альдегида, карбонила, O-замещенного гидроксиламина, активного сложного эфира, алкенила, алкинила, азида и других групп с высокой химической реактивностью.

В другом аспекте настоящее раскрытие обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую следующее: комбинацию PB-721 и PB-119, комбинацию PB-722 и PB-119 и комбинацию PB-708 и PB-120; или она включает компонент, выбранный из следующих: PB-716, PB-717, PB-718, PB-719 и PB-720. В частности, структуры PB-119, PB-120, PB-707, PB-708, PB-709, PB-713, PB-716, PB-717, PB-718, PB-719, PB-720, PB-721 и PB-722 показаны в Таблице 1.

В другом аспекте настоящее раскрытие обеспечивает набор, включающий фармацевтическую композицию или конъюгат в соответствии с настоящим раскрытием и необязательно инструкции по применению.

В другом аспекте настоящее раскрытие обеспечивает применение композиции или конъюгата по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для профилактики или лечения неалкогольной жировой болезни печени, похудения и/или снижения уровня липидов.

В другом аспекте настоящее раскрытие обеспечивает применение композиции или конъюгата по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для подавления аппетита у субъекта, снижения общего холестерина в сыворотке и/или снижения содержания триглицеридов в печени.

В другом аспекте настоящее раскрытие обеспечивает композицию или конъюгат, описанные выше, для применения для профилактики или лечения неалкогольной жировой болезни печени, снижения массы тела и/или снижения уровня липидов.

В другом аспекте настоящее раскрытие обеспечивает композицию или конъюгат, описанные выше, для применения для подавления аппетита у субъекта, снижения общего холестерина в сыворотке и/или снижения содержания триглицеридов в печени.

В другом аспекте настоящее раскрытие обеспечивает способ для профилактики или лечения неалкогольной жировой болезни печени, похудения и/или снижения уровня липидов, включающий введение композиции или конъюгата в соответствии с настоящим раскрытием субъекту, нуждающемуся в этом.

В другом аспекте настоящее раскрытие обеспечивает способ для подавления аппетита у субъекта, снижения уровня общего холестерина в сыворотке и/или снижения содержания триглицеридов в печени, включающий введение композиции или конъюгата в соответствии с настоящим раскрытием субъекту, нуждающемуся в этом.

Авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаружили, что композиция и конъюгат по настоящему изобретению существенно уменьшают частоту дозирования, необходимую для поддержания желаемого эффекта. В некоторых вариантах осуществления конъюгат по настоящему изобретению вводят субъекту с частотой один раз по меньшей мере каждые 30 дней, один раз по меньшей мере каждые 25 дней, один раз по меньшей мере каждые 20 дней, один раз по меньшей мере каждые 15 дней, один раз по меньшей мере каждые 10 дней, один раз по меньшей мере каждые 9 дней, один раз по меньшей мере каждые 8 дней, один раз по меньшей мере каждые 7 дней, один раз по меньшей мере каждые 6 дней, один раз по меньшей мере каждые 5 дней, один раз по меньшей мере каждые 4 дня, один раз по меньшей мере каждые 3 дня, один раз по меньшей мере каждые 2 дня и один раз по меньшей мере каждый день. В некоторых вариантах осуществления конъюгат по настоящему изобретению вводят субъекту с частотой не более чем один раз каждые 30 дней, не более чем один раз каждые 25 дней, не более чем один раз каждые 20 дней, не более чем один раз каждые 15 дней, не более чем один раз каждые 10 дней, не более чем один раз каждые 9 дней, не более чем один раз каждые 8 дней, не более чем один раз каждые 7 дней, не более чем один раз каждые 6 дней, не более чем один раз каждые 5 дней, не более чем один раз каждые 4 дня, не более чем один раз каждые 3 дня, не более чем один раз каждые 2 дня и не более чем один раз каждый день.

Композиция и конъюгат по настоящему изобретению существенно снижают частоту дозирования и повышают соблюдение субъектом инструкций по приему препарата.

Композицию и конъюгат по настоящему изобретению можно использовать для предотвращения прибавки массы тела или для промотирования снижения массы тела. "Предотвращение" относится к подавлению или уменьшеню прибавки массы тела по сравнению с тем, когда лечение отсутствует, и необязательно означает полную остановку прибавки массы тела. Композиция и конъюгат по настоящему изобретению могут вызывать снижение потребления пищи и/или увеличение расхода энергии, приводя к видимому эффекту на массу тела. Независимо от этого эффекта на массу тела, композиция и конъюгат по настоящему изобретению могут иметь благоприятный эффект на переносимость глюкозы и уровни холестерина в кровотоке (например, снижение уровней LDL в кровотоке и повышение отношения HDL/LDL). Таким образом, соединение по настоящему изобретению можно использовать для непосредственного или опосредованного лечения любого состояния, вызванного или характеризующегося избыточной массой тела, например, для лечения и/или профилактики ожирения, патологического ожирения, связанного с ожирением воспаления, связанного с ожирением заболевания желчного пузыря или индуцированного ожирением апноэ во сне. Композицию и конъюгат по настоящему изобретению также можно использовать для лечения метаболического синдрома, инсулинорезистентности, непереносимости глюкозы, диабета II типа, гипертензии, атерогенной дислипидемии, атеросклероза, артериосклероза, коронарного сердечного заболевания, или инсульта. Их роль в этих расстройствах может быть вызвана или связана с их эффектами на массу тела, или может быть независимой от их эффекта на массу тела.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает профиль очистки PB-716.

Фиг. 2 показывает профиль очистки PB-717.

Фиг. 3 показывает профиль очистки PB-718.

Фиг. 4 показывает профиль очистки PB-719.

Фиг. 5 показывает профиль очистки PB-720.

Фиг. 6 показывает эффект разовой дозы соединений серии PB-716 на массу тела DIO мышей.

Фиг. 7 показывает эффект длительного введения соединений серии PB-716 на кумулятивное потребление пищи у DIO мышей.

Фиг. 8 показывает процент снижения кумулятивного потребления пищи между группами лечения и контрольной модельной группой после введения в течение 14 последовательных дней.

Фиг. 9 показывает эффект длительного введения соединений серии PB-716 на массу тела DIO мышей.

Фиг. 10 показывает процент снижения массы тела у DIO мышей после длительного введения соединений серии PB-716.

Фиг. 11 показывает эффект длительного введения соединений серии PB-716 на случайный уровень сахара в крови у DIO мышей.

Фиг. 12 показывает эффект длительного введения соединений PB-718, PB-119 и комбинации (PB-708+PB-120) на массу тела DIO мышей.

Фиг. 13 показывает процент снижения массы тела у DIO мышей после длительного введения соединений PB-718, PB-119 и комбинации (PB-708+PB-120).

Фиг. 14 показывает эффект длительного введения соединений PB-718, PB-119 и комбинации (PB-708+PB-120) на кумулятивное потребление пищи у DIO мышей.

Фиг. 15 показывает процент снижения кумулятивного потребления пищи после введения в течение 14 последовательных дней.

Фиг. 16 показывает эффект длительного введения соединений PB-718, PB-119 и комбинации (PB-708+PB-120) на случайный уровень сахара в крови у DIO мышей.

Фиг. 17 показывает эффект длительного введения на случайную массу тела DIO мышей.

Фиг. 18 показывает процент снижения случайного значения массы тела DIO мышей после длительного введения.

Фиг. 19 показывает эффект длительного введения на потребление пищи у DIO мышей.

Фиг. 20 показывает процент снижения кумулятивного потребления пищи после длительного введения.

Фиг. 21 показывает эффект длительного введения на уровень триглицеридов в сыворотке у DIO мышей.

Фиг. 22 показывает эффект длительного введения на уровень триглицеридов в печени у DIO мышей.

Фиг. 23 показывает эффект длительного введения на уровень общего холестерина в сыворотке у DIO мышей.

Фиг. 24 показывает эффект длительного введения композиции по настоящему изобретению на массу тела у страдающих ожирением обезьян cynomolgus.

Фиг. 25 показывает эффект длительного введения композиции по настоящему изобретению на кумулятивное потребление пищи у страдающих ожирением обезьян cynomolgus.

Фиг. 26 показывает гистограмму процентного изменения среднего потребления пищи после длительного введения композиции по настоящему изобретению - количество введений обезьянам cynomolgus.

Фиг. 27 показывает эффект длительного введения композиции по настоящему изобретению на уровень триглицеридов в сыворотке обезьян cynomolgus.

Фиг. 28 показывает эффект длительного введения композиции по настоящему изобретению на уровень глюкозы в сыворотке у обезьян cynomolgus.

Фиг. 29 показывает эффект длительного введения композиции по настоящему изобретению на уровень аланинаминотрансферазы в сыворотке у обезьян cynomolgus.

Фиг. 30 показывает эффект длительного введения композиции по настоящему изобретению на объем талии у обезьяны cynomolgus.

Фиг. 31 показывает эффект длительного введения композиции по настоящему изобретению на распределение жировой ткани у обезьян cynomolgus.

Фиг. 32 показывает эффект длительного введения комбинации (PB-119+ PB-722) в течение 21 дня на кумулятивное потребление пищи у DIO мышей.

Фиг. 33 показывает процент снижения кумулятивного потребления пищи после длительного введения комбинации (PB-119+ PB-722) в течение 21 дня по сравнению с модельной контрольной группой.

Фиг. 34 показывает эффект длительного введения комбинации (PB-119+ PB-722) в течение 21 дня на массу тела у DIO мышей.

