Способ выделения и очистки амброксида

Группа изобретений относится к способу выделения и очистки изомера (-)-амброксида и способу усиления запаха (-)-амброксида. Способы включают выделение (-)-амброксида из реакционной смеси, содержащей (-)-амброксид и одно или более чем одно из соединений (II), (III) и (IV): , путем селективной кристаллизации (-)-амброксида. После выделения (-)-амброксид не содержит или содержит лишь ольфакторно приемлемые количества соединений (II), (III) или (IV). 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 3 табл., 7 пр.

 

Настоящее изобретение относится к способу получения, выделения и очистки изомера (-)-амброксида. Более конкретно, изобретение относится к способу получения (-)-амброксида посредством биоконверсии, а также к способу его выделения и очистки из реакционной смеси.

AMBROFIX™ представляет собой зарегистрированный товарный знак Givaudan для энантиомерно чистого соединения (-)-амброксида, имеющего общую формулу (I).

AMBROFIX™ представляет собой очень важную молекулу в парфюмерной палитре ингредиентов. Он обеспечивает очень мощную, очень постоянную и высокостабильную амбровую нотку для применения во всех парфюмерных приложениях. AMBROFIX™, доступный от Givaudan, представляет собой наиболее подходящее вещество для достижения аутентичной амбровой нотки аромата.

В настоящее время AMBROFIX™ получают синтетически из исходных веществ природного происхождения. Доступность и качество некоторых исходных материалов зависят от климатических условий, а также социально-экономических факторов. Кроме того, поскольку исходные материалы могут быть экстрагированы из природных источников с умеренными выходами, они доступны по ценам, которые по всей вероятности все в большей степени делают их применение экономически нецелесообразным в промышленном масштабе. Соответственно, если коммерческие промышленные поставщики AMBROFIX™ будут продолжать поставлять его по разумной стоимости, то возникнет необходимость в более экономически эффективном способе продукции и очистки, подходящем для промышленного производства.

Промышленно масштабируемый биотехнологический способ получения AMBROFIX™ может быть перспективным, поскольку он потенциально является менее сложным и в меньшей степени загрязняющим по сравнению с полностью синтетическими способами.

Потенциально полезный субстрат, для которого делались попытки осуществить биоконверсию, с целью получения (-)-амброксида, представляет собой гомофарнезол. В своей оригинальной статье Neumann et al (Biol. Chem. Hoppe-Seyler Vol. 367 pp 723-726 (1986)) обсуждали возможность превращения гомофарнезола в (-)-амброксид при ферментативном катализе с использованием фермента сквален-гопен-циклазы (SHC). Используемый гомофарнезол представлял собой смесь четырех геометрических изомеров этой молекулы. Из четырех изомеров только 7Е,3Е геометрический изомер (при использовании обычной номенклатуры) может быть циклизован и потому обеспечивается только очень низкий выход желаемого (-)-амброксида.

В JP 2009-60799 (Kao) раскрыт синтез, при котором SHC действует на субстрат гомофарнезол с получением (-)-амброксида. Субстрат представляет собой смесь всех четырех геометрических изомеров (3Z,7Z; 3E,7Z; 3Z,7E; и 3Е,7Е). В документе раскрыто только получение (-)-амброксида из гомофарнезоловых экстрактов, содержащих SHC. Смесь гомофарнезола превращают в (-)-амброксид и его 9-эпи стереоизомер, и очистка может быть осуществлена путем перегонки или при помощи колоночной хроматографии. Kao не описывает способ, посредством которого гомофарнезол превращается в (-)-амброксид с использованием интактных микроорганизмов, продуцирующих SHC, и таким образом, не предложено какое-либо техническое руководство, связанное с последующей обработкой сложных реакционных смесей, получаемых при помощи таких способов, которые могут обеспечить получение (-)-амброксида в ольфакторно чистой форме.

В соответствии с информацией, которой обладает автор изобретения, в предшествующем уровне техники не описаны какие-либо практически осуществлимые промышленно применимые способы, включающие катализируемую SHC биоконверсию гомофарнезола для получения (-)-амброксида в ольфакторно чистой форме.

Кроме того, если биоконверсия гомофарнезола должна реализоваться в промышленном масштабе, тогда должны быть доступны экономически эффективные источники высокочистого 3Е,7Е-гомофарнезола. Однако, хотя в литературе описаны способы синтеза гомофарнезола (см., например, US 2013/0273619), в соответствии с информацией, которой обладает автор изобретения, в настоящее время отсутствуют экономически эффективные источники чистого 7Е,3Е-гомофарнезола для применения в промышленных масштабах.

Остается потребность в обеспечении экономически целесообразного и промышленно масштабируемого способа получения ценного ароматизирующего вещества (-)-амброксида.

В находящихся в одновременном рассмотрении заявках на изобретение РСТ/ЕР 2014/072891 (опубликованной как WO 2015/059293) и РСТ 2014/ЕР/072882 (опубликованной как WO 2015/059290) автор изобретения описывает эффективный способ приготовления смеси 7Е,3E/Z-гомофарнезола, обогащенной геометрическим изомером 7Е,3Е. Смесь 7Е,3Е/Z-гомофарнезола получают из бета-фарнезена, и сохраняют информацию об изомерии, содержащуюся в этом исходном веществе, таким образом, что двойная связь в гомофарнезоле в 7-положении фиксируется в Е-конфигурации. Тем не менее, даже эта превосходный химический синтез все же приводит в результате к смеси 3E/Z изомеров. Чистый 7Е,3Е-гомофарнезол остается сложным для синтеза и может получаться только при помощи экономически невыгодной очистки изомерных смесей.

Неожиданно, автор изобретения обнаружил, что смеси 7E,3E/Z-гомофарнезола могут подвергаться превращению с помощью микроорганизмов, в процессе которого смесь гомофарнезола ферментативно циклизуется в присутствии рекомбинантного микроорганизма, экспрессирующего фермент, в частности биокатализатор сквален-гопен-циклазы (SHC), способный конвертировать гомофарнезол до (-)-амброксида с получением реакционной смеси, из которой (-)-амброксид может быть выделен в ольфакторно чистой форме с неожиданно легкой последующей обработкой.

В одном из аспектов изобретения предложена ферментативно катализируемая циклизация гомофарнезола с получением реакционной смеси, содержащей (-)-амброксид, где гомофарнезол содержит смесь 7E,3E/Z-геометрических изомеров гомофарнезола, и где реакцию осуществляют в присутствии рекомбинантного микроорганизма, продуцирующего фермент, более конкретно, интактного рекомбинантного микроорганизма, продуцирующего фермент.

В одном воплощении изобретения реакцию циклизации осуществляют в присутствии биокатализатора SHC, способного осуществлять превращение гомофарнезола в (-)-амброксид.

Биокатализатор SHC представляет собой фермент дикого типа или его вариант или представляет собой микроорганизм, экспрессирующий ген, кодирующий фермент SHC, предпочтительно рекомбинантный микроорганизм Е. coli. Биокатализатор SHC может быть использован в любой форме, такой как очищенный фермент SHC, неочищенный экстракт, содержащий фермент SHC или иммобилизированный фермент SHC (например, на носителе), или биокатализатор может представлять собой микроорганизм, который продуцировал или продуцирует фермент SHC, такой как интактная рекомбинантная целая клетка и/или фрагментированная клетка, или мембранная фракция, содержащая фермент SHC, но не ограничиваться этим.

В конкретном воплощении настоящего изобретения смесь гомофарнезола обогащена 7Е,3Е-геометрическим изомером.

В более конкретном воплощении смесь гомофарнезола представляет собой по меньшей мере 55/45 по массе 7E,3E/7E,3Z.

В более конкретном воплощении смесь гомофарнезола представляет собой по меньшей мере 70/30 по массе 7E,3E/7E,3Z.

В еще более конкретном воплощении смесь гомофарнезола представляет собой по меньшей мере 80/20 по массе 7E,3E/7E,3Z

В еще более конкретном воплощении смесь гомофарнезола представляет собой по меньшей мере 90/10 по массе 7E,3E/7E,3Z.

В еще более конкретном воплощении смесь гомофарнезола представляет собой по меньшей мере 95/5 по массе 7E,3E/7E,3Z.

В конкретном воплощении настоящего изобретения смесь гомофарнезола состоит из 7Е,3Е/Z-геометрических изомеров и не содержит никаких других геометрических изомеров гомофарнезола.

Специалисту в данной области техники понятно, что 7Е, 7Z, 3Е или 3Z, использованные отношении гомофарнезола, относятся соответственно к ориентации двойной связи в 7-позиции и 3-позиции гомофарнезола. Соединение 7Е,3Е-гомофарнезол имеет CAS номер 459-89-2, тогда как соединение 7Е,3Z-гомофарнезол имеет CAS номер 138152-06-4. Термин «7Е, 3Е/Z-гомофарнезол» относится к смеси соединений.

Способы получения смесей гомофарнезола, пригодных в качестве субстрата в реакции циклизации в соответствии со способом по настоящему изобретению, изложены в находящихся в одновременном рассмотрении заявке на изобретение РСТ/ЕР 2014/072891 (опубликованной как WO 2015/059293) и заявке РСТ 2014/ЕР/072882 (опубликованной как WO 2015/059290), на которые ссылаются выше, которые включены в настоящее описание путем ссылки. В общих чертах, в них описан синтез смесей гомофарнезола, которые готовят путем превращения фарнезена, более конкретно, альфа-фарнезеиа и/или бета-фарнезена в соответствующее циклопропановое производное фарнезена, с использованием органического раствора N-алкил-N-нитрозомочевины. Циклопропановое производное затем подвергается реакции раскрытия кольца и реакции перегруппировки в присутствии кислоты Бренстеда с получением смеси гомофарнезола, которая селективна в отношении 7Е,3Е геометрического изомера. Использованием фарнезена в качестве исходного вещества особенно предпочтительно, поскольку он обеспечивает то, что Е-конфигурация двойной цепи в 7-положении гомофарнезола фиксирована.

