Пептидные дендримеры, содержащие фибриноген-связывающие пептиды
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым дендримерным пептидам, и может быть использовано в медицине. Описан пептидный дендример, содержащий разветвленное ядро и совокупность фибриноген-связывающих пептидов, отдельно ковалентно присоединенных к разветвленному ядру напрямую либо через линкер. Изобретение может применяться для полимеризации фибриногена, а также в качестве кровоостанавливающего агента. 11 н. и 23 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 8 пр.
Изобретение относится к пептидным дендримерам и агентам, содержащим фибриноген-связывающие пептиды, к композициям, содержащим пептидные дендримеры или агенты, к их использованию для полимеризации фибриногена и в качестве кровоостанавливающего средства.
Образование нерастворимого полимера фибрина из его растворимого прекурсора фибриногена является заключительной стадией свертывания крови. Превращение фибриногена в фибрин происходит в три стадии: ограниченный протеолиз фибриногена в мономеры фибрина с участием тромбина; агрегация мономеров фибрина в двунитчатые протофибриллы, в которых молекулы фибрина смещены друг относительно друга на 1/2 длины; и сшивание агрегированого фибрина для упрочнения тромба.
Молекула фибриногена состоит из трех пар неидентичных полипептидных цепей Аα, Bβ и γ, связанных вместе дисульфидными связями. Цепи фибриногена свернуты с образованием трех отдельных участков структуры: два участка D на концах связаны с одним центральным участком Е. Каждый участок D содержит центры полимеризации «а» и «b», расположенные на С-конце цепей γ и Вβ, соответственно. Тромбин катализирует отщепление коротких пептидов, фибринопептидов A (FpA) и В (FpB), от амино-концов цепей фибриногена Аα и Bβ в центральном участке Е, соответственно, открывая два участка полимеризации: «лиганд А» с последовательностью на амино-конце Gly-Pro-Arg-; и «лиганд В» с последовательностью на амино-конце Gly-His-Arg-. Вновь образованные полимеризационные лиганды одного мономера фибрина взаимодействуют с соответствующими рецепторами другого мономера фибрина посредством взаимодействий лиганд-рецептор «А-а» и «В-b», что приводит к агрегации мономеров фибрина в двунитевые протофибриллы, в которых молекулы фибрина смещены друг относительно друга на 1/2 длины.
Протофибриллы латерально агрегируют с образованием более толстых волокон, которые соединяются, образуя трехмерную сеть фибринового тромба. FpA отщепляется от фибриногена более быстро, чем FpB. Отщепление FpA запускает образование протофибрилл, тогда как отщепление FpB совпадает с их поперечной агрегацией. Высвобождение FpB, которое очень медленное в начале реакции, ускоряется при образовании полимера. Такая задержка отщепления FpB необходима для нормальной агрегации фибрина, а также связана с образованием различных типов тромбов. Фибрин I, в котором отщеплен только FpAs, менее плотный и легче растворяется в плазмине, тогда как фибрин II, в котором отщеплены и FpA, и FpB, более плотный и более устойчив к фибринолизу.
Исследования с ферментами змеиного яда, которые отщепляют только FpA или преимущественно FpB, продемонстрировали, что фибриновые тромбы могут образовываться или за счет «А-а», или за счет «В-b» взаимодействий, указывая на то, что оба взаимодействия могут участвовать в образовании протофибрилл. Эксперименты с вариантным рекомбинантным фибриногеном продемонстрировали, что «В-b» взаимодействия могут играть важную роль в образовании протофибрилл, когда взаимодействия «А-а» ослаблены. Другие исследования продемонстрировали, что при связывании фрагментов фибрина с молекулами фибриногена происходят только взаимодействия «А-а», даже когда доступны как лиганды «В», так и рецепторы «b», и что взаимодействия лиганд-рецептор «В-b» наблюдались, только когда взаимодействия «А-а» отсутствовали. Однако исследования ингибирования пептидов указывают на то, что взаимодействия «В-b» могут происходить одновременно с «А-а».
Фибрин стабилизируется путем образования ковалентных поперечных связей между боковыми цепями различных молекул в волокне фибрина. В реакции переамидирования, которую катализирует фактор XIIIa, между определенными боковыми цепями глутамина и лизина образуются пептидные связи.
Фибриновый тканевый клей (ФТК) представляет собой название продуктов, полученных имитацией последней стадии каскада коагуляции, в результате чего образуется фибриновый тромб. Коммерчески доступные наборы ФТК быстро образуют прочные биодеградируемые гели, которые используют для гемостаза, доставки лекарственных соединений и в качестве хирургических клеев и тканевых уплотнителей. Фибриноген, фактор XIII, тромбин и ионы кальция, как правило, доставляют с помощью шприца, который отделяет фибриноген и фактор XIII от ионов кальция и тромбина при хранении. Смешивание компонентов при впрыскивании из шприца приводит к тромболизу фибриногена с образованием фибрина, который самоагрегирует в гель, который затем сшивается фактором XIII, активированным ионами кальция.
Традиционные ФТК имеют тот недостаток, что их не поставляют в готовой к использованию форме, следовательно компоненты ФТК необходимо смешивать до нанесения на рану. Когда компоненты смешаны, ФТК необходимо использовать в течение короткого периода времени. Необходимость получения смеси непосредственно перед использованием может быть особенно неудобной, например, если средство необходимо в чрезвычайной ситуации.
Во многих ФТК используют бычий тромбин, который загрязнен бычьим антигеном, в частности бычьим фактором V. Антитела, выработанные против этого антигена, могут давать перекрестную реакцию с фактором V человека и приводить к угрожающим жизни кровотечениям и в некоторых случаях анафилаксии и смерти. Для уменьшения этих рисков из объединенной плазмы доноров выделяют человеческий тромбин, но он имеет потенциальную возможность передавать гемоконтактные патогены, особенно вирусы. Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) разработан и утвержден для использования рекомбинантный человеческий тромбин. Его преимуществом является минимальная антигенная активность и отсутствие риска передачи вирусов. Однако его получают с использованием генетически модифицированной линии клеток яичников китайского хомячка, и следовательно его получение является относительно дорогим.
Препараты очищенного бычьего и рекомбинантного человеческого тромбина хранят при комнатной температуре в виде порошка, который необходимо ресуспендировать с помощью солевого раствора перед использованием. Очищенный человеческий тромбин, утвержденный FDA, выпускают в виде раствора, но его можно хранить при комнатной температуре только 24 часа; для длительного хранения необходима заморозка (Lew and Weaver, Biologics: Targets & Therapy 2008: 2(4) 593-599). Дополнительным недостатком использования тромбина является то, что необходимо время для того, чтобы фермент превратил фибриноген в фибрин, так что ускорение коагуляции крови происходит с задержкой.
В традиционных ФТК также используют очень большие количества фибриногена. Другие кровоостанавливающие средства основаны на собственном фибриногене пациента, способствующем свертыванию крови. Матрица кровоостанавливающего средства, именуемого «FLOSEAL», состоит из смеси матрицы из бычьего желатина, человеческого тромбина и хлорида кальция. Тромбин находится в лиофилизированной форме, его необходимо растворить в растворе хлорида кальция, а затем смешать с желатиновой матрицей до использования. Средство необходимо использовать в течение восьми часов после получения. В этом случае необходимость готовить смесь непосредственно перед использованием также может быть особенно нежелательна, например, если средство необходимо в чрезвычайной ситуации.
WO 2008/065388 описывает образование биогеля с использованием агента, который способен полимеризовать фибриноген в отсутствие тромбина. Агент включает несколько фибриноген-связывающих пептидов, конъюгированных с носителем, представляющим собой растворимый человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), с помощью сшивающего агента сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (СМЦК). US 2012/0114682 описывает использование конъюгатов фибриновых лигандных пептидов для получения полимеров фибрина и их использование для лечения ран. Этот документ также описывает получение конъюгата, содержащего фибриноген-связывающий пептид GPRP (SEQ ID NO: 1), присоединенный к полиэтиленгликолю (ПЭГ). Конъюгат «лиганд-ПЭГ» был получен по реакции ПЭГ, активированного имидом малеиновой кислоты, с цистеином на С-конце синтезированного лигандного пептида.
Способы конъюгации часто являются сложными, требующими большого количества стадий, некоторые из которых необходимо осуществлять в различных местах, и которые часто дают в результате достаточно низкий выход желаемого продукта. Дополнительным недостатком конъюгированных продуктов является то, что они могут быть чувствительны к стерилизующему облучению из-за носителя и/или линкера, используемых при их синтезе.
Следовательно, существует необходимость в кровоостанавливающих средствах, которые могут быстро полимеризовать фибриноген, могут быть легко получены без использования иммуногенных реагентов, устойчивы к стерилизующему облучению и могут быть приготовлены в готовой к использованию форме.