Фиг. 35 показывает процент снижения массы тела у DIO мышей после длительного введения комбинации(PB-119+ PB-722) в течение 21 дня.

Фиг. 36 показывает эффект длительного введения комбинации (PB-119+ PB-722) в течение 21 дня на уровень сахара в крови натощак у DIO мышей.

Фиг. 37 показывает эффект длительного введения комбинации (PB-119+ PB-722) в течение 21 дня на пероральную переносимость сахара у DIO мышей.

Фиг. 38 показывает концентрацию сахара в крови у мышей после длительного введения комбинации (PB-119+ PB-722) в течение 21 дня.

Фиг. 39 показывает уровень инсулина в сыворотке мышей после длительного введения комбинации (PB-119+ PB-722) в течение 21 дня.

Фиг. 40 показывает оценку NASH у мышей после длительного введения комбинации (PB-119+ PB-722) в течение 21 дня.

Подробное описание

Определения

В контексте настоящей заявки термины "линкер", "первый линкер", "второй линкер" и т.п. относятся к группе, сегменту, химической связи или любой структуре, которая служит для связывания полимера с биологически активной молекулой в настоящем раскрытии. В настоящем раскрытии линкер может содержать активирующую группу (например, малеимид, галоген, винилсульфон, дисульфидную связь, сульфгидрил, альдегид, карбонил, O-замещенный гидроксиламин, активный сложный эфир, алкенил, алкинил, азид или другие группы с высокой химической реактивностью), например MAL, ppMAL и т.п.

"Полиэтиленгликоль", описанный в настоящей заявке, имеет значение, обычно понятное специалистам в данной области техники, и включает как полиэтиленгликоль (включая различные структуры, например линейную, разветвленную или бифуркационную структуру, такую как звездчатая форма), так и его терминально-модифицированные производные, если не указано иное. Например, ПЭГ представляет собой метоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ). В настоящей заявке, если не указано иное, полиэтиленгликоль (ПЭГ) включает оба типа, в которых концевая группа представляет собой гидроксильную группу или другие группы. Другие группы включают, но не ограничиваются этим, алкокси, циклоалкокси, циклоалкилокси, алкенил, арилокси или аралкилокси. Эти типы ПЭГ известны в данной области и обычно используются в модификации полипептидов. Боковая цепь ПЭГ может быть линейной, разветвленной, бифуркационной или состоящей из нескольких плеч, а различные полиэтиленгликоли могут иметь разную длину полимерной цепи и структуру агрегата.

В контексте настоящей заявки термин "конъюгат" относится к продукту, образованному путем ковалентного связывания молекулы, имеющей биологическую активность (например, агониста рецептора GLP-1 и агониста рецептора глюкагона), с молекулой полиэтиленгликоля непосредственно или через линкер.

Кроме того, существует множество способов определения молекулярной массы полимера, такого как полиэтиленгликоль. Поскольку полимер состоит из молекул с различной степенью полимеризации в определенном диапазоне распределения, средняя молекулярная масса обычно используется для обозначения молекулярной массы полимера. В частности, это может быть среднечисленная молекулярная масса или среднемассовая молекулярная масса. Хотя могут быть некоторые отклонения в среднечисленной молекулярной массе и среднемассовой молекулярной массе, когда степень полимеризации полимера сильно отличается, эти две массы имеют тенденцию быть одинаковыми для полимера с узким диапазоном распределения. Что касается полимеров, указанных в настоящей заявке, таких как полиэтиленгликоль, то, когда речь идет о его молекулярной массе, это может быть либо среднемассовая молекулярная масса, либо среднечисленная молекулярная масса, предпочтительно среднечисленная молекулярная масса.

Описанный в настоящей заявке "агонист рецептора GLP-1" относится к веществу, которое может активировать GLP-1 рецептор, например GLP-1 дикого типа и его варианты (такие как GLP-1-(7-37) амид и GLP-1-(7-36) амид), эксендин-4 дикого типа и его варианты, эксендин-3 дикого типа и его варианты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат, образованный агонистом GLP-1 рецептора и гидрофильным полимером, является долгодействующим. В других вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгат, образованный агонистом GLP-1 рецептора и агонистом рецептора глюкагона вместе с гидрофильным полимером, является долгодействующим.

В контексте настоящей заявки "агонист глюкагонового рецептора" относится к веществу, которое может активировать глюкагоновый рецептор, такому как глюкагон дикого типа и его варианты. Например, глюкагон представляет собой PB-702 (например, он имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, где амино группа в боковой цепи лизина в положении 12 последовательности связана с цистеиновой группой через амидную связь), PB-703 (например, он имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4, где глутамин в положении 24 последовательности заменен цистеином), PB-740 (например, он имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5, где цистеиновый остаток добавлен после 29^й аминокислоты) или PB-741 (например, он имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, где боковая цепь "-CO-NH₂" глутамина в положении 24 модифицирована следующим образом "-CO-NH-CH₂CH₂-SH"). В некоторых вариантах осуществления конъюгат по настоящему изобретению, образованный агонистом глюкагонового рецептора и гидрофильным полимером, является долгодействующим.

"Эксендин-4", в контексте настоящей заявки, относится к полипептиду, обнаруженному в слюне ядовитых игуан (J. Biol. Chem, 265, 20259-20262, 1990; J. Biol. Chem, 267, 7402-7405, 1992), и его вариантам, которые по существу сохраняют функцию активации GLP-1 рецептора. Эксендин-4 дикого типа является высокогомологичным (53%) с GLP-1 (7-36), который имеет последовательность His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 7).

В контексте настоящей заявки, "глюкагон" относится к полипептиду, соответствующему аминокислотам 53-81 препроглюкагона (имеющему последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr), и его вариантам, которые по существу сохраняют функцию активации глюкагонового рецептора.

В контексте настоящей заявки, термин "долгодействующий", когда он используется для агониста рецептора, означает частоту введения не больше, чем один раз в день, предпочтительно в несколько дней, например, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней, 25 дней, 30 дней, 40 дней, 50 дней или больше.

Термины, такие как "включать", "составлять", "содержать" и "включать в себя" не должны рассматриваться как ограничивающие. Кроме того, если не указано иное, слово без числовой модификации включает форму множественного числа, и «или» означает «и/или». Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, которое хорошо известно специалистам в данной области техники.

В контексте настоящей заявки, термины "вариант" и "функциональный вариант" используются взаимозаменяемо и относятся к модифицированной или измененной биологической молекуле, предпочтительно вариант сохраняет ее биологическую активность. Например, "вариант" полипептида относится к полипептидам, которые в аминокислотной последовательности отличаются одной или несколькими заменами, делециями, вставками, слияниями, усечениями или любой их комбинацией. Вариантные полипептиды могут быть полностью функциональными или могут не иметь одну или несколько активностей. Полностью функциональный вариант может содержать, например, только консервативные изменения или изменения некритических остатков или некритических областей. Функциональный вариант может также содержать замену аналогичных аминокислот, что приводит к неизмененной функции или незначительному функциональному изменению.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, которое хорошо известно специалистам в данной области техники. Что касается определений и терминологии в данной области техники, специалист в данной области может ссылаться на Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel). Аббревиатуры для аминокислотных остатков представляют собой стандартные 3-буквенные и/или 1-буквенные коды, используемые в данной области для обозначения одной из 20 обычно используемых L-аминокислот.

В контексте настоящей заявки, термин "фармацевтическая композиция" означает комбинацию по меньшей мере одного лекарственного средства и, необязательно, фармацевтически приемлемого носителя или эксципиента, которые объединены вместе для достижения определенной цели. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает комбинации, которые разделены во времени и/или пространстве, при условии, что они могут действовать совместно для достижения цели настоящего раскрытия. Например, ингредиенты, содержащиеся в фармацевтической композиции (например, конъюгат по настоящему изобретению), можно вводить субъекту как единое целое или применять отдельно для субъекта. Когда ингредиенты, содержащиеся в фармацевтической композиции, отдельно вводят субъекту, ингредиенты можно вводить субъекту одновременно или последовательно. Предпочтительно, фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду, буфер, изотонический солевой раствор, такой как PBS (фосфатный буфер), глюкозу, маннит, декстрозу, лактозу, крахмал, стеарат магния, целлюлозу, карбонат магния, 0,3% глицерин, гиалуроновую кислоту, этанол или полиалкиленгликоль, такой как полипропиленгликоль, триглицерид и т.п. Тип фармацевтически приемлемого носителя зависит от того, сформулирована ли композиция по изобретению для перорального, назального, внутрикожного, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения. Композиция в соответствии с изобретением может содержать смачивающий агент, эмульгатор или буферное вещество в качестве добавки.

Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить любым подходящим путем, например, перорально, назально, внутрикожно, подкожно, внутримышечно или внутривенно.

В контексте настоящей заявки, термины "фармацевтически эффективное количество" и "эффективное количество" относятся к дозе, достаточной для того, чтобы продемонстрировать пользу для субъекта, которому ее вводят. Фактическое количество вводимого вещества, а также скорость и время введения зависят от имеющегося у конкретного субъекта состояния и его тяжести. Назначение лечения (например, определение дозы и т.д.) в конечном итоге осуществляет лечащий врач и другие врачи, которые должны принимать решение, обычно с учетом заболевания, подлежащего лечению, состояния конкретного пациента, места доставки, способа введения и других факторов, известных врачу.

В контексте настоящей заявки, термин "субъект" относится к млекопитающему, например человеку, но это также могут быть другие животные, такие как дикие животные (например, цапля, аист, журавли и т.д.), домашние животные (например, утки, гуси и т.д.) или экспериментальные животные (например, орангутанг, обезьяна, крыса, мышь, кролик, морская свинка, сурок, суслик и т.д.).