Специфические условия реакции, которые образуют конкретные воплощения настоящего изобретения, изложены в находящихся в одновременном рассмотрении заявках на изобретение, а также нижеприведенных примерах, и не требуют дополнительного уточнения в настоящем описании.

Циклизация гомофарнезола с получением реакционной смеси, содержащей (-)-амброксид, может быть катализирована сквален-гопен-циклазой (SHC). SHC может представлять собой фермент дикого типа (например, с SEQ ID №1) или его вариант (например, с SEQ ID №. 2 или SEQ ID №4). SHC может быть получена из Alicyclobacillus acidocaldarius (Bacillus acidocaldarius), Zymomonas mobilis или Bradyrhizobium japonicum (как изложено в примере 3b в US 20120135477 A1).

Тем не менее, этот фермент также может быть получен при помощи рекомбинантных средств с использованием методик, общеизвестных в области техники.

Термин "рекомбинантный", используемый в отношении продукции ферментов, должен относиться к ферментам, продуцируемым при помощи методов рекомбинантной ДНК, т.е. продуцируемым из клеток, трансформированных экзогенной конструкцией ДНК, кодирующей желаемый фермент. Таким образом, термин "рекомбинантная ДНК" включает рекомбинантную ДНК, введенную в вектор в автономно реплицирующейся плазмиде или вирусе, или в геномную ДНК прокариота или эукариота (или в геном гомологичной клетки в положении, отличающемся от природного расположения в хромосоме).

Молекула(ы) нуклеиновой кислоты функционально связана(ы) с последовательностями, контролирующими экспрессию, которые обеспечивают экспрессию в прокариотических и/или эукариотических клетках-хозяевах. Используемый здесь термин "функционально связанный" обозначает включенный в генетическую конструкцию таким образом, что последовательности, контролирующие экспрессию, эффективно контролируют экспрессию интересующей кодирующей последовательности. Регулирующие транскрипцию/трансляцию элементы, приведенные выше, включают, без ограничения, индуцируемые и не индуцируемые конститутивные, регулируемые клеточным циклом, метаболически регулируемые промотеры, энхансеры, операторы, сайленсеры, репрессоры и другие элементы, которые известны специалистам в данной области техники и которые руководят генной экспрессии или иным образом регулируют ее. Такие регулирующие элементы включают, без ограничения, регулирующие элементы, контролирующие конститутивную экспрессию, или которые дают возможность для индуцируемой экспрессии, такие как, например, промотор CUP-1, репрессор tet, используемый, например в системах tet-on или tet-off, система lac, регулирующие элементы системы trp. В качестве примера изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) представляет собой эффективный индуктор белковой экспрессии в диапазоне концентраций от 100 мкМ до 1,0 мМ. Это соединение представляет собой молекулярный имитатор аллолактозы, представляющей собой метаболит лактозы, который запускает транскрипцию оперона lac, и, таким образом, используется для индукции экспрессии белка, когда ген находится под контролем оператора lac.

Аналогично, молекула(ы) нуклеиновой кислоты может(гут) образовывать часть гибридного гена, кодирующего дополнительные полипептидные последовательности, например последовательность, которая функционирует в качестве маркера или репортера. Примеры маркерных генов и генов-репортеров включают бета-лактамазу, хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), аденозиндеаминазу (ADA), аминогликозидфосфотрансферазу, дигидрофолатредуктазу (DHFR), гигромицин-В-фосфотрансферазу (НРН), тимидинкиназу (ТK), lacZ (кодирующую бета-галактозидазу) и ксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазу (XGPRT). Как и множество стандартных методов, ассоциирующихся с практической реализацией описания изобретения, специалистам в данной области техники известны дополнительные полезные реагенты, например дополнительные последовательности, которые могут выполнять функцию маркера или репортера.

Рекомбинантные полинуклеотиды могут кодировать ферменты SHC, такие как SHC дикого типа или его вариант, который могут быть встроен в вектор для экспрессии и возможной очистки. Один из типов вектора представляет собой плазмиду, представляющую собой кольцевую петлю двухцепочечной ДНК, в которой лигированы дополнительные сегменты ДНК. Некоторые векторы могут контролировать экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Эти векторы называют "векторами экспрессии". Обычно векторы экспрессии, подходящие для способов рекомбинации ДНК, представляют собой векторы плазмидного типа. Как правило, вектор экспрессии включает ген, такой как SHC дикого типа или его вариант. В описании настоящего изобретения термины "плазмида" и "вектор" используются взаимозаменяемо, поскольку плазмида представляет собой тип вектора, используемый наиболее часто.

Такие векторы могут включать последовательности ДНК, которые включают, без ограничения, последовательности ДНК, которые в природе отсутствуют в клетках-хозяевах, последовательности ДНК, которые обычно не транскрибируются в РНК или транслируются в белок ("экспрессируемые"), и другие гены или последовательности ДНК, которые желательно вводить нерекомбинантному хозяину. Понятно, что, как правило, геном рекомбинантного хозяина усиливается путем стабильного введения одного или более чем одного рекомбинантного гена. Тем не менее, автономные или репликативные плазмиды или векторы также могут быть использованы в объеме настоящей заявки. Кроме того, настоящее изобретение может быть практически реализовано с использованием низкокопийной, например однокопийной, или высококопийной плазмиды или вектора.

В предпочтительном воплощении вектор в соответствии с настоящим изобретением включает плазмиды, фагмиды, фаги, космиды, искусственные бактериальные и искусственные дрожжевые хромосомы, конструкции типа нокаут или нокин. Синтетические последовательности нуклеиновой кислоты или кассеты и подгруппы могут быть продуцированы в форме линейных полинуклеотидов, плазмид, мегаплазмид, синтетических или искусственных хромосом, таких как искусственные хромосомы растений, бактерий, млекопитающих или дрожжей.

Предпочтительно, чтобы белки, кодируемые введенным полинуклеотидом, продуцировались в клетке после введения вектора. Различные генные субстраты могут быть включены в плазмиды. Плазмиды часто представляют собой стандартные клонирующие векторы, например бактериальные мультикопийные плазмиды. Субстраты могут быть включены в одну и ту же плазмиду или в различные плазмиды. Часто по меньшей мере два различных типа плазмид, имеющих различные типы селективных маркеров, используют для того, чтобы обеспечить отбор клеток, содержащих по меньшей мере два типа вектора.

Обычно бактериальные или дрожжевые клетки могут быть трансформированы одной или более чем одной из следующих нуклеотидных последовательностей, что хорошо известно в области техники. Для рекомбинации in vivo ген, который предполагается рекомбинировать с геномом или другими генами, используют для трансформации хозяина с помощью стандартных методик трансформации. В подходящем воплощении ДНК, обеспечивающую ориджин репликации, включают в конструкцию. Ориджин репликации может быть подходящим образом выбран специалистом в данной области техники. В зависимости от природы генов дополнительный ориджин репликации может не потребоваться в том случае, если в генах или геноме уже присутствуют последовательности, которые сами по себе функционируют в качестве ориджинов репликации.

Бактериальная или дрожжевая клетка может быть трансформирована экзогенной или гетерологической ДНК, когда такую ДНК вводят внутрь клетки. Трансформирующая ДНК может быть интегрирована, т.е. ковалентно связана в геноме клетки, или не интегрирована. Например, в прокариотах и дрожжах трансформирующая ДНК может содержаться на эписомальном элементе, таком как плазмида. В отношении эукариотических клеток стабильно трансформируемая клетка представляет собой клетку, в которой трансфицированная ДНК интегрируется в хромосому таким образом, что она наследуется дочерними клетками в процессе репликации хромосомы. Эта стабильность демонстрируется способностью эукариотической клетки к образованию клеточных линий или клонов, состоящих из популяции дочерних клеток, содержащих трансформирующую ДНК.

Как правило, вводимая ДНК исходно не является первоначально резидентной для хозяина, который является реципиентом ДНК, но она входит в объем настоящей заявки для выделения сегмента ДНК из заданного хозяина, и в последующем одна или более чем одна дополнительная копия такой ДНК вводится тому же самому хозяину, например для усиления продукции гена или изменения паттерна экспрессии гена. В некоторых случаях вводимая ДНК будет модифицировать или даже заменять эндогенный ген или последовательность ДНК, например путем гомологичной рекомбинации или сайт-направленного мутагенеза. Подходящие рекомбинантные хозяева включают микроорганизмы, клетки растений и растения.

Настоящая заявка также относится к рекомбинантным хозяевам. Термин "рекомбинантный хозяин", также называемый "генетически модифицированная клетка-хозяин" или "трансгенная клетка" обозначает клетку-хозяин, которая содержит гетерологическую нуклеиновую кислоту, или в геном которой добавлена по меньшей мере одна включенная последовательность ДНК. Клетка-хозяин в соответствии с описанием настоящего изобретения может быть генетически сконструирована с полинуклеотидом или вектором, раскрытыми выше.

Клетки-хозяева, которые могут быть использованы для задач настоящего изобретения, включают, без ограничения, прокариотические клетки, такие как бактерии (например, Е. coli и В. subtilis), которые могут быть трансформированы, например, рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК, бактериальной искусственной хромосомой или космидными векторами экспрессии ДНК, содержащими полинуклеотидные молекулы в соответствии с описанием; простые эукариотические клетки, такие как дрожжи (например, Saccharomyces и Pichia), которые могут быть трансформированы, например, рекомбинантными дрожжевыми векторами экспрессии, содержащими полинуклеотидную молекулу в соответствии с описанием изобретения. В зависимости от клетки-хозяина и соответствующего вектора, используемого для введения полинуклеотида в соответствии с описанием изобретения, полинуклеотид может интегрироваться, например, в хромосому или митохондриальную ДНК, или может содержаться экстрахромосомально, например эписомально, или может включаться в клетку только временно.

Понятно, что используемый здесь термин "клетка", в частности в отношении генетической инженерии и введения одного или более чем одного гена или собранных кластеров генов в клетку, или продуцирующая клетка относится к любой прокариотической или эукариотической клетке. Прокариотические и эукариотические клетки-хозяева рассматривающиеся для применения в соответствии с описанием изобретения, включают бактериальные клетки-хозяева, такие как Е. coli или Bacillus sp, дрожжевые клетки-хозяева, такие как S. cerevisiae, клетки-хозяева насекомых, такие как Spodoptora frugiperda или человеческие клетки-хозяева, такие как HeLa и Jurkat.

В частности, клетка представляет собой эукариотическую клетку, предпочтительно клетку грибов, млекопитающих или растений, или прокариотическую клетку. Подходящие эукариотические клетки включают, например, без ограничения, клетки млекопитающих, клетки дрожжей или клетки насекомых (включая Sf9), клетки амфибий (включая клетки меланофоры), или клетки червей, включающие Caenorhabditis (включая Caenorhabditis elegans). Подходящие клетки млекопитающих включают, например, без ограничения клетки COS (включающие Cos-1 и Cos-7), клетки СНО, клетки НЕK293, клетки НЕK293Т, клетки НЕK293 T-RexTM или другие трансфицируемые линии эукариотических клеток. Подходящие бактериальные клетки включают, без ограничения, Е. coli.

Предпочтительно могут быть использованы прокариоты, такие как Е. coli, Bacillus, Streptomyces, или клетки млекопитающих, такие как клетки HeLa или клетки Jurkat, или клетки растений, таких как Arabidopsis.

Предпочтительно, клетка представляет собой Aspergillus sp или грибковую клетку, предпочтительно клетка может быть выбрана из группы, состоящей из родов Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Hansenula, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Pichia и Aspergillus.

Предпочтительно, клетка-хозяин E. coli представляет собой клетку-хозяин E. coli, которая признается в промышленности и регламентирующими органами (включая, без ограничения, клетку-хозяин Е. coli K12 или, как продемонстрировано в примерах, клетку-хозяин Е. coli BL21).

Одна из предпочтительных клеток-хозяев для применения в настоящем изобретении представляет собой Е. coli, которая может быть рекомбинантно получена в соответствии с описанным в настоящей заявке. Таким образом, рекомбинантный хозяин может представлять собой рекомбинантную клетку-хозяин Е. coli. Для Е. coli существуют библиотеки мутантов, плазмид, подробные компьютерные модели метаболизма и другая информация, обеспечивая возможность для рационального дизайна различных модулей для усиления выхода продукта. Способы, аналогичные описанным выше для Saccharomyces, могут быть использованы для получения рекомбинантных микроорганизмов Е. coli.

В одном из воплощений рекомбинантный микроорганизм Е. coli содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие гены SHC или их функциональные эквиваленты/гомологи, включающие, без ограничения, варианты, гомологичные мутанты, их производные или фрагменты.

Еще одна предпочтительная клетка-хозяин для применения в описании настоящего изобретения представляет собой S. cerevisiae, которая представляет собой широко используемый базовый организм в синтетической биологии. Таким образом, рекомбинантный хозяин может представлять собой S. cerevisiae. Существуют библиотеки мутантов, плазмид, подробные компьютерные модели метаболизма и другая информация, доступная для S. cerevisiae, дающая возможность для рационального дизайна различных модулей для увеличения выхода продукта. Известны способы для получения рекомбинантных микроорганизмов S. cerevisiae.

Выращивание клеток осуществляют обычным образом. Культуральная среда содержит источник углерода, по меньшей мере один источник азота и неорганических солей, и в нее добавляют витамины. Составляющие этой среды могут представлять собой составляющие, которые обычно используют для выращивания интересующих видов микроорганизмов.

Источники углерода для применения в способе по настоящему изобретению включают любую молекулу, которая может быть метаболизирована рекомбинантной клеткой-хозяином для облегчения роста и/или продукции (-)-амброксида. Примеры подходящих источников углерода включают, без ограничения, сахарозу (например, находящуюся в мелассах), фруктозу, ксилозу, глицерин, глюкозу, целлюлозу, крахмал, целлобиозу или другой содержащий глюкозу полимер.

Например, в воплощениях, где используются дрожжи в качестве хозяина, являются подходящими источники углерода, такие как сахароза, фруктоза, ксилоза, этанол, глицерин и глюкоза. Источник углерода может быть доступен для организма-хозяина в течение периода выращивания или, альтернативно, организм может быть выращен в течение периода времени в присутствии другого источника энергии, например белка, и затем обеспечиваться источником углерода только во время фазы подпитки.

Пригодность рекомбинантных клеток-хозяев микроорганизмов для применения в способах в соответствии с описанием настоящего изобретения может быть определена при помощи простых тестовых процедур с использованием хорошо известных способов. Например, тестируемый микроорганизм может размножаться на обогащенной среде (например, среде LB, бакто-триптоновой среде на основе дрожжевого экстракта, питательной среде и т.п.) при рН, температуре и в условиях аэрации, обычно используемых для размножения микроорганизма. После выбора рекомбинантных микроорганизмов (т.е. рекомбинантных клеток-хозяев), которые продуцируют желаемые продукты биоконверсии, эти продукты как правило продуцируют при помощи продуцирующей линии клеток-хозяев в большом масштабе при помощи подходящих систем экспрессии и ферментации, например путем микробной продукции в клеточной культуре.

В одном из воплощений описания настоящего изобретения определенная минимальная среда, такая как М9А, используется для выращивания клеток. Компоненты среды М9А включают: 14 г/л KН₂РО₄, 16 г/л K₂НРО₄, 1 г/л Na₃Цитрат.2Н₂O, 7,5 г/л (NH₄)₂SO₄, 0,25 г/л MgSO₄.7H₂O, 0,015 г/л CaCl₂.2H₂O, 5 г/л глюкозы и 1,25 г/л дрожжевого экстракта).

В еще одном воплощении описания настоящего изобретения использовали обогащенную питательными веществами среду, такую как LB (Луриа-Бертани). Компоненты LB включают: 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl.

Другие примеры минеральной питательной среды и минеральной питательной среды М9 раскрыты, например в US 6524831 В2 и US 2003/0092143 А1.

Рекомбинантный микроорганизм может быть выращен в периодическом процессе, периодическом процессе с подпиткой или непрерывном процессе, или их комбинациях. Как правило, рекомбинантный микроорганизм выращивают в ферментере при определенной температуре в присутствии подходящего источника питательных веществ, например источника углерода, в течение желательного периода времени для биоконверсии гомофарнезола в (-)-амброксид в желаемом количестве.

Рекомбинантные клетки-хозяева могут быть культивированы любым подходящим способом, например путем периодического выращивания или периодического выращивания с подпиткой. Используемый здесь термин "периодическое выращивание" представляет собой способ выращивания, при котором культуральную среду ни добавляют, ни удаляют во время выращивания. Использованный здесь термин "периодическое выращивание с подпиткой" обозначает способ выращивания, при котором культуральную среду добавляют во время выращивания, но не удаляют.

В одном из воплощений описания настоящего изобретения предложен способ получения (-)-амброксида в клеточной системе, включающий продуцирование SHC дикого типа или его вариантов в подходящих условиях в клеточной системе, загрузку гомофарнезола в клеточную систему, превращение гомофарнезола в (-)-амброксид с использованием SHC или вариантов, продуцируемых с использованием клеточной системы, сбор (-)-амброксида из клеточной системы и выделение (-)-амброксида из системы. Экспрессия других нуклеотидных последовательностей может способствовать усилению способа. Способ биоконверсии может включать дополнительную экспрессию других нуклеотидных последовательностей в клеточной системе. Экспрессия других нуклеотидных последовательностей может усиливать путь биоконверсии для получения (-)-амброксида.

Еще одно воплощение описания настоящего изобретения представляет собой способ биоконверсии для получения (-)-амброксида, включающий выращивание клеток-хозяев, содержащих гены SHC дикого типа или его варианта, продукцию фермента SHC дикого типа или вариантов ферментов в клетках-хозяевах, загрузку гомофарнезола (например, ЕЕН) в клетки-хозяева, выращивание клеток-хозяев в условиях рН, температуры и солюбилизирующего агента, подходящих для того, чтобы способствовать превращению гомофарнезола в амброксид, и сбор (-)-амброксида. Продукция SHC дикого типа или вариантов ферментов в клетках-хозяевах обеспечивает способ получения (-)-амброксида тогда, когда гомофарнезол добавляют в клетки-хозяева в подходящих реакционных условиях. Достигаемое превращение может быть усилено путем добавления дополнительного количества биокатализатора и SDS в реакционную смесь.

Рекомбинантные клетки-хозяева микроорганизмов могут быть выращены множеством способов для получения клеток в подходящих количествах, экспрессирующих SHC дикого типа или варианты фермента для последующей стадии биоконверсии. Поскольку микроорганизмы, применимые для стадии биоконверсии, широко варьируются (например, дрожжи, бактерии и грибы), условия культивирования безусловно корректируют в отношении специфических требований для каждого из видов, и эти условия хорошо известны и документированы. Любой из известных в области техники способов выращивания рекомбинантных клеток-хозяев микроорганизмов может быть использован для продуцирования клеток, используемых на последующей стадии биоконверсии в соответствии с настоящим изобретением. Как правило, клетки выращивают до конкретной плотности (измеряемой в виде оптической плотности (OD)) с целью продуцирования достаточной биомассы для реакции биоконверсии. Выбранные условия выращивания влияют не только на получаемое количество клеток (биомасса), но и качество условий выращивания, а также влияют на то, как биомасса принимает вид биокатализатора. Микроорганизм, представляющий собой рекомбинантную клетку-хозяин, экспрессирующуе гены SHC дикого типа или варианты, и продуцирующую SHC дикого типа или варианты фермента, обозначен как «биокатализатор», который подходит для применения в реакции биоконверсии. В некоторых воплощениях биокатализатор представляет собой рекомбинантную клетку-хозяин, продуцирующую SHC дикого типа или варианты фермента, или он может находиться в суспензии или иммобилизированном формате.

В одном из воплощений биокатализатор получают в достаточных количествах (для получения достаточной биомассы), собирают и промывают (и возможно хранят (например, замороженным или лиофилизированным)) до стадии биоконверсии.

В еще одном воплощении клетки продуцируют в достаточных количествах (для получения достаточного биокатализатора), и условия реакции затем корректируют без необходимости сбора и промывания биокатализатора для реакции биоконверсии. Этот одностадийный (или "однореакторный") способ является благоприятным, поскольку он упрощает способ при уменьшении стоимости. Культуральная среда, используемая для выращивания клеток, также подходит для применения в реакции биоконверсии, при условии того, что реакционные условия корректируют для облегчения реакции биоконверсии.

Способы биоконверсии в соответствии с настоящим изобретением осуществляют в условиях времени, температуры, рН и солюбилизирующего агента, обеспечивающих превращение сырья гомофарнезола в (-)-амброксид. Значение рН реакционной смеси может находиться в диапазоне 4-8, предпочтительно от 5 до 6,5, более предпочтительно 4,8-6,0 для вариантов фермента SHC и в диапазоне от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0 для фермента SHC дикого типа и может поддерживаться путем добавления в реакционную смесь буферов. Пример буфера для этой задачи представляет собой буфер на основе лимонной кислоты. Предпочтительная температура составляет от приблизительно 15°С до приблизительно 45°С, предпочтительно от приблизительно 20°С до приблизительно 40°С, хотя она может быть выше до 55°С для термофильных организмов, особенно, если используют фермент дикого типа из термофильного микроорганизма. Температура может поддерживаться постоянной или может изменяться во время процесса биоконверсии.

Автор изобретения продемонстрировал, что может быть полезно включать солюбилизирующий агент (например, поверхностно-активное вещество, детергент, усилитель растворимости, смешивающийся с водой органический растворитель и т.п) в реакцию биоконверсии. Примеры поверхностно-активных веществ включают, без ограничения, Triton Х-100, Tween 80, тауродезоксихолат, тауродезоксихолат натрия, додецилсульфат натрия (SDS) и/или лаурилсульфат натрия (SLS).

Автор изобретения выбрал и идентифицировал SDS в качестве особенно полезного солюбилизирующего агента из длинного перечня других менее полезных солюбилизирующих агентов. В частности, автор изобретения идентифицировал SDS в качестве значительно более хорошего солюбилизирующего агента, чем, например Triton Х-100 с точки зрения скорости реакции и выхода гомофарнезола для реакции биоконверсии (-)-амброксида.

Не желая быть связанными теорией, применение SDS с рекомбинантными клетками-хозяевами микроорганизмов может быть благоприятным, поскольку SDS может благоприятно взаимодействовать с мембраной клетки-хозяина для получения фермента SHC (представляющего собой связанный с мембраной фермент), более доступного для субстрата гомофарнезола. Кроме того, включение SDS на подходящем уровне в реакционную смесь может улучшить свойства эмульсии (гомофарнезол в воде) и/или улучшить доступ субстрата гомофарнезола к ферменту SHC в клетке-хозяине, в то же самое время предупреждая нарушение (например, денатурацию/инактивацию SHC дикого типа или варианта фермента).

На концентрацию солюбилизирующего агента (например, SDS), используемого в реакции биоконверсии, влияет количество биомассы и концентрация субстрата (ЕЕН). То есть, существует степень взаимозависимости между концентрацией солюбилизирующего агента (например, SDS), количеством биомассы и концентрацией субстрата (ЕЕН). В качестве примера по мере увеличения концентрации субстрата гомофарнезола достаточные количества биокатализатора и солюбилизирующего агента (например, SDS) требуются для эффективного осуществления реакции биоконверсии. Например, если концентрация солюбилизирующего агента (например, SDS) является слишком низкой, то может быть обнаружено недостаточное превращение гомофарнезола. С другой стороны, если, например, концентрация солюбилизирующего агента (например, SDS) является слишком высокой, то может существовать риск того, что биокатализатор нарушается вследствие нарушения интактной микробной клетки и/или денатурации/инактивации фермента SHC/HAC.

Выбор подходящей концентрации SDS в контексте количества биомассы и концентрации субстрата (ЕЕН) находится в объеме знаний специалиста в данной области техники. Например, прогностическая модель доступна для специалистов в данной области техники для определения подходящих концентраций SDS, субстрата (ЕЕН) и биомассы.

Температура реакции биоконверсии для фермента SHC дикого типа составляет приблизительно 45-60°С, предпочтительно 55°С.

Диапазон рН реакции биоконверсии для фермента SHC дикого типа составляет от приблизительно 5,0 до 7,0, более предпочтительно от приблизительно 5,6 до приблизительно 6,2, еще более предпочтительно приблизительно 6,0.

Температура реакции биоконверсии для варианта фермента SHC составляет от приблизительно 34°С до приблизительно 50°С, предпочтительно приблизительно 35°С.

Значение рН реакции биоконверсии для варианта фермента SHC составляет приблизительно 4,8-6,4, предпочтительно приблизительно 5,2-6,0.

Предпочтительно солюбилизирующий агент, используемый в реакции биоконверсии, представляет собой SDS.

Отношение [SDS]/[клетки] находится в диапазоне приблизительно 10:1-20:1, предпочтительно приблизительно 15:1-18:1, предпочтительно приблизительно 16:1, когда отношение биокатализатора к ЕЕН гомофарнезолу составляет приблизительно 2:1.

Концентрация SDS в реакции биоконверсии для варианта фермента SHC находится в диапазоне приблизительно 1-2%, предпочтительно в диапазоне приблизительно 1,4-1,7%, еще более предпочтительно приблизительно 1,5%, когда концентрация гомофарнезола составляет приблизительно 125 г/л ЕЕН, и концентрация биокатализатора составляет 250 г/л (соответствуя OD приблизительно 175 (650 нм)).

Отношение биокатализатора к субстрату ЕЕН гомофарнезолу находится в диапазоне приблизительно 0,5:1-2:1, в некоторых воплощениях 2:1, предпочтительно приблизительно 1:1 или 0,5:1.

В некоторых воплощениях (-)-амброксид получают с использованием биокатализатора, к которому добавлен субстрат гомофарнезол. Можно добавлять субстрат путем загрузки с использованием известных средств (например, перистальтического насоса, инфузионного шприца и т.п.). Гомофарнезол представляет собой маслорастворимое соединение и представлен в виде масла. Принимая во внимание то, что биокатализатор присутствует в водной фазе, реакция биоконверсии может рассматриваться как двухфазная система, где гомофарнезол добавляют в реакционную смесь для биоконверсии. Последнее справедливо даже тогда, когда присутствует солюбилизирующий агент (например, SDS).

Дополнительная информация о подходящем способе биоконверсии раскрыта в нижеприведенных примерах.

Способ биоконверсии в соответствии с настоящим изобретением позволяет получить реакционную смесь, содержащую желаемый (-)-амброксид, и также ряд побочных продуктов. Более конкретно, реакционная смесь содержит дополнительно к (-)-амброксиду сложную смесь побочных продуктов, включающую новый структурный изомер (-)-амброксида формулы (II), а также известные стереоизомеры (-)-амброксида формул (III) и (IV)

Автор изобретения полагает, хотя и не желает быть связанным конкретной теорией, что соединение формулы (II) образуется путем циклизации 7Е,3Z-геометрического изомера гомофарнезола. Этот изомер описан как практически лишенный запаха с порогом обнаружения >500 нг/л.

Как указано выше, автор изобретения полагает, что соединение формулы (II) представляет собой новую молекулу, и само по себе это соединение образует еще один аспект настоящего изобретения.

Парфюмерные ингредиенты и парфюмерные композиции, состоящие из соединения формулы (II) или содержащие его, а также парфюмерные изделия, содержащие их, образуют дополнительные аспекты изобретения.

Применение соединения формулы (II) в качестве парфюмерного ингредиента в парфюмерной сфере, например в духах с тонким запахом, или в функциональных парфюмерных композициях, таких как композиции для личной гигиены, домашней гигиены и ухода за тканью, образуют дополнительные аспекты изобретения.

Смеси (-)-амброксида и ольфакторно приемлемого количества соединения (II) образуют еще один аспект настоящего изобретения.

Понятно, что термин "ольфакторно приемлемое количество", используемый здесь в отношении соединения формулы (II) или любых других побочных продуктов (III) или (IV), или, несомненно, в отношении любого вещества, которое может быть представлено в качестве примеси в (-)-амброксиде, получаемом в соответствии со способом по настоящему изобретению, означает, что это соединение или вещество представлено в смеси с (-)-амброксидом в количестве ниже предела обнаружения его запаха, или в количестве, в котором оно не вносит вклад в ольфакторные характеристики таким, чтобы влиять на ольфакторные свойства (-)-амброксида. (-)-Амброксид, содержащий ольфакторно приемлемое количество любого такого соединения или вещества, может идентифицироваться квалифицированным парфюмером, как обладающий запахом товарной марки (-)-амброксида, такой как AMBROFIX™, получаемого при помощи процедуры синтеза экс-склареола, и доступного от Givaudan.

В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения реакционная смесь не содержит или по существу не содержит непрореагировавший гомофарнезол.

Автор изобретения обнаружил, что гомофарнезол являлся сильным растворителем для (-)-амброксида, а также для вышеупомянутых побочных продуктов способа биоконверсии. Сам по себе (-)-амброксид в присутствии существенных количеств гомофарнезола и побочные продукты остаются растворенными вместе в неочищенной труднообрабатываемой смеси, из которой его сложно, долго и дорого выделять, и, в конечном счете, выделять (-)-амброксид в ольфакторно чистой форме. Обнаружено, что уменьшение уровня непрореагировавшего гомофарнезола в смеси с (-)-амброксидом и соединениями (II), (III) и (IV) значительно облегчает последующую обработку и выделение/очистку (-)-амброксида.

Специалисту в данной области техники понятно, что последующая обработка представляет собой критическую операцию при изготовлении полезных соединений, образующихся при помощи способов биоконверсии. Как часть синтеза соединения она может оказать влияние на физические свойства соединения. В случае получения ингредиентов парфюмерных изделий биотехнологическими методами желательно, чтобы целевое соединение могло быть выделено из реакционной смеси в ольфакторно чистой форме, для того чтобы желаемые характеристики аромата желаемого соединения не искажались ароматами примесей и побочных продуктов в сложной смеси, которые могут быть представлены в ферментационной среде или биокатализаторе.

Соответственно, в еще одном аспекте изобретения предложен способ выделения и очистки (-)-амброксида из реакционной смеси, содержащей одно или более чем одно из соединений (II), (III) и (IV).

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ улучшения или усиления аромата (-)-амброксида, включающий стадии выделения и очистки (-)-амброксида из реакционной смеси, содержащей одно или более чем одно из соединений (II), (III) и (IV).

В выделенной и очищенной форме (-)-амброксид не содержит любое из соединений (II), (III) или (IV), или если он содержит какое-либо из указанных соединений, тогда оно должно быть представлено в ольфакторно приемлемом количестве.

Реакционная смесь, получаемая способом биоконверсии, таким как вышеописанный способ, как правило, содержит твердую фазу, содержащую неочищенный (-)-амброксид и один или более чем один из побочных продуктов (II), (III) и (IV), а также клеточный материал и/или его дебрис; и жидкую фазу или жидкие фазы, содержащие воду и/или любой непрореагировавший гомофарнезол.

Твердая фаза может быть отделена от жидкой фазы или фаз путем фильтрации или центрифугирования. Кроме того, путем выбора фильтра с подходящим размером пор также можно осуществлять отделение неочищенного (-)-амброксида от клеточного материала и/или дебриса. После отделения (-)-амброксида от клеточного материала и/или его дебриса его можно промыть, а затем подвергнуть процедурам дополнительной обработки для отделения (-)-амброксида от соединений (II), (III) и (IV).

Альтернативно, вместо фильрации или центрифугирования реакционная смесь может быть нагрета до температуры выше температуры плавления (-)-амброксида, после чего (-)-амброксид образует масляную фазу над водной фазой, содержащей клеточный материал и дебрис. Необязательно и для обеспечения полного выделения (-)-амброксида водный и клеточный материал может быть промыт не смешивающимся с водой органическим растворителем (таким как толуол) для удаления какого-либо остаточного (-)-амброксида, который может захватываться водной фазой, и эти промывки могут быть комбинированы с масляной фазой. После этого масляная фаза может быть концентрирована путем упаривания с получением неочищенной смеси, содержащей (-)-амброксид и одно или более чем одно из соединений (II), (III) и (IV), где смесь затем может быть подвергнута дополнительным процедурам обработки для выделения и очистки (-)-амброксида.

В еще одном воплощении вместо нагревания реакционной смеси для образования содержащей (-)-амброксид масляной фазы реакционная смесь может быть экстрагирована подходящим не смешивающимся с водой органическим растворителем (таким как толуол) с образованием органической фазы, содержащей (-)-амброксид и одно или более чем одно из соединений (II), (III) и (IV), которая может быть отделена от водной фазы, содержащей клеточный материал и дебрис. Органическая фаза может быть концентрирована путем упаривания с получением неочищенной смеси, содержащей (-)-амброксид и одно или более чем одно из соединений (II), (III) и (IV), которая может быть подвергнута дополнительным процедурам обработки для выделения и очистки (-)-амброксида.

В еще одном альтернативном способе реакционная смесь может быть перегнана с паром для отделения погона от клеточного материала и дебриса. Дистиллят может быть собран в виде двухфазной смеси до того, как масляная фаза двухфазной смеси, содержащей смесь (-)-амброксида и одного или более чем одного из соединений (II), (III) и (IV), отделяется от водной фазы, и затем подвергнут дополнительным процедурам обработки для выделения и очистки (-)-амброксида.

В конкретном воплощении настоящего изобретения указанный способ выделения и очистки (-)-амброксида включает стадию селективной кристаллизации (-)-амброксида из смеси, содержащей одно или более чем одно из соединений (II), (III) или (IV).

Фраза "селективная кристаллизация" относится к стадии способа, в которой (-)-амброксид заставляют кристаллизоваться из растворителя, тогда как соединения (II), (III) и (IV) остаются растворенными в кристаллизационном растворителе до такой степени, что выделенный кристаллический материал содержит только (-)-амброксид, или если оно содержит любое из соединений (II), (III) или (IV), тогда они представлены исключительно в приемлемых для обоняния количествах.

Кристаллизация может быть осуществлена в подходящем органическом растворителе. Выбор растворителя основан на таких факторах как различия растворения при комнатной температуре и при высоких температурах, или в кипящем растворителе; и для необходимости выделения множества кристаллов в охлажденном растворителе. Как правило, выделяемое соединение растворяют в относительно полярном растворителе и затем относительно менее полярный растворитель может быть добавлен, для того чтобы довести растворяемое соединение до его предела растворимости, после чего оно начинает кристаллизовываться. Кроме того, в промышленном процессе важными являются факторы стоимости, а также безопасности обработки. Подходящие растворители включают, без ограничения, метанол, ацетон, петролейный эфир, гексан, трет-бутилметиловый эфир, THF и этилацетат. Предпочтительные растворители включают толуол или этиловый спирт. Также могут быть использованы пары растворителей.

В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения селективную кристаллизацию осуществляют таким образом, что смесь, содержащую (-)-амброксид и одно или более чем одно из соединений (II), (III) и (IV), растворяют в нагретом этаноле и оставляют (-)-амброксид селективно кристаллизоваться путем медленного добавления к охлаждающему этанольному раствору осадителя, такого как вода.

Учитывая близкое структурное родство (-)-амброксида и побочных продуктов-соединений (II), (III) и (IV), которые соответственно представляют собой структурный изомер и два стереоизомера (-)-амброксида, удивительно, что (-)-амброксид может быть селективно кристаллизован из такой смеси с получением (-)-амброксида в ольфакторно чистой форме и с высокими выходами. Специалист в данной области техники может обосновано предполагать, что соединения могут сокристаллизоваться с (-)-амброксидом, усложняя последующую обработку, делая ее более времязатратной и дорогостоящей, чем было обнаружено в данном случае.

Неожиданно легкий способ, при котором (-)-амброксид может быть отделен от смеси, содержащей соединение (II), (III) и/или (IV), путем кристаллизации, представляет собой особенное преимущество настоящего изобретения.

Легкость, с которой (-)-амброксид может быть отделен путем кристаллизации, может контрастировать с обнаружением того, что (-)-амброксид не может быть выделен так легко и с таким высоким выходом из смеси, содержащей (II), (III) и/или (IV), при помощи других методов очистки, таких как путем дистилляции, вследствие очень похожих температур плавления (-)-амброксида и побочных продуктов (II), (III) и (IV).

Предполагается, что термин "ольфакторно чистый", используемый в отношении (-)-амброксида, означает, что (-)-амброксид не содержит соединения (II), (III) или (IV), или любое другое вещество, обнаруживаемое в реакционной смеси, или что если такие соединения или вещества присутствуют, то они представлены в ольфакторно приемлемых количествах, как этот термин здесь определен.

В одном из воплощений изобретения (-)-амброксид в ольфакторно чистой форме содержит менее чем 5% по массе любого из соединений (II), (III) или (IV).

В более конкретных воплощениях (-)-амброксид в ольфакторно чистой форме содержит менее чем 4%, менее чем 3%, менее чем 2%, менее чем 1%, менее чем 0,9%, менее чем 0,8%, менее чем 0,7%, менее чем 0,6%, менее чем 0,5%, менее чем 0,4%, менее чем 0,3%, менее чем 0,2%, менее чем 0,1% или менее чем 0,05% по массе каждого из соединений (II), (III) или (IV).

На качество отделения (-)-амброксида от смеси соединений (II), (III) и/или (IV) путем селективной кристаллизации можно влиять при помощи композиции смеси, от которой его отделяют. Конкретней, качество отделения (-)-амброксида от смеси соединений (II), (III) и/или (IV) путем кристаллизации улучшалось тогда, когда массовое отношение (-)-амброксида к другим соединениям (II), (III) и (IV) в смеси было больше чем 70:30, более конкретно 80:20, более конкретно 90:10, еще более конкретно 95:5, и еще более конкретно 97:3.

Кроме того, на качество отделения (-)-амброксида путем кристаллизации можно влиять при помощи количества непрореагировавшего гомофарнезола, представленного в смеси, от которой его отделяют. Более конкретно, качество отделения улучшается тогда, когда уровень непрореагировавшего гомофарнезола составляет менее чем 30% по массе, более конкретно менее чем 20% по массе, более конкретно менее чем 10% по массе, более конкретно менее чем 5% по массе и еще более конкретно менее чем 3% по массе, еще более конкретно менее чем 2% по массе, и еще более конкретно менее чем 1% по массе на основе массы смеси, из которой кристаллизуют (-)-амброксид.

Предпочтительно, реагенты и реакционные условия, используемые в способе биоконверсии по настоящему изобретению, являются такими, что реакция протекает со 100% превращением гомофарнезола, или по существу таким образом, что в реакционной смеси не остается непрореагировавший гомофарнезол. Тем не менее, если имеется непрореагировавший гомофарнезол, то, несмотря на экономическую убыточность, он может быть отделен от (-)-амброксида и других побочных продуктов, например путем дистилляции.

Соответственно, в конкретном воплощении изобретения предложен способ выделения и очистки (-)-амброксида из смеси, содержащей одно или более чем одно из соединений (II), (III) и (IV), где смесь не содержит или по существу не содержит гомофарнезол.

В более конкретном воплощении выделение и очистку (-)-амброксида из смеси, содержащей одно или более чем одно из соединений (II), (III) и (IV), и не содержащей или по существу не содержащей гомофарнезол, достигают путем селективной кристаллизации (-)-амброксида.

(-)-Амброксид, получаемый способом по настоящему изобретению, получают в ольфакторно чистой форме. Ольфакторно чистый (-)-амброксид образует еще один аспект настоящего изобретения.

(-)-Амброксид в кристаллической форме образует еще один аспект настоящего изобретения.

(-)-Амброксид, получаемый способом по настоящему изобретению, может быть смешан с одним или более чем одним дополнительным парфюмерным ингредиентом с образованием парфюмерных композиций, которые используются в парфюмерных сферах применения, включающих применение в парфюмерных изделиях с тонким запахом, а также применение в потребительских товарах, таких как применение для личной гигиены, уход за тканью и домашняя гигиена.

Соответственно, в других аспектах изобретения предложена парфюмерная композиция, содержащая (-)-амброксид и по меньшей мере один другой парфюмерный ингредиент, где указанная парфюмерная композиция содержит приемлемые для обоняния количества одного или более чем одного из соединений (II), (III) или (IV).

Изобретение будет дополнительно проиллюстрировано со ссылкой на следующие примеры.

ПРИМЕРЫ

Пример 1:

Получение гомофарнезола

Общие аналитические условия:

Неполярная GC (газовая хроматография)/MS (масс-спектрометрия): 50°С/2 мин, 20°С/мин 200°С, 35°С/мин 270°С. GC/MS Agilent 5975С MSD с системой HP 7890А Series GC. Неполярная колонка: ВРХ5 из SGE, 5% фенил 95% диметилполисилокссан 0,22 мм × 0,25 мм × 12 м. Газ-носитель: гелий. Температура инжектора: 230°С. Разделение 1:50. Поток: 1,0 мл/мин. Переходная линия: 250°С. MS-квадруполь: 106°С. MS-источник: 230°С.

А) Получение MNU (N-метил-N-ниторозомочевины) в THF (тетрагидрофуран)

Раствор мочевины (175 г, 2,9 моль) и метиламина гидрохлорида (198 г, 2,9 моль) в воде (400 мл) нагревают с обратным холодильником (105°С) в течение 3,5 ч при перемешивании. При 40°С добавляют NaNO₂ (101 г, 1,45 моль), растворенный в воде (200 мл). Через 15 мин добавляют THF (1000 мл), что приводит в результате к прозрачной 2-фазной смеси. Концентрированную H₂SO₄ (110 г, 1,1 моль) добавляют при 0-5°С и перемешивают в течение 1,5 ч. После еще 0,5 ч при 0-5°С две прозрачные фазы разделяют при 25°С. Органическую фазу (А) (1065 мл, теоретически 1,35 М) хранят в течение нескольких суток при 0-5°С или отправляют непосредственно в реактор для циклопропанирования.

После фазового разделения водную фазу дважды экстрагируют THF (2×1 л). Последнее позволяет получить 1100 мл фазы В и 1075 фазы С. В то время как в фазе А обеспечивает 51% превращение алкена с концевой двойной связью в циклопропан в последующей реакции циклопопанирования, фаза В обеспечивает <0,5% циклопропана и фаза С не обеспечивает детектируемого превращения. Авторы изобретения сделали вывод о том, что >99% MNU экстрагируется после первой фазы разделения. Поэтому водную фазу обычно удаляют после первой фазы отделения (от органической фазы А) после обработки концентрированным водным KОН и уксусной кислотой.

Б) Получение Е-Δ-фарнезена с использованием MNU в THF

N-Метил-N-нитрозомочевину 1,35 М в THF (136 мл, 184 ммоль) по каплям добавляют при 0°С к быстро перемешиваемой смеси Е-бета-фарнезена (CAS 18794-84-8) (25 г, 122 ммоль) и водного KОН (50 мл, 40%) при 0-5°С. После добавления 4 мл раствора MNU добавляют Pd(acac)₂ (7,4 мг, 0,024 ммоль, 0,02%), дополнительно растворенный в 0,5 мл дихлорметана. Оставшийся раствор MNU добавляют в течение 4 ч при 0-5°С. GC на этой стадии показала 28% не подвергнутого превращению Е-бета-фарнезена, 65% желаемого моноциклопропана (представленного выше) и 3% бисциклопропанированного соединения 5. После 16 ч при 25°С добавляют уксусную кислоту (100 мл) при 0-5°С, затем трет-бутилметиловый эфир (250 мл). После фазового разделения органическую фазу промывают 2М HCl (250 мл), и водную фазу экстрагируют трет-бутилметиловым эфиром (250 мл). Объединенные органические слои промывают водой (2×100 мл), водным 10% NaOH (2×100 мл) и водой (2×100 мл), сушат над MgSO₄, фильтруют и концентрируют с получением 26,9 г слегка желтоватой жидкости, которая содержит 9% Е-бета-фарнезена, 82% желаемого моноциклопропанового соединения и 6% бисциклопропанированного побочного продукта.

Желаемое соединение может быть дополнительно выделено при помощи очистки путем дистилляции.

Добавление 1 г K₂СO₃ (1 г) и дистилляция через колонку с рулонной сталью длиной 30 см при 40-60 мбар (4000-6000 Па) обеспечивает получение 147 г моноциклопропанового соединения (68% корр.) при 135-145°С. Фракции объединяют с получением 92 г моноциклопропанового соединения со 100% чистотой.

Аналитические данные для Е-Δ фарнезена:

¹H-NMR (ядерный магнитный резонанс) (CDCl₃, 400 МГц): 5.1 (2 m, 2 Н), 4.6 (2 Н), 2.2 (2 Н), 2.1 (4 Н), 2.0 (2 Н), 1.7 (s, 3 Н), 1.6 (2 s, 6 Н), 1.3 (1 Н), 0.6 (2 Н), 0.45 (2 Н) млн^-1. ¹³C-NMR (CDCl₃, 400 МГц): 150.9 (s), 135.1 (s), 131.2 (s), 124.4 (d), 124.1 (d), 106.0 (t), 39.7 (t), 35.9 (t), 26.7 (t), 25.7 (q), 17.7 (q), 16.0 (d), 6.0 (t) млн^-1. GC/MS: 218 (2%, M+), 203 (5%, [M - 15]+), 175 (11%), 147 (31%), 134 (15%), 133 (20%), 121 (12%), 107 (55%), 95 (16%), 93 (30%), 91 (20%), 82 (11%), 81 (33%), 79 (42%), 69 (100%), 67 (22%), 55 (20%), 53 (21%), 41 (75%). IR (инфракрасная спектроскопия) (пленка): 3081 (w), 2967 (m), 2915 (m), 2854 (m), 1642 (m), 1439 (m), 1377 (m), 1107 (w), 1047 (w), 1018 (m), 875 (s), 819 (m), 629 (w). Анал. рассчит.для C16H26: С, 88,00; Н, 12,00. Обнаружено: С, 87,80; Н, 12,01.

В) Получение (7Е)-4,8,12-триметилтридека-3,7,11-триен-1-ола ((7Е)-гомофарнезола)

Смесь (Е)-(6,10-диметилундека-1,5,9-триен-2-ил)циклопропана (Е-Δ фарнезена) (1 г, 4,6 ммоль), додекана (0,2 г, 1,15 ммоль, внутренний стандарт) и L-(+)-винной кислоты (1 г, 6,9 ммоль) в пробирке под давлением нагревают при перемешивании при 150°С. Через 18 ч и после полного превращения (в соответствии с GC) смесь выливают в воду (50 мл) и толуол (50 мл). Фазы разделяют, и водную фазу экстрагируют толуолом (50 мл). Объединенные органические слои промывают концентрированным водным Nа₂СО₃ (50 мл) и концентрированным NaCl (2×50 мл), сушат над MgSO₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении с получением коричневатой смолы (1,35 г), которую смешивают с 30% водным KОН (4,3 мл) и перемешивают при 25°С в течение 2 ч. Анализ путем GC выявил образование 96% (7Е)-4,8,12-триметилтридека-3,7,11-триен-1-ола в соответствии с внутренним стандартом. Отношение E/Z 68:22. Аналитические данные для Е-изомера согласуются с данными из литературы, см., например, P. Kocienski, S. Wadman J. Org. Chem. 54, 1215 (1989).

Пример 2

Получение плазмиды SHC и продуцирование биокатализатора

Получение плазмиды SHC

Ген, кодирующий сквален-гопен-циклазу Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC) (GenBank M73834, Swissprot P33247), встраивали в плазмиду рЕТ-28а(+), когда она находилась под контролем индуцируемого IPTG (изопропилтиогалактозида) промотора Т7 для продукции белка в Escherichia coli. Плазмиду трансформировали в Е. coli штамм BL21 (DE3) с использованием стандартного протокола трансформации путем теплового шока.

Культуры в колбе Эрленмейера

Для продуцирования белка использовали обогащенную среду (среду LB) или минимальные среды. М9 является одним из примеров минимальных сред, которые успешно использовали.

Приготовление сред

Минимальную среду, выбранную по умолчанию, готовили следующим образом для 350 мл культуры: к 35 мл концентрированного раствора лимонная кислота/фосфатный маточный раствор (133 г/л KН₂РO₄, 40 г/л (NH₄)₂HPO₄, 17 г/г лимонная кислота. Н₂O при рН, доведенным до 6,3) добавляли 307 мл Н₂O, рН доводили до 6,8 с использованием 32% NaOH при потребности. После автоклавирования добавляли 0,850 мл 50% MgSO₄, 0,035 мл раствора следовых элементов (состав в следующем разделе), 0,035 мл тиаминового раствора и 7 мл 20% глюкозы.

Продуцирование биокатализатора SHC (продукция биокатализатора)

Для маломасштабной продукции биокатализатора (SHC дикого типа или варианты SHC) 350 мл культуры (среда, дополненная 50 мкг/мл канамицина) инокулировали из предварительной культуры Е. coli штамма BL21(DE3), содержащей продуцирующую SHC плазмиду. Клетки выращивали до оптической плотности приблизительно 0,5 (OD_650нм) при 37°С при постоянном перемешивании (250 об/мин).

Продуцирование белка затем индуцировали путем добавления IPTG до концентрации 300 мкМ с последующей инкубацией в течение следующих 5-6 часов при постоянном перемешивании. Полученную в результате биомассу собирали путем центрифугирования, промывали 50 мМ буфером Tris-HCl с рН 7,5. Клетки хранили в виде осадков при 4°С или -20°С для последующего использования. В общем, от 2,5 до 4 грамм клеток (влажная масса) получали из 1 литра культуры независимо от используемой среды.

Готовили ферментационную смесь, и ферментацию осуществляли в реакторах InforsHT объемом 750 мл. В ферментационный сосуд добавляли 168 мл деионизированной воды. Реакционный сосуд оборудовали всеми требуемыми датчиками (рO₂, рН, отбор образца, противовспениватель), питание С+N и флаконы с гидроксидом натрия и автоклавировали. После автоклавирования в реактор добавляли следующие ингредиенты:-

20 мл 10× буфер фосфат/лимонная кислота;

14 мл 50% глюкозы;

0,53 мл раствора MgSO₄;

2 мл раствора (NH₄)₂SO₄;

0,020 мл раствора следовых элементов;

0,400 мл раствора тиамина;

0,200 мл концентрированного раствора канамицина.

Условия реакции были следующими: рН=6,95, рО₂=40%, Т=30°С, перемешивание при 300 об./мин. Каскад: заданное значение 300 об./мин, мин 300, макс 1000, поток 0,1 л/мин, мин 0, max 0,6. Контроль противовспенивания: 1:9.

Ферментер инокулировали из культуры для посева до OD_650нм 0,4-0,5. Эту культуру для посева выращивали в среде LB (+ канамицин) при 37°С, 220 об./мин в течение 8 ч. Ферментацию сначала запускали в периодическом режиме в течение 11,5 ч, после чего начинали подачу С+N с питающим раствором (стерилизованный раствор глюкозы (143 мл Н₂О + 35 г глюкозы), к которому после стерилизации добавляли: 17,5 мл раствора (NH₄SO₄, 1,8 мл раствора MgSO₄, 0,018 мл раствора следовых элементов, 0,360 мл раствора тиамина, 0,180 мл концентрированного раствора канамицина. Подачу осуществляли при постоянной скорости потока приблизит. 4,2 мл/ч. Измерения глюкозы и NH₄⁺ осуществляли извне для оценки доступности источников С и N в культуре. Обычно уровни глюкозы оставались очень низкими.

Культуры выращивали в общем в течение приблизительно 25 часов, при котором они достигали как правило OD_650нм 40-45. Продукцию SHC затем начинали путем добавления IPTG до конечной концентрации в ферментере приблизительно 1 мМ (в виде импульсного введения IPTG или в течение периода 3-4 часов с использованием инфузионного шприца), устанавливая температуру 40°С и рО₂ 20%. Индукция продукции SHC продолжалась в течение 16 ч при 40°С. В конце индукции клетки собирали путем центрифугирования, промывали 0,1 М буфером лимонная кислота/цитрат натрия при рН 5,4 и хранили в виде осадков при 4°С или -20°С до дальнейшего использования.

Результаты Iа

В общем, при неизменности всех других условий специфическая активность продуцируемого биокатализатора была выше при использовании минимальной среды по сравнению с обогащенной средой.

Индукцию успешно осуществляли при 30 или 37°С. Было отмечено, что, когда индукцию осуществляли при 40-43°С, тогда получали биокатализатор с более высокой специфической активностью.

Результаты Iб

В следующей таблице 1 представлены для двух примеров культуральный объем, оптическая плотность и количество клеток в начале индукции и в конце индукции, а также количество собранной биомассы (влажная масса).

OD_650нм при инокуляции: 0,45 (Пример 1) и 0,40 (Пример 2). Исходные объемы: 205 мл.

Аминокислотная последовательность дикого типа SHC (SEQ ID No. 1) (GenBank М73834, Swissprot P33247)

Вариант аминокислотной последовательности F601Y SHC (SEQ ID No. 2) - вариант по отношению к SEQ ID No. 1

Вариант нуклеотидной последовательности F605W SHC (SEQ ID No. 3)

Вариант аминокислотной последовательности F605W SHC (SEQ 10 No. 4) - вариант по отношению к SEQ ID No. 1

Пример 3

Биоконверсия смеси 7Е, 3Е/Z-гомофарнезола

Биоконверсию осуществляли с использованием следующих условий реакции:

Реакцию (общий объем 150,1 г) осуществляли в 0,1 М буфере лимонная кислота/цитрат натрия с рН 5,4 в ферментере InforsHT объемом 750 мл, содержащем 146 г/л общего гомофарнезола, с использованием субстрата гомофарнезола, представляющего собой смесь 86:14 7E,3E:7E,3Z, 250 г/л клеток (получаемых в соответствии со способом примера 2, ферментация) и 1,55% SDS. Реакцию проводили при 35°С при постоянном перемешивании (900 об./мин), контроль рН осуществляли с использованием 10-40% лимонной кислоты в воде.

Реакционную смесь подвергали стадиям выделения и очистки, как изложено в примере 4 ниже.

Пример 4

Процедура последующей обработки

Реакционную смесь, образующуюся в результате биоконверсии 7Е, 3E/Z-гомофарнезола (86:14 3E:3Z), подвергали паровой дистилляции. Дистиллят собирали в виде двухфазной смеси. Органическую фазу сохраняли, а водную фазу удаляли. Состав органической фазы анализировали при помощи GC, и результаты представлены в таблице 2 ниже (смотри "неочищенный").

Органическую фазу затем концентрировали досуха. Затем добавляли этанол к неочищенному продукту, продукт сушили и смесь нагревали до растворения продукта. При комнатной температуре медленно добавляли воду и (-)-амброксид кристаллизовался при периодическом перемешивании и охлаждении в ледяной бане.

В таблице 1 представлены результаты анализа путем GC для кристаллизованного продукта. Данные демонстрируют сильное обогащение (-)-амброксида при практическом отсутствии побочных продуктов (а), (b) или (с) в кристаллизованном образце.

Следует отметить, что в таблице 2, "а", "b" и "с" относятся соответственно к соединению (II), соединению (IV) и соединению (III). "EZH" и "ЕЕН" относятся соответственно к 7Е,3Z-гомофарнезолу и 7Е,3Е-гомофарнезолу.

Пример 5

Экстракция твердой фазы реакционного бульона:

Учитывая то, что (-)-амброксид не растворим в воде и не является жидким при температурах ниже приблизительно 75°С, эти свойства рассматриваются как возможные преимущества для экстракции продукта из твердой фазы после биотрансформации с использованием смешивающихся с водой растворителей (например, этанола) и не смешивающихся с водой растворителей (например, толуола).

200 мл реакционного бульона центрифугировали для отделения твердой фазы от жидкой (водной) фазы (Sorvall GS3, 5000 об./мин, 10 мин, 10°С). Отделяли приблизительно 80 мл твердого осадка от приблизительно 120 мл жидкой фазы. Анализ (газовая хроматография) водной фазы после экстракции МТВЕ (трет-бутилметиловым эфиром) продемонстрировал, что она содержит не более чем приблизительно 0,3% (-)-амброксида, исходно представленного в 200 мл реакционного бульона. Толуол и 99% этанол использовали для экстракции (-)-амброксида из твердой фазы.

Экстракция толуолом:

80 мл твердой фазы 6 раз экстрагировали 45 мл толуола (приблизит. объема твердой фазы, интенсивно встряхивая в течение 30 с, центрифугировали (Sorvall GS3, 5000 об./мин, 10 мин, 10°С). Фазу растворителя анализировали при помощи GC на содержание в ней (-)-амброксида. Свыше 99,5% (-)-амброксида, исходно находящегося в реакционном бульоне, экстрагировали путем 6 экстракций, составляя общий объем толуола 1,35× относительно исходного объема всего реакционного бульона (200 мл) или 3,4× относительно объема твердой фазы.

Экстракция этанолом:

Экстрагировали 80 мл твердой фазы (Infors Multifors НТ, 35°С, 1000 об./мин, 30 мин) при помощи приблизительно 160 мл (2 объема) 99% этанола с последующим центрифугированием. (-)-Амброксид не кристаллизовался в процессе экстракции. После 4 промываний (в общем 640 мл этанола, т.е. 3,2× относительно исходного объема всего реакционного бульона или 8× относительно объема твердой фазы) выделяли приблизительно 99% (-)-амброксида, исходно находящегося в реакционном бульоне. Достаточное количество этанола требуется на первой стадии экстракции для предупреждения кристаллизации (-)-амброксида (растворимость в этаноле). Когда только 1 или объема твердой фазы использовали на первой стадии экстракции, тогда получали вязкую пасту, которую было трудно обрабатывать, и (-)-амброксид кристаллизовался в виде игл на осадке во время центрифугирования. Температура, по-видимому, не является фактором, ответственным за эту кристаллизацию (экстракцию и центрифугирование тестировали при комнатной температуре и приблизительно 35°С-40°С).

Концентрация (-)-амброксида в этанольной фазе, а также отношение этанол/вода в жидкой фазе (остаточная влажность твердой фазы), по-видимому, ответственны за образование кристаллов. Тем не менее, отмечают, что можно уменьшить объем этанола до 1 объема твердой фазы.

Поскольку (-)-амброксид не находится в жидкой фазе при комнатной температуре, он отделяется с биомассой и может быть экстрагирован органическим растворителем (например, смешивающимся с водой растворителем (например, этанолом) или не смешивающимся с водой растворителем (например, толуолом). Стадия центрифугирования, которая отделяет (-)-амброксид в твердой фазы реакционной смеси, является полезной, поскольку она уменьшает количество растворителя, требующегося для экстракции (-)-амброксида.

Пример 6

Органолептический анализ

Задача: осуществление органолептического анализа (-)-амброксида и соединений (II), (III) и (IV), образовавшихся в неочищенном материале и в кристаллизованном материале.

Биотрансформация Е,Е-гомофарнезола приводит в результате к получению (-)-амброксида и соединения (IV).

Биотрансформация E,Z-гомофарнезола приводит в результате к получению макроциклического эфирного соединения (II) и соединения эпи-амброксид (III).

Неочищенная смесь (-)-амброксида содержит желаемый (-)-амброксид, соединение (II), (III) и (IV), соответственно представленные в количестве 87,1% по массе, 2,8% по массе, 2,5% по массе и 7,6% по массе.

Когда неочищенную смесь селективно кристаллизуют (лабораторный масштаб), тогда кристаллизованный материал имеет те же самые компоненты, как неочищенная смесь, но они представлены соответственно в количестве 99,1% по массе, 0,1% по массе, 0,1% по массе и 0,7% по массе.

Результаты органолептического анализа были следующими:

(-)-Амброксид: порог восприятия аромата 0,2 нг/л.

Соединение (IV): слабый запах, IsoE, деревянистый, порог обнаружения GC 5-10 нг.

Соединение (II): "лишенное запаха" (порог GC>500 нг).

Соединение (III): порог GC приблизительно в 10 раз выше чем у (-)-амброксида (приблизительно 2 нг).

Органолептический анализ 3 побочных продуктов (соединения II, III и IV) указывает на наличие у них более слабого запаха, чем обеспечиваемый (-)-амброксидом запах. Фактически, запах эпи-амброксида (соединение III) приблизительно в 10 раз слабее, чем у (-)-амброксида, что свидетельствует о том, что он по существу не обладает запахом.

Пример 7

Выделение амброксида при помощи экстрагирования паром.

Получающаяся в результате чистота неочищенного (экстрагированного паром) и кристаллизованного (-)-амброксида.

Биотрансформация ЕЕ:Е2-гомофарнезола 86:14 позволила получить реакционную смесь, которую подвергали экстрагированию паром. Дистиллят от паровой дистилляции собирали в виде двухфазной смеси. Органическую фазу сохраняли, а водную фазу удаляли. Состав органической фазы анализировали при помощи GC, и результаты представлены в нижеприведенной таблице (смотри "неочищенный"). Органическую фазу затем концентрировали досуха. Этанол затем добавляли к неочищенному продукту, продукт сушили и смесь нагревали до растворения продукта. При комнатной температуре медленно добавляли воду, и (-)-амброксид кристаллизовался при периодическом перемешивании и охлаждении в ледяной бане.

Данные в таблице также демонстрируют результаты анализа при помощи GC для продуктов, получающихся после стадии экстракции паром/дистилляции с паром ("неочищенный"), и кристаллизованного продукта ((-)-амброксид). Ссылки в таблице на "EZH" и "ЕЕН" относятся соответственно к (3Z,7Е)-гомофарнезолу и 7Е,3Е-гомофарнезолу.

Данные в нижеприведенной таблице показывают, что конкретное исходное вещество (EEH:EZH 86:14) позволяет получить желаемый конечный продукт (-)-амброксид и очень специфическую смесь побочных продуктов (II, IV и III) с использованием фермента WT SHC или производного SHC. Данные для селективной кристаллизации демонстрируют сильное обогащение (-) амброксида при практически полном отсутствии побочных продуктов (II), (IV) или (III) в кристаллизованном образце. Соответственно, эта смесь EE:EZ обеспечивает ольфакторно чистый продукт (-)-амброксид, который селективно кристаллизуется относительно несложным и экономически эффективным способом.

Экстракция паром/фильтрование представляют собой экологически безопасные способы выделения (-)-амброксида, поскольку они обеспечивают удобное выделение (-)-амброксида без растворителя при одновременной инактивации биокатализатора.

(-)-Амброксид, получаемый с использованием реакции биоконверсии, может быть экстрагирован с использованием растворителя из всей реакционной смеси (например, с использованием не смешивающегося с водой растворителя или при помощи экстракции паром/перегонки с паром, или путем фильтрования) или из твердой фазы (например, с использованием смешивающегося с водой растворителя) с использованием методов, которые известны специалистам в данной области техники.

1. Способ выделения и очистки (-)-амброксида из реакционной смеси, содержащей одно или более чем одно из соединений (II), (III) и (IV):

,

включающий стадию селективной кристаллизации (-)-амброксида из указанной смеси, содержащей одно или более чем одно из соединений (II), (III) или (IV).

2. Способ усиления запаха (-)-амброксида, включающий стадию селективной кристаллизации (-)-амброксида из смеси, содержащей одно или более чем одно из соединений (II), (III) или (IV), путем селективной кристаллизации (-)-амброксида из смеси таким образом, что после выделения (-)-амброксид не содержит или содержит лишь ольфакторно приемлемые количества соединений (II), (III) или (IV).

3. Способ по п. 1 или 2, где смесь не содержит или по существу не содержит гомофарнезол.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где растворитель для кристаллизации выбран из группы, состоящей из воды, метанола, ацетона, петролейного эфира, гексана, трет-бутилметилового эфира, THF (тетрагидрофурана), этилацетата, этанола, толуола и их смесей.

5. Способ по п. 4, где растворитель для кристаллизации представляет собой смесь этанола и воды.

6. Способ по любому из пп. 1-5, включающий стадию селективной кристаллизации (-)-амброксида из указанной смеси путем добавления органического растворителя с последующим медленным добавлением воды при охлаждении.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где селективную кристаллизацию осуществляют путем растворения смеси, содержащей (-)-амброксид и одно или более чем одно из соединений (II), (III) и (IV), в нагретом этаноле и оставляют (-)-амброксид селективно кристаллизоваться путем медленного добавления к охлаждающему этанольному раствору осадителя, такого как вода.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где смесь образуется в результате катализируемой ферментом циклизации гомофарнезола, содержащего смесь 7E,3E и 7E,3Z геометрических изомеров гомофарнезола, где реакцию осуществляют в присутствии рекомбинантного микроорганизма, экспрессирующего ген, кодирующий указанный фермент, причем указанный фермент представляет собой сквален-гопен-циклазу дикого типа или вариант сквален-гопен-циклазы дикого типа с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

9. Способ по п. 8, где смесь 7E,3E и 7E,3Z гомофарнезола обогащена 7E,3E геометрическим изомером.

10. Способ по п. 8 или 9, где смесь 7E,3E и 7E,3Z гомофарнезола состоит из 7E,3E и 7E,3Z гомофарнезола и не содержит никаких других геометрических изомеров гомофарнезола.

11. Способ по любому из пп. 8-10, где массовое отношение 7E,3E изомера к 7E,3Z изомеру составляет по меньшей мере 80:20, и более конкретно по меньшей мере 90:10, и еще более конкретно по меньшей мере 95:5.

12. Способ по любому из пп. 8-11, где указанный фермент представляет собой сквален-гопен-циклазу дикого типа, и где температура реакции биоконверсии составляет приблизительно 45-60°C, предпочтительно 55°C, и диапазон pH реакции биоконверсии составляет от приблизительно 5,0 до 7,0, более предпочтительно от приблизительно 5,6 до приблизительно 6,2, еще более предпочтительно приблизительно 6,0.

13. Способ по любому из пп. 8-11, где указанный фермент представляет собой вариант сквален-гопен-циклазы дикого типа, и где температура реакции биоконверсии составляет от приблизительно 34°C до приблизительно 50°C, предпочтительно приблизительно 35°C, и значение pH реакции биоконверсии составляет приблизительно 4,8-6,4, предпочтительно приблизительно 5,2-6,0.

14. Способ по любому из пп. 8-13, где в указанную реакцию биоконверсии включают солюбилизирующий агент, где указанный солюбилизирующий агент предпочтительно выбран из Triton X-100, Tween 80, тауродезоксихолата, тауродезоксихолата натрия, додецилсульфата натрия (SDS) и/или лаурилсульфата натрия (SLS).

15. Способ по любому из пп. 8-14, где реакционную смесь, полученную в процессе биоконверсии, фильтруют или центрифугируют для отделения твердой фазы от жидкой фазы или фаз.

16. Способ по любому из пп. 8-14, где реакционную смесь, полученную в процессе биоконверсии, нагревают до температуры выше температуры плавления (-)-амброксида, после чего (-)-амброксид образует масляную фазу над водной фазой, содержащей клеточный материал и дебрис.

17. Способ по любому из пп. 8-14, где реакционную смесь, полученную в процессе биоконверсии, экстрагируют подходящим не смешивающимся с водой органическим растворителем с образованием органической фазы, содержащей (-)-амброксид и одно или более чем одно из соединений (II), (III) и (IV), которая может быть отделена от водной фазы, содержащей клеточный материал и дебрис.

18. Способ по любому из пп. 8-14, где реакционную смесь, полученную в процессе биоконверсии, перегоняют с паром для отделения дистиллята от клеточного материала и дебриса, дистиллят собирают в виде двухфазной смеси и масляную фазу двухфазной смеси, содержащей смесь (-)-амброксида и одного или более чем одного из соединений (II), (III) и (IV), отделяют от водной фазы.