Способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов

Изобретение относится к области медицины и микробиологии. Раскрыт способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов путем создания микробной биопленки, в котором биопленку формируют под предметным стеклом, расположенным под углом 30° в чашке Петри, окрашивают любым из доступных методов и визуализируют структуру биопленки с помощью видеоокуляра DCM 310 (Китай), подвергают ее морфометрическому исследованию в программе Scope Photo х86, 3.1.312 (США) для оценки морфологических особенностей структуры биопленки микроорганизмов и измерения размеров отдельных ее структурных компонентов, с последующим сохранением результата на электронном носителе в формате файлов jpg. Изобретение обеспечивает повышение информативности способа, возможность изучения структурных особенностей пленок при разных методах их окраски и биопленкообразующей способности практически всех известных микроорганизмов. 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, инфекционным болезням, дезинфектологии и может быть использовано для изучения действия химических веществ и физических факторов на биопленку и биопленкообразующую способность разных микроорганизмов.

Биопленки - высокоорганизованные, подвижные, непрерывно изменяющиеся гетерогенные сообщества микроорганизмов, состоящие, как правило, из клеточной части и, преимущественно полисахаридного, матрикса, обеспечивающего защиту от неблагоприятных внешних факторов, в том числе эффекторов иммунитета и антибиотиков (Сидоренко С.В. и соавт., 2017). Существующие методы визуализации биопленки не предусматривают дифференцированной окраски ее компонентов, т.к. нет возможности установить субстрат, окрашиваемый, например генцианвиолетом, поскольку этот краситель может формировать комплексы, как с внутриклеточными, так и внеклеточными структурами. В целом, имеющиеся подходы не позволяют адекватно оценивать антибиопленочные эффекты препаратов, в то время как результаты изучения взаимодействия лекарственных средств с компонентами биопленки могут обеспечивать их наиболее корректный выбор.

Известен способ оценки биопленокоообразующей способности микроорганизмов при экспозиции в течение 40 минут в 0,1% водном растворе генцианвиолета с последующей его экстракцией спиртом в течение 10 минут [O'Toole, G.A. Microtiter dish biofilm formation assay. J. Vis. Exp.2011; 47: 2437].

Недостатки прототипа: недостаточная точность способа из-за отсутствия возможности визуализации и дифференцировки отдельных структурных компонентов микробной биопленки, невозможность проведения морфометрических исследований, отсутствие возможности сохранения результатов исследований на электронных носителях.

Технический результат: повышение информативности способа за счет дифференцировки и визуализации отдельных структурных компонентов биопленки, возможность изучения структурных особенностей пленок при разных методах их окраски, сохранение результатов исследования в виде файлов формата jpg, доступность способа для изучения биопленкообразующей способности практически всех известных микроорганизмов.

Сущность метода заключается в том, что для оценки морфологической структуры биопленки используют двухэтапный подход, позволяющий на первом этапе культивировать штаммы на границе раздела двух сред «воздух-жидкость» для создания условий для биопленкообразования, а на втором - визуализировать отдельные структурные компоненты биопленки и провести их морфометрическое исследование с помощью видеоокуляра DCM 310 (Китай) в программе ScopePhoto х86, 3.1.312 (США) с последующим сохранением результата на электронных носителях в формате файлов jpg. Такой способ дает возможность определять точки действия лекарственных препаратов и повышать терапевтический эффект за счет комбинации лекарственных средств, с различными мишенями действия.

Способ осуществляют следующим образом:

Биопленки исследуемых культур микроорганизмов формируют в стерильной чашке Петри, в которую помещают предметное стекло под углом 30° и в пространство под ним наливают питательный бульон с предварительно подготовленной микробной взвесью. Для создания оптимальных условий биопленкообразования в чашку Петри помещают стерильный тампон, смоченный дистиллированной водой. По окончании 24 часовой инкубации стекло извлекают и аккуратно промывают забуференным физиологическим раствором, после чего подсушивают на воздухе. Далее после фиксации препарата в пламени спиртовки можно использовать любой из доступных методов окраски, например, метод Грама [Silhavy T.J., Kahne D., Walker S. The Bacterial Cell Envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2010. 2 (5).]. В последующем при микроскопии препаратов с помощью видеоокуляра DCM 310 (Китай) и программы Scope Photo х86, 3.1.312 (США) оценивается морфологическая структура биопленки: наличие каналов и камер, количество и толщина слоев матрикса, выраженность клеточного компонента. Далее полученные результаты фиксируют на электронном носителе (например, HDD, съемные USB-носители и др.) в виде файлов jpg.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. В чашку Петри поместили предметное стекло под углом 30° и заполнили пространство под ним мясо-пептонным бульоном с взвесью Staphylococcus aureus. Для создания условий влажной камеры в чашку Петри поместили стерильный ватный тампон, смоченный дистиллированной водой. После 24 часовой инкубации стекло извлекли и промыли забуференным физиологическим раствором и после непродолжительного подсушивания фиксировали в пламени спиртовки с последующей окраской по методу Грама. С помощью видеоокуляра DCM 310 и программы Scope Photo х86, 3.1.312 произвели визуализацию биопленки и морфометрическую оценку отдельных структурных компонентов биопленки, с последующим сохранением результатов морфометрических исследований на электронном носителе в формате файлов jpg.

При микроскопии окрашенного препарата было установлено, что биопленка имеет три слоя матрикса, продольный канал и в нижней части -область локализации клеток стафилококка.

Пример 2. В чашку Петри поместили предметное стекло под углом 30° и заполнили пространство под ним мясо-пептонным бульоном с взвесью Staphylococcus aureus. После этого в жидкую часть добавляли раствор цефтазидима (10 мкг/мл). Для создания условий влажной камеры в чашку Петри поместили стерильный ватный тампон, смоченный дистиллированной водой. После 24 часовой инкубации стекло извлекли и промыли забуференным физиологическим раствором и после непродолжительного подсушивания фиксировали в пламени спиртовки с последующей окраской по методу Грама. С помощью видеоокуляра DCM 310 и программы Scope Photo х86, 3.1.312 производили визуализацию биопленки и морфометрическую оценку отдельных структурных компонентов биопленки, результаты морфометрических исследований сохраняли на электронном носителе в формате файлов jpg.

При микроскопии окрашенного препарата было установлено, что биопленка после действия антибиотика имеет те же три слоя матрикса, продольный канал и в нижней части область локализации клеток стафилококка. Однако было выявлено, что диаметр канала существенно сужен, а толщина слоев матрикса в несколько раз больше, чем в аналогичных пробах, но без антибиотика. Можно сделать заключение, что при использовании такой дозы антибиотика тест-штамм усиливает свою биопленкообразующую активность, что выражается в увеличении толщины слоев, а также в сужении просвета канала, по которому возможно поступление антибиотика в глубжележащие слои биопленки.

Пример 3. В чашку Петри поместили предметное стекло под углом 30° и заполнили пространство под ним мясо-пептонным бульоном с взвесью Staphylococcus aureus. После этого в жидкую часть добавляли 150 мкл свежеполученной плазмы крови от практически здорового донора. Для создания условий влажной камеры в чашку Петри поместили стерильный ватный тампон, смоченный дистиллированной водой. После 24 часовой инкубации стекло извлекли и промыли забуференным физиологическим раствором и после непродолжительного подсушивания фиксировали в пламени спиртовки с последующей окраской по методу Грама. С помощью видеоокуляра DCM 310 и программы Scope Photo х86, 3.1.312 производили визуализацию биопленки и морфометрическую оценку отдельных структурных компонентов биопленки, результаты морфометрических исследований сохраняли на электронном носителе в формате файлов jpg.

При микроскопии окрашенного препарата было установлено, что биопленка имеет слабо выраженный слой матрикса, продольный канал практически отсутствует или сужен до крайней степени. В слоях биопленки наблюдаются полости и каверна-подобные образования. Можно сделать заключение, что факторы свежеполученной плазмы, обладая бактерицидным эффектом, нарушают жизнедеятельность и функционирование бактериальных клеток, в результате чего биопленка имеет существенные структурные изменения.

Положительный эффект заявляемого способа состоит в следующем: способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов позволяет отдифференцировать отдельные структурные части биопленки, изучить их размеры и расположение, обеспечивая получение дополнительной информации, способствующей повышению эффективности антимикробной терапии.

Способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов путем создания микробной биопленки, отличающийся тем, что биопленку формируют под предметным стеклом, расположенным под углом 30° в чашке Петри, окрашивают любым из доступных методов и визуализируют структуру биопленки с помощью видеоокуляра DCM 310 (Китай), подвергают ее морфометрическому исследованию в программе Scope Photo х86, 3.1.312 (США) для оценки морфологических особенностей структуры биопленки микроорганизмов и измерения размеров отдельных ее структурных компонентов, с последующим сохранением результата на электронном носителе в формате файлов jpg.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Описана siRNA для ингибирования экспрессии GST-π, содержащая смысловую цепь и антисмысловую цепь, где цепи образуют дуплексную область, и где антисмысловая цепь представляет собой SEQ ID NO:157, и смысловая цепь представляет собой SEQ ID NO:131, где длина каждой цепи составляет 30 нуклеотидов или менее.

Изобретение относится к способам и устройствам для определения относительной детонационной способности газообразных и жидких горючих материалов. Способ определения относительной детонационной способности газообразных и диспергированных конденсированных горючих материалов включает подачу горючей смеси, заполнение детонационной трубы горючей смесью, зажигание горючей смеси слабым источником энергии, ускорение пламени на турбулизирующих препятствиях с образованием ударной волны, бегущей перед ускоряющимся пламенем, очаговое самовоспламенение ударно-сжатой горючей смеси с последующим переходом горения в детонацию, регистрацию факта перехода горения в детонацию и оценку относительной детонационной способности по сравнению с эталонной горючей смесью, при этом компоненты горючей смеси могут подаваться раздельно в виде газов и/или диспергированных конденсированных горючих материалов и заполнять детонационную трубу, создавая в ней течение горючей смеси с заданными термодинамическими и газодинамическими параметрами, причем зажигание горючей смеси слабым источником энергии происходит циклически, а факт перехода горения в детонацию регистрируется в каждом цикле по времени перехода горения в детонацию, причем для обеспечения одинакового расстояния перехода горения в детонацию для различных горючих смесей используется явление фокусировки ударной волны, бегущей перед ускоряющимся пламенем, а относительная детонационная способность горючей смеси оценивается сравнением среднего времени перехода горения в детонацию, определенного по нескольким циклам, с таковым для эталонной горючей смеси, причем количество циклов должно быть достаточным для статистической достоверности получаемого результата.

Изобретение относится к области медицины. Предложен автоматизированный способ обнаружения нуклеиновых кислот ВИЧ-1 в образце крови.

Изобретение относится к клинической иммунологии и гемостазиологии. Раскрыт способ определения тромбинового пути активации системы комплемента (ТПАСК) по лизису эритроцитов человека группы А, включающий использование цитратной плазмы крови человека как источник циркулирующего тромбина, его природного субстрата - компонента С5 и белков мембрано-атакующего комплекса С6, С7, С8 и С9, протеолиз компонента С5 комплемента тромбином приводит к формированию мембрано-атакующего комплекса и лизису добавленной 1% суспензии эритроцитов, активность ТПАСК в пробе определяют турбидиметрически после 10-минутной инкубации при 37°С по калибровочному графику, где 100% лизис представляет собой полный лизис эритроцитов человека при добавлении воды, а контроль эритроцитов на спонтанный лизис - 0% лизиса, при лизисе до 30% эритроцитов человека считают нормальной активность тромбинового пути системы комплемента, от 30 до 60% - повышенная активность и свыше 60% лизиса - высокая активность тромбинового пути системы комплемента человека.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен биосенсор и система для быстрого обнаружения определяемых компонентов, а также способ получения указанной системы и способ обнаружения определяемого компонента.

Изобретение относится к медицине, а именно к психиатрии, и может быть использовано для диагностики метаболического синдрома у больных шизофренией, получающих нейролептическую терапию.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для отбора женщин в группу риска развития рака молочной железы в перименопаузальном периоде.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови.

Изобретение относится к биотехнологии и описывает способ неинвазивной диагностики анеуплоидий плода с помощью анализа внеклеточной ДНК из крови беременной женщины методом массового параллельного секвенирования ДНК.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования прогрессирования хронической сердечной недостаточности (ХСН) в течение года после перенесенного инфаркта миокарда.

Группа изобретений относится к медицине, а именно цитологии, и может быть использовано для оценки цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на гепатоциты экспериментальных животных и человека.

Группа изобретений относится к медицине, а именно цитологии, и может быть использовано для оценки цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на гепатоциты экспериментальных животных и человека.
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, биохимии, имплантологии, и может быть использовано для оценки интеграции остеозамещающего материала в эксперименте.
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для раннего выбора тактики ведения животного с кишечной непроходимостью в эксперименте.
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для раннего выбора тактики ведения животного с кишечной непроходимостью в эксперименте.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способу количественного определения хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов во внутренних органах и тканях человека.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки систематической и случайной составляющих искажения сигнала датчика изображения. Раскрыт способ коррекции сигнала датчика изображения слабоконтрастных объектов в системах компьютерной микроскопии при онкологической диагностике, включающий получение цветного изображения медицинского препарата, расположенного на предметном столике микроскопа, посредством тринокуляра с цифровой камерой, после чего проводится получение серии данного изображения, с последующим усреднением в одно изображение, при этом число изображений в серии выбирается так, чтобы измеренная оценка стандартного отклонения яркости среднего значения пикселя составляло менее одной градации яркости, далее проводится получение N серий изображений без препарата для разных положений регулятора яркости микроскопа так, чтобы разность яркости изображения в соседних положениях регулятора яркости отличилась на значение, соответствующее примерно 1/N от максимально возможной яркости, а крайние позиции регулятора яркости соответствовали яркостям изображения, отличающимся от максимальной и соответственно минимальной яркости примерно на 1/(2N) от максимально возможной яркости изображения, с расчетом средней яркости по изображению для каждого из положений регуляторов яркости, после чего проводят корректировку искажений сигнала изображения.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к гельминтологии, и может быть использовано для качественного и количественного учета гельминтов при ветсанэкспертизе органов или при выявлении причин смерти животного.
Изобретение относится к области судебной медицины, судебно-медицинской экспертизы и криминалистики. Способ определения биологического возраста трупа включает гистологическое исследование тканей головного мозга - участков неповрежденного мозолистого тела, морфометрический анализ трех полученных гистологических образцов, включающий суммирование диаметров всех глиальных макрофагов под микроскопом, и при результате, равном 185 мкм и менее, делают вывод о биологическом возрасте трупа 25 лет и моложе, при результате 530 мкм и более, делают вывод о биологическом возрасте трупа 67 лет и старше.

Изобретение относится к области медицины и созданию новых материалов биомедицинского назначения. Предложен способ моделирования процесса образования фторгидроксилапатита из аналога раствора слюны человека, основанный на синтезе фторгидроксилапатита в искусственно созданной модельной среде, отличающийся тем, что для этого готовят модельную среду указанного состава: NaCl - 9,00 ммоль/л, K2CO3 - 5,00 ммоль/л, (NH4)2HPO4 - 3,30 ммоль/л, (NH4)2HPO4 - 17,00 ммоль/л, NH4Cl - 29,4901 ммоль/л, NH4F - 0,01 ммоль/л, KCl - 25,00 ммоль/л, CaCl2⋅2H2O - 6,90 ммоль/л, MgCl2⋅6H2O - 3,00 ммоль/л, варьируя концентрацию фторид-ионов от 0,0076 до 0,0229 моль/л, заменяя фосфат-ионы на фторид-ионы, синтез проводят при значении рН=6,95±0,05, при этом через 10 дней образуется фаза фторгидроксилапатита.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана siRNA для ингибирования экспрессии GST-π, содержащая смысловую цепь и антисмысловую цепь, где цепи образуют дуплексную область, и где антисмысловая цепь представляет собой SEQ ID NO:157, и смысловая цепь представляет собой SEQ ID NO:131, где длина каждой цепи составляет 30 нуклеотидов или менее.

Изобретение относится к области медицины и микробиологии. Раскрыт способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов путем создания микробной биопленки, в котором биопленку формируют под предметным стеклом, расположенным под углом 30° в чашке Петри, окрашивают любым из доступных методов и визуализируют структуру биопленки с помощью видеоокуляра DCM 310, подвергают ее морфометрическому исследованию в программе Scope Photo х86, 3.1.312 для оценки морфологических особенностей структуры биопленки микроорганизмов и измерения размеров отдельных ее структурных компонентов, с последующим сохранением результата на электронном носителе в формате файлов jpg. Изобретение обеспечивает повышение информативности способа, возможность изучения структурных особенностей пленок при разных методах их окраски и биопленкообразующей способности практически всех известных микроорганизмов. 3 пр.

Наверх