Хотя числовые диапазоны и параметры, представленные в широком объеме настоящего раскрытия, охватывают приближения, численные значения в конкретных примерах указаны как можно более точно. Однако любое числовое значение по своей сути обязательно содержит определенную ошибку, вызванную стандартным отклонением, существующим при соответствующих измерениях. Кроме того, все раскрытые диапазоны следует понимать как охватывающие любые и все поддиапазоны, содержащиеся в них. Например, указанный диапазон от 1 до 10 должен рассматриваться как включающий любые и все поддиапазоны между минимальным значением 1 и максимальным значением 10 включительно, то есть все поддиапазоны, начинающиеся с минимум 1 или более, например от 1 до 6,1, и поддиапазоны, заканчивающиеся максимум 10 или менее, например от 5,5 до 10. Кроме того, любое указание "включен в настоящую заявку" следует понимать как включенный посредством ссылки во всей полноте.

Следует также отметить, что, как используется в настоящем описании, форма единственного числа включает форму множественного числа, если явно не ограничивается одним указанным объектом. Термин "или" может использоваться взаимозаменяемо с термином "и/или", если контекст явно не диктует иное.

Следующие примеры приведены для демонстрации и дальнейшего объяснения некоторых предпочтительных вариантов осуществления и аспектов настоящего раскрытия и не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.

Таблица 1 Биоактивные молекулы, включенные в настоящее раскрытие
Название	Структура	SEQ ID No.	Описание
PB-105	HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPC	1	Вариант эксендина-4
PB-701	HSQGTFTSDY SKYLDSRRAQ DFVQWLMNT	2	Глюкагон дикого типа
PB-702	HSQGT FTSDY SK(-Cys)YLDSRRAQ DFVQWLMNT	3	Вариант глюкагона (12-ое положение)
PB-703	HSQGTFTSDY SKYLDSRRAQ DFVCWLMNT	4	Вариант глюкагона (24-ое положение)
PB-740	HSQGTFTSDY SKYLDSRRAQ DFVQWLMNTC	5	Вариант глюкагона (30-ое положение)
PB-741	HSQGTFTSDY SKYLDSRRAQ DFVQ(-CH2CH2SH)WLMNT	6	Вариант глюкагона (24-ое положение)
PB-119	мПЭГ-23KD -ppMAL-PB-105
PB-120	мПЭГ-25KD -ppMAL-PB-105
PB-107	мПЭГ-30KD -ppMAL-PB-105
PB-707	мПЭГ-23KD -ppMAL-PB-703
PB-708	мПЭГ-25KD -ppMAL-PB-703
PB-709	мПЭГ-30KD -ppMAL-PB-703
PB-713	мПЭГ-40KD -ppMAL-PB-703
PB-716	PB-105-ПЭГ-40KD -(ppMAL)2--PB-703
PB-717	PB-105-ПЭГ-30KD -(ppMAL)2--PB-703
PB-718	PB-105-ПЭГ-25KD -(ppMAL)2--PB-703
PB-719	PB-105-ПЭГ-20KD -(ppMAL)2--PB-703
PB-720	PB-105-ПЭГ-10KD -(ppMAL)2--PB-703
PB-721	мПЭГ-23KD -ppMAL--PB-740
PB-722	мПЭГ-23KD -ppMAL--PB-741
Примечание: модификации подчеркнуты

Примеры

Пример 1. Получение PB-119 (Конъюгат PB-105 и мПЭГ-ppMAL-23KD)

10 мг PB-105 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China) и 65 мг мПЭГ23KD-ppMAL (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 50-мл стеклянный контейнер (Молярное отношение PB-105 к ПЭГ=1:1,2). Смесь растворяли в 5 мл 0,2M PBS буфера (pH 6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 10 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки буфер A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для вымывания избытка ПЭГ, и 10 колоночных объемов элюирующего буфера B (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0 +1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 30%. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности.

Пример 2. Получение PB-120 (Конъюгат PB-105 и мПЭГ-ppMAL-25KD)

10 мг PB-105 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China) и 72 мг мПЭГ25KD-ppMAL (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 50-мл стеклянный контейнер (Молярное отношение PB-105 к ПЭГ=1:1,2). Смесь растворяли в 5 мл 0,2M PBS буфера (pH 6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты и загружали в 10 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки буфер A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для вымывания избытка ПЭГ, и 10 колоночных объемов элюирующего буфера B (20 мМ HAc-NaAc, pH4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 30%. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности.

Пример 3. Получение PB-107 (Конъюгат PB-105 и мПЭГ-ppMAL-30KD)

10 мг PB-105 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China) и 86 мг мПЭГ30KD-ppMAL (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 50-мл стеклянный контейнер (Молярное отношение PB-105 к ПЭГ=1:1,2). Смесь растворяли в 5 мл 0,2M PBS буфера (pH6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 10 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки буфер A (20мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для вымывания избытка ПЭГ, и 10 колоночных объемов элюирующего буфера B (20мМ HAc-NaAc, pH4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 30%. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности.

Пример 4. Получение PB-707 (Конъюгат PB-703 и мПЭГ-ppMAL-23KD)

10 мг PB-703 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China) и 100 мг мПЭГ-ppMAL-23KD (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 50-мл стеклянный контейнер (Молярное отношение PB-703 к ПЭГ=1:1,5). Смесь растворяли в 5 мл 0,2M PBS буфера (pH 6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 10 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки буфер A (20мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для вымывания избытка ПЭГ, и 15 колоночных объемов элюирующего буфера B (20мМ HAc-NaAc, pH4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 30%. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности.

Пример 5. Получение PB-708 (Конъюгат PB-703 и мПЭГ-ppMAL-25KD)

10 мг PB-703 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China) и 110 мг мПЭГ-ppMAL-25KD (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 50-мл стеклянный контейнер (Молярное отношение PB-703 к ПЭГ=1:1,5). Смесь растворяли в 5 мл 0,2M PBS буфера (pH 6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 10 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки буфер A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для вымывания избытка ПЭГ, и 15 колоночных объемов элюирующего буфера B (20мМ HAc-NaAc, pH4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 30%. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности.

Пример 6. Получение PB-709 (Конъюгат PB-703 и мПЭГ-ppMAL-30KD)

10 мг PB-703 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China) и 130 мг мПЭГ-ppMAL-30KD (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 50-мл стеклянный контейнер (Молярное отношение PB-703 к ПЭГ=1:1,5). Смесь растворяли в 5 мл 0,2M PBS буфера (pH 6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 10 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки буфер A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для вымывания избытка ПЭГ, и 15 колоночных объемов элюирующего буфера B (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 30%. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности.

Пример 7. Получение PB-713 (Конъюгат PB-703 и мПЭГ-ppMAL-40KD)

10 мг PB-703 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China) и 175 мг мПЭГ-ppMAL-40KD (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 50-мл стеклянный контейнер (Молярное отношение PB-703 к ПЭГ=1:1,5). Смесь растворяли в 5 мл 0,2M PBS буфера (pH 6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 10 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки буфер A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для вымывания избытка ПЭГ, и 15 колоночных объемов элюирующего буфера B (20мМ HAc-NaAc, pH4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 30%. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности.

Пример 8. Получение PB-721 (Конъюгат PB-740 и мПЭГ-ppMAL-23KD)

10 мг PB-740 (закупали у компании Chinese Peptide Co., Ltd., China) и 96 мг мПЭГ-ppMAL-23KD (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 50-мл стеклянный контейнер (Молярное отношение PB-740 к ПЭГ=1:1,5). Смесь растворяли в 5 мл 0,2M PBS буфера (pH 6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 10 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки буфер A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для вымывания избытка ПЭГ, и 15 колоночных объемов элюирующего буфера B (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 30%. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности.

Пример 9. Получение PB-722 (Конъюгат PB-741 и мПЭГ-ppMAL-23KD)

10 мг PB-741 (закупали у компании Chinese Peptide Co., Ltd., China) и 97 мг мПЭГ-ppMAL-23KD (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 100-мл стеклянный контейнер (Молярное отношение PB-741 к ПЭГ=1:1,5). Смесь растворяли в 5 мл 0,2M PBS буфера (pH 6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 10 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки буфер A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для вымывания избытка ПЭГ, и 15 колоночных объемов элюирующего буфера B (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 300%. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности.

Пример 10. Получение PB-716 (Конъюгат PB-703, PB-105 и ПЭГ-(ppMAL)2-40KD)

20 мг PB-105 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China), 21 мг PB-703 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China) и 158,6 мг ПЭГ-(ppMAL)2-40KD (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 50-мл стеклянный контейнер (молярное отношение ПЭГ, PB-105 и PB-703=1:1,2:1,5). Смесь растворяли в 10 мл 0,2M PBS буфера (pH 6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 20 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки 3-4 колоночных объема буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для уравновешивания, и 30 колоночных объемов элюирующего буфера B (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 40%. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности. Фиг. 1 показывает профиль очистки PB-716.

Пример 11. Получение PB-717 (Конъюгат PB-703, PB-105 и ПЭГ-(ppMAL)2-30KD)

20 мг PB-105 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China), 21 мг PB-703 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China) и 119 мг ПЭГ-(ppMAL)2-30KD (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 100-мл стеклянный контейнер (молярное отношение ПЭГ, PB-105 и PB-703=1:1,2:1,5). Смесь растворяли в 10 мл 0,2M PBS буфера (pH 6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 20 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки 3-4 колоночных объема буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для уравновешивания, и 30 колоночных объемов элюирующего буфера B (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 40%. Пики элюирования собирали в равном объеме. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности. Фиг. 2 показывает профиль очистки PB-717.

Пример 12. Получение PB-718 (Конъюгат PB-703, PB-105 и ПЭГ-(ppMAL)2-25KD)

20 мг PB-105 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China), 21 мг PB-703 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China) и 99 мг ПЭГ-(ppMAL)2-25KD (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 100-мл стеклянный контейнер (молярное отношение ПЭГ, PB-105 и PB-703=1:1,2:1,5). Смесь растворяли в 10 мл 0,2M PBS буфера (pH 6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 20 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки 3-4 колоночных объема буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для уравновешивания, и 30 колоночных объемов элюирующего буфера B (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 40%. Пики элюирования собирали в равном объеме. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности. Фиг. 3 показывает профиль очистки PB-718.

Пример 13. Получение PB-719 (Конъюгат PB-703, PB-105 и ПЭГ-(ppMAL)2-20KD)

20 мг PB-105 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China), 21 мг PB-703 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China) и 79,3 мг ПЭГ-(ppMAL)2-20KD (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 100-мл стеклянный контейнер (молярное отношение ПЭГ, PB-105, PB-703=1:1,2:1,5). Смесь растворяли в 10 мл 0,2M PBS буфера (pH6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 20 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0). После загрузки 3-4 колоночных объема буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0) использовали для уравновешивания, и 30 колоночных объемов элюирующего буфера B (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 40%. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности. Фиг. 4 показывает профиль очистки PB-719.

Пример 14. Получение PB-720 (Конъюгат PB-703, PB-105 и ПЭГ-(ppMAL)2-10KD)

20 мг PB-105 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China), 21 мг PB-703 (закупали у компании Kaijie Peptide Co., Ltd., Chengdu, China) и 39,7 мг ПЭГ-(ppMAL)2-10KD (изготовитель PEGBIO Co., Ltd., China) отвешивали и помещали в 100-мл стеклянный контейнер (молярное отношение ПЭГ, PB-105 и PB-703=1:1,2:1,5). Смесь растворяли в 10 мл 0,2M PBS буфера (pH6,5) и осуществляли взаимодействие при комнатной температуре (25°C) в течение 1 часа при перемешивании. pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием хлористоводородной кислоты для остановки реакции. Реакционный раствор хранили при 4°C для очистки и последующего использования.

Реакционный раствор разбавляли 5-кратно ультрачистой водой и pH реакционного раствора доводили до 4,0 с использованием уксусной кислоты. Реакционный раствор загружали в 20 мл Macrocap SP катионообменную колонку, которая была уравновешена 3-4 колоночными объемами буфера A (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0). 30 колоночных объемов элюирующего буфера B (20 мМ HAc-NaAc, pH 4,0+1M NaCl) использовали для градиентного элюирования до 40%. Пики элюирования собирали в равных объемах и каждую собранную фракцию анализировали при помощи ВЭЖХ. Фракции с чистотой больше чем 95% объединяли и подвергали количественному определению с получением образцов для последующих экспериментов для оценки эффективности. Фиг. 5 показывает профиль очистки PB-720.

Пример 15. In Vitro EC50 ПЭГилированного глюкагона

HEK293 клетки, стабильно экспрессирующие глюкагоновый рецептор (HD Biosciences Co., Ltd., Shanghai, China), культивировали в DMEM среде (Hyclone), дополненной 10% FBS (Hyclone), в инкубаторе при 37°C с 10% CO₂. Клетки расщепляли трипсином (Hyclone), высевали в 96-луночный планшет при плотности 5×10⁴ клеток/100 мкл и инкубировали в течение 16-24 часов. Затем исходную культуральную среду сливали и заменяли бессывороточной DMEM средой и инкубацию продолжали в течение 4 часов. Добавляли глюкагон дикого типа, варианты глюкагона и ПЭГилированный глюкагон (конечные концентрации были 100 нмоль/л, 30 нмоль/л, 10 нмоль/л, 3 нмоль/л, 1 нмоль/л, 0,3 нмоль/л, 0,1 нмоль/л, 0,01 нмоль/л, соответственно) и инкубировали с клетками в течение 20 минут. Среду с глюкагоном в разных формах сливали и добавляли буфер для лизиса клеток (включенный в набор для cAMP твердофазного иммуноферментного анализа, R&D Systems). Планшет помещали в -80°C морозильник и два раза повторяли цикл замораживание-оттаивание для лизиса клеток. Супернатанты собирали криогенным центрифугированием. Следуя инструкциям изготовителя, прилагаемым к набору для cAMP твердофазного иммуноферментного анализа (R&D Systems), концентрации cAMP в супернатанте в содержащих образцы лунках определяли путем построения стандартной кривой. Программу Graphpad Prism использовали для построения кривых доза-ответ для глюкагона и его вариантов и рассчитывали EC50 для каждого образца.

Было показано, что глюкагон дикого типа, варианты глюкагона и ПЭГилированный глюкагон повышают содержание cAMP в HEK293 клетках и/или глюкагон R клетках дозозависимым образом на клеточном уровне, и EC50 значения для стимуляции клеток для высвобождения cAMP показаны в Таблице 2.

Таблица 2 In Vitro EC50 ПЭГилированного глюкагона
Соединение	EC50(нМ)
Глюкагон	0,84
PB-702	2,23
PB-703	1,7
PB-707	14,9
PB-716	6,2
PB-740	1,45
PB-741	2,25
PB-721	6,94
PB-722	12,3

Пример 16. Эксперимент для определения фармакологического эффекта длительного введения конъюгата по настоящему изобретению на снижение массы тела у DIO мышей

Самцов C57BL/6 мышей (Cavens Lab Animal Co., Ltd., Changzhou, China) содержали на высокожировой диете (MD12032, 45% ккал, Medicience Co., Ltd., Jiangsu, China) в течение 9 недель, и масса тела у них была на 20% больше, чем у мышей, получавших обычный корм (Suzhou Shuangshi Animal Feed Technology Co., Ltd., China), показывая, что модель алиментарного ожирения (DIO) успешно установлена. 35 DIO мышей разделяли на 7 групп на основании их массы тела и случайного уровня сахара в крови, по 5 мышей на группу, где группы представляли собой следующие: PB-716 группа (383 мкг/кг), PB-717 группа (383 мкг/кг), PB-718 группа (383 мкг/кг), PB-719 группа (383 мкг/кг), PB-720 группа (383 мкг/кг), группа, получавшая Виктозу (200 мкг/кг), и модельная контрольная группа (физиологический солевой раствор) (доза в расчете на содержание пептида). После первого введения каждую группу наблюдали в течение 96 часов и затем осуществляли второе введение. В последующих экспериментах группе, получавшей Виктозу, введение осуществляли один раз в день, а в остальных группах введение осуществляли один раз каждые 3 дня. Эксперименты с продолжительным введением осуществляли в общей сложности в течение 14 дней. В период осуществления эксперимента у мышей каждый день измеряли массу тела и потребление пищи. Случайный уровень сахара в крови измеряли до начала эксперимента и после завершения эксперимента.

После первого введения масса тела животных каждой группы обработки была существенно ниже, чем в контрольной группе. Результаты показаны на Фиг. 6. Через 48-96 часов после введения масса тела мышей в группе, получавшей Виктозу, постепенно изменялась в обратную сторону; к 96 часам не было никакой существенной разницы в массе тела между мышами группы, получавшей Виктозу, и контрольной группы. Масса тела мышей в PB-720 группе оставалась по существу постоянной в течение 48-96 часов после введения, с небольшим обратным эффектом. Масса тела мышей в PB-716, PB-717, PB-718 и PB-719 группах продолжала снижаться вплоть до 48 часов после введения и слегка изменялась в обратную сторону в течение 72-96 часов после введения. По сравнению с контрольной группой, эффект снижения массы тела после разового введения PB-716, PB-717, PB-718 и PB-719 может поддерживаться вплоть до 96 часов после введения, указывая на то, что ПЭГилирование существенно продлевает время действия соединения у животных.

Эффект длительного введения на потребление пищи у DIO мышей показан на Фиг. 7. После разового введения мышей наблюдали в течение 96 часов и затем начинали длительное введение, при этом группе, получавшей Виктозу, введение осуществляли один раз в день, а в остальных группах введение осуществляли один раз каждые 3 дня. В течение 14 дней после начала длительного введения модельная контрольная группа показала линейную тенденцию к повышению кумулятивного потребления пищи, тогда как группы обработки имели разные степени снижения потребления пищи по сравнению с контрольной группой. К концу 14-дневного периода постоянного введения кумулятивное потребление пищи в группе PB-716 и группе, получавшей Виктозу, снижалось в наибольшей степени, вплоть до 58,67% и 50,82%, соответственно. Кумулятивное потребление пищи в PB-720, PB-719, PB-718 и PB-717 группах также снижалось на 31,83%, 34,88%, 48,79% и 39,63%, соответственно. Фиг. 8 показывает процент снижения кумулятивного потребления пищи в группах обработки по сравнению с контрольной модельной группой после введения в течение 14 последовательных дней.

Эффект длительного введения на массу тела DIO мышей показан на Фиг. 9 и Фиг. 10. В конце эксперимента масса тела в модельной контрольной группе повышалась на 10,24% по сравнению с массой тела до начала введения, и масса тела в каждой группе обработки снижалась в разной степени. Из них, PB-716 группа имела наиболее существенное снижение, с потерей массы тела 38,03% по сравнению с массой тела до начала введения, что показало статистически значимую разницу по сравнению с модельной контрольной группой (p<0,001). Снижение массы тела в других группах было следующим: в группе, получавшей Виктозу, на 15,83% (p<0,05) по сравнению с массой тела до начала введения; в PB-720 группе на 10,21% (p<0,05); в PB-719 группе на 24,73% (p< 0,001); в PB-718 группе на 30,25% (p<0,001); в PB-717 группе на 28,11% (p<0,001), указывая на то, что длительное введение соединений серии PB-716 имело существенный эффект ингибирования массы тела DIO мышей.

Эффект длительного введения на случайный уровень сахара в крови у DIO мышей показан на Фиг. 11. После 9 недель содержания на высокожировой диете случайный уровень сахара в крови у C57BL/6 мышей повышался до некоторой степени. Средний случайный уровень сахара в крови в группе с нормальным питанием составил 8,7 ммоль/л, тогда как средний случайный уровень сахара в крови в группе, получавшей корм с высоким содержанием жира, повысился на 33,3%, до 11,6 ммоль/л. Случайный уровень сахара в крови в каждой группе обработки существенно снижался после введения, и PB-716 группа показала самое большое снижение (51,06% в среднем) (P<0,05). PB-720, PB-719 и PB-718 также показали снижение на 29,31%, 33,40% и 38,89%, соответственно, что показывает статистически значимую разницу (p<0,05) по сравнению с модельной контрольной группой, указывая на то, что длительное введение соединений серии PB-716 имело гипогликемический эффект на DIO мышей.

Эти результаты показывают, что PB-716 серия конъюгатов Эксендина-4 и глюкагона, являющихся двойными агонистами, существенно продлевает продолжительность действия соединения у животных в результате присоединения ПЭГ молекул. Длительное введение соединений серии PB-716 имеет очевидный ингибиторный эффект на потребление пищи у DIO мышей и существенно снижает массу тела DIO мышей, из этих соединений PB-716 имеет наилучший эффект снижения массы тела.

Пример 17. Эксперимент для оценки фармакологического эффекта длительного введения комбинации PB-708 и PB-120 на снижение массы тела у DIO Мышей

Самцов C57BL/6 мышей (Cavens Lab Animal Co., Ltd., Changzhou, China) содержали на высокожировой диете (MD12032, 45% ккал, Medicience Co., Ltd., Jiangsu, China) в течение 12 недель, и масса тела у них была на 20% больше, чем у мышей, получавших обычный корм (Suzhou Shuangshi Animal Feed Technology Co., Ltd., China), показывая, что модель алиментарного ожирения (DIO) успешно установлена. 35 DIO мышей разделяли на 7 групп на основании их массы тела и случайного уровня сахара в крови, по 5 мышей на группу, где группы представляли собой следующие: группа, получавшая Виктозу (200 мкг/кг), группа введения высокой дозы PB-718 (383 мкг/кг), группа введения низкой дозы PB-718 (153,2 мкг/кг), PB-119 группа (210 мкг/кг), ПЭГ-OXM (конъюгат природного двойного агониста GLP-1 рецептора и глюкагонового рецептора Оксинтомодулина и 23кДа ПЭГ) группа (222,5 мкг/кг), группа комбинированного введения (172,9 мкг/кг PB-708+210 мкг/кг PB-120) и модельная контрольная группа (физиологический солевой раствор) (доза в расчете на содержание пептида). Группе, получавшей Виктозу, введение осуществляли один раз в день, а в остальных группах введение осуществляли один раз каждые 2 дня. Эксперимент с длительным введением осуществляли в общей сложности в течение 14 дней. В период осуществления эксперимента у мышей каждый день измеряли массу тела и потребление пищи. Случайный уровень сахара в крови измеряли до начала эксперимента и после завершения эксперимента.

Эффект длительного введения на массу тела DIO мышей показан на Фиг. 12 и Фиг. 13. В конце эксперимента масса тела мышей в модельной контрольной группе повышалась на 6,30% по сравнению с массой тела до начала введения, и масса тела каждой группы обработки снижалась в разной степени. Из этих групп, группа, получавшая Виктозу, потеряла 15,92% (p<0,05) массы тела по сравнению с массой тела до начала введения; PB-119 группа потеряла 13,33% (p<0,05), подобно группе, получавшей Виктозу. В ПЭГ-OXM группе снижение было только на 1,34% (p>0,05), вероятно из-за того, что природный двойной агонист Оксинтомодулин имел слабую активность к глюкагону и GLP-1 рецептору. Масса тела группы комбинированного введения снижалась на 24,72% по сравнению с массой тела до начала введения, показывая статистически значимую разницу (p<0,001) по сравнению с модельной контрольной группой. PB-718 показал дозозависимый эффект на снижение массы тела у DIO мышей. Группа введения низкой дозы PB-718 потеряла 18,78% массы тела (p<0,001), тогда как группа введения высокой дозы PB-718 потеряла 27,38% массы тела (p<0,001). Результаты эксперимента показывают, что PB-718, являющийся двойным агонистом глюкагона и GLP-1 рецептора, а также длительное введение комбинации глюкагон+агонист рецептора GLP-1 имеет явный ингибиторный эффект на массу тела DIO мышей, при этом эффект снижения массы тела был значительно лучше, чем эффект агониста GLP-1 рецептора PB-119, используемого отдельно.

Эффект длительного введения на потребление пищи у DIO мышей показан на Фиг. 14 и Фиг. 15. В ходе эксперимента кумулятивное потребление пищи в модельной контрольной группе показало линейную тенденцию к повышению, тогда как группы обработки имели разную степень снижения потребления пищи по сравнению с контрольной группой. К концу 14-дневного периода постоянного введения наибольшее снижение кумулятивного потребления пищи показали группа комбинированного введения и группа введения высокой дозы PB-718, вплоть до 43,69% и 45,34%, соответственно. Кумулятивное потребление пищи в группе введения низкой дозы PB-718 и в группе PB-119 также снижалось на 34,37% и 39,95%, соответственно.

Эффект длительного введения на случайный уровень сахара в крови у DIO мышей показан на Фиг. 16. После 12 недель содержания на высокожировой диете случайный уровень сахара в крови у C57BL/6 мышей повышался до некоторой степени. Средний случайный уровень сахара в крови в группе с нормальным питанием составил 8,7 ммоль/л, тогда как средний случайный уровень сахара в крови в группе, получавшей корм с высоким содержанием жира, повысился на 17,3%, вплоть до 10,2 ммоль/л. Случайный уровень сахара в крови в каждой группе обработки существенно снижался после введения, и уровень сахара в крови в группе введения высокой дозы PB-718, группе комбинированного введения, группах введения низких доз PB-119 и PB-718 снижался на 31,61%, 31,61%, 27,27% и 28,30%, соответственно, показывая статистически значимую разницу (p<0,05) по сравнению с модельной контрольной группой, и это указывает на то, что длительное введение соединения PB-718 имело определенный гипогликемический эффект у DIO мышей.

Пример 18. Эксперимент для оценки фармакологического эффекта длительного введения комбинации PB-119 и PB-721 или комбинации PB-119 и PB-722 на снижение массы тела у DIO мышей

Самцов C57BL/6 мышей (Cavens Lab Animal Co., Ltd., Changzhou, China) содержали на высокожировой диете (MD12032, 45% ккал, Medicience Co., Ltd., Jiangsu, China) в течение 16 недель, и масса тела у них была на 20% больше, чем у мышей, получавших обычный корм (Suzhou Shuangshi Animal Feed Technology Co., Ltd., China), показывая, что модель алиментарного ожирения (DIO) успешно установлена. 80 DIO мышей разделяли на 10 групп на основании их массы тела и случайного уровня сахара в крови, по 8 мышей на группу, где группы представляли собой следующие: модельная контрольная группа, группа PB-119 (10 нмоль/кг), группа PB-721 (60 нмоль/кг), группа PB-722 (60 нмоль/кг), группа PB-722 (10 нмоль/кг)+PB-119 (10 нмоль/кг), группа PB-722 (30 нмоль/кг)+PB-119 (10 нмоль/кг), группа PB-722 (60 нмоль/кг)+PB-119 (10 нмоль/кг), группа PB-722 (100 нмоль/кг)+PB-119 (10 нмоль/кг), группа PB-722 (150 нмоль/кг)+PB-119 (10 нмоль/кг), группа PB-721 (60 нмоль/кг)+PB-119 (10 нмоль/кг) и модельная контрольная группа (физиологический солевой раствор). Введение в каждой группе осуществляли подкожно один раз каждые два дня, и эксперимент продолжался в течение 21 дня с 11 введениями. В период осуществления эксперимента у мышей каждый день измеряли массу тела и потребление пищи. Уровень сахара в крови измеряли в День 1 и День 21 и уровень триглицеридов в сыворотке, общий холестерин, уровень триглицеридов в печени и другие показатели измеряли в День 21.

Эффект длительного введения на массу тела DIO мышей показан на Фиг. 17 и Фиг. 18. В ходе эксперимента масса тела в модельной контрольной группе была стабильной, и масса тела в каждой группе обработки снижалась в разной степени. После введения масса тела в модельной контрольной группе повышалась на 0,85% по сравнению с массой тела до начала введения. Масса тела в группе отдельного введения PB-119 (10 нмоль/кг) снижалась на 14,37%, и масса тела в группах отдельного введения PB-721 (60 нмоль/л) и PB-722 (60 нмоль/л) снижалась на 21,65% и 21,95%, соответственно. Однако, в случае равных доз, мыши в группах комбинированного введения (10 нмоль/кг PB-119+60 нмоль/кг PB-721) и (10 нмоль/кг PB-119+60 нмоль/кг PB-722) имели снижение массы тела 47,18% и 40,02%, соответственно, и процент снижения массы тела превышал сумму процентов при отдельном введении двух компонентов комбинации, демонстрируя, что одновременное использование двух компонентов комбинации имеет синергический эффект на снижение массы тела у DIO мышей.

Кроме того, авторы настоящего изобретения к удивлению обнаружили, что, когда молярное соотношение агониста рецептора GLP-1 (т.е. PB-119) и агониста глюкагонового рецептора (т.е. PB-722) находится в определенных пределах, эффект снижения массы тела является удивительно хорошим. См. данные для группы PB-722 (60 нмоль/кг)+PB-119 (10 нмоль/кг), группы PB-722 (100 нмоль/кг)+PB-119 (10 нмоль/кг), группы PB-722 (150 нмоль/кг)+PB-119 (10 нмоль/кг).

Эффект длительного введения на потребление пищи у DIO мышей показан на Фиг. 19 и Фиг. 20. Введение PB-119, PB-721 и PB-722 отдельно имеет определенный ингибиторный эффект на аппетит у DIO мышей, тогда как комбинация PB-119 и PB-721 или комбинация PB-119 и PB-722 имеет сильный ингибиторный эффект на аппетит у DIO мышей, который является более значительным, чем сумма ингибиторных эффектов, достигаемых при введении этих двух компонентов по отдельности. По сравнению с модельной контрольной группой кумулятивное потребление пищи в группах введения PB-119 (10 нмоль/кг) отдельно, PB-721 (60 нмоль/кг) отдельно и PB-722 (60 нмоль/кг) отдельно снижалось на 25,14%, 2,36% и 9,11%, соответственно. Кумулятивное потребление пищи в группе комбинированного введения (10 нмоль/кг PB-119+60 нмоль/кг PB-721) снижалось на 61,44%, и кумулятивное потребление пищи в группе комбинированного введения (10 нмоль/кг PB-119+60 нмоль/кг PB-722) снижалось на 50,56%.

Результаты, показывающие уровень триглицеридов в сыворотке, общий холестерин в сыворотке и уровень триглицеридов в печени, показаны на Фиг. 21, Фиг. 22 и Фиг. 23. Общий холестерин и уровень триглицеридов в печени в модельной контрольной группе DIO мышей были существенно выше, чем в нормальной контрольной группе, указывая на явное нарушение метаболизма липидов. Длительное введение PB-119 (10 нмоль/кг), PB-721 (60 нмоль/кг) или PB-722 (60 нмоль/кг) отдельно существенно не улучшало уровень триглицеридов в сыворотке у DIO мышей. Уровень триглицеридов в сыворотке в группах комбинированного введения PB-119 и PB-721 или PB-119 и PB-722 при равной дозе существенно снижался (p<0,05) на 32,58% и 22,83%, соответственно, по сравнению с модельной контрольной группой.

Содержание триглицеридов в печени у DIO мышей было значительно выше, чем у нормальных контрольных мышей (p<0,01). По сравнению с модельной контрольной группой содержание триглицеридов в печени в группе введения PB-119 отдельно (10 нмоль/кг) снижалось на 12,67% (p>0,05); содержание триглицеридов в печени в группе введения PB-721 отдельно (60 нмоль/кг), группе введения PB-722 отдельно (60 нмоль/кг) и в двух группах комбинированного введения существенно (p<0,01) снижалось на 73,29%, 76,84%, 64,47% и 74,48%, соответственно, что было близко к уровню триглицеридов в печени у нормальных контрольных мышей.

Содержание общего холестерина в сыворотке у DIO мышей было значительно выше, чем у нормальных контрольных мышей (P < 0,001). Содержание общего холестерина в сыворотке у DIO мышей в группах длительного введения PB-119 отдельно (10 нмоль/кг), PB-721 отдельно (60 нмоль/кг) и PB-722 отдельно (60 нмоль/кг) снижалось (p<0,05) на 39,35%, 60,86% и 60,56%, соответственно. Содержание общего холестерина в сыворотке в группе введения комбинации PB-119 и PB-721 или в группе PB-119 и PB-722 существенно снижалось (p<0,001) на 90,85% и 91,88%, соответственно.

Пример 19. Эксперимент для оценки фармакологического эффекта на снижение массы тела у обезьян cynomolgus с алиментарным ожирением

14 обезьян cynomolgus с алиментарным ожирением (закупали у компании Jingang Biotechnology Co. Ltd., Hainan, China; модель алиментарного ожирения, установленная WuXi Apptec Co. Ltd., Shanghai, China; индекс массы тела BMI>35) рандомизированным образом распределяли по 4 группам, по 1 обезьяне каждого пола в не получавшую лекарственного средства контрольную группу и по 2 обезьяны каждого пола в группу обработки: не получавшая лекарственного средства контрольная группа (0,9% физиологический солевой раствор), группа введения низкой дозы (композиция по настоящему изобретению), группа введения средней дозы (композиция по настоящему изобретению) и группа введения высокой дозы (композиция по настоящему изобретению). Животным в каждой группе введение осуществляли подкожно один раз каждые 4 дня в течение 8 раз подряд. В ходе эксперимента животных наблюдали два раза в день на нарушение общего состояния, поведения, активности, экскреции, дыхания и другие аномальные симптомы. Количество потребляемой пищи измеряли каждый день, массу тела измеряли каждые 4 дня, и образцы крови брали для измерения биохимических показателей крови в День 1 (до введения) и День 32 (после введения).

В этом эксперименте, за исключением снижения массы тела и уменьшения потребления пищи, все экспериментальные животные показали хорошую переносимость и не показали никаких других отклонений.

Эффект длительного введения композиции по настоящему изобретению на массу тела страдающих ожирением обезьян cynomolgus показан на Фиг. 24. В ходе эксперимента масса тела животных не получавшей лекарственного средства контрольной группы была стабильной, и масса тела в каждой группе обработки снижалась в разной степени. После введения масса тела животных не получавшей лекарственного средства контрольной группы увеличивалась на 0,065% по сравнению с массой тела до начала введения, и процент снижения массы тела в группе введения низкой дозы, группе введения средней дозы и группе введения высокой дозы составил 15,0%, 12,4% и 11,5%, соответственно.

Эффект длительного введения на потребление пищи у обезьяны cynomolgus с алиментарным ожирением показан на Фиг. 25 и Фиг. 26. После введения один раз каждые 4 дня 8 раз подряд потребление пищи в каждой группе обработки заметно снижалось. До и после введения потребление пищи в не получавшей лекарственного средства контрольной группе снижалось только на 2,33%, тогда как потребление пищи в группах введения низкой дозы, средней дозы и высокой дозы снижалось на 75,6%, 62,5% и 53,7%, соответственно.

Представленные выше результаты показывают, что композиция по настоящему изобретению может существенно снижать массу тела субъекта и существенно подавлять аппетит у субъекта.

Результаты биохимического анализа крови экспериментальных животных показаны в Таблице 3. Средние уровни триглицеридов, глюкозы и аланинаминотрансферазы показаны на Фиг. 27, 28 и 29. Обезьянам cynomolgus с алиментарным ожирением подкожно вводили композицию по настоящему изобретению один раз каждые 4 дня в течение 8 последовательных недель. До и после введения уровень триглицеридов в сыворотке, уровень глюкозы в сыворотке и уровень аланинаминотрансферазы в сыворотке снижались, тогда как в не получавшей лекарственного средства контрольной группе уровни триглицеридов, глюкозы и аланинаминотрансферазы были немного повышенными. Не было никаких отклонений в экспериментах определения биохимических показателей крови в группе введения низкой дозы, группе введения средней дозы и группе введения высокой дозы.

Таблица 3 Обезьянам cynomolgus с алиментарным ожирением подкожно вводили композицию по настоящему изобретению 8 раз подряд. Показаны биохимические показатели крови до и после введения.
Группа	1 (контрольная группа)	2 (группа введения низкой дозы)	3 (группа введения средней дозы)	4 (группа введения высокой дозы)
Пол	Мужск.	Женск.	Мужск.	Женск.	Мужск.	Женск.	Мужск.	Женск.
Животное №	C1001	C1502	C2001	C2002	C2503	C2504	C3001	C3002	C3503	C3504	C4001	C4002	C4503	C4504
Общий холестерин (ммоль/л)	До введения	2,36	2,72	2,18	2,84	2,80	2,81	2,78	2,22	2,68	2,35	3,41	2,78	2,88	2,47
После введения	2,36	2,21	2,79	2,92	2,88	2,24	2,97	1,70	2,53	3,00	4,17	3,50	2,81	2,55
Триглицериды (ммоль/л)	До введения	0,91	1,46	1,53	1,26	1,03	0,57	0,70	0,49	0,61	1,51	0,30	1,46	0,30	1,60
После введения	1,25	0,97	0,42	0,22	0,63	1,05	0,45	0,31	0,40	0,43	0,25	0,62	0,32	0,82
Глюкоза (ммоль/л)	До введения	3,18	6,95	5,05	3,87	6,36	9,14	4,88	3,46	5,31	6,08	3,96	4,97	4,06	4,09
После введения	3,25	7,48	3,36	2,52	4,51	5,61	3,83	3,32	4,91	6,87	2,99	2,91	3,77	3,39
Общий билирубин (мкмоль/л)	До введения	2,46	2,69	2,49	5,16	2,65	3,39	3,38	3,18	2,87	2,87	4,61	2,48	5,52	2,87
После введения	2,15	3,43	5,33	5,77	3,98	11,69	6,05	3,84	3,87	4,71	4,13	3,72	8,08	4,46
Аланинамино-трансфераза (Ед./л)	До введения	30	41	41	60	26	20	73	24	25	129	43	54	56	64
После введения	42	50	18	50	50	19	22	29	23	42	18	35	42	65
Аспарагин-амино-трансфераза (Ед./л)	До введения	29	26	40	37	28	33	64	39	31	53	48	41	44	40
После введения	34	27	30	40	30	40	44	40	40	44	42	47	39	45
Общее содержание белка (г/л)	До введения	81,2	85,3	76	90	88	75,5	81,8	86,5	89,4	85,6	82,6	88,5	90,2	79,5
После введения	80,4	81	70,5	82,2	83,2	68,5	79,1	80,6	86,5	87	80,3	84,8	88,8	75
Альбумин (г/л)	До введения	41,5	42,5	40,4	46,9	37,2	38,4	41	43,2	44,8	39,5	43	44,8	43,9	38,8
После введения	40,3	41,2	35,5	45	38,9	31,1	43	41,7	44	43	43,3	44,6	43,1	39,6
Щелочная фосфатаза (Ед./л)	До введения	116	153	162	145	94	238	180	162	126	168	94	266	140	168
После введения	115	114	162	122	80	474	128	130	98	123	119	193	110	124
Глутамил-транспептидаза (Ед./л)	До введения	46	87	25	77	52	79	102	87	54	55	49	66	59	29
После введения	45	77	22	74	49	58	86	96	59	35	64	52	55	26

Группа	1 (контрольная группа)	2 (группа введения низкой дозы)	3 (группа введения средней дозы)	4 (группа введения высокой дозы)
Пол	Мужск.	Женск.	Мужск.	Женск.	Мужск.	Женск.	Мужск.	Женск.
Животное №.	C1001	C1502	C2001	C2002	C2503	C2504	C3001	C3002	C3503	C3504	C4001	C4002	C4503	C4504
Глобулин (г/л)	До введения	39,7	42,8	35,6	43,1	50,8	37,1	40,8	43,3	44,6	46,1	39,6	43,7	46,3	40,7
После введения	40,1	39,8	35	37,2	44,3	37,4	36,1	38,9	42,5	44	37	40,2	45,7	35,4
Альбумин/Глобулин	До введения	1,05	0,99	1,13	1,09	0,73	1,04	1	1	1	0,86	1,09	1,03	0,95	0,95
После введения	1,00	1,04	1,01	1,21	0,88	0,83	1,19	1,07	1,04	0,98	1,17	1,11	0,94	1,12
Мочевина (ммоль/л)	До введения	4,30	5,14	4,31	4,44	5,42	4,34	5,11	5,32	5,46	3,97	6,9	5,08	4,54	6,25
После введения	4,37	6,16	4,44	7,08	5,28	6,99	5,25	5,39	7,74	6,33	4,88	5,3	3,95	4,07
Креатинин (ммоль/л)	До введения	81,0	51,0	93,0	109	65,0	50	119	82	45	54	102	116	50	39
После введения	72,0	46,0	77,0	104	60,0	48	108	75	42	55	87	86	49	39
Креатинкиназа (Ед./л)	До введения	149	151	112	213	86,0	96	150	96	118	391	139	174	138	314
После введения	294	151	59	153	79,0	186	96	92	217	181	60	175	86	394
Кальций (ммоль/л)	До введения	2,42	2,44	2,41	2,58	2,36	2,49	2,49	2,54	2,72	2,51	2,69	2,74	2,41	2,31
После введения	2,43	2,33	2,31	2,46	2,45	2,38	2,37	2,47	2,73	2,79	2,49	2,47	2,41	2,32
Фосфор (ммоль/л)	До введения	1,44	1,73	1,46	1,8	1,01	2,03	1,58	1,87	1,75	1,52	1,91	1,65	1,85	1,7
После введения	1,6	1,62	1,49	1,16	1,08	1,94	1,3	1,56	1,16	1,06	1,38	1,26	1,44	1,41
Натрий (ммоль/л)	До введения	145	150	148	151	143	149	149	150	152	149	155	162	145	149
После введения	143	146	141	144	142	141	145	146	151	148	145	147	147	151
Калий (ммоль/л)	До введения	4,3	4,1	4,0	4,9	4,1	4,9	5,1	5,3	6,4	3,8	4,3	5,5	4,2	3,8
После введения	4,6	4,9	4,8	5,1	4,5	5,9	4,1	6,6	7,1	5,8	5,4	5,6	5,0	5,1
Хлор (ммоль/л)	До введения	105	105	106	104	103	106	106	107	106	103	104	114	103	105
После введения	104	111	103	106	107	101	105	110	112	110	106	110	112	115

Эффекты длительного введения на объем талии и распределение жировой ткани у обезьян cynomolgus с алиментарным ожирением показаны на Фиг. 30 и Фиг. 31. После введения один раз каждые 4 дня 8 раз подряд объем талии и распределение жировой ткани во всех группах обработки существенно уменьшались, тогда как у обезьян cynomolgus в не получавшей лекарственного средства контрольной группе не было существенного изменения объема талии и распределения жировой ткани до и после введения.

Пример 20. Эксперимент для оценки фармакологического эффекта комбинации PB-119 и PB-722 на снижение массы тела у DIO мышей

Самцов C57BL/6 мышей (из того же источника, который описан выше) содержали на высокожировой диете (45% ккал) в течение 22 недель. Средняя масса тела и уровень сахара в крови у них были на 20% выше по сравнению с мышами того же возраста, получавшими обычный корм, показывая, что модель ожирения и гипергликемии успешно установлена. 36 DIO мышей разделяли на 6 групп на основании их массы тела и случайного уровня сахара в крови, по 6 мышей на группу. Группа 1 представляла собой модельную контрольную группу, группа 2 представляла собой группу введения 10 нмоль/кг PB-119 (42,03 мкг/кг, в расчете на пептид, то же самое ниже), группа 3 представляла собой группу введения PB-722 60 нмоль/кг (212,58 мкг/кг), группа 4 представляла собой группу введения PB-119 10 нмоль/кг (42,03 мкг/кг) и 20 нмоль/кг PB-722 (70,86 мкг/кг), группа 5 представляла собой группу введения PB-119 10 нмоль/кг (42,03 мкг/кг) и PB-722 60 нмоль/кг (212,58 мкг/кг), группа 6 представляла собой группу введения инъекции лираглутида 25 нмоль/кг (75,02 мкг/кг). Исключение составляла группа 6, где введение осуществляли два раза в день, в других группах введение осуществляли один раз каждые два дня. Эксперимент осуществляли в общей сложности в течение 21 дня для длительного постоянного введения. Массу тела мышей и потребление пищи измеряли в день введения, а случайный уровень сахара в крови и уровень сахара в крови натощак измеряли на второй день после последнего введения.

Результаты показали, что длительное введение комбинации (PB-119+PB-722) имеет существенный ингибиторный эффект на потребление пищи и массу тела у DIO мышей.

В течение 21 дня после начала длительного введения кумулятивное потребление пищи в модельной контрольной группе показало линейную тенденцию к повышению, а потребление пищи в группах введения комбинации снижалось в различной степени по сравнению с контрольной группой. Результаты показаны на Фиг. 32 и Фиг. 33. В конце 21-дневного эксперимента длительного постоянного введения группа 5: PB-722 (60 нмоль/кг)+PB-119 (10 нмоль/кг) показала наибольшее уменьшение кумулятивного потребления пищи, достигающее 61,1%, тогда как PB-119 группа имела наименьшее уменьшение кумулятивного потребления пищи, которое составило 14,4%.

Масса тела в модельной контрольной группе повышалась на 2,3% по сравнению с массой тела до начала введения, тогда как группы обработки показали уменьшение масса тела в различной степени. Результаты показаны на Фиг. 34 и Фиг. 35. Уменьшение в группе введения комбинации PB-722 (60 нмоль/кг)+PB-119 (10 нмоль/кг) было наиболее существенным, которое составило 46,1% по сравнению с массой тела до начала введения, показывая статистическую значимость по сравнению с модельной контрольной группой (p<0,01). PB-119 группа имела наименьшее снижение массы тела, которое составило 16,6% по сравнению с массой тела до введения.

Длительное постоянное введение комбинации мышам существенно снижало уровень сахара в крови натощак. За исключением того, что в контрольной группе концентрация сахара в крови натощак повышалась, в других группах обработки концентрация сахара в крови натощак снижалась в различной степени. Результаты показаны на Фиг. 36. Группа введения комбинации PB-722 (60 нмоль/кг)+PB-119 (10 нмоль/кг) имела наибольшее существенное снижение, которое составило 39,6% по сравнению с показателем до введения. Уровень сахара в крови натощак в группе введения лираглутида (вводили два раза в день) снижался на 37,0%. PB-119 группа имела наименьшее уменьшение уровня сахара в крови, который был на 17,9% ниже, чем до введения.

Длительное введение комбинации также существенно улучшало пероральную переносимость глюкозы у мышей. После 21-дневного введения осуществляли эксперимент пероральной переносимости глюкозы. Мышам перорально вводили 2,5 г/кг раствора глюкозы и уровень глюкозы измеряли в точках времени 0 мин, 15 мин, 30 мин, 60 мин и 120 мин после приема сахара. Как показывают результаты, площадь под кривой концентрация сахара в крови - время для групп введения высокой дозы и низкой дозы комбинации существенно меньше, чем для контрольной группы и существенно лучше, чем для группы введения лираглутида, и это демонстрирует, что комбинация по настоящему изобретению эффективно улучшает пероральную переносимость глюкозы у мышей, и результаты показаны на Фиг. 37.

Пример 21. Эксперимент для оценки фармакологического эффекта комбинации PB-119 и PB-722 в мышиной модели неалкогольного стеатогепатита (NASH)

В этом эксперименте использовали 30 C57/BL6J мышей (закупали у компании Lingchang Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China). Двадцати четырем из них интраперитонеально вводили стрпетозоцин (STZ) через одну неделю после их рождения и содержали на высокожировой диете (корм закупали у компании Research Diets, Inc) в течение пяти недель для успешного создания модели неалкогольного стеатогепатита (NASH). Оставшихся 6 мышей использовали в качестве нормального контроля, и они получали нормальный корм. Введение начинали на шестой неделе. 24 NASH модельных мышей рандомизированным образом разделяли на 4 группы на основании их массы тела, по 6 мышей на группу, где группы представляли собой следующие: не получавшая лекарственное средство контрольная группа (0,9% физиологический солевой раствор), положительная контрольная группа (10 мг/кг телмисартана), группа введения низкой дозы (10 нмоль/кг PB-119+30 нмоль/кг PB-722), группа введения высокой дозы (10 нмоль/кг PB-119+60 нмоль/кг PB-722). Введение в положительной контрольной группе осуществляли перорально один раз в день, а в других группах введение осуществляли подкожно один раз каждые два дня в течение 21 дня подряд. В период введения массу тела измеряли каждый день, а потребление пищи измеряли каждые два дня. После последнего дня введения животные голодали в течение ночи, и затем их взвешивали и умерщвляли. Сыворотку и ткани печени извлекали и измеряли массу печени. Определяли уровни глюкозы и инсулина в сыворотке. Ткань печени фиксировали раствором формальдегида и получали срезы ткани и окрашивали HE, масляным красным и Сириус красным. Срезы исследовали и оценивали для определения индекса NASH.

Эффекты длительного введения на уровень сахара в крови и уровни инсулина у мышей показаны на Фиг. 38 и Фиг. 39. Концентрация сахара в крови в модельной контрольной группе была значительно выше, чем в нормальной контрольной группе. Положительный контроль телмисартан не имел никакого эффекта на уровень сахара в крови у животных. После длительного введения низкой дозы комбинации (10 нмоль/кгPB-119+30 нмоль/кг PB-722) и высокой дозы (10 нмоль/кгPB-119+60нмоль/кг PB-722) уровень сахара в крови существенно снижался, показывая явный эффект снижения уровня сахара в крови. После длительного введения в каждой группе не было никакого существенного изменения уровня инсулина. Объединив этот результат с изменениями концентрации сахара в крови, было продемонстрировано, что длительное введение комбинации улучшало чувствительность к инсулину у животных.

После 21-дневного длительного введения NASH оценки срезов печени показаны на Фиг. 40. NASH оценки в модельной контрольной группе были существенно выше, чем в нормальной контрольной группе, показывая, что модель успешно установлена. Длительное введение PB-119+PB-722 комбинации улучшало NASH оценку у животных дозозависимым образом, указывая на то, что введение комбинации существенно улучшало NASH у мышей. NASH оценки в группах введения высокой дозы и низкой дозы были ниже, чем в группе введения телмисартана в качестве положительного контроля.

Вышеприведенное описание является только предпочтительным вариантом осуществления, который приведен только в качестве примера и не ограничивает комбинацию признаков, необходимых для осуществления настоящего раскрытия. Представленные заголовки не предназначены для ограничения различных вариантов осуществления настоящего раскрытия. Термины, такие как «содержит», «содержащий» и «включает», не предназначены для ограничения. Кроме того, если не указано иное, слово без числовой модификации включает форму множественного числа, и «или» означает «и/или». Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, которое хорошо известно специалистам в данной области техники.

Все публикации и патенты, указанные в настоящей заявке, включены в настоящую заявку посредством ссылки. Различные модификации и варианты описанных способов и композиций настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники без отступления от объема и сущности настоящего раскрытия. Хотя настоящее раскрытие описано с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно неоправданно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, различные модификации описанных вариантов осуществления для осуществления настоящего изобретения, которые очевидны для специалистов в данной области, предусматриваются как охватываемые формулой изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PEGBIO CO.,LTD.

<120> КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ АГОНИСТ РЕЦЕПТОРА GLP-1 И АГОНИСТ ГЛЮКАГОНОВОГО РЕЦЕПТОРА, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PB-105

<400> 1

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys

35

<210> 2

<211> 29

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 2

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 3

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PB-702

<400> 3

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 4

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PB-703

<400> 4

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Cys Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 5

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PB-740

<400> 5

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys

20 25 30

<210> 6

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PB-741

<400> 6

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<---

1. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения неалкогольной жировой болезни печени, похудения, снижения уровня сахара в крови, снижения уровня липидов, ингибирования аппетита у субъекта, снижения уровня общего холестерина в сыворотке и/или снижения содержания триглицеридов в печени, включающая фармацевтически эффективное количество агониста рецептора GLP-1 и агониста глюкагонового рецептора, где агонист рецептора GLP-1 и агонист глюкагонового рецептора каждый независимо образуют конъюгат с гидрофильным полимером,

где молярное отношение конъюгата, включающего агонист рецептора GLP-1, к конъюгату, включающему агонист глюкагонового рецептора, составляет от 1:1 до 1:15;

где агонист рецептора GLP-1 выбран из эксендина-4, эксендина-3 и GLP-1;

где агонистом глюкагонового рецептора является глюкагон и гидрофильным полимером является полиэтиленгликоль.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, которая дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.

3. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где гидрофильный полимер имеет молекулярную массу от 10 кДа до 40 кДа, более предпочтительно от 20 кДа до 40 кДа, в частности от 15 кДа до 30 кДа, более конкретно от 21 кДа до 29 кДа.

4. Фармацевтическая композиция по п. 1, где агонист рецептора GLP-1 представляет собой PB-105.

5. Фармацевтическая композиция по п. 1, где глюкагон представляет собой PB-702, PB-703, PB-740 или PB-741, где

PB-702 имеет последовательность SEQ ID NO: 3;

PB-703 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

PB-740 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и

PB-741 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, где боковая цепь "-CO-NH2" глутамина в 24 положении модифицирована в "-CO-NH-CH2CH2-SH".

6. Фармацевтическая композиция по п. 1, где последовательность глюкагона модифицирована на одном или нескольких сайтах относительно последовательности глюкагона дикого типа, где модификация выбрана из группы, состоящей из добавления цистеина к боковой цепи лизина в положении 12 SEQ ID NO: 2, добавления тиогликолевой кислоты к боковой цепи лизина в положении 12 SEQ ID NO: 2, добавления меркаптопропионовой кислоты к боковой цепи лизина в положении 12 SEQ ID NO: 2, добавления цистеина к боковой цепи глутамина в положении 24 SEQ ID NO: 2, добавления меркаптоэтила к боковой цепи глутамина в положении 24 SEQ ID NO: 2, добавления меркаптопропила к боковой цепи глутамина в положении 24 SEQ ID NO: 2 и добавления меркаптопропионовой кислоты к боковой цепи глутамина в положении 24 SEQ ID NO: 2.

7. Фармацевтическая композиция по п. 6, где добавление или замена цистеином выбраны из группы, состоящей из замены глутамина в положении 24 SEQ ID NO: 2 цистеином, замены лизина в положении 12 SEQ ID NO: 2 цистеином и добавления цистеина после 29-го положения SEQ ID NO: 2.

8. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения неалкогольной жировой болезни печени, похудения, снижения уровня сахара в крови, снижения уровня липидов, ингибирования аппетита у субъекта, снижения уровня общего холестерина в сыворотке и/или снижения содержания триглицеридов в печени, включающая средство, выбранное из группы, состоящей из: комбинации PB-721 и PB-119, комбинации PB-722 и PB-119 и комбинации PB-708 и PB-120, где

PB-721 представляет собой мПЭГ-23KD-ppMAL-PB-740, где PB-740 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;

PB-722 представляет собой мПЭГ-23KD-ppMAL-PB-741, где PB-741 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, в которой боковая цепь "-CO-NH2" глутамина в 24 положении модифицирована в "-CO-NH-CH2CH2-SH";

PB-119 представляет собой мПЭГ-23KD-ppMAL-PB-105, где PB-105 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;

PB-120 представляет собой мПЭГ-25KD-ppMAL-PB-105, где PB-105 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и

PB-708 представляет собой мПЭГ-25KD-ppMAL-PB-703, где PB-703 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

9. Набор для предупреждения или лечения неалкогольной жировой болезни печени, похудения, снижения уровня сахара в крови, снижения уровня липидов, ингибирования аппетита у субъекта, снижения уровня общего холестерина в сыворотке и/или снижения содержания триглицеридов в печени, включающий композицию по любому из пп. 1-8 и необязательно инструкцию по применению.

10. Применение композиции по любому из пп. 1-8 для изготовления лекарственного средства для профилактики или лечения неалкогольной жировой болезни печени, похудения, снижения уровня липидов и/или снижения уровня сахара в крови.

11. Применение композиции по любому из пп. 1-8 для изготовления лекарственного средства для подавления аппетита у субъекта, снижения уровня общего холестерина в сыворотке и/или снижения содержания триглицеридов в печени.