Согласно первому аспекту изобретения предложен пептидный дендример, который содержит разветвленное ядро и совокупность фибриноген-связывающих пептидов, отдельно ковалентно присоединенных к разветвленному ядру, причем разветвленное ядро содержит:
от двух до десяти многофункциональных аминокислотных остатков, причем каждый фибриноген-связывающий пептид отдельно ковалентно присоединен к многофункциональному аминокислотному остатку разветвленного ядра;
совокупность многофункциональных аминокислотных остатков, причем один или более фибриноген-связывающих пептидов отдельно ковалентно присоединены к каждому из по меньшей мере двух соседних многофункциональных аминокислотных остатков разветвленного ядра;
совокупность многофункциональных аминокислотных остатков, причем два или более фибриноген-связывающих пептидов отдельно ковалентно присоединены к по меньшей мере одному из многофункциональных аминокислотных остатков разветвленного ядра;
совокупность многофункциональных аминокислотных остатков, причем два или более многофункциональных аминокислотных остатков ковалентно присоединены через боковую цепь соседнего многофункционального аминокислотного остатка; или
один многофункциональный аминокислотный остаток, а фибриноген-связывающий пептид отдельно ковалентно присоединен к каждой функциональной группе многофункционального аминокислотного остатка;
причем многофункциональные аминокислотные остатки включают три- или тетрафункциональные аминокислотные остатки или три- и тетрафункциональные аминокислотные остатки, или один многофункциональный аминокислотный остаток представляет собой три- или тетрафункциональный аминокислотный остаток.
Каждый фибриноген-связывающий пептид имеет различные точки присоединения к разветвленному ядру, поэтому фибриноген-связывающие пептиды упомянуты в данном документе как «отдельно ковалентно присоединенные» к разветвленному ядру.
Разветвленное ядро содержит любую пригодную аминокислотную последовательность. Разветвленное ядро может содержать до десяти многофункциональных аминокислотных остатков, например от двух до десяти или от двух до шести многофункциональных аминокислотных остатков.
Разветвленное ядро может содержать совокупность последовательных многофункциональных аминокислотных остатков. Разветвленное ядро может содержать до десяти последовательных многофункциональных аминокислотных остатков.
Термин «трифункциональная аминокислота» используется в данном документе для обозначения любого органического соединения с первой функциональной группой, которая является аминогруппой (-NH2), второй функциональной группой, которая является карбоксильной (-СООН), и третьей функциональной группой. Термин «тетрафункциональная аминокислота» используется в данном документе для обозначения любого органического соединения с первой функциональной группой, которая является аминогруппой (-NH2), второй функциональной группой, которая является карбоксильной (-СООН), третьей функциональной группой и четвертой функциональной группой. Третья и четвертая функциональная группа может представлять собой любую функциональную группу, которая способна реагировать с карбоксильной концевой группой фибриноген-связывающего пептида или с функциональной группой линкера, присоединенного к карбоксильной концевой группе фибриноген-связывающего пептида.
Многофункциональные аминокислоты могут содержать центральный атом углерода (α- или 2-), несущий аминогруппу, карбоксильную группу и боковую цепь, несущую дополнительную функциональную группу (таким образом давая трифункциональную аминокислоту), или две дополнительные функциональные группы (таким образом давая тетрафункциональную аминокислоту).
Каждый многофункциональный аминокислотный остаток может представлять собой остаток протеиногенной или непротеиногенной многофункциональной аминокислоты или остаток природной или неприродной многофункциональной аминокислоты.
Протеиногенные трифункциональные аминокислоты имеют центральный атом углерода (α- или 2-), несущий аминогруппу, карбоксильную группу, боковую цепь и α-водород в левовращающей конфигурации. Примеры пригодных трифункциональных протеиногенных аминокислот включают L-лизин, L-аргинин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутаминовую кислоту, L-аспарагин, L-глутамин и L-цистеин.
Примеры пригодных трифункциональных непротеиногенных аминокислотных остатка включают остатки D-лизина, бета-лизина, L-орнитина, D-орнитина и D-аргинина.
Таким образом, примеры пригодных трифункциональных аминокислотных остатков для использования в пептидном дендримере в соответствии с данным изобретением включают остатки лизина, орнитина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина, глутамина и цистеина, такие как остатки L-лизина, D-лизина, бета-лизина, L-орнитина, D-орнитина, L-аргинина, D-аргинина, L-аспарагиновой кислоты, D-аспарагиновой кислоты, L-глутаминовой кислоты, D-глутаминовой кислоты, L-аспарагина, D-аспарагина, L-глутамина, D-глутамина, L-цистеина и D-цистеина.
Примеры многофункциональных неприродных аминокислот, пригодных для использования в пептидном дендримере в соответствии с данным изобретением, включают цитруллин, 2,4-диаминоизомасляную кислоту, 2,2'-диаминопимелиновую кислоту, 2,3-диаминопропионовую кислоту и цис-4-амино-L-пролин. Многофункциональные неприродные аминокислоты доступны у Sigma-Aldrich.
В некоторых вариантах реализации изобретения разветвленное ядро может содержать гомополимерную многофункциональную аминокислотную последовательность, например полилизиновую, полиаргининовую или полиорнитиновую последовательность, например разветвленное ядро, содержащее от двух до десяти или от двух до шести последовательных остатков лизина, аргинина или орнитина. В других вариантах реализации изобретения разветвленное ядро может содержать различные многофункциональные аминокислотные остатки, например один или более остатков лизина, один или более остатков аргинина и/или один или более остатков орнитина.
В других вариантах реализации изобретения разветвленное ядро может содержать совокупность многофункциональных аминокислотных остатков и один или более других аминокислотных остатков.
Когда разветвленное ядро содержит совокупность многофункциональных аминокислотных остатков, соседние многофункциональные аминокислотные остатки могут быть связаны вместе связями между боковыми цепями аминокислот, пептидными связями, или некоторые соседние многофункциональные аминокислотные остатки могут быть связаны вместе связями между боковыми цепями, а другие - пептидными связями.
В дополнительных вариантах реализации изобретения разветвленное ядро может содержать два или более многофункциональных аминокислотных остатков, и по меньшей мере один фибриноген-связывающий пептид отдельно присоединен к каждому из двух или более многофункциональных аминокислотных остатков, а два или более фибриноген-связывающих пептидов отдельно присоединены к по меньшей мере одному из многофункциональных аминокислотных остатков разветвленного ядра.
В соответствии с другими вариантами реализации изобретения два фибриноген-связывающих пептида отдельно присоединены к концевому многофункциональному аминокислотному остатку разветвленного ядра.
Примеры структур пептидных дендримеров в соответствии с данным изобретением включают пептидные дендримеры, в которых:
- разветвленное ядро содержит первый трифункциональный аминокислотный остаток, к которому присоединены два фибриноген-связывающих пептида, и второй трифункциональный аминокислотный остаток, к которому присоединен один фибриноген-связывающий пептид;
- разветвленное ядро содержит первый трифункциональный аминокислотный остаток, к которому присоединены два фибриноген-связывающих пептида, и второй трифункциональный аминокислотный остаток, к которому присоединены два фибриноген-связывающих пептида;
- разветвленное ядро содержит первый трифункциональный аминокислотный остаток, к которому присоединены два фибриноген-связывающих пептида, второй трифункциональный аминокислотный остаток, к которому присоединен один фибриноген-связывающий пептид, и третий трифункциональный аминокислотный остаток, к которому присоединен один фибриноген-связывающих пептид; или
- разветвленное ядро содержит первый трифункциональный аминокислотный остаток, к которому присоединены два фибриноген-связывающих пептида, второй трифункциональный аминокислотный остаток, к которому присоединен один фибриноген-связывающий пептид, третий трифункциональный аминокислотный остаток, к которому присоединен один фибриноген-связывающий пептид, и четвертый трифункциональный аминокислотный остаток, к которому присоединен один фибриноген-связывающий пептид.
Пептидный дендример в соответствии с данным изобретением может иметь общую формулу (I):
где:
FBP представляет собой фибриноген-связывающий пептид;
-(линкер)- представляет собой необязательный линкер, предпочтительно непептидный линкер;
X представляет собой трифункциональный аминокислотный остаток, предпочтительно лизин, орнитин или аргинин;
Y представляет собой -FBP или -NH2;
Z представляет собой -(линкер)-FBP в случае, если Y представляет собой -FBP, или -[-Xn-(линкер)-FBP]а-(линкер)-FBP в случае, если Y представляет собой -NH2;
где:
Xn представляет собой трифункциональный аминокислотный остаток, предпочтительно лизин, L-орнитин или аргинин; и
а равен 1-10, предпочтительно 1-3.
Например, в случае, если Y представляет собой NH2, Z представляет собой -[-Xn-(линкер)-FBP]а-(линкер)-FBP, структура дендримера представляет собой:
где а равен 1:
или, где а равен 2:
или, где а равен 3:
В альтернативном варианте Z представляет собой -[-Xn-(линкер)-FBP]а-(линкер)-FBP в случае, если Y представляет собой -FBP;
где:
Xn представляет собой трифункциональный аминокислотный остаток, предпочтительно лизин, L-орнитин или аргинин; и
а равен 1-10, предпочтительно 1-3.
Например, в случае, если Y представляет собой -FBP, Z представляет собой -[-Xn-(линкер)-FBP]а-(линкер)-FBP, и а равен 1, структура дендримера представляет собой:
Пептидный дендример в соответствии с данным изобретением может иметь общую формулу (II):
где:
FBP представляет собой фибриноген-связывающий пептид;
-(линкер)- представляет собой необязательный линкер, предпочтительно содержащий -NH(CH2)5CO-;
Y представляет собой -FBP или -NH2;
Z представляет собой:
-R-(линкер)-FBP в случае, если Y представляет собой -FBP, или
в случае, если Y представляет собой -NH2; или
в случае, если Y представляет собой -NH2; или
в случае, если Y представляет собой -NH2;
где R представляет собой -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH- или -(CH2)3NHCNHNH-.
Следовательно, в одном варианте реализации изобретения Z может представлять
собой:
в случае, если Y представляет собой -NH2;
где R представляет собой -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH- или -(CH2)3NHCNHNH-;
где а равен 1-3.
В альтернативном варианте а может быть равным 4-10, или он может быть равным 1-10.
В другом варианте реализации изобретения Z представляет собой:
в случае, если Y представляет собой -FBP;
где R представляет собой -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH- или -(CH2)3NHCNHNH-;
где а равен 1-10, предпочтительно 1-3.
Например, Z представляет собой:
в случае, если Y представляет собой -FBP, и а равен 1.
Пептидный дендример в соответствии с данным изобретением может иметь общую формулу (III):
где:
FBP представляет собой фибриноген-связывающий пептид;
-(линкер)- представляет собой необязательный линкер, предпочтительно содержащий -NH(CH2)5CO-;
Y представляет собой -FBP или -NH2;
Z представляет собой:
-(CH2)4NH-(линкep)-FBP в случае, если Y представляет собой -FBP; или
в случае, если Y представляет собой -NH2; или
в случае, если Y представляет собой -NH2; или
в случае, если Y представляет собой -NH2.
Следовательно, в одном варианте реализации изобретения Z может представлять собой:
в случае, если Y представляет собой -NH2;
где а равен 1-3.
В альтернативном варианте а равен 4-10, или он может быть равным 1-10.
В другом варианте реализации изобретения Z представляет собой:
в случае, если Y представляет собой -FBP;
где а равен 1-10, предпочтительно 1-3.
Например, Z представляет собой:
в случае, если Y представляет собой -FBP, и а равен 1.
В одном варианте реализации изобретения пептидный дендример не имеет структуру:
Можно использовать любой пригодный фибриноген-связывающий пептид (FBP). Например, пептид может быть способен связываться с участком фибриногена, который в естественных условиях связан с фибрином или с гликопротеинами GPIIb-IIIa мембран тромбоцитов. Связывание фибрина с фибриногеном описано в Mosesson et al. 2001, Ann. N.Y. Acad. Sci., 936, 11-30. Связывание GPIIb-IIIa с фибриногеном описано в Bennett, 2001, Annals of NY Acad. Sci., 936, 340-354.
Термин «пептид», при использовании в данном документе, также включает аналоги пептидов. Специалистам в данной области известно несколько аналогов пептидов. Можно использовать любой пригодный аналог при условии, что фибриноген способен связывать фибриноген-связывающий пептид.
Примеры пригодных фибриноген-связывающих пептидов и то, как их можно идентифицировать, представлены в WO 2005/035002, WO 2007/015107 и WO 2008/065388.
Предпочтительно каждый из фибриноген-связывающих пептидов составляет 30-60, предпочтительно 3-30, более предпочтительно - 3-10, аминокислотных остатков в длину.
Каждый фибриноген-связывающий пептид предпочтительно связывает фибриноген с константой диссоциации (KD), которая составляет между 10-9 и 10-6 М, например около 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или более нМ. Предпочтительным является KD около 100 нМ. Константа диссоциации может быть измерена в условиях равновесия. Например, меченый радиоизотопом фибриноген с известной концентрацией может быть инкубирован с микросферами, к которым пришит фибриноген-связывающий фрагмент. Как правило, 5 мкМ пептида сшивают с 1 г микросфер, или 15-40 мкмоль пептида сшивают с 1 г микросфер. Микросферы, связанные с пептидами, разбавляют до 0,5 мг/мл и инкубируют в изотоническом буферном растворе при pH 7,4 (например, в 0,01 М буферном растворе Hepes, содержащем 0,15 М NaCl) с меченым радиоизотопом фибриногеном при концентрациях между 0,05 и 0,5 мг/мл в течение 1 ч при 20°С. Фибриноген, связанный с фибриноген-связывающим фрагментом на микросферах, можно отделить от свободного фибриногена с помощью центрифугирования, и измерить количество свободного и связанного фибриногена. Константу диссоциации можно затем определить с помощью анализа Скэтчарда, строя зависимость концентрации связанного фибриногена от отношения концентраций связанный: свободный фибриноген, где наклон кривой представляет KD.
В соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения фибриноген-связывающие пептиды пептидных дендримеров в соответствии с данным изобретением предпочтительно связываются с рецептором «а» фибриногена по сравнению с рецептором «b» фибриногена. Примеры последовательностей пригодных фибриноген-связывающих пептидов, которые предпочтительно связываются с рецептором «а», а не рецептором «b» фибриногена, включают: GPR-; GPRP- (SEQ ID NO: 1); GPRV- (SEQ ID NO: 2); GPRPFPA- (SEQ ID NO: 3); GPRVVAA- (SEQ ID NO: 4); GPRPVVER- (SEQ ID NO: 5); GPRPAA- (SEQ ID NO: 6); GPRPPEC-(SEQ ID NO: 7); GPRPPER- (SEQ ID NO: 8); GPSPAA- (SEQ ID NO: 9).
В соответствии с другими вариантами реализации изобретения фибриноген-связывающие пептиды пептидных дендримеров в соответствии с данным изобретением предпочтительно связываются с рецептором «b» фибриногена по сравнению с рецептором «а» фибриногена. Примеры последовательностей фибриноген-связывающих пептидов, которые предпочтительно связываются с рецептором «b», а не рецептором «а» фибриногена, включают: GHR-, GHRP- (SEQ ID NO: 10), GHRPY- (SEQ ID NO: 11), GHRPL- (SEQ ID NO: 12), GHRPYамид- (SEQ ID NO: 13).
Каждый фибриноген-связывающий пептид пептидного дендримера в соответствии с данным изобретением может независимо присоединяться по своему карбоксильному концу (необязательно через линкер) или по своему амино-концу (необязательно через линкер) к разветвленному ядру дендримера. Если фибриноген-связывающий пептид присоединен по своему амино-концу, карбоксильный конец пептида может содержать амидную группу. Присутствие амидной группы, а не карбоксильной группы (или отрицательно заряженного карбоксилат-иона) на свободном карбоксильном конце пептида может помочь оптимизировать связывание фибриноген-связывающего пептида с фибриногеном.
В некоторых вариантах реализации изобретения каждый фибриноген-связывающий пептид присоединен (необязательно через линкер) по своему карбоксильному концу к разветвленному ядру дендримера. В других вариантах реализации изобретения по меньшей мере один фибриноген-связывающий пептид присоединен (необязательно через линкер) по своему амино-концу к разветвленному ядру дендримера. Например, по меньше мере один фибриноген-связывающий пептид, который предпочтительно связывается с рецептором «а», а не рецептором «b» фибриногена, такой как пептид, состоящий из последовательности APFPRPG (SEQ ID NO: 14), может быть присоединен (необязательно через линкер) по своему амино-концу к разветвленному ядру дендримера.
Пептидный дендример в соответствии сданным изобретением предпочтительно содержит фибриноген-связывающие пептиды с различными последовательностями (именуемый в данном документе как «химерный» пептидный дендример). Например, в некоторых вариантах реализации изобретения пептидный дендример в соответствии с данным изобретением содержит фибриноген-связывающие пептиды, которые имеют различную селективность к связыванию с рецептором «а» и с рецептором «b» фибриногена.
Согласно второму аспекту изобретения предложен агент, который содержит совокупность носителей, при этом каждый носитель содержит совокупность фибриноген-связывающих пептидов, присоединенных к носителю, а фибриноген-связывающие пептиды, присоединенные к носителям, включают фибриноген-связывающие пептиды с различными последовательностями.
В некоторых вариантах реализации второго аспекта изобретения совокупность носителей включают первую совокупность носителей и вторую совокупность носителей, причем фибриноген-связывающие пептиды, присоединенные к первой совокупности носителей, имеют последовательность, отличную от последовательности фибриноген-связывающих пептидов, присоединенных ко второй совокупности носителей.
В других вариантах реализации второго аспекта изобретения каждый носитель содержит присоединенные к нему фибриноген-связывающие пептиды с различными последовательностями.
Носитель может представлять собой растворимый или нерастворимый носитель, но предпочтительно не является тромбоцитом. Носитель может быть пригодным для местного нанесения на участок ткани субъекта, например на участок кровоточащей раны или участок слизистой. Водорастворимые носители могут быть пригодными для внутривенного, а не местного введения. Носитель может включать растворимый или нерастворимый белок, терапевтическое средство, полимер (например, биосовместимый полимер, такой как полиэтиленгликоль) или любую их комбинацию. Примеры белковых носителей представляют собой фермент или белок, который не является ферментом, такой как человеческий сывороточный альбумин.
Нерастворимый носитель может представлять собой микрочастицу (в том числе твердую, полую или пористую микрочастицу, предпочтительно практически сферическую микрочастицу). Микрочастицы могут быть получены из любого пригодного вещества, например поперечно сшитого белка. Пригодный белок представляет собой альбумин (полученный из сыворотки или рекомбинантный, с человеческой или другой последовательностью) или желатин. Микрочастицы, пригодные для использования в качестве нерастворимых носителей в настоящем изобретении, могут быть получены с помощью сушки распылением человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) с использованием хорошо известного способа сушки распылением, например, как в WO 92/18164. Альтернативные варианты использованию микрочастиц в качестве носителей включают липосомы, синтетические полимерные частицы (такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и поли(молочная/гликолевая)кислота) или фрагменты клеточных мембран.
По меньшей мере большая часть носителей имеет максимальный размер, который меньше 6 мкм. Это может быть предпочтительным, если агенты изобретения предназначены для внутривенного введения.
В альтернативном варианте по меньшей мере большая часть носителей могут иметь максимальный размер, который больше 6 мкм. Это может быть предпочтительным, если агенты изобретения предназначены для местного применения.
Теоретически не существует верхнего предела для количества фибриноген-связывающих пептидов на молекулу носителя. Оптимальное количество, вероятно, зависит от многих факторов, таких как природа носителя и количество реакционно-способных групп на каждом носителе, пригодных для присоединения фибриноген-связывающих пептидов. Однако предпочтительно, чтобы было в среднем до 100 фибриноген-связывающих пептидов на молекулу носителя. Предпочтительным является наличие в среднем по меньшей мере трех, предпочтительно по меньшей мере четырех или пяти фибриноген-связывающих пептидов на молекулу носителя. Предпочтительный интервал представляет собой 10-20 фибриноген-связывающих пептидов на молекулу носителя.
Носитель может включать группы, которые обеспечивают присоединение фибриноген-связывающих пептидов к носителю. Например, носитель может содержать на поверхности тиоловые фрагменты или аминные фрагменты. Если носитель является белковоподобным, тиоловые или аминные фрагменты могут присутствовать на боковых цепях аминокислот, например цистеина или лизина. К носителю могут быть присоединены непептидные группы. Это особенно предпочтительно, если носитель получен из белка, такого как ЧСА. Например, тиоловые группы можно присоединить к носителю с использованием таких реагентов, как 2-иминотиолан (2-ИТ), который способен реагировать с первичными аминогруппами на носителе.
Фибриноген-связывающие пептиды с различными последовательностями могут включать первый фибриноген-связывающий пептид, который предпочтительно связывается с рецептором «а» по сравнению с рецептором «b» фибриногена, и второй фибриноген-связывающий пептид, который связывается с рецептором «а» по сравнению с рецептором «b» фибриногена с большей селективностью, чем первый фибриноген-связывающий пептид. Установлено, что такие пептидные дендримеры быстро полимеризуют фибриноген в достаточно широком диапазоне концентраций пептидного дендримера.
Например, первый фибриноген-связывающий пептид может содержать аминокислотную последовательность GPRP- (SEQ ID NO: 1) на своем амино-конце, и/или второй фибриноген-связывающий пептид может содержать аминокислотную последовательность -APFPRPG (SEQ ID NO: 14) на своем карбоксильном конце, причем аминокислотные остатки последовательностей указаны в направлении от амино- к карбоксильному концу, а «-» обозначает конец последовательности, который присоединен к разветвленному ядру пептидного дендримера или к носителю. Фибриноген-связывающий пептид с последовательностью -APFPRPG (SEQ ID NO: 14)на его карбоксильном конце связываются с рецептором «а» по сравнению рецептором «b» фибриногена с большей селективностью, чем фибриноген-связывающий пептид с последовательностью GPRP- (SEQ ID NO: 1) на своем амино-конце.
В других вариантах реализации изобретения фибриноген-связывающие пептиды с различными последовательностями могут включать первый фибриноген-связывающий пептид, который предпочтительно связывается с рецептором «а» по сравнению с рецептором «b» фибриногена, и второй фибриноген-связывающий пептид, который предпочтительно связывается с рецептором «b» по сравнению с рецептором «а» фибриногена. Установлено, что такие пептидные дендримеры полимеризуются с фибриногеном с образованием относительно плотных гидрогелей по сравнению с эквивалентными пептидными дендримерами, содержащими только фибриноген-связывающие пептиды, которые предпочтительно связываются с рецептором «а», а не рецептором «b» фибриногена. Полагают, что увеличение плотности полученного гидрогеля происходит вследствие связывания фибриноген-связывающих пептидов дендримеров с рецептором «а» и рецептором «b» фибриногена, что упрочняет сеть полимеризуемого фибриногена.
Например, первый фибриноген-связывающий пептид может содержать аминокислотную последовательность GPRP- (SEQ ID NO: 1) на своем амино-конце, и/или второй фибриноген-связывающий пептид может содержать аминокислотную последовательность GHRP- (SEQ ID NO: 10) или аминокислотную последовательность GHRPY- (SEQ ID NO: 11) на своем амино-конце. Фибриноген-связывающие пептиды с последовательностью GPRP- (SEQ ID NO: 1) на амино-конце с некоторой селективностью связываются с рецептором «а» фибриногена. Фибриноген-связывающие пептиды с последовательностью GHRP- (SEQ ID NO: 10) или GHRPY- (SEQ ID NO: 11) на амино-конце предпочтительно связываются с рецептором «b» фибриногена.
Один, или несколько, или каждый фибриноген-связывающий пептид может быть ковалентно присоединен к разветвленному ядру пептидного дендримера в соответствии с данным изобретением с помощью непептидного линкера. Линкер может представлять собой любой пригодный линкер, который не препятствует связыванию фибриногена с фибриноген-связывающими пептидами пептидного дендримера. Линкер может представлять собой гибкий неразветвленный линкер, например неразветвленную алкильную группу. Такие линкеры дают возможность фибриноген-связывающим пептидам пептидного дендримера находиться на расстоянии друг от друга. Например, линкер может содержать группу -NH(CH2)nCO-, где n равен любому число, предпочтительно 1-10, например 5. Линкер, содержащий группу -NH(CH2)5CO- можно получить с использованием ε-аминокислоты 6-аминогексановой кислоты (εАГК).
Теоретически не существует верхнего предела для количества фибриноген-связывающих пептидов, которые могут присутствовать в пептидном дендримере в соответствии с данным изобретением. Однако на практике для любой конкретной структуры можно изменять количество фибриноген-связывающих пептидов и определять оптимальное количество для получения желаемых характеристик полимеризации фибриногена, например скорости полимеризации фибриногена или плотности гидрогеля, образующегося при полимеризации фибриногена. Пептидные дендримеры могут в общем содержать до двадцати фибриноген-связывающих пептидов на дендример, например до десяти фибриноген-связывающих пептидов на дендример или до пяти фибриноген-связывающих пептидов на дендример.
Заявители неожиданно установили, что смеси пептидного дендримера в соответствии с данным изобретением с пептидным конъюгатом, содержащим два или более фибриноген-связывающих пептидов, способны полимеризовать фибриноген более быстро, чем или пептидный дендример, или пептидный конъюгат по отдельности.
Согласно изобретению предложена композиция, содержащая пептидный дендример в соответствии с данным изобретением, и пептидный конъюгат, содержащий два или более фибриноген-связывающих пептидов.
Пептидный конъюгат может содержать фибриноген-связывающие пептиды с одинаковой или различными последовательностями. Например, пептидный конъюгат может содержать только фибриноген-связывающие пептиды, которые предпочтительно связываются с рецептором «а» по сравнению с рецептором «b» фибриногена, или только фибриноген-связывающие пептиды, которые предпочтительно связывается с рецептором «b» по сравнению с рецептором «а» фибриногена, или один или более фибриноген-связывающих пептидов, которые предпочтительно связываются с рецептором «а» по сравнению с рецептором «b» фибриногена, и один или более фибриноген-связывающих пептидов, которые предпочтительно связывается с рецептором «b» по сравнению с рецептором «а» фибриногена.
Пептидный конъюгат может содержать носитель к которому присоединены фибриноген-связывающие пептиды. Пригодный носитель может содержать один или более аминокислотных остатков, например единственный аминокислотный остаток, такой как аминокислотный остаток лизина. Преимуществом конъюгатов, содержащих носители, которые содержат один или более аминокислотных остатков, является то, что они могут быть легко получены с использованием способов твердофазного пептидного синтеза.
Каждый фибриноген-связывающий пептид пептидного конъюгата может независимо присоединяться по своему карбоксильному концу (необязательно через линкер) или по своему амино-концу (необязательно через линкер) к носителю. Если фибриноген-связывающий пептид присоединен по своему амино-концу, карбоксильный конец пептида может содержать амидную группу.
В некоторых вариантах реализации изобретения пептидный конъюгат может представлять собой пептидный дендример в соответствии с данным изобретением.
Фибриноген-связывающие пептиды пептидного дендримера композиции изобретения могут предпочтительно связываться с рецептором «а» фибриногена по сравнению с рецептором «b» фибриногена, а фибриноген-связывающие пептиды пептидного конъюгата могут предпочтительно связываться с рецептором «b» фибриногена по сравнению с рецептором «а» фибриногена.
Установлено, что такие композиции обладают взаимоусиливающим действием, которое проявляется в том, что они способны полимеризовать фибриноген быстрее, чем или пептидный дендример, или пептидный конъюгат по отдельности. Механизм этого взаимоусиливающего действия полностью не ясен, но, не ограничиваясь теорией, полагают, что оно может наблюдаться из-за того, что в композиции имеется большее количество полимеризационных участков «А» и «В» фибриногена.
В альтернативном варианте фибриноген-связывающие пептиды пептидного дендримера композиции изобретения могут предпочтительно связываться с рецептором «b» фибриногена по сравнению с рецептором «а» фибриногена, а фибриноген-связывающие пептиды пептидного конъюгата предпочтительно связываются с рецептором «а» фибриногена по сравнению с рецептором «b» фибриногена.
Согласно изобретению также предложена фармацевтическая композиция, которая содержит пептидный дендример в соответствии с данным изобретением, агент в соответствии с данным изобретением или композицию в соответствии с данным изобретением и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель.
Пригодные фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества и разбавители хорошо известны специалистам в данной области техники. Фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества и разбавители включают вещества, пригодные для местного применения пептидного дендримера, агента или композиции в соответствии с данным изобретением на участок раны. Примеры пригодных фармацевтически приемлемых носителей включают носители, предпочтительно в жидкотекучей форме, такие как желатин, фибрин, хитозан, фибронектин, коллаген, крахмал, гиалуроновая кислота. Пригодные фармацевтически приемлемые разбавители или вспомогательные вещества включают буферные системы, такие как Трис-HCl, ацетатный или фосфатный буферные растворы, добавки, такие как поверхностно-активные вещества или солюбилизирующие агенты (например, твин 80, полисорбат 80), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), консерванты (например, метакрезол, парабены (метил-, пропил- или бутил-), хлорбутанол, соли фенилртути (например, ацетат, борат, нитрат), сорбиновая кислота, бензиловый спирт) и вещества для увеличения объема (например, лактоза, маннит), агенты, регулирующие тоничность (например, сахара, хлорид натрия), полимерные соединения, такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота.
Особым преимуществом пептидных дендримеров, агентов и композиций в соответствии с данным изобретением является то, что их легко стерилизовать, например подвергая облучению, предпочтительно гамма-облучению, без значительной потери способности пептидного дендримера или композиции полимеризовать фибриноген.
Согласно изобретению предложен способ стерилизации пептидного дендримера в соответствии с данным изобретением, агента в соответствии с данным изобретением или композиции в соответствии с данным изобретением, который включает воздействие на пептидный дендример, агент или композицию гамма-излучения предпочтительно в дозе до 30 кГр. Пептидный дендример, агент или композиция могут быть в сухой, влажной или растворенной форме.
Согласно изобретению также предложены пептидный дендример в соответствии с данным изобретением, агент в соответствии с данным изобретением или композиция в соответствии с данным изобретением, которые являются стерильными.
Пептидные дендримеры, агенты или композиции в соответствии сданным изобретением предпочтительно могут быть в виде стерильного готового к использованию состава, в частности стерильного готового к использованию кровоостанавливающего или ранозаживляющего состава.
В некоторых вариантах реализации изобретения, пептидный дендример в соответствии с данным изобретением может находиться в составе гидратированной текучей желатиновой пасты, упакованной в шприц, который можно облучать, чтобы получить стерильный готовый к использованию текучий препарат.
Согласно изобретению также предложен способ полимеризации фибриногена, который включает приведение в контакт фибриногена с пептидным дендримером в соответствии с данным изобретением, с агентом в соответствии с данным изобретением или с композицией в соответствии с данным изобретением.
Относительные концентрации дендримера и фибриногена, используемых для полимеризации, будут зависеть от природы дендримера, например от того, сколько присутствует фибриноген-связывающих пептидов, и последовательности фибриноген-связывающих пептидов. Заявители фиксировали небольшую длительность полимеризации при использовании пептидных дендримеров в соответствии с данным изобретением в концентрациях от 0,005 мг/мл до 2 мг/мл и при физиологическом уровне фибриногена (3 мг/мл).
Для некоторых пептидных дендримеров в соответствии с данным изобретением с увеличением концентрации дендримера скорость полимеризации фибриногена (т.е. «время свертывания») уменьшается. Не ограничиваясь теорией, полагают, что это происходит вследствие насыщения рецепторов «а» и/или «b» молекул фибриногена фибриноген-связывающими пептидами дендримера. При более высоких концентрациях дендримера наблюдается избыток фибриноген-связывающих пептидов, конкурирующих за свободные связывающие рецепторы фибриногена (т.е. незанятые рецепторы «а» и/или «b»), и полагают, что такое конкурирование уменьшает скорость, с которой происходит полимеризация.
Согласно изобретению также предложен набор для получения гидрогеля, который содержит пептидный дендример в соответствии с данным изобретением, агент в соответствии с данным изобретением или композицию в соответствии с данным изобретением и отдельно фибриноген.
Согласно изобретению дополнительно предложен гидрогель, содержащий сополимер пептидного дендримера в соответствии с данным изобретением, агента в соответствии с данным изобретением или композиции в соответствии с данным изобретением и фибриногена.
Пептидные дендримеры, агенты или композиции в соответствии с данным изобретением можно использовать в качестве кровоостанавливающих средств, например для остановки кровотечения, или для лечения раны.
Согласно изобретению также предложен способ остановки кровотечения или лечения раны, который включает нанесение пептидного дендримера в соответствии с данным изобретением, агента в соответствии с данным изобретением или композиции в соответствии с данным изобретением на участок кровотечения или на рану.
Пептидный дендример, агент или композиция могут полимеризовать эндогенный фибриноген (т.е. фибриноген хозяина), присутствующий в месте кровотечения или раны. В некоторых вариантах реализации изобретения экзогенный фибриноген, а также пептидный дендример, агент или композиция в соответствии с данным изобретением могут быть нанесены на место кровотечения или на рану.
Термин «фибриноген», при использовании в данном документе, включает природный фибриноген, рекомбинантный фибриноген или производное фибриногена, которое может быть превращено в фибрин с помощью тромбина (например, природный или рекомбинантный мономер фибрина или производное мономера фибрина, которое способно или неспособно к спонтанной агрегации). Фибриноген должен связывать по меньшей мере два фибриноген-связывающих пептида. Фибриноген может быть получен из любого источника и от любого вида (включая бычий фибриноген), но предпочтительным является человеческий фибриноген. Человеческий фибриноген может быть получен из аутологической или донорской крови. Аутологический фибриноген или рекомбинантный фибриноген являются предпочтительными, так как в этом случае уменьшается риск инфицирования при введении субъекту.
Количество пептидного дендримера, пригодное для введения человеку, будет зависеть, например, от типа дендримера, например от того, сколько присутствует фибриноген-связывающих пептидов на молекулу дендримера, и от типа и размера участка раны или кровотечения. Однако типичное количество дендримера составляет от 0,1 мл до 50 мл, например от 0,1 мл до 5 мл или от 1 до 50 мл, препарата (например, водного препарата), содержащего дендример в концентрации от 0,005 до 25 мг/мл.
Количество экзогенного фибриногена, пригодное для введения человеку, составляет от 0,1 мг до 200 мг, например от 3 мг до 200 мг.
Пептидные дендримеры, агенты или композиции в соответствии с данным изобретением могут быть в составе жидкости для нанесения непосредственно на рану или нанесены на губку или ткань (например, импрегнированную или покрытую) необязательно с фибриногеном до применения. В альтернативном варианте пептидные дендримеры, агенты или композиции в соответствии с данным изобретением можно смешивать с текучей пастой, чтобы вводить с помощью шприца.
Согласно изобретению также предложены пептидный дендример в соответствии с данным изобретением, агент в соответствии с данным изобретением или композиция в соответствии с данным изобретением для применения в качестве лекарственного препарата.
Согласно изобретению дополнительно предложен пептидный дендример в соответствии с данным изобретением, агент в соответствии с данным изобретением или композиция в соответствии с данным изобретением для применения при остановке кровотечения или для применения при лечении ран.
Согласно изобретению также предложено использование пептидного дендримера в соответствии с данным изобретением, агента в соответствии с данным изобретением или композиции в соответствии с данным изобретением для производства лекарственного препарата, применяемого для остановки кровотечения или для лечения раны.
Пептидные дендримеры, агенты или композиции в соответствии с данным изобретением имеют несколько важных преимуществ. В частности, в некоторых вариантах реализации изобретения пептидные дендримеры, агенты и композиции можно легко получать, используя традиционные методики твердофазного пептидного синтеза. При оптимальных концентрациях пептидные дендримеры, агенты и композиции в соответствии с данным изобретением могут полимеризовать фибриноген в отсутствие тромбина менее чем за секунду. Пептидные дендримеры и агенты в соответствии с данным изобретением также могут полимеризовать фибриноген в плазме человека менее чем за секунду.
Структуру пептидного дендримера или агента в соответствии с данным изобретением можно выбрать так, чтобы оптимизировать его свойства в соответствии с предполагаемым использованием дендримера. Например, пептидный дендример, содержащий пять фибриноген-связывающих пептидов с одинаковыми последовательностями, которые предпочтительно связывают рецептор «а» фибриногена, способен полимеризовать фибриноген практически мгновенно. В отличии от этого «химерный» пептидный дендример с одним или несколькими фибриноген-связывающими пептидами, которые предпочтительно связываются с рецептором «а» фибриногена, и одним или несколькими фибриноген-связывающими пептидами, которые предпочтительно связываются с рецептором «b» фибриногена, может полимеризовать фибриноген более медленно, но образует гидрогели с большей плотностью и размером.
Пептидные дендримеры, агенты или композиции в соответствии с данным изобретением можно стерилизовать без потери способности полимеризовать фибриноген. Это является важным преимуществом, так как для пептидных дендримеров, агентов и композиций возможно получение стерильных готовых к использованию составов, например стерильных готовых к использованию кровоостанавливающих или ранозаживляющих составов.
Варианты реализации изобретения будут теперь описаны только как пример со ссылкой на прилагаемые графические материалы, в которых:
Фиг. 1 иллюстрирует способность пептидного дендримера согласно предпочтительным вариантам реализации изобретения полимеризовать фибриноген при различных концентрациях;
Фиг. 2 иллюстрирует способность нескольких различных пептидных дендримеров полимеризовать фибриноген при различных концентрациях; Нумерация относится к обозначению пептидного дендримера;
Фиг. 3 иллюстрирует способность нескольких различных пептидных дендримеров полимеризовать фибриноген при различных концентрациях; Нумерация относится к обозначению пептидного дендримера;
Фиг. 4 иллюстрирует способность нескольких различных пептидных дендримеров полимеризовать фибриноген при различных концентрациях. Нумерация относится к обозначению пептидного дендримера;
Фиг. 5 иллюстрирует фотографию гидрогелей, полученных полимеризацией фибриногена с использованием различных пептидных дендримеров в соответствии с данным изобретением;
Фиг. 6 иллюстрирует способность различных комбинаций пептидных дендримеров в соответствии с данным изобретением с пептидными конъюгатами полимеризовать фибриноген при различных концентрациях; и
Фиг. 7 иллюстрирует способность нескольких различных пептидных дендримеров в соответствии с данным изобретением полимеризовать фибриноген в плазме человека.
Пример 1
Синтез пептидных дендримеров и пептидных конъюгатов
Пептиды были получены на амидной МВНА-смоле Ринка с низкой нагрузкой (Novabiochem, 0,36 ммоль/г) с помощью стандартного синтеза пептидов по Fmoc-методу с использованием Fmoc-защищенных аминокислот (Novabiochem).
Обычно для всех синтезов использовали циклы одного сочетания, а активацию выполняли с помощью HBTU (в качестве сшивающих агентов использовали HBTU и РуВОР (производства AGTC Bioproducts)). Однако в некоторых положениях взаимодействие было менее эффективным, чем ожидалось, и требовалось двойное сочетание.
Пептиды синтезировали с использованием автоматического пептидного синтезатора и HBTU до точек разветвления и с использованием ручного пептидного синтеза с РуВОР для пептидных ответвлений.
Для автоматического синтеза использовали трехкратный избыток аминокислоты и HBTU для каждого сочетания и девятикратный избыток диизопропилэтиламина (ДИПЭА, Sigma) в диметилформамиде (ДМФА, Sigma).
Для ручного синтеза использовали трехкратный избыток аминокислоты и РуВОР для каждого сочетания и девятикратный избыток ДИПЭА в N-метилпирролидиноне (NMP, Sigma).
Снятие защиты (отщепление групп Fmoc) с цепи растущего пептида с использованием 20% пиперидина (Sigma) в ДМФА также не всегда может быть эффективным, и требуется двойное снятие защиты.
Ответвления получали с использованием Fmoc-Lys(Fmoc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH или Fmoc-Lys(Mtt)-OH.
Заключительное снятие защиты и отщепление пептида от твердофазного носителя выполняли обработкой смолы 95% ТФУ (Sigma), содержащей триизопропилсилан (TIS, Sigma), воду и анизол (Sigma) (1:1:1, 5%) в течение 2-3 часов.
Отщепленный пептид осаждали в холодном диэтиловом эфире (Sigma), центрифугировали и лиофилизировали. Осадок после центрифугирования снова растворяли в воде (10-15 мл), фильтровали и очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием колонки С-18 (Phenomenex при скорости потока 20 мл/мин) и смесей ацетонитрил/вода с градиентом концентраций в присутствии 0,1% ТФУ. Очищенный продукт лиофилизировали и анализировали с помощью ЖХ-МС с ЭРИ и аналитической ВЭЖХ; в результате установлено, что он был чистым (>95%). Все полученные массы согласовывались с рассчитанными значениями.
Пептидные дендримеры и пептидные конъюгаты
Структуры пептидных дендримеров и пептидных конъюгатов, синтезированных с использованием способов, описанных выше, представлены ниже.
Группа «NH2-» в конце последовательности пептида обозначает аминогруппу на амино-конце последовательности. Группа «-am» в конце последовательности пептида обозначает амидную группу на карбоксильном конце последовательности.
Пептидный конъюгат №1:
Пептидный конъюгат №2:
Пептидный дендример №3:
Пептидный дендример №4:
Пептидный дендример №5:
Пептидный дендример №8:
Пептидный дендример №9:
Пептидный дендример №10:
Пептидный дендример №11:
Пептидный дендример №12:
Пептидный дендример №13:
Пример 2
Сополимеризация пептидного дендримера с фибриногеном
Дендример №12 содержит разветвленное ядро с пятью последовательными остатками лизина. Остатки лизина ковалентно связаны через боковую цепь соседнего остатка лизина.
Оценивали способность пептидного дендримера №12 полимеризовать фибриноген. 30 мкл раствора дендримера с концентрацией в интервале от 0,005 до 2 мг/мл добавляли к 100 мкл очищенного человеческого фибриногена с концентрацией 3 мг/мл (уровень фибриногена, обнаруженный в крови). Полимеризацию фибриногена исследовали с использованием анализатора коагуляции Sigma Amelung KC4 Delta. Фиг. 1 иллюстрирует график зависимости времени полимеризации (свертывания) (в секундах) от увеличения концентрации дендримера.
Результаты демонстрируют, что дендример способен сополимеризоваться с фибриногеном практически мгновенно, даже при очень низких концентрациях дендримера. Полагают, что увеличение времени свертывания при концентрациях дендримера выше 0,5 мг/мл можно объяснить избытком фибриноген-связывающих пептидов по сравнению с количеством свободных участков связывания в фибриногене. При более высоких концентрациях фибриноген-связывающие пептиды дендримера могут насыщать участки связывания фибриногена, что приводит к значительному избытку молекул дендримера, которые не способны сополимеризоваться с фибриногеном.
Пример 3
Влияние изменения количества Фибриноген-связывающих пептидов на дендример на скорость сополимеризации с фибриногеном
В этом примере исследуют влияние изменения количества фибриноген-связывающих пептидов в пептидном дендримере на скорость сополимеризации с фибриногеном.
Оценивали способность пептидных дендримеров №4, 5, 10, 11 и 12 к сополимеризации с фибриногеном с использованием способа, описанного в примере 2. Концентрацию каждого дендримера варьировали от 0,005 до 0,5 мг/мл. Фиг. 2 иллюстрирует график зависимости времени свертывания (в секундах) от увеличения концентрации каждого из различных дендримеров.
Результаты показывают, что дендример №5 (только с двумя фибриноген-связывающими пептидами/дендример) был неспособен к сополимеризации с фибриногеном. С увеличением количества фибриноген-связывающих пептидов от трех до пяти, при концентрации дендримера от ~0,125 до ~0,275 мг/мл, скорость сополимеризации возрастала. При концентрациях дендримера ниже ~0,125 мг/мл, дендример №10 (с тремя фибриноген-связывающими пептидами/дендример) продемонстрировал меньшее время свертывания, чем дендример №4 (с четырьмя фибриноген-связывающими пептидами/дендример). В интервале ~0,02-0,5 мг/мл дендример №12 (с пятью фибриноген-связывающими пептидами/дендример) вызывал практически мгновенное свертывание. В интервале ~0,05-0,3 мг/мл дендример №11 (с четырьмя фибриноген-связывающими пептидами/дендример) также вызывал практически мгновенное свертывание.
Итак, скорость, с которой фибриноген полимеризуется под действием дендримера в соответствии с данным изобретением, обычно увеличивается с увеличением количества фибриноген-связывающих пептидов на дендример.
Пример 4
Влияние ориентации фибриноген-связывающих пептидов и различных последовательностей фибриноген-связывающих пептидов на скорость сополимеризации с фибриногеном
Для определения того, может ли влиять ориентация фибриноген-связывающего пептида на способность пептидного дендримера сополимеризоваться с фибриногеном, синтезировали пептидные дендримеры, содержащие три фибриноген-связывающих пептида, присоединенных к одному трифункциональному аминокислотному остатку (лизин) (именуемые дендримерами «с тремя ответвлениями»), при этом один из фибриноген-связывающих пептидов ориентирован так, что его амино-конец присоединен к разветвленному ядру, а его карбоксильный конец амидирован. Также исследовали способность пептидных дендримеров, содержащих фибриноген-связывающие пептиды с различными последовательностями, к сополимеризации с фибриногеном.
Каждый из фибриноген-связывающих пептидов пептидных дендримеров №3 и 10 имеет последовательность GPRPG (SEQ ID NO: 15). Каждый фибриноген-связывающий пептид пептидного дендримера №10 ориентирован так, что его карбоксильный конец присоединен к разветвленному ядру. Один из фибриноген-связывающих пептидов пептидного дендримера №3 ориентирован так, что его амино-конец присоединен к разветвленному ядру. Карбоксильный конец этого пептида содержит амидную группу.
Два пептида из фибриноген-связывающих пептидов пептидного дендримера №8 имеют последовательность GPRPG (SEQ ID NO: 15), а третий фибриноген-связывающий пептид имеет последовательность APFPRPG (SEQ ID NO: 14) и ориентирован так, что его амино-конец присоединен к разветвленному ядру. Карбоксильный конец этого пептида содержит амидную группу.
Два пептида из фибриноген-связывающих пептидов пептидного дендримера №9 имеют последовательность GPRPFPA (SEQ ID NO: 3), а третий фибриноген-связывающий пептид имеет последовательность APFPRPG (SEQ ID NO: 14) и ориентирован так, что его амино-конец присоединен к разветвленному ядру. Карбоксильный конец этого пептида содержит амидную группу.
Последовательность GPRPG (SEQ ID NO: 15) связывается с рецептором «а» и рецептором «b» фибриногена, но более предпочтительно с рецептором «а». Последовательность GPRPFPA (SEQ ID NO: 3) связывается преимущественно с рецептором «а» фибриногена. Последовательность Pro-Phe-Pro стабилизирует остов пептидной цепи и усиливает взаимодействие лиганд-рецептор (Stabenfeld et al., BLOOD, 2010, 116: 1352-1359).
Способность дендримеров сополимеризоваться с фибриногеном оценивали с использованием способа, описанного в примере 2, для концентраций каждого дендримера в интервале от 0,005 до 0,5 мг/мл. Фиг. 3 иллюстрирует график для времени свертывания (в секундах), полученный при увеличении концентрации каждого из различных дендримеров.
Результаты демонстрируют, что изменение ориентации одного из фибриноген-связывающих пептидов в дендримере, содержащем три ответвления таким образом, что пептид присоединен своим амино-концом к разветвленному ядру (т.е. дендример №3) уменьшает способность дендримера к сополимеризации с фибриногеном (сравн. время свертывания для дендримера №. 3 и дендримера №10). Однако при более высоких концентрациях фибриногена дендример №3 был способен к сополимеризации с фибриногеном (данные не показаны).
Дендример, содержащий три ответвления, с фибриноген-связывающим пептидом с другой последовательностью, который ориентирован так, что его амино-конец присоединен к разветвленному ядру, был способен сополимеризоваться с фибриногеном (см. результаты для дендримера №8).
Дендример с тремя ответвлениями, в котором два из фибриноген-связывающих пептидов содержат последовательность, которая предпочтительно связывается с рецептором «b» фибриногена (последовательность GPRPFPA (SEQ ID NO: 3)), причем эти пептиды ориентированы так, что их карбоксильные концы присоединены к разветвленному ядру, а другой пептид, содержащий обратную последовательность (т.е. последовательность APFPRPG (SEQ ID NO: 14)), ориентирован так, что его амино-конец присоединен к разветвленному ядру (дендример №9), также продемонстрировал очень высокую активность в сополимеризации с фибриногеном.
Пример 5
Способность пептидных дендримеров. содержащих фибриноген-связывающие пептиды с различными последовательностями, к сополимеризации с фибриногеном
Мотивы GPRPG (SEQ ID NO: 15) и GPRPFPA (SEQ ID NO: 3) связываются главным образом с рецептором «а» фибриногена. Этот пример описывает оценку способности химерного пептидного дендримера (т.е. пептидного дендримера, содержащего фибриноген-связывающие пептиды с различными последовательностями, присоединенные к одному и тому же разветвленному ядру) к сополимеризации с фибриногеном.
Пептидный дендример №13 представляет собой химерный пептидный дендример с четырьмя ответвлениями, содержащий два фибриноген-связывающих пептида с последовательностью GPRPG- (SEQ ID NO: 15) (которая предпочтительно связывается с рецептором «а») и два фибриноген-связывающих пептида с последовательностью GHRPY- (SEQ ID NO: 11) (которая предпочтительно связывается с рецептором «b»). Нехимерные пептидные дендримеры №11 и 12 представляют собой пептидные дендримеры с четырьмя и пятью ответвлениями, соответственно. Каждый фибриноген-связывающий пептид этих дендримеров имеет последовательность GPRPG- (SEQ ID NO: 15). Каждый фибриноген-связывающий пептид дендримеров №11, 12 и 13 присоединен своим карбоксильным концом к разветвленному ядру.
Способность дендримеров сополимеризоваться с фибриногеном оценивали с использованием способа, описанного в примере 2, для концентраций каждого дендримера в интервале от 0,005 до 0,5 мг/мл. Фиг. 4 иллюстрирует график для времени свертывания (в секундах), полученный при увеличении концентрации каждого из различных дендримеров.
Результаты демонстрируют, что скорость свертывания с использованием химерного дендримера была ниже, чем с использованием нехимерных дендримеров при концентрациях ниже 0,3 мг/мл. Однако фиг.5 иллюстрирует фотографию гидрогелей, полученных с использованием различных пептидных дендримеров. Гели обозначены в соответствии с номером используемого пептидного дендримера (11, 12 и 13), а «Р» обозначает гидрогель, полученный с использованием продукта, в котором несколько фибриноген-связывающих пептидов присоединены к растворимому человеческому сывороточному альбумину. Гидрогель, полученный с использованием химерного дендримера, был более плотным и содержал меньше жидкости по сравнению с гидрогелями, полученными с использованием дендримеров №11 и 12 (при 3 мг/мл фибриногена или при более высоких концентрациях фибриногена). Таким образом, хотя скорость свертывания с использованием химерного дендримера была ниже, гидрогель, полученный с использованием этого дендримера, был более плотным.
Пример 6
Способность смесей пептидных дендримеров и пептидных конъюгатов к сополимеризации с фибриногеном
Фибриноген-связывающий пептид с последовательностью GPRP- (SEQ ID NO: 1) предпочтительно и сильно связывается с рецептором «а» фибриногена (Laudano et al., 1978 PNAS 7S). Пептидный конъюгат №1 содержит два фибриноген-связывающих пептида с этой последовательностью, при этом каждый присоединен к остатку лизина. Первый пептид присоединен своим карбоксильным концом к остатку лизина посредством линкера, а второй пептид присоединен своим амино-концом к остатку лизина посредством линкера. Карбоксильный конец второго пептида содержит амидную группу.
Фибриноген-связывающий пептид с последовательностью GHRPY- (SEQ ID NO: 11) предпочтительно и сильно связывается с рецептором «b» фибриногена (Doolittle and Pandi, Biochemistry 2006, 45, 2657-2667). Пептидный конъюгат №2 содержит один фибриноген-связывающий пептид с этой последовательностью, присоединенный своим карбоксильным концом к остатку лизина посредством линкера. Второй фибриноген-связывающий пептид, который имеет обратную последовательность (YPRHG (SEQ ID NO: 16)), присоединен своим амино-концом к остатку лизина посредством линкера. Карбоксильный конец второго пептида содержит амидную группу.
Линкеры дают возможность пептидам находиться на расстоянии друг от друга.
Пептидный конъюгат №1 или 2 (2 мг/мл) смешивали с пептидным дендримером №3 или 4 и фибриногеном, и оценивали способность смесей сополимеризоваться с фибриногеном с использованием способа, описанного в примере 2, для концентраций каждого дендримера в интервале от 0,025 до 0,5 мг/мл. Фиг. 6 иллюстрирует график для времени свертывания (в секундах), полученный при увеличении концентрации каждого из различных дендримеров.
Результаты демонстрируют что, как ни удивительно, только смеси, содержащие пептидный конъюгат №2 (т.е. содержащий пептиды с лигандом В) и пептидные дендримеры, обладали взаимоусиливающим действием и повышенной активностью, тогда как смеси, содержащие пептидный конъюгат №1 (пептиды с лигандами А), были неактивными при добавлении как к пептидному конъюгату №2, так и пептидным дендримерам.
Пример 7
Способность пептидных дендримеров полимеризовать фибриноген в плазме человека.
Оценивали способность нескольких различных пептидных дендримеров (№4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13) полимеризовать фибриноген в плазме человека.
30 мкл каждого дендримера (с концентрацией 0,25 мг/мл) добавляли к 100 мкл плазмы человека при 37°С, и исследовали полимеризацию фибриногена с использованием анализатора коагуляции Sigma Amelung KC4 Delta.
Время свертывания для каждого дендримера представлено на фиг. 7; видно, что пептидные дендримеры №10, 11, 4, 12 и 13 были способны полимеризовать фибриноген в плазме человека, причем дендример №12 был особенно эффективным (время свертывания составляло менее одной секунды). Однако пептидные дендримеры №5, 8 и 9 были неспособны полимеризовать фибриноген в плазме человека.
Пример 8
Влияние стерилизации на готовые к использованию составы пептидных дендримеров
Этот пример описывает влияние гамма-облучения на кровоостанавливающую активность пептидных дендримеров в составе готовой к использованию пасты с гидратированным желатином.
2 мл раствора пептидного дендримера №12 или 13 смешивали с кровоостанавливающей матрицей SURGIFLO (гидратированная текучая желатиновая матрица) для получения пасты каждого пептида. Каждую пасту стерилизовали гамма-излучением, полученным от источника 60Со в дозе 30 кГр, а затем хранили при комнатной температуре. Образцы стерилизованных паст исследовали после хранения в течение двух и четырех недель.
После хранения пептидные дендримеры экстрагировали из каждой пасты с использованием 10 мМ буферного раствора HEPES. 30 мкл каждого экстракта (с концентрацией пептида около 0,25 мг/мл) добавляли к 100 мкл человеческого фибриногена с концентрацией 3 мг/мл, и определяли способность каждого дендримера к полимеризации фибриногена («свертывающую» активность) при 37°С с использованием анализатора коагуляции Sigma Amelung KC4 Delta. Также определяли полимеризационную активность необлученных контрольных образцов. Результаты представлены ниже в таблице.
Результаты демонстрируют, что пептидные дендримеры в соответствии с данным изобретением в составе готовой к использованию пасты с гидратированным желатином, сохраняют способность полимеризовать фибриноген после стерилизации облучением.
1. Пептидный дендример для полимеризации фибриногена, содержащий разветвленное ядро и совокупность фибриноген-связывающих пептидов, отдельно ковалентно присоединенных к разветвленному ядру по своему карбоксильному концу или аминоконцу, необязательно через линкер, причем разветвленное ядро содержит:
от двух до десяти многофункциональных аминокислотных остатков, причем каждый фибриноген-связывающий пептид отдельно ковалентно присоединен к многофункциональному аминокислотному остатку разветвленного ядра;
совокупность многофункциональных аминокислотных остатков, причем один или более фибриноген-связывающих пептидов отдельно ковалентно присоединены к каждому из по меньшей мере двух соседних многофункциональных аминокислотных остатков разветвленного ядра;
совокупность многофункциональных аминокислотных остатков, причем два или более фибриноген-связывающих пептидов отдельно ковалентно присоединены к по меньшей мере одному из многофункциональных аминокислотных остатков разветвленного ядра; или
совокупность многофункциональных аминокислотных остатков, причем два или более многофункциональных аминокислотных остатков ковалентно присоединены через боковую цепь соседнего многофункционального аминокислотного остатка;
причем многофункциональные аминокислотные остатки включают три- или тетрафункциональные аминокислотные остатки или три- и тетрафункциональные аминокислотные остатки;
причем трифункциональные аминокислотные остатки имеют центральный атом углерода, несущий аминогруппу, карбоксильную группу и боковую цепь, несущую дополнительную функциональную группу, и тетрафункциональные аминокислотные остатки имеют центральный атом углерода, несущий аминогруппу, карбоксильную группу и боковую цепь, несущую две дополнительные функциональные группы.
2. Пептидный дендример по п. 1, отличающийся тем, что разветвленное ядро содержит совокупность последовательных многофункциональных аминокислотных остатков.
3. Пептидный дендример по п. 1, отличающийся тем, что разветвленное ядро содержит до десяти многофункциональных аминокислотных остатков.
4. Пептидный дендример по п. 2, отличающийся тем, что совокупность многофункциональных аминокислотных остатков включают остатки лизина, орнитина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина, глутамина или цистеина.
5. Пептидный дендример по п. 1 общей формулы (I):
где:
FBP представляет собой фибриноген-связывающий пептид;
–(линкер)- представляет собой необязательный линкер, предпочтительно непептидный линкер;
X представляет собой трифункциональный аминокислотный остаток, предпочтительно остаток лизина, орнитина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина, глутамина или цистеина;
Y представляет собой –FBP или -NH2;
Z представляет собой -[-X-(линкер)-FBP]a-(линкер)-FBP в случае, если Y представляет собой -NH2, или -[-X-(линкер)-FBP]a-(линкер)-FBP в случае, если Y представляет собой -FBP;
и
a равен 1-10, предпочтительно 1-3.
6. Пептидный дендример по п. 1 общей формулы (II):
где:
FBP представляет собой фибриноген-связывающий пептид;
–(линкер)- представляет собой необязательный линкер, предпочтительно содержащий –NH(CH2)5CO–;
Y представляет собой –FBP или -NH2;
Z представляет собой:
в случае, если Y представляет собой -NH2; или
в случае, если Y представляет собой -NH2; или
в случае, если Y представляет собой -NH2; или
в случае, если Y представляет собой –FBP, и a равен 1-10, предпочтительно 1-3,
где R представляет собой -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH- или -(CH2)3NHCNHNH.
7. Пептидный дендример по п. 1 общей формулы (III):
где:
FBP представляет собой фибриноген-связывающий пептид;
–(линкер)- представляет собой необязательный линкер, предпочтительно содержащий –NH(CH2)5CO–;
Y представляет собой –FBP или -NH2;
Z представляет собой:
в случае, если Y представляет собой -NH2; или
в случае, если Y представляет собой -NH2; или
в случае, если Y представляет собой -NH2; или
в случае, если Y представляет собой –FBP, и a равен 1-10, предпочтительно 1-3.
8. Пептидный дендример по п. 1, отличающийся тем, что фибриноген-связывающие пептиды предпочтительно связываются с рецептором «a» фибриногена по сравнению с рецептором «b» фибриногена.
9. Пептидный дендример по п. 1, отличающийся тем, что фибриноген-связывающие пептиды предпочтительно связываются с рецептором «b» фибриногена по сравнению с рецептором «a» фибриногена.
10. Пептидный дендример по п. 1, отличающийся тем, что каждый фибриноген-связывающий пептид присоединен к разветвленному ядру с помощью непептидного линкера.
11. Пептидный дендример по п. 10, отличающийся тем, что линкер представляет собой неразветвленный линкер, предпочтительно неразветвленную алкильную группу.
12. Пептидный дендример по п. 11, отличающийся тем, что линкер содержит
–NH(CH2)nCO–, где n равен 1-10.
13. Пептидный дендример по п. 1, который не содержит:
14. Пептидный дендример по п. 1, содержащий фибриноген-связывающие пептиды с различными последовательностями.
15. Пептидный дендример по п. 14, отличающийся тем, что фибриноген-связывающие пептиды с различными последовательностями имеют различную селективность к связыванию с рецептором «a» по сравнению с рецептором «b» фибриногена.
16. Пептидный дендример по п. 14, отличающийся тем, что фибриноген-связывающие пептиды с различными последовательностями включают первый фибриноген-связывающий пептид, который предпочтительно связывается с рецептором «a» по сравнению с рецептором «b» фибриногена, и второй фибриноген-связывающий пептид, который связывается с рецептором «a» фибриногена по сравнению с рецептором «b» фибриногена с большей селективностью, чем первый фибриноген-связывающий пептид.
17. Пептидный дендример по п. 16, отличающийся тем, что первый фибриноген-связывающий пептид содержит аминокислотную последовательность GPRP- (SEQ ID NO: 1) на своем аминоконце.
18. Пептидный дендример по п. 16, отличающийся тем, что второй фибриноген-связывающий пептид содержит аминокислотную последовательность -APFPRPG (SEQ ID NO: 14) на своем карбоксильном конце.
19. Пептидный дендример по п. 14, отличающийся тем, что фибриноген-связывающие пептиды с различными последовательностями включают первый фибриноген-связывающий пептид, который предпочтительно связывается с рецептором «a» фибриногена по сравнению с рецептором «b» фибриногена, и второй фибриноген-связывающий пептид, который предпочтительно связывается с рецептором «b» фибриногена по сравнению с рецептором «a» фибриногена.
20. Пептидный дендример по п. 19, отличающийся тем, что первый фибриноген-связывающий пептид содержит аминокислотную последовательность GPRP- (SEQ ID NO: 1) на своем аминоконце.
21. Пептидный дендример по п. 19, отличающийся тем, что второй фибриноген-связывающий пептид содержит аминокислотную последовательность GHRP- (SEQ ID NO: 10), предпочтительно аминокислотную последовательность GHRPY- (SEQ ID NO: 11) на своем аминоконце.
22. Кровоостанавливающая композиция, которая содержит эффективное количество пептидного дендримера по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель.
23. Композиция по п. 22, которая представляет собой готовый к использованию кровоостанавливающий состав, в котором фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель включают гидратированный желатин.
24. Пептидный дендример по п. 1, который является стерильным.
25. Способ стерилизации пептидного дендримера по п. 1, который включает воздействие на него гамма-излучения.
26. Способ по п. 25, который включает воздействие на него гамма-излучения в дозе до 30 кГр.
27. Способ полимеризации фибриногена в растворе, который включает приведение в контакт фибриногена с пептидным дендримером по п. 1.
28. Кровоостанавливающий гидрогель, содержащий сополимер эффективного количества пептидного дендримера по п. 1 и фибриногена.
29. Набор для получения гидрогеля по п. 28, который содержит пептидный дендример по п. 1 и отдельно фибриноген.
30. Способ остановки кровотечения или лечения кровоточащей раны, который включает нанесение эффективного количества пептидного дендримера по п. 1 на участок кровотечения или на кровоточащую рану.
31. Способ остановки кровотечения или лечения кровоточащей раны, который включает нанесение эффективного количества пептидного дендримера по п. 1 на участок кровотечения или на кровоточащую рану и дополнительно включает нанесение фибриногена на участок кровотечения или на кровоточащую рану.
32. Применение пептидного дендримера по п. 1 в качестве кровоостанавливающего средства.
33. Применение пептидного дендримера по п. 1 для остановки кровотечения или для лечения кровоточащей раны.
34. Применение пептидного дендримера по п. 1 для производства лекарственного препарата, используемого для остановки кровотечения или для лечения кровоточащей раны